Actividad antifúngica de extractos de macroalgas marinas de la costa de … · 2019-02-26 · Este trabajo se llevó a cabo en la Unidad de Biotecnología del Centro de Investigación

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

Posgrado en Ciencias Biológicas

Actividad antifúngica de extractos de macroalgas

marinas de la costa de Yucatán

Tesis que presenta

MAURICIO GÓMEZ HERNÁNDEZ

En opción al título de

MAESTRO EN CIENCIAS

(Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología)

Mérida, Yucatán, México

2018

DECLARACIÓN DE PROPIEDAD

Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos

Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las

actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó

para desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro

de Investigación Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en

contraprestación de los servicios educativos o de apoyo que me fueron

brindados, dicha información, en términos de la Ley Federal del Derecho de

Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, le pertenece patrimonialmente a dicho

Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya manifestado,

reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos

tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha

información, le pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación

Científica de Yucatán, A.C., y en el mismo tenor, reconozco que si derivaren de

este trabajo productos intelectuales o desarrollos tecnológicos, en lo especial,

estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley Federal del Derecho

de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo expuesto en la

presente Declaración.

Firma: ________________________________

Biól. Mar. Mauricio Gómez Hernández

Este trabajo se llevó a cabo en la Unidad de Biotecnología del Centro de Investigación

Científica de Yucatán, y forma parte del proyecto titulado “Actividad antifúngica de

extractos de macroalgas marinas de la costa de Yucatán”, bajo la dirección de la Dra.

Cecilia Mónica Rodríguez García.

AGRADECIMIENTOS

A CONACYT, por la beca otorgada # 612342.

Al CICY, por las instalaciones y el apoyo brindado para realizar este trabajo.

A la Dra. Cecilia Mónica Rodríguez García, por su asesoría académica, sabios consejos,

paciencia y dedicación en la revisión de mis documentos y trabajo en el laboratorio, que me

permitieron desarrollarme profesionalmente.

A la M.C. Leticia Peraza Echeverría, por su asesoría académica, sabios consejos, paciencia y

dedicación en mi capacitación en el trabajo de laboratorio y revisión de mis documentos.

Al M.C. Luis W. Torres Tapia, por su apoyo técnico en diversos experimentos relacionados

con la extracción orgánica y la cromatografía líquida de alta resolución.

A la Biól. Silvia Hernández Aguilar, por su apoyo en el herbario.

A la Dra. Ileana Ortegón Aznar, por la identificación de las especies de macroalgas marinas.

A los compañeros de laboratorio, por sus consejos y buenos deseos.

Al comité tutorial conformado por la Dra. Cecilia Mónica Rodríguez García, Dr. Sergio Rubén

Peraza Sánchez, Dr. Ignacio Rodrigo Islas Flores, Dra. Elizabeth Ortiz Vázquez y Dra.

Alejandra Prieto Davó, por sus asesorías, correcciones, consejos y conocimientos que me

permitieron crecer de manera profesional y personal.

DEDICATORIA

A Dios por cuidarme, protegerme y enseñarme el camino.

A mi esposa Guadalupe Dayre Catzim Uc, por sus consejos, dedicación, amor y sobre todo por acompañarme en este viaje que es la vida.

A mis hijas Yoshy y Cami que, a pesar del poco tiempo que estuvieron, muy pronto volverán.

A mi abuela María Cristina Hernández Vásquez, por ser mi primera maestra, por sus cuidados y cariño.

Y a mi madre Fe Gómez Hernández, por su motivación y fuerza.

Índice

i

ÍNDICE

Índice …………………………………………………………………………………...……………………. i

Listado de abreviaturas …………………………….……………..……………………………………… v

Índice de figuras ………………….……………………………………………………………………….. vi

Índice de cuadros ………………….……………………………………………………………………… viii

Resumen

Abstract

INTRODUCCIÓN …………………………………………………………………………………………. 1

CAPÍTULO I

ANTECEDENTES

1.1. La importancia de la agricultura en México ……………………………………………..………. 3

1.1.1. Principales productos agrícolas ………………………………………………………………… 4

1.1.2. Derrama económica de la agricultura …………………………………………………………… 5

1.2. Riesgos que afectan a la agricultura en México ………………………………………………….

. 6

1.2.1. Riesgos abióticos y costos económicos ……………………………………………………….. 6

1.2.2. Riesgos bióticos y costos económicos …………………………………………………………. 6

1.3. Hongos fitopatógenos ……………………………………………………………………………… 7

1.4. Pseudocercospora fijiensis Morelet ………………………………………………………………. 8

1.4.1. Ciclo de vida ……………………………………………………………………………………….. 8

1.4.2. Patogenia …………………………………………………………………………………………. 9

1.4.3. Control …………………………………………………………………………………………….. 10

1.4.4. Daños económicos ……………………………………………………………………………….. 10

1.5. Fusarium oxysporum Schlechtendal ………………………………………………………………. 11

1.5.1. Ciclo de vida ……………………………………………………………………………………….. 11

1.5.2. Patogenia …………………………………………………………………………………………. 12

1.5.3. Control …………………………………………………………………………………………….. 12


1.6. Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Penz. y Sacc. ………………………………………….. 13

1.6.1. Ciclo de vida ……………………………………………………………………………………….. 13

1.6.2. Patogenia …………………………………………………………………………………………. 14

1.6.3. Control …………………………………………………………………………………………….. 14


1.7. Los fungicidas sintéticos ……………………………………………………………………………. 15

1.7.1. Fungicidas de contacto y sistémicos …………………………………………………………… 16

1.7.2. Afectaciones causadas por la aplicación de fungicidas ……………………………………… 16

1.7.3. Alternativas a los fungicidas sintéticos …………………………………………………………. 17

1.8. Las macroalgas marinas ……………………………………………………………………………. 18

Índice

ii

1.8.1. Distribución ……………………………………………………………………………………….. 19

1.8.2. Aprovechamiento de macroalgas marinas ……………………………………………………... 20

1.8.3. Metabolitos de macroalgas marinas …………………………………………………………….. 21

1.8.4. Actividad antifúngica de macroalgas marinas …………………………………………………. 21

1.8.5. Estudios de macroalgas marinas contra fitopatógenos ……………………………………… 21

1.8.6 Macroalgas marinas en Yucatán y su potencial aprovechamiento …………………………... 23

1.8.7. Los arribazones de macroalgas marinas ……………………………………………………….. 24

1.8.8. Estudios sobre arribazones ……………………………………………………………………… 24

JUSTIFICACIÓN …………………………………………………………………………………………. 27

HIPÓTESIS ………………………………………………………………………………………………. 28

OBJETIVO GENERAL …………………………………………………………………………………. 29

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ……………………………………………………………………………. 29

ESTRATEGIA DE INVESTIGACIÓN …………………………………………………………………... 30

CAPÍTULO II

ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE EXTRACTOS CRUDOS ACUOSOS, FRACCIONES ORGÁNICAS

Y PARTE PROTEICA DE LAS MACROALGAS MARINAS

2.1. MATERIALES Y MÉTODOS ……………………………………………………………………… 32

2.1.1. Material algal …………………………………………………………………………………….. 32

2.1.2. Preparación e identificación de macroalgas …………………………………………………… 32

2.1.3. Preparación de las muestras para la obtención de extractos crudos acuosos (ECA’s) ……. 33

2.1.4. Métodos de elaboración de ECA’s ……………………………………………………………… 34

2.1.5. Bioensayo de actividad antifúngica de los ECA’s …………………………………………….. 35

2.1.6. Extracción orgánica y fraccionamiento de las macroalgas marinas con actividad antifúngica 36

2.1.7. Bioensayo de actividad antifúngica de las fracciones orgánicas ……………………………. 36

2.1.8. Extracción de proteína de los ECA’s de las macroalgas mediante ultrafiltración …………. 37

2.1.9. Cuantificación mediante el método de Bradford de la proteína de los ECA’s con actividad

antifúngica ………………………………………………………………………………………………..

37

2.1.10. Análisis de los ECA’s con actividad antifúngica mediante cromatografía líquida de alta

resolución (CLAR) y cromatografía en capa delgada (CCD) ……………………………………….

38

2.1.11. Determinación de la actividad antifúngica de los ECA’s utilizando el método de Alamar

Blue ………………………………………………………………………………………………………..

39

2.1.12. Análisis de toxicidad de los ECA’s en camarones de salmuera (Artemia salina) ………... 40

2.13. RESULTADOS …………………………………………………………………………………….. 41

2.14. Material algal ……………………………………………………………………………………… 41

2.15. Elección del método de elaboración de ECA’s ………………………………………………… 44

2.16. Bioensayo de actividad antifúngica del ECA de Halymenia floresii …………………………. 45

2.17. Análisis de toxicidad del ECA de H. floresii ……………………………………………………... 47

Índice

iii

2.17.1. Análisis de toxicidad del ECA de H. floresii en camarones de salmuera (Artemia salina) ... 48

2.17.2. Análisis de toxicidad en lombriz de tierra (Eisenia foetida) …………………………………... 48

2.18. Análisis del ECA de H. floresii mediante cromatografía en capa delgada (CCD) …………. 48

2.19. Análisis del ECA de H. floresii mediante cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) …. 49

2.20. Determinación de la actividad antifúngica del ECA de H. floresii mediante el método de

Alamar Blue ………………………………………………………………………………………………

52

2.21. Extracción de fracciones orgánicas de H. floresii y bioensayo de actividad antifúngica..…... 54

2.22. Bioensayo de actividad antifúngica de la parte proteíca del ECA de H. floresii ……………. 55

2.23. Perfil proteico de H. floresii ………………………………………………………………………. 58

2.24. DISCUSIÓN ………………………………………………………………………………………... 60

CAPÍTULO III

CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

3.1. CONCLUSIONES …………………………………………………………………………………. 66

3.2. PERSPECTIVAS Y RECOMENDACIONES ……………………………………………………… 67

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS …………………………………………………………………….. 68

ANEXOS ………………………………………………………………………………………………….. 85

Índice

iv

Listado de abreviaturas

v

Listado de abreviaturas

AB Alamar Blue

CCD Cromatografía de capa delgada

CLAR Cromatografía líquida de alta resolución

ECA Extracto crudo acuoso

mAU Miliunidades de absorbancia

µL Microlitros

µm Micrómetros

nm Nanómetros

p/v Peso/volumen

PDA Papa dextrosa agar

PDB Caldo de papa dextrosa

SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio

ton Toneladas

Índice de figuras

vi

ÍNDICE DE FIGURAS CAPÍTULO I

Figura 1.1. Promedio anual de superficie sembrada y cosechada en México en el año 2015

(SIAP, 2017) …………………………………………………………………………………………………

4

Figura 1.2. Producción agrícola en México en el año 2015 (SIAP, 2017) ……………….................... 5

Figura 1.3. Principales productos agrícolas mexicanos y su valor económico en el año 2015

(SIAP, 2017) ………………………………………………………………………………………..............

5

Figura 1.4. Ciclo de vida de Pseudocercospora fijiensis en plantas de banano (Manzo-Sánchez et

al.,2005) ………………………………………………………………………………….…..

9

Figura 1.5. Estadios de la Sigatoka negra en hojas de banano.1), pizca; 2) y 3), estrías; 4), 5) y 6),

manchas (Fouré, 1997) …………………………….………………………........................................

10

Figura 1.6. Ciclo de vida de Fusarium oxysporum (Grimaldo, 2016) ………………………………. 12

Figura 1.7. Ciclo de vida de Colletotrichum gloeosporioides y Giberella cingulata (Agrios, 2002). 14

Figura 1.8. Modo de acción de los fungicidas en las plantas: a) de contacto y b) sistémicos

(Pérez y Forbes, 2014) ……………………………………………………………………………………

16

Figura 1.9. Divisiones de las algas marinas: a) Rhodophyta, b) Ochrophyta, c) Chlorophyta ……. 19

Figura 1.10. Mapa de distribución de macroalgas marinas en el mundo (Kerswell, 2006)

…………………………………………………………………………………………………………………..

19

Figura 1.11. Arribazón de algas en la costa de Sisal, Yucatán (16 enero del 2017) ………………. 24

Figura 1.12. Proceso de secado de macroalgas marinas ……………………………………........... 33

Figura 1.13. Estrategia experimental de tres métodos de elaboración de ECA’s …………….…… 35

CAPÍTULO II

Figura 2.1. Espécimen de Halymenia floresii con las características representativas de la especie

………………………………………………………………………………………………………………….

41

Figura 2.2. Espécimen de Agardhiella subulata con las características representativas de la

especie ……………………………………………………………………………………………………….

42

Figura 2.3. Espécimen de Codium isthmocladum con las características representativas de la

especie ...............................................................................................................................................

42

Figura 2.4. Espécimen de Dictyota dichotoma con las características representativas de la especie

…………………………………………………………………………………………………………………..

43

Figura 2.5. Espécimen de Bryothamnion triquetrum con las características representativas de la

especie ……………………………………………………………………..............................................

43

Figura 2.6. Crecimiento del micelio de los hongos (C. gloeosporioides y F. oxysporum ) tratados

con el ECA de H. floresii a 30 días de inoculación ……………………………………………………..

45

Figura 2.7. Inhibición del crecimiento micelial de P. fijiensis ocasionado por el extracto acuoso de

Índice de figuras

vii

H. floresii ………………………………………………………………………………………….............. 46

Figura 2.8. Conidios de P. fijiensis sin crecimiento micelial ocasionado por el ECA de H. floresii

…………………………………………………………………………………………………........................

47

Figura 2.9. Cromatograma en capa delgada (CCD) del ECA (1), parte proteica (2) y no proteica (3)

de H. floresii con actividad antifúngica ……………………………………………...............................

49

Figura 2.10. Cromatogramas del extracto crudo acuoso de H. floresii a 214nm …………….......... 50

Figura 2.10. Continuación Cromatogramas del extracto crudo acuoso de H. floresii a 214nm …… 51

Figura 2.11. Curva de reducción de resazurina-resorufina ……………………………….................. 52

Figura 2.12. Reducción de resazurina-resorufina del ECA de H. floresii ……………………………. 53

Figura 2.13. Inhibición del ECA de H. floresii (27.27 mg/mL) sobre conidios de P. fijiensis ………. 53

Figura 2.14. Conidios germinados al inicio del experimento …………………………………............ 56

Figura 2.15. Conidios de P. fijiensis sin crecimiento micelial ocasionado por la parte proteica del

ECA de H. floresii ……………………………………………………………………………...................

56

Figura 2.16. Inhibición del crecimiento micelial de P. fijiensis ocasionado por la parte proteica del

ECA de H. floresii …………………………………………………………………………………………..

57

Figura 2.17. Conidios de P. fijiensis sin crecimiento micelial ocasionado por la parte proteica del

ECA de H. floresii ………………………………………………………………………………................

57

Figura 2.18. Crecimiento micelial de P. fijiensis que indica ausencia de actividad antifúngica de la

parte no proteica del ECA de H. floresii …………………………………………………………………

58

Figura 2.19. Perfil proteico de los ECA’s de H. floresii ………………………………………………... 59

Índice de cuadros

viii

ÍNDICE DE CUADROS

CAPÍTULO

Cuadro 1.1. Fungicidas sintéticos, nombres comunes, grupo químico al que pertenecen y

mecanismo de acción …………………………………………………………………………………

15

Cuadro 1.2. Bioplaguicidas en el mercado …………………………………………………………. 18

Cuadro 1.3. Estudios sobre actividad antifúngica de macroalgas marinas …………………….. 22

CAPÍTULO II

Cuadro 2.4. Condiciones del gradiente de elución utilizado para obtención del perfil

cromatográfico del extracto crudo acuoso de H. floresii …………………………………………..

38

Cuadro 2.5. Biomasa colectada de algas marinas, peso húmedo colectado, peso seco y

porcentaje de peso seco ………………………………………………………………………………

44

Cuadro 2.6. Material obtenido de las fracciones orgánicas de H. floresii ………………………… 54

Cuadro 2.7. Rendimiento de las fracciones orgánicas de C. isthmocladum …………………….. 55

Resumen

RESUMEN

Los hongos fitopatógenos son responsables de pérdidas económicas enormes en la

agricultura debido a su gran diversidad y adaptabilidad. Para su control se utilizan

principalmente fungicidas sintéticos, pero ocasionan un impacto negativo en el

ambiente y la salud, por lo cual es necesario la búsqueda de nuevos compuestos y el

desarrollo de productos alternativos de control que tengan baja toxicidad y sean

efectivos. En este trabajo se evaluó la actividad antifúngica de extractos de

macroalgas marinas contra fitopatógenos como Pseudocercospora fijiensis,

Colletotrichum gloeosporioides y Fusarium oxysporum.

Dado su bajo costo, fácil acceso y abundancia, se identificaron y obtuvieron extractos

acuosos de las macroalgas marinas Halymenia floresii, Agardhiella subulata, Codium

isthmocladum, Dictyota dichotoma y Bryothamnion triquetrum colectadas de

arribazones de la zona costera de Dzilam de Bravo y Sisal, Yucatán. Únicamente el

ECA de H. floresii en concentraciones de 27.27 y 13.72 mg/mL presentó actividad

inhibitoria sobre el crecimiento del hongo P. fijiensis durante 30 días. Además, el ECA

de H. floresii no presentó actividad tóxica sobre Artemia salina y Eisenia foetida. El

análisis por cromatografía líquida de alta resolución del ECA de H. floresii presentó

tres picos mayoritarios en los tiempos de retención 1.633, 23.047 y 23.900 con un

máximo de absorbancia de 319, 270 y 265 mAU y un área bajo la curva de 10.06,

12.28 y 10.74%, respectivamente, y 20 picos minoritarios. Una prueba colorimétrica

usando el reactivo resazurina para determinar la viabilidad de P. fijiensis después del

tratamiento con el ECA de H. floresii mostró una reducción del 47.32% en la viabilidad

y una actividad inhibitoria de la germinación de los conidios de P. fijiensis del 58.64%

confirmando la actividad antifúngica del ECA de H. floresii. La evaluación de las

fracciones órganicas de H. floresii no mostraron actividad antifúngica; sin embargo, la

parte proteica del ECA de H. floresii fue activa contra P. fijiensis en concentraciones de

0.625, 1.25, 2.5 y 5 ng/µL a 30 días, indicando que el posible origen de la actividad

antifúngica del ECA de H. floresii sea de naturaleza proteica o peptídica.

ABSTRACT

Fungi are phytopathogens responsible for the economic losses in the agriculture.

Farmers use mainly synthetic fungicides for there control, but they cause a negative

impact on the environment and health. It is necessary to search for innovative

compounds and the development of alternative products with low toxicity and efficacy.

Aqueous extracts of marine macroalgae collected from the coastal zone of Dzilam de

Bravo and Sisal, Yucatán (Halymenia floresii, Agardhiella subulata, Codium

isthmocladum, Dictyota dichotoma, and Bryothamnion triquetrum) were obtained. Only

the aqueous crude extracts of H. floresii presented inhibitory activity on the growth of

the fungus P. fijiensis at 27.27 and 13.72 mg/mL during 30 days. The toxicity analysis

was carried out in Artemia salina and Eisenia foetida, where the ECA of H. floresii

showed no toxic activity at the evaluated settings. To know the richness of the

compounds present in the ECA of H. floresii, a high-resolution liquid chromatography

was performed, which showed three large peaks at the retention times of 1.633, 23.047

and 23.900 with a maximum absorbance of 319, 270 and 265 mAU and an area under

the curve of 10.06, 12.28, and 10.74%, respectively, and 20 minority peaks. A

colorimetric test was also carried out using the reagent Alamar Blue to determine the

viability of P. fijiensis fungi after treatment with the ECA of H. floresii, where a reduction

percentage of 47.32% and an inhibitory activity on the conidia of P. fijiensis of 58.64%

were obtained, confirming the antifungal activity of H. floresii. The activity of the general

fractions was also evaluated; however, the antifungal activity was not present. The

protein part of the ECA of H. floresii was active against P. fijiensis at 0.625, 1.25, 2.5

and 5.0 ng/μL at 30 days, indicating that the possible origin of the antifungal activity of

the ECA of H. floresii, could be either proteinic or peptidic.

Introducción

1

INTRODUCCIÓN

Los fertilizantes y plaguicidas en la agricultura han incrementado los rendimientos de

las cosechas y en cierta medida han contribuido al control de patógenos como

bacterias, virus, insectos y hongos (SAGARPA, 2015), los cuales causan cuantiosas

pérdidas económicas y biológicas (Agrios, 2005).

El uso excesivo de fertilizantes y plaguicidas sintéticos ocasiona efectos adversos

sobre el medio ambiente, e.g., contaminación del suelo, agua, aire y daños a la salud

dado que se han reportado casos de cáncer de piel en la población involucrada en el

proceso de cultivo de banano, tal es el caso de Ecuador (Arce, 2015 citado por Lizardo

y Montiel, 2016), además algunos hongos patógenos han desarrollado resistencia a

los fungicidas (revisado por Hahn, 2014).

Se han reportado compuestos alternativos a los fungicidas sintéticos como el yodo (I)

que ha permitido el control de las especies Rhizoctonia y Gaeumannomyces en arroz

a dosis de 0.75 L/ ha (8.4 g/L de yodo libre) (Rivas y Sael, 2017), nanopartículas de

cobre contra Cladosporium herbarum (Cu) (Alta y Pastrana, 2017), extractos acuosos,

orgánicos, polvos, aceites esenciales y metabolitos secundarios de plantas superiores

como eucalipto, neem (Alfonso, 2002 citado por Nava-Pérez et al., 2012), clavo,

orégano, epazote, albahaca, tomillo y yerbabuena (Montes y Carvajal, 1999 citado por

Montes et al., 2000), microorganismos como levaduras y bacterias (Riviera-Méndez et

al., 2016) o de origen marino como extractos proteicos de macroalgas como Hypnea

musciformis contra Colletotrichum lindemunthianum (Melo et al., 1997), metabolitos

secundarios como terpenos de Stypopodium zonale, Laurencia dendroidea, Pelvetia

canaliculata, Sargassum muticum, Ascophyllum nodosum y Fucus spiralis que afectan

al hongo fitopatógeno Colletotrichum lagenarium que provoca antracnosis en las

cucurbitáceas (Peres et al., 2012).

Diversos extractos de macroalgas han mostrado actividad inhibitoria contra Botrytis

cinerea (Selim et al., 2015; Jiménez et al., 2011), Verticillium spp, Rhizoctonia solani

(Barreto et al., 1997), Fusarium solani, F. oxysporum, Sclerotinia sclerotiorum (Kulik,

1995), Alternaria solani (Chanthini et al., 2012), Cladosporium cladosporioides, C.

sphaerospermum, (De Felício et al., 2010), Pestalotiopsis theae y Hypoxylon serepens

(Samanta, 2011).

Introducción

2

Se ha reportado actividad antifúngica en especies de macroalgas verdes como

Codium iyengarii contra Fusarium solani (Sultana et al., 2005) y en extractos orgánicos

de Ulva lactuca, Caulerpa sertularioides, Padina gymnospora y Sargassum liebmanni

contra Alternaria solani (Hernández et al., 2014). Por tal motivo las macroalgas

marinas son una fuente de compuestos con actividad antifúngica y su uso en la

agricultura es una alternativa a los fungicidas sintéticos.

Las macroalgas marinas de arribazones en la costa yucateca son recursos

abundantes y de fácil acceso, por lo cual son una fuente potencial de compuestos para

la investigación y desarrollo de productos biotecnológicos que permitan disminuir el

uso de plaguicidas sintéticos en la región. El presente estudio se enfoca en la

evaluación del potencial de actividad antifúngica de extractos de macroalgas marinas

de arribazones de la zona costera de Yucatán contra hongos fitopatógenos de cultivos

de importancia comercial.

Capítulo I

3

CAPÍTULO I

1.- ANTECEDENTES

1.1. La importancia de la agricultura en México

La agricultura se originó independientemente en al menos seis regiones tropicales y

subtropicales del planeta, entre los años 11,000 y 5,000 a.C. (Smith, 1998 citado por

Smith, 2005). Entre las cuales se encuentra Mesoamérica (actualmente Guatemala,

Belice, Honduras, El Salvador, Costa Rica, Nicaragua y el centro-sur de México).

Los valles de Tehuacán en Puebla y la cuenca del Balsas, en el centro de México se

consideran como lugares que dieron origen a la domesticación y cultivo de especies

vegetales como el maíz (Zea mays), frijol (Phaseolus vulgaris), chiles (Capsicum spp)

y tomates (Solanum lycopersicum) (Zizumbo-Villarreal, 2010). La agricultura se

convirtió en un componente fundamental para el sustento y desarrollo de las urbes

prehispánicas (De Tapia, 2000).

La agricultura en la época colonial se enfocó a satisfacer las necesidades de la

población minera, durante los siglos XVII y XVIII se convirtió en la principal actividad

económica, cultivándose especies como el tabaco, cacao, algodón y maíz (Domínguez

y Carrillo, 2010). En dicho período los españoles introdujeron nuevos cultivos como

arroz, lentejas, manzanas, melocotones y peras (Vargas, 2012 citado por Román et

al., 2013).

En México, aproximadamente 5.5 millones de personas se encuentran ocupadas en

actividades agrícolas, de las cuales el 56% son agricultores y el 44% son jornaleros o

peones, siendo los estados de Chiapas, Guerrero, Michoacán, Oaxaca, Puebla y

Veracruz los que tienen mayor población dedicada a las actividades agrícolas (INEGI,

2016). En México, la diversidad de cultivos ha posicionado al país en el doceavo lugar

en el mundo y el tercero en Latinoamérica, en cuanto a producción agroalimentaria

(SAGARPA, 2016).

Capítulo I

4

1.1.1. Principales productos agrícolas

En México se cultivan 22,148,245 hectáreas, con una producción aproximada de 250.1

millones de toneladas de productos agrícolas. México es el primer productor a nivel

mundial de aguacate (Persea americana) con cerca de 1,644,225.86 ton siendo

Michoacán el principal estado productor con cerca de 1,283,313.29 ton. México ocupa

también el segundo puesto a nivel mundial en cultivo de chile verde (Capsicum

annuum) con 2,782,340 ton, con Sinaloa a la cabeza de producción con 601,736 ton y

limón (Citrus × limón) con 2,326,068 ton siendo Veracruz productor de 42,885 ton. Con

respecto al maíz, base de la alimentación, México ocupa el séptimo lugar a nivel

mundial en producción con 24,694,046.25 toneladas (SIAP, 2017). En la Figura 1.1 se

indican las hectáreas (ha) sembradas y cosechadas por estado. En la Figura 1.2 se

observa la producción en toneladas de los principales productos agrícolas.

Figura 1.1. Promedio anual de superficie sembrada y cosechada en México en el

año 2015. Los estados de Chiapas, Jalisco, Michoacán, Tamaulipas, Oaxaca y

Veracruz encabezan la lista de mayor superficie sembrada y cosechada (SIAP,

2017).

Capítulo I

5

Figura 1.2. Producción agrícola en México en el año 2015 (SIAP, 2017).

1.1.2. Derrama económica de la agricultura

Las actividades agrícolas contribuyen con aproximadamente el 4% del producto

interno bruto (PIB) del país con un valor de 451,766 millones de pesos (INEGI, 2016).

El valor de las exportaciones agroalimentarias mexicanas alcanza 10,217 millones de

dólares, siendo Estados Unidos y Japón los principales mercados consumidores

(SAGARPA, 2015). El maíz representa una derrama económica de cerca de

$84,523,647, seguido por la caña de azúcar con $26,673,949 y el chile verde con

$22,585,487. En la Figura 1.3 se observan los principales productos agrícolas

producidos en México y el valor de la producción en pesos.

Figura 1.3. Principales productos agrícolas mexicanos y su valor económico en el

año 2015 (SIAP, 2017).

Capítulo I

6

1.2. Riesgos que afectan a la agricultura en México

En México existe el Programa de Agricultura Sostenible y Reconversión Productiva en

Zonas de Siniestralidad Recurrente (PIASRE) dedicado a fomentar, con un carácter

preventivo y en función de las condiciones agroecológicas, el desarrollo sustentable en

regiones y zonas frecuentemente afectadas por fenómenos adversos que inciden en

una disminución de la productividad. Este menciona que existen fenómenos

ambientales (abióticos) que afectan a la agricultura como son: las sequías, huracanes,

tormentas, granizadas y heladas, otros riesgos (bióticos) son los virus, bacterias,

insectos y hongos que pueden provocar pérdidas económicas muy importantes.

1.2.1. Riesgos abióticos y costos económicos

Las sequías son períodos de carencia de lluvias que abarcan zonas geográficas

extensas y pueden prevalecer por varios años (Wilhite y Vanyarkho, 2000). En el 2011

en Guanajuato y Puebla, estos fenómenos afectaron la producción de frijol (28.81%),

maíz (14.37%), trigo (9.5%), tomate verde (26.25%), papa (16.59%), chile verde

(14.47%) y tomate rojo (12.25%) (ASERCA, 2011). En el caso del frijol, se reportaron

pérdidas aproximadas de $281,998,400.

Los huracanes y tormentas se caracterizan por fuertes vientos y abundante

precipitación. El huracán “Ingrid” y la tormenta tropical “Manuel” en 2013 provocaron

daños en 534,000 ha con un valor aproximado de $75,000 millones de pesos,

afectando 215,000 ha, sólo en el estado de Guerrero (SAGARPA, 2013).

Las heladas son el descenso de temperatura a 0 °C ó menos durante un período de

tiempo mayor a 8 h. En el año 2011 en el estado de Sinaloa, provocaron daños en

436,216 ha de maíz, 29,789 ha de frijol y 38,207 ha de garbanzo con un valor

económico de cerca de $40,000 millones de pesos (SIAP, 2017).

La carencia de planes de manejo en la utilización de los recursos naturales y suelos

agrícolas es un factor de vulnerabilidad ante estos fenómenos (SAGARPA, 2012).

1.2.2. Riesgos bióticos y costos económicos

De la gran cantidad de factores bióticos que afectan a los cultivos se mencionan a

continuación algunos ejemplos:

a) El virus del enanismo amarillo de la cebolla (OYDV) y el virus del puerro de veta

Capítulo I

7

amarilla (LYSV) se han detectado mediante la técnica de ELISA en ajo (Allium

sativum), pueden causar disminuciones de la calidad del cultivo (Pérez, 2013;

Pérez-Moreno et al., 2008).

b) La mosca blanca (Bemisia sp) en tomates ha provocado pérdidas de 125 millones

de dólares (Norman et al., 1997 citado por Cano-Rios, et al., 2001).

c) La bacteria Candidatus liberibacter causante de la enfermedad del dragón amarillo

(huanglongbing, HLB) ha provocado daños de $ 6,965 millones en la citricultura

mexicana (Salcedo et al., 2011).

d) Especies de hongos fitopatógenos del género Fusarium ocasionan en cultivos de

fresas, pérdidas superiores al 50% (Castro y Dávalos, 1990 citado por Dávalos et

al., 2011), así como del género Colletotrichum que produce la enfermedad llamada

antracnosis que tiene una incidencia de hasta el 100% en mangos (Arauz et al.,

1994 citado por Arauz, 2000).

1.3. Hongos

Los hongos son organismos eucariontes, heterótrofos, uni o pluricelulares, productores

de esporas y tienen paredes celulares de quitina, de los cuales se han descrito

712,000 especies (Schmit y Muller, 2007). Algunos grupos son: basidiomycota,

zygomycota, chytridiomycota, glomeromycota y ascomycotas.

Se han reportado aproximadamente 23,000 especies fitopatógenas que provocan

afectaciones en raíces, flores, hojas o el sistema vascular (Persley et al., 2010). Los

hongos fitopatógenos se encuentran ampliamente distribuidos en los ecosistemas, e.g.

cuerpos de agua, suelo, aire y zonas desérticas (Gastón, 2007).

Algunos géneros de hongos fitopatógenos son: Diplodia, Alternaria, Mycosphaerella,

Botrytis, Monilinia, Penicillium, Colletotrichum, Phomopsis, Fusarium, Rhizoctonia,

Rhizopus, Gibberella y Mucor (Rivera, 2008). Los hongos producen enfermedades

como el tizón temprano causado por Alternaria solani, pudrición de la raíz por

Fusarium oxysporum, pudrición del tallo por Gibberella moniliformis, antracnosis por

Colletotrichum spp y Sigatoka negra por Pseudocercospora fijiensis. Debido a su

diversidad, la dificultad de control y a los daños económicos y biológicos que

Capítulo I

8

producen, los hongos se consideran entre los microorganismos fitopatógenos más

importantes (Agrios, 2005).

1. 4. Pseudocercospora fijiensis Morelet

Pseudocercospora fijiensis es un hongo ascomiceto perteneciente al orden

Dothideales, familia Dothideaceae que ataca el plátano (Musa sp) provoca la

enfermedad llamada Sigatoka negra caracterizada por la aparición de necrosis,

reducción del área foliar y disminución del rendimiento de la fruta (Stover, 1980). La

Sigatoka negra es la enfermedad foliar más importante de los cultivos de banano en el

mundo (Noar y Daub, 2016), su elevado éxito en la colonización se debe a su alta

frecuencia de reproducción sexual-asexual y a su exitosa producción por esporas

sexuales (ascosporas) (Mouliom Pefoura et al., 1996 citado por Romero, 2003) y

esporas asexuales (conidios) (Sánchez et al., 2001).

1.4.1. Ciclo de vida

El ciclo de vida de P. fijiensis inicia sobre las hojas de banano, a temperatura de 26-

28 °C y humedad de 90 a 100%. Las esporas se dispersan a través del viento, lluvia o

rocío (Marín et al., 2003), una vez en su hospedero germinan y sus tubos germinativos

penetran a través de los estomas, posteriormente se desarrollan en el espacio

intercelular de las hojas (Churchill, 2011, Merchán, 2000,). El hongo establece una

relación biotrófica al penetrar los estomas durante 3 a 4 semanas (Hoss et al., 2000),

hasta que el hospedero presenta los primeros síntomas necróticos de la enfermedad,

las ascosporas se desprenden en los estadios 5 y 6 de la enfermedad, mientras tanto

los conidios se desprenden en los estadios 2 al 6 y son transportados por el viento o el

agua hasta hojas sanas y el ciclo se repite (Gauhl et al., 2000 citado por Churchill,

2011). En la Figura 1.4 se observan las principales etapas del ciclo de vida de P.

fijiensis.

Capítulo I

9

Figura 1.4. Ciclo de vida de P. fijiensis en plantas de banano (Manzo-Sánchez et

al., 2005).

1.4.2. Patogenia

La enfermedad Sigatoka negra se manifiesta solamente en las hojas de banano,

afecta la actividad fotosintética, crecimiento y productividad de la planta. Los signos de

la enfermedad inician con manchas cloróticas pequeñas que se convierten en rayas

marrones hasta formar manchas negras necróticas (Bennett y Arneson, 2003). Los

signos de la enfermedad se desarrollan en seis estados (Fouré, 1997). En el primero

se observan pequeñas decoloraciones de color café rojizo en el envés de la hoja (< 1

mm de longitud). En el segundo se observa un crecimiento en las decoloraciones en

sentido longitudinal (2 a 3 mm). En el tercero las decoloraciones crecen tornándose

oscuras (2 a 3 cm). En el cuarto se forman manchas elípticas de color café y negro. En

el quinto, la mancha elíptica es completamente negra, rodeada por un halo amarillo y

en el sexto, la mancha presenta un halo amarillo con un hundimiento en su zona

central desarrollándose hasta provocar la muerte de las hojas. En la Figura 1.5 se

observan los seis estados de la enfermedad.

Capítulo I

10

Figura 1.5. Estadios de la Sigatoka negra en hojas de banano.1), pizca; 2) y 3), estrias;

4), 5) y 6), manchas (Fouré, 1997).

1.4.3. Control

El hongo P. fijiensis se controla principalmente con fungicidas sintéticos como benomyl

y carbendazim, también se realizan prácticas agrícolas como el deshoje, dehije,

densidad de plantación, drenaje, control de malezas y fertilización (Orozco-Santos,

1998 citado por Hidalgo et al., 2016). Debido a la aparición de cepas resistentes, el

control se ha vuelto más complejo y costoso (Patiño et al., 2007). Se reportan métodos

alternativos para controlar a la enfermedad, como son: biocontrol mediante bacterias,

control cultural mediante poda temprana de hojas y nutrición mineral balanceada

(Guzmán, 2012).

1.4.4. Daños económicos

El control químico de la Sigatoka negra en México se realiza mediante tres tipos de

programas: el intensivo, semi-intensivo y rústico. El programa intensivo conlleva

aplicaciones de fungicidas como el mancozeb de 35 veces por año, el semi- intensivo

de 15 veces por año y el rústico no utiliza fungicidas (Orozco-Santos et al., 2001 citado

por Aguilar-Barragán et al., 2014). En plantaciones sin control químico P. fijiensis

puede ocasionar pérdidas en la producción de hasta el 100% (David et al., 2011).

Capítulo I

11

1.5. Fusarium oxysporum Schlechtendal

Fusarium oxysporum es un hongo ascomiceto perteneciente al orden Hypocreales

familia Nectriaceae (Snyder y Hansen, 1940). F. oxysporum comprende una amplia

variedad de formas especiales patogénicas y no patogénicas que tienen una

distribución cosmopolita (agua, tierra y aíre). Las formas especiales fitopatogénicas

pueden atacar a una amplia variedad de cultivos provocando marchitamiento vascular,

de raíces y la muerte de la planta. F. oxysporum produce tres tipos de esporas

asexuales macronidias, micronidias y clamidosporas.


Los ciclos de vida son similares en las diversas formas especiales de F. oxysporum. El

hongo se desarrolla en temperaturas de 25 - 28 °C, a pH de 7.5 a 8.5 y en oscuridad

continua (De Granada et al., 2001). Las clamidosporas del hongo se pueden encontrar

en desechos de bananos, estas germinan al estar en contacto con la planta hospedera

para posteriormente penetrar por las raíces terciarias hasta alcanzar el rizoma y

pseudotallo, invadiendo el xilema (Batlle y Pérez, 2009). Al entrar al xilema el hongo se

reproduce hasta tapar los haces vasculares evitando el movimiento de agua y

nutrientes, posteriormente el hongo crece fuera del sistema vascular y sus tres tipos

de esporas son expulsadas al ambiente y pueden permanecer en el suelo y en tejido

muerto (en dormancia) hasta germinar e infectar una nueva planta y repetir el ciclo

(Davis, 2005 citado por Urías, 2015). En la Figura 1.6 se describe el ciclo de vida de F.

oxysporum.

Capítulo I

12

Figura 1.6. Ciclo de vida de F. oxysporum (Grimaldo, 2016).

https://es.slideshare.net/GrimaldoPecerosMatute/hongos-de-importancia-agricola.

Publicado Julio 2016.

1.5.2. Patogenia

Formas especiales como F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici provocan la

enfermedad llamada “fusariosis” o marchitamiento vascular. F. oxysporum f. sp.

cubense provoca la enfermedad llamada “mal de Panamá” en bananos (Batlle y Pérez,

2009). Sus signos son un amarillamiento en las hojas basales hasta la marchitez y una

necrosis vascular del tallo y las raíces (Apodaca-Sánchez et al., 2002). Estos últimos

son ocasionados por la obstrucción de los haces vasculares debido al crecimiento

micelial (Abawi y Pastor-Corrales, 1990 citado por Martinez, et al., 2004). F.

oxysporum también provoca enanismo y la disminución de brotes. El rasgo

representativo de la enfermedad es la presencia de un color blanquecino, amarillento

marrón y descomposición en los tejidos sin afectar la médula de la planta (Baker, 1980

citado por De Granada, 2001).

1.5.3. Control

Se basa en la aplicación preventiva de fungicidas sintéticos, en el uso de suelos libres

del patógeno, en la rotación de cultivo, en la quema de plantas infectadas, en el uso de

cultivares resistentes al hongo y en la solarización (Ancurio, 2010). El control mediante

https://es.slideshare.net/GrimaldoPecerosMatute/hongos-de-importancia-agricola.%20Publicado%20Julio%202016

https://es.slideshare.net/GrimaldoPecerosMatute/hongos-de-importancia-agricola.%20Publicado%20Julio%202016

Capítulo I

13

fungicidas consiste en el uso de benomyl, captan, bromuconazol, procloraz,

thiabendazol, carbendazim y metiltiofanato (Amini y Sidovich, 2010).


Este patógeno provoca pérdidas superiores al 50% en cultivos de tomate (Ramiréz,

1989 citado por Apodaca-Sánchez et al., 2004). F. oxysporum f. sp. cubense ha

provocado pérdidas en banano de hasta 75 millones de dólares (Perez- Vicente et al.,

2004 citado por OIRSA, 2009). En México se han reportado daños en 40,000 ha de

banano (Orozco et al., 2009 citado por Lara-Fiallos, 2009).

1.6. Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Penz. y Sacc.

Es un hongo ascomiceto del orden Glomerellales de la familia Glomerellaceae, de

distribución cosmopolita predominante en regiones tropicales (Paul et al., 1997 citado

por Ali et al., 2010). Produce la enfermedad llamada antracnosis en papaya y otros

cultivos tropicales y subtropicales (Santamaría 2011). Colletotrichum gloeosporioides

se reproduce mediante conidios cilíndricos con extremos redondeados.


Colletotrichum gloeosporioides presenta dos fases una sexual y otra asexual (Abang et

al., 2003). El ciclo inicia cuando los conidios llegan a la superficie de una planta

hospedera, posteriormente desarrollan el apresorio que es un estructura plana que

permite la adhesión y posterior entrada. Los conidios germinan y forman el tubo

germinal que penetra la cutícula colonizando la pared celular (Gomes et al., 2011), el

hongo puede penetrar tanto por lo estomas como por heridas, desarrollándose en

cualquier tejido de la planta. Es un hongo hemibiotrófico que infecta de dos formas a

su hospedero, de manera biotrófica intracelular (asintomática inicial) y necrotrófica

subcuticular (destructiva, disolviendo la matriz péptica de las células) (Agrios, 2002).

En condiciones favorables el hongo se desarrolla de manera rápida en la planta, no

obstante en condiciones adversas puede permanecer en forma quiescente y en

latencia sobre tejido muerto. El ciclo se completa al diseminarse los conidios mediante

la lluvia, riego o foresis (transportado por otros organismo) (Agrios, 2005). C.

gloeosporioides es considerado como hemibiótrofo (Barhoom y Sharon, 2007). En la

Figura 1.7 se describe el ciclo de vida de C. gloeosporioides.

Capítulo I

14

Figura 1.7. Ciclo de vida de Colletrotrichum gloeosporioides y Giberella cingulata

(Agrios, 2002).

1.6.2. Patogenia

Colletorichum gloeosporioides provoca una mancha hundida y pequeña de color

negro, ocasionando la pudrición del fruto (Agrios, 2005). En el aguacate produce

manchas redondas transparentes que evolucionan a un color café oscuro, este signo

cuando aparece en frutos en desarrollo se denomina como “viruela”, también producen

lesiones irregulares y hundidas de color negro, cuando aparecen en frutos maduros se

denomina como “clavo” (Campos A., J. 1987 citado por Zamora et al., 2001). El hongo

presenta esporulación de color rosado y en las hojas el hongo produce manchas color

café con halos cloróticos, en las flores se observan manchas oscuras y en los tallos

manchas circulares purpúreas y necrosadas (Morales y Ángel, 2007 citado por

Rodríguez-López et al., 2009).

1.6.3. Control

Para el control de C. gloeosporioides se usan fungicidas sintéticos como benomyl,

maneb, captafol (Agrios, 2005), siembra de cultivares resistentes y buenas prácticas

de cultivo. En la etapa de postcosecha se han usado métodos como la aplicación de

ácido salicílico en el mango (Zainuri et al., 2001), quitosano en papaya (Hernández et

al., 2001), aire caliente (Coates et al., 1993) y luz ultravioleta (Stevens et al., 1997).

Capítulo I

15


La antracnosis inducida por C. gloesporiodes causa daños económicos considerables

debido a la pérdida de sabor, rápida madurez y disminución en la calidad de la fruta

(Tian et al., 2010), por ejemplo en mango puede ocasionar pérdidas de hasta el 100%

en la fase de comercialización (Michereff, 2013).

1.7. Los fungicidas sintéticos

Los fungicidas controlan muchas enfermedades de los cultivos y permiten mantener

los rendimientos y el tiempo de vida de las plantas. Los fungicidas son compuestos en

su mayoría de naturaleza sintética (Brent y Hollomon, 1998), en el Cuadro 1.1.se

mencionan algunos ejemplos.

Cuadro 1.1. Fungicidas sintéticos, nombres comunes, grupo químico al que pertenecen y

mecanismo de acción.

Nombre común Grupo químico Mecanismo de acción

Captan, folpet Ftalimida Multi-sitio

Mancozeb, maneb Ditiocarbamatos Multi-sitio

Metil-tiofanato Tiofanatos Afecta la división celular

benalaxil, metalaxil Acilalaninas Afecta la síntesis de ácidos

nucleicos

Azoxistrobin Metoxiacrylatos Inhibe la respiración celular

Iprodiona Dicarboximidas Afecta la síntesis de lípidos y

membranas

Los fungicidas actúan inhibiendo el metabolismo energético, pueden alterar la

membrana celular de los hongo, bloquear la biosíntesis de sustancias importantes, la

división celular y algunos presentan modos de acción múltiples (Melgarejo y Portilla,

2011). Pueden tener efectos en la pared celular, citoplasma, mitocondrias, ribosomas

o el núcleo de los hongos. Los fungicidas se clasifican en dos categorías: sistémicos y

de contacto.

Capítulo I

16

1.7.1. Fungicidas de contacto y sistémicos

Los fungicidas de contacto tienen una función preventiva, matan al hongo antes de

que el micelio se desarrolle e invada los tejidos de la planta (Yuste y Gostincar, 1999

citado por García et al., 2003), estos se aplican sobre la superficie y no entran a los

tejidos, son propensos a ser lavados por la lluvia o riego por lo cual tienen un efecto de

corta duración (Pérez y Forbes, 2014). Fungicidas de este tipo son el oxicloruro de

cobre, mancozeb, maneb.

Los fungicidas sistémicos tienen un función curativa, matan al hongo aún cuando el

micelio se ha desarrollado e invadido los tejidos de la planta (Yuste y Gostincar, 1999

por García et al., 2003), se absorben a través de las hojas o raíces y se movilizan a

todos los tejidos de la planta permitiendo una efecto de larga duración (Pérez y

Forbes, 2014). Fungicidas de este tipo son el benalaxyl, metalaxyl, fosetyl-al. En la

Figura 1.8 se observa el modo de acción de los fungicidas de contacto y sistémicos.

Figura 1.8. Modo de acción de los fungicidas en las plantas: a) de contacto y b)

sistémicos (Pérez y Forbes, 2014).

1.7.2. Afectaciones causadas por la aplicación de fungicidas

En México la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios

(COFEPRIS), en su “Catálogo de plaguicidas 2016” reporta 611 formulaciones de

origen sintético y natural. Algunos fungicidas se encuentran prohibidos en Europa y

Estados Unidos debido a los daños que provocan, pero están permitidos en México,

como por ejemplo: captofol, dicloran, quintozeno, maneb, mancozeb tridemorf, captan,

a) b)

Capítulo I

17

mientras que otros se encuentran prohibidos como la aldrina y el nitrofenol (Instituto

Nacional de Ecología INE, 2016).

La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y Agricultura (FAO por

sus siglas en inglés) menciona que en México se usaron 42,223 ton de fungicidas

(FAOSTAT, 2016), aunque estos datos pueden estar subestimados, ya que se

desconocen los datos reales de producción y comercialización de las empresas. El uso

excesivo de los fungicidas, provoca graves problemas metabólicos, inducción de

resistencia en cepas patogénicas (Brent y Hollomon, 1995), biomagnificación y

bioconcentración en las especies (Reyes, 2011 citado por García y Rodríguez, 2012).

La aparición de la resistencia depende del grupo químico del fungicida aplicado, su

frecuencia y dosis, de la biología del patógeno y de las prácticas agrícolas (Brent y

Hollomon, 1995). La resistencia es un factor limitante en el control de enfermedades y

causa pérdidas económicas a productores y al público (Hollomon, 2015).

Las estrategias de manejo de cepas resistentes son: la rotación de fungicidas,

combinación de fungicidas, limitar la cantidad y los tiempos de los tratamientos,

respetar las recomendaciones del proveedor y la combinación con métodos no

químicos (Brent y Hollomon, 1995).

Se han reportado efectos negativos en la salud humana, como por ejemplo, el

aumento en la probabilidad de contraer la enfermedad de Parkinson en hasta un 75%,

después de exposiciones prolongadas al fungicida (Costello et al., 2009) y dermatitis

aguda en humanos causada por el captan (Vilaplana y Romaguera, 1993). El impacto

de estos fungicidas es de gran transcendencia social, biológica y económica, por lo

que es necesario la búsqueda y desarrollo de productos alternativos de baja toxicidad

y efectivos, para disminuir o sustituir el uso de estos fungicidas.

1.7.3. Alternativas a los fungicidas sintéticos

Se han reportado compuestos como el timol, linalol, eugenol, mentol, 2

metilcinamaldehído y cafeína obtenidos de plantas como tomillo, albahaca, canela,

clavo y yerbabuena que han tenido actividad antifúngica contra fitopatógenos de los

géneros Alternaria, Aspergillus, Cercospora, Colletotrichum, Fusarium, Oidium,

Penicillium y Stemphylium (Hernández et al., 1996 citado por Montes et al., 2000).

Como biocontrol se han utilizado bacterias (Bacillus subtilis) y levaduras (Rhodotorula

minuta) contra C. gloeosporioides que afecta cultivos de mango (Fasio et al., 2005) ó

Capítulo I

18

de Trichoderma contra F. oxysporum f. sp. ciceri que produce la marchitez del

garbanzo (Ibarra et al., 2006). Existen en el mercado productos alternativos

(bioplaguicidas) para el control de microorganismos patógenos (Cuadro 1.2).

Cuadro 1.2. Bioplaguicidas en el mercado.

Nombre

comercial

Tipo de

plaguicida

Compuesto Fuente

Bacter F®

Bactericida,

fungicida

Aceites esenciales de orégano

mexicano y extracto de ricino

Bionutra,

2016

Bio Gober ®

Fungicida,

insecticida

Planta gobernadora (Larrea

tridentata) y aceite de ricino (Ricinus

communis)

Idem

Natucontrol® Fungicida Esporas de Trichoderma harzianum

Biokrone

2015

Baktillis® Fungicida Subtilina y Bacitricina Idem

FungifreeAB

® Fungicida Bacteria Bacillus subtilis sp 83

Agro&Biotecn

ia, 2016

Otras de las alternativas a los fungicidas sintéticos son los productos de origen marino

como Biorend Cobre®, elaborado a partir de quitina extraída de centollas (Lithodes

santolla) y sulfato de cobre pentahidratado (Bioagro, 2011) y Alguicidium® elaborado a

partir de algas marinas (Corporación Selva de Oro, 2016) aunque las fichas técnicas

de dichos productos no especifican contra que hongos fitopatógenos son activos. Las

algas marinas pueden ser una alternativa para el control de fitopatógenos al producir

compuestos con actividad antiviral, antifúngica y antibacterial.

1.8. Las macroalgas marinas

Las macroalgas marinas son organismos multicelulares fotosintéticos, simples,

carentes de estructuras como flores, sistema vascular y raíces. Estos organismos son

importantes para la vida marina ya que proveen alimento, protección y son formadores

de sustrato (Mateo et al., 2013). Se clasifican en tres grupos basados en su

pigmentación: algas ocres (phylum Ochrophyta), algas rojas (phylum Rhodophyta) y

algas verdes (phylum Chlorophyta) (Silberfeld et al., 2014; Guiry, 2012). En la Figura

1.9 se muestran especies representativas de las divisiones de macroalgas marinas.

Capítulo I

19

Figura 1.9. Divisiones de las algas marinas: a) Rhodophyta, b) Ochrophyta, c)

Chlorophyta.

1.8.1. Distribución

Las macroalgas abarcan cerca del 2% del suelo marino (vida bentónica), se

distribuyen dependiendo de la temperatura y luz. Presentan una mayor diversidad en

aguas tropicales y zonas someras (Karleskint et al., 2010). Estudios biogeográficos

indican que las regiones con mayor diversidad algal son las costas de Japón, sur de

Australia y Europa occidental, y las de menor densidad las regiones polares, el sur del

Pacífico y occidente de África (Santelices y Marquet, 1998 citado por Kerswell, 2006).

Como explicación a la diversidad de algas, se propone una correlacion positiva directa

entre las variables ambientales (luz y nutrientes) y el número de taxones encontrados

(Kerswell, 2006). En la Figura 1.10 se observa la riqueza de géneros de macroalgas

marinas en el mundo.

Figura 1.10. Mapa de distribución de macroalgas marinas en el mundo (Kerswell,

2006).

a) b) c)

Capítulo I

20

1.8.2. Aprovechamiento de macroalgas marinas

Las macroalgas marinas son utilizadas para la elaboración de alimento para aves,

composta, abonos foliares, extracción de ficocoloides, alimentación humana,

producción de fármacos y cosméticos (revisado por Barsanti y Gualtieri, 2006). Desde

la antiguedad diversas especies de macroalgas marinas han sido utilizadas como

fertilizantes en países como Japón, China, Reino Unido, Islandia, Francia, Finlandia,

Dinamarca y Chile (Meier 1942), debido a su riqueza en macro y microelementos,

entre las principales macroalgas aprovechadas para este fin se encuentran

Ascophyllum nodosum, Ecklonia maxima, Fucus vesiculosus, Laminaria sp y

Sargassum sp.

Desde hace aproximadamente tres décadas las macroalgas marinas han sido

utilizadas en la cosmética principalmente en Francia debido a sus propiedades

gelificantes o espesantes, como protectores solares, cicatrizantes, antiinflamatorios de

la piel, agentes revitalizadores de la piel, lociones suavizantes y nutritivas, tonificantes,

antiedad y antioxidantes, los principales géneros usados para este fin son Fucus,

Laminaria y Ascophyllum.

Como alimento las macroalgas marinas han sido utilizadas ampliamente en Japón y

China, debido a sus cualidades nutritivas, su riqueza en minerales, vitaminas,

proteínas, antioxidantes y fibras, los principales géneros aprovechados para este fin

son Laminaria, Undaria, Porphyra, Eucheuma/Kappaphycus y Gracilaria.

(Bourgougnon et al., 2011).

Otros usos de las macroalgas marinas son para obtener sustancias ficocoloides como

carrageninas, alginatos y agares usados en la medicina, alimentación y ciencia, siendo

los principales productores Estados Unidos, Chile, España, Filipinas y Francia, los

géneros aprovechados son Macrocystis, Eucheuma, Ascophyllum, Gelidium, Hypnea,

Chondrus, Gigartina y Kappaphycus (Mchugh, 2002).

Capítulo I

21

1.8.3. Metabolitos de algas marinas

En la base de datos MarinLit de la Real Sociedad de Química se han reportado más

de 24,000 compuestos extraídos de especies marinas de los cuales 3,200 (13%)

corresponden a compuestos extraídos de especies de macroalgas marinas. El phylum

Rhodophyta cuenta con más del 7% de compuestos aislados (revisado por Blunt y

Munro, 2013) del cual la familia Rhodomelaceae representa el 57% (Maschek y Baker

2009). Se han reportado del phylum Ochrophyta 1,200 compuestos, siendo el género

Dictyota el mejor representado y del phylum Chlorophyta solamente 270 compuestos

(Blunt et al., 2013). Los isoprenos (terpenoides, carotenoides y esteroides) seguido por

los shikimatos y policétidos, son los principales compuestos aislados de las

macroalgas marinas (Leal et al., 2013).

Se han reportado metabolitos con actividades biológicas como por ejemplo:

polisácaridos sulfatados de Ulva pertusa, Laminaria japonica, Enteromorpha linza y

Bryopsis plumose con propiedades antioxidantes (Zhang et al., 2010),

metoxibifurcarenona de Cystoseira tamariscifolia con propiedades antibacteriales

(revisado por Faulkner, 2002) y florotaninos de algas cafés con propiedades

antifúngicas (revisado por Lopes et al., 2015). Estos organismos poseen un potencial

biotecnológico para su uso en el combate de fitopatógenos en la agricultura orgánica

(libre de pesticidas sintéticos) (Ambika y Sujatha, 2015).

1.8.4. Actividad antifúngica de macroalgas marinas

Extractos etanólicos de la especie Hypnea musciformis han presentado actividad

contra patogénos como Trichophytum rubrum (pie de atleta), T. tonsurans (tiña de la

cabeza), T. mentagrophytes (tiña), Microsporum canis (tiña capites), M. gypseum

(lesiones en anillo) y la levadura Candida albicans (Guedes et al., 2012). El florotatino

dieckol extraído de Ecklonia cava muestra una actividad fungicida contra el hongo T.

rubrum (Lee et al., 2010).

1.8.5. Estudios de macroalgas marinas contra fitopatógenos

Se ha reportado que material seco molido de Codium iyengarii presentó actividad

antifúngica a un porcentaje de 0.5% (p/p) contra Fusarium solani que infecta raíces de

la okra (Sultana et al., 2005).

Estudios que evalúan extractos de macroalgas marinas contra hongos fitopatógenos

se describen en el Cuadro 1.3.

Capítulo I

22

Cuadro 1.3. Estudios sobre actividad antifúngica de macroalgas marinas.

Especie Tipo de extracto o compuestos

aislados Fitopatógeno Referencia

Dictyopteris zonarioides Zonarol e isozonarol Rhizoctonia solani y Sclerotinia sclerotiorum Fenical et al. (1973)

Algas marinas Extractos orgánicos Botrytis cinerea y Erysiphe polygoni Kulik (1995)

Hypnea musciformis Extracto proteico Colletotrichum lindemunthianum Melo et al. (1997)

Stypopodium zonale, Laurencia

dendroidea, Pelvetia canaliculata,

Fucus spiralis

Neofitadieno, cartilagineol, obtusol,

elatol; etil hexadecanoato, 1,1-bis(4-

hidroxifienil) etano , isooctil ftalato,

ácido ftalico y bis (2-etilhexil) adipato

Colletotrichum lagenarium y Aspergillus

flavus Peres et al. (2012)

Ulva lactuca, Caulerpa sertularioides,

Padina gymnospora y Sargassum

liebmanni

Extractos orgánicos Alternaria solani Hernández et al.

(2014)

S. myricocystum y Gracillaria edulis Extractos acuosos y etanólicos Colletotrichum falcatum Ambika y Sujatha

(2015)

S. polycystum y S. terranimun Extractos acuosos, etanólicos,

metanólicos y cloroformo

Aspergillus niger, Rhizoctonia solani, Mucor

racemosus, Rhizopus stolonifer

Kausalya y Narasimba

(2015)

S. vulgare, Cystoseira barbata, D.

membranácea, Dictyota dichotoma y

Colpomenia sinuosa

Extractos ciclohexánicos

Alternaria alternata, Cladosporium

cladosporioides, F. oxysporum, Epicoccum

nigrum, A. niger, A. ochraceus, A. flavus y

Penicillium citrinum

El Shafay et al. (2016)

Capítulo I

23

1.8.6. Macroalgas marinas en Yucatán y su potencial aprovechamiento

En México se han reportado aproximadamente 2,745 especies de macroalgas

(Pedroche y Sentíes, 2003), de la cuales 500 especies se encuentran distribuidas en la

península de Yucatán e incluyen los estados de Campeche y Quintana Roo (Huerta-

Múzquiz y Espinosa, 2000) y en la costa del estado de Yucatán en Sisal y Dzilam de

Bravo se han identificado un total de 64 especies (Ortegón y Aguilar, 2014), en la zona

entre Uaymitún y Chuburná se han reportado 46 especies, siendo la familia

Rhodomelaceae la mejor representada. Las características físicas de la plataforma

yucateca como su amplia extensión de hasta 160 km, poca profundidad, altos niveles

de radiación solar y un sustrato idonéo para la fijación y crecimiento de macroalgas

marinas han propiciado que la península yucateca sea una zona geográfica rica en

estas especies (Robledo-Ramírez, 1996).

Diversos estudios han reportado una biomasa colectable de hasta el 3.2 Kg/m2 de

algas rojas (Robledo y Freile, 1998), lo cual permite su posible uso para extracción de

ficocoloides, agares y carragenatos. Existen reportes sobre la viabilidad en Yucatán

para soportar el desarrollo de cultivos de algas como Kappaphycus alvarezi (Muñoz et

al., 2004). También se ha evaluado la composición química y de minerales de

especies como Gracilaria cornea, Eucheuma isiforme, Caulerpa racemosa, Codium

isthmocladum, Padina gymnospora y Sargassum filipendula para su potencial

consumo humano o alternativas como alimento animal e incluso fertilizantes (Robledo

y Pelegrín, 1997).

En cuanto al aprovechamiento y comercialización de productos elaborados con

macroalgas marinas el estado de Yucatán, un claro ejemplo es el de mujeres de la

comunidad de Sinanché que produjeron shampoos, jabones y cosméticos a la partir de

las algas Sargassum sp y Halymenia floresii, ésta iniciativa fue promovida por

integrantes del Programa Integral de Desarrollo Rural, Componente de Extensión e

Innovación Productiva (CEIP), del Gobierno de Yucatán en colaboración con la

Universidad Autónoma de Yucatán (Alpuche et al., 2016). Actualmente existe una

empresa dedicada a la producción de fertilizantes foliares elaborados a partir de

macroalgas marinas de arribazón del género Sargassum sp llamada Salgax

Biotecnología Marina Aplicada S. de R.L. de C.V. (com. pers.).

Capítulo I

24

1.8.7. Los arribazones de macroalgas marinas

La llegada masiva de macroalgas a las playas se conoce como arribazón (beach-cast

o wrack en inglés); pueden ser mono o poliespecíficos dependiendo de la composición

ficoflorística, la zona geográfica y la estacionalidad. Estos fenómenos ocurren en el

Caribe Mexicano durante todo el año, siendo más recurrentes en los meses de

noviembre a abril. La frecuencia de los arribazones se ha relacionado a las corrientes

marinas, ciclones, frentes fríos y tamaño de las especies (Dreckmann y Sentíes,

2003). En la Figura 1.11 se observa un arribazón de algas marinas en la costa de

Sisal, Yucatán.

Figura 1.11. Arribazón de algas en la costa de Sisal, Yucatán (16 enero del

2017).

1.8.8. Estudios sobre arribazones

Estudios de caracterización florística y aprovechamiento de los arribazones se han

realizado en Alaska donde se evaluaron los riesgos asociados a los diferentes

mercados donde se comercializan productos obtenidos de macroalgas marinas, sus

canales de distribución, promoción y precios para otorgar oportunidades de trabajo a

residentes de la isla de St. Lawrence (Roberts y Stekoll, 1993). En Argentina se ha

evaluado en la comunidad de Bahía Nueva al noreste de la provincia de Chubut, el

aprovechamiento de macroalgas marinas para su compostaje donde se concluyó que

los arribazones son adecuados para su uso como composta siendo la especie Undaria

pinnatifida la más idónea para este fin debido a su composición química (Eyras y Sar,

2003; Becherucci y Benavides, 2016).

Capítulo I

25

En Estonia se ha investigado los patrones de acumulación, ficoflora asociada y

factores ambientales que afectan a la macroalga Furcellaria lumbricalis en la bahía de

Kassari donde encontraron que existe una pérdida aproximada de la biomasa de la

población del 3% debido a los arribazones y que estos están relacionados a

condiciones meteorológicas e hidrológicas como la velocidad del viento, inclinación de

la costa y las fuerza de las olas (Kersen y Martin, 2007). En Suecia se evaluó el valor

no comercial de la recolección de macroalgas marinas de arribazones en la

municipalidad de Trelleborg, enfocándose en un programa ambiental para su

aprovechamiento como biocombustible o biofertilizante teniendo una aceptación

positiva por los habitantes (Risén et al., 2017).

En México los estudios son muy limitados (Dreckmann y Senties, 2013), en Yucatán

se reporta la caracterización de macroalgas marinas bénticas y de arribazón en la

zona de Dzilam de Bravo, entre las especies más abundantes se encuentran S.

filipendula, Sporochnus pedunculatus, Padina sp, H. floresii, H. elongata, Meristotheca

gelidium, G. cervicornis, Caulerpa racemosa, C. prolifera y C. paspaloide (Rosado et

al., 2011).

Los arribazones de algas son fenómenos recurrentes que afectan a la población

costera, debido al mal aspecto y olor que despiden al descomponerse. El gobierno

federal en su programa de empleo temporal que ofrece trabajo a cerca de 4,600

personas, incluyó el retiro y el manejo de los recursos algales en los estados de

Yucatán y Quintana Roo, en este último se publicó el documento “Lineamiento técnico

para el bloqueo y retiro del sargazo en la zona marina” (SEMARNAT, 2015).

En el 2018 los arribazones se han vuelto una problemática para la zona costera de

Quintana Roo con más de 106 mil metros cúbicos de macroalgas marinas retiradas de

40 km de playas en la temporada junio-agosto, según informó a medios periodísticos

el Sr. Alfredo Arellano Guillermo titular de la Secretaria de Ecología y Medio Ambiente

(SEMA). Se han intentado diferentes métodos para resolver el problema de los

arribazones en Quintana Roo, desde bandas transportadoras, embarcaciones que

colectan dentro del mar hasta barreras y aspiradoras, sin embargo la problemática no

se resuelve, ya que estos esfuerzos están enfocados a retirar la macroalgas de la

costa y no al aprovechamiento de la misma.

Capítulo I

26

Una industria que use estos recursos para la elaboración de productos biotecnológicos

innovadores, disminuiría los efectos de los arribazones y sería además una fuente de

empleos. Por lo anterior este trabajo evalúa la actividad antifúngica potencial de

extractos de macroalgas marinas de arribazón de la zona costera de Yucatán contra

fitopatógenos de importancia comercial como: Pseudocercospora fijiensis,


Capítulo I

27

JUSTIFICACIÓN

Los fungicidas sintéticos causan daños al ambiente, a la salud, además algunas cepas

han desarrollado resistencia a dichos fungicidas. La búsqueda y evaluación de

compuestos y extractos naturales efectivos y menos tóxicos contra hongos

fitopatógenos abre la posibilidad de desarrollar productos biotecnológicos que

promuevan una agricultura ecoamigable, reduciendo los efectos negativos de los

fungicidas sintéticos. Las macroalgas marinas procedentes de arribazones de la zona

costera de Yucatán tienen el potencial de ser una fuente de compuestos antifúngicos,

antibacteriales, antivirales y antioxidantes, adémas son abundantes, baratas y de fácil

acceso. Asimismo al utilizarlas se disminuirá su impacto negativo en las zonas

turísticas. En este trabajo se evaluó el potencial antifúngico de extractos de cinco

macroalgas marinas de arribazón.

Capítulo I

28

HIPÓTESIS

Los extractos de macroalgas marinas de la zona costera de Yucatán presentan

actividad antifúngica contra hongos fitopatógenos como Pseudocercospora fijiensis,


Capítulo I

29

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la actividad antifúngica de extractos de macroalgas marinas de la zona costera

de Yucatán contra fitopatógenos de cultivos agrícolas de importancia comercial.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Recolectar e identificar especímenes de macroalgas marinas representativos de

los phyla Rhodophyta, Ochrophyta y Chlorophyta de la zona costera de Yucatán.

Evaluar la actividad antifúngica in vitro de extractos crudos acuosos, fracciones

orgánicas y proteicas contra tres hongos fitopatógenos: Pseudocercospora

fijiensis, Colletotrichum gloeosporioides y Fusarium oxysporum.

Obtener el perfil proteico del ECA con actividad antifúngica.

Obtener el perfil cromatográfico mediante CLAR de los extractos con actividad

antifúngica.

Validar cuantitativamente la actividad inhibitoria de los ECA’s utilizando el método

de Alamar Blue.

Analizar la toxicidad de los ECA´s con actividad antifúngica en camarones de

salmuera (Artemia salina).

Capítulo I

30

ESTRATEGIA DE INVESTIGACIÓN

Capítulo I

31

ESTRATEGIA DE INVESTIGACIÓN

Capítulo II

32

CAPÍTULO II

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE EXTRACTOS

CRUDOS ACUOSOS, FRACCIONES ORGÁNICAS Y PROTEÍNA DE

MACROALGAS MARINAS DE YUCATÁN

2.1. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1.1. Material algal

Se colectaron especies de macroalgas marinas de arribazones en las localidades de

Sisal (21°09′56.1″N 90°02´49.8″O) y Dzilam de Bravo (21°23′25.2″N 88°54′31.5″O)

durante la temporada 2016-2017 (octubre-enero). La colecta se realizó en la zona

intermareal y de manera manual, los especímenes se lavaron en el sitio con agua de

mar para retirar epibiontes, arena y objetos extraños, posteriormente se depositaron

en bolsas de plástico para su transporte. Se seleccionaron cinco especies

considerando los siguientes criterios:

1) Que tuvieran una biomasa abundante (> 1 Kg).

2) Que el rendimiento peso húmedo/peso seco fuera mayor al 4%.

3) Y que fueran representativas de los tres phyla de macroalgas marinas.

La preparación y el análisis se realizaron en el laboratorio de biotecnología de plátano

de la Unidad de Biotecnología del Centro de Investigación Científica de Yucatán, CICY

A.C.

Cuatro ejemplares de cada especie se preservaron en formaldehído al 5% para su

prensado.

Se realizó una segunda colecta (noviembre 2016) de la macroalga marina cuyo

extracto crudo acuoso presentó actividad antifúngica con la finalidad de evaluar si el

extracto de dicha colecta también era activo.

2.1.2. Preparación e identificación de macroalgas

Los especímenes se prensaron siguiendo las especificaciones de Florez et al., (2010),

se lavaron con agua de la llave para retirar el excedente de formaldehído, se

depositaron sobre cartulinas para herbario (Bristol 110 Kg libre de ácido de un tamaño

de 40 cm × 28 cm), se prensaron y se depositaron en un horno a 45 °C por una

semana (Figura 2.1). Posteriormente se depositaron dos ejemplares de cada especie

en los herbarios "U Najil Tikin Xiw” del Centro de Investigación Científica de Yucatán y

en el “Alfredo Barrera Marín” de la Universidad Autónoma de Yucatán.

http://tools.wmflabs.org/geohack/geohack.php?language=es&pagename=Dzilam_de_Bravo&params=21.3925_N_-88.8914_E_type:city

Capítulo II

33

Para la identificación morfológica de los ejemplares se consultó la base de datos de

Algaebase (Guiry and Guiry, 2013) y las guías de Littler y Littller (2000) y Wynne

(2011), además se realizaron cortes manuales histológicos transversales de los talos

de las macroalgas con una navaja de bisturí # 11 (Salavarría et al., 2015) y se tiñeron

con azul de lactofenol por 10 min (fenol: 0.1 g, ácido láctico: 8 mL, agua destilada: 10

mL, glicerina: 20 mL y azul de anilina: 0.5 g) para observar estructuras internas

mediante un estereomicroscopio binocular Stemi DV4, Zeiss®. La Dra. Ileana Ortegón

Aznar, profesora asociada de la Universidad Autónoma de Yucatán y especialista en

macroalgas marinas, confirmó la identificación de las especies.

2.1.3. Preparación de las muestras para la obtención de extractos crudos

acuosos (ECA’s)

La macroalgas marinas se lavaron con agua de la llave y posteriormente agua

destilada, siguiendo el método de Ambika y Sujatha (2015) con modificaciones se

secaron a la sombra sobre papel a 27 °C (+/– 3 °C) de 3 a 7 días, posteriormente en

horno a 37 °C por 24 h. Al finalizar el secado se molieron en una licuadora (Waring®

Comercial, USA Modelo WF2211212), hasta obtener un polvo fino y se guardaron en

bolsas ziploc, en oscuridad, a 27 °C +/– 3 °C hasta su uso (Figura 1.12).

Figura 1.12. Proceso de secado de macroalgas marinas.

Capítulo II

34

2.1.4. Métodos de elaboración de ECA’s

Se compararon tres métodos de elaboración de ECA’s para elegir el más práctico (fácil

y rápido). Se utilizó una muestra de arribazón del grupo Rhodophyta recolectada el día

6 de enero del 2015.

En la Figura 1.13 se describe la estrategia experimental utilizada para la extracción

acuosa y enseguida se describe a detalle cada procedimiento.

1) El primer método fue el de Díaz et al. (2015) con modificaciones; brevemente, se

realizó una maceración de 5 g de material seco en 50 mL de agua destilada estéril,

dejando en agitación constante a 27 °C +/- 3 °C durante 24 h, posteriormente se

centrifugó a 5,854 × g a 4ºC por 30 min, se transfirió el sobrenadante a tubos

Eppendorf, se centrifugó a 18,213 × g por 30 min. Se filtró mediante membranas

Durapore® de 0.65 µm, 0.45 µm para retirar partículas suspendidas en el extracto, el

paso final se modificó pues el sobrenadante no se liofilizó, si no que se esterilizó por

filtración utilizando una membrana de 0.22 µm y se conservó a 4 ºC hasta su uso.

2) El segundo método fue el de Ruiz-Ruiz et al. (2016) con modificaciones; consistió

en mezclar 5 g de material seco con 50 mL de agua destilada estéril y licuar a mínima

potencia por 1 min. El sobrenadante de la muestra se distribuyó en tubos Falcon y se

centrifugó a 5,854 × g por 30 min, se volvió a recuperar y se transfirió a tubos

eppendorf de 2 mL para centrifugarse nuevamente a 18,213 × g por 30 min y al

finalizar el sobrenadante se filtró por medio de membranas Durapore® de 0.65 µm,

0.45 µm, se esterilizó por filtración a 0.22 µm y se conservó a 4 ºC hasta su uso.

3) El tercer método fue el de Kuda e Ikemori (2009) con modificaciones, consistió en

licuar 5 g de material seco con 50 mL de agua destilada estéril, por un minuto a

máxima potencia. La mezcla se calentó por 30 min a 50 °C, se mantuvo en agitación

constante y se centrifugó a 5,854 × g por 30 min, el sobrenadante se transfirió a tubos

eppendorf y se centrifugó a 18,213 × g por 30 min, se filtró el sobrenadante por medio

de membranas Durapore® de 0.65 µm, 0.45 µm, se esterilizó por filtración a 0.22 µm y

se conservó a 4 °C hasta su uso.

Capítulo II

35

Figura 1.13. Estrategia experimental de tres métodos de elaboración de ECA’s.

2.1.5. Bioensayo de actividad antifúngica de los ECA’s

Se siguió el método de Ruiz-Ruiz et al. (2016) debido a que permite evaluar

tanto la actividad fungistática como fungicida de un extracto determinado, además de

su simplicidad, bajo costo y rapidez. Se prepararon tratamientos con un volumen de

112.5 µL de extracto crudo acuoso a concentraciones de 27.27 (C4), 13.635(C3),

6.817(C2) y 3.408 mg/mL (C1) y 12.5 µL de suspensión conidial a una concentración

de 150 conidios ó esporas/µL; como control negativo se utilizaron 12.5 µL de agua

destilada estéril y 12.5 µL de suspensión conidial, como control positivo se utilizaron

111 µL de agua destilada estéril y 1.5 µL del fungicida nitrato de miconazol y 12.5 µL

suspensión conidial, las muestras se incubaron por 72 h en oscuridad a 27 °C +/– 3

°C.

Para evaluar la actividad antifúngica de los extractos acuosos de manera cualitativa,

se transfirieron 25 µL de cada muestra donde se observó ausencia del crecimiento

micelial del hongo y se depositaron por duplicado en cajas Petri con PDA, se dejaron

incubar en periodos de luz/oscuridad de 12 h por 30 días, se evaluó la presencia o

Capítulo II

36

ausencia del crecimiento micelial a los 5, 15 y 30 días. En las muestras en las que se

observó inhibición micelial del hongo en la cajas Petri se documentó con

microfotografías mediante microscopio óptico marca AXIOPLAN I ®, Zeiis.

2.1.6. Extracción orgánica y fraccionamiento de las macroalgas marinas con

actividad antifúngica

A las algas cuyos extractos crudos acuosos presentaron actividad antifúngica, se les

realizó una extracción orgánica, siguiendo el método de Lenis et al. (2007) con

modificaciones; el material algal seco y molido (25 g - 50 g) se mezcló con etanol:

agua (9:1) y se expuso a ultrasonido (60 Hz por 60 min mediante un baño sonicador

Cole-Parmer Modelo 08895-16, Illinois, USA). El sobrenadante se recuperó mediante

filtración (se repitió la extracción dos veces con el material sobrante) y se concentró en

un rotovapor IKA® RV10 a 40 °C hasta secado total, se pesó para determinar su

rendimiento. El extracto crudo se resuspendió en una mezcla metanol:agua (1:3), se

fraccionó con hexano (1 × 80 mL, 2 × 40 mL), diclorometano (1 × 80 mL, 2 × 40 mL) y

acetato de etilo (1 × 80 mL,2 × 40 mL); cada fracción se concentró en un rotavapor

IKA® RV10 a 40 °C. Las muestras resultantes se pesaron para determinar su

rendimiento. Se etiquetaron y guardaron a 4 °C hasta su uso.

2.1.7. Bioensayo de actividad antifúngica de las fracciones orgánicas

Para los bioensayos de actividad antifúngica, se siguió el método de Vargas, (2014)

con modificaciones, se realizaron dos experimentos independientes usando medio de

cultivo PDB y H20 estéril, para lo cual se pesaron 5 mg de cada fracción y se

resuspendieron en 100 µL de dimetil sulfóxido (DMSO) quedando la disolución madre

a 50 µg/µL, se tomaron 40 µL y se realizaron seis diluciones con PDB o H20 estéril a

las concentraciones de 2000 µg/mL, 1000 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL y

62.5 µg/mL, se tomaron 112.5 µL de cada concentración y se agregaron 12.5 µL de

suspensión conidial a una concentración de 150 conidios ó esporas/µl, como control

negativo se utilizó 112.5 µL de PDB o H20 estéril y 12.5 µL de suspensión conidial,

como control positivo se utilizó 111 µL de PDB o H20 estéril más 1.5 µL de nitrato de

miconazol y 12.5 µL de suspensión conidial, las muestras se incubaron por 72 h en

oscuridad a 27 °C +/– 3 °C.

Para evaluar cualitativamente a la actividad antifúngica de los extractos acuosos, se

transfirieron 25 µL de cada muestra donde se observó ausencia del crecimiento

Capítulo II

37

micelial del hongo y se depositaron por duplicado en cajas Petri con PDA, se dejaron

incubar en periodos de luz/oscuridad de 12 h por 30 días, se evaluó la presencia o

ausencia del crecimiento micelial a los 5, 15 y 30 días. En las muestras en las que se

observó inhibición micelial se documentó con microfotografías mediante microscopio

óptico marca AXIOPLAN I ®, Zeiss®.

2.1.8. Extracción de proteína de los ECA’s de las macroalgas mediante

ultrafiltración

La técnica de ultrafiltración se eligió debido a su rapidez, simplicidad, capacidad de

procesamiento, capacidad de desalinización y obtención de compuestos de naturaleza

proteica sensibles y de bajo peso molecular (Chabeaud et al., 2009; Denis et al.,

2009). Se usaron membranas de 3 kDa (Amicon® MWCO 0.5mL Ultra, Germany) para

filtrar 1.5 mL del extracto crudo acuoso con actividad inhibitoria a una concentracion de

27.27 mg/mL, centrifugando a 14000 × g por 20 min, hasta alcanzar un volumen

retenido de 200 µL, la muestra retenida conteniendo a las proteínas mayores de 3 kDa

se recuperó mediante centrifugación a 1000 x g por 2 minutos. Las muestras retenidas

(parte proteica) se resuspendieron en un volumen de 1.3 mL de agua estéril y se

esterilizaron mediante membranas de nitrocelulosa (Millipore®) de 0.22 µm, se

etiquetaron y guardaron a 4 °C hasta su uso. La muestra filtrada (parte no proteica) se

esterilizó siguiendo el procedimeinto antes mencionado. Se realizó un bioensayo de

actividad antifúngica de la parte proteica y de la no proteica siguiendo el método

descrito en el apartado 2.1.5.

2.1.9 Cuantificación mediante el método de Bradford de la proteína de los ECA’s

con actividad antifúngica

Para cuantificar las muestras proteícas se siguió el protocolo de Kruger (1994) basado

en el método colorimétrico de Bradford. Se obtuvo el perfil proteico de las muestras

mediante un gel de acrilamida SDS-PAGE siguiendo el método de Laemmli (1970) con

modificaciones. Se tomaron 20 µL de la muestra retenida, de la filtrada y del ECA de la

especie con actividad antifúngica y se mezclaron con 6 µL de tampón de carga

(dodecilsulfato sódico al 4%). Se depositaron 20 µL de cada muestra en un gel

discontinuo de poliacrilamida, el primero llamado de apilamiento de proteínas y

formado de 4% de acrilamida y el segundo llamado gel separador de 15% de

acrilamida. La electroforesis se realizó a 90 volts por 90 min y se como referencia del

peso molecular de las proteínas se utilizó el paquete comercial “prestained sds page-

Capítulo II

38

standards broad range” con proteínas en el rango de entre 6.9-210 kDa. Después de la

electroforesis el gel se tiñó con nitrato de plata y se observaron las bandas de

proteína.

2.1.10 Análisis de los ECA’s con actividad antifúngica mediante cromatografía

líquida de alta resolución (CLAR) y cromatografía en capa delgada (CCD)

La cromatografia líquida de alta resolución (CLAR) es una técnica instrumental de alta

sensibilidad, cuantitativa y cualitativa que permite la separación de una amplia gama

de compuestos mediante el uso de una columna (fase estacionaria) y una fase móvil,

acoplada a detectores que ayudan a determinar la naturaleza del compuesto. Para la

obtención del perfil cromatográfico del extracto crudo acuoso de las especies con

actividad antifúngica se utilizó un equipo de cromatografía líquida de alta resolución

Agilent Technologies 1290 Infinity y una columna cromatográfica Grace® Altima C18 µ

250 mm × 4.6mm, usando un método de gradiente de elución que se muestra en el

Cuadro 2.4.

Cuadro 2.4 Condiciones del gradiente de elución utilizado para obtención del perfil

cromatográfico del extracto crudo acuoso de H. floresii.

H2O (%) MeOH (%) Acetonitrilo

(%)

Tiempo

(min)

Flujo

(mL/min)

Temperatura

(°C)

90 10 0 8 1.5

24

50 50 0 5 1

0 70 30 15 0.5

50 0 50 7 1

Para el análisis mediante cromatografía en capa delgada del extracto crudo acuoso,

de la parte proteica y parte no proteica del ECA de las especies con actividad

antifúngica se utilizaron placas TLC gel de sílice 60 F254 y TLC gel de sílice 60 RP-18

F254s, empleando un sistema de disolventes metanol:acetato de etilo (1:1) y

H2O:metanol (7:3), respectivamente, revelando con ácido fosfomolíbdico.

Capítulo II

39

2.1.11 Determinación de la actividad antifúngica de los ECA’s utilizando el

método de Alamar Blue

El análisis de la actividad antifúngica de los ECA’s mediante Alamar Blue (AB) se basa

en la reducción de la resazurina (azul) a resarufina (rojo) por oxido-reductasas

localizadas en las mitocondrias de las células, el cambio de color es directamente

proporcional al número de células que se encuentren viables (Zhang et al. 2004). En

este trabajo se calculó el porcentaje de viabilidad mediante la fórmula de porcentaje de

reducción del AB, que se describe a continuación:

% = (O2 × A1) – (O1 × A2) / (R1 × N2) – (R2 × N1) × 100

Donde:

O1 = Coeficiente de extinción molar oxidado del Alamar Blue a 570 nm

O2 = Coeficiente de extinción molar oxidado del Alamar Blue a 600 nm

R1 = Coeficiente de extinción molar reducido del Alamar Blue a 570 nm

R2 = Coeficiente de extinción molar reducido del Alamar Blue a 600 nm

A1 = Absorbancia de prueba a 570 nm

A2 = Absorbancia de prueba a 600 nm

N1 = Absorbancia de control a 570 nm

N2 = Absorbancia de control a 600 nm

Coeficientes de extinción molar de Alamar Blue

Oxidado Reducido

570 nm 155677 80586

600 nm 14652 117216

Se preparó una curva estándar con una concentración de conidios de 40,000, 20,000 y

10,000 conidios/mL con PDB (pH 7.2) y Alamar Blue. Las muestras se prepararon

siguiendo la metodología del punto 2.1.5 con la modificación de que al finalizar la

incubación de 27 °C +/– 3 °C por 3 días, se centrifugaron a 18,213 × g por 30 min, se

desechó el sobrenadante y se recuperaron las pastillas, adicionando 500 µL de PDB y

50 µL de Alamar Blue. Para el control positivo se utilizó un volumen determinado de

PDB, Alamar Blue y suspensión conidial. Se incubaron las muestras en oscuridad y se

evaluó la reducción del AB mediante absorbancia a 570 y 600 nm a las 0, 24, 48 y 72

Capítulo II

40

h mediante un espectrofotómetro. Los análisis se realizaron por triplicado. Se calculó

el porcentaje de reducción y las gráficas de actividad antifúngica.

2.1.12 Análisis de toxicidad de los ECA’s en camarones de salmuera (Artemia

salina)

Se determinó la toxicidad de los extractos activos, siguiendo el método de Meyer et al.

(1982) con modificaciones, se usó en un recipiente rectangular de plástico con

divisiones de luz y oscuridad, con una disolución de agua marina (200 mL agua

destilada ésteril + 5 g de sal marina), la cual se mantuvo en aireación mediante una

bomba de pecera durante 2 h.

Se agregaron 45 mg de quistes de camarones para su eclosión, a las 24 h se tomaron

15 nauplios y se depositaron en viales con 4.5 mL de disolución de eclosión y 0.5 mL

del extracto a evaluar, se usaron concentración finales de 1350, 675, 337.5 y 168.75

µg/mL, como control negativo 0.5 mL de la solución de eclosión y como positivo 6µL

de nitrato de miconazol (20 mg/mL), se dejaron incubar por 24 h. Durante todo el

experimento se usó como fuente de luz artificial un foco de luz blanca (127 V, 23 W,60

Hz marca Brith Ligth®) a 27 °C+/– 3 °C.

Se determinó el porcentaje de letalidad y la CL50 mediante la función PROBIT usando

el programa XLSTAT, considerando una mortalidad natural del 11%.

Capítulo II

41

2.13. RESULTADOS

2.14. Material algal

Se identificaron cinco especies de macroalgas marinas colectadas de la zona costera

de Dzilam de Bravo y Sisal, Yucatán. Las especies identificadas fueron:

Halymenia floresii (Clemente) C.Agardh 1817. Phylum: Rhodophyta, familia

Halymeniaceae. Se caracteriza por un talo aplanado y gelatinoso, con ramificaciones

de 0.7 mm a 3 mm de ancho, el alga presenta una coloración rojiza, rosácea a

anaranjada (Figura 2.1a), los cortes histológicos mostraron un cortéx papiloso y firme

con un médula filamentosa anticlinal (Figura 2.1b).

Figura 2.1. Espécimen de H. floresii con las características representativas de la

especie. a) vista macroscópica, b) corte transversal del talo observado bajo un

microscopio estereoscopio a 32x. Se observa el cortéx y la médula teñidos con azul de

lactofenol.

Agardhiella subulata (C.Agardh) Kraft y M.J.Wynne 1979. Phylum: Rhodophyta familia:

Solieriaceae. Se caracteriza por un talo erecto, tubular de superficie lisa, de 15 a 45

cm con ramificaciones opuestas, el alga presenta una coloración rojiza-anaranjada-

café (Figura 2.2a), los cortes histológicos mostraron un córtex pseudoparenquimatoso

y médula filamentosa (Figura 2.2b).

a) b)

32x 5 cm

Capítulo II

42

Figura 2.2. Espécimen de A. subulata con las características representativas de la


microscopio estereoscopio a 32x. Se observa el cortéx y la médula teñidos con azul

de lactofenol.

Codium isthmocladum Vickers 1905. Phylum Chlorophyta, Familia Codiaceae. Se

caracteriza por un talo ramificado dicotómico, rugoso y suculento con un tamaño de 5

a 15 cm de largo y ramas corticadas, el alga presenta una coloración verde oscuro

(Figura 2.3a), el corte histológico mostró utrículos cilíndricos colocados radialmente

(Figura 2.3b).

Figura 2.3. Espécimen de C. isthmocladum con las características representativas

de la especie. a) vista macroscópica, b) corte transversal del talo observado bajo un

microscopio estereoscopio a 32x. Se observa utrículos y la médula teñidos con azul

a) b)

a) b)

32x

32x

3 cm

2 cm

Capítulo II

43

de lactofenol.

Dictyota dichotoma (Hudson) J.V.Lamouroux 1809. Phylum: Ochrophyta, familia

Dictyotaceae. Se caracteriza por talos dicotómicos, planos y firmes de hasta 14 cm de

altura, con ramas corticadas, el alga presenta una coloración café claro–amarillenta-

verdosa (Figura 2.4a), el corte histológico mostró un córtex simple con células

rectangulares y médula sencilla (Figura 2.4b).

Figura 2.4. Espécimen de D. dichotoma con las características representativas de la


microscopio estereoscopio a 32x. Se observa corteza y la médula teñidos con azul de

lactofenol.

Bryothamnion triquetrum (S.G.Gmelin) M.Howe 1915. Phylum Rhodophyta, familia

Rhodomelaceae. Se caracteriza por un talo erecto, con ramificaciones cortas tipo

espina, el alga presenta una coloración roja a café oscura (Figura 2.5a), el corte

histológico mostró un córtex con células corticales rectangulares muy pigmentadas, y

una médula con células globosas pericentrales (Figura 2.5b).

a) b)

a) b)

25x

25x

1 cm

2 cm

Capítulo II

44

Figura 2.5. Espécimen de Bryothamnion triquetrum con las características

representativas de la especie. a) vista macroscópica, b) corte transversal del talo

observado bajo un microscopio estereoscopio a 32x. Se observa cortex y la médula

teñidos con azul de lactofenol.

Se ingresaron a cada herbario dos ejemplares de las especies H. floresii, A. subulata,

C. isthmocladum, D. dichotoma y solo una de la especie B. triquetrum.

La especie H. floresii presentó una biomasa fresca colectada de 4,232 g siendo la más

representativa en la comunidad de Sisal, lo cual representa 4.3% de peso seco, la

especie A. subulata presentó el mayor porcentaje de peso seco (7.1%) y las especies

C. isthmocladum y D. dichotoma de 4.6 y 4.3%, respectivamente (Cuadro 2.5).

Cuadro 2.5 Biomasa colectada de algas marinas, peso húmedo colectado, peso seco y

porcentaje de peso seco.

Especie Peso húmedo colectado (g)

Peso seco (g)

Peso seco en % Lugar de colecta

H. floresii 4,232 185 4.3 Sisal

A. subulata 2,021 145 7.1 Sisal

C.

isthmocladum

1,410 66 4.6 Sisal

D. dichotoma 440 19 4.3 Dzilam de

Bravo

B. triquetrum 2,299 151 6.5 Sisal

2.15. Elección del método de elaboración de ECA´s

Se eligió el método de Ruiz-Ruiz et al. (2016) para realizar la extración porque se

obtuvo un mayor volumen de ECA y es un método práctico.

Con el método de Ruiz-Ruiz et al. (2016) se obtuvieron cinco ECA´s de cada especie y

se evaluó la actividad antifúngica contra los hongos fitopatógenos: P. fijiensis, F.

oxysporum y C. gloeosporioides.

Capítulo II

45

2.16. Bioensayo de actividad antifúngica del ECA de H. floresii

El extracto acuoso de de la primera colecta de H. floresii presentó actividad

fungiestática al inhibir temporalmente (tres días) el crecimiento del micelio de F.

oxysporum y C. gloeosporioides a las concentraciones 27.27 mg/mL (C4), 13.72

mg/mL (C3), 6.89 mg/mL (C2) y 3.44 mg/mL (C1) respectivamente (Figura 2.6 a, b). El

extracto de H. floresii presentó actividad inhibitoria del crecimiento del hongo P.

fijiensis a las concentraciones de 27.27 mg/mL (C4) y 13.72 mg/mL (C3) durante 30

días (Figura 2.7 y 2.8).

El extracto acuoso de C. isthmocladum presentó actividad fungistática (temporalmente

durante tres días) contra el hongo C. gloeosporioides. Los extractos acuosos de A.

subulata, D. dichotoma y B. triquetrum no presentaron actividad contra los hongos

evaluados.

Figura 2.6. Crecimiento del micelio de los hongos tratados con el ECA de H. floresii a

30 días de inoculación. a) C. gloeosporioides y b) F. oxysporum. Control (–), control

(+) y tratamientos a las concentraciones C4, C3, C2 y C1.

a) b)

Capítulo II

46

Figura 2.7. Inhibición del crecimiento micelial de P. fijiensis ocasionado por el

extracto crudo acuoso de H. floresii. Control negativo (C–), control positivo (C+).

Concentraciones activas: 13.72 mg/mL (C3) y 27.27 mg/mL. Evaluación a 30

días de inoculación.

Bajo microscopio se observó germinación de los conidios de P. fijiensis a las

concentraciones de 3.44 mg/mL (C1) y 6.89 mg/mL (C2) y conidios sin germinar a las

concentraciones de 13.72 mg/mL (C3) y 27.27 mg/mL (C4) (Figura 2.8).

Capítulo II

47

Figura 2.8. Conidios de P. fijiensis sin crecimiento micelial ocasionado por el ECA de

H. floresii. Control negativo (C–), control positivo (C+). Concentraciones activas: 13.72

mg/mL (C3) y 27.27 mg/mL (C4). C = conidio, M = micelio. Evaluación a 30 días de

inoculación.

Una segunda colecta fue realizada en el mes de noviembre del 2016 de la especie H.

floresii para comprobar la presencia de actividad antifúngica. El ECA no presentó

actividad contra los hongos P. fijiensis, F. oxysporum y C. gloroeosporoides.

2.17. Análisis de toxicidad del ECA de H. floresii

Debido a la búsqueda de extractos menos tóxicos que los fungicidas sintéticos es

necesario verificar si los extractos de origen algal con actividad inhibitoria presentan

toxicidad contra fauna benéfica, para esto se realizan estudios de toxicidad en

organismos modelo como Artemia salina o Eisenia foetida. Por lo cual en este estudio

se determinó la toxicidad del extracto de H. floresii de la primera colecta en las

especies modelo Artemia salina y Eisenia foetida.

100x 100x 100x

M

M

C

C

C

M

Capítulo II

48

2.17.1 Análisis de toxicidad del ECA de H. floresii sobre camarones de salmuera

(Artemia salina)

El ECA de H. floresii no presentó actividad tóxica contra Artemia salina a las

concentraciones evaluadas (1350, 675, 337.5 y 168.75 µg/mL). En el experimento se

observó una muerte natural del 11% de los organismos.

2.17.2 Análisis de toxicidad en lombriz de tierra (Eisenia foetida)

El ECA de H. floresii no presentó actividad tóxica contra Eisenia foetida a las

concentraciones evaluadas (27.27, 13.72, 6.89 y 3.44 mg/mL). En el experimento no

se observó muerte natural de los organismos.

2.18. Análisis del ECA de H. floresii mediante cromatografía en capa delgada

CCD

Se realizó una cromatografía en capa delgada (CCD) en placas de TLC gel de sílice

60 RP-18 F254s, donde se observaron bandas continuas con una relación frontal (Rf) de

0.25 a 0.8 en el extracto crudo acuoso de H. floresii (1). En la parte proteica del ECA

(2), se observaron bandas con una Rf de 0.8 y no se observaron bandas en la parte no

proteica (3) (Figura 2.9a). Al realizar la cromatografía en capa delgada (CCD) en

placas de TLC gel de sílice 60 F254 se observaron dos bandas con una Rf de 0.625 y

0.125, en el extracto crudo acuoso de H. floresii (1) en la parte proteica del ECA (2) no

se observaron bandas y en la parte no proteica (3) se observó una banda con una Rf

de 0.625 (Figura 2.9b).

Capítulo II

49

Figura 2.9. Cromatograma en capa delgada CCD del ECA (1), parte proteica (2)

y no proteica (3) de H. floresii con actividad antifúngica. a) TLC gel de sílice 60

RP-18 F254s y b) TLC gel de sílice 60 F254 revelado con ácido fosfomolíbdico.

2.19. Análisis del ECA de H. floresii mediante cromatografía líquida de alta

resolución (CLAR)

Para obtener un perfil de los componentes presentes en el ECA de H.floresii que

presentó actividad antifúngica contra P.fijiensis, se realizó una cromatografía líquida de

alta resolución (CLAR), donde se encontró que la longitud de onda de mayor

sensibilidad para la detección fue de 214 nm. El tiempo de corrida fue de 35 min y en

total se obtuvieron 23 picos, quince de esos picos se observaron en la primera parte

de la corrida de 0 a 10 min con un ancho de banda menor a 0.3 min y ocho picos en la

segunda parte de la corrida del minuto 14 al 35, los cuales presentaron una

sobreposición en la base de los picos. El cromatograma presentó tres picos

mayoritarios en los tiempos de retención 1.633, 23.047 y 23.900 con un máximo de

absorbancia a 319, 270 y 265 mAU y un porcentaje bajo la curva de 10.06, 12,28 y

10.74% respectivamente (Figura 2.10).

a) b)

Capítulo II

50

Figura 2.10. Cromatogramas del ECA de H. floresii a 214nm, a) Cromatograma con un tiempo de corrida de 35 min donde se observa la

presencia de tres picos mayoritarios con un tiempo de retención de 1.633, 23.047 y 23.900.

a)

Capítulo II

51

Figura 2.10 (continuación). Cromatogramas del ECA de H. floresii a 214nm, b) Ampliación del cromatograma del minuto 1 al 14 donde se

observa la presencia de un pico mayoritario con un tiempo de retención de 1.633 y 14 picos minoritarios c) Ampliación del cromatograma del

minuto14 al 35 donde se observa la presencia de dos picos mayoritarios con tiempos de retención de 23.047 y 23.900, respectivamente y

seis minoritarios.

b) c)

Capítulo II

52

2.20. Determinación de la actividad antifúngica del ECA de H. floresii mediante el

método de Alamar Blue

Se realizó un experimento a diferentes concentraciones de conidios y tiempos de

incubación con el objetivo de obtener una curva de reducción y así determinar las

condiciones óptimas para el experimento de viabilidad celular de los conidios de P.

fijiensis expuestos al ECA de H. floresii (Figura 2.11).

Figura 2.11. Curva de reducción de resazurina-resorufina. Concentraciones de

conidios de P. fijiensis a 40000, 20000 y 10000, tiempos de incubación 0, 24, 36 y 48

h.

Se eligió la concentración de 10,000 conidios y el tiempo de incubación de 36 h para

determinar el porcentaje de reducción e inhibición del ECA de H. floresii, dando como

resultados un porcentaje de reducción del 63.29% para el control positivo y de 47.32%

para el extracto de H. floresii (Figura 2.12). La actividad inhibitoria del ECA de H.

floresii sobre los conidios de P. fijiensis fue de 58.64% (Figura 2.13).

Capítulo II

53

Figura 3.12.- Reducción de resazurina-resorufina del ECA de H. floresii. Control

positivo (+) PDB.

Figura 3.13 Inhibición del ECA de H. floresii (27.27mg/mL) sobre conidios de P.

fijiensis. Control positivo (+) PDB.

Capítulo II

54

2.21. Extracción de fracciones orgánicas de H. floresii y bioensayo de actividad

antifúngica

La cantidad de material obtenido de las fracciones orgánicas de la especie H. floresii

se muestran en el Cuadro 2.6. La fracción acuosa y diclorometánica presentaron los

mayores rendimientos con 5208 mg y 155.9 mg respectivamente.

Cuadro 2.6 Material obtenido de las fracciones orgánicas de H. floresii.

Fracción

orgánica

Peso total

(mg)

Rendimiento

(%) respecto a

extracto crudo

Rendimiento

(%) respecto

material

usado (50g)

Etanol:agua

(Extracto crudo) 7097 100 14.1

Hexano 98 1.3 0.19

Diclorometano 155.9 2.2 0.31

Acetato de etilo 126.5 1.7 0.25

Acuosa 5208 73.37 10.41

La cantidad de material obtenido de las fracciones orgánicas de la especie C.

isthmocladum se observan en el Cuadro 2.7. La fracción hexánica presentó el más alto

rendimiento con 231 mg.

Capítulo II

55

Cuadro 2.7 Rendimiento de las fracciones orgánicas de C. isthmocladum

Fracción

orgánica

Peso total

(mg )

Rendimiento (%)

respecto a

extracto crudo

Rendimiento

(%) respecto

material

usado (30g)

Etanol:agua

(Extracto crudo) 6222 100 20.74

Hexano 231 3.71 0.77

Diclorometano 143.8 2.31 0.48

Acetato de etilo 65.8 1.05 0.22

Acuoso 1,935 31.1 6.4

Ninguna fracción orgánica presentó actividad inhibitoria o fungistática contra los

hongos evaluados.

2.22. Bioensayo de actividad antifúngica de la parte proteica del ECA de H.

floresii

La parte proteica del ECA de H. floresii fue activa contra el hongo P. fijiensis. Se

observó ausencia de crecimiento micelial a las concentraciones evaluadas [0.625

ng/µL (C1), 1.25 ng/µL (C2), 2.5 ng/µL (C3) y 5 ng/µL (C4)]. Se tomaron fotografías de

los conidios al inicio del experimento (Figura 2.14) y al finalizar la incubación de tres

días (Figura 2.15), al transferirse a cajas Petri con medio PDA se observó inhibición de

la germinación de los hongos (Figura 2.16) y a los 30 días de inoculación del hongo

(Figura 2.17). La parte no proteica no fue activa contra P. fijiensis (Figura 2.18).

Capítulo II

56

Figura 2.14. Conidios germinados al inicio del experimento.

Figura 2.15. Conidios de P. fijiensis sin crecimiento micelial ocasionado por la parte

proteica del ECA de H. floresii. Control negativo (C–), control positivo (C+).

Concentraciones activas: 0.625 ng/µL (C1), 1.25 ng/µL (C2), 2.5 ng/µL (C3) y 5

ng/µL (C4). (C4). C = conidio, M = micelio. Evaluación a 72h de incubación.

M

C C

C

C

C

Capítulo II

57

Figura 2.16 Inhibición del crecimiento micelial de P. fijiensis ocasionado por

la parte proteica del ECA de H. floresii. Control negativo (C–), Control

positivo (C+). Concentraciones activas: 0.625 ng/µL (C1), 1.25 ng/µL (C2),

2.5 ng/µL (C3) y 5 ng/µL (C4). Evaluación a 30 días de incubación.

Figura 2.17 Conidios de P. fijiensis sin crecimiento micelial ocasionado por la

parte proteica del ECA de H. floresii. Control negativo (C–), control positivo

(C+). Concentraciones activas: 0.625 ng/µL (C1), 1.25 ng/µL (C2), 2.5 ng/µL

(C3) y 5 ng/µL (C4). (C4). C = conidio, M = micelio. Evaluación a 30 días de

incubación.

C C

C C C

M

Capítulo II

58

Figura 2.18. Crecimiento micelial de P. fijiensis que indica ausencia de

actividad antifúngica de la parte no proteica del ECA de H. floresii. Control

negativo (C–), control positivo (C+). Evaluación a 30 días de incubación.

2.23 Perfil proteico de H. floresii

Se observaron diferencias en los perfiles proteicos de los ECA´s de H. floresii, esto es,

la intensidad de las bandas fue mayor en las muestras de la primera colecta la cual

presentó actividad antifúngica (Figura 3.19).

Capítulo II

59

Figura 2.19. Perfil proteico de los ECA’s de H. floresii. a) Muestra colectada en octubre

2016 de H. floresii con actividad antifúngica (HF1). b) Muestra colectada en noviembre

2016 de H. floresii sin actividad antifúngica (HF2). ECA, parte proteica (Pro) y no

proteica (NPro) del ECA H. floresii. (+) Activo, (–) inactivo. M = SDS-PAGE Standards,

Bio-Rad® (6.9 - 210 kDa).

+ + -

a) b)

20µL de carga

Capítulo II

60

2.24. DISCUSIÓN

Los arribazones en el Caribe Mexicano se originan debido al desprendimiento de los

talos o filoides de las macroalgas ocasionado por las lluvias y corrientes superficiales

durante la temporada ciclónica (mayo-octubre), los restos son arrojados a las costas al

final de la temporada (Castillo-Arenas y Dreckmann, 1995 citado por Dreckmann y

Santíes, 2013). Las macroalgas marinas de la península de Yucatán son abundantes

en su hábitat en la época de lluvias, debido a las escorrentías y a la surgencia de

aguas profundas que aportan nutrientes al ecosistema, (Mateo-Cid et al., 2013;

Ortegón et al., 2001), lo que provoca que la biomasa de macroalgas marinas en los

arribazones sea abundante. La ficoflora del litoral yucateco tiene características

tropicales, con una mayor abundancia de especies del phylum Rhodophyta (Mateo-Cid

et al., 2013).

En este trabajo se obtuvo una mayor abundancia de especies del phylum Rhodophyta

lo cual concuerda con las características de la ficoflora de la región. Los arribazones

en la zona costera de Yucatán son más frecuentes en los meses de octubre-febrero

comparado con el Caribe Mexicano. Especies como H. floresii, D. dichotoma A.

subulata, B. triquetrum y C. isthmocladum que se observaron en la la temporada 2016-

2017 (octubre-enero), concuerdan con las características tropicales del litoral yucateco

y son consideradas especies comunes en los arribazones.

Especies como H. floresii y B. triquetrum han sido reportadas como constituyentes de

arribazones en Yucatán y con alta presencia en la zona de Sisal (Rosado et al., 2011;

Ortegón y Aguilar, 2014) en este trabajo fueron componentes principales de los

arribazones.

En este estudio se reporta que el extracto crudo acuoso de H. floresii presentó

actividad fungicida contra conidios de P. fijiensis a las concentraciones 27.57 y 13.72

mg/mL, siendo estas concentraciones más bajas que las reportadas para extractos

acuosos de Sargassum polycystum y Sargassum tenerrimum, quienes fueron activos

contra Aspergillus niger a 100 mg/mL y 500 mg/mL, respectivamente (Kausalya y

Narasimba, 2015).

Las concentraciones en las cuales los extractos crudos acuosos de macroalgas

marinas presentan alguna actividad antifúngica en general es alta, cabe mencionar

que puede depender de la especie evaluada, método de extracción o el bioensayo

utilizado, adémas las características fisicoquímicas del agua que permiten la disolución

Capítulo II

61

de una amplia variedad de compuestos hidrofílicos como por ejemplo proteínas,

azúcares, taninos, saponinas y sustancias glicosiladas, entre otras, hacen difícil definir

el principio activo del extracto. Aunque en general los componentes mayoritarios

reflejan las características biofísicas y biológicas de los extractos evaluados (Bakkali et

al., 2008).

En el presente trabajo se observó actividad antifúngica en el extracto crudo acuoso y

ausencia de ésta en las fracciones orgánicas de H. floresii. Contrariamente se ha

reportado que el extracto etanólico de Sargassum polycystum ha presentado actividad

antifúngica contra Aspergillus niger y Rhizophus stolonifer a 100 mg/mL (Ambika y

Sujatha, 2015; Kausalya y Narasimba, 2015). La variación depende de la mayor

riqueza de compuestos extraídos por el disolvente utilizado, ya que compuestos

lipofílicos, glicolípidos, terpenoides fenólicos y otros, tienden a ser más solubles en

disolventes órganicos como el etanol y metanol que en agua (Dressman y Reppas,

2000; Ghanem et al., 1992) e incluso tiene un mayor potencial de presentar

propiedades antibacterianas y antifúngicas (El-Baky et al., 2008).

La cromatografía líquida de alta resolución es una técnica que permite la separación y

análisis de compuestos presentes en una muestra mediante el uso de un equipo

especializado. En el presente trabajo se reporta un perfil cromatográfico mediante

CLAR y CCD del extracto crudo acuoso de H. floresii, en el cual se observan picos y

bandas que posiblemente correspondan a pigmentos como clorofilas o carotenoides

ya que estos son solubles en disolventes orgánicos de media y alta polaridad, son

fáciles de extraer y su intensa absorción permite su detección a concentraciones muy

bajas (Garrido y Zapata, 1999). Para identificar los componentes de manera más

precisa en una muestra acuosa como es el caso del extracto de H.floresii es posible

realizar un análisis utilizando un equipo de cromatografía liquida de alta resolución con

un detector de arreglo de diodos y posteriormente un análisis de ionización en

electrospray en tándem con espectrometría de masas (HPLC-PDA-(–)ESI-MS/MS por

su siglas en inglés) (Tang et al., 2011).

Mediante el método colorimétrico Alamar Blue (AB) se verificó que el extracto de H.

floresii provocó la muerte de las conidios de P. fijiensis en un 58.64%, esto indica que

el extracto es fungicida sobre P. fijiensis confirmando los resultados en los bioensayos.

Este método ha sido utilizado exitosamente para determinar la viabilidad de hongos

filamentosos como Aspergillus spp., Fusarium spp. y Scedosporium spp. (Carrillo et

Capítulo II

62

al., 2006). También se han evaluado los efectos de ciertos fungicidas sobre el hongo

C. gloeosporioides donde los porcentajes relativos de inhibición son dependientes de

la concentración y tipo de compuesto (Rampersad y Teelucksingh, 2012). El método

de Alamar Blue es confiable para cuantificar la viabilidad de los conidios de P. fijiensis

expuestos al ECA de H. floresii.

En el presente trabajo, se observó una variación en la actividad antifúngica de los

extractos acuosos de H. floresii en muestras de dos colectas, lo que indica que

probablemente se deba a las condiciones ambientales como temperatura del agua,

salinidad, radiación solar, fenología de la especie o variación biogeográfica, ya que al

ser obtenida de arribazones se desconoce la procedencia de la especie, así como su

edad. Se han reportado variaciones en la composición de ácidos grasos en H. floresii

obtenida de las costas de Yucatán (Godínez et al., 2012). Asimismo, la actividad

antifúngica de extractos acuosos de Gracillaria chilensis (alga roja), contra

fitopatógenos como Phytophthora cinnamomi causante de la enfermedad llamada

“tinta del castaño” mostró dependencia de la dosis y temporada (Jiménez et al., 2011).

En otras especies de macroalgas, la actividad biológica de Laminaria sp, Codium sp,

Chondrus crispus y Ascophyllum nodosum contra Staphylococcus aureus fue

dependiente de la época del año (Hornsey y Hide, 1976).

También se ha observado que en algunas especies (e.g.Gracilaria blodgettii) se

producen variaciones en la cantidad de determinados metabolitos, en periodos cortos

(González et al., 2003); existe evidencia de que las algas marinas presentan variación

en concentración de determinados compuestos y que se relaciona con las zonas

biogeográficas en las que habitan (Steinberg, 1989). Al igual, compuestos

estructurales como el agar-agar obtenido del género Gracilaria son afectados en su

cantidad, calidad y fuerza por la condiciones ambientales (Marinho-Soriano y Bourret,

2003).

Los estudios antes mencionados podrían explicar que las muestras evaluadas de los

ECA’s de H. floresii presentaran variación en su actividad, esto es, que sólo el extracto

de la primera colecta tuviera actividad antifúngica aunque la diferencia de la fecha de

colectas fue de un mes.

Algunos autores mencionan que los elementos activos de algunas especies de

macroalgas marinas se producen o acumulan durante la época de lluvias mostrando

un aumento de la efectividad de diversos extractos (Jiménez et al., 2011). Incluso

Capítulo II

63

estos autores mencionan variaciones de compuestos relacionados a la edad de las

estructuras de las macroalgas, observando que en tejidos viejos se presentan mayor

concentraciones de metabolitos de defensa que propician que sean menos

susceptibles a ser consumidos por herbívoros (Cronin y Hay, 1996).

En este estudio se reporta por primera vez la inocuidad (CL50 > 27,750 µg/mL) del

extracto acuoso de H. floresii en Eisenia foetida, lombriz de tierra. Se han realizado

estudios sobre los efectos de extractos acuosos de macroalgas marinas en especies

de lombrices como Eudrilus eugeniae, que también resultaron ser inocuos (Karthick et

al., 2013). Al igual, el extracto acuoso de H. floresii mostró una concentración letal

media de CL50 > 27,750 µg/mL en Artemia salina, lo que confirma la inocuidad del ECA

de esta especie. La toxicidad de extractos orgánicos de H. floresii contra Artemia salina

ha sido reportada previamente con una CL50 > 1000 µg/mL (Freile-Pelegrín, 2008). En

resumen, el ECA de H. floresii fue inocuo contra A. salina y E. foetida, siendo un factor

a favor para su potencial uso agrícola e incluso como alimento o para la elaboración

de cósmeticos.

Diversos estudios se han realizado con H. floresii para evaluar actividad

anticoagulante (Gurgel-Rodrigues et al., 2011), aglutinante de eritrocitos (Chiles y Bird,

1989), antibacterial sobre Staphyloccocus aureus y Bacillus subtilis y actividad

antioxidante de extractos diclometano:metanol (Zubia et al., 2007). Se han reportado

metabolitos de naturaleza monoterpenica como por ejemplo, el terpeno loliólido que se

ha encontrado con una concentración media de 0.14 mg/g-1 (Percot et al., 2008).

Se han obtenido compuestos como el halymeniaol que presentó actividad inhibitoria

contra la malaria (Plasmodium falciparum cepa 3D7 resistente a la cloroquina)

(Meesala et al., 2017). También se ha evaluado su uso en la alimentación de moluscos

como Strombus pugilis (Sánchez et al., 2016), su cultivo para obtención de

carragenina (Robledo y Freile-Pelegrín, 2011) y la caracterización de ésta (Freile-

Pelegrín et al., 2011); la composición estacional de ácidos grasos (Godínez-Ortega et

al., 2012) y se ha reportado que la ingesta de polisacáridos sulfatados presentes en

esta especie favorece la movilidad gastrointestinal en ratas (Graça et al., 2011).

En cuanto a propiedad intelectual, se ha patentado una formulación líquida de proteína

y lambda carragenina para su uso como bebida (Sewall et al., 2011), la dosificación

sólida y liberación controlada de compuestos farmacéuticos, veterinarios y

nutracéuticos (e.g. analgésicos, antihistaminícos, antiepilépticos, antiinflamatorio,

Capítulo II

64

antibióticos, sedativos) usando lambda carragenina de Halymeniales (Sewall et al.,

2013) y su uso como bioabsorbente (Paul et al., 2014).

En este trabajo se hace hincapié en el posible uso agrobiotecnólogico del extracto

crudo acuoso de H. floresii debido a su potencial actividad antifúngica, a su

abundancia en la región y a su fácil acceso, cabe mencionar que es necesario evaluar

otras actividades biólogicas (e.g. antibacteriana, antiprotozoaria, antiviral y

antifúngica).

La concentración minima con actividad antifúngica in vitro del extracto crudo acuoso

de H. floresii contra P. fijiensis fue de 13.72 mg/mL. Es difícil comparar el extracto

evaluado con los biofungicidas comerciales ya que presentan principios activos

diferentes, asi como presentar actividades biológicas a diferentes concentraciones. En

el mercado existen varios biofungicidas como Fungi Free® elaborado con la bacteria

Bacillus subtilis con una dosis recomendada a la concentracion de 2mg/mL,

Natucontrol® elaborado con el hongo Trichoderma harzianum con una dosis

recomendada a la concentracion de 25mg/mL, Biogober® elaborado con extractos de

Ricinus communis y Larrea tridentata con una dosis recomendada de 1 a 1.5 L/Ha y/o

3 a 8 mL/L y Timorex gold® elaborado con la planta Melaleuca alternifolia con una

dosis recomendada contra P. fijiensis de 1.5 L/Ha aplicado de manera foliar. Cabe

mencionar que no hay productos antifúngicos agrícolas en el mercado elaborados a

partir de compuestos extraídos de macroalgas marinas, siendo un nicho de

oportunidad a desarrollar.

La actividad antifúngica de macroalgas marinas contra patógenos de cultivos agrícolas

se ha reportado desde el siglo XX, atribuyéndosela a metabolitos secundarios,

acuosos y proteicos. Existen pocos estudios que evalúan la actividad antifúngica de

compuestos proteicos provenientes de macroalgas marinas, aunque puede ser una

oportunidad de estudio ya que las macroalgas marinas en general son ricas en

proteínas con porcentajes en peso seco de 25 a 35% (Khanzada et al., 2007).

Se observó actividad fungicida en el ECA y la parte proteica del ECA contra conidios

de P. fijiensis, lo que indicaría que el origen del compuesto o compuestos activos

pudiera ser de origen proteico. Se han reportado extractos de macroalgas marinas con

actividad antifúngica que puede tener origen orgánico (El Shafay et al., 2016) o

proteico (Melo et al., 1997). Sin embargo, aún faltan evidencias que pudieran indicar

cuál es el origen del principio activo del ECA de H. floressi contra P. fijiensis, así como

Capítulo II

65

descartar la presencia de metabolitos residuales en la parte proteica del ECA de H.

floresii. Independientemente de esto, es importante mencionar que existen reportes de

actividad antifúngica de la parte proteica de otra macroalga roja, Hypnea musciformis,

contra Colletotrichum lindemunthianum atribuyéndose tal actividad a las aglutininas

(Melo et al., 1997), debido a que su mecanismo de acción antifúngica es probable que

sea similar a las aglutininas de trigo, esto es, que inhiban la síntesis de quitina

(Mirelman et al., 1975).

Las diferencias observadas en los perfiles proteicos de las muestras de las colectas de

H. floresii, pueden deberse a factores mencionados anteriormente como ambientales,

edad de los organismos y procedencia biogeográfica.

Reportes sugieren que complejos proteínas-polisacáridos como los proteoglicanos o

lectinas, pueden tener actividades biológicas (antivirales, anticoagulante, antifúngica) y

es posible que el origen de la actividad inhibitoria observada en H. floresii contra

conidios de P. fijiensis sea originada por alguno de estos compuestos, cabe mencionar

que para confirmar dicha aseveración es necesario realizar diversos estudios como

aislamientos de compuestos de naturaleza proteica mediante cromatográfia de

exclusión molecular o extracción de polisacáridos sulfatados con un alto porcentaje de

proteínas y evaluar individualmente la actividad antifúngica. Al igual, es recomendable

estudiar con más detalle las características fisicoquímicas del ECA de H. floresii

colectada de los arribazones y descartar que la actividad antifúngica observada contra

P. fijiensis sea ocasionada por contaminantes como metales pesados o pesticidas.

Para identificar el compuesto responsable de la actividad antifúngica de la parte

proteica del extracto crudo acuoso de H. floresii se podría utilizar una técnica como la

cromatografia líquida de exclusión molecular por ser de alta resolución y fácil

cuantificación (revisado por Benítez et al., 2008).

Las macroalgas marinas de arribazones son una fuente de compuestos prometedores,

de fácil acceso y abundantes. Fungicidas naturales desarrollados a partir de

macroalgas marinas, de baja toxicidad y eficientes, serían una alternativa a los

fungicidas sintéticos.

Capítulo III

66

CAPÍTULO IV

3. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

3.1. CONCLUSIONES

El ECA de Halymenia floresii colectada de un arribazón en el mes de octubre

del 2016 presentó actividad antifúngica in vitro contra P. fijiensis a las

concentraciones 27.27 mg/mL y 13.72 mg/mL.

El origen de la actividad antifúngica de H. floresii es de naturaleza proteica.

En la búsqueda de extractos de baja toxicidad y con actividad antifúngica, el

ECA de H. floresii es inocuo para Artemia salina y Eisenia foetida.

Las macroalgas marinas de arribazones son una alternativa sustentable, barata

y de fácil acceso para la investigación y el desarrollo de productos

biotecnológicos.

Capítulo III

67

3.2. PERSPECTIVAS Y RECOMENDACIONES

Para confirmar la actividad antifúngica del ECA y parte proteica del ECA de H.

floresii que se observó en este trabajo se recomienda colectar organismos de

arribazones de diferentes temporadas.

Para determinar si la especie es candidata a una explotación sustentable, se

recomienda evaluar la biomasa presente de H. floresii en los arribazones.

Se recomienda comparar la presencia o ausencia de la actividad inhibitoria en

los ECA’s de organismos de H. floresii colectados in situ durante varias

temporadas del año, determinando edad y condiciones ambientales donde se

desarrollan.

Profundizar en la identificación de los componentes proteicos de H. floresii para

detectar el principio activo (proteína o complejo proteína-polisacárido).

Los polisacáridos sulfatados presentan actividades biológicas interesantes, por

lo cual se recomienda extraerlos de H. floresii, cuantificar su porcentaje de

proteínas y evaluar su posible actividad antifúngica.

La actividad antifúngica observada en este estudio fue evaluada sólo contra

tres hongos fitopatógenos, por lo cual se recomienda evaluar la actividad

contra otros hongos fitopatógenos que afectan cultivos de importancia

comercial.

Para un mayor conocimiento sobre las características de los ECA’s y proteínas

de H. floresii y su potencial aprovechamiento se recomienda evaluar otras

actividades biológicas de H. floresii, como antibacteriana, antiviral y

antioxidante.

Las macroalgas de arribazón presentan actividades biológicas prometedoras,

por lo cual tienen potencial de ser aprovechadas para fines biotecnológicos.

El uso de las macroalgas de arribazones para fines biotecnológicos permitiría

disminuir los problemas causados por estos fenómenos a la población que vive

del turismo, además de desarrollar productos ecoamigables y con bajo impacto

ambiental.

Capítulo III

68

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Capítulo III

85

4.4 ANEXOS

Anexo 1. Tabla de conversión de Fuerza (g) a Revoluciones por minuto (rpm)

(Tech tip#40 Thermo scientific Convert between times gravity (×g)

and centrifuge rotor speed (RPM)

Fuente: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/TR0040-

Centrifuge-speed.pdf .

http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/TR0040-Centrifuge-speed.pdf

http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/TR0040-Centrifuge-speed.pdf