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ABSORPTIONSPHOTOMETRIE
Biophysik Vorlesung
29.01.2015., PTE
Gábor Talián
ENTWURF
• Strahlungen und Wechseleirkungen
• Energieniveaus der Moleküle
• Spektroskopische Methoden, Überblick
• Absorption
STRAHLUNGEN
Ausbreitung der Energie in Raum durch fortschreitende Bewegung von Teilchen oder Wellen
Strahlungsquelle Strahlung bestrahlterKörper
ENERGIE
Teilchen: α-, β-Strahlung
Elektromagnetisch
Mechanisch: Schall
Ionisierend: Teilchenstrahlung, UV, Röntgen, γ-Strahlung
Nonionisierend:LichtRadio-, MikrowellenSchall
isotrop anisotrop
∆� � � ∙∆�
4 ∙ � ∙ �
� �Δ�
����
spezifische Ausstrahlung (M)und Bestahlungsstärke (Eein)
� �Δ�
�� ����
�� ��
Δ�Strahlungsfluss
1m2
Strahlungsflussdichte �� �∆��
∆�
LICHT = ELEKTROMAGNETISCHE WELLE
Doppelnatur: Welle (Ausbreitung) Teilchen (Wehselwirkung)
Lichtquant: E=h·ν
WECHSELWIRKUNGEN
Absorption
Transmission - Durchlässigkeit
Streuung
Reflexion
S0
S3
S2
S1
S0
S3
S2
S1
v0
v1
v2
v3
Aleksander Jabłoński (1898-1980)
S0
S3
S2
S1
S0
S3
S2
S1
S0
S3
S2
S1
v0
v1
v2
v3
S0
S3
S2
S1
v0
v1
v2
v3
• I0 : Einfallende Lichtintensität
• Ia : Absorbierte Lichtintensität
• It : Transmittierte (ausfallende) Lichtintensität (=Id)
• x: Schichtdicke
Δx
I0 (λ)
I(λ)
I0 (λ)
I1(λ)
Δx1
x
� � � ∙ ∆�
I0 (λ)
I1(λ)
Δx1
∆�~�
∆�~�
∆�~�
∆�� � −� ∙ ∆�� ∙ ��ΔI1
∆�� � �� − ��
�� � �� + ∆�� � �� − � ∙ ∆�� ∙ �� � ���1 − � ∙ ∆���
�∆� � �!"# − �����
�� � ���1 − � ∙ ∆���
Δx1 = Δx2 = Δx3 = Δx4 = Δx5
I0 I1I2
I3I4
I5
�� � ���1 − � ∙ ∆���
� � �� 1 − � ∙ ∆� � �� 1 − � ∙ ∆�� ∙ 1 − � ∙ ∆�� � �� ∙ �1 − � ∙ ∆���
�$ � � 1 − � ∙ ∆�$ = �� ∙ (1 − � ∙ ∆��) ∙ 1 − � ∙ ∆�� = �� ∙ (1 − � ∙ ∆��)
$
�% = �$ 1 − � ∙ ∆�% = �� ∙ (1 − � ∙ ∆��) $∙ 1 − � ∙ ∆�� = �� ∙ (1 − � ∙ ∆��)
%
&' = �()� 1 − � ∙ ∆�( = �� ∙ (1 − � ∙ ∆��) ()�
∙ 1 − � ∙ ∆�� = &* ∙ (+ − , ∙ ∆-+) '
&' � �()� 1 − � ∙ ∆�� = �� ∙ (1 − � ∙ ∆��) ()�
∙ 1 − � ∙ ∆�� = &* ∙ (+ − , ∙ ∆-+) '
∆�( = −� ∙ ∆�� ∙ �()� −� ∙ ∆�� =∆�(
�()�= −
1
.Maß der Abnahme
�( � �� ∙ 1 − � ∙ ∆�� (� �� ∙ 1 −
1
.
(
= �� ∙ 1 −1
.
/∙!∙0
= �� ∙ 1 −1
.
! 0∙/
� =�
∆��
1
∆��= . ∙ � � = � ∙ . ∙ �
wenn ∆�� → 0 denn . → ∞ 1 −1
.
!
→ 1
4≈ 0,3679
&' = & = &* ∙ ;),∙-
das Lambert-Beersche Gesetz:
&< � &* ∙ ;),∙- • I0 : Einfallende Lichtintensität
• Ia : Absorbierte Lichtintensität
• It : Transmittierte (ausfallende) Lichtintensität
• x: Schichtdicke
• µ: Schwächungskoeffizient
&< � &* ∙ =)
--+/=
x1/2: Halbwertsdicke
wenn � � ��/
�? � �� ∙ 2)� �
1
2��
4)0∙/ � 2)
//A/B
�� ∙ � � CD2)
//A/B � �
�
��/∙ ln2
, ∙ -+/= � GH=
• I0 : Einfallende Lichtintensität
• Ia : Absorbierte Lichtintensität
• It : Transmittierte (ausfallende) Lichtintensität
• x: Schichtdicke
• µ: Schwächungskoeffizient
• c: Konzentration (mol/l; mg/ml)
• ε(λ): Extinktionskoeffizient
& � &* ∙ ;),∙-
& � &* ∙ +*)I(J)∙K∙-
molarer Extinktionskoeffizient:
Massenextinktionskoeffizient:
LM$
MNC ∙ OM
MC
MP ∙ OM �
OM$
MP ∙ OM�OM
MP
& � &* ∙ +*)I(J)∙K∙-
&
&*� +*)I(J)∙K∙-
GQ&*
&� I(J) ∙ K ∙ -
Transmittanz
Absorbanz / Extinktion / optische Densität (OD)
• Additiv• Linear proportional mit Konzentration
(in dünnen Lösungen)
Absorptionsspektrum
Frauhofer-Linien der Sonne
Einstrahlphotometer
Zweistrahlphotometer
Küvette
260 280 300 320 340 360 380 4000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Absorp
tio
n
Wellenlänge (nm)
Absorptionsspektrum von Pyren-Aktin
�R� � 0,415�$%% = 0,263T R� = 0,63MC
MP ∙ OMT $%%= 0,0222
LM$
MNC ∙ OM
�R�,(UVV�W��V? = �R� − 0,127 ∙ �$%% = 0,415 − 0,127 ∙ 0,263 = 0,382
OY(?�� =�R�,(UVV
TR� ∙ �=
0,382
0,63MC
MP ∙ OM∙ 1OM
= 0,606MP
MC→ 14,13�
OZ[V�� =�$%%
T $%% ∙ �=
0,263
0,0222LM$
MNC ∙ OM∙ 1OM
= 11,85�
�V = 42.900P
MNC
�.��]4�^DP_P�.L =11,85�
14,13�∙ 100 = 83,86%
A290
A344
ZUSAMMENFASSUNG
• Strahlungen, Strahlungsintensität
• Anregungs-, Vibrations- und Rotationsniveaus von Elektronenenergie in Molekülen
• Spektroskopische Methoden passen sich auf den Energiebereich der Teilchen-Strahlung Wechselwirkung an
• Lichtabsorption in dünnen Lösungen:das Lambert-Beersche Gesetz
• Absorptionskoeffizient, Halbwertsdicke
• Absorbanz, Absorptionsspektrum
• Spektrophotometer
& = &* ∙ +*)I(J)∙K∙-
Danke für Ihre Aufmerksamkeit!