ผศ.ดร.ปิยะนุช เนียมทรพัย์

คณะวิทยาศาสตร ์มหาวิทยาลยัแม่โจ้

กล้องจลุทรรศน์และการย้อมสี

การวดัขนาดจลิุนทรีย์

เน่ืองจากจุลนิทรยีเ์ป็นสิง่มชีวีติขนาดเลก็ทีไ่มส่ามารถมองเหน็

ไดด้ว้ยตาเปลา่ ดงันัน้จงึตอ้งอาศยักลอ้งจุลทรรศน์ (microscope) ซึง่จะ

ชว่ยขยายใหม้องเหน็รายละเอยีดทัง้รปูรา่งและลกัษณะของเซลล์

หน่วยใชว้ดัขนาดของจุลนิทรยี ์เชน่ ไมครอนหรอืไมโครเมตร

(micron, micrometer หรอื µm), นาโนเมตร (nanometer, nm) และ

แองสตรอม (angstrom, oA)

1 micrometer (µm) = 10-3 millimeter

= 10-6 meter

1 nanometer = 10-9 meter

1 angstrom (oA) = 10-10 meter

กล้องจลุทรรศน์ (Microscope) กลอ้งจุลทรรศน์ แบ่งออกเป็น 2 ประเภท คอื แบบใชแ้สง

ธรรมดาและแบบใชแ้สงอเิลก็ตรอน

1. กล้องท่ีใช้แสงธรรมดา (compound microscope)

มเีลนส ์2 ชุด คอื เลนสว์ตัถุ (objective lens)

และเลนสต์า (ocular lens หรอื eyepieces)

ใชแ้สงธรรมดาเป็นแหล่งกาํเนิดแสง ขยายภาพ

โดยแสงเดนิทางจากแหล่งกําเนิดแสงผา่นเลนส์

รวมแสง (condenser lens) ซึง่จะบงัคบัใหแ้สง

ตรงเขา้สูว่ตัถุทีต่อ้งการด ูภาพของวตัถุจะถูก

ขยายอกีครัง้หน่ึงดว้ยเลนสต์า

1. กล้องท่ีใช้แสงธรรมดา (compound microscope)

แบ่งออกเป็น

1.1 กลอ้งจุลทรรศน์แบบไบรทฟิ์ลด ์(bright field microscope)

1.2 กลอ้งจุลทรรศน์แบบดารค์ฟิลด ์(dark field microscope)

1.3 กลอ้งจุลทรรศน์แบบใชแ้สงอลัตราไวโอเลต (ultraviolet microscope)

1.4 กลอ้งจุลทรรศน์ฟลอูอเรสเซนซ ์(fluorescence microscope)

1.5 กลอ้งจุลทรรศน์เฟสคอนทรสัต ์(phase-contrast microscope)

1.1 กล้องจลุทรรศน์แบบไบรทฟิ์ลด ์(bright field microscope)

เป็นกลอ้งจุลทรรศน์ทีใ่ชก้นัอยา่งแพรห่ลายในหอ้งปฏบิตักิารทัว่ไป มี

กาํลงัขยายประมาณ 1,000 เทา่ ขอ้จาํกดัของกาํลงัขยาย (magnification)

น้ีไมไ่ดข้ึน้อยูก่บัผลคณูของกาํลงัขยายของเลนสต์าและเลนสว์ตัถุเทา่นัน้

แต่ยงัขึน้กบัความสามารถของเลนสว์ตัถุในการแยกแยะรายละเอยีดของ

ภาพ ใหเ้หน็ความแตกต่างกนัได ้ทีเ่รยีกวา่รซีอลวงิเพาเวอร ์(resolving

power)

คา่ resolving power หรอืคา่รโีซลชูนั (resolution) หมายถงึ ค่าความสามารถของเลนสใ์นการแยกแยะรายละเอยีดของภาพ ทาํใหเ้หน็ความแตกต่างระหวา่งจุดสองจุดทีอ่ยูภ่ายในโครงสรา้งได้ คา่ resolving power ขึน้อยูก่บัความยาวคลื่นแสง และคา่ numerical aperture, N.A.) ของเลนสน์ัน้

ค่า resolving power = ความยาวคล่ืนแสง2 N.A.

ดงันัน้ ถา้ความยาวคลื่นแสงยิง่สัน้ จะใหร้ายละเอยีดของภาพมากขึน้ Numerical aperture (N.A.) เป็นสมบตัขิองเลนสท์ีเ่กีย่วขอ้งกบัดชันีหกัเหของตวักลางทีแ่สงผา่นไปก่อนจะเขา้สูเ่ลนสว์ตัถุ

คา่ numerical aperture, N.A. มสีตูรดงัน้ี

N.A. = n sin θ

θ = มมุครึง่หน่ึง (half-aperture angle) ของกรวยแสงทีผ่า่นเขา้สูเ่ลนส์ n = ดชันีหกัเหแสงของตวักลางระหวา่งวตัถุกบัเลนส์

จะเหน็วา่การใชน้ํ้ามนัจะทาํใหค้า่ N.A. สงูขึน้ ดงันัน้ถา้ตอ้งการใหค้า่

resolving power สงูทีส่ดุ จะตอ้งใช้

แสงทีม่คีวามยาวคลื่นสัน้ทีส่ดุ และ

เลนสว์ตัถุมคีา่ N.A. มากทีส่ดุดว้ย

เลนสว์ตัถท่ีุใช้น้ํามนั (oil immersion objective)

เป็นเลนสว์ตัถุทีม่กีาํลงัขยายมากทีส่ดุ คอื 100 เทา่ ซึง่การใชเ้ลนสน้ี์

ตอ้งเพิม่ความระมดัระวงัมาก เน่ืองจากระยะหา่งระหวา่งวตัถุกบัเลนสช์ดิ

กนัมาก เวลาใชจ้งึตอ้งหยดน้ํามนั (immersion oil) บนสไลดแ์ละใหเ้ลนส์

วตัถุสมัผสักบัน้ํามนั เพือ่ใหแ้สงเดนิทางผา่นเป็นเสน้ตรงเขา้สูเ่ลนสว์ตัถุได ้

ถา้ไมใ่ชน้ํ้ามนั แสงทีผ่า่นจากแกว้สไลดเ์ขา้สูอ่ากาศ จะหกัเหออกไปมาก

ทาํใหแ้สงเขา้สูเ่ลนสน้์อย ภาพจงึไมช่ดั

กาํลงัขยายของกล้องจลุทรรศน์ (magnification)

กลอ้งสว่นใหญ่ทีใ่ชใ้นหอ้งปฏบิตักิารจุลชวีวทิยา ประกอบดว้ยเลนส์

วตัถุ 4 ขนาด ซึง่มกีาํลงัขยายทีต่่างกนั คอื

- เลนสว์ตัถุกาํลงัขยายตํ่า (low-power objective lens) = 4x, 10x

- เลนสว์ตัถุกาํลงัขยายสงู (high-power objective lens) = 40x

- เลนสว์ตัถุหวัน้ํามนั (oil immersion objective lens) = 100x

ขณะทีเ่ลนสต์ามกีาํลงัขยาย 10 เทา่

ดงันัน้ กาํลงัขยายของภาพจากกลอ้งจุลทรรศน์จงึสามารถคาํนวณไดจ้าก

กาํลงัขยายของภาพ = กาํลงัขยายของเลนสต์า x กําลงัขยายของเลนสว์ตัถุ

1.2 กล้องจลุทรรศน์แบบดารค์ฟิลด ์(dark field microscope)

เป็นกลอ้งจุลทรรศน์ทีท่าํใหพ้ืน้ภาพเป็นสดีาํ ในขณะทีว่ตัถุทีต่อ้งการดู

เกดิภาพสว่าง โดยอาศยั condenser พเิศษ (dark field stop) ทีจ่ะตดัแสง

ออกไปไมใ่หเ้ขา้กลอ้ง ดงันัน้ถา้พืน้ของตวัอยา่งทีจ่ะศกึษาเป็นสารเน้ือ

เดยีวกนัและโปรง่ใส แสงทีผ่า่น condenser พเิศษน้ีจะเลยออกไปและพืน้

ภาพจะเป็นสดีาํ แต่ถา้มวีตัถุอยูจ่ะเกดิการสะทอ้นและหกัเหแสงใหเ้ขา้สู่

เลนส ์จงึเกดิภาพสว่างขึน้ในทีม่ดื กลอ้งน้ีมี

ประโยชน์ใชศ้กึษาจุลนิทรยีท์ีไ่มย่อ้มสแีละ

ศกึษาสไลดส์ดและเทคนิคหยดแขวน

และใชใ้นการวนิิจฉยั

เชือ้โรคบางชนิด เชน่

เชือ้ซฟิิลสิ

1.3 กล้องจลุทรรศน์อลัตราไวโอเลต (ultraviolet microscope)

เป็นกลอ้งจุลทรรศน์ทีใ่ชแ้สงอลัตราไวโอเลต ซึง่จะทาํให ้resolving

power มากกวา่กลอ้งธรรมดา เพราะแสงอลัตราไวโอเลตมคีลื่นสัน้กวา่

(ประมาณ 180-400 nm) เลนสข์องกลอ้งชนิดน้ีทาํจากควอตซ ์ทาํใหแ้สง

เขา้สูก่ลอ้งไดม้าก จงึทาํใหภ้าพชดัเจน แต่เน่ืองจากแสงอลัตราไวโอเลตน้ี

ตาเรามองไมเ่หน็ จงึตอ้งบนัทกึภาพไวบ้นฟิลม์

1.4 กล้องจลุทรรศน์ฟลอูอเรสเซนซ ์(fluorescence microscope)

เป็นกลอ้งทีใ่ชห้ลกัการทีใ่หจุ้ลนิทรยีย์อ้มสฟีลอูอเรสเซนซ ์ซึง่จะเกดิ

การเรอืงแสงและสวา่งขึน้เมือ่ผา่นรงัสอีลัตราไวโอเลต จงึทาํใหจุ้ลนิทรยี์

ชดัเจนในฉากทีม่ดื สทีีนิ่ยมใชย้อ้ม เชน่ ส ีauramine O ส ีacridine yellow

สฟีลอูอเรสเซนซใ์ชม้ากในการหาปฏกิริยิาทางน้ําเหลอืงวทิยา

เรยีกเทคนิคน้ีวา่ fluorescent-antibody technique

1.5 กล้องจลุทรรศน์เฟสคอนทรสัต ์(phase contrast microscope)

เป็นกลอ้งทีใ่ชศ้กึษาเซลลท์ีม่ชีวีติ โดยมหีลกัการทีใ่ช ้phase contrast

objective และ condenser พเิศษ (annular stop) ตดิเขา้ไปในกลอ้ง

จุลทรรศน์ทีใ่ชแ้สงธรรมดา โดยการทีแ่สงผา่นวตัถุทีม่คีวามหนาแน่น

ต่างกนั แสงจะหกัเหออกไปมากน้อยต่างกนั ทาํใหแ้ต่ละสว่นของวตัถุมี

ความสวา่งต่างกนัดว้ย จงึทาํใหก้ลอ้งชนิดน้ีแยกรายละเอยีดของลกัษณะ

ภายในจุลนิทรยีไ์ด้

2. กล้องจลุทรรศน์อิเลก็ตรอน (electron microscope, EM)

เป็นกลอ้งทีม่คีวามแตกต่างจากกลอ้งจุลทรรศน์ธรรมดาหลายขอ้

- มกีําลงัขยายสงูมาก

- มคีวามยาวคลื่นอเิลก็ตรอนสัน้มาก คอื 0.05 Ao ดงันัน้จงึสามารถ

แยกแยะรายละเอยีดของวตัถุทีข่นาด 10 Ao ได ้และขยายภาพไดถ้งึ

400,000 เทา่

- การทาํใหเ้กดิภาพจะใชส้นามแมเ่หลก็ไฟฟ้า และการเตรยีมตวัอยา่งเพือ่

ใชศ้กึษาตอ้งเป็นตวัอยา่งทีแ่หง้และเบามาก

- ภาพทีไ่ดจ้ะปรากฏบนฉากเรอืงแสงหรอืถ่ายภาพไว้

กลอ้งจุลทรรศน์อเิลก็ตรอนม ี2 ชนิด คอื

2.1 กลอ้งจุลทรรศน์อเิลก็ตรอนแบบสอ่งผา่น (Transmission EM, TEM)

2.2 กลอ้งจุลทรรศน์อเิลก็ตรอนแบบสอ่งกราด (Scanning EM, SEM)

2.1 กล้องจลุทรรศน์อิเลก็ตรอนแบบส่องผา่น (TEM)

ใชใ้นการศกึษาโครงสรา้งภายในและรายละเอยีดขององคป์ระกอบ

ภายในตวัอยา่ง และยงัสามารถใชศ้กึษารปูรา่ง ขนาด และลกัษณะ

ภายนอกของตวัอยา่งแบบสองมติไิด้

Bacillus subtilis

2.2 กล้องจลุทรรศน์อิเลก็ตรอนแบบส่องกราด (SEM)

ใชใ้นการศกึษาลกัษณะทางสณัฐานและลกัษณะพืน้ผวิของตวัอยา่ง

แต่กาํลงัขยายทีไ่ดไ้มส่งูเทา่กบั TEM

เปรยีบเทยีบระบบการเกดิภาพของกลอ้งจุลทรรศน์ 3 ชนิด

TEM SEM

ขอ้ดี - มคีา่ resolution สงู ขยายภาพได้

ถงึแสนเทา่

- ไมต่อ้งตดัชิน้สว่นใหบ้าง

- สามารถมองเหน็ภาพ 3 มติไิด้

ขอ้เสยี - มคีวามสามารถในการทะลุทะลวง

จาํกดั ตอ้งใชช้ิน้ตวัอยา่งทีบ่างมาก

- ไมส่ามารถเหน็ภาพ 3 มติไิด้

- ตอ้งผา่นกระบวนการเตรยีม

ตวัอยา่งหลายขัน้ตอน ทาํให ้

ตวัอยา่งเหีย่วยน่และเสยีรปูทรงได้

- กาํลงัขยายไมส่งูเทา่ TEM

การเตรียมวตัถเุพ่ือศึกษาด้วยกล้องจลุทรรศน์ธรรมดา

การเตรยีมตวัอยา่งเชือ้จุลนิทรยีเ์พือ่นํามาศกึษาดว้ยกลอ้งจุลทรรศน์ที่

ใชแ้สงธรรมดาอาจทาํได ้2 วธิ ีคอื

- การเตรยีมสไลดส์ดและการทาํเทคนิคหยดแขวน

- การทาํใหเ้ซลลแ์หง้ตรงึอยูก่บัที ่และยอ้มสเีพือ่ใหเ้หน็ความแตกต่าง

การเตรียมสไลดส์ด

วธิน้ีีจะชว่ยใหม้องเหน็จุลนิทรยีใ์นสภาพธรรมชาตจิรงิๆ โดยทีจุ่ลนิทรยีจ์ะ

ลอยอยูใ่นของเหลว โดยหยดของเหลวทีม่จุีลนิทรยีบ์นแผน่แกว้สไลด ์ปิดทบั

ดว้ยกระจกปิดสไลด ์(cover slip)

การทาํเทคนิคหยดแขวน (Hanging drop technique)

มลีกัษณะคลา้ยการทาํสไลดส์ด แต่ใหห้ยดของเหลวทีม่จุีลนิทรยีบ์น

กระจกปิดสไลดก่์อน แลว้จงึควํ่าสไลดห์ลุมทีม่หีลุมตรงกลางลงบนกระจกปิด

สไลดใ์หบ้รเิวณหลุมอยูต่รงกลางเหนือหยดของเหลว แลว้พลกิสไลดใ์หห้งาย

ขึน้ หยดเชือ้จะแขวนอยูก่บักระจกปิดสไลดแ์ละอยูเ่หนือหลุมของสไลดห์ลุม

พอดี ขอ้ดี

- สามารถศกึษาเซลลท์ีม่ชีวีติได้

- สงัเกตรปูรา่งและการเรยีงตวัของเซลล์

ไดช้ดัเจน

- สามารถศกึษาพฤตกิรรมต่างๆ ของเซลล์

ได ้เชน่ การเคลื่อนที่

- สามารถศกึษาถงึองคป์ระกอบต่างๆ ภาย

ในเซลล์

การย้อมสีจลิุนทรีย ์(Staining)

เน่ืองจากจุลนิทรยีม์ขีนาดเลก็มากและมกัโปรง่แสง จงึแยกความ

แตกต่างกบัของเหลวทีจุ่ลนิทรยีแ์ขวนลอยอยูไ่ดน้้อย ทาํใหม้องเหน็ไดย้าก

ดงันัน้การยอ้มสจีะชว่ยใหเ้หน็รายละเอยีดและความแตกต่างของจุลนิทรยีแ์ต่

ละชนิดไดม้ากขึน้

สทีีใ่ชย้อ้มจุลนิทรยีพ์วกแบคทเีรยี แบ่งออกเป็น 2 ชนิด คอื

1. สทีีม่คีุณสมบตัเิป็นกรดหรอืมปีระจุลบ (acid dye หรอื ionic dye)

ตวัทาํใหเ้กดิสมีปีระจุเป็นลบ จงึยอ้มตดิกบัสารทีม่ปีระจุไฟฟ้าเป็นบวก

ไดแ้ก่สอีโีอซนิ (eosin)

2. สทีีม่สีมบตัเิป็นเบสหรอืมปีระจุบวก (basic dye หรอื cationic dye)

ตวัทีท่าํใหเ้กดิสมีปีระจุไฟฟ้าเป็นบวก จงึยอ้มตดิกบัสารทีม่ปีระจุ

ไฟฟ้าเป็นลบไดด้ ีไดแ้ก่สเีมทลินีบล ู(methylene blue)

วิธีการเตรียมสเมียรเ์ช้ือ (smear preparation)

1. Smear preparation

2. Air dry 3. Heat fix 4. Staining

วิธีการย้อมสีแบคทีเรีย มวีธิกีารทีส่าํคญั 2 แบบ คอื

1. การย้อมสีแบบธรรมดา (simple staining)

โดยใชส้ชีนิดเดยีวยอ้มเซลลท์ิง้ไวร้ะยะหน่ึง หลงัจากนัน้ลา้งออกดว้ยน้ํา

และซบัใหแ้หง้ เซลลจ์ะยอ้มตดิสสีมํ่าเสมอกนั การยอ้มแบบน้ีเพือ่ศกึษา

รปูรา่งและขนาดของเซลล ์ตวัอยา่งสทีีใ่ช ้เชน่ crystal violet (A), methylene

blue (B) และ carbol fuchsin (C) เป็นตน้

2. การย้อมมากกว่าหน่ึงสี (differential staining)

โดยการใชส้ยีอ้มมากกวา่หน่ึงชนิด ทาํใหส้ยีอ้มตดิสว่นต่างๆ ของเซลล์

ไมเ่ทา่กนั จงึเหน็ความแตกต่างระหวา่งเซลลห์รอืองคป์ระกอบของเซลล ์

2.1 การย้อมสีแบบแกรม (Gram staining)

การยอ้มสแีบบน้ีมคีวามสาํคญัทีส่ดุ

และใชก้นัแพรห่ลาย สามารถใชศ้กึษา

รปูรา่งลกัษณะและการจดัเรยีงตวัของ

เซลล ์และทาํใหจ้าํแนกแบคทเีรยีออก

เป็นสองชนิดคอื แบคทเีรยีแกรมบวก

และแบคทเีรยีแกรมลบ

Gram positive bacteria

Gram negative bacteria

ขอ้จาํกดัของการยอ้มสแีบบแกรม

- อายขุองเชือ้ ถา้แก่ แบคทเีรยีแกรมบวกจะ

สญูเสยีความสามารถในการตดิส ีcrystal

volet ทาํใหต้ดิสแีกรมลบแทน

- ขึน้กบัสภาพแวดลอ้มของแบคทเีรยี

หรอืขึน้กบัวธิกีารเกลีย่เชือ้ วธีกีารยอ้มส ี

และคุณภาพของสทีีใ่ช้

2.2 การย้อมสีแบบทนกรด (Acid-fast staining)

แบคทเีรยีบางชนิดมคีวามสามารถทีจ่ะทนต่อการลา้งดว้ย acid alcohol

เราเรยีกแบคทเีรยีพวกน้ีว่าแบคทเีรยีทนกรด (acid-fast bacteria)

เน่ืองจากมปีรมิาณไขมนัในเซลลส์งู เชน่ mycolic acid ไดแ้ก่แบคทเีรยี

กลุ่ม Mycobacterium เชน่ M. tuberculosis สาเหตุของวณัโรค และ

M. leprae สาเหตุของ

โรคเรือ้น

2.3 การย้อมสีสปอร(์Spore staining)แบคทเีรยีบางชนิด เชน่ ในจนีสั Bacillus และ Clostridium จะมกีาร

สรา้งสปอรภ์ายในเซลลเ์รยีกวา่ endospore ซึง่สปอรจ์ะตดิสยีอ้มยาก แต่ เมือ่ตดิแลว้กล็า้งออกยากดว้ย จงึตอ้งใชค้วาม รอ้นชว่ยเพือ่ใหต้ดิสมีากขึน้และเรว็ขึน้ การ ยอ้มสปอรช์ว่ยใหศ้กึษาขนาดรปูรา่งและ ตําแหน่งของสปอรไ์ด้ วธิยีอ้มนิยมใชว้ธิขีอง Schaeffer และ

Fulton โดยใชส้ ีmalachite green ยอ้มสปอร์ และยอ้มเซลลด์ว้ยสแีดงของ safranin

2.4 การย้อมสีโครงสร้างต่างๆ ของเซลลแ์บคทีเรีย

โครงสรา้งต่างๆ ของเซลลแ์บคทเีรยี เชน่ แฟลกเจลลา แคปซลู ผนงัเซลล ์เมด็แกรนูลต่างๆ ตอ้งใชว้ธิกีารยอ้มดว้ยเทคนิคพเิศษ จงึจะเหน็ความแตกต่างของโครงสรา้งเหล่านัน้

2.5 การย้อมสีแบบลบ (negative staining)

การยอ้มแบบลบตวัเซลลแ์บคทเีรยีจะไมต่ดิสยีอ้ม แต่สจีะไปตดิแน่นกบัแผน่สไลดแ์ทน จงึมองเหน็ฉากมดื สว่นตวัเซลลแ์บคทเีรยีจะโปรง่แสง สทีีนิ่ยมคอื หมกึอนิเดยี หรอืสนิีโกรซนิ วธิน้ีีมขีอ้ดคีอื ทาํใหข้นาดและ

รปูรา่งของแบคทเีรยีไมเ่ปลีย่นแปลง เน่ืองจากไมม่กีารใชค้วามรอ้นซึง่จะทาํให้ ขนาดเลก็ลงและรปูรา่งบดิเบีย้วจากความ เป็นจรงิ