Abstrak
Genus Henipavirus dalam keluarga Paramyxoviridae berisi dua
virus, virus Hendra (HEV) dan virus Nipah (BIS) yang pteropid
kelelawar bertindak sebagai reservoir alami utama. Setiap virus
juga menyebabkan infeksi serius dan sering mematikan orang serta
berbagai spesies hewan domestik, namun sedikit yang diketahui
tentang mekanisme terkait patogenesis. Di sini, kami melaporkan
isolasi dan karakterisasi dari paramyxovirus baru dari kelelawar
pteropid, Cedar virus (CedPV), yang berbagi fitur signifikan dengan
henipaviruses dikenal. Ukuran genom (18162 nt) dan organisasi CedPV
sangat mirip dengan HEV dan NIV; protein menampilkan nukleokapsid
yang antigenik reaktivitas silang dengan henipaviruses; dan
menggunakan molekul reseptor yang sama (B2 ephrin-) untuk masuk
selama infeksi. Studi tantangan awal dengan CedPV di musang dan
marmut, baik rentan terhadap infeksi dan penyakit dengan
henipaviruses dikenal, dikonfirmasi replikasi virus dan produksi
antibodi meskipun penyakit klinis tidak diamati. Dalam konteks ini,
menarik untuk dicatat bahwa perbedaan genetik utama antara CedPV
dan HEV atau BIS terletak dalam strategi pengkodean gen P, yang
dikenal untuk memainkan peran penting dalam menghindari sistem
kekebalan tubuh bawaan tuan rumah. Tidak seperti HEV, NIV, dan
paramyxoviruses hampir semua dikenal, gen CedPV P kurang baik
editing RNA dan juga kapasitas coding untuk protein V sangat kekal.
Penelitian pendahuluan menunjukkan bahwa infeksi CedPV sel manusia
menginduksi respon IFN- lebih kuat dari HEV.
Penulis Ringkasan
Hendra dan Nipah virus 2 paramyxoviruses sangat patogen yang
muncul dari kelelawar dalam dua dekade terakhir. Keduanya mampu
menyebabkan penyakit fatal pada manusia dan banyak spesies mamalia.
Bukti serologis dan molekuler virus Henipa-seperti telah dilaporkan
dari berbagai lokasi termasuk Asia dan Afrika, namun, sampai
sekarang tidak ada isolasi sukses virus ini telah dilaporkan.
Makalah ini melaporkan isolasi dari paramyxovirus baru, bernama
virus Cedar, dari kelelawar buah di Australia. Sekuensing genom
penuh virus ini menunjukkan hubungan yang erat dengan
henipaviruses. Antibodi terhadap virus Cedar ditunjukkan untuk
menyeberang bereaksi dengan, tetapi tidak menyeberangi menetralisir
Hendra atau Nipah virus. Meskipun hubungan dekat ini, ketika virus
Cedar diuji dalam tantangan model eksperimental di musang dan
marmut, kami mengidentifikasi replikasi virus dan generasi
antibodi, tetapi tidak ada penyakit klinis yang diamati. Dengan
demikian, virus ini menyediakan referensi yang berguna untuk
genetika terbalik masa percobaan untuk menentukan dasar molekul
patogenisitas dari henipavirusesPengantar
Henipaviruses pertama kali ditemukan pada 1990-an setelah
penyelidikan wabah penyakit serius pada kuda, babi dan manusia di
Australia dan Malaysia [1], [2] dan terdiri dari hanya dikenal
Biosafety Level 4 (BSL4) agen di keluarga Paramyxoviridae [3].
Tergantung pada lokasi geografis wabah, dan spesies virus dan hewan
yang terlibat, kematian kasus adalah antara 40% sampai 100% di
kedua manusia dan hewanmembuat mereka salah satu kelompok yang
paling mematikan dari virus yang dikenal dengan menginfeksi
manusia. Genus Henipavirus di subfamili Paramyxovirinae saat ini
berisi dua anggota, virus Hendra (HEV) dan virus Nipah (BIS) [6].
Kelelawar buah dalam genus Pteropus, umumnya dikenal sebagai rubah
terbang, telah diidentifikasi sebagai reservoir alami utama kedua
virus meskipun bukti serologis menunjukkan bahwa henipaviruses juga
beredar di kelelawar non-pteropid
Penemuan henipaviruses memiliki dampak yang signifikan terhadap
pemahaman kita tentang keanekaragaman genetik, virus evolusi dan
berbagai host paramyxoviruses. Paramyxoviruses, seperti virus
campak dan virus distemper anjing, secara tradisional dianggap
memiliki kisaran inang yang sempit dan menjadi genetik stabil
dengan dekat dengan ukuran genom seragam bersama oleh semua anggota
Paramyxovirinae [3]. Henipaviruses bergeser paradigma ini pada
kedua dihitung memiliki kisaran inang yang lebih luas dan genom
secara signifikan lebih besar [6]. Identifikasi kelelawar sebagai
reservoir alami henipaviruses juga memainkan peran penting dalam
secara signifikan meningkatkan perhatian ilmiah internasional pada
kelelawar sebagai reservoir penting dari virus zoonosis, termasuk
Ebola, Marburg, SARS dan virus Melaka
Sejak penemuan henipavirus pertama pada tahun 1994, banyak
kemajuan telah dibuat dalam penelitian henipavirus, dari
identifikasi reseptor seluler fungsional untuk pengembangan
diagnostik baru, vaksin dan terapi Sebaliknya, ada sedikit
pemahaman patogenesis virus ini sangat mematikan. Hal ini
disebabkan sebagian untuk kebutuhan fasilitas BSL4 keamanan yang
tinggi untuk studi infeksi hidup dan sebagian kisaran terbatas alat
penelitian dan reagen untuk model hewan kecil saat ini. Penelitian
mekanisme henipavirus patogenesis juga terhambat oleh kurangnya
terkait, tetapi virus non-patogenik atau kurang patogen, sehingga
mencegah ditargetkan studi patogenetik komparatif.
Investigasi serologis awal di Australia dan studi yang lebih
baru di wilayah lain (misalnya, Cina) menunjukkan adanya
cross-reaktif, tapi tidak lintas penetral, antibodi untuk
henipaviruses di kelelawar spesies yang berbeda [8]. Temuan ini
selanjutnya didukung oleh deteksi urutan genom henipavirus seperti
kelelawar Afrika [26]. Penemuan dan isolasi virus ini terkait akan
sangat penting untuk pemahaman lebih lanjut kami henipavirus
evolusi, mekanisme transmisi lintas-spesies, dan patogenesis pada
spesies hewan yang berbeda.
Di sini kita melaporkan isolasi dan karakterisasi kelelawar
henipavirus baru yang, berdasarkan studi infeksi awal, adalah
non-patogenik dalam dua model infeksi hewan kecil yang saat ini
digunakan dalam penelitian henipavirus. Kami percaya bahwa virus
baru ini akan memberikan alat yang ampuh untuk memfasilitasi
penelitian masa depan kita menjadi aspek yang berbeda dari
henipaviruses, terutama di daerah yang kurang maju
patogenesis.Hasil
Isolasi virus dari sampel urin dikumpulkan kelelawar
Sebagai bagian dari kami berlangsung studi lapangan di HEV
genetik keragaman dan infeksi dinamika di Queensland populasi
flying fox, sampel urin dikumpulkan secara teratur untuk PCR dan
isolasi virus. Sejak berdirinya garis sel primer Pteropus alecto
dalam kelompok kami [27], kami telah mengintensifkan upaya kami
untuk mengisolasi virus hidup dari sampel urin tersebut dengan
rutin inokulasi garis sel primer terpisah berasal dari ginjal,
limpa, otak, dan plasenta, serta sebagai sel Vero. Syncytial CPE
diamati pada sel ginjal (Paki) monolayers 5 hari pasca inokulasi
(dpi) dengan dua sampel urin yang berbeda (Gambar. S1) yang
dikumpulkan pada bulan September 2009 dari koloni flying fox di
Cedar Grove, Queensland Tenggara (lihat Gambar. S2 untuk Peta
lokasi). Tidak ada CPE diamati pada salah satu dari empat baris sel
lainnya. Supernatan dipanen 6 dpi digunakan untuk menyuntik
monolayers sel Paki segar. Setelah dua bagian dalam sel Paki, virus
mampu menginfeksi dan menyebabkan CPE pada sel Vero. Namun,
morfologi CPE infeksi CedPV dalam sel Vero adalah berbeda dari
infeksi HEV. Analisis lebih lanjut menggunakan-HEV spesifik primer
PCR menunjukkan bahwa virus kelelawar baru bukanlah isolat HEV.
Analisis genom virus baru diisolasi
Mengingat pembentukan syncytial CPE oleh virus baru ini dan
keberhasilan sebelumnya dalam mengisolasi paramyxoviruses dari
kelelawar urin [28], [29], [30], paramyxovirus primer spesifik
genus keluarga-spesifik dan digunakan untuk menentukan apakah virus
baru ini anggota dari keluarga Paramyxoviridae. Positif PCR fragmen
ukuran yang diharapkan diperoleh dari Paramyxovirinae dan
Respirovirus / morbillivirus / Henipavirus primer set dikembangkan
oleh Tong et al [31]. Sequencing dari produk PCR menunjukkan bahwa
itu adalah paramyxovirus baru terkait erat dengan HEV dan BIS.
Berdasarkan data-data awal, virus bernama virus Cedar (CedPV)
setelah lokasi koloni kelelawar sampel.
Urutan panjang genom penuh ditentukan oleh kombinasi dari tiga
pendekatan yang berbeda, sequencing acak dalam menggunakan
teknologi 454, urutan produk PCR diperoleh dengan menggunakan
primer degenerate dirancang berdasarkan henipaviruses dikenal, dan
RACE untuk menentukan urutan genom terminal yang tepat. Seperti
yang ditunjukkan pada Gambar. 1, genom CedPV adalah 18.162 nt
panjang yang paling mirip dengan HEV dalam keluarga. Urutan genom
penuh telah disetor ke GenBank (Aksesi No JQ001776). Ukuran genom
merupakan kelipatan dari 6, maka mematuhi Peraturan-of-Enam diamati
untuk semua anggota yang dikenal dari subfamili Paramyxovirinae
[3]. Ini memiliki urutan intergenic 3-nt dari CTT benar-benar
dilestarikan di semua tujuh posisi dan mulai gen sangat kekal dan
menghentikan sinyal sama dengan yang hadir di HEV dan NIV (Gambar.
S3). Juga mirip dengan genom HEV adalah adanya daerah non-coding
yang relatif besar di CedPV genom (Gbr. 1 dan Tabel 1). Kapasitas
protein-coding keseluruhan genom CedPV adalah 87,41% yang secara
signifikan lebih rendah dari rata-rata 92,00% untuk anggota
keluarga yang lain tetapi lebih tinggi dari HEV di 82,12%. Sebagai
ukuran genom CedPV dan HEV sangat mirip, peningkatan kapasitas
pengkodean dari CedPV dikaitkan dengan peningkatan ukuran protein
untuk lima dari enam protein utama, dengan protein L menjadi 257-aa
lebih besar (Tabel 1). Pada 2501 aa, protein CedPV L adalah yang
terbesar, tidak hanya dalam keluarga Paramyxoviridae tetapi juga
untuk semua virus yang dikenal dalam urutan Mononegavirale\
Prevalensi antibodi pada kelelawar buah Australia
Untuk menyelidiki status paparan CedPV kelelawar pteropid di
Queensland dan co-infeksi potensial (bersamaan atau berurutan) dari
CedPV dengan HEV, kami menguji 100 flying fox sera dikumpulkan
sebelumnya untuk penelitian lain untuk antibodi terhadap kedua
virus. Karena reaktivitas silang yang diamati di atas, virus tes
netralisasi dilakukan untuk memperoleh data infeksi yang lebih
akurat untuk setiap virus. Secara keseluruhan, 23% dari sera yang
CedPV-positif dan 37% HEV-positif (Tabel S1). Koinfeksi tercermin
dalam 8% dari sera diuji.
Diskusi
Munculnya virus zoonosis kelelawar-borne (termasuk HEV, NIV,
Ebola, Marburg, dan SARS) telah memiliki dampak yang signifikan
terhadap kesehatan masyarakat dan ekonomi global selama beberapa
dekade terakhir. Dengan pengetahuan berkembang pesat keragaman
virus pada populasi kelelawar di seluruh dunia, diperkirakan bahwa
lebih bat-ditanggung virus zoonosis mungkin muncul di masa depan.
Penemuan Ebolavirus seperti filovirus novel dalam microbats Spanyol
menunjukkan bahwa potensi tumpahan tersebut atas peristiwa tidak
terbatas pada Afrika atau Asia [39]. Oleh karena itu penting untuk
meningkatkan kesiapan kami untuk melawan wabah masa depan dengan
melakukan penelitian aktif pra-Munculnya menjadi pengawasan, memicu
untuk transmisi lintas-spesies, dan ilmu identifikasi patogen
potensial.
Henipaviruses merupakan salah satu yang paling penting patogen
kelelawar-ditanggung untuk ditemukan dalam sejarah. Meskipun CedPV
menampilkan beberapa perbedaan dari anggota yang ada dari genus
Henipavirus, kami mengusulkan bahwa CedPV diklasifikasikan sebagai
henipavirus baru berdasarkan fitur bersama berikut dengan
henipaviruses diketahui: 1) itu adalah antigen terkait dengan
henipaviruses saat ini; 2) ukuran genom dan organisasi hampir
identik dengan HEV dan NIV; 3) memiliki prevalensi yang sama di
rubah terbang; dan 4) menggunakan ephrin-B2 sebagai reseptor masuk
sel.
Kurangnya lintas netralisasi antara CedPV dan HEV atau NIV tidak
terduga dari analisis urutan komparatif semua protein yang
menyimpulkan, terutama protein G (lihat Tabel 1). Hal ini jelas
bahwa keterkaitan genetik CedPV dengan HEV atau BIS jauh lebih
rendah dibandingkan antara HEV dan BIS. Namun, identitas urutan
persentase dari protein virus utama antara CedPV dan HEV / NIV yang
rata-rata minimal 10% lebih tinggi dari itu antara HEV / BIS dan
setiap paramyxoviruses dikenal lainnya. Juga, tidak ada antigen
reaktivitas silang diamati antara CedPV dan virus wakil dari genera
paramyxovirus lain dalam subfamili Paramyxovirinae (Gambar.
S6).
Seperti paramyxoviruses lain, gen P dari henipaviruses
menghasilkan beberapa protein yang memainkan peran kunci dalam
penggelapan virus host respon bawaan kekebalan [4], [40], [41].
Salah satunya adalah protein V Cys-kaya: semua anggota subfamili
Paramyxovirinae menghasilkan protein V dengan pengecualian dari
parainfluenza manusia virus 1 (hPIV1). Meskipun urutan editing RNA
diduga (AAGAGGG) hadir di situs editing yang diharapkan dari gen P,
polimerase RNA hPIV1 tidak menghasilkan mRNA diedit dari gen P
[42]. Ada sisa-sisa V ORF mudah terdeteksi pada gen hPIV1 P
meskipun diperkirakan 68-aa wilayah ORF terganggu oleh beberapa
di-frame berhenti kodon. Dari 7 Cys residu dilestarikan antara sapi
parainfluenza virus 3 dan virus Sendai, empat masih ada di ORF V
non-fungsional hPIV1 [42]. Sebaliknya, sebuah ORF dan urutan
homologi pencarian ekstensif dari gen CedPV P hanya
mengidentifikasi satu aa coding dengan identitas urutan minimal
untuk V ORFs dari HEV dan NIV (lihat Gambar. S8). Di wilayah ini,
dari 9 Cys residu dilestarikan antara HEV dan protein BIS V, hanya
2 yang hadir dalam gen CedPV P. Selanjutnya, urutan (AGATGAG) hulu
dari yang diduga ORF V coding ini tidak cocok dengan situs editing
konsensus RNA. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa CedPV adalah
satu-satunya anggota dari Paramyxovirinae yang tidak memiliki kedua
V fungsional mRNA / protein dan kapasitas coding untuk situs
editing RNA dan ORF V. Pentingnya evolusi temuan ini perlu
penelitian lebih lanjut.
Kami studi in vitro menunjukkan bahwa ephrin B2, tetapi tidak
ephrin B3, mampu mengembalikan infeksi CedPV di ephrin
B2-kekurangan sel HeLa. Sementara ini sangat sugestif bahwa ephrin
B2 adalah reseptor entri fungsional untuk CedPV, harus ditekankan
bahwa ini bukan bukti langsung yang ephrin B2 adalah reseptor.
Penyelidikan lebih lanjut diperlukan untuk mengkonfirmasi hal
ini.
Dalam penelitian awal kami, itu menunjukkan bahwa CedPV mampu
mereplikasi di marmut dan musang, tapi gagal menyebabkan penyakit
klinis yang signifikan, tidak seperti yang dari HEV terkait erat
dan BIS. Percobaan ini infeksi pertama dilakukan dengan dosis
tinggi jika virus untuk menentukan apakah CedPV bisa meniru pada
hewan ini dan menentukan tingkat penyakit klinis. Percobaan kedua
kemudian dilakukan di musang untuk menentukan lokasi replikasi dan
tropisme jaringan di berurutan dikorbankan hewan. Dosis rendah
digunakan untuk mendapatkan perbandingan yang lebih baik dengan
percobaan infeksi serupa dengan menggunakan HEV dan NIV [18], [35].
Meskipun studi eksperimental infeksi awal ini menunjukkan bahwa
CedPV kurang atau non-patogenik pada spesies ini, adalah mungkin
bahwa CedPV mungkin patogen di host lain, seperti kuda. Kami
berhipotesis bahwa kurangnya protein V dapat berdampak pada
patogenisitas tersebut. Dalam hal ini, itu mendorong untuk
mengamati bahwa infeksi sel manusia dengan CedPV induksi jauh lebih
kuat respon IFN- dari HEV. Studi lebih lanjut diperlukan untuk
membedah mekanisme molekuler yang tepat dari perbedaan yang diamati
ini.
Karena hubungan erat antara CedPV dan HEV, itu penting untuk
menyelidiki kemungkinan co-infeksi oleh kedua virus pada populasi
kelelawar Australia. Berdasarkan deteksi antibodi pada 23% untuk
CedPV, 37% untuk HEV dan 8% untuk kedua, dapat disimpulkan bahwa
tingkat koinfeksi sangat dekat dengan tingkat teoritis 8,5% (produk
dari dua independen tingkat infeksi). Berdasarkan analisis awal ini
terbatas, tampak bahwa infeksi kelelawar per satu henipavirus tidak
mencegah atau meningkatkan kemungkinan infeksi oleh yang lain.
Singkatnya, penemuan henipavirus lain di rubah terbang Australia
menyoroti pentingnya kelelawar sebagai reservoir yang signifikan
dari agen zoonosis potensial dan kebutuhan untuk memperluas
pemahaman kita tentang hubungan virus-kelelawar pada umumnya.
Penelitian masa depan kita akan diarahkan pada menentukan apakah
spill-over dari CedPV ke host lain telah terjadi di masa lalu di
Australia, apakah CedPV adalah patogen dalam host mamalia tertentu,
dan apakah CedPV ada pada populasi kelelawar di wilayah geografis
yang beragam.
Bahan dan metode
Semua penelitian pada hewan telah disetujui oleh Komite Etika
Hewan CSIRO Australia Hewan Laboratorium Kesehatan dan dilakukan
menyusul Kesehatan Nasional Australia dan Medical Research Council
Kode Praktek untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan untuk Keperluan
Ilmiah pedoman untuk perumahan dan perawatan hewan
laboratorium.
Kultur sel
Baris sel yang digunakan penelitian ini adalah Vero (ATCC),
HeLa-USU [22], dan P. baris sel alecto utama berasal dari ginjal
(Paki), otak (PaBr), (limpa) PaSp dan plasenta (PaPl) baru-baru ini
didirikan pada kelompok kami [27]. Sel ditumbuhkan dalam Dulbecco
itu Modifikasi Eagle Medium Nutrient Campuran F-12 Ham dilengkapi
dengan kekuatan ganda antibiotik-antimycotic (Invitrogen), 10 mg /
ml ciprofloxacin (MP Biomedicals) dan 10% serum janin anak sapi
pada suhu 37 C dengan adanya 5% CO2.
Pengumpulan urin dan isolasi virus
Urine (sekitar 0,5-1 ml) dikumpulkan dari lembaran plastik
ditempatkan di bawah koloni rubah terbang (terutama Pteropus alecto
dengan beberapa P. Poliocephalus dalam populasi campuran) di Cedar
Grove, Queensland Tenggara, Australia dan dikumpulkan ke dalam
tabung 2-ml mengandung 0,5 ml media transportasi virus (SPGA:
campuran sukrosa, fosfat, glutamat dan albumin ditambah penisilin,
streptomisin dan Fungizone). Tabung yang disimpan sementara di es
setelah pengumpulan dan diangkut ke laboratorium di Queensland,
dibekukan pada -80 C, dan kemudian dikirim pada es kering ke CSIRO
Australia Hewan Laboratorium Kesehatan (AAHL) di Geelong, Victoria
untuk isolasi virus. Sampel dicairkan pada suhu 4 C dan
disentrifugasi pada 16.000 xg selama 1 menit untuk pelet
puing-puing. Urine di supernatan (sekitar 0,5-1 ml) diencerkan 1:10
dalam media kultur sel. Urin diencerkan kemudian disentrifugasi
pada 1.200 g selama 5 menit dan membagi secara merata di atas Vero,
Paki, PaBr, PaSp dan sel PaPl monolayers di 75-cm2 termos kultur
jaringan. Labu bergoyang selama 2 jam pada suhu 37 C, 14 ml media
kultur sel segar ditambahkan dan kemudian diinkubasi selama 7 hari
pada 37 C. Termos diamati setiap hari untuk toksisitas,
kontaminasi, atau efek sitopatik virus (CPE).
Karakterisasi Molekuler
Sel menunjukkan CPE syncytial disaring menggunakan diterbitkan
primer secara luas reaktif [31] untuk semua paramyxoviruses dikenal
dan subset dari paramyxoviruses. Produk PCR gel diekstrak dan
diklon ke pGEM T-Easy (Promega) untuk memfasilitasi sequencing
menggunakan primer M13. Urutan diperoleh dan selaras dengan urutan
paramyxovirus diketahui memungkinkan untuk klasifikasi awal.
Urutan genom seluruh ditentukan dengan menggunakan kombinasi 454
sekuensing [43] dan Sanger sequencing konvensional. Virion dari
kultur jaringan supernatan dikumpulkan dengan sentrifugasi pada
30.000 xg selama 60 menit dan diresuspensi dalam 140 ml PBS dan
dicampur dengan 560 ml baru dibuat AVL untuk ekstraksi RNA
menggunakan QIAamp Viral RNA Mini kit (Qiagen). Sintesis cDNA dan
amplifikasi acak dilakukan dengan menggunakan modifikasi dari
prosedur yang diterbitkan [44]. Secara singkat, cDNA sintesis
dilakukan dengan menggunakan octomer terkait acak ke 17-mer
ditentukan urutan primer: (5'-GTTTCCCAGTAGGTCTCNNN NNNNN-3 ') dan
superscript III reverse transcriptase (Invitrogen). 8 ml ds-cDNA
diamplifikasi di 200 ml PCR reaksi dengan panas mulai enzim Taq
polymerase (Promega) dan 5'-A * G * C * A * C
TGTAGGTTTCCCAGTAGGTCTC-3 '(di mana * menunjukkan modifikasi tiol)
sebagai primer amplifikasi untuk 40 siklus 95 C / 1 menit, 48 C / 1
menit, 72 C / 1 menit setelah langkah denaturasi awal 5 menit pada
95 C dan diikuti oleh pemurnian dengan QIAquick PCR pemurnian kit
(Qiagen). Persiapan sampel untuk Roche 454 sequencing (454 Life
Sciences Branford, CT, USA) telah sesuai dengan manual seri
Titanium mereka, cepat Perpustakaan Persiapan dan emPCR Lib-L
SV.
Untuk mendapatkan urutan genom CedPV akurat, 454 dihasilkan data
(setelah menghapus urutan kualitas rendah, ambigu dan adaptor)
dianalisis dengan baik de novo perakitan dan membaca pemetaan baku
membaca ke urutan genom CedPV rancangan berasal dari Sanger
sequencing. Untuk 454 baca pemetaan, SNPs dan DIP dihasilkan dengan
software CLC secara manual dinilai untuk akurasi dengan
memvisualisasikan baku dipetakan membaca (kesalahan PCR acak yang
jelas dibandingkan dengan SNP nyata dan DIP terutama ketika cakupan
baca mendalam). Urutan konsensus untuk kedua 454 de novo dan
membaca metode perakitan pemetaan tersebut kemudian dibandingkan
dengan urutan Sanger dengan yang terakhir digunakan untuk
menyelesaikan konflik dalam wilayah cakupan rendah serta untuk
menyelesaikan 454 kesalahan homopolimer.
Urutan genom termini ditentukan oleh 3'dan 5'-RACE menggunakan
protokol yang sebelumnya diterbitkan oleh kelompok kami [45].
Secara singkat, sekitar 100 ng RNA diligasi dengan adaptor DT88
(lihat referensi untuk informasi urutan) menggunakan T4 ligase RNA
(Promega) diikuti oleh sintesis cDNA menggunakan kit superscript
III RT (Invitrogen) dan primer adaptor khusus, DT89. PCR
amplifikasi kemudian dilakukan dengan menggunakan DT89 dan satu
atau lebih primer-genom tertentu. Produk PCR disekuensing langsung
baik menggunakan DT89 atau genom primer spesifik dengan layanan
kelompok-rumah di ABI Sequencer 3100.Analisis urutan
CLC Genomics Workbench v4.5.1 (CLC Inc, Aarhus, Denmark)
digunakan untuk memangkas 454 adaptor dan cDNA / PCR urutan primer,
untuk menghilangkan kualitas rendah, ambigu dan kecil membaca
