Advances in Biochemistryrcin.org.pl/Content/30340/WA488_24008_P939_T41-z4-PB.pdfpodziałowy komórek, na pewnym etapie mają te same wspólne mechanizmy regulacji (poprzez geny wczesnej

POLSKIE ■ TOWARZYSTWO BIOCHEMICZNE

Advances in BiochemistryTOM 41, NR 4 1995

Czy znamy już gen śmierci? . . .210 Gen SRY w determinacji płci . . 212 Diagnostyka molekularna . . . . 220 Terapia genowa — wektory i strategie .....................................230Markery molekularne................... 237Cykliczna przemiana rodników tlenowych ......................................... 243Domeny b łonow e.......................... 247RNaza L ............................................257Syntetazy aminoacylo-tRNA . . . 266 Fosfatazy fosfoproteinowe . . . . 276 Regulacja [Ca2+] .......................... 283

http://rcin.org.pl

BOEHRINGER MANNHEIMBiochemica

Odczynniki biochemiczne z następujących działów:* Przeciwciała m onoklonalne* A ntybiotyki - substancje do badania in vitro

* Enzym y i koenzym y* Cytokiny* G enetyka m olekularna

- PCR- D N A- Plazm idy- Enzym y restrykcyjne- Prim ery i linkersy- W zorce ciężaru D N A- N ukleotydy

* Czynniki w zrostu* H orm ony* Lecytyny* M itogeny* F itod iagnostyka* Proteazy

Zestawy diagnostyczne:* PC R* Bioluminescencj a/ Chemiluminescencj a* Zestawy ELISA (nieizotopowe m etody

badania w zrostu i śmierci kom órek)* Analizy żywności* F itodiagnostyka

Przedstawiciel i wyłączny dystrybutor w Polsce:

Hand-Prod Sp z o.o. ul. Ulrychowska 26

01-113 WARSZAWA tel/fax +48 22 374235

fax +48 26 626303

http://rcin.org.pl

WYDAWCAE ditorP O L S K IE TO W A R ZY STW O B IO C H E M IC Z N E Polish Biochemical Society ul. Pasteu ra 302-093 W arszaw a Poland

Drukarnia Naukowo-Techniczna Mińska 6503-828 Warszawa

REDAKCJAEditorial Board R E D A K TO R N A CZELN Y E ditor in chief Z O FIA Z IE L IŃ SK A tel. 31-24-03 R ED A K TO R ZY EditorsG RA ŻY N A PALAM ARCZYK tel. 658-47-02A N D R Z E J JE R Z M A N O W SK I tel. 659-70-72 w. 3234 A N N A SZA K IEL tel. 23-20-46JO L A N T A GRZY BO W SK A tel. 13-05-15

R E C E N Z E N C I ZESZYTU Referees of this issue JER ZY BAL(W arszawa)JO L A N T A BARAŃSKA (W arszawa)T A D E U S Z BILIŃ SK I (Zamość)A N N A IN G L O T (W rocław)TER ESA JA K U B O W IC Z (Lublin)A N D R Z E J JER ZM A N O W SK I (W arszawa)H A LIN A K RZA N O W SK A (K raków )W IESŁA W A LEŚNIAK (W arszawa)B O H D A N LEW A RTO W SK I (W arszawa)IR E N A S ZU M IE L (W arszaw a)L E C H W O JTC ZA K (W arszaw a)

ADRES REDAKCJIA ddressR E D A K C JA K W A R TA LN IK A„P O S T Ę P Y B IO C H E M II”IN S T Y T U T B IO L O G IID O ŚW IA D C Z A L N E Jim. M . N enckiego PANul. P as teu ra 302-093 W arszaw atel (2) 659-85-71 w. 332fax: (22) 22-53-42telex: 81-48-92

SPIS TREŚCI CONTENTS

Czy znamy już gen śmierci?Do we already know the death gene?EWA S IK O R A .......................................................................................... 210

Gen SRY — p ierw otny „w łączn ik" determinacji płci u człowieka?SRY-gene — a primary „sw itch ” in human sex determination? KAROLINA MICHALCZYK-JANITZ, MICHAŁ WITT, JADWIGA JA R U Z E L S K A .......................................................................................... 212

Diagnostyka molekularna: amplifikacja sekwencji czy wzmacnianie sygnału?Molecular diagnostics: sequence or signal amplification?RYSZARD SŁOMSKI, JOLANTA KW IATKO W SKA.....................220

Terapia genowa — w ektory i strategieGene therapy — vectors and strategiesŁUKASZ H U M IN IE C K I.......................................................................... 230

Markery molekularne w genetyce i hodowli roślinMolecular markers in plant genetics and plant breeding WALDEMAR M A R C Z E W S K I.............................................................. 237

Czy przemiany rodników tlenow ych w organizmie przebiegają cyklicznie?Does oxygen — radical metabolic — cycle exist in the organism? ROMAN G O N D K O .................................................................................243

Domeny w błonach biologicznych i ich znaczenie fiz jo logiczneDomains in biological membranes and their physiological significanceJOANNA BANDOROW ICZ-PIKUŁA..................................................247

Rola allosterycznej RNazy L w indukowanym przez in terferon układzie obronnym komórkiThe role of allosteric RNase L in interferon-induced defence system of the cellANDRZEJ W IE R Z B IC K I....................................................................... 257

Struktura i funkcja syntetaz am inoacylo-tRNAStructure and function of aminoacyl-tRNA synthetases MIROSŁAWA SIATECKA, JAN BARCISZEW SKI............................266

Serynow o/treoninowe fosfatazy fosfoproteinow e w tkance mózgowejSerine/treonine phosphoprotein phosphatases in brain tissue LUDMIŁA ŻYLIŃSKA, LILLA LAC HO W ICZ....................................... 276

Regulacja w ew nątrzkom órkow ego stężenia Ca2+ w komórkach niepobudliwychRegulation of intercellular Ca2+ concentration in nonexcitable cellsBARBARA NIEW CZAS.......................................................................... 283

http://rcin.org.pl

NOWE W BIOCHEMII

Czy znamy już gen śmierci?

D o we already know the death gene?

EWA SIKORA*

H ipoteza apoptozy, czyli genetycznego program owania śmierci kom órek, po wielu latach lekceważenia, zyskała należne miejsce we współczesnej biologii molekularnej. Początkow y sceptycyzm zniknął. Zastąpiła go fascynacja znacząco przyczyniając się do poznania m echanizmów tego biologicznego zjawiska. Podobnie jak podziały kom órek, apoptoza jest zjawiskiem fizjologicznym, niezbędnym do utrzym ania hom eostazy organizm u i jako taka jest procesem genetycznie kontrolow anym 1. Co więcej, uważa się, że obydwa procesy, zarów no śmierć program ow ana, jak i cykl podziałowy kom órek, na pewnym etapie m ają te same wspólne mechanizmy regulacji (poprzez geny wczesnej odpowiedzi kom órkowej, takie jak c-myc, c-fos i c-jun, niektóre cykliny i cyklino-zależne kinazy oraz geny supresorowe now otw oru, p53 i Rb) [1,2]. Rozwiązanie zagadki apoptozy przyczyni się z pewnością do lepszego zrozum ienia m echanizm ów onkogenezy, a tym samym do zracjonalizow ania m etod zw alczania choroby nowotworowej. M ożna się bowiem spodziewać, że kom órka now otw orow a to taka kom órka, k tóra uciekła nie tylko spod kontroli podziałów , ale na pewnym etapie transform acji nowotworowej w ym knęła się także spod kontroli śmierci.

Jednakże, chociaż każdy tydzień przynosi nowe ekscytujące doniesienia, musimy jeszcze trochę poczekać na możliwość uporządkow ania wszystkich fragm entów tej biologicznej układanki. B adania m echanizmów apoptozy zdają się obecnie koncentrow ać na obserwacji, że wiele różnych czynników stym ulujących różne szlaki przekazywania sygnału kom órkow ego indukuje apoptozę. Inaczej, chciałoby się spytać, czy pom im o różnic w przekazywaniu sygnałów zależnych od stanu fizjologicznego kom órki, takich jak dostępność substratu i czynników wzrostowych, wpływ sąsiadujących kom órek jak również etapu cyklu kom órkowego, stopnia zróżnicow ania i ekspresji genów indukujących i ham ujących apoptozę, działa w niej uniwersalny „w ykonawca” program u śmierci. I cho

* Zakład Biochemii K om órki, Insty tu t Biologii D ośw iadczalnej im. M. Nenckiego, P asteura 3, 02-093 W arszawa

ciaż zdecydowana większość badaczy podejm ująca zagadnienie apoptozy zastrzega się, że nie ma genu(ów) śmierci, to jednak daje się wyczuć mimowolne ukierunkowanie badań prow adzonych w najróżniejszych układach doświadczalnych w celu odkrycia wspólnych m echanizm ów śmierci. Bardzo obiecujące pod tym względem wydają się być proteazy cysteinowe z rodziny tzw. ICE/CED -3.

Gen ced-3 zidentyfikowano po raz pierwszy u nicienia Caenorhabditis elegans. M utacje tego genu pow odowały zaburzenia apoptozy kom órek ginących podczas morfogenezy tego nicienia [3]. Późniejsze sklono- wanie i zsekwencjonowanie genu ced-3 wykazało ho- mologię jego p roduktu białkowego z cysteinową pro- teazą występującą w tkankach ssaków, zwaną ICE [4], ICE (interleukin-1 - fi-converting enzyme) katalizuje reakcję konwersji prointerleukiny 1(3 do jej aktywnej formy, I L -1 (3, poprzez proteolityczne rozszczepienie w miejscu reszty asparaginianowej [5]. C ytokina IL- 1 (3 odgrywa zasadniczą rolę w ostrych i przewlekłych stanach zapalnych i chociaż, jako taka, nie ma nic wspólnego z apoptozą, to jednak wprow adzenie genu ice do szczurzych fibroblastów indukow ało w nich śmierć program ow aną [6], Jednakże, ostatnie badania myszy z am putow anym genem ice (tzw. knockout) wykazały występowanie procesu apoptozy w trak towanych deksam etazonem lub prom ieniam i gam m a tym ocytach [7]. Zachodzi więc podejrzenie, że ICE oraz cztery znane ludzkie proteazy cysteinowe rodziny IC E-/C ED -3 (ICErel-II, IC E rel-III, N edd-2/IC H -l i CPP-32) mogą wywoływać apoptozę w sposób niespecyficzny. W iadom o bowiem, że inne proteazy takie jak np. trypsyna, chym otrypsyna, proteinaza K, czy granzym B również indukują apoptozę. Stwierdzono jednak, że specyficzny inhibitor proteazy ICE, którym jest p roduk t białkowy genu wirusa ospy bydlęcej CrmaA, ham ow ał apoptozę indukow aną przez różne czynniki w różnych kom órkach, co wska-

1 W Postępach Biochemii ukazały się dotychczas dwa artykuły au tork i poruszające zagadnienie apoptozy w tomie 39, str. 212-220 i tomie 40, str. 150-160.

210 POSTĘPY BIOCHEMII 41(4), 1995http://rcin.org.pl

żuje na specyficzną rolę tej proteazy w apoptozie. W ykazano to: w neuronach kurczęcia indukow anych do śmierci poprzez pozbawienie ich czynnika wzrostu nerwu, w limfocytach ludzkich poprzez aktywację receptora Fas lub receptora czynnika nekrozy now otw oru (TNF), których rola w przekazywaniu sygnału do śmierci jest dobrze znana, w szczurzych fibroblas- tach hodow anych bez surowicy [8 i odsyłacze tamże]. P onadto , aktywacja receptora Fas nie wywoływała apoptozy w tym ocytach myszy z am putow anym genem ice [7]. Tak więc możliwość specyficznego udziału w apoptozie proteaz z rodziny IC E/C ED -3 wydaje się być wciąż bardzo ak tualna i otw arta. Tym bardziej, że wyniki doświadczeń przedstawione ostatnio w dwóch artykułach i opublikow anych w Celi i Naturę [8 i 9] wskazują na proteazę z rodziny C E D -3/IC E jako bezpośrednio zaangażowaną w procesie śmierci kom órkowej, oraz na jej substrat, k tóry autorzy jednej z tych prac [8] podnieśli do rangi „substratu śmierci”. M owa tutaj o proteazie, której substratem jest enzym poli(ADP-rybozo)polim eraza, w skrócie PARP.

PA R P jest białkiem jądrow ym , związanym strukturalnie z chrom atyną, wymagającym do swej enzymatycznej aktywności obecności naciętego DNA. Ponadto , aktywność tego enzymu wzrasta p ro p o rcjonalnie do uszkodzeń DNA. Uważa się, że enzym ten na równi z innymi, uczestniczy w reperacji i replikacji DNA, a także w transpozycji genów, do której niezbędny jest rozpad i ponow ne łączenie łańcuchów DNA [10]. Szczegółowa rola PA R P w apoptozie nie jest dotąd opisana, aczkolwiek pojawianie się jednego z produktów jego hydrolizy, o masie cząsteczkowej 85 kDa, opisano jako jeden z pierwszych sym ptomów apoptozy indukow anej przez leki przeciwnowotworowe w kom órkach wielu linii nowotworowych, czy w tym ocytach traktow anych glukokortykoidam i [11]. Enzym o aktywności proteazy hydrolizującej PA R P został ostatnio zidentyfikowany niezależnie przez duże grupy badaczy [8,9]. Jest to proenzym kodow any przez gen z rodziny ice/ced-3, który wcześniej został opisany pod nazwą C PP-32 [12]. D opiero proteolityczne rozszczepienie proenzym u uwalnia aktyw ną pod- jednostkę katalizującą hydrolizę PARP. N ieaktywny proenzym został nazwany przez jednych badaczy apopainą [9], a przez innych został ochrzczony imieniem hinduskiego Boga Śmierci Jam a (ang. Yama) [8]. Ponieważ rozpad PA R P wydaje się być biochemicznym znacznikiem apoptozy, proteaza katalizująca ten proces może odgrywać zasadniczą rolę w apoptozie kom órek ssaczych podobnie jak to m a miejsce w przypadku CED-3 w C.elegans. Należałoby jednak spraw dzić, czy kom órki zwierząt z am putow anym genem apopaina/yama nie są zdolne do śmierci program ow anej. Pozostaje również do wyjaśnienia znaczenie innych enzymów z tej rodziny (chociażby samego ICE), których substratem nie jest PARP. Ponieważ jednak aktyw na form a enzymu apopaina/yam a powstaje poprzez proteolityczne rozszczepienie nieaktywnego pro-

enzymu, nie wykluczone, że jest to właśnie zadanie dla proteaz C ED -3/IC E.

W świetle przedstawionych danych apoptoza zaczyna się jawić jako proces proteolitycznej kaskady, na końcu której różne sygnały zbiegają się na aktywacji, być może, jednej proteazy (apopaina/yam a?) katalizującej rozpad PARP, a być może także innych, dotychczas nie znanych „substratów śmierci”. N adal jednak nie wiemy w jaki sposób „substrat śmierci” dokonuje swojego dzieła. N a razie m ożna jedynie spekulować na ten tem at. Jednym z bardziej charakterystycznych i powszechnych zjawisk apoptozy jest fragm entacja DN A katalizow ana przez endonukleazy, których genów dotychczas nie sklonowano. A może fragment PA R P, 85 kD a, aktywuje endonukleazy? Nie wykluczone również, że niehydrolizowany PA R P wręcz blokuje aktyw ność endonukleaz. Te i inne pytania muszą na razie zostać bez odpowiedzi.

A rtykuł otrzymano 24 sierpnia 1995 r.Zaakceptowano do druku 14 września 1995 r.

Piśmiennictwo

1. P a n d e y S, W a n g , E (1995) J Celi Biochem 58: 135-1502. M e i k r a n t z W, S c h l e g e l , R (1995) J Celi Biochem 58:

160-1743. E l l i s H M , H o r t w i z H R (1986) Cell 44: 817-8294. Y u a n J - Y , S h a h a m S, L e d o u x S, E l l i s H M , H o r

t w i z H R (1993) Cell 75: 641-6525. C e r r e t t i D P , K o z l o s k y CJ , M o s l e y B, N e l s o n

N, N e s s KV, G r e e n s t r e e t TA, M a r c h CJ , K r o n - h e i m SR, D r u c k T, C a n n i z a r o LA, H u b n e r K, B l a c k R A (1992) Science 256: 97-100

6. M i u r a M, Z h u H, R o t e l l o R, H a r t w i e g E A, Y u a n J - Y (1993) Celi 75: 653-660

7. K u i d a K, L i p p k e J, K u G, H a r d i n g M W , L i v i n g s t o n D J Su, M S - S , F l a v e l l R A (1995) Science, 267: 2000-2003

8. T e w a r i M, Q u a n LT, O ’ R o u r k e K, D e s n o y e r S, Zeng Z, B e i d l e r D R , P o i r i e r G G , S a l v e s e n GS , D i x i t V M (1995) Celi 81: 801-809

9. N i c h o l s o n D, A l i A, T h o r n b e r r y NA, V a i l l a n - c o u r t J P , D i n g C K , G a l l a n t , M, G e r a u Y, G r i f f i n P R , L a b e l l e M, L a z e b n i k Y. A., M u n d a y NA, S a y y p a r a j u M R , S m u l s o n M E , Y a m i n T - T , Y u V L, M i l l e r D K (1995) Nature (Lond) 376: 37-43

10. D i n g R, P o m m i e r Y, K a n g V, S m u l s o n M. (1991) J Biol Chem 267: 12804-12812

11. K a u f m a n n S H, D e s n o y e r s S, O t t a v i a n o Y, D a v i d s o n NE , P o i r i e r G G (1993) Cancer Res 53: 3976-3985

12. F e r n a n d e s - A l n e m r i T, L i t w a c k G, A l n e m r i ES. (1994) J Biol Chem 269: 30761-30764

W . Mejbaum-Katzenellenbogen's Seminars 3. Liposomes in Biology and M edicineWrocław, Poland, June 3 -5 1996 Info: Prof. Arkadiusz Kozubek University of Wrocław, Inst. Biochemistry, Department of Genetic Biochemistry, ul. Przybyszewskiego 63/77,PL-51-148 Wrocław, Poland Fax (48) +71 252-930

POSTĘPY BIOCHEMII 41(4), 1995 211http://rcin.org.pl

ARTYKUŁY

Gen SRY — pierwotny „włącznik” determinacji płci u człowieka?*

SRY gen — primary „switch” in human sex determination?

KAROLINA MICHALCZAK-JANITZ1, MICHAŁ WITT2, JADWIGA JARUZELSKA3

Spis treści:

I. WstępII. Mapowanie genu kodującego czynnik determinacji płciIII. Transgen Sry powoduje „odwrócenie płci” u myszyIV. Struktura genu SRYV. Ekspresja genu SRY

V-1. Ekspresja genu SRY w pierwotnej gonadzieV-2. Ekspresja genu SRY w dojrzałym jądrze

VI. Mutacje genu SRY i ich wpływ na różnicowanie płciVII. Właściwości białka SRYVIII. Ekspresja zmutowanego białka SRY w układzie in vitroIX. Ewolucja genu SRYX. Podsumowanie

Contents:

I. IntroductionII. Mapping of the sex determining factor geneIII. Sry transgene causes „sex reversal” in mouseIV. Structure of the SRY geneV. Expression of SRY

V-1. Expression of SRY in a primary gonad V-2. Expression of SRY in mature testis

VI. Mutations of SRY gene and their influence on sexual differentiation

VII. Characteristics of SRY proteinVIII. Expression in vitro of mutant SRY geneIX. Evolution of SRY geneX. Conclusions

Wykaz stosowanych skrótów: T D F — czynnik determinujący pow stanie ją d ra u człowieka; PAR — region pseudoautosom alny; ZFY — region chrom osom u Y kodu jący dom niem any czynnik determ inacji płci o strukturze palców cynkowych; SRY — region determ inacji płci na chrom osom ie Y u człowieka; Sry — region determ inacji płci na chrom osom ie Y u myszy; kD — kilodalton; białka H M G — białka o wysokiej ruchliwości elektroforetycznej; T C F -I — czynnik transkrypcyjny specyficzny dla limfocytów T; LEF-1 — specyficzny limfoidalny czynnik wzm acniający; białka M c — białka odpowiedzialne za rozm nażanie płciowe drożdży; Stel 1 — czynnik niepłodności u drożdży; CAT — acetylotransferaza chloram fenikolu; N G F — czynnik wzrostu nerwu; E G F — czynnik wzrostu naskórka; LTR— długie sekwencje zasad pow tarzające się terminalnie; W T 1— czynnik odpowiedzialny za wystąpienie guza Wilmsa; PCR — reakcja łańcuchowa polimerazy; RT-PC R — o d w rotna reakcja łańcuchow a polimerazy; A M H — horm on antymiillerowski; SOX — sekwencja hom ologiczna z ko n serwatywnym regionem genu determ inacji płci; DSS — czynnik w arunkujący odwrócenie płci, wrażliwy na efekt dawki.

* A rtykuł napisany w ram ach realizacji projektu badaw czego KBN N r 405319101

Mgr, 2 d r hab. 3 dr Zakład G enetyki Człowieka PAN, ul. Strzeszyńska 32, 60-479 Poznań

I. Wstęp

Badania różnicowania płci, a szczególnie badanie m echanizm u jej genetycznej determ inacji są kluczowe dla genetyki człowieka nie tylko ze względów poznaw czych, lecz również ze względów praktycznych. W ystępowanie bowiem dość częstych i niejednorodnych pod względem objawów przypadków patologicznych oraz ich diagnozow anie i leczenie, na obecnym etapie wiedzy, stanow ią trudny problem medyczny. Różnicowanie płci to złożony proces, w którym arbitralnie wyróżnia się kilka etapów: genetyczna determ inacja płci, powstanie wewnętrznych i zewnętrznych narządów płciowych oraz dojrzewanie płciowe. Pojęcie genetycznej determ inacji płci oznacza mechanizm odpowiedzialny za różnicowanie bipotencjalnej gonady pierwotnej w gonadę m ęską (jądro) lub żeńską (jajnik). Z akładano, że charakter różnicow ania zależy od specyficznego sygnału, którym jest obecność czynnika determ inującego rozwój jąd ra (ang. testis determining factor — TD F). Sygnał ten pojawia się na przełomie szóstego i siódmego tygodnia życia zarodka o kariotypie męskim (XY). Po jego zadziałaniu pierw otna gonada różnicuje się w jądro . W przypadku zarodka o kariotypie żeńskim XX, w którym T D F nie wy


stępuje, gonada rozwija się w jajnik. Początek różnicow ania się jajn ika następuje jednak dopiero między jedenastym a dwunastym tygodniem życia płodowego. Drugi e tap różnicowania płci to powstanie wewnętrznych i zewnętrznych narządów płciowych. W przypadku płodu męskiego proces ten uw arunkow any jest wpływem horm onów wydzielanych przez płodowe jądro , natom iast w przypadku płodu żeńskiego rozwój wewnętrznych i zewnętrznych narządów płciowych wydaje się zachodzić niezależnie od różnicowania jajn ika; także w przypadku patologii charakteryzujących się brakiem gonady następuje różnicowanie płci typu żeńskiego [1]. Trzeci etap to okres dojrzewania płciowego, w którym pojawiają się cechy płciowe w tórne. U kształtow ana ostatecznie płeć fenotypowa w yznaczona jest przez różnice w budowie zewnętrznych narządów płciowych oraz różnice we wtórnych cechach płciowych [2]. Prawidłowy rozwój cech płciowych zależny jest od wielu genów, występujących w chrom osom ie Y, X oraz w autosom ach. Geny te zapewniają syntezę czynników, hormonów, białek receptorowych w odpowiedniej ilości i sekwencji czasowej.

II. Mapowanie genu kodującego czynnik determinacji płci

M olekularne badania m echanizmu determ inacji płci skupiały się w ostatnich latach na próbie sklonow ania i charakterystyki genu kodującego czynnik TD F. Z akłada się, że czynnik ten jest aktywny w bardzo krótkim przedziale czasowym na wczesnym etapie rozwoju zarodkow ego i działa jako „w łącznik” u ru cham iający kaskadę reakcji prowadzących do pow stania fenotypu męskiego.

Podjęto próby zlokalizowania genu T D F w ludzkim chrom osom ie. Był to klasyczny przykład strategii zwanej klonowaniem pozycyjnym, dawniej określanej jako odw rotna genetyka (ang. reverse genetics). S trategię tę stosuje się w poszukiwaniu genu odpow iedzialnego za chorobę, gdy produkt genu i jego funkcja nie są znane. Pom ocne w lokalizacji genu T D F okazały się przypadki pacjentów z aberracjam i liczby i struktury chrom osom ów płci. Wskazywały one, że niezależnie od liczby chrom osom ów X, obecność chrom osom u Y determ inow ała fenotyp męski. Stąd wyciągnięto wniosek, że gen T D F zlokalizowany jest w chrom osom ie Y [3,4], Ludzkie chrom osom y płci X i Y, w odróżnieniu od autosom ów, nie stanow ią pary chrom osomów homologicznych. Jednak w obrębie krótkich ram ion chrom osom u Y oraz X występuje niewielki region homologiczny, zwany przez to regionem pseudoautosom ow ym (ang. pseudoautosomal region-PAR) (Rye. 1) [5], W procesie spermatogenezy podczas mejozy dochodzi w tym regionie do rekom binacji typu crossing-over pomiędzy chrom osom am i X i Y [6,7] (Rye. 1A).

Zaobserw ow ana patologia rekombinacji mejotycz- nej w regionie pseudoautosom ow ym była dalszą w ska

zówką dla lokalizacji T D F w obrębie chrom osom u Y. Stwierdzono mianowicie, że u niektórych bezpłodnych mężczyzn występować może kariotyp 46,XX, na to miast u niektórych kobiet z pierwotnym brakiem miesiączki zdarza się kariotyp 46,XY. Zastosowanie technik cytogenetycznych i molekularnych doprow adziło do stwierdzenia, że podłożem obydwu patologii była nieprawidłowa rekom binacja w regionie pseudoautosom owym [8-10], Zaburzenie to polegało na tym, że fragment chrom osom u Y przylegający do regionu pseudoautosom ow ego był przeniesiony na chrom osom X (Rye. IB). To nieprawidłowe przegrupowanie DNA jest przyczyną niezgodności płci genetycznej z płcią fenotypową (mężczyźni o kariotypie 46,XX i kobiety o kariotypie 46,XY), określanej jako „odwrócenie płci” (ang. sex reversal). Powyższe odkrycie wskazywało, że locus T D F występuje w przeniesionym fragmencie chrom osom u Y w pobliżu regionu pseudoautosom owego, więc szukano tutaj locus TD F. Pom ocne w tym zakresie okazało się mapowanie delecyjne chrom osom u Y. Technika ta polega na hybrydyzacji DNA, pochodzącego od pacjentów o różnym zakresie delecji chrom osom u Y określonych cytogenetycznie, ze specyficznymi sondam i kom plem entarnym i do loci chrom osom u Y. Korzyści m apow ania delecyjnego są dwojakie: umożliwia ono dokładniejszą ocenę zakresu delecji oraz uszeregowanie loci chrom osom u Y [11]. M apow anie delecyjne doprow adziło do wyróżnienia w chrom osom ie Y siedmiu interwałów delecyjnych[12]; w niektórych dodatkow o wyróżniono podinter- wały [13-15] (Ryc. 2). M apowanie delecyjne regionu sąsiadującego z regionem PAR wykonywano przy użyciu DNA mężczyzn o kariotypie 46,XX, u których cytogenetycznie stw ierdzono różnej długości fragmen-

A

x Y x YB

XX mężczyzna

4XY

kobieta

X Y X YRvs. 1 Rekom binacja mejotyczna (crossing over) pomiędzy chrom o

som am i X i Y.A — prawidłow y crossing over w obrębie regionu pseudoautosom ow ego. prowadzący do pow stania kobiety o kario typie 46.XX oraz mężczyzny o kariotypie 46.XY. B — Nieprawidłowy crossing over w obrębie regionu pseudoautosomowego, polegający na przeniesieniu fragm entu z locus T D F na chrom osom X. R ekom binacja taka jest podłożem pato logii tak zwanej odwróconej płci: locus T D F na chrom osom ie X w arunkuje fenotyp męski (mężczyźni o kariotypie 46.XX), a delecja locus T D F na chrom osom ie Y w arunkuje fenontyp żeński (kobiety o kariotypie 46,XY).


CHROMOSOM Y

p q

Ryc. 2 E tapy m apow ania genu SRY w obrębie chrom osom u Y.p — krótk ie ram ię chrom osom u Y; q — długie ram ię chrom osom u Y; cen — centrom er; PAR — region pseudoautosom ow y; H — region heterochrom atyny; 1-7 — in terwały delecyjne; 1A-1C oraz 4A i 4B — podinterw ały delecyjne; SRY — region determ inacji płci występujący w chrom osom ie Y u człowieka; Z FY — region chrom osom u Y człowieka kodujący białko o strukturze palców cynkowych.

ty krótkiego ram ienia chrom osom u Y. W ten sposób w podinterwale 1A2 określono najmniejszy region chrom osom u Y, wystarczający do pow stania fenotypu męskiego u osoby o kariotypie żeńskim (46,XX). W regionie tym, obejmującym 140 kz zidentyfikowano gen ZFY (ang. zinc finger Y), którem u przypisano funkcję T D F [16] (Ryc. 2). W ykazano, że gen ZFY występuje u wszystkich wyższych ssaków. Stw ierdzono także, iż gen ten koduje białko zawierające 13 dom en o strukturze palców cynkowych, wykazujące znaczny konserwatyzm ewolucyjny. W ystępowanie struktury palców cynkowych sugerowało, że białko ZFY jest czynnikiem transkrypcyjnym , który poprzez wiązanie z DNA mógłby inicjować procesy różnicowania płci w kierunku męskim [16]. W ykazano ponadto, że homologiczne geny u myszy (Zfy-1, Zfy-2) występują w regionie Sxr chrom osom u Y, którego udział w determinacji płci został już wcześniej opisany [17,18]. Jednak dalsze badania podważyły rolę ZFY jako T D F. Stw ierdzono mianowicie, że u człowieka sekwencje wykazujące homologię z genem ZFY występują rów nież w chrom osom ie X (locus ZFX) [16,19]; natom iast u torbaczy występują one w autosom ach [20]. P o n ad to, ekspresja genu Zfy-1 w zarodku mysim ma miejsce w kom órkach gametogenicznych, które nie biorą udziału w różnicowaniu jąd ra [21]. O pisano także cztery przypadki mężczyzn o kariotypie 46,XX u k tó rych fragment chrom osom u Y o długości 35 kz, pochodzący z podinterw ału 1A2, przeniesiony na X (translokacja), nie zawierał locus ZFY [22]. K ró tko potem, we fragmencie tym zidentyfikow ano nowy gen nazywany SRY (ang. sex-determining region Y) (Ryc. 2). Gen SRY, podobnie jak gen ZFY, występuje u wszyst

kich ssaków wyższych, jednak wyłącznie w chrom osomie Y [23]. W ykazano ponadto, że w przypadku m utantów myszy z delecją hom ologu tego genu (Sry) [24], nie dochodziło do różnicowania się pierwotnej gonady w jąd ro [25]

III. Transgen Sry powoduje „odwrócenie płci” u myszy

N ajbardziej spektakularnym doświadczeniem, stanowiącym bezpośredni dow ód na to, że gen Sry jest czynnikiem determ inującym płeć męską, było uzyskanie myszy transgenicznej pod względem genu Sry. Fragm ent genomowego DNA myszy o długości 14 kz, zawierający gen Sry oraz jego sekwencje regulatorowe, w prow adzono do zapłodnionej kom órki jajowej o kariotypie 46,XX. W 25% przypadków uzyskanych w ten sposób myszy transgenicznych występował fenotyp męski o prawidłowej strukturze histologicznej jąder, pozbawionych jednak kom órek gametogenicznych. Doświadczenie to wskazywało, że gen SRY jest wystarczającym czynnikiem w determ inacji różnicowania gonady. Sugerowano, że zaburzenie ekspresji genu Sry było przyczyną tego, że w niektórych myszach transgenicznych „odwrócenie płci” nie wystąpiło. Próby uzyskania myszy transgenicznych zawierających ludzki gen SRY nie powiodły się. Być może w trans- fekowanym fragmencie DNA zawierającym gen SRY nie było wszystkich regionów regulatorow ych niezbędnych dla jego prawidłowej ekspresji. M ożna przypuszczać, że różnice w budowie genów SRY i Sry w arunkują ich odm ienną interakcję z białkam i regulatorow ymi i genami docelowymi. Możliwe również, że w kom órkach mysich dochodzi do zaham ow ania lub nieprawidłowej translacji transkryptu genu SRY, albo powstałe białko SRY nie jest stabilne i ulega degradacji [26].

IV. Struktura genu SRY

Gen SRY nie zawiera intronów i koduje białko0 wielkości 204 am inokw asów i masie 23.9 kD [23,27] (Ryc. 3). W środkowej części jego cząsteczki występuje motyw o długości 80 am inokwasów , homologiczny z odpowiedzialnym za wiązanie się z DNA motywem białek H M G (ang. high mohility group). M otyw H M G jest typowy dla wielu białek regulujących transkrypcję1 różnicowanie [28,29]. W ystępowanie pojedynczej dom eny H M G i specyficzność tkankow a wskazują na ścisłe pokrewieństwo białka SRY z kilkom a czynnikam i transkrypcyjnym i. Należy do nich czynnik transkrypcyjny występujący w limfocytach T tj. TCF-1 (ang. T lymphocyte-specyfic transcription factor), LEF- 1 (ang. lymphoid-specyfic enhacer factor) [30,31], regulatorowe białko Mc odpowiedzialne za rozm nażanie płciowe drożdży [32] oraz czynnik niepłodności d rożdży S te ll (ang. yeast sterility factor) [33]. O becność w transfekowanych kom órkach mysich dwóch trans- kryptów genu SRY o długości około 1.1 kz wskazuje na


Rye. 3 S tru k tu ra locus SRYH M G — konserw atyw ny region H M G genu SRY; AT — regiony bogate w pary AT; P — region prom otorow y; C G — region o wysokiej zaw artości par CG; P G — pseudogen genu SRY. Zaznaczono miejsca w iązania się czynników transkrypcyjnych (SP1, T F IID , WT1), w zm acniach transkrypcji kB; sekwencje osłabiające transkrypcję S (ang. silencers) oraz miejsca wiązania się białka SRY [SRY( + ), SRY( —)] występujących w przeciwnej orientacji.

występowanie dwóch miejsc inicjacji transkrypcji [27]. W ykazano, że prom otor genu SRY zaw arty jest w regionie 310 pz bezpośrednio sąsiadującym z genem struktury. Jest zaskakujące, że prom otor genu SRY wykazuje cechy charakterystyczne dla prom otorów genów o ekspresji konstytutywnej: brak regionu TATA, znaczna liczba par G-C (60%) a ponad to dwa miejsca w iązania czynnika Spl [34]. W regionie 5' bardziej oddalonym od miejsca inicjacji transkrypcji zidentyfikowano motyw TATAAA zgodny z motywem TATA wiążącym czynnik transkrypcyjny T F IID . W regionie tym jest również obecny motyw G G G G A C T T T C C hom ologiczny z sekwencją wzmacniacza (ang. enhancer) kB prom otorów genów kodujących łańcuch ciężki im munoglobulin, lekki łańcuch k, prom otora LTR wirusa HIV oraz p rom otora genu kodującego łańcuch a receptora interleukiny 2. W regionie flankującym 5' zidentyfikowano ponad to sekwencje osłabiające transkrypcję (ang. silencers) (Ryc. 3) [27]. O becność dwóch regionów AACAAG opisanych jako miejsca wiązania białka SRY (SRY1 + i SRY-) sugeruje, że białko to wiąże się z własnym prom otorem (Ryc. 3) [27,35,36]. W regionie flankującym 5' występuje ponadto sekwencja C G C C C C C G C (Ryc. 3), opisana jako miejsce wiązania białek zawierających palce cynkowe, np. białka WT1 (czynnik odpow iedzialny za wystąpienie guza Wilmsa). Jest interesujące, że delecje i mutacje punktowe genu WT1 pow odują nieprawidłowości w rozwoju gonad oraz zewnętrznych narządów płciowych, u osób z chrom osom am i płci X Y. Białko WT1 jest przypuszczalnie represorem transkrypcji i przynajmniej u myszy ulega ekspresji w listwie płciowej. Być może niektóre białka zawierające palce cynkowe, w sposób bezpośredni aktywują lub ham ują transkrypcję ludzkiego genu SRY [37].

Brak intronów w genie SRY może wskazywać na to, że gen SRY jest retropozonem powstałym poprzez przepisanie transkryptu genu przodka na D N A i w budowanie do genomu. W skazywałaby na to również obecność dwóch bloków bogatych w pary A-T w regionie flankującym 5' i 3'. W obydwu blokach A-T oraz pomiędzy nimi występują liczne pow tórzenia tandemowe (ang. tandem repeats), odwrócone pow tórzenia (ang. inverted repeats), pow tarzalne sekwencje o odwrotnej orientacji (ang. co m p lem en ta ry inverted repea ts) oraz struktury szpilki do włosów (ang. hairpin). N iektóre z nich występują w sąsiedztwie transposonów biorąc udział w ich przemieszczaniu w obrębie genom u

[praca przegląd. 38]. W regionie 3' cDNA genu SRY zidentyfikowano przypuszczalny sygnał poliadenylacji AATAAA oraz pięć sekwencji powtórzonych, przypom inających sygnały poliadenylacji w bloku A-T 3'. Podobnie w bloku A-T 5' występuje pięć odwróconych powtórzeń kom plem entarnych. Ta szczególna organizacja flankujących gen SRY wspiera twierdzenie, że bloki A-T mogły brać udział w transpozycji genu SRY [27] (Ryc. 3).

V. Ekspresja genu SRY

V-l. Ekspresja genu SRY w pierwotnej gonadzie

Ekspresja genu SRY u ssaków ma miejsce w pierwotnej, niezróżnicowanej gonadzie. G onada ssaków składa się z kom órek gametogenicznych, oraz kom órek som atycznych trzech typów. K om órki somatyczne gonady to kom órki podporow e (kom órki Sertoliego u samca i kom órki pęcherzykowe u samicy), kom órki steroidogenne (kom órki Leydiga u samca i kom órki osłonki pęcherzyka u samicy) i wreszcie kom órki tkanki łącznej. D okładny moment, w którym Sry determ inuje rozwój gonady męskiej nie jest znany. Stwierdzono, że Sry ulega ekspresji w okresie od 10.5 do 12.5 dnia po zapłodnieniu, w którym dochodzi do charakterystycznego uszeregowania pierwotnych kom órek Sertoliego w sznury płciowe (ang. g en ita l cords) [39]. Ekspresja Sry występuje być może już wcześniej, ale wykrycie transkryptów było trudne, ponieważ izolowano je z całych em brionów. Potwierdzeniem przypuszczenia wcześniejszej ekspresji Sry było doniesienie, w którym transkrypty Sry wykryto w mysim zarodku w stadium preim plentacyjnym, co świadczy, że inicjacja determ inacji płci zachodzi przed rozpoczęciem różnicowania się gonady w jąd ro [40]. N ieznany jest również dokładny okres w którym proces determ inacji płci zostaje zakończony. Poprzez analizę RNA pochodzącego z gonad przy pomocy techniki R T-PCR wykazano jedynie, że w 13.5 dnia po zapłodnieniu transkrypty Sry nie są już wykrywalne [39],

Dla poznania kaskady procesów związanych z determ inacją i różnicowaniem płci istotne było wyjaśnienie, w których kom órkach pierwotnej gonady Sry ulega ekspresji. Obecność transkryptów Sry w listwie płciowej w okresie od 10.5 do 12.5 dnia po zapłodnieniu sugeruje, że głównym miejscem transkrypcji tego genu są prekursory kom órek Sertoliego. Potw ier


dzenie tej hipotezy przyniosły badania przeprow adzone u myszy homozygotycznych pod względem mutacji w locus W (ang. white spotting) [39]. C harakterystyczną cechą tych myszy jest brak w nich kom órek gametogenicznych w praw idłow o rozwijającym się jądrze. Stwierdzenie w nich ekspresji genu Sry wykluczyło udział prekursorów kom órek gametogenicznych w procesie wykształcania się jądra.

V-2. Ekspresja genu SRY w dojrzałym jądrze

Zaskakujące było odkrycie, że zarów no ekspresja mysiego Sry jak i ludzkiego SRY m a miejsce ponownie w jądrze osobnika dorosłego [23,24]. Co więcej, ekspresja Sry u myszy jest znacznie silniejsza w jądrze niż w pierwotnej gonadzie. T a ponow na ekspresja genu Sry jest obserw ow ana u myszy pomiędzy dwudziestym pierwszym a dwudziestym ósmym dniem po urodzeniu. Stwierdzono to głównie w kom órkach gam etogenicznych [39], a w znacznie mniejszym stopniu w kom órkach Sertoliego [41]. Sugeruje się, że w dojrzałym jądrze gen Sry może uczestniczyć w regulacji procesu spermatogenezy.

Stwierdzono, że u myszy ponad 89% transkryptów genu Sry występowało w formie kolistej. Zatem u m yszy transkrypt Sry w pierwotnej gonadzie i w jądrze osobnika dorosłego różnią się znacznie. Koliste transkrypty wykrywano wyłącznie w cytoplazmie, n a to miast w jądrze kom órkow ym niewielką ilość formy liniowej reprezentującej być może niedojrzałą postać transkryptów genu Sry. Nie wykryto aktywności translacyjnej kolistych transkryptów . Analiza sekwencyjna klonu genomowego Sry wykazała obecność ramki odczytu obejmującej 2.7 kz, zawierającej region HM G , a po jej obydwu stronach występowanie długich odwróconych sekwencji powtórzonych (ang. large inverted repeat). M ożna założyć, że sekwencje te odgrywają rolę w generowaniu kolistych transkryptów . Znaczenie kolistych transkryptów ' w jądrach myszy nie jest ostatecznie wyjaśnione. M ożna założyć, że poprzez brak aktywności translacyjnej mogłyby one stanowić element regulacyjny w ekspresji genu Sry. [42,43]. W ykazano, że w jądrze dorosłego mężczyzny brak kolistych transkryptów genu SRY [37]. Może to wynikać z faktu, że w locus SRY człowieka powtórzone sekwencje odwrócone nie występują.

VI. Mutacje genu SRY oraz ich wpływ na różnicowanie płci

M utacje genu SRY pow odują „odwrócenie płci” i przez to stanowią jeden z najważniejszych dowodów, że gen SRY koduje czynnik TD F. Zidentyfikowano dotąd 23 mutacje genu SRY [44-57]. M utacje te ham ują różnicowanie gonady męskiej, czego skutkiem jest jej wczesna degeneracja w okresie zarodkowym , prow adząca do całkowitej dysgenezji (ang. complete gonadal dysgenesis). Ten skrajny typ dysgenezji (nie

prawidłowego rozwoju gonad) polega na występowaniu w miejscu gonad pasm łącznotkankowych. Płeć fenotypowa jest w tym przypadku żeńska. W genie SRY wykazywano najczęściej m utacje zmiany sensu. Inne, to mutacje nonsensowe i m utacje zmiany fazy odczytu. Wszystkie znane mutacje, z wyjątkiem jednej, występowały w konserwatywnym regionie HM G. Chociaż większość wykrytych mutacji genu SRY p o wstała de novo, opisano kilku pacjentów, którzy odziedziczyli je od swoich ojców. Przypadki te wskazują, że ten sam zm utowany allel genu SRY u jednej osoby (ojciec) nie powoduje zaburzeń, natom iast u innej (dziecko) prowadzi do patologii. Fenotyp osób ze zm utowanym genem SRY, jest albo żeński z to warzyszącą mu dysgenezją gonad, albo męski i p ra widłowy (brak zaburzeń w różnicowaniu płci). W yjątkiem od tej reguły był jeden przypadek obojnactw a[58]. U tego pacjenta m utacja genu SRY mogła wystąpić w stadium postzygotycznym wczesnego e ta pu rozwoju, co mogło prowadzić do mozaicyzmu w obrębie gonady. Stwierdzono, że tylko u około 15% kobiet o kariotypie 46, XY występuje m utacja genu SRY. M ogłoby to oznaczać, że u pozostałych pacjentek m utacja występuje w regionie regulatorowym genu SRY lub w innym genie odpowiedzialnym za determ inację płci.

VII. W łaściwości białka SRY

Obecność konserwatywnego motywu H M G w genie SRY wskazywała na możliwość wiązania się białka SR Y z DNA. Badania białka SRY techniką opóźnienia migracji w żelu (ang. gel retardation) potwierdziły te przypuszczenia. Badania kom pleksów SRY/AACAA- AG uzyskanych w układzie in vitro wskazywały, że białko SRY wykazuje powinowactwo tylko do po- dwójnoniciowego DNA [36]. Stwierdzono, że białko SRY może się wiązać z DNA w różny sposób, jak to przedstawiono na rycinie 4. Pierwszy z nich to m ożliwość specyficznego wiązania białka SRY z bogatą w pary A-T sekwencją AACAAAG (Rye. 4A). In terak cja białka SRY z DNA następuje w mniejszym rowku DNA i powoduje wygięcie cząsteczki DNA o około 83° [56, 60]. W ykazano, że czynniki transkrypcyjne TC F- la , LEF-1 i Stel 1 z rodziny białek zawierających H M G rozpoznają tę sam ą co białko SRY sekwencję DNA. Jest to zaskakujące, ponieważ białka te cechuje niewielkie podobieństw o strukturalne z motywem H M G genu SRY i biorą udział w regulacji transkrypcji genów o innej specyficzności tkankowej niż gen SRY. Sugerowano, że właściwość białka SRY zginania helisy DNA może prowadzić do utw orzenia stabilnego specyficznego kom pleksu nukleoproteinow ego, um ożliwiającego wzajemne oddziaływanie wchodzących w je go skład białek. Możliwe jest także (Rye. 4B) niespecyficzne oddziaływanie białka SRY z fragm entam i DNA o nieregularnej strukturze, przypom inającej literę X (ang. four-way junctions) [59]. O ddziaływ anie


I

/ S R Y \

Rye. 4 O ddziaływ anie białka SRY z DNA. M odyfikacja z F e r r a r i i w s p. [59],A — Białko SRY wiąże się w specyficzny sposób z sekwencją AACAAAG w DNA (zaciemniony prostokąt), co prowadzi do wygięcia DNA i białka SRY. Um ożliwia to interakcje czynników transkrypcyjnych (białka B) i utworzenie stabilnego kom pleksu rybonukleoproteinow ego. B — Białko SRY m oże rozpoznaw ać niespecyficzne sekwencje DN A o nieregularnej strukturze.

innych białek H M G z DNA o takiej strukturze ma miejsce w takich procesach, jak napraw a i rekom binacja DNA oraz tworzenie nukleosom ów [61].

Poznanie sekwencji regionu DNA wykazującego powinowactwo do białka SRY było cenną wskazówką w poszukiw aniach genów współdziałających z białkiem SRY w różnicowaniu jądra. W badaniach in vitro wykazano, że białko odpowiadające regionowi H M G białka SRY specyficznie rozpoznawało p rom otor ludzkiego genu kodującego horm on antym iillerowski (A M H — anti-Mullerian hormone) oraz ludzkiego genu kodującego arom atazę P450. AM H jest odpow iedzialny za regresję żeńskich przewodów (ang. Mullerian ducts) w pierwotnej gonadzie różnicującej się w jądro . Z kolei arom ataza P450 katalizuje przekształcenie testosteronu w estradiol i jej aktywność jest zaham owana w zarodku męskim. Białko SRY m ogłoby zatem aktywow ać transkrypcję genu kodującego A M H i jed nocześnie ham ować transkrypcję genu arom atazy P450 [62]. Sugestie dotyczące oddziaływania białka SRY z innymi genami tylko na podstawie ich obecności w sąsiedztwie motywu AACAAAG winny być traktow ane z należytą ostrożnością. W prawdzie liczba kopii tego motywu nie została określona, m ożna się jednak spodziewać, że jest ona stosunkow o wysoka w ludzkim genomie. Stw ierdzono niedawno, że w linii em brionalnych kom órek jąd ra wykazujących ekspresję genu SRY dochodziło do inicjacji transkrypcji AM H, natom iast w kom órkach transfekowanych zm utowanym klonem SRY aktywacji transkrypcji AM H nie obserwowano. W badaniach tych wykazano ponadto, że w aktywacji transkrypcji AM H przez SRY uczestniczy dodatkow y niezidentyfikowany dotąd czynnik, wiążący się bezpośrednio z prom otorem genu AM H [63]. Badania te są poparciem hipotezy, że białko SRY aktywuje transkrypcję AM H.

VIII. Ekspresja zmutowanego białka SRY w układzie in vitro

W przeciwieństwie do mutacji nonsensownych oraz powodujących zmianę ramki odczytu, wpływ mutacji zmiany sensu na zaburzenie funkcji białka SRY nie jest oczywisty. Pam iętać należy, że substytucja am inokwasu nie musi prowadzić do dysfunkcji białka. O p racowanie układu doświadczalnego ekspresji mutacji genu SRY in vitro umożliwiło rozwiązanie tego p roblemu, pozwalając na analizę funkcjonalną zm utow anego białka SRY. W tym układzie doświadczalnym zm utow ane białko izolowano z kom órek Escherichia coli po transfekcji zrekom binowanym plazmidem SRY. Po oczyszczeniu, białko poddaw ano ocenie pod względem zdolności wiązania się z docelową sekwekcją DNA (AACAAAG) przy zastosow aniu techniki opóźnienia migracji w żelu [35, 36, 54, 57]. M etoda ta pozwoliła wykazać utratę lub zmniejszenie zdolności wiązania zm utow anego białka SRY ze specyficzną sekwencją w DNA.

Bardzo interesujące okazały się wyniki ekspresji in vitro w czterech przypadkach rodzinnych mutacji genu SRY. W dwóch z nich, m utacje genu SRY wykryto u dwóch kobiet o kariotypie 46, XY oraz u ich ojców [36]. W pierwszym przypadku wykazano zredukow ane powinowactwo białka SRY do DNA, natom iast w drugim stwierdzono całkowity brak powinowactwa zm utow anego białka do DNA. W pozostałych dwóch przypadkach rodzinnej mutacji genu SRY, mutacje występowały zarów no u ojców jak i zdrowych członków rodziny. W pierwszym przypadku (mutacja występowała u ojca i braci pacjentki) stwierdzono, że właściwości wiązania zm utowanego białka do DNA były takie same jak białka prawidłowego [50]. N a to miast w drugim przypadku (m utacja występowała u ojca i sióstr pacjentki) wykazano zredukow aną aktywność białka SRY [57]. Pomijając możliwość m etodycznego błędu w badaniach in vitro, powyższe kontrow ersyjne wyniki tłumaczy się odmiennym tłem genetycznym i środowiskowym poszczególnych osobników. Istnieje również możliwość wystąpienia u ojca pacjentki mozaicyzmu (prawidłowa kopia genu SRY i zm utow ana wersja genu SRY). Należy pamiętać, że zastosowany układ ekspresji (oddziaływanie białka SRY z fragmentem DNA AACAAAG) był zbyt zawężony. Stw ierdzono bowiem niedawno, że również motyw AACAATG wykazuje wysokie powinowactwo do białka SRY [64],

IX. Ewolucja genu SRY

Jednym z istotnych kryteriów, które brano pod uwagę w ocenie czy dany gen koduje czynnik TD F, była jego ewolucyjna konserwatywność. Gen SRY cechy tej nie posiada. Poza konserwatywnym regionem H M G , gen SRY człowieka, myszy i torbaczy nie


wykazuje homologii [65]. Badania porównawcze sekwencji genu SRY u naczelnych wykazały, że jedynie region H M G jest konserwatywny [66]. Co więcej, stosunkow o wysoka liczba różnic nukleotydów występuje na poziomie sekwencji aminokwasowej. Z identyfikowano ponadto rodzinę genów występujących w autosom ach i chrom osom ie X zawierających region H M G , wykazujący pod względem sekwencji am inokwasowej ponad 60% podobieństw a do H M G genu SRY i stąd ich nazwa: geny SOX (SRY-box) [24, 67]. Powstaje zatem pytanie, czy geny SOX i SRY p o chodzą od jednego genu przodka. Dywergencja genu SRY i pełnienie przez niego funkcji czynnika determ inującego płeć mogło poprzedzać i inicjować różnicowanie chrom osom ów płci X i Y. Albo też, pełnienie tej funkcji mogło być konsekwencją dywergencji ch rom osom u X i Y, zainicjowanej przez poprzednio występujące geny determ inacji płci, których funkcję przeją ł gen SRY.

X. Podsumowanie

Badania m olekularnego podłoża determ inacji płci opisane w niniejszym przeglądzie dostarczyły w ystarczających dowodów na to, by przyjąć, że gen SRY koduje czynnik determ inujący rozwój gonady męskiej. Najważniejsze z nich to: i/ekspresja genu SRY w pierwotnej, niezróżnicowanej gonadzie w okresie poprzedzającym formowanie się jąder, ii/ „odwrócenie płci” u myszy transgenicznej pod względem genu Sry oraz „odwrócenie płci” u pacjentek 46, XY, z m utacją genu SRY. W świetle dotychczasowych badań nie w iadom o nadal, czy gen SRY stanowi pierw otny oraz jedyny element inicjujący ten proces. Istnieją przesłanki, że inne geny występujące w autosom ach i w chrom osom ie X m ają istotne znaczenie w determ inacji płci. Świadczy o tym m.in. fakt, że u znacznej liczby fenotypowych kobiet o kariotypie 46, XY gen SRY jest prawidłowy. U części tych kobiet wykazano duplikację w krótkim ram ieniu chrom osom u X w hipotetycznym locus DSS (dosage sensitive sex reversal) [68], W innych p rzypadkach „odw rócenia płci” wykazano delecję w krótkim ram ieniu chrom osom u 9 [69], a w jeszcze innych delecję w długim ram ieniu chrom osom u 10 [70] lub translokację w obrębie długiego ram ienia ch rom osom u 17 [71]. Klonowanie pozycyjne tych regionów zapewne przyczyni się do identyfikacji nowych genów zaangażow anych w determ inację i różnicowanie się płci. Zastosow anie dotychczasowej wiedzy na tem at determ inacji płci ma miejsce w diagnostyce klinicznej o raz prognozowaniu leczenia. Przykładem tego jest wykrywanie genu SRY poprzez PCR oraz ocena aberracji chrom osom u Y u pacjentów z niepraw idłowościami rozwoju płciowego [72, 73]. O pisano również próby prenatalnego określenia płci zarodka poprzez detekcję genu SRY w chorobach sprzężonych z chrom osom em X [74]. Należy oczekiwać, że w k ró tkim czasie zakres zastosow ań w medycynie wiedzy na

tem at m olekularnego m echanizmu determinacji płci znacznie się poszerzy.

A rtykuł otrzymano 1 czerwca 1995 r. Zaakceptowano do druku 11 września 1995 r.

Piśmiennictwo

1. J o s t A, V i g i e r B, P r e p i n J, P e r c h e l l e t J P (1973) Rec Prog Horm Res 29: 1-41

2. S z a r r a s - C z a p n i k M , R o m e r T E (1993) W: Rom er TE (red) Zaburzenia horm onalne u dzieci i młodzieży. Om nitech Pres, str. 140-161

3. J a c o b s PA, S t r o n g J A (1959) N ature (lond) 183: 302-3034. F o r d CE , P o l a n i P E , B r i g g s J H , B i s k o p P M F

(1959) Nature (lond) 183: 1030-10325. B u r g o y n e P S (1982) Hum Genet 61: 85-906. G a b r i e l - R o p e z O, R u m p l e r Y, R a t o m p o n i r i n a

C, P e t i t C, L e v i l l i e r s J, C r o q u e t t e M F , C o u t u r i e r J (1990) Cytogenet Cell Genet 54: 38-42

7. R o u y e r F, S i m m l e r M C , V e r g n a u d G, J o h n s s o n C, L e v i l l i e r s J, P e t i t C, W e i s s e n b a c h J (1986) Cold Spr Harb Symp Quan Biol LI: 221-228

8. F e r g u s o n - S m i t h M A (1966) Lancet II: 475-4769. M a g e n i s RE, W e b b MJ , M c K e a n RS, T o m a r D,

A l l e n LJ , K a m m e r H, V a n D y k e , L o v r i e n E (1982) Hum Genet 62: 271-276

10. M a g e n i s RE, T o c h e n ML , H o l a h a n K P , C a r e y T. A l l e n L, B r o w n M G (1984) J Pediat 105: 916-919

11. K o t e c k i M, J a r u z e l s k a J, S k o w r o ń s k a M , F i c h - n a P (1991) Hum Genet 87: 234-236

12. V e r g n a u d P, P a g e D C , S i m m l e r MC , B r o w n L, R o u y e r F, N o e l B, B o t s t e i n D, d e l a C h a p e l l e A, W e i s s e n b a c h J (1986) Am J Hum Genet 34: 109-124

13. A f f a r a N A, F e r g u s o n - S m i t h M A, M a g e n i s RE, T o l m i e J L , B o y d E, C o o k e A, J a m i e s o n m D, K w o k K, M i t c h e l l M, S n a d d e n L (1987) Nucleic Acid Res 15: 7325-7342

14. F e r g u s o n - S m i t h M A, A f f a r a N A, M a g e n i s R E (1987) Development 101: 41-50

15. M ü l l e r U (1987) Development 101:51-5816. P a g e D C , M o s h e r R, S i m p s o n E M , F i s h e r E M L ,

M a r d o n G, P o l a c k J, M c G i l l i v r a y B, C h a p e l l e A (1987) Cell 51: 1091-1104

17. M a r d o n G, M o s h e r R, D i s t e c h e C M , N i s h i o k a YU, M c L a r e n A, P a g e D C (1989) Science 243: 78-80

18. N a g a m i n e C M , C h a n K, K o z a k C A, L o w Y - F (1989) Science 243: 80-83

19. S c h n e i d e r - G ä d i c k i e A, B e e r - R o m e o P, B r o w n L G, N u s s b a u m R, P a g e D C (1989) Cell 57: 1247-1258

20. S i n c l a i r A H , P o s t e r J W, S p e n c e r J A, P a g e D C , P a l m e r M, G o o d f e l l o w P N , M a r s h a l l - G r a v e s J A (1988) N ature (Lond) 336: 780-783

21. K o o p m a n P, G u b b a y J, C o l l i g n o n J, L o v e l l - B a d g e R (1989) Nature (Lond) 342: 940-942

22. P a l m e r MS , S i n c l a i r AH , B e r t a P, E l l i s N, G o o d - f e l l o w P N , A b b a s N E , F e l l o u s M (1989) Nature (Lond) 342: 937-939

23. S i n c l a i r A H , B e r t a P, P a l m e r MS , H a w k i n s J R, G r i f f i t h s BL, S m i t h MJ , F o s t e r J W, F r i s c h a u f A M , L o v e l l - B a d g e R, G o o d f e l l o w P N (1990) Nature (Lond) 346: 240-244

24. G u b b a y J, C o l l i g n o n J, K o o p m a n P, C a p e l B, E c o n o m o u A, M u n s t e r b e r g A, V i v i a n N, G o o d f e l l o w P N , L o v e l l - B a d g e R (1990) Nature (Lond) 346: 245-250

25. G u b b a y J, V i v i a n N, E c n o n o m o u A, J a c k s o n DI , G o o d f e l l o w P N , L o v e l l - B a d g e R (1992) Proc N atl Acad Sei U SA 89: 7953-7957

26. K o o p m a n P, G u b b a y J, V i v i a n N, G o o d f e l l o w P, L o v e l l - B a d g e R (1991) Nature (Lond) 351: 117-121

27. S u H, L a u Y - F (1993) Am J Hum Genet 52: 24-3828. G o o d w i n G H , S a n d e r s C, J o h n s E W (1973) Eur

J Biochem 38: 14-19


29. J a n t z e n H M , A d m o n A, B e l l SP, T j i a n R (1990) N ature (Lond) 344: 830-836

30. W a t e r m a n ML , F i s c h e r W H , J o n e s K A (1991) Genes Dev 5: 656-669

31. T r a v i s A, A m s t e r d a m A, B e l a n g e r C, G r o s s e h e d l R (1991) Genes Dev 5: 880-894

32. K e l l y M, B u r k e J, S m i t h M, K l a r A, B e a c h D (1988) E M B O 7: 1537-1547

33. S u g i m o t o A, l i n o Y, M a e d a T, W a t a n a b e Y, Y a m a m o t o M (1991) Genes Dev 5: 90-99

34. V i l a i n E, F e l l o u s M, M e E l r e a v e y K (1992) M ethods in M olecular and Cellular Biology 3: 128-134

35. N a s r i n N, B u g g s C, K o n g XF , C a r n a z z a J, G o e b l M, A l e x a n d e r - B r i d g e s M (1991) Nature (Lond) 354: 317-320

36. H a r l e y VR , J a c k s o n D I, H e x t a 11 P J , H a w k i n s J R , B e r k o v i t z G D , S o c k a n a t h a n S, L o v e l l - B a d g e R, G o o d f e l l o w P N (1992) Science 255: 453-456

37. B e h l k e M A, J o n a t h a n SB, B e e r - R o m e r o P, P a g e D C (1993) Genomics 17: 736-739

38. W i r t h - D z i ? c i o l o w s k a E (1994) Post Biol Kom 23: 263-274

39. K o o p m a n P, M ü n s t e r b e r g A, C a p e l B, V i v i a n N, L o v e l l - B a d g e R (1990) Nature (Lond) 348: 450-452

40. Z w i n g m a n T, E r i c k s o n RP , B o y e r T, A o A (1993) Proc N atl Acad Sei U SA 90: 814-817

41. R o s s i P, D o l c i P, A l b a n e si C, G r i m a l d i P, G e r e in i a R (1993) M ol Repord Dev 43: 369-373

42. C a p e l B, S w a i n A, N i c o l i s S, H a c k e r A, W a l t e r M, K o o p m a n P, G o o d f e l l o w P, L o v e l l - B a d g e R (1993) Cell 73: 1019-1030

43. Z w i n g m a n T, F u j i m o t o H , L a i L, B o y e r T, A o A, S t a n l e y J R D , B l e n c h e r SR, E r i c k s o n R P (1994) M ol Reprod Dev 37: 370-381

44. B e r t a P, H a w k i n s J R, S i n c l a i r A H , T a y l o r A, G r i f f i t h s BL, G o o d f e l l o w P N 6, F e l l o u s M (1990) N ature (Lond) 348: 448-450

45. J ä g e r RJ , A n v e r t M, H a l l K, S c h e r e r G ( 1 990) Nature (L ond) 348: 452-454

46. M c E l r e a v y K D , V i l a i n E, B o u c e k k i n e C, V i - d a u d M , J a k u b e r t F, R i c h a u d F, F e l l o u s M (1992) Genomics 13: 838-840

47. H a w k i n s J R , T a y l o r A, B e r t a P, L a v i l l i e r s J , V a n d e r A u w e r a B, G o o d f e l l o w P N (1992) Hum Genet 88: 471-474

48. H a w k i n s J R , T a y l o r A, G o o d f e l l o w P N , M i g e o n C J, S m i t h K D , B e r k o v i t z G D (1992) Am J Hum Genet 51: 979-984

49. M ü l l e r J, S c h w a r t z M, S k a k k e b a e k N E (1992) J Clin Endocrinol M etah 75: 331-333

50. J ä g e r RJ , H a r l e y VR, P f e i f f e r R A, G o o d f e l l o w P N , S c h e r e r G (1992) Hum Genet 90: 350-355

51. M c E l r e a v y K, V i l a i n E, A b b a s N, C o s t a J M, S o u l e y r e a u N, K u c h e r i a K, B o u c e k k i n e C, T h i - b a u d E, B r a u n e r R, F I a m a n t F, F e l l o u s M (1992) Proc N atl Acad Sei USA 89: 1106-11020

52. Z e n g Y, R e n Z, Z h a n g M, H u a n g Y, Z e n g F, H u a n g S (1993) J M ed Genet 30: 655-657

53. A f f a r a N A, C h a l m e r s 1L, F e r g u s o n - S m i t h M A (1993) Hum M ol Genet 2: 785-789

54. P o u l a t F, S o u l l i e r S, G r o z e C, H e i t z F, C a l a s B, B e r t a P (1994) Hum M ut 3: 200-204

55. I i d a T, N a k a h o r i Y, K o m a k i R, M o r i E, H a y a s h i N, T s u t s u m i O, T a k e t a n i Y, N a k a g o m e Y (1994) Hum M ol Genet 3: 1437-1438

56. T a j i m a T, N a k a e J , S h i n o h a r a N, F u j i e d a K (1994) Hum M ol Genet 3: 1187-1189

57. S c h m i t t - N e y M, T h i e l e H, K a l t w a k ß e r P, B a r - d o n i B, C i s t e r n i n o M, S c h e r e r G, (1995) Am J Hum Genet 56: 862-869

58. B r a u n A, K ä m m e r e r S, C l e v e H, L o h r s U, S c h w a r z H P , K u h n l e U (1993) Am J Hum Genet 52: 578-585

59. F e r r a r i S, H a r l e y VR, P o n t i g g i a A, G o o d f e l l o w P N , L o v e l l - B a d g e R, B i a n c h i M E (1992.) EM BO 11: 4497-4506

60. v a n d e W e t e r i n g M, C l e v e r s H (1992) E M B O 11: 3039-3044

61. G r o s c h e d l R, G i e s e K, P a g e l J (1994) 77G 10: 94-10062. H a a q C M , K i n g CY, D o n a h o e P K , W e i s s M A

(1993) Proc N atl Acad Sei USA 90: 1097-110163. H a a q C M , K i n g CY, U k i y a m a E, F a l s a f i S, H a a q

T N , D o n a h o e P K , W e i s s M A (1994) Science 266: 1494-1500

64. H a r l e y VR, L o v e l l - B a d g e R, G o o d f e l l o w P N(1994) Nucleic Acids Res 22: 1500-1501

65. F o s t e r J W, B r e n n a n F E , H a m p i k i a n G K , G o o d f e l l o w P N , S i n c l a i r AH , L o v e l l - B a d g e R, S e l - w o o d L, R e n f r e e MB , C o o p e r D W , G r a v e s J A M(1992) Nature (Lond) 359: 531-533

66. W h i t f i e l d LS, L o v e l l - B a d g e R, G o o d f e l l o w P N(1993) Nature (Lond) 364: 713-715

67. D e n n y P, S w i f t S, B r a n d N, D a b h a d N, B a r t o n P, A s h w o r t h A (1992) Nucleic Acids Res 20: 2887

68. A r n P, C h e n H, T u c k - M u l l e r C M , M a n k i n e n C, W a t c h e l G, L i S, S e h e n C C , W a t c h e l S S (1994) Hum Genet 93: 389-393

69. B e n n e t t C P , D o c h e r t y Z, R o b b SA, R a m a n i P, H a w k i n s J R, G r a n t D (1993) J M ol Genet 30: 518-520

70. W i l k i e A O M, C a m p b e l l F M , D a u b e n e y P, G r a n t DB, D a n i e l s RJ , M u l l a r k e y M, A f f a r a N A, F i - c h e t t M, H u s o n S M (1993) Hum M ol Genet 3: 1463-1467

71. W a g n e r T, W i r t h J, M e y e r J, Z a b e l B, H e l d B, Z i m m e r J, P a s a n t e s J, B r i c a r e l l i F D , K e u t e l J, H u s t e r t E, W o l f U , T o m m e r u p N, S c h e m p p W, S c h e r e r G (1994) Cell 79: 1111-1120

72. W i t t M, M i c h a l c z a k K, L a t o s - B i e l e n s k a A, J a - r u z e l s k a J, K u c z o r a I, L o p e z M (1993) J M ed Genet 30: 304-307

73. W i t t M, J a r u z e l s k a J, (1994) Post Biol Kom 21: 121-13274. C u i K - H, W arnes G M , J e f f r e y R, M a t t h e w s C (1994)

L ancet 343: 79-82

Do członków Polskiego Towarzystwa Biochemicznego

la l

Zarząd P.T.Bioch. uprzejmie prosi wszystkich członków o wpłatę zaległych i bieżących składek członkowskich. Zachęcamy także do zaprenumerowania „Postępów Biochemii” .


Diagnostyka molekularna: amplifikacja sekwencji czy wzmacnianie sygnału?

Molecular diagnostics: sequence or signal amplification?

RYSZARD SŁOMSKI1 JOLANTA KWIATKOWSKA2

Spis treści:

I. WstępII. Rynek badań kwasów nukleinowychIII. Amplifikacja DNA

III-l. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)III-2. Reakcja łańcuchowa ligazy (LCR)I1I-3. Reakcja łańcuchowa polimerazy i ligazy (P/LCR)

IV. Ampflikacja RNAV. Amplifikacja sygnałuVI. Perspektywy rozwoju diagnostyki molekularnej opartej

o amplifikację sekwencji i sygnału

Contents:

I. IntroductionII. Market of nucleic acids analysisIII. Amplification of DNA

III-l. Polymerase chain reaction (PCR)III-2. Ligase chain reaction (LCR)III-3. Polymerase and ligase chain reaction (P/LCR)

IV. Ampflication of RNAV. Signal amplificationVI. Perspectives of further development of molecular diag

nostics based on sequence and signal amplification

Wykaz stosowanych skrótów: ASA — am plifikacja DNA ze starteram i o specyficzności dla allelu; ASO — sonda m olekularna, oligonukleotyd o specyficzności dla allelu; bDNA— sonda m olekularna, rozgałęziony DNA do amplifikacji sygnału; C FT R — gen białka C FTR pełniącego funkcję kanału chlorkowego, m utacje genu C FTR prow adzą do mukowiscydozy; C M L — przewlekła białaczka mieloblas- tyczna; CM V — cytomegalowirus; C PR — cykliczna reakcja sondy molekularnej; DG — gradient czynnika denaturującego; D M D — gen dystrofiny, m utacje genu D M D prowadzą do wystąpienia dystrofii mięśniowej D uchenne’a; ELISA— im m unoenzym atyczna m etoda detekcji; HBC — wirus C zapalenia wątroby; HBV — wirus B zapalenia wątroby; H D — heterodupleksy; HIV — wirus niedoboru odporności imm unologicznej człowieka; HLA — antygeny zgodności tkankowej; LCR — reakcja łańcuchow a ligazy; M CC — metoda chemiczna wykrywania niesparow ań w DNA; MTB— Mycobacterium tuberculosis; NASBA — ampifikacja kwasów nukleinowych; PCR — reakcja łańcuchowa polimerazy; RCR — reakcja łańcuchow a naprawy; R F L P — polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych; RIA — metoda radioim m unologiczna; SSCP — polimorfizm konformacji pojedynczoniciowych DNA; STD — choroby przenoszone drogą płciową.

1 Prof. d r hab., Zakład Genetyki Człowieka PAN, ul. Strze- szyńska 32, 60-479 Poznań, K atedra Biochemii i Biotechnologii A.R. ul. W ołyńska 35 60-637 Poznań, L aborato rium Genetyki M olekularnej, ul. Szeherezady 100, 60-195 Poznań

2 dr, Zakład Genetyki Człowieka PAN, ul. Strzeszyńska 32, 60-479 Poznań

I. Wstęp

O pracow ane w minionej dekadzie m etody badań ow ocują obecnie coraz szerszym w prowadzaniem an aliz DNA do badań diagnostycznych. M ożna przyjąć, że lata 90-te przejdą do historii jako okres rozpowszechnienia diagnostyki m olekularnej. Badania DNA do łączyły w ten sposób do zaakceptow anych technik diagnostycznych, które do tej pory polegały głównie na reakcjach im munochem icznych antygenu z przeciwciałem. W tabeli 1 przedstaw iono rozwój analitycznych technik diagnostycznych na tle najważniejszych wydarzeń w badaniach DNA. Przede wszystkim zauważyć m ożna znaczne opóźnienie w powszechnym wdrożeniu analizy DNA w porów naniu do innych

Tabela 1.Rozwój badań diagnostycznych na tle ważniejszych osiągnięć w badaniach DNA.

Test diagnostyczny B adania m olekularne DN A

Precypitacja białek 19451953 S truk tu ra DNA

Test aglutynacji 19651968 Enzymy restrykcyjne

RIA 19701972 K lonow anie DNA1975 Transfer Southerna1977 Izolacja genu człowieka1977 Sekwencjonowanie DN A1978 R ELP

ELISA 19831985 PCR

DNA 1990


technik np. techniki ELISA, k tó rą prawie natychm iast w drożono w badaniach rutynowych. Opóźnienie wynika nie tyle z kosztów wykonywania analiz DNA, chociaż i te odgrywają ważną rolę, lecz przede wszystkim z silnej pozycji testów immunochemicznych na rynku diagnostycznym. Udział badań DNA na rynku diagnostycznym w 1994 r. nie przekroczył jeszcze 10% [!]•

Pierwsze badania diagnostyczne z zastosowaniem analizy DNA zostały przeprow adzone w 1978 r. przez K a n a i D o z y ’ e g o [2] i niezależnie przez O r - k i n a i w s p . [3]. K a n i D o z y w swoich badaniach zastosowali analizę restrykcyjną DNA dla miejsca mutacji prowadzonej do wystąpienia anemii sier- powatej oraz jako sondę m olekularną fragment genu P globiny człowieka. O kazało się, że tą m etodą, zwaną obecnie analizą polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (R FLP) m ożna było rozróżnić osoby chore od heterozygot (nosicieli choroby) i osób zdrowych. Z kolei O r k i n do wykrycia tej samej mutacji w 6 kodonie P globiny, w którym doszło do tranzycji A->T zastosow ał hybrydyzację z dw om a w ariantam i oligonukleotydowej sondy m olekularnej umożliwiającymi rozróżnienie alleli prawidłowych od zm utow anych. T a technika diagnostyczna została określona jako ASO i podobnie jak technika R FL P umożliwiała wykrywanie nosicielstwa choroby. Zarów no K a n i D o z y jak i O r k i n i w s p . stosowali w swych badaniach sondy m olekularne znakow ane 32P. W badaniach zachodziło zatem wzmocnienie sygnału sondy m olekularnej poprzez zastosow anie radioizotopu do wykryw ania charakterystycznych prążków hybrydyzacyjnych, z tym, że badanie R FL P posiadało zdecydowanie większą czułość, gdyż do sondy molekularnej w budow ać m ożna było więcej 32P-aN T P niż w przypadku badania ASO, w którym najczęściej znakowany był koniec 5' oligomeru 32-yNTP, a wprowadzenie większej liczby znakow anych nukleotydów do sondy oligonukleotydowej (najczęściej 19 nukleotydowej) prowadziło do jej szybkiej radiolizy. Nic dziwnego zatem, że badanie typu R FL P uległo w latach 80-tych rozpowszechnieniu i dom inow ało nad badaniam i ASO. Prace przeglądowe omawiające te aspekty zostały zamieszczone na łamach Postępów Biochemii [4, 5] i Biotechnologii [6, 7], Rynek badań diagnostycznych ograniczony był jednak głównie do chorób genetycznych. Obecny rynek badań DNA ulega rozszerzeniu i obejmuje coraz więcej zastosow ań (Tab. 2).

Szersze zastosowanie technologii badań DNA w diagnostyce m olekularnej rozpoczęło się po w prowadzeniu m etody amplifikacji DNA in vitro przez S a i k i i ws p . w 1985 r. [8], Uzyskali oni ponad 200.000-krotną amplifikację fragm entu genu (3 globiny stosując parę starterów (primerów) kom plem entarnych do fragm entu tego genu i flankujących region amplifikacji oraz fragment Klenowa polimerazy z Escherichia coli. Zaledwie rok później amplifikacja DNA zmieniła się w reakcję łańcuchow ą polimerazy (PCR), której odkrywcą był M u 11 i s [9]. Technika PCR jest

Tabela 2.M ożliwości zastosow ania analizy DNA w diagnostyce m olekularnej.

1. Badania bezpośrednio dotyczące człowiekaC horoby infekcyjne

W irusy STD MTB H1VPasożyty

GenetykaW ady w rodzone Predyspozycje Prognozow anie

C horoby nowotworow e D iagnostyka M onitorow anie Prognozow anie Predyspozycja

IdentyfikacjaBadanie ojcostwaK rym inalistykaT ransplantologia

2. B adania pośrednio związane z człowiekiemProdukcja żywności C horoby zwierząt Biotechnologia

3. B adania naukowe

bez w ątpienia jedną z najważniejszych technik biologii m olekularnej i umożliwiła gwałtowny rozwój diagnostyki m olekularnej ostatnich 10 lat (Tab. 3). Duże firmy farm aceutyczne o ugruntowanej pozycji na rynku diagnostycznym bardzo szybko zauważyły potencjał tej techniki i zaczęły stopniow o wprowadzać na rynek zestawy diagnostyczne do badań DNA. M ożna zadać pytanie czy amplifikacja sekwencji, bo z nią mamy do czynienia w technice PCR powtórzy rewolucję kliniczną, k tó ra nastąpiła po wprowadzeniu przeciwciał m onoklonalnych. Główne zainteresowanie firm farm aceutycznych zwróciło się na choroby trudne do jednoznacznego diagnozowania. Wszyscy potentaci diagnostyczni zwrócili się do badań w kierunku chorób zakaźnych, natom iast zainteresow ania chorobam i genetycznymi przesunęły się na dalszy plan. Krok ten uczyniono głównie dlatego aby wykazać znaczenie kliniczne wyników badań DNA, oszacować koszty analizy chorób zakaźnych a dopiero w drugim etapie przesunąć zainteresow ania w kierunku badań nowotw orów i chorób genetycznych. Zakłada się, że około 300 min dolarów w skali roku przeznaczonych jest właśnie na ten cel. Pierwszy etap wdrożenia badań DNA do analizy chorób zakaźnych poświęcony jest głównie opracow aniu testów m olekularnych dla badań AIDS, chlamydii, wirusowego zapalenia w ątroby i gruźlicy.

II. Rynek badań kwasów nukleinowych

Rynek badań DNA pom imo gwałtownego rozwoju w ostatnich latach stanowi jedynie niewielką część


Tabela 3.Przykłady możliwości zastosow ania amplifikacji kwasów nukleinow ych w testach diagnostycznych.

Częstość występowania Populacja

1. C horoby genetyczne

Pląsaw ica H unting tona 1/10000 30.000 R(A)Zespół kruchego chrom osom u X 1/1250 mężczyzn

1/2000 kobietDystrofia m iotoniczna 1/7500C horoba Alzheimera 1-6% ludzi powyżej 65

lat (A)5.000.000 P(A)

Dystrofia mięśniowa D uchenne’a 1/3000H em oglobinopatie 7% populacjiM ukow iscydoza

2. C horoby now otw orow e

1/2000 8.000.000 N(A) 30.000 P(A)

R odzinna polipow atość jelita (FAP) 1/5000Rak okrężnicy 1/200Rak macicy 3.000.000 T(A)Rak sutka 1/10O gólna śm iertelność 4.500.000 P(W)

3. C horoby infekcyjne

HIV 20.000.000 P(W)AIDS 8.000.000 P(W)Chlamydia trachomatis 280.000.000 INeisseria gonorrhoea 0,5% populacji

31.000.000 T(A)Herpes simplex 40.000 P

28.000.000 THepatitis B 300.000.000 PTuberculosis 8.000.000 P

15.000.000 I(W)

A — dane z USA; I — liczba zainfekowanych; N — liczba nosicieli; P — liczba przypadków; R — liczba rodzin; T — liczba testów; W — dane W HO.

rynku diagnostycznego. Nie ma jednorodnych informacji na ten tem at, m ożna jednak przyjąć, że badania DNA stanow ią około 1-10% dochodów z badań diagnostycznych, które w 1993 r. przekroczyły na świecie 15 mld dolarów. Przewiduje się, że badania DN A w najbliższych latach przekroczą wartość 1.7 mld dolarów [1]. W edług sceptycznych oszacowań am erykańskich w roku 2000 wartość analiz DN A będzie wynosiła około 600 min dolarów , a wg bardziej optymistycznych prognoz powyżej 2.8 mld dolarów , przy czym potencjalny roczny wzrost może dochodzić nawet do 35%. Jak już w spom niano głównym zainteresowaniem w tych badaniach, które jak dotąd stanowi amplifikacja sekwencji DNA są choroby przenoszone drogą płciową, diagnozow ane dotychczas w oparciu o pracochłonne hodowle. Zróżnicow ana diagnostyka rzeżączki i chlamydii jest stosunkow o trudna z zastosowaniem technik klasycznych, stanowi więc idealny obiekt do opracow ań testów genetycznych. Bezpośrednie wykrywanie wirusów HIV i hepatitis C przyczynia się również do rozwoju badań nad poszukiw aniem nowych leków i m onitorow aniem terapii, której koszt jest obecnie bardzo wysoki. Innym przykładem zainteresow ań firm farmaceutycznych jest badanie mycobacterii. W ystępuje tutaj isto tna przewaga badań

m olekularnych nad badaniam i obejmującymi hodow le, ponieważ w badaniach m olekularnych uzyskuje się wynik w ciągu 1 dnia, podczas gdy badania klasyczne trwają nieraz kilka tygodni.

W śród firm farmaceutycznych, które w swoich testach stosują amplifikację DNA na czołowe miejsce wysuwają się A bbott Laboratories, które obejmują ponad 53% rynku diagnostycznego. Dla badań DNA firma Abbott opracow ała dwie nowe reakcje zbliżone do PCR — reakcję łańcuchow ą ligazy (LCR) i reakcję łańcuchową napraw y (RCR — repair chain reaction). W ubiegłym roku A bbott doniósł o bardzo pozytywnych wynikach badań z zastosowaniem LCR u kobiet z chlam ydią w porów naniu z hodowlam i m ateriału pobranego z wymazów cytologicznych. Podobne testy w ykonane u mężczyzn w badaniach moczu wykazały jednak duży odsetek wyników fałszywie negatywnych, co spowodowało wzrost zainteresow ań wstępnym etapem przygotow ań próbek do badań, w taki sposób aby zostały usunięte inhibitory reakcji. W kwietniu 1994 r. Abbott i Perkin Elmer zawarły porozum ienie o wzajemnej wymianie patentów odnośnie m etody am plifikacji DN A jak również sprzętu do wykonywania reakcji.

Kolejną wielką firmą farm aceutyczną, k tó ra bardzo szybko doceniła przydatność PCR w diagnostyce jest


firma HofTmann-La Roche. Ta firma dysponuje najważniejszą technologią badania DN A — reakcją łańcuchową polim erazy (PCR), k tó rą odkupiła za 300 min dolarów od firmy Cetus w 1992 r. Roche bardzo ostrożnie dysponuje licencjami na wykonywanie reakcji PCR i jak do tąd udzielił jej tylko Kodakowi. Jak już zaznaczono A bbott i Roche w 1994 r. zawarły porozumienie o wym ianie swoich technologii. Tak więc Roche stosow ać może w badaniach diagnostycznych PCR, LCR, RCR jak również testy hybrydowe P/LCR. F irm a Roche położyła duży nacisk na przygotow anie testów diagnostycznych dla określania HLA -DRB oraz wykryw ania enterowirusów, wirusa HIV, cyto- m egalowirusa, Mycobacterium avium i Mycobacterium intracelulare a także testu wykrywającego 15 mutacji genu C FT R , prowadzących do wystąpienia m ukowiscydozy. W najbliższej przyszłości wdrażaniem objęte m ają być badania oporności na ryfampicynę w gruźlicy. Jeśli chodzi o osiągnięcia techniczne firma przygotow ała analizator Cobas Amplicor umożliwiający przeprow adzenie detekcji 210 próbek, przy czym m ożliwe jest jednoczesne wykonanie 24 amplifikacji i 6 testów diagnostycznych dla każdej próbki. Szybkość detekcji oceniana jest na 50 na godz. M ożna tutaj zauważyć, że mino istotnego postępu metodycznego w diagnostyce m olekularnej w dalszym ciągu dużym problem em jest wstępne przygotowanie m ateriału do badania diagnostycznego, które również dla om aw ianych wyżej przypadków nie jest zautom atyzow ane.

W m inionym roku na rynku diagnostycznym DNA pojawiła się firma Johnson & Johnson. Stało się to możliwe po zakupieniu przez tę firmę oddziału diagnostyki klinicznej Kodaka. F irm a Johnson & Johnson jako jedyna nie zajęła się jeszcze chorobam i zakaźnym i1 jej główne zainteresowanie zwrócone jest na badania genetyczne. W 1995 r. ukazać się m ają trzy nowe testy diagnostyczne, w tym jeden na mukowiscydozę. O p arte są one o w ariant PCR tzw. ASA-PCR, w którym startery do reakcji PCR charakteryzują się specyficznością dla DNA typu dzikiego lub zm utowanego. F irm a rozważa również możność wprow adzenia specjalistycznego sprzętu do amplifikacji DNA w okresie2 lat. Do grupy firm wprowadzających badania DNA w swoich testach diagnostycznych należy również firma Chiron, sprzedająca swoje testy pod nazwą Quantiplex. Rozprow adza ona zestawy diagnostyczne do badań HBV-DNA, HCV-RNA, HIV -RNA, CM V i m RN A dla cytokin, co wskazuje na zwrócenie się w kierunku badań onkologicznych. W badaniach dotyczących RNA duży udział ma również firma O rganon-Teknika. Ta firma co praw da nie ujaw nia dochodów ze sprzedaży zestawów diagnostycznych, lecz n a pewno znajduje się w czołówce. W próbnych badaniach jest już zestaw diagnostyczny do w ykryw ania RNA wirusa HIV. Dotychczasowe główne osiągnięcia firmy to dwa zestawy dostępne w USA i Europie do wykrywania HIV: test jakościowy HIV-1 RNA Q L i test ilościowy HIV RNA QT. Firm a O rganon Tek-

nika jest właścicielem technologii określonej jako NASBA, umożliwiającej amplifikację RNA, a której w ykonanie nie jest uzależnione od specjalistycznego sprzętu. W najbliższym czasie ukazać się mają zestawy do wykryw ania translokacji w CM L, mutacji czynnika V, hepatitis, CM V, chlamydii i MTB.

Japon ia reprezentow ana jest na rynku diagnostycznym DNA przez firmę Gene-Probe, k tó ra opracow ała zestawy diagnostyczne do badań DNA Chlamydia trachomatis i Neisseria gonorrhoea. Z kolei Boehringer M annheim , drugi co do wielkości potentat diagnostyczny, zakupił pod koniec 1994 r. duńską firmę PNA D iagnostics i w ten sposób dołączył do grupy sprzedających zestawy do badań DNA.

III. Amplifikacja D N A

O d chwili opublikow ania pierwszej pracy dotyczącej amplifikacji DNA in vitro, m etody amplifikacji DN A bardzo rozwinęły się i uległy różnym m odyfikacjom . D oprow adziło to do powstania co najmniej 12 różnych technologii umożliwiających zwielokrotnienie ilości D N A lub RNA. Równolegle rozwijają się techniki wzm acniania sygnału detekcji. N a czele technik amplifikacji kwasów nukleinowych znajdują się PCR, LCR i NASBA, a także przy mniejszym udziale CPR.

III-l. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

M etoda PCR została w prow adzona w połowie lat 80-tych przez firmę Cetus, k tóra wcześniej próbow ała skonstruow ać hybrydy komórek somatycznych z przeznaczeniem do im m unoterapii nowotworów. W prow adzenie techniki PCR stanowiło przełom w badaniach m olekularnych. Technika PCR stosuje termofilną po- limerazę DNA (polimerazę Taq) do uzyskania am plifikacji odcinka DNA między param i starterów (pri- merów). Reakcja przebiega przy nadm iarze primerów, które hybrydyzują z m atrycą w 60-65°C, natom iast wydłużanie prim erów przebiega w 72°C. M atryca DNA jak i powstające am plikony (produkty PCR) są cyklicznie denaturow ane przez ogrzewanie w 94°C (Rye. 1). Reakcja przebiegająca w ten sposób wymaga specjalistycznego sprzętu. Każdy cykl trwa poniżej 3 min. i powstające am plikony służą jako matryce w następnych cyklach reakcji prow adząc do logarytmicznego przyrostu ilości produktów .

M etoda PCR w krótkim czasie dała początek kilku innym m etodom , w ariantom PCR umożliwiającym amplifikację nie tylko znanych sekwencji lecz również sekwencji, co do których brakuje jeszcze informacji o sekwencji, przykładem może być w ariant PCR tzw. odw rócona PCR (ang. inverted PCR), w której badany fragm ent DNA łączy się z fragmentem znanym lub wklonowanym w w ektor a startery są specyficzne dla znanego odcinka DNA [10]. Innym w ariantem jest wewnętrzny PCR (ang. nested PCR), w którym korzysta się z dwóch par starterów , a przy czym druga para


A m plifikacja matrycy D N A -» D N A PCR

1. Materiał badawczy

2. Izolacja D N A W W

3. D enaturacja

4. Inkubacja ze starteram i

5. SyntezaPolim eraza DNA

6. PCRA kum ulacja DNA

7. W ykryw anie produktu ------------------

Rye. 1 Amplifikacja DNA in vitro m etodą PCR.

umieszczona jest wewnętrznie w stosunku do pierwszej pary [11]. Przez amplifikację z pierwszą parą sta rterów, w której zalecane jest aby amplifikowano duże fragmenty (1000-2000 pz), a następnie drugą am plifikację znacznie mniejszych fragmentów, uzyskać m ożna podwyższenie specyficzności reakcji przy jednoczesnym wyeliminowaniu fragm entów niespecyficznych.

M atrycą w reakcji PCR może być również RNA, a enzymem stosowanym w tej sytuacji jest odw rotna transkryptaza z Haemophilus. O statn io dokonyw ane są próby koamplifikacji nieznanej m atrycy jednocześnie z m atrycą o znanym stężeniu, co umożliwić ma uzyskanie wyników ilościowych. Jest to rozwinięcie jednego z najważniejszych w ariantów PCR tzw. m ultipleks PCR, w którym przy zastosow aniu kilku par starterów m ożna jednocześnie przeprow adzać am plifikację kilku regionów jednego genu lub wykrywać określone m utacje kilku genów [12]. Tego typu po

stępowanie stosowane jest powszechnie w wykrywaniu delecji genu D M D (dystrofia mięśniowa Duchenne’a) lub mutacji punktow ych w C FTR (mukowiscydoza). Uzyskać m ożna nawet 13 am plikonów, jednak z przyczyn praktycznych wskazane jest, aby ich liczba w ahała się między 5-7 bo ułatwia to znacznie dobranie w arunków PCR jak i rozdziałów am plikonów w żelach analitycznych. Teoretycznie w ariantów PCR można by przygotow ać znacznie więcej jednak w praktyce, szczególnie ostatnio, coraz więcej, uwagi poświęca się rozwojowi m etod ograniczających zanieczyszczenie reakcji, a różnego rodzaju w arianty podstawowej reakcji PCR znalazły się na drugim planie. Jak dotąd największy postęp w zwalczaniu zanieczyszczeń tow arzyszących m etodzie PCR w badaniach klinicznych odnotow ała firma Roche, k tó ra przy wykonywaniu testów diagnostycznych w mieszaninie reakcyjnej w miejsce T T P wprow adziła UTP. Umożliwia to działanie na m atrycowy DNA N-glikozylazą uracylo- wą celem usunięcia ew entualnych am plikonów zanieczyszczających m atrycowy DNA, przy czym N-gliko- zylaza uracylowa działa wyłącznie na DNA zaw ierający uracyl i może być po działaniu na taki DNA łatwo zinaktyw ow ana poprzez ogrzewanie we wstępnym, denaturującym etapie PCR. Ta ciekawa technologia pochodzi z licencji firmy Life Technologies i określona została jako AmpErase.

III-2. Reakcja łańcuchowa ligazy (LCR)

M etoda PCR należy bez wątpienia do najważniejszych technik amplifikacji DNA in vitro i wykorzystywana jest w 70% laboratoriów diagnostycznych lecz uzyskała również konkurenta w postaci reakcji LCR, która z pow odu unikatow ych właściwości stała się bardzo atrakcyjna dla badań diagnostycznych. W m etodzie LCR stosowane są 4 startery o długości 50-60 nukleotydów i term ofilna ligaza. Startery przygotow ane są w ten sposób, aby hybrydyzowały z m atrycą nie pozostaw iając lub pozostaw iając jedynie jeden wolny nukleotyd między nimi. Jedynie startery, które hybrydyzowały z m atrycą ulegają ligacji. Po ligacji i denaturacji przebiegających cyklicznie podobnie jak w PCR powstające fragmenty D N A służą jako m atryca w kolejnych cyklach amplifikacji [13,14], P odobnie jak w PCR reakcja LCR charakteryzuje się logarytmicznym przyrostem ilości p roduktów (Ryc. 2). O k azało się, że modyfikacje podstawowych wersji m etody LCR m ogą znaleźć natychm iastow e zastosow anie w diagnostyce i jednocześnie stanowić punkt wyjścia do autom atyzacji diagnostyki. Dla testów klinicznych obydwa startery m ogą być przygotow ane w ten sposób, że do ich końców 5' przyłączone są łigandy zakotwiczające i ligandy detekcyjne, co w rezultacie prowadzi do tego, że jedynie startery, które uległy ligacji m ogą być zidentyfikowane dzięki jednoczesnemu zakotw iczeniu i detekcji. Ta strategia pozwoliła firmie A bbott na dostosow anie reakcji LCR do ist-


A m plifikacja m atrycy DNA —> DNA LCR


2. Izolacja RN A lub DNA

3. D enaturacja

4. Inkubacja ze starterami A ,B ,C i D

5. L igacjaLigaza DNA

6. LCRA kum ulacja DNA

7. Wykrywanie produktu □ 1 ■Ryc. 2 Amplifikacja DNA in vitro metod;} LCR.

niejącego już sprzętu firmy. F irm a w prow adza na rynek 3-częściowy zestaw LCX umożliwiający w ykonanie reakcji LCR i immunodetekcji produktu . R eakcja LCR wykorzystywana jest również do wykrywania mutacji punktow ych i stosowane są wtedy dwie pary starterów kom plem entarnych do obydwu nici m atrycy. N iesparowanie zasad w miejscu m utacji uniemożliwia przebieg reakcji LCR. Oznacza to, że reakcja LCR jest szczególnie przydatna do w ykrywania różnego rodzaju mutacji punktow ych w produktach PCR.

III-3. Reakcja łańcuchowa polimerazy i ligazy (P/LCR)

Ponieważ w LCR stosowane są długie startery, praw dopodobieństw o ich niespecyficznego w iązania

z m atrycą jest niskie, jednakże może wystąpić tło amplifikacji z pow odu ligacji tępych końców starterów. Połączenie reakcji PCR i LCR zaproponow ane przez firmę Imclone i A bbott wydaje się przezwyciężać problem tła, a więc podwyższenia specyficzności, co czyni tę reakcję szczególnie przydatną w badaniach diagnostycznych. Podobnie jak LCR przy wykrywaniu m utacji punktow ych P/L CR stosuje 2 pary starterów, ale pozostaw ia między starteram i odstęp kilku nukleotydów. W przciwieństwie do LCR odstęp między starteram i wynosi jedynie kilka nukleotydów i co najważniejsze w odstępie między starteram i w składzie nukleotydowym m atrycy występować m ają jedynie trzy różne nukleotydy. W mieszaninie reakcyjnej P /L C R umieszcza się trzy nukleotydy występujące w matrycy. W wyniku współdziałania polimerazy i ligazy dochodzi do ligacji obydwu starterów. Pow stawanie niespecyficznych fragmentów uniemożliwia brak pełnego zestawu czterech nukleotydów w mieszaninie reakcyjnej. Podobnie jak LCR i PCR również P /LC R przebiega w sposób cykliczny. Pojawia się jednak jeszcze dodatkow a możność podwyższenia specyficzności reakcji poprzez dobranie odrębnych optym alnych tem peratur dla wydłużania starterów i ligacji.

IV. Amplifikacja RNA

Amplifikacja sekwencji RNA jest często szybsza i wydajniejsza niż amplifikacja DNA, lecz występują tu ograniczenia — przede wszystkim dobrego oczyszczenia badanej m atrycy jak i jej zabezpieczenia przed działaniem nukleaz. Amplifikację RNA w swoich zestawach diagnostycznych stosuje firma O rganon Tek- nika. Technika ta, określana jako NASBA (ang. nucleic acid sequence based amplification) stosuje 3 enzymy do amplifikacji pojedynczoniciowych RNA (Ryc. 3) lub dwuniciowych DNA (Ryc. 4). Reakcja przebiega w warunkach izotermicznych, a najczęściej stosowanymi enzymami są odw rotna transkryptaza AM V-RT, poli- m eraza RNA T7 i RN aza H [15,16]. Reakcję opracowano do wykrywania wirusów DNA, lecz obecnie jej aplikacja została rozszerzona o wykrywanie wirusów RNA, retrowirusów, wykrywanie żywych patogenów i m onitorow anie proliferacji kom órek now otw orowych. Technika NASBA okazała się tak samo czuła jak PCR przy wykrywaniu wirusa HIV-1. Jak już zaznaczono NASBA jest reakcją izotermiczną, a więc nie korzysta się dla jej w ykonania z amplifikatora.

V. Amplifikacja sygnału

Przed opracowaniem m etody PCR główny nacisk w diagnostyce m olekularnej kładziono na zwiększenie sygnału detekcji. Pojawiły się m etody w budowania do sond m olekularnych 32P -aN T P („nick” translacja, m etoda heksamerowa, z zastosow aniem polimerazy DNA), znakow ania końca 5’ sondy 32P-yN TP (z

POSTĘPY BIOCHEMII 41 (4), 1995 225http://rcin.org.pl

Amplifikacja matrycy RNA —> RNA NASBA


2. Izolacja RNA

3. Inkubacja ze starterem I Odwrotna transkrypcja

AM V-RT

4. Hydroliza RNA Inkubacja ze starterem II Synteza dsDNA

RNaza H AMV-RT

5. TranskrypcjaPolimeraza T7 RNA

6. NASBAAkumulacja RNA

7 W ykrywanie produktu ------------------------

Ryc. 3 Amplifikacja RNA in vitro m etodą NASBA.

zastosow aniem kinazy polinukleotydowej) i znakow ania 3’ sondy 32P -aN T P (z zastosow aniem terminalnej transferazy). W wielu laboratoriach diagnostycznych stanow ią one nadal podstawowe narzędzie pracy. Ich główne ograniczenie polega na stosow aniu rad ioizotopów. Dlatego coraz więcej uwagi poświęca się opracowywaniu m etod znakow ania sond m olekularnych nieradioaktyw nym i ligandami, przy czym najczęściej s to sowana jest fluoresceina, digoksygenina i biotyna. E tap detekcji polega na wiązaniu ligandu z przeciwciałem skoniugowanym z enzymem, przy którego udziale w obecności substratu zachodzi reakcja chemiluminiscencji lub kolorym etrii.

Przykładem reakcji pośrednich między amplifikacją sygnału, a amplifikacją sekwencji jest C PR — cykliczna reakcja sondy m olekularnej. Reakcja ta została zaproponow ana do badań diagnostycznych przez firmę ID Biomedical. Sonda m olekularna jest hybrydem D N A : RNA i łączy się z sekwencją docelową DNA, a w drugim etapie następuje przecięcie cząsteczki RNA RN azą H, co prowadzi do pow stania dwóch fragm entów RNA. CPR jest reakcją izotermiczną.

Nową, oryginalną propozycją amplifikacji sygnału na cele diagnostyczne jest tzw. bD N A (ang. branched D N A) zaproponow any przez firmę Chiron. W systemie tym zachodzą dwie reakcje: hybrydyzacji do detekcji DNA i amplifikacji sygnału. W pierwszej reakcji sonda

Am plifikacja matrycy DNA -> RNA

1, M ateriał badawczy

2. Izolacja dsDNA

3. Denaturacja Inkubacja ze starterem I

4. Synteza DNA AM V-RT

5. Inkubacja ze starterem II Synteza DNA

A M V-RT

6. TranskrypcjaPolimeraza T7 RNA

7. NASBAAkum ulacja RNA

7. Odw rotna transkrypcjaAM V-RT

8. HydrolizaRNaza H

9. Synteza DNAAM V-RT

Ryc. 4 Amplifikacja DNA in vitro m etodą NASBA.

m olekularna hybrydyzuje z kom plem entarną sekwencją matrycy. Sonda m olekularna najczęściej zw iązana jest ze stałym podłożem, np. ścianką m ikropłytki (Ryc. 5). D ruga sonda m olekularna wiąże wychwyconą przez pierwszą sondę m atrycę z amplifikującym sygnał DNA, którym jest syntetyczny DNA, silnie rozgałęziony o długości ok. 1000 pz. — bDN A . Rozgałęziony DN A jest zsyntetyzowany w ten sposób, że zawiera tysiące chemiluminiscencyjnych ligandów, k tóre wykrywane są przez chemiluminiscencję digoksyetanu [1]. W metodzie bD N A nie wym agane jest oczyszczenie próbek. W edług zapewnień firmy m etoda bD N A może wykryć już 60 cząsteczek danej m atrycy w 1 ml.

VI. Perspektywy rozwoju diagnostyki m olekularnej opartej o amplifikację sekwencji i sygnału

W najbliższej przyszłości oczekiwać m ożna dalszego postępu badań DNA i rozszerzania wyników dla

NASBA


Amplifikacja sygnału bDNA


2. Izolacja RN A/DNA

3. Inkubacja z sondami molekularnymi

4. H y b ry d y zacja z w olnym i sondam i i sondam i zw iązanym i z podłożem

5. Inkubacja z bDNA

6. U tw orzen ie hybrydu bD N A :sonda: m atryca

7. Inkubacja z sondam i zaw iera jącym i enzym dla detekcji sygnału

8. Inkubacja z substratem , ocena chem ilum iniscencji

Ryc. 5 Am plifikacja sygnału — bDNA.

potrzeb diagnostyki m olekularnej. Autorzy zakładają, że postęp obejm ow ał będzie zarów no dobór m ateriału badawczego jak i zwiększenie czułości m etod oraz autom atyzację procedur analitycznych. Jak wynika z przykładów zamieszczonych w tabeli 3 zapotrzebowanie na nowe testy diagnostyczne jest ogrom ne i w krajach zachodnich, dla wielu chorób genetycznych, now otworow ych i wykryw ania patogenów wykonywane są one już rutynowo. Szczególnie w przypa

dkach zakażeń, m etody amplifikacji sekwencji um ożliwiają wykrycie patogenu w czasie zdecydowanie krótszym niż hodowle. W obawie przed ewentualnymi konsekwencjam i wynikającymi z opóźnienia terapii poprzez oczekiwanie na wynik hodowli (nieraz 3 tygodnie) szpitale wdrażają testy m olekularne. Zgodność wyników takich testów uzyskanych m etodam i am plifikacji DNA z wynikami hodowli, dla których przyjmuje się 100% jest bardzo wysoka — powyżej 99% [1].

W etapie wstępnym przygotow ania m ateriału do badań występuje opóźnienie m etodyczne i sprzętowe w stosunku do samej strategii badań DNA, która poprzez sekwencjonowanie umożliwia wykrycie zmian pojedynczych nukleotydów w DNA. E tap przygotowania D NA do badań jest jednak najważniejszy, gdyż rzutuje na pozostałe etapy wykonywania analizy. Dla przykładu obecność inhibitorów enzymów w preparatach D N A uniemożliwia jego badanie lub powoduje pow stanie artefaktów. Jest to szczególnie niebezpieczne przy stosowaniu badań opartych wyłącznie o enzym atyczną amplifikację DNA in vitro. Może do chodzić tu do wybiórczej amplifikacji niektórych alleli. Z kolei postęp w samych badaniach DNA jest ogrom ny i możliwe jest badanie bardzo małych ilości DNA, nawet z pojedynczych kom órek. W przypadkach m ateriału przeznaczonego do badań medyczno-sądowych częstym zjawiskiem jest zdegradowanie DNA. B adania D N A m ogą dać wtedy wynik fałszywie negatywny, dlatego wszelkie badania DNA poprzez jego am plifikację powinny przebiegać w obecności kontroli doświadczenia.

Zwiększenie czułości m etod obejmować będzie coraz szersze wprow adzanie chemiluminiscencji i kolory- metrii do wykrywania DNA, co w przyszłości zaow ocować ma zautom atyzow aniem badania DNA na poziomie rozdziału elektroforetycznego i detekcji wyniku. Trw ają również poszukiwania nowych, optym alnych m arkerów do badań DNA, które charakteryzowałyby się wielkością w zakresie 100-500 pz i wykazywałyby duży polimorfizm wielkości oraz wysoki stopień heterozygotyczności a jednocześnie niewielką częstość mutacji.

M atrycam i do amplifikacji sekwencji i sygnału w celach diagnostycznych może być zarówno RNA jak i D N A (Ryc. 6). D iagnostyka m olekularna przebiega głównie poprzez amplifikację DNA m etodą PCR. PCR jest również m etodą wyjściową dla większości innych analiz m olekularnych, które mogą prowadzić do wykrycia obecności defektu m olekularnego lub/i podania dokładnej jego charakterystyki (Poziom I i Poziom II na Ryc. 6).

Rozwój inform atyki umożliwi przygotowanie specjalistycznych baz danych, jednak z tym zagadnieniem bardzo silnie wiąże się standaryzacja badań wykonywanych przez różne placówki czy kraje. Problem ten na pew no nie ulegnie rozwiązaniu w najbliższej przyszłości, gdyż m etody biologii m olekularnej, a w szcze-


Rye. 6 Amplifikacja m ateriału genetycznego w celach diagnostycznych.Wyjściowy m ateriał badawczy m ożna zakwalifikować do dwóch grup, w których m ateriał genetyczny (RNA lub DNA) izolowany jest bezpośrednio po pobran iu krwi (tkanki) lub z m ateriału przechowywanego, przesyłanego drogą pocztową lub utrwalonego. W pierwszym przypadku możliwe jest uzyskanie zarów no w ysokocząsteczkow ego DNA jak i RNA. W drugiej grupie najczęściej izolowany jest DNA. RNA i DNA m ogą być stosow ane w diagnostyce m olekularnej w formie wyjściowej lub po amplifikacji in vitro. Pogrub ionymi strzałkam i oznaczono m etody analityczne stosow ane najczęściej. Zauw ażyć m ożna, że obecna diagnostyka m oleku larna przebiega głównie przez amplifikację DNA m etodą PCR. M etoda PCR stanowi m etodę wyjściową dla większości analiz m olekularnych. W yróżnić m ożna dwa poziom y uzyskiwania informacji o defekcie m olekularnym (poziom I i II). M etody analityczne I poziom u um ożliwiają wykrycie m utacji, jednak bezjej bliższej charakterystyki. Poziom drugi um ożliwia poznanie m olekularnego podłoża choroby, przy czym sekwencjonowanie, ASO, R F L P i LCR dają najdokładniejsze wyniki.W yjaśnienie skrótów:

ASA — Amplifikacja określonych alleli z zastosow aniem starterów rozpoznających allel dziki i allele zm utowane.

ASO — Hybrydyzacja oligom erów specyficznych dlaallelu z badanym DNA. Oligom ery łączą się wybiórczo z allelem dzikim lub zm utowanym .

D G — M etoda analityczna polegająca na obserwacjidenaturacji dwuniciow ego DN A we w zrastającym gradiencie czynnika denaturującego (m ocznika lub tem peratury) podczas rozdziału elektroforetycznego w żelach poliakryloam i- dowych.

H D — M etoda analizy m utacji poprzez obserwacjęheterodupleksów DNA : DN A między zm utowanymi DNA a DNA typu dzikiego. Nie- sparow ania heterodupleksów opóźniają migrację w żelach poliakryloam idow ych.

LCR — Reakcja łańcuchow a ligazy na poziom ie I m oże wykryć DN A (lub patogen) a na poziom ie II

228

um ożliwia identyfikację m utacji poprzez d o b ranie starterów dla miejsca zm utowanego.

M CC — M etoda chemiczna, wykrywanie m utacji polega na działaniu czterotlenku osmu, hydroksyloam iny i piperydyny w miejscach niesparow ań heterodupleksów DN A : DNA. Hetero- duplcks ulega fragmentacji, a powstałe fragm enty wykrywane są w badaniu elektroforety- cznym.

NASBA — M etoda amplifikacji kwasów nukleinowych um ożliw iająca uzyskanie wielu kopii RNA na m atrycy RNA lub DNA.

R F L P — Analiza polim orfizm u długości fragm entów restrykcyjnych DNA. N a poziom ie I stosow ana jest do wykryw ania polim orfizm u,Na poziom ie II poprzez zastosow anie enzymu restrykcyjnego dla miejsca m utacji może wykryć mutację.

RN aza A — N a poziom ie I działanie RN azą A na hybrydy RNA: DNA i przecięcie RNA w miejscu niesparow ania hybrydu.N a poziom ie II działanie RN azą A na hybrydy RNA: DNA z tą różnicą, że stosow any jest RNA lub DNA zawierający określoną m utację.

SSCP — M etoda analizy polegająca na wykryw aniu polim orfizm u konform acji pojedynczoniciowych fragm entów DNA. M utacje punktow e i -ąnikrodelecje m ogą prow adzić do zmiany migracji pojedynczych nici DN A w w arunkach natyw nych po uprzedniej denaturacji.

gólności PCR uw arunkow ane są wieloma param etrami i ich standaryzacja nie jest obecnie możliwa. Nie ma również jasności jakie organizacje powinny czuwać nad popraw nością wykonywania badań diagnostycznych w oparciu o testy m olekularne.

Obecnie w diagnostyce molekularnej wykonywanej przez placówki badawcze przeważa am plifikacja sekwencji m etodą PCR, a wzmacnianie sygnału w badaniach hybrydyzacyjnych z sondam i m olekularnym i (transfer Southernajjest na pewno rzadziej w ykonyw ane niż w latach ubiegłych. Nie wszystkie badania diagnostyczne m ogą być wykonywane technikam i amplifikacji sekwencji. Wszędzie, gdzie wykrywane są allele o wielkości powyżej 2000 pz. nadal dom inuje am plifikacja sygnału sondy m olekularnej. Firm y farm aceutyczne produkujące gotowe zestawy d iagnostyczne do badań rutynow ych w laboratoriach przyszpitalnych umiejętnie łączą, w zależności od potrzeb amplifikację sekwencji z wzmocnieniem sygnału. M ożna zatem przyjąć, że amplifikacja sekwencji stosow ana do niedaw na jako osobna strategia, po połączeniu z wzmocnieniem sygnału będzie podstaw ow ą m etodą diagnostyki m olekularnej.

Praca w ykonana w ram ach gruntu KBN 4S 405 054 04.

A rtykuł otrzymano 21 kwietnia 1995 r. Zaakceptowano do druku 3 lipca 1995 r.


Piśmiennictwo

1. M ateriały Konferencji Nucleic Acid-Based Technology A m sterdam 7-9.11.1995

2. K a n Y W, D o z y A M (1978) Lancet 2: 910-9123. O r k i n S H , A l t e r BP , A l t a y C (1978) N Engl J M ed 299:

166-1724. Z i ę t k i e w i c z E, S ł o m s k i R (1987) Post Biochem 33:

451-4725. J u n g e r m a n M, S ł o m s k i R (1990) Post Biochem 36: 14-216. S ł o m s k i R, J u n g e r m a n M, K r a s z e w s k i A,

H o r s t - S i k o r s k a W (1989) Biotechnologia 2: 74-847. S ł o m s k i R, K w i a t k o w s k a J, C h l e b o w s k a

H (1993) Biotechnologia 4: 125-1318. S a i k i R K , S c h a r f S, F a l o o n a F, M u l l i s KB,

H o r n G T , E h r l i c h H A (1985) Science 230: 1350-13549. M u l l i s KB , F a l o o n a F A (1987) M ethods Enzymol 155:

335-350

10. T r i g l i a AT, P e t e r s o n M G , K e m p D J (1988) Nucleic Acids Res 16: 8186

11. G i b b s R A, (1990) Anal Chem 62: 1202-121412. C h a m b e r l a i n J S, G i b b s , RA, R a n i e r J E, N g u y

e n P N , C a s k e y C T (1989) Nucleic Acids Res 16: 11141- 11156

13. B o n d SB, C a r r i n o J J, H a m p l H, H a n l e y K, R i n e h a r d t LA, L a f f l e r T (1990) W: M onzenego (wyd): Papillom avirus in H um an Pathology. Recent Progress in Epiderm oid Precancers. Serono Sym posia Publications 78: 425-433

14. B a c k m a n n K C , C a r r i n o J J , B o n d SB, L a f f l e r T G (1991) European Patent Application No EP 0 439 183 A2

15. C o m p t o n J (1991) Nature (Lond) 350: 91-9216. K i e v i t i s T, v a n G e m e n B, v a n S t r i j p D, S c h u k -

k i n k R, D i r i c k s M, A d r i a n s e H, M a l e k L, S o o k - n a n R, L e n s P (1991) Journal o f Virologieal M ethods 35: 273-286

17. B r u i s t e n S, v a n G e m e n B, K o p p e l m a n M, R a s c h M, v a n S t r i j p D, S c h u k k i n k R, B e y e r R, W e i g e l H, L e n s P, H u i s m a n H (1993) A ID S Research and Human Retrovirus 9: 259-265

W . M ejb au m -K atzen elleb ogen ’s Sem inars

3. LIPOSOMES IN BIOLOGY AND MEDICINE

June 3-5,1996, Wrocław, PolandGeneral Objective of the Seminar:To discuss recent advances in construction and application of liposomes in research and clinical practice.Selected Aspects:• liposomes, techniques of their preparation and loading• liposomal stability and its modulation• liposomes in studies of biomembranes• liposome technology - from lab bench to clinic• other drug delivery systems

Daily lectures (international speakers) and facilities for posters. Social events. Exhibition o f pharmaceutical, chemical and biochemical companies.Send application requests to:

Prof. Arkadiusz Kozubek Organising Committee

3 rd Mejbaum-Katzenellenbogen’s Seminar.LIPOSOMES IN BIOLOGY AND MEDICINE

Institute o f Biochemistry'Wroclaw University

Przybyszewskiego 63/77 51-148 Wroclaw, Poland tel/fax+48 (71)252930

Early application is advised as Seminar LB&M is limited to 100 persons.


Terapia genowa — wektory i strategie

Gene therapy — vectors and strategies

ŁUKASZ HUMINIECKI*

Spis treści:

I. WstępII. Metody transferu genów

IM . Wektory wirusoweII-2. Wektory niewirusoweII-3. Nakierowanie wektorów

III. Strategie terapii genowejIII-1. Choroby nowotworowe III-2. Choroby dziedziczneIII-3. Nabyty zespół niedoboru odporności — AIDS

IV. Uwagi końcowe

Wykaz stosowanych skrótów: ADA — ostry złożony zespół niedoboru odporności; AIDS — nabyty zespół n iedoboru odporności; LTRs — long te rm in a l re p e a ts ; ITRs — in verted te rm in a l repeats: AAV — A d en o A sso c ia te d Virus; HSV-tk — kinaza tym idynowa wirusa H e rp e s s im p le x ; TI Ls — limfocyty naciekające guz; T N F — czynnik nekrozy now otworów; sIL-6R — rozpuszczalna form a receptora dla interleukiny 6; M H C — zespół głównych antygenów zgodności tkankowej; M D R — geny oporności wielolekowej; HIV — H u m a n I m m u n o d eß c ie n c y Virus: T at i Rev — białka regulatorow e HIV; TAR i RRE — sekwencje rozpoznaw ane przez Tat i Rev; RevMIO — transdom inujący m u tan t Rev; Sfv — wewnątrzkom órkowe mono-łańcuchowe przeciwciało.

I. Wstęp

Rozwój biologii m olekularnej, a w szczególności m etod rekombinacji DNA, zasugerował nowe podejście do leczenia niektórych chorób — terapię genową. Z dość dużą pewnością m ożna przewidywać, że w przyszłości będzie ona przydatna w leczeniu now otworów , chorób dziedzicznych i infekcji wirusowych. P o d sta wową jej zasadą jest dostarczanie do kom órki genu tak, aby ulegał transkrypcji. Powstające w wyniku ekspresji wprowadzonej informacji genetycznej RNA może służyć do syntezy białka, bądź sam o w sobie spełniać funkcję terapeutyczną.

Terapia genowa jest dziedziną niezwykle m łodą. Pierwsza kliniczna próba prow adzona przez A n - d e r s o n a, R o s e n b e r g a i B l a e s e m iała miejsce w 1990 r. i dotyczyła leczenia ostrego złożonego zespołu niedoboru odporności — ADA [1]. Do końca 1994 r. na całym świecie zostało zatw ierdzonych do badań klinicznych ponad 100 różnych program ów [2].

* Student, Uniwersytet im. A. Mickiewicza, W ydział Biologii, ul. M iędzychodzka 5, 60-371 Poznań

Contents:

I. IntroductionII. Methods of gene transfer

II-1. Viral vectorsII-2. Non-viral vectorsII-3. Vector targeting

III. Gene therapy strategiesIII-l. TumoursIII-2. Hereditary disordersIII-3. Acquired immunodeficiency syndrom — AIDS

IV. Conclusions

Próby te objęły ponac 300 pacjentów. O koło 60% tych badań dotyczyło nowotworów, 25% chorób dziedzicznych, 10% nabytego zespołu n iedoboru odporności — AIDS. Większość z nich to próby kliniczne pierwszej fazy, m ające na celu oszacowanie bezpieczeństwa analizowanych metod. Terapia genowa stw arza wiele teoretycznych zagrożeń. D latego do p rób klinicznych tak dobierano pacjentów, aby stan ich zdrow ia uzasadniał stosowanie słabo zbadanej, eksperym entalnej metody leczenia. W wielu przypadkach byli to ludzie śmiertelnie chorzy. W świetle w spom nianych obaw wyniki testów bezpieczeństwa wydają się niespodziewanie dobre. D oniesiono o poważniejszych efektach ubocznych tylko w przypadku jednego pacjenta z mu- kowiscydozą (zapalenie płuc) i kilku z nowotworem mózgu [3].

II. Metody transferu genów

Techniki wprow adzania genów m ożna posegregować na takie, w których DNA w prow adza się do kom órek stosując pewne m etody Fizyczne lub chemiczne oraz takie, gdzie konstruuje się wektory zdolne do samodzielnego przekazywania informacji genetycznej do kom órki.

D o pierwszych zalicza się precypitację z C a P 0 4, elektroporację, m ikroiniekcję, techniki biobalistyczne. M etody te są jednak mało wydajne [4] i uciążliwe w stosowaniu. T rudno sobie wyobrazić ich użycie in vivo. Obecnie zdają się służyć przede wszystkim do konstruow ania linii kom órek produkujących w ektory wirusowe.

D opiero opracow anie systemów w ektorow ych umożliwiło wydajne i selektywne w prow adzanie genów do kom órek. M ożna wyróżnić w ektory oparte na rekom binow anych wirusach (retrow irusach, adenowi-


rusach, defektywnych parwowirusach, wirusach H erpes simplex, Vaccinia, Polio, Sindbis [4]) i niewirusowe (liposomy, koniugaty m olekularne [5]). Należy jednak pam iętać, że tylko wektory retrowirusowe, adenowiru- sowe i lipofekcja są dopuszczone do prób klinicznych [6], reszta to systemy eksperym entalne testowane na zwierzętach i hodow lach kom órek in vitro. O tym czy i w jakim stopniu terapia genowa będzie miała wpływ na codzienną p rak tykę leczniczą, zadecyduje rozwój coraz doskonalszych systemów wektorowych. K onieczne jest przełam anie zjawiska znacznie obniżonej wydajności m odyfikacji przy zwiększaniu jej specyficzności. W ektory przyszłości powinny cechować się wysoką pojem nością, wydajnością i selektywnością, zapewniać integrację genu terapeutycznego z genomem kom órki-gospodarza w ściśle określonym miejscu, jeśli to konieczne poddaw ać jego ekspresję m echanizm om regulacyjnym kom órki-gospodarza oraz działać bez w ywoływania skutków ubocznych.

Przykładem dokonującego się postępu jest opracowanie now atorskiej m etody transportu genów do m itochondriów [7]. U dow odniono, że kowalencyjne związanie D N A z peptydem tranzytow ym specyficznym dla tran sp o rtu białek do m atriks m itochondrialnej (np. z peptydem tranzytowym transkarboksylazy ornitynowej), wydajnie stymuluje jego transport poprzez błonę m itochondrialną. Perspektywicznym celem tych prac jest terap ia chorób spowodowanych m utacjam i m itochondrialnego DNA.

II-I. Wektory wirusowe

a) Retrow irusy — są to RNA wirusy. Po wniknięciu retrow irusa do kom órki następuje synteza właściwego mu DNA, k tóry następnie integruje z genomem gospodarza w przypadkow ym miejscu, przy czym niezbędnym w arunkiem integracji jest podział kom órki. Jedynym wyjątkiem od tej ostatniej reguły są len- tiwirusy mogące integrować także w kom órkach nie- dzielących się. T erapia retrow irusow a daje trwałą ekspresję w prow adzonego genu (także u potom stw a zm odyfikowanej komórki). Przypadkow e miejsce integracji, stw arza też jednak niebezpieczeństwo transformacji kom órki w wyniku mutagenezy insercyjnej (aktywacja leżącego poniżej protoonkogenu, albo in- aktyw acja znajdującego się w miejscu integracji anty- onkogenu). K od retrow irusa zawarty w jego RNA po „przepisaniu” na DNA m ożna przedstawić następująco: LTR-gag-pol-env-LTR. LTRy (ang. long terminal repeats — LTRs) to regiony niekodujące, odpow iedzialne za integrację i regulację transkrypcji. Region gag koduje białka rdzenia wirusa, poi odw rotną trans- kryptazę i integrazę, a env glikoproteiny otoczki. Genem terapeutycznym (z ewentualnym genem m arkerowym) zastępuje się gag-pol-env. T aka pochodna retrow irusa ulega integracji, ale nie jest zdolna do autoreplikacji. Najczęściej używany w ektor retrow irusowy to rekom binow any wirus leukemii mysiej (ang.

M urine Leukemia Virus — M uLV) [8]. W yjątkowo dla terapii AIDS korzystniejsze wydaje się zastosowanie jako w ektora (mimo trudności w produkcji) zrekom - binowanego wirusa HIV [9] (selektywne infekowanie limfocytów CD 4 oraz właściwa lentiwirusom zdolność do integracji nawet przy braku podziałów komórki).

b) Adenowirusy — są to podwójnoniciowe DNA wirusy, nie integrujące się z genomem gospodarza. Nie wym agają one do produktyw nej infekcji podziałów kom órek. W irusowe D N A funkcjonuje w postaci nietrwałego episomu, łatwo podlegającego inaktywacji (szczególnie w trakcie podziału komórki). Dlatego efekt terapii jest stosunkow o krótkotrw ały, ale zm inimalizowane jest niebezpieczeństwo transform acji kom órki-gospodarza. Uniemożliwienie autoreplikacji osiąga się przez usunięcie z genomu adenow irusa regionu El [10, 11]. W adą adenowirusów jest ich im m unogenność, przy czym indukow ana jest także odpow iedź cytotoksyczna wobec kom órek stransdu- kowanych. Jest to kolejny czynnik decydujący o krót- kotrw ałości efektów terapii przeprowadzanej za pośrednictwem rekom binowanych adenowirusów. Nie należy jednak wykluczać ich użycia jako wektorów w terapii genowej. M ogą one być z powodzeniem stosow ane w sytuacjach kiedy krótkotrw ałość osiąganego efektu nie jest wielką przeszkodą, a wywoływana reakcja immunologiczna nie m a praktycznego znaczenia (na przykład w mukowiscydozie).

c) Defektywne parwowirusy — są to pojedynczoni- ciowe DN A wirusy. Ich zaletą jest to, że do au to replikacji wymagają koinfekcji adenowirusa. Stąd nazwa wirus adenosatelitarny (ang. Adeno Associated Virus— AAV). Ponadto preferencyjnie integrują z genomem gospodarza w określonym miejscu chrom osom u 19. Cechę tą w arunkują dwie odw rotnie powtórzone sekwencje końcowe (ang. inverted terminal repeats— ITRs) wraz z białkam i kodowanymi przez region rep [12]. Niestety białka Rep są toksyczne dla kom órki-gospodarza. Specyficznej co do miejsca integracji towarzyszy równie częsta integracja niespecyficzna. T rudno jest także otrzymywać AAV bez zanieczyszczeń tzw. pomocniczymi adenowirusam i. Kolejną w adą jest niska (nawet jak na wektor wirusowy) pojem ność — około 4000pz. W szystko to sprawia, że rekom- binow ane AAV — wektory wzbudzające początkowo duże nadzieje, ciągle nie są stosowane w próbach klinicznych.

II-2. Wektory niewirusowe

a) Liposom y — charakteryzuje je duża pojemność, niska immunogenność, nietoksyczność. W przypadku konieczności długotrwałej terapii m ożna lipofekcję bez przeszkód wielokrotnie powtarzać. Jeśli użyjemy kationowych liposomów in vivo we wlewie dożylnym to głównymi odbiorcam i będą kom órki prowadzące intensywną endocytozę (przede wszystkim makrofagi wolne oraz osiadłe wątroby, szpiku kostnego i śledzio


ny). Aby tego uniknąć stosuje się w taki sposób liposomy typu „niewidzialne” (ang. stealth), z d o d a tkiem gangliozydu GM1 lub glikolu polietylenowego (PEG), co nadaje ich powierzchni ładunek ujemny i czyni „niewidocznymi” dla m akrofagów [5]. Aby nadać liposomowi pow inowactw o do określonych kom órek m ożna umieścić na jego powierzchni przeciwciało, horm on albo czynnik wzrostu. Stymulację fuzji liposom u z błoną cytoplazm atyczną kom órki docelowej zapewnić może białko fuzjogenne F (ang. fusiogenic protein) wirusa Sendai.

Wysoce wydajne, łatwo integrujące się z błoną kom órkow ą liposomy kationow e powinno się raczej stosować ex vivo, ewentualnie in vivo miejscowo (iniekcja w prost do guza, wlew dotętniczy, podanie do dróg oddechowych w postaci aerozolu itp.).

b) FConiugaty m olekularne (ang. molecular conjugate vectors) — składają się z określonego liganda połączonego kowalencyjnie z polilizyną (polikation), k tóra dzięki oddziaływaniom elektrostatycznym wiąże plazmid. Taki koniugat wnika do kom órki na zasadzie endocytozy sterowanej receptorem (dla w/w liganda[13]). Aby wektor opuścił endosom przed przyłączeniem lizosom u i strawieniem, dodaje się do niego fragm ent otoczki adenow irusa [13]. Związane jest to z właściwą adenow irusom , pow odow aną przez pewne białka otoczki, zdolnością do szybkiego opuszczania endosom u.

II-3. Nakierowywanie wektorów

W wielu przypadkach krytyczne znaczenie dla powodzenia terapii genowej m a skonstruow anie wektora doprow adzającego do ekspresji genu terapeutycznego tylko w niektórych rodzajach kom órek. W ektory o takiej właściwości określa się mianem kierowanych (ang. targeted), a terapię prow adzoną z ich użyciem nazywa się selektywną. O pisany efekt można osiągnąć na dwa sposoby:

a) W ybiórcze infekowanie. W ektor przekazuje gen terapeutyczny tylko niektórym rodzajom komórek. W absolutnej większości wirusy aby wniknąć do kom órki muszą związać się ze specyficznym receptorem na jej powierzchni. Powinowactw o do tych receptorów zapewniają pewne elementy otoczki (np. glikoproteiny kodow ane przez geny env u retrowiru- sów). Zm ieniając te ligandy na drodze rekombinacji genetycznej, przyłączenia przeciwciała, czy chemicznej modyfikacji, możemy sterować tropizm em tkan k o wym wirusa [5].

b) W ybiórcza transkrypcja genu terapeutycznego. D okonuje się przez umieszczenie genu terapeutycznego pod kontro lą p rom otora tkankowo-specyficznego. N a przykład aby osiągnąć ekspresję w hepatocy- tach m ożna zastosować p rom otor album iny [14], w przypadku melanocytów odpowiedni będzie prom oto r tyrozynazy [15]. Proponuje się także szereg p ro m otorów nowotworowo-specyficznych. Przykłady to

prom otor a-fetoproteiny dla now otw oru w ątrobow o- kom órkowego; prom otor onkogenu ERBB2 dla raka sutka, żołądka, jelita cienkiego i grubego; prom otor antygenu karcynoem brionalnego dla raka jelita grubego, płuca, żołądka [16]. M ożna też wykorzystać naturalne powinow actwo retrow irusów (użytych jako wektor) i niedefektywnych parw owirusów (wykorzystujemy tylko wirusowy prom otor) do kom órek now otworowych.

III. Strategie terapii genowej

Podstaw ow ą decyzją jak ą należy podjąć w trakcie opracow yw ania program u terapii genowej jest wybór, czy ingerencji genetycznej będziemy dokonyw ać poza (ex vivo), czy wewnątrz (in vivo) organizm u pacjenta. W ygodniejsza jest modyfikacja ex vivo. Nie jest wtedy tak ważna selektywność (izolujemy tylko interesujący nas typ kom órek). Ex vivo możliwe jest wprowadzenie genu terapeutycznego w uprzednio upatrzone miejsce w genomie, w drodze tzw. somatycznej rekombinacji homologicznej [17]. Jak na razie jest to nie do przeprow adzenia in vivo ze względu na m ałą wydajność procesu pow odującą konieczność selekcji negatywnej kom órek, w których integracja nie zaszła, bądź miała miejsce bez selektywności. W ektory stosowane ex vivo zawierają najczęściej oprócz genu terapeutycznego także gen oporności na antybiotyk, um ożliwiający pozytywną selekcję kom órek, do których udało się wprowadzić m ateriał genetyczny, i w których ulega on ekspresji. T aka selekcja nie jest oczywiście możliwa in vivo. Przykładem jest gen oporności na neomycynę, czyniący kom órki niewrażliwymi na stosow any analog neomycyny G418. Gen niewrażliwości na antybiotyk może służyć także jako gen m arkerow y.

W wielu przypadkach konieczna jest jednak m odyfikacja kom órek in vivo. Szczególnie trudna jest terapia obliczona na eliminację kom órek now otworow ych. W ymaga ona wysokiej wydajności (celem jest zabicie wszystkich nieprawidłowych kom órek) oraz doskonałej wprost selektywności. Nieco mniej wym agająca jest terapia chorób dziedzicznych (terapię genow ą in vivo trzeba np. stosować w leczeniu m ukowiscydozy [18]). Częściowo traci wtedy na znaczeniu wymóg w ydajności (często dla skorygow ania nieprawidłowego fenotypu wystarcza, że tylko pewien procent kom órek n o rmalnie produkujących daną substancję podejmie swoją funkcję). Podobnie mniej rygorystyczne jest kryterium selektywności (produkcja w tkance białka, które norm alnie się tam nie znajduje, o ile zachodzi w znikom ych ilościach, nie jest zwykle toksyczna).

W przypadku terapii genowej infekcji wirusem HIV (Human Immunodeficiency Virus) najczęstszym celem jest m odyfikacja limfocytów CD4. Z pow odu ryzyka zakażenia personelu, zastosow anie program ów ex vivo na szerszą skalę w leczeniu klinicznym wydaje się wręcz niemożliwe. D latego w tym w yjątkowym przypadku istnieje tendencja do rozwijania technik in vivo.


III-l. Choroby nowotworowe

O becnie ilościowo zdają się przeważać program y związane ze szczepionkam i przeciwnowotworowymi [4], Pow odem jest zapewne duże bezpieczeństwo i stosunkow a łatw ość w ykonania (modyfikacji do k o nuje się ex vivo). Bardzo obiecujące, choć trudne i ryzykowne, są strategie w prow adzania do kom órek niepraw idłow ych genów wrażliwości na pewne leki (tzw. „genów sam obójczych” ang. suicide genes).

a) W prow adzanie „genów sam obójczych”. Zabiegu dokonuje się in vivo poprzez iniekcję w ektora (bądź fibroblastów produkujących wektor wirusowy) wprost do guza (w celu zniszczenia guza pierwotnego), ewentualnie dożylnie (chcąc wyeliminować przerzuty). Po upływie czasu koniecznego do transferu genów do kom órek now otw orow ych i ekspresji zawartej w nich inform acji genetycznej, podaje się systemicznie o d powiedni lek, norm alnie nietoksyczny albo słabo to k syczny dla kom órek człowieka.

Najczęściej stosow any jest gen kinazy tymidynowej wirusa Herpes simplex (HSV-tk) kodujący białko fos- forylujące gancyklow ir (ew. nieco inną pochodną gua- niny — acyklowir) do m onofosforanu, który pod wpływem enzym ów kom órki-gospodarza, ulega przem ianie w silnie toksyczny trójfosforan [19-21]. Jednocześnie niszczące działanie nie jest ograniczone do kom órki produkującej białko HSV-tk, ale obejmuje także kom órki kontak tu jące się z nią swą powierzchnią (ang. bystander killing effect). Umożliwia to całkowite zniszczenia guza nawet wtedy, gdy tylko do części jego kom órek w prow adzony został gen HSV-tk.

Inny przykład to gen kodujący dezaminazę cyto- zynową. W obecności tego enzymu przy podaw aniu 5'-fluorocytozyny pow staje toksyczny 5'-fluorouracyl. Nie m oże on jednak m igrować poza kom órkę w związku z czym brak jest efektu bystander killing [22-24].

N iedaw no w ykazano [25-27], że w przypadku HSV- tk i genu dezam inazy cytozyny w grę wchodzi nie tylko wytwarzanie toksycznych m etabolitów, ale także stym ulacja układu im munologicznego, gdyż pozytywnych efektów terapii nie obserwowano u zwierząt z niedoborem odporności.

O statn io zaproponow ano użycie jako „genu sam obójczego” genu cytochrom u p-450 [28]. Zdziwienie może budzić w ykorzystanie enzymu silnie aktywnego w wątrobie. Rzeczywiście, mamy tu do czynienia z odm iennym podejściem terapeutycznym. Stosow anymi lekami są pochodne oksazofosforynowe: cyklo- fosfamid i jego izom er ifosamid — cytostatyki „norm alnie” stosowane w leczeniu niektórych now otw orów. Są to w rzeczywistości proleki, przekształcane w aktyw ną formę w w ątrobie pod wpływem cytochrom u p-450. O ksazofosforyny wykazują bardzo silny, nie wym agający nawet bezpośrednio kontak tu kom órek, bystander killing effect. P onadto cytostatyki te są skuteczne we wszystkich fazach cyklu kom órkowego (system HSV-tk niszczy tylko w fazie S, pewna

zaś pula kom órek now otworu pozostaje w fazie Go, co powoduje duże niebezpieczeństwo wznowy). Aby uniknąć układowej toksyczności oksazofosforynów planuje się stosować ich iniekcję wprost do masy guza i/albo selektywne ham owanie aktywności w ątrobow ego cytochrom u p-450 (dominuje tam inny izoenzym niż wszczepiany kom órkom nowotworu).

b) „N apraw a now otw orów ”.Powszechnie wskazuje się na genetyczne podłoże

choroby nowotworowej [29, 31, 32], Za proces kar- cinogenezy odpowiedzialne są grom adzone w ciągu życia (w pewnych przypadkach także odziedziczone) mutacje w różny sposób powodujące aktywację on- kogenów lub inaktywację antyonkogenów. Przypuszcza się, że bez względu na charakter mutacji, w prow adzenie funkcjonalnej kopii antyongogenu, czy „wyciszanie” onkogenów za pom ocą którejś ze strategii antysensu [30], powinno ham ować niekontrolow ane podziały kom órek nowotworowych.

c) Im m unostym ulacja.Kom órki nowotworowe są rozpoznawane jako obce

i są w pewnej mierze atakow ane przez układ odpornościowy. Najważniejszą rolę gra tu odpowiedź kom órkowa za pom ocą limfocytów T cytotoksycznych. Reakcja ta jest jednak słaba i w efekcie nie dochodzi do zwalczenia choroby.

Chcąc wykorzystać możliwości terapii genowej dla wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej przeciw nowotworowi, próbow ano bezpośredniej stymulacji limfocytów przez wprowadzenie do nich genów cytokin. W tym celu pobierano limfocyty naciekające guz (ang. tumour infiltrating lymphocytes), nam nażano je in vitro i w prow adzano gen czynnika nekrozy now otworów (ang. tumour necrosis factor — TN F) w celu nadania im większej zjadliwości oraz gen interleukiny 2, dla stymulacji ich ilościowego rozwoju. Próby kliniczne prow adzone w Narodow ym Instytucie Z d ro wia USA w 1991 r. dały zniechęcające rezultaty. Nie ma podstaw aby twierdzić, że zmodyfikowane limfocyty po wszczepieniu w większych ilościach ponownie a takują guz. M onitorow anie wyników krwi pacjentów i testy laboratoryjne na zwierzętach zdają się potw ierdzać obawy przed ich niekontrolow anym autokrynnie stym ulowanym nam nażaniem [33].

W innym podejściu stosuje się specyficzne szczepionki przeciwrakowe. D la ich przygotow ania pobiera się kom órki nowotworu, nam naża in vitro i w prow adza do nich gen którejś z cytokin. Wyniki badań zdają się sugerować szczególną aktywność połączenia dwóch genów: interleukiny 6 i rozpuszczalnej formy jej receptora (sIL-6R) [4]. Przed przeprowadzeniem szczepienia należy jeszcze naświetlić kom órki nowotworowe odpowiednią daw ką prom ieni Rtg, aby uniemożliwić ich dalszy wzrost.

Kolejna strategia im m unostym ulacji polega na wszczepieniu kom órkom nieprawidłowym in vivo genu kodującego silnie immunizujący antygen (np. allogeni- czne główne antygeny zgodności tkankowej — M H C


[34]), ewentualnie tzw. kostym ulatorów pow ierzchniowych (np. B7.1 [35]), których obecność silnie aktywuje swoiste limfocyty T cytotoksyczne.

d) O chrona kom órek szpiku w trakcie chem ioterapii poprzez wprowadzenie genu oporności wielolekowej (ang. multi drug resistance — MDR1).

O pracow anie tej strategii umożliwiły badania nad m echanizm am i oporności niektórych now otw orów na stosowane chem ioterapeutyki [36]. C ytostatyki są lekami o niskim indeksie terapeutycznym , w związku z czym wywołują liczne efekty uboczne. Jedną z na jbardziej narażonych jest silnie proliferująca populacja kom órek krwiotwórczych szpiku. N adaw anie jej op o rności na następnie podaw ane leki poprzez w prow adzanie genu M DR1, pozw alałoby na dłuższą i intensywniejszą kurację [37].

e) Próby stosowania terapii genowej dla udoskonalenia techniki przeszczepów autologicznych szpiku w leczeniu białaczek.

Stosowanie chem ioterapeutyków w przebiegu n o wotworów krwi daje często tylko okresow ą remisję. W ykonanie przeszczepu allogenicznego wymaga znalezienia odpowiedniego dawcy i stwarza duże niebezpieczeństwo powikłań. N iedogodności te nie istnieją w przypadku przeszczepu własnego, uprzednio oczyszczonego z kom órek nowotworow ych szpiku kostnego [38]. Niestety stosowane dotychczas procedury oczyszczania wydają się być nieskuteczne. Zastosow anie transferu genów może być dwojakie. Po pierwsze, znakowanie oczyszczonego szpiku genem m arkerowym pozwoli ustalić, czy wznowa rzeczywiście pow odow ana jest niedokładnością procesu oczyszczania (kom órki nowotworow e będą posiadały gen m arkerowy), czy też zawodzi stosow ana in vivo chem ioterapia

(kom órki wznowy bez genu markerowego). Istnieją bowiem przypuszczenia, że o sukcesie przeszczepu allogenicznego decyduje reakcja przeszczep-przeciw- białaczce (ograniczony w ariant zespołu przeszczep- przeciw-gospodarzowi). Jeżeli obawy te nie potwierdzą się, terapia genowa może posłużyć do lepszego oczyszczania szpiku.

III-2. Choroby dziedziczne

W tabeli 1 wymienione są niektóre z chorób dziedzicznych, w przypadkach których próbuje się stosować terapię genową.

W ydaje się, że aby terapia genowa m ogła być obecnie skutecznie zastosow ana dla leczenia danej choroby dziedzicznej powinny być spełnione następujące warunki: a) jednogenowość; b) ograniczona liczba kom órek, których korekcja ma krytyczne znaczenie dla przywrócenia prawidłowego fenotypu; c) brak konieczności regulacji ekspresji w prow adzonego genu w zależności od fazy cyklu kom órkowego, czy od sygnałów ze środow iska zewnętrznego; d) szeroki przedział terapeutyczny pomiędzy zbyt niską (nieskuteczną), a zbyt wysoką (toksyczną) ekspresją genu.

W przypadku kiedy patologiczny fenotyp jest rece- sywny wystarczy tzw. wzmocnienie genu (dostarczenie prawidłowej kopii bez eliminacji zm utow anego alellu). Jednak, gdy będzie on dom inował, potrzebna jest wym iana genu („uciszenia” nieprawidłowego alellu m ożna dokonać w strategii antysensu [30], albo z wykorzystaniem somatycznej rekom binacji hom ologicznej [17]).

Prowadzi się intensywne badania nad transferem genów do kom órek prekursorow ych krwi, tak aby

Tabela 1.N iektóre z chorób dziedzicznych, dla których próbuje się stosow ać terapię genową

C horoba Białko kodow ane przez w prow adzany gen Typ m odyfikowanych kom órek

O stry złożony zespół niedoboru odporności — ADA

Dezam inaza adenozynow a Limfocyty T obwodow e i ich kom órki prekursorow e

M ukow iscydoza C FTR N abłonek dróg oddechowych

Rodzinna hipercholesterelonem ia Receptor LDL H epatocyty

Hemofilia A Czynnik VII Płytki krwi

Hemofilia B Czynnik IX Fibroblasty skóry

Fenyloketonuria H ydroksylaza fenyloalaninow a Hepatocyty

C horoba G auchera G lukocerebrozydaza M akrofagi, kom órki prekursorow e krwi

A drenoleukodystrofia A L D P K om órki prekursorow e krwi

Anemia złośliwa P-globina Erytrocyty

Dystrofia D uchenne’a Dystrofina M ioblasty

Zespół Lesch-N yhana Fosforybozylotransferaza hipoksantynow a K om órki zwojów podstawnych

Przewlekła choroba ziarniniakow a Białko cytochrom u b Neutrofile


wyeliminować konieczność powtarzania terapii istniejącą przy modyfikowaniu kom órek obwodowych [39].

Należy podkreślić, że wszystkie dotychczas p row adzone próby kliniczne leczenia chorób dziedzicznych (także, co jest właściwie oczywiste AIDS i now otworów) — to som atyczna terapia genowa (modyfikuje się kom órki somatyczne). Teoretycznie możliwe są także m anipulacje dokonyw ane na kom órkach gene- ratywnych, czy we wczesnych stadiach rozwoju za rod ka. Nie przeprow adza się ich ze względu na trudności metodyczne, wątpliwe znaczenie praktyczne i silne opory etyczne [40]. Z podobnych powodów pom ijam ich dokładniejszy opis w niniejszym artykule.

III-3. Nabyty zespół niedoboru odporności — AIDS

W ydaje się, że terapia genowa AIDS napotyka na tę sam ą trudność, co próby opracow ania skutecznych chem ioterapeutyków . Tym problem em jest szybkie powstawanie opornych odm ian wirusa HIV (Human Immunodeficiency Virus) w wyniku jego dużej niestabilności genetycznej. Skuteczną terapię m ogłoby praw dopodobnie zapewnić dopiero połączenie kilku metod.

N a podstaw ie badań in vitro zaproponow ano następujące strategie terapii genowej infekcji wywołanej wirusem HIV:

a) K om petycyjne sensowne RNA1. „Pułapki RNA” (ang. R N A decoys) — replikacja wirusa HIV jest możliwa w obecności dwóch białek T at i Rev (stym ulują one transkrypcję i transport syntetyzowanego RNA z jąd ra do cytopłazmy). Sekwencje wiążące Tat i Rev to odpow iednio TAR i RRE. Sensowne RNA zawierające wielokrotnie pow tórzone sekwencje TAR albo RRE, poprzez kompetycyjne wiązanie w/w białek, są w stanie ham ować replikację wirusa [41].2. Sensowne RNA z sygnałem pakow ania — w b ad aniach in vitro wykazywały silniejszy efekt przeciw- wirusowy niż „pułapki RNA” [42]. W trakcie form ow ania się wirionów o interakcji genomowego RNA wirusa z białkam i rdzenia decyduje specyficzna sekwencja zwana sygnałem pakow ania. Obecność „fałszywych” genomowych RNA z sygnałem pakow ania owocuje produkcją defektywnych wirionów.

b) Strategie antysensu — w związku z cyklem życiowym wirusa HIV atrakcyjnym celem antysen- sownych oligonukleotydów są sekwencje TAR i RRE (przyłączanie T at i Rev do transkryptów stymuluje ich transport z jąd ra do cytopłazmy). Z kolei rybozymy mogłyby nie tylko unieczynniać produkty ekspresji prowirusa, ale także niszczyć w prow adzane w trakcie infekcji genomowe RNA (zapobiegając syntezie DNA, a poprzez to powstawaniu prowirusa) [43].

c) Produkcja w ew nątrzkom órkow ych przeciwiruso- wych białek.1. W yróżniono grupę białek zwanych m utantam i transdom inującym i (ang. transdominant mutant). O d

kryw ano je w trakcie badań nad szczepami wirusa, k tóre utraciły „zjadliwość”. Przykład to Rev 1 OM — zm utow ana form a białka Rev, zdolna wiązać się z sekwencją RRE, ale niespełniająca roli regulatorowej i transportow ej [45].2. W ew nątrzkom órkow e m ono-łańcuchowe przeciwciała (intracellular single-chain antibodies — Sfv). Sfv specyficzny dla gp l60 (glikoproteina otoczki wirusa odpow iedzialna za interakcję z receptorem CD4) poprzez łączenie się z gp l60 powoduje jego uwięzienie wewnątrz retikulum endoplazm atycznego i w efekcie produkcję wirionów nieinfekcyjnych. Z kolei Sfv specyficzny dla Rev uniemożliwia jego migrację z cytoplazm y do jąd ra (z miejsca syntezy do miejsca aktyw ności), ham ując w ten sposób replikację wirusa [46].

d) Eliminacja zainfekowanych kom órek. D okonuje się poprzez dostarczenie „genu sam obójczego” pod k on tro lą wirusowego p rom otora (ekspresja tylko w kom órkach zainfekowanych gdzie występują białka T at i Rev) [47].

e) Szczepionki genetyczne. U kład immunologiczny jest w stanie walczyć z infekcją wirusem HIV. N ajw ażniejszą rolę zdają się tu grać limfocyty CD8 cytotoksyczne i odpowiedź hum oralna. W prowadzenie do pewnej grupy kom órek genów białek wirusowych, z następczą ich ekspresją i prezentacją antygenów na powierzchni kom órek za pom ocą (M HC I-odpowiedź kom órkow a) lub M H C II (odpowiedź hum oralna), może zwiększać siłę reakcji immunologicznej [48].

N iektóre z w/w strategii już dziś testuje się w p ró bach klinicznych I i II fazy. Przykłady podane są w tabeli 2.

IV. Uwagi końcowe

Niezwykle mało pisze się dzisiaj o skuteczności testowanych klinicznie program ów terapii genowej. W iadom o o dwóch przypadkach długotrwałej skutecznej kuracji ostrego złożonego zespołu niedoboru odporności. Był jeden pacjent z rodzinną hipercholesterelonem ią, u którego miał miejsce znaczący spadek

Tabela 2.N iektóre z prow adzonych AIDS

w USA prób klinicznych terapii genowej

O środek Opis program u

Viagene W szczepienie zm odyfikowanych ex vivo fibroblastów (wektor retrowirusow y niosący geny env i rev)

Viagene Iniekcja retrowirusow ego w ektora niosącego geny env i rev

Univ. of M ichigan W szczepienie zm odyfikowanych ex vivo autologicznych limfocytów CD4 (gen rev MIO)

Univ. of California Jak wyżej, ale w prow adzony gen koduje rybozym


poziomu cholesterolu we krwi. Z aobserw ow ano k ilkanaście remisji u osób z now otw oram i [2], Jednak nawet i te wyniki obciążone są wątpliw ościam i in terpretacyjnym i [49] i niepewnością co do d ługo term inowych skutków terapii. Stawia to pod znakiem zapytania celowość olbrzymich nakładów pracy i pieniędzy: liczne ośrodki prowadzące badania, dwa czasopisma tematyczne: Gene Therapy i Humań Gene Thera- py, inwestycje prywatnych firm biotechnologicznych [50] kierowanych na rozwój terapii genowej. W spom niany stan dezinformacji m ożna jednak po części wytłumaczyć niechęcią do ujaw niania wyników badań w m iarę zbliżania się do ich kom ercyjnego wdrożenia.

Uzasadnieniem entuzjazm u w okół terapii genowej m ogą być olbrzymie teoretyczne możliwości jej zastosowań (choć w chwili obecnej jej przydatność w praktyce leczniczej jest bardzo nikła). K orekcja nieprawidłowego fenotypu rozwijającego się w przebiegu chorób dziedzicznych to w rzeczywistości tylko niewielka ich część. Transfer genów może być praw dopodobnie użyteczny w większości chorób człowieka. Chodzi tu bowiem nie tylko o przyw racaniu no rm alnych funkcji kom órek, ale także nadaw anie im zupełnie nowych właściwości (np. oporności na infekcję wirusową), znakowanie, a także selektywne niszczenie.

A rtykuł otrzymano 25 maja 1995 r.Zaakceptowano do druku 28 sierpnia 1995 r.

Piśmiennictwo

1. G a v a g h a n H ( 1 9 9 5 ) N a t u r e ( L o n d ) 3 7 4 : 3 9 32. A n d e r s o n W F (1994) Hum Gene Ther 5: 1431-14323. E d i t o r i a l (1995) Lancet 11: 739-7404. G ó r n y A, W i z n e r o w i c z M, M a c k i e w i c z A (1995)

Biotechnologia 1: 74-895. M i l l e r N, V i l e R (1995) F A SE B J 2: 190-1996. B r e n n e r M K (1995) J Internal M edicine 237: 229-2397. S e i b e l P, T r a p p e J, V i l l a n i G, K l o p s t o c k T, P a p a

S, R e i c h m a n n H (1995) Nucleic Acids Research 1: 10-178. S a m o n s B, G u n z b u r g W H (1993) Human Gene Ther 4:

129-1419. B r i d g e s S H, S a r v e r N (1995) Lancet 6: 427-432

10. E n g e l h a r d t J F , Y a n g Y, S t r a f o r d - P e r r i c a u d e t L D, A l l e n E D, K o z a r s k y K (1993) N at Genet 4: 27-34

11. L e G a l L a S a l l e G, R o b e r t J J , B e r r a r d S, R i d o u x V, S t r a f o r d - P e r r i c a u d e t L D (1993) Science 259: 988- 990

12. W e i z m a n M D , K y o s t i o S R M, K o t i n R M, O w e n s R A (1994) Proc N atl Acad Sci USA 91: 5808-5812

13. M i c h a e l SI , C u r i e l D T (1994) Gene Ther 1: 223-23214. H u b e r B, R i c h a r d s CA, K r e n i t s k y T A (1991) Proc

N atl Acad Sci U SA 88: 8039-804315. V i l e RG, H a r t I R (1993) Cancer Res 53: 3860-386416. D e o n a r i a n M P , S p o o n e r RA, E p e n e t o s A A (1995)

Gene Ther 2: 235-24417. C a p e c h i M R (1994) Świat nauki 5: 36-4318. B a l J (1994) Post Biochem 2: 86-9119. M o o l t e n F, W e l l s J (1990) J N a tl Cancer Inst 82: 297-30020. F i e l d A, D a v i e s M, D e v i t t C (1983) Proc N atl Acad Sci

USA 80: 4139-414321. M o o l t e n F M (1986) Cancer Res 46: 5276-528122. M u l l e n CA, K i l s t r u p M , B l a e s e R M (1992) Proc N atl

Acad Sci USA 89: 33-3723. H u b e r BE, A u s t i n E A, G o o d SS, K n i c k V C, Tibbels

S, R i c h a r d s C A (1993) Cancer Res 53: 4619-462624. H u b e r BE, R i c h a r d s CA, K r e n i t s k y T A (1991) Proc

N atl Acad Sci U SA 88: 8039-804425. V i l e R G, N e l s o n J A, C a s t l e d e n S, C h o n g H, H a r t

J R (1994) Cancer Res 54: 6228-623426. B a r b a D, H a r d i n J, S a d e l a i n M, G a g e F H (1994)

Proc N atl Acad Sci USA 91: 4348-435227. M u l l e n C A, C o a l e M M , L o w e R (1994) Cancer Res 54:

1503-150628. C h e n L, W a x m a n D J (1995) Cancer Res 55: 581-58929. B e r b e ć H (1994) Post Biochem 1: 6-1030. S t e c W J (1994) Biotechnologia 4: 5-1531. S i k o r a E (1993) Post Biochem 4: 212-22032. H a r ł o z i ń s k a - S z m y r k a A (1995) Post Biochem 1: 7-1433. Y a m a d a G, K i t a m u r a Y, S o n o d a H, T a k i S, M u l

l i g a n R C (1993) E M BO J : 2705-270934. N a b e l G J , N a b e l E G , Y a n g Y, F o x BA, P l a u t z G E ,

G a o X (1993) Proc N atl Acad Sci U SA 90 (23): 11307-1131135. C h e n L, A h e S, B r a d y WA, H e l l s t r o m I, H e 1 -

l s t r o m KE , L e d b e t t e r J A (1992) Cell 71: 1093-110236. S a l m o n SE, D a t t o n WS, G r o g a n T M , P l e z i a P,

L e h n e r t M, R o e D J (1991) B/ooć/ 78: 4437. L e v i n L, S i m o n R (1993) J N atl Cancer Inst 85: 173238. G o 1 d e W D (1992) Świat nauki 2: 38-4639. H u g h e s P F D , T h a c k e r J D , H o g g e D, S u t h e r l a n d

HJ , T h o m a s T E , L a n d s d o r p P M (1992) J Clin Invest 89: 1817-1824

40. H a m i l t o n M (1994) Hum Gene Ther 12: 1433-143741. S u l l e n g e r BA, G a l l a r d o H F , U n g e r s G E , G i l b o a

E (1991) J Virol 65: 6811-681642. B e r k h o u t B, J e r o e n L b v a n W a m e l (1995) Antiviral

Research 26: 101-11543. R o s s i J J , S a r v e r N (1992) Adv Exp M ed Biol 312: 95-10944. N a b e l G J , F o x BA, P o s t L (1994) Hum Gene Ther 5:79-9245. M a r a s c o WA , H a s e l t i n e W A, C h e n S Y (1993) Proc

N atl Acad Sci USA 90: 7889-789346. D u a n L, B a g a s r a O, L a u g h l i n M A (1994) Proc N atl

Acad Sci USA 91: 5075-507947. B r a d y H J M , M i l e s C G , P e n n i n g t o n DJ , D z i e

r ż a k E A (1994) Proc N atl Acad Sci USA 91: 365-36948. I r w i n MJ , L a u b e L S , L e e V (1994) J Virol 68: 5036-504449. G r o s s m a n M, R a p e r S E (1994) N at Genet 6: 335-34150. S w i n b a n k s D (1995) Nature (Lond) 374: 394

Wydawca prosi o kontakt tych, którzy chcieliby wykorzystać łamy „Postępów Biochemii” do reklamowania swych produktów i usług związanych z biochemią, biologią molekularną i biologią komórki.

Please contact the Editors if you wish to advertise in „Post^py Biochemii" the products and services related to biochemistry, molecular biology and cell biology.


Markery molekularne w genetyce i hodowli roślin

Molecular markers in plant genetics and plant breeding

WALDEMAR MARCZEWSKI*

Spis treści:

I. WstępII. Metoda RFLPIII. Metody M AAPIV. Porównanie metod RFLP i RAPDV. Konwersja dominujących loci RAPD na markery kodo-

minująceVI. Metoda SRFAVII. Mikrosatelitarne markery DNAVIII. Metody AS-PCR i SSCPIX. Metoda YACX. Uwagi końcowe

Wykaz stosowanych skrótów: PCR — polymerase chain reaction, łańcuchow a reakcja polimerazy; R F L P — restriction fragm ent length polymorphism ; Q TL — quantitative trait loci: M A A P — multiple arbitrary amplicon profiling: D A F— D N A amplification fingerprinting; RA PD — random amplified polymorphic DNA: A P-PC R — arbitrarily primed PCR: BSA — bulked segregant analysis: A F L P — amplification (amplified) fragment length polymorphism: SRFA— selective restriction fragment amplification: A R F — amplified restriction fragment: D G G E — denaturing gradient gel electrophoresis: SCAR — sequence-characterized amplified region: STS — sequence tagged site: STAR — sequence- tagged amplified region: CAPS — cleaved amplified polymorphic sequence: SSR — simple sequence repeat: AS-PCR — allele-specific PCR: SSCP — single-strand conformational polymorphism: YAC — yeast artificial chromosome, sztuczny chrom osom drożdżowy; kb — tysiąc par zasad; nt — nukleotyd.

I. Wstęp

W ykorzystanie m arkerów m olekularnych w badaniach genetycznych roślin zostało zapoczątkow ane wraz z odkryciem izoenzymów. Ekspresja m arkerów izoenzymowych, w przeciwieństwie do m arkerów m orfologicznych i cytologicznych, jest niezależna od fenotypu rośliny, w arunków środowiskowych oraz nie jest związana z występowaniem zjawiska epistazy [1-3]. Jednak niewielka liczba znanych loci m arkerów izoenzymowych stanowi przeszkodę w ich szerszym wykorzystaniu [1, 4, 5]. D opiero wprowadzenie m etod wykorzystujących m arkery DNA doprow adziło do przełom u w badaniach genetycznych roślin.

M ożna wyróżnić trzy podstawowe rodzaje m arkerów DNA;

* Dr, Zakład Genetyki i Syntezy M ateriałów Wyjściowych, Insty tu t Z iem niaka, Młochów, 05-832 Rozalin

Contents:

I. IntroductionII. RFLP methodIII. M AAP methodsIV. Comparison of RFLP and RAPD methodsV. Conversion of dominant RAPD loci into codominant

markersVI. SRFA methodVII. MicrosatellitesVIII. AS-PCR and SSCP methodsIX. YAC methodX. Concluding remarks

1 — m arkery będące fragm entam i DNA, powstałymiw wyniku traw ienia DNA enzymami restrykcyjnymi

2 — m arkery wykorzystujące łańcuchową reakcjępolimerazy (polymerase chain reaction — PCR)

3 — m arkery będące powtarzającym i się sekwencjam i genomu.

Celem tego artykułu jest przedstawienie m etod badawczych wykorzystujących m arkery DNA, które znalazły zastosow anie w m apowaniu genomu roślinnego.

II. M etoda R FLP

M etoda R FL P (restriction fragment length polymorphism) została opracow ana w 1974 r. [6]. Jej schemat przedstaw iono w tabeli 1. W yizolowany genomowy lub organellowy DNA jest poddany trawieniu jednym

Tabela 1.Schem at p rocedur stosow anych w m etodach R FL P i MAAP.

R F L P MAAP

Izolacja DNA

Traw ienie enzym am i restrykcyjnymi PCR

E lektroforeza na żelu agarozowymElektroforeza na

H ybrydyzacja DNA typu „Southern” żelu agarozowym lub poliakrylam i- dowymZ nakow anie sond i hybrydyzacja:

n ierad ioak tyw na radioaktyw na

D etekcja optycz- A utoradiografia na, lum inoscen- cyjna lub fluorescencyjna

Detekcja optyczna lub au to rad iog rafia


lub kilkom a enzymami restrykcyjnymi. W wyniku działania każdego enzymu restrykcyjnego powstaje duża liczba (rzędu 106) różnej długości fragm entów D N A [7-9], które są rozdzielane m etodą elektroforezy na żelu agarozowym, a następnie „przenoszone” na filtr nylonowy. Hybrydyzacja tak przygotow anych filtrów ze specyficznymi sondam i m olekularnym i jest kluczowym etapem m etody R FLP. Sondy m olekularne hybrydyzują do określonych fragm entów chrom osomów co umożliwia identyfikację pojedynczych fragm entów restrykcyjnych DNA. Identyfikacja hybrydy- zujących fragmentów DN A odbywa się m etodą auto- radiografii [10, 11], bądź m etodam i nieradioaktyw - nymi [12, 13]. Odzwierciedleniem zróżnicow ania genetycznego (polimorfizmu) badanych genotypów jest występowanie różnego spektrum identyfikowanych fragm entów restrykcyjnych. Isto tą m etody R FL P jest „wyszukanie” takich fragm entów restrykcyjnych (m arkerów RFLP), które są wyróżnikiem badanej cechy.

Polimorfizm może wynikać zarów no z pojedynczych zmian zasad, jak i zm ian obejmujących większe fragmenty DNA, co zostało schematycznie przedstawione na rycinie 1. G enotypy A i B charakteryzują się różną długością hom ozygotycznych fragm entów D N A między identycznymi miejscami restrykcyjnymi (Ryc. 1 A, B). N atom iast genotyp C jest heterozygotą względem badanego locus, co wyraża się występowaniem odm iennych miejsc restrykcyjnych dla obu alleli (Ryc. 1C).

W ykorzystanie m etody R FL P w badaniach genetycznych organizm ów eukariotycznych datuje się od początku lat 80. Zastosow ano ją do m apow ania genomu człowieka [15, 16] a także w wielu działach genetyki i hodowli zwierząt i roślin [1, 5, 17]. W o p a rciu o m arkery R FL P powstały m apy genetyczne dla wielu gatunków roślin [1, 18, 19]. M etodę R FL P zastosow ano do m apow ania genów odpowiedzialnych za odporność dzikich i upraw nych gatunków roślin na zakażenia rozmaitym i patogenam i [20]. Stała się ona przydatna do identyfikacji cech determ inow anych przez pojedyncze geny, a także do analizy cech dziedzicz

Ryc. 1 Schemat ilustrujący traw ienie enzymem restrykcyjnym D N A z trzech roślin diploidalnych (A, B, C) oraz au to rad iogram identyfikujący p rodukty traw ienia (D).O pracow ano na podst. [7,17],K reskam i pionowym i zaznaczono miejsca traw ienia D N A endonukleazą. Pogrubioną kreską zaznaczono miejsce w iązania sondy do DNA.

nych poligenicznie (tzw. Q TL — quantitative trait loci) [1, 4, 21, 22]. M etoda R FL P znalazła również zastosowanie w badaniach filogenetycznych i taksonomicznych roślin [23-25].

III. Metody M A AP

Termin M A AP (multiple arbitrary amplicon profiling) [26] odnosi się do trzech m etod w ykorzystujących technikę PCR. Są to:D A F — D N A amplification fingerprinting [28]R A PD — random amplified polymorphic D N A [29] A P-PC R — arbitrarily primed PC R [30]

Technika PCR jest najczęściej stosow anym system em powielania (amplifikacji) kwasów nukleinowych in vitro [31]. Polega ona na hybrydyzacji s ta rterów (primers) do końców 3' identyfikowanej sekwencji na obu niciach DN A i amplifikacji tego fragmentu przy pom ocy term ostabilnej polimerazy DNA. Synteza nowej nici odbywa się więc od końca 3'-OH każdego startera. Po termicznej denaturacji proces ten jest pow tarzany nawet kilkadziesiąt razy [31, 32],

W yróżnia się dwa rodzaje starterów:— specyficzne, wykorzystywane jako startery do am p

lifikacji określonych alleli [33], sekwencji minisate- litarnych i m ikrosatelitarnych [34, 35]. Zagadnienia te są om ów ione w dalszej części artykułu.

— dowolne (arbitrary), które są wykorzystywane w m etodach M AAP. Są to k ilkunastonukleotydo- we sekwencje DNA, o 50-80% składzie zasad G i C, które wyznaczają amplifikację od kilku do kilkudziesięciu różnych fragmentów genom u [36].

P roduk ty amplifikacji DN A techniką PC R są identyfikowane elektroforetycznie (Tab. 1). W tabeli 2 przedstaw iono różnice występujące między kluczowymi param etram i m etod DAF, R A PD i AP-PCR.

Tabela 2.P odstaw ow a charak terystyka m etod DA F, A P -PC R i RAPD.

Cecha D A F A P -PC R R A PD

Długość sta rte ra (nt) 5-15 18-32 9-10Stężenie startera (pM) 3-30 1-10 0.3Stężenie D N A (ng/pl) 0.01-1 0.1-5 1T em pera tu ra 30-70 35-50 35-42w iązania sta rte ra (°C)Zel rozdzielający poliakrylam id agarozaIdentyfikacja srebro au torad iografia brom ek

etydyny

O pracow ano na podst. [28, 36, 55].

M etody M AAP znalazły zastosow anie w wielu dziedzinach biologii m olekularnej, szczególnie w b ad aniach roślin, do m apow ania genomów [36-38]. Ź ró d łem polimorfizmu, na którym opiera się m apow anie są: — zm iany nukleotydowej sekwencji w obrębie miejsca

238 POSTĘPY BIOCHEMII 41 (4), 1995http://rcin.org.pl

przyłączania startera do m atrycy DNA, co może prow adzić do eliminacji lub utworzenia nowego miejsca hybrydyzacji startera do DNA

— zm iany w długości amplifikowanego segmentu DNA "

— zm iany konform acyjne DNA powodujące zróżnicow anie efektywności hybrydyzacji startera lub procesu am plifikacji [28, 39-42],

Bardzo isto tnym etapem m apow ania genomu m etodam i M A A P jest odpowiednie przygotowanie badanej populacji roślin. Poniżej wyszczególniono trzy m etody umożliwiające wyodrębnienie genowego regionu zawierającego badaną cechę.

Pierwszą jest m etoda linii izogenicznych (near-isoge- nic lines), k tó ra umożliwia uzyskanie, przez serię krzyżowań wstecznych (backross), linii genetycznych cechujących się obecnością fragm entu DNA z genem kodującym pożądaną cechę [18, 43, 44]. M etoda ta została zastosow ana w badaniach wielu gatunków roślin, do identyfikacji regionów zawierających geny odporności [14] a także geny warunkujące w ystępowanie różnych cech fenotypowych [43]. N iekorzystną cechą m etody linii izogenicznych jest konieczność w ykonyw ania wielu krzyżowań wstecznych, co wydłuża okres przygotow yw ania m ateriału roślinnego do kilku lat [14, 45].

D ruga m etoda nazywana BSA (bulked segregant analysis) jest zdecydowanie szybsza [46]. Z badanej populacji wybiera się 15-20 roślin charakteryzujących się obecnością analizowanej cechy oraz tak sam o liczną grupę roślin nie posiadających danej cechy. W yizolowane D N A z indywidualnych roślin jest łączone zgodnie z podziałem badanej populacji na dwie grupy. Badanie polimorfizmu między w yodrębnionymi pulam i D N A polega na szukaniu startera PCR (m arkera RA PD ) występującego tylko w grupie roślin mających b adaną cechę. M etodę BSA zastosow ano do identyfikacji loci sprzężonych z genami odporności [14].

W trzecim podejściu, zaproponow anym przez G i o v a n n o n i i ws p . [47], wykorzystano m etody R F L P i RAPD. Są to najczęściej stosowane m etody m apow ania genom u roślinnego [48]. W metodzie tej m apa m arkerów R FL P jest wykorzystywana do w yodrębnienia dwóch grup roślin. W yróżnikiem tak iego podziału nie jest cecha fenotypowa jak w klasycznej metodzie BSA, a są nim dwa m arkery R FLP. Badanie polimorfizm u polega na szukaniu m arkera R A PD odróżniającego te dwie grupy roślin. Jednym z zastosow ań tej m etody jest „uzupełnianie luk” występujących w m apach m arkerów R FL P [47].

IV. Porównanie metod R FLP i R A PD

Zaletą m arkerów R FL P jest kodom inujący charak ter, co oznacza, że heterozygotę m ożna odróżnić od hom ozygoty. N atom iast m arkery RA PD są dom inujące. Oznacza to, że nie m ożna ustalić, czy am plifikowany fragm ent D N A występuje w obu allelach, czy tylko

RFLP RAPD

Ryc. 2 Schemat ilustrujący kodom inujący charakter m arkerów R F L P i dom inujący m arkerów RAPD. a — identyfikacja prążków na filtrze nylonowym w m etodzie R FL Pb — identyfikacja prążków na żelu agarozowym w metodzie R A PD

w jednym allelu [36, 45, 49]. N a rycinie 2 przedstawiono schemat gdzie w przypadku metody R FL P w pokoleniu F2 wyróżnikiem heterozygoty jest obecność dwóch prążków hybrydyzacyjnych. N atom iast w przypadku m etody RA PD obraz elektroforetyczny produktów amplifikacji jest taki sam dla hom ozygoty dominującej i heterozygoty. Jest to zasadnicza różnica między m etodam i R FL P i RAPD.

Sondy m olekularne stosowane w metodzie R FLP z reguły zawierają sekwencje homologiczne do pojedynczych kopii badanego DNA, co umożliwia uzyskanie informacji o jednym genetycznym locus. N a to m iast każdy starter użyty w metodzie RAPD zapoczątkowuje reakcję amplifikacji wielu loci genomu [14,49]

Badanie polimorfizmu m etodą RAPD nie wymaga wstępnej informacji o sekwencji analizowanego DNA[41]. M etoda RA PD jest również mniej pracochłonna i zdecydowanie szybsza, niż R FLP [41, 45, 48, 50].

V. Konwersja dominujących loci R A PD na markery kodominujące

W celu rozróżnienia homozygotycznego i hetero- zygotycznego charakteru m arkerów RAPD m ożna zastosow ać krzyżowania wsobne (recombinant inbred) i wsteczne badanej populacji. Procedury te są jednak czasochłonne [14].

M ało skuteczna wydaje się też technika densytom et- rycznego pom iaru na żelu intensywności prążków RA PD [32].

Zaw odne jest także zastosow anie w metodzie R FL P sond m olekularnych, otrzym anych przez klonowanie produktów amplifikacji uzyskanych przy użyciu star-


terów RA PD [14, 32].Innymi utrudnieniam i są wielość amplifikowanych

loci i wrażliwość na zm iany w arunków amplifikacji w metodzie RA PD [14, 51].

Jednym ze skutecznych sposobów umożliwiających rozróżnienie hom ozygotycznych i heterozygotycznych m arkerów R A PD jest m etoda D G G E (denaturing gradient gel electrophoresis). W tej metodzie wykorzystywane jest zjawisko odmiennej podatności na termiczną denaturację alleli tworzących locus hetero- zygotyczny, czego efektem jest ich zróżnicow ana migracja w żelu zawierającym wzrastający gradient związku denaturującego [36, 49, 52].

W drugiej metodzie, nazwanej SCAR (sequence- characterized amplified region) [14, 42], oba końce fragm entów DNA, będących produktam i amplifikacji ze starterów RAPD, są sekwencjonowane. N a podstawie ustalonych sekwencji syntetyzowane są specyficzne pary starterów , zawierające 10 oryginalnych nukleotydów starterów RA PD oraz 14 kolejnych nukleotydów z każdego końca amplifikowanego fragm entu DNA. Zastosow anie takich starterów — m arkerów SCAR — do ponownej amplifikacji DNA pozwala ustalić dom inujący lub kodom inujący charakter wyjściowego m arkera RAPD. M etoda SCAR jest podobna do metody STS (sequence tagged site), zastosowanej do badania genom u człowieka [53], Być może dlatego dla metody STS zaproponow ano nazwę STAR (sequence-tagged amplified region) [49],

Trzecia technika, określana term inem CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) [49, 54], polega na amplifikacji m etodą RA PD fragmentów DNA, które są następnie poddane trawieniu enzymami restrykcyjnymi. Elektroforetyczna analiza produktów tego tra wienia pozwala na identyfikację różnic między al- lelami. Schemat tej m etody przedstawiono na rycinie 3. W ystępowanie miejsca restrykcyjnego tylko w jednym allelu heterozygoty R/r prowadzi do pow stania większej liczby prążków na żelu (Rye. 3B), (prążki odpow iadają sumie fragmentów restrykcyjnych charakterystycznych dla hom ozygot R/R i r/r).

VI. Metoda SRFA

M etoda SRFA (selective restriction fragment amplification) została opatentow ana w 1993 r. przez firmę biotechnologiczną K EY G EN E N.V. w Holandii [56]. Polega ona na amplifikacji techniką PCR fragmentów DN A otrzym anych po trawieniu co najmniej jednym enzymem restrykcyjnym. Nowością tej m etody jest konstrukcja miejsca rozpoznaw anego przez specyficzne startery oraz samego startera. Do fragm entu restrykcyjnego dołączone są krótkie, 10-30 nukleotydo- we, sekwencje DNA nazywane adaptoram i, które razem z sekwencjami rozpoznaw anym i przez endonukleazy, stanow ią część stałą, do której przyłączają się startery. Sekwencja nukleotydow a starterów odpow iada sekwencji części stałej (adaptor plus miejsce restryk-

R /R r/r R /r

Ryc. 3 Schemat ilustrujący sposób rozróżnienia hom ozygoty (R/R i r/r) od heterozygoty (R/r) przy zastosow aniu m etody CA PS. O pracow ano na podst. [54].(A) Kreskam i pionowym i zaznaczono miejsca traw ienia enzymem restrykcyjnym. Pogrub iona kreska oznacza miejsce w iązania startera. (B) Rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji.

cyjne) i jest uzupełniona o część selekcyjną. Część selekcyjna jest elementem różnicującym startery i składa się z 1 do 4 nukleotydów, które rozpoznają końce fragmentów restrykcyjnych zgodnie z formułą 4 2n, gdzie n jest liczbą zasad selekcyjnych. Gdy różnica między częścią selekcyjną a końcem fragm entu restrykcyjnego dotyczy tylko jednej zasady, to zgodnie z po wyższą formułą 1 z 16 restrykcyjnych fragmentów DNA będzie amplifikowany. G dy różnica ta obejmuje 2, 3 lub 4 zasady, to odpowiednio jeden z 256, 4096 lub 65536 fragmentów DNA zostanie powielony. W m etodzie SRFA uwzględnione są nie tylko różnice w traw ieniu DNA enzymami restrykcyjnymi (jak w metodzie RFLP), ale także różnice w sekwencji przyległych do miejsca traw ienia zasad, które są rozpoznaw ane przez startery selekcyjne. Schemat tworzonego w tej m etodzie układu starter — am plifikowany fragment restrykcyjny przedstawiono na rycinie 4.

Pierwsze doniesienia o zastosow aniu metody SFRA ukazały się w formie streszczeń i dotyczą m apow ania genomu petuni (Petunia hybrida) [57] oraz genu R l, warunkującego odporność na Phytophthora infestans, w ziemniaku (Solanum tuberosum) [58]. Pierwsze publikacje dotyczące w ykorzystania m etody SRFA w badaniach genetycznych ziem niaka powinny się ukazać jeszcze w tym roku (Dr C. G e b h a r d t , M ax-

s t a r t e r 1

adapter s e l .

fragment r e s t r y k c y jn y

s e l . m. r . ad ap ter

s t a r t e r 2

l— c z . s t a ł a —II c z . z m i e n n a — —̂ — c z . s t a ł a —IRyc. 4 Schemat ilustrujący konstrukcję starterów stosow anych

w m etodzie SRFA. O pracow ano na podst. [56], Oznaczenia: m.r. — sekwencja sta rte ra kom plem entarna do miejsca restrykcyjnego rozpoznaw anego przez en d o n u k leazy; sel. — część selekcyjna;


-P lanck-Institu t für Züchtungforschung, K olonia, inform acja ustna).

O statn ie zagadnienie w tej części artykułu dotyczy rozbieżności stosow ania term inu A FLP. Termin A FLP, będący skrótem nazwy amplification fragment length polymorphism, wprowadzili C a e t a n o - A - n o 11 e s i w s p. [28] przez analogię do term inu R FLP. O dnosi się on do polimorfizmu fragmentów DNA am plifikowanych przy zastosow aniu metody DAF. Inni autorzy [55] skrót A FL P tłum aczą jako amplified fragm ent length polymorphism.

A utorzy m etody SRFA [56] do określenia tej m etody stosują również term in AFLP. W tym przypadku skrót ten odnosi się do polimorfizmu między p roduktam i am plifikacji fragmentów restrykcyjnych (amplified restriction fragment - ARF).

VII. M ikrosatelitarne markery D N A

M ikrosatelitarne m arkery DN A (microsatellites)[59] określa się również terminami: SSR (simple sequence repeat) [60], short tandem repeat [61] oraz STMS (sequence tagged microsatellite sites) [62]. Są to dwu-1 trójnukleotydow e, powtarzające się jednostki sekwencyjne DNA, których liczba zmienia się od kilku do kilkudziesięciu [63-65]. Czteronukleotydowe sekwencje m ikrosatelitarne zidentyfikowano w pom idorze (Lyco- persicon esculentum) za pom ocą sondy (GATA)4 [66].

W badaniu polimorfizmu wykorzystuje się specyficzne startery kom plem entarne do fragm entów DNA otaczających sekwencje m ikrosatelitarne. Źródłem polimorfizmu jest różna długość amplifikowanych fragm entów DNA, wynikająca z różnej liczby pow tarzających się jednostek [62, 63]. Identyfikowane m arkery m ikrosatelitarne m ają kodom inujący charak ter [49, 64]. Znalazły one zastosow anie w badaniach wielu roślin [63-65, 67].

Sekwencji m ikrosatelitarnych nie należy mylić z sekwencjami m inisatelitarnym i (minisatellites), które są również powtarzającym i się fragm entam i D N A o d ługości 11-60 par zasad, wykorzystywanymi szczególnie w badaniach genom u człowieka [63].

VIII. M etody AS-PCR i SSCP

Istnieje wiele w ariantów m etody AS-PCR (allele- specific P C R ) [53]. W podstawowej wersji [33] m etoda AS-PCR polega na amplifikacji fragm entów DNA za pom ocą trzech specyficznych starterów:— SI — specyficzny dla jednego allelu— S2 — specyficzny dla drugiego allelu— S3 — specyficzny dla obu alleli.

D opasow anie starterów SI i S3 do allelu 1 prowadzido powielania tego fragm entu DNA. M utacja allelu2 występująca w miejscu rozpoznawanym przez starter SI blokuje reakcję amplifikacji (Ryc. 5). W przypadku zastosow ania startera S2 zamiast SI sytuacja będzie odw rotna. Istnieje możliwość w yznakow ania starte

rów na końcach 5' różnymi znacznikami, np. starter SI biotyną, a starter S2 barwnikiem fluorescencyjnym. Stw arza to możliwość identyfikacji obu alleli jednocześnie. Stosuje się w tym celu chrom atografię na kolum nie agarozowej z dołączoną streptoaw idyną (dla wyróżnienia SI) i badanie fluorescencji (dla wyróżnienia S2).

M etodą AS-PCR wykorzystano do m apow ania genom u ryżu (Oryza sativa), stosując ją razem z m etodami: R FL P i RA PD [69, 70], a także SSCP [70], W ykryto dzięki tem u polimorfizm spowodowany zm ianą jednego tylko nukleotydu.

W m etodzie SSCP (single-strand conformational polymorphism) wykorzystywany jest fakt odmiennej konformacji denturow anych fragmentów DNA, które są identyfikowane elektroforetycznie na żelu poliakryia- midowym [42, 49, 68].

IX. Metoda YAC

Do m apow ania genom u stosuje się różne typy wektorów [14]. Jednym z nich jest sztuczny chrom osom drożdżowy (yeast artificial chromosome - YAC) [71]. Podstaw ow ą zaletą YAC jest możliwość klonowania bardzo dużych fragm entów DNA, od 150 kb do 1600 kb [14, 72, 73], co jest istotne w metodzie zwanej „spacerowaniem po chrom osom ie” (chromosome walking) [14, 72, 74, 75]. Jest to jednak technika skom plikowana, a zatem dostępna dla nielicznych labo ra to riów [73], M etoda YAC polega na częściowym traw ieniu wyizolowanego DN A enzymem restrykcyjnym, eliminacji frakcji zawierającej małe fragmenty DNA, przyłączeniu dużych fragmentów do ram ion wektora YAC i w prow adzeniu ich do drożdży za pom ocą techniki transform acji. Cechą w ektora jest posiadanie sekwencji spełniających funkcje centrom eru i telome- ru, co zapewnia replikację sztucznego chrom osom u

A lle l 1 A lle l 2s i ST-

S3 S3

I PCR

B rak------------------- a m p lif ik a c j iRyc. 5 Schemat ilustrujący identyfikację alleli za pom ocą specyficz

nych starterów w m etodzie AS-PCR.O pracow ano na podst. [33],


[14, 72]. M etodę YAC zastosow ano do m apow ania genom u soi [76] i buraka (Beta vulgaris) [77],

X. Uwagi końcowe

M apy genetyczne opracow ane za pom ocą m etody R FL P są uzupełniane o inne markery. Jest to związane z tworzeniem tzw. gęstych m ap chrom osom ow ych [78]. Przykładow o, m apa genetyczna Arabidopsis tha- liana obejmuje m arkery R FL P, RAPD, CAPS, YAC oraz m arkery morfologiczne i m ikrosatelitarne [54, 79], natom iast m apa Pisum sativum składa się z m arkerów R FLP, RAPD, morfologicznych, izoenzymowych i m ikrosatelitarnych [80]. Uzyskanie gęstych m ap genetycznych stanowi punkt wyjścia do m apow ania genów zgodnie z procedurą chromosome walking [54, 78, 79].

O sobną kwestią jest zastosow anie przedstawionych w tym artykule m etod w rutynow ych pracach hodow lanych. T rudno jest dzisiaj znaleźć takie przykłady. Jednak rozwój m etod wykorzystujących reakcję PCR, które są szybsze, tańsze i bardziej dostępne od innych dla przeciętnie wyposażonych laboratoriów stwarza szansę na znaczny postęp w tej dziedzinie [81].

PodziękowanieA utor dziękuje dr J a c k o w i H e n n i g o w i, dr J e r z e

m u S y l l e r o w i i dr E w i e Z i m n o c h - G u z o w - s k i e j za uwagi i dyskusję. P raca finansow ana w ram ach G ran tu KBN N r 6 P 0 4 B 006 08.

A rtykuł otrzymano 31 stycznia 1995 r.Zaakceptowano do druku 29 czerwca 1995 r.

Piśmiennictwo

1. T a n k s l e y S D, Y o u n g N D , P a t e r s o n AH, B o n i e r - b a l e M W (1989) Bio Technology 7: 257-264

2. H u n t e r RL , M a r k e r t C L (1957) Science 125: 1294-12953. S m i t h i e s O (1955) Biochem J 61: 6294. T a n k s l e y S D (1993) Annu Rev Genet 27: 205-2335. H e l e n t j a r i s T, S l o c u m M, W r i g h t S, S c h a e f e r A,

N i e n h u i s J (1986) Theor Appl Genet 72: 761-7696. G r o d z i c k e r T, W i l l i a m s J, S h a r p P, S a m b r o o k

J (1974) Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 39: 439-4467. W a t a n a b e K N (1994) W: Bradshaw JE, M ackay GR (red)

P o ta to Genetics, CAB International, W allingford, str 213-2358. H e l e n t j a r i s T (1987) Trends Genet 3: 2179. K o c h e r t G (1989) W: In troduction to R F L P M apping and

P lan t Breeding Applications, University Press, Cornell, str. 1-1410. F r e i n b e r g A P , V o g e l s t e i n B (1983) Anal Biochem 132:

6-1311. H e l e n t j a r i s T G , S l o c u m K M , S i e d e n s t r a n g C,

W e g m a n S (1985) Plant M ol Biol 5: 109-11812. K r e i k e C M , d e K o n u n g J R A , K r e n s F A (1990) Plant

M ol Biol Reptr 8: 172-17913. P a n a u d O, M a g p a n t a y G, M c C o u c h S (1993) Plant

M ol Biol Reptr 11: 54-5914. M i c h e l m o r e R W, K e s s e l i R V, F r a n c i s D M , F o r

t i n M G , P a r a n I, Y a n g C H (1992) W: G u rr SJ, M cPherson M J, Bowles DJ (red) M olecular P lant Pathology: A Practical A pproach, t 2. IRL Press, Oxford, str 233-288

15. B o t s t e i n D, W h i t e RL , S k o l n i c k M, D a v i s R W (1980) Am J Hum Genet 32: 314-331

16. W y m a n AR, W h i t e R (1980) Proc N a tl Acad Sci U SA 77: 6754-6758

17. B e c k m a n n J S, S o l l e r M (1986) Euphytica 35: 111-12418. K l e i n - L a n k h o r s t R M, V e r m u n t A, W e i d e R, L i -

h a r s k a T, Z a b e l P (1991) Theor Appl Genet 83: 108-11419. G e b h a r d t C, R i t t e r E, B a r o n e A, D e b n e r T, W a 1 -

k e m e i e r B, S c h a c h t s c h a b e l U, K a u f m a n n H, T h o m p s o n R D, B o n i e r b a l e M W , G a n a l M W , T a n k s l e y S D, S a l a m i n i F (1991) Theor Appl Genet S3: 49-57

20. G a b r i e l D W , d e F e y t e r R (1992) W: G u rr SJ, M cPherson M J, Bowels DJ (red) M olecular P lan t Pathology: A Practical A pproach, t 1. IR L Press, Oxford, str 51-66

21. B a c k m a n n J S, S o H e r (1986) W: Miflin BJ (red) Oxford Surveys of P lant M olecular and Cell Biology, t 3. University Press, Oxford, str 196-250

22. H e l e n t j a r i s T G , B u r r B (1989) W: Developm ent and A pplication of M olecular M arkers to Problem s in P lant G enetics, Cold Spring H abor L aboratory , New York

23. S o n g K M , O s b o r n T C , W i l l i a m s P H (1998) Theor Appl Genet 75: 784-794

24. H o s a k a K, H a n n e m a n J r . R E (1988) Theor Appl Genet 76: 172-176

25. H o s a k a K, H a n n e m a n J r . R E (1988) Theor Appl Genet 76: 333-340

26. C a e t a n o - A n o l l e s G, B a s s a m BJ, G r e s s h o f f P M(1992) Bio Technology 10: 937

27. S a i k i R K , S c h a r f SJ , F a l o o n a F, M u l l i s KB, H o r n G T , E r l i c h HA, A r n h e i m N A (1985) Science 230: 1350

28. C a e t a n o - A n o l l e s G, B a s s a m BJ , G r e s s h o f f P M (1991) Bio Technology 9: 553-557

29. W i l l i a m s J G K , K u b e l i k AR, L a v a k KJ , R a f a l s k i J A, T i n g e y S Y (1990) Nucl Acids Res 18:6531-6535

30. W e l s h J, M c C l e l l a n d M (1990) Nucl Acids Res 18: 7213-7218

31. T i j s s e n P (1993) W: H ybridization with Nucleic Acid Probes, t 1. Elsevier Science Publishers B.V, Am sterdam , str 165-219

32. W i l l i a m s J G K , H a n a f e y M K , R a f a l s k i J A, T i n - g e y S V (1993) W: Wu R (red) M ethods in Enzymology, Vol 218: R ecom binant DNA, 1 1. Academic Press, Inc, New York, str 704-740

33. W u D Y , U g o z z o l i L, P a l B K, W a l l a c e R B (1989) Proc N atl Acad Sci U SA 86: 2757-2769

34. H o r n G T , R i c h a r d s B, K l i n g e r K W (1989) Nucl Acid Res 17: 2140

35. W e b e r J L (1991) W: Davies K E (red) Genom e Analysis Vol 1: G enetic and Physical M apping, Cold Spring H arbor L ab o ra to ry Press, str 159-181

36. C a e t a n o - A n o l l e s G (1994) Plant M ol Biol 25: 1011-102637. C a e t a n o - A n o l l e s G, B a s s a m BJ , G r e s s h o f f (1991)

Plant M ol Biol Reptr 8: 294-30738. C a e t a n o - A n o l l e s G, B a s s a m BJ , G r e s s h o f f P M

(1993) M ol Gen Genet 241: 57-6439. V i e r l i n g R A, N g u y e n H T (1992) Theor Appl Genet 84:

835-83840. W a u g h R, P o w e l l W (1992) Trends Biotechnol 10: 186-19141. B o w d i t c h B M, A l b r i g h t D G , W i l l i a m s J G K ,

B r a u n M J (1993) W: M ethods in Enzym ology, Vol 224: Biological Diversity of M acrom olecules, Academic Press, Inc, New York, str 294-309

42. P a r a n I, M i c h e l m o r e R W (1993) Theor Appl Genet 85: 985-993

43. M a r t i n G B , W i l l i a m s J G K , T a n k s l e y S D (1991) Proc N a tl Acad Sci USA 88: 2336-2340

44. P a r a n I, K e s s e l i R, M i c h e l m o r e R W (1991) Genome 34: 1021-1027

45. T i n g e y SV, d e l T u f o J P (1993) Plant Physiol 101: 349-35246. M i c h e l m o r e R W , P a r a n I, K e s s e l i R V (1991) Proc

N atl Acad Sci U SA 88: 9828-983247. G i o v a n n o n i J J, W i n g R A, G a n a l M W , T a n k s l e y

S D (1991) N ucl Acids Res 19: 6553-655848. R a g o t M, H o i s i n g t o n D A (1993) Theor Appl Genet 86:

975-98449. R a f a l s k i J A, T i n g e y S V (1993) Trends Genet 9: 215-28050. Q u i r o s C F, C e a d a A, G e o r g e s c u A, H u J (1993) Am

Potato J 70: 35-4251. E l l s w o r t h D L , R i t t e n h o u s e K D , H o n e y c u t t R J

(1993) Biotechniques 14: 214-217


52. H e S, O h m H, M a c k e n z i e S (1992) Theor Appl Genet 84: 573-578

53. O l s e n M, C a n t o r C, B o t s t e i n D (1989) Science 245: 1434-1435

54. K o n i e c z n y A, A u s u b e l F M (1993) Plant J 4: 403-41055. P r a b h u R R , G r e s s h o f f P M (1994) Plant M ol Biol 26:

105-11656. Z a b e a u M, V o s P (1992) E P O Paten t 0534858A157. Z e t h o f J , D e K e u k e l e i r e P, v a n M o n t a g u M (1994)

4th International Congress o f Plant Molecular Biology, Abstract 19

58. M a k s e m K, L e i s t e r D, S a l a m i n i F, G e b h a r d t C (1994) 4th International Congress o f Plant Molecular Biology Abstract 20

59. L i 11 M, L u t y J A (1989) A M J Hum Genet 44: 397-40160. J a c o b H J K , L i n d p a i n t n e r K, L i n c o l n S E, K u s u -

m i K, B u n k e r K, M a o YP , G a n t a n D, D z a u VJ , L a n d e r E S (1991) Cell 67: 213-224

61. E d w a r d s A, C i v i t e l l o A, H a m m o n d HA, C a s k a y (1991) Am J Hum Genet 49: 746-756

62. B e c m k a n n J S , S o l l e r M (1990)Bio Technology8:930-93363. A k k a y a MS , B h a g w a t A A, C r e g a n P B (1992) Gene

tics 132: 1131-113964. M o r g a n t e M, O l i v i e r i A M (1993) Plant J 3: 175-18265. C r e g a n P, A k k a y a M, R o n g w e n J, S h o e m a k e r R,

S p e c h t J, B h a g w a t A, L a v i U (1994) 4th International Congress o f Plant M olecular Biology, Abstract 1846

66. V o s m a n B, A r e n s P (1994) 4th International Congress o f Plant M olecular Biology, Abstract, 42

67. R a f a l s k i J A M o r g a n a t e M, A n d r e C, B i d d l e P, P o w e l l W, T a r a m i n o G, H a n a f e y J, T i n g e y S (1994) 4th International Congress o f Plant M olecular Biology, Abstract, 1842

68. O r i t a M H , I w a h a n a H, K a n a z a w a K, S e k i y a T (1994) Proc N atl Acad Sci U SA 86: 2766-2770

69. M i y a o A, M o n n a L, Z h o n g HS, F u k u o k a S, Y a - m a z a k i M , S a s a k i T, M i n o b e Y (1994) 4th International Congress o f Plant Molecular Biology, Abstract 26

70. N a i r S, M o h a n M, B e n t u r JS, P r a s a d a R (1994) 4th International Congress o f Plant Molecular Biology Abstract, 1875

71. B r u k e DT , C a r l e G F , O l s o n M V (1987) Science 236: 806

72. S a m b r o o k J, F r i t s h E F , M a n i a t i s T (1989) W: M olecular Cloning: A L aborato ry M anual, t 2. Cold Spring H arbor L abora to ry Press, New York

73. F r i s c h a u f A M (1993) W: Brown TA (red) Essentia! M olecular Biology: A Practical A pproach, t 2. IRL Press, Oxford, str 15-38

74. W o c h n i a k P, M a l e p s z y S (1994) W: B iotechnologia — Przegląd Inform acyjny, str 15-30

75. H o h e i s e l J D (1994) Trends Biotechnol 10: 79-8376. F u n k e R, K o l c h i n s k y A, G r e s s h o f f (1994) 4th In ter

national Congress o f Plant Molecular Biology, Abstract, 2377. D e l - f a v e r o J, C h a r e l s D, V a n d e n b o s s c h e D,

D ’ H a e s e l e e r M, J a c o b s M (1994) 4 th International Congress o f Plant Molecular Biology, Abstract, 22

78. T a n k s l e y SD, G a n a l M W , P r i n c e J P , d e V i n c e n t e MC , B o n i e r b a l e M W , B r o u n P, F u l t o n T M , G i o v a n n o n i J J , G r a n d i l l o S, M a r t i n GB , M e s - s e g u e r R, M i l l e r J C, M i l l e r L, P a t e r s o n , P i n e d a O, R ö d e r MS , W i n g R A, W u W, Y o u n g N D (1992) Genetics 132: 1141-1160

79. R e i t e r RS, W i l l i a m s J G K , F e l d m a n n K A, R a f a l s k i J A, T i n g e y SV, S c o l n i k P A (1992) Proc N atl Acad Sci U SA 89: 1477-1481

80. D i r l e w a n g e r E, I s a a c P G , R a n a d e S, B e l a j o u z a M, C o u s i n R, d e V i n n e D (1994) Theor Appl Genet 88: 17-27

81. N i e w ö h n e r J, S a l a m i n i F, G e b h a r d t C (1995) M olecular Breeding 1: 65-78

Czy przemiany rodników tlenowych w organizmie przebiegają cyklicznie?**

Does the oxygen — radical metabolic — cycle exist in theorganism?

ROMAN GONDKO*

Wykaz stosowanych skrótów: RFT — reaktywne formy tlenu(rodnikowe i nierodnikowe pochodne tlenu), 0 7 — anionorodnik ponadtlenkowy, OH — rodnik wodorotlenowy(hydroksylowy), 07 — rodnik ozonowy, LH — wielo- nienasycony kwas tłuszczowy, L' — rodnik alkilowy, LO— rodnik alkokslowy, LOO — rodnik nadtlenkowy, SOD— dysmutaza ponadtlenkowa, CAT — katalaza, GPx — peroksydaza glutationowa, GSH — zredukowany glutation, GSSG — disulfid glutationu (utleniony glutation).

* Prof. dr hab., Katedra Biofizyki Ogólnej U.Ł., Banacha 12/16, 90-237 Łódź

Odkrycie reakcji dysmutacji, zachodzącej przy udziale enzymu dysm utazy ponadtlenkowej (SOD), zapoczątkow ało w biologii i medycynie dziedzinę badań reakcji wolnorodnikowych [1]. W wyniku jednoelektronow ej redukcji cząsteczki tlenu powstaje anionorodnik ponadtlenkow y (07). Jego spontaniczna

** W tomie 34 (1988) Postępów Biochemii ukazały się następujące artykuły n.t. rodników tlenowych: L i c z m a ń s k i A E — Toksyczność tlenu. I. Uszkodzenie żywych komórek: 273-291.L i c z m a ń s k i AE — Toksyczność tlenu. II. Mechanizmy obronne: 293-310.K w i a t o w s k i J A — Dysmutaza ponadtlenkowa — struktura, funkcja i filogeneza: 311-333.


czy niespontaniczna dysm utacja, lub dw uelektronow a redukcja tlenu prow adzą do pow stania nadtlenku w odoru (H 20 2).

W reakcji Habera-W eissa czy Fentona ponadtlenek z nadtlenkiem w obecności metali (Cu + , F e2+) tworzą rodnik wodorotlenow y (hydroksylowy — OH) (Ryc. 1.). Powyższe rodniki oraz H 20 2 zwane „reaktywnymi formami tlenu” (RFT) okazały się bardzo szkodliwe dla organizm ów („szok tlenowy”), a także są zdolne do naruszenia struk tu r materii nieorganicznej. „Aktywny tlen” uczestniczy w procesach peroksydacji lipidów (Ryc. 1.), co prowadzi do destrukcji błon i innych struk tu r kom órkow ych [2]. W olne rodniki pow odują m. in. korozję metali, uszkodzenie skał, plastiku, a także jełczenie masła i innych tłuszczów.

ZMIATACZE

A B CRyc. 1 Jedno- i dw uelektronow a redukcja tlenu (A) w pow iązaniu

z reakcją Fen tona (B):M e(n 1 )’ / M e n +

0 ^ + H 20 2 ♦ O H + O H + 0 2 oraz inicjacjąperoksydacji lipidów (C): O H + LH ->• L + H 20 .

W środowisku naturalnym głównym źródłem rod ników są reakcje tlenu z węglowodorami. Powstają one w procesie spalania stałych i płynnych paliw, a także tytoniu. Fotodysocjacja H N 0 3 w wyniku której w atmosferze generowane są rodniki hydroksylowe i ozonowe ( 0 3), to w naturze drugie bogate źródło reakcji wolnorodnikowych. W wyniku reakcji fotochemicznych anionorodnik ponadtlenkow y i nadtlenek w odoru powstają w wodach słodkich i morskich. Po naprom ieniow aniu (X, y, UV) (np. radioliza wody) lub przyłączeniu związków inicjujących szereg związków chemicznych może ulec przekształceniu w wolne rodniki [3]. W organizm ach aerobowych wolne rod niki pow stają w procesach metabolicznych w trakcie autooksydacji wielu związków, bądź w wyniku oddziaływań czynników zewnętrznych. Stwierdzono, że wolne rodniki m ogą być przyczyną pewnych stanów chorobowych, zwłaszcza w w arunkach osłabionej ochrony anty oksydacyjnej, a także procesów starzenia [4-8]. Prawie wszystko o budowie, własnościach i roli tlenu oraz jego reaktywnych pochodnych (23 dotychczas zidentyfikowanych) w organizm ach (przyrodzie), a także wiele dodatkow ych informacji (np. metody oznaczeń) znajdzie czytelnik w m onografii B a r t o s z a [9].

W w arunkach fizjologicznych wolne rodniki generowane są w toku wielu procesów fizjologicznych (tj. oddychanie, fotosynteza, autooksydacja chinonów,

leukoflawin, hem oglobiny i innych związków). G łównym źródłem rodników tlenowych w organizm ach jest m itochondrialny łańcuch oddechowy. Czteroelektro- now a redukcja tlenu cząsteczkowego do wody w łańcuchu oddechowym zachodzi wyłącznie na poziomie oksydazy cytochrom owej (kompleks IV). Jednakże przepływ elektronów przez składowe łańcucha o d dechowego nie jest szczelny: część elektronów „wyciek a” redukując cząsteczkę tlenu na drodze procesu jednoelektronow ego. Odpowiedzialnym i za „jednoelektronow y wyciek” z łańcucha oddechowego są: dehydrogenaza N A D H i koenzym Q. Zredukow ane formy: koenzym u dehydrogenazy N A D H i ubihyd- rochinonu na drodze jednoelektronow ej reakcji z tlenem tworzą O^. Tym samym m itochondrialny łańcuch oddechowy nie jest w 100% wydajny. Z całkowitej puli tlenu cząsteczkowego, 99-96% ulega w mito- chondriach pełnej czteroelektronowej redukcji do H 20 . Pozostała część (1-4%) po częściowej redukcji stanow i „jednoelektronow y wyciek” (O^) z układu. F ak t ten świadczyć może o „niedoskonałości” czy błędzie procesu ewolucyjnego. W ystępująca w macierzy m itochondrialnej dysm utaza m anganow a (M nSO D) transform uje do H 20 2 około 80% „jednoelektronowego wycieku”. Pozostała część (20% tzn. 0,2% z wyjściowej całości) wnika do cytoplazm y gdzie napotyka dysm utazę cynkowo-m iedziową (Cu, ZnSOD). A nionorodnik ponadtlenkow y powstaje tak że w m ikrosom alnym łańcuchu oddechowym przy udziale reduktazy cytochrom u P-450 i cytochrom u P-450. Rodnik ten wytwarzany jest również podczas fotosyntezy, kiedy stężenie C 0 2 w chloroplastach ulega obniżeniu [9, 10].

N asuw a się pytanie, czy stałe generowanie wolnych rodników w kom órce jest „błędem” ewolucyjnym, czy też niezbędnym, wyselekcjonowanym w trakcie ew olucji, szlakiem m etabolicznym. Gdyby R FT były tylko szkodliwe dla organizm ów, to na drodze doboru naturalnego powinny zostać wyeliminowane reakcje, k tóre je generują [11]. Takie właśnie przypuszczenia wysunięto po analizie produktów redukcji tlenu z udziałem niektórych enzymów, w tym oksydazy cytochrom owej [12]. Źródłem R FT w kom órkach są także reakcje enzymatyczne z udziałem oksydaz (ok- sydoreduktaz). Enzymy te uczestniczą w przeniesieniu elektronu lub atom u w odoru na tlen. Jedna z grup oksydaz zawiera w centrum aktywnym tylko metal, a ich produktem redukcji jest H 20 . W innej grupie oksydaz, obok metalu, koenzymem jest dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD). Z udziałem tych oksydaz powstaje H 20 2. Jest interesujące, że oksydaza ksan- tynow a (grupa prostetyczna: M o, FAD) może redukować tlen jedno lub dw uelektronow o tj. w ytwarzając O i bądź H 20 2. Ilość tlenu, k tórą enzym zredukuje jednoelektronow o lub dw uelektronow o zależy od stężenia tlenu w roztw orze i pH. W roztw orze zrów noważonym z tlenem pod ciśnieniem 101 kPa w pH = 10, szlakiem jednoelektronow ym przem iesz


czonych zostaje 100% elektronów. N atom iast w pH 7,8 w roztw orach dobrze napowietrzonych tylko 15% elektronów. Wyższe stężenia tlenu i wyższe wartości pH nasilają jednoelektronow ą redukcję tlenu, a wyższe stężenie substra tu odwrotnie [9]. W układzie in uitro z udziałem oksydazy dytochrom owej produktem redukcji jest H 20 [12]. Rozważenie wyżej przedstawionych danych prow adzi do wniosku, że redukcja cząsteczkowego tlenu do wody nie musi zachodzić etapow o z utw orzeniem reaktywnych rodników tlenowych. Tym sam ym hipotezę o „błędzie” należy odrzucić, przyjm ując hipotezę o fizjologicznej konieczności generow ania rodników tlenowych w m itochondrialnym łańcuchu oddechowym . Tym bardziej, że mamy coraz więcej faktów świadczących o roli i znaczeniu wolnych rodników tlenowych w norm alnych reakcjach m etabolicznych. W organizm ach aerobowych reaktywne formy tlenu wydają się być niezbędnymi, „norm alnym i”, m etabolitam i, a ich generowanie i usuwanie utrzym uje stan dynam icznej równowagi (hom eostaza prooksyda- cyjno-antyoksydacyjna), którego naruszenie prowadzi do patologii [13]. N a podstawie danych lite ratu ro wych B a r t o s z opisał szczegółowo ponad 20 reakcji fizjologicznych w których R FT są niezbędne [9]. Poniżej przytoczone przykłady świadczą o szczególnej roli wolnych rodników w prawidłowej funkcji kom órek i tkanek. T ak na przykład, zm iana stężenia cG M P zachodzi pod wpływem Oy, OH i H 20 2, a hiperoksja, czy rozkład H 20 2 z udziałem katalazy, warunkuje aktywność cyklazy guanylowej [14-17]. O rganiczne rodniki pojaw iają się podczas syntezy deoksyrybonu- kleozydów, przebiegającej z udziałem reduktazy difos- forybonukleozydowej [18]. O kazało się, że nie tylko kom órki endotelialne, ale także neurony wytwarzają 0 2 oraz rodnik — N O ', z którego tworzy się nadtleno- azotyn (O N O O - ), a są to dwie zawierające azot bardzo ważne formy „reaktywnego tlenu” [19]. N iszczenie obcych kom órek bądź struk tu r przez fagocyty następuje w wyniku wybuchu (szoku) tlenowego wywołanego przez O^ generowanego przy udziale oksydazy N A D PH w błonie neutrofilii, m akrofagów, m onocytów i eozynofili [20], Nadtlenek w odoru pow stający w błonie adipocytów szczurów uważany jest za drugi regulator insuliny [21]. Stężenia nadtlenków lipidów oraz H 20 2 w arunkują syntezę prostag- landyn, leukotrien i tyroksyny (melanin) [22-24], Tak ważne procesy fizjologiczne jak: potencjał błonowy, wpływ witaminy na syntezę protrom biny i koagulację czynników VII i IX; agregacja płytek, m etabolizm ksenobiotyków , zachodzą przy udziale [25-27], A nionorodnik ponadtlenkow y jest substratem kilku enzymów takich jak: dioksygenaza 2- n itropropanu, dioksygenaza indofenylowa; oksydaza galaktozowa, indoloam ino-2,3-dihydroksylaza, dopam ino-dihydroksylaza [28]. Uważa się, że wolne rodniki tlenowe są niezbędne w tak podstawowych procesach życiowych, jak podział kom órek i rozwój organizm ów [29]. W ytwarzanie wolnych rodników i peroksydacja lipi

dów są silnie stym ulowane w okresach dużego zużycia tlenu jaki ma miejsce w włóknach mięśniowych w trak cie wysiłku fizycznego lub w brązowej tkance podczas termogenezy [30, 31].

U bezkręgowców i roślin szereg prawidłowych fizjologicznych funkcji tkanek (organów) uw arunkow anych jest obecnością wolnych rodników. Obecne w błonie zapłodnionych jaj jeżowca morskiego wolne rodniki zapobiegają polispermii [32]. U niektórych bezkręgowców wywołują bioluminescencję [33] i biorą udział w specyficznej reakcji obronnej niektórych chrząszczy biegaczowatych [34], W świecie roślin proces peroksydacji ułatwia syntezę głównego składnika drew na — ligniny [35]. N adtlenki lipidów i aldehydy powstałe w uszkodzonych tkankach roślin m ogą pełnić istotną rolę w obronie roślin przed bakteriam i i grzybami wnikającymi w miejsce zranienia [36]. *

Analiza danych literaturow ych dotyczących wolnorodnikowych reakcji skłoniła B a r j a ’ę do zaproponowania hipotezy cyklicznej przemiany w organizmie anionorodnika ponadtlenkowego (Ryc. 2) [10]. W przemianie tej kluczową rolę grać mają enzymy: dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) i katalaza (CAT) przy czym produkt(y) reakcji miałby regulować cykliczność przemian na drodze sprzężenia zwrotnego. Tym samym wymienione enzymy przede wszystkim grałyby rolę regulacyjną, a nie obronną (antyoksydacyjną).

W stosunku do ilości tlenu uwolnionego z hem oglobiny, ilość uwalnianego tlenu przy udziale SOD i CAT w hipotetycznym cyklu jest nieznaczna. M imo to cykliczność procesu może, w przypadku dużego przyrostu wolnych rodników, spowodować miejscowe obniżenie p 0 2 w tkankach. G dyby układ nie mógł wytwarzać 0 2, to wybuch tlenowy (duże punktow e stężenie rodników) połączony ze zm iataniem rodników (tj. zużyciem tlenu) mógłby doprowadzić do lokalnej hipoksji oraz ograniczenie reakcji tlenowo- zależnych.

W proponow anym cyklu, podczas jednego pełnego obrotu, nie ma równowagi pomiędzy ilością zużytego i wytworzonego tlenu (ilość O j plus reakcje z SOD i CAT). Stechiom etria reakcji wskazuje, że na każde 4 cząsteczki zużytego tlenu podczas jednego obrotu cyklu, odtw orzone są tylko 3 cząsteczki 0 2 (Ryc. 2.). Cztery cząsteczki 0 2 zostają zredukowane do 2 cząsteczek H 20 . Takie samo zdarzenie tj. nierównoważ- ność w ilości zużytego i wytworzonego tlenu ma miejsce w m itochondrialnym łańcuchu oddechowym z udziałem oksydazy cytochromowej, sprzężonym z syntezą ATP. W proponow anym cyklu nie uwzględniono tworzenia wiązań wysokoenergetycznych (ATP).

Cykl rozpoczyna tlen i elektrony pochodzące ze środowiska zewnętrznego (dieta, oddychanie). P ro dukt pośredni cyklu — H 20 2 eliminuje peroksydaza glutationow a (GPx). Enzymy antyoksydacyjne: SOD i CAT w pierwszym rzędzie stanowią fizjologiczny


ie}ŹróŹródło

Ryc. 2 H ipotetyczny cykl rodników tlenowych [10]. Enzymy: SO D usuwanie H 20 2 przy udziale GSH pełni PGx.

układ regulatorowy, odpowiedzialny za ilość wolnychrodników tlenowych w kom órkach i tkankach.

Z obecności cyklu wynikają następujące konsekwencje.

(a) Kiedy przyrostowi zawartości SO D nie tow arzyszy przyrost katalazy, to nastąpi wzrost stężenia H 20 2. SO D nie eliminuje produktów cyklu, katalizuje tw orzenie H 20 2. N adm iar H 20 2 może spowodować bezpośrednie uszkodzenie kom órek, bądź pośrednie, po przez generowanie w obecności jonów żelazawych — rodnika O H w reakcji Fentona.

(b) N adm iar katalazy nie m a tak negatywnych skutków, bowiem przy jej udziale powstaje tlen cząsteczkowy i woda.

(c) Równoczesny przyrost SO D i katalazy spowoduje w ydatkow anie energii (w wyniku redukcji tlenu do wody), zużytkow ując w tym celu elektrony z m etabolizmu, bez syntezy ATP.

(d) W zrost spożycia pokarm ów teoretycznie może podwyższyć w tkankach ilości O ^ i H 20 2. Jeżeli rodniki tlenowe są uwalniane w procesie starzenia to szybkość starzenia może zostać spowolniona poprzez regulowanie (ograniczenie) wartości kalorycznej diety.

(e) Podobnie, wzrost utlenienia tkankow ego — zużycie tlenu mające miejsce podczas wysiłku fizycznego (praca — sport) może być powodem stresu tlenowego spowodowanego przyrostem w kom órkach stężeń p ro duktów pośrednich cyklu.

Przedstaw iona hipoteza B a r j a, co jest oczywiste, wymaga doświadczalnej weryfikacji.

A rtykuł otrzymano 17 marca 1995 r.Zaakceptowano do druku 11 września 1995 r.

Piśmiennictwo1. F r i d o v i c h J (1975) Annu Rev Biochem 44: 147-1592. H a l l i w e l l B, G u t t e r i d g e J M C (1984) Biochem J 219:

1-14

Parowanie

i CAT są regulatoram i cyklu, a główną funkcję antyoksydacyjną tj.

3. R i le y P A (1994) ln t J Radiat Biol 65: 27-334. F e h e r J , C s o m o s G , V e r e c k e i A (1987) W: Free Radical

Reaction in M edicine, Springer-Verlag, Berlin, Heideberg, New York, London, Paris, Tokyo

5. W a r n e r H R (1994) Free Radical Biol M ed 17: 249-2586. S i k o r a E (1989) Post Biochem 35: 563-5747. J a r u g a P, O l i ń s k i R (1994) Post Hig M ed Dośw 48:

443-4568. J u r k o w i a k M, O l i ń s k i R (1995) Kosmos 44: 71-819. B a r t o s z G (1995) W: D ruga Tw arz Tlenu, W ydawnictwo

Naukow e PW N , W arszawa10. B a r j a G (1993) Free Rad Res Comms 18: 63-7011. H a l l i w e 11 B, G u t t e r i d g e J M C (1989) W: Halliwell B,

G utteridge JM C (red) Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford Univ Press, Oxford str 366-415

12. C h a n c e B (1981) W: G ilbert DL (red) Oxygen and Living Processes: an interdisciplinary approach, Springer-Verlag, New York str 200-209

13. G o n d k o R (1994) W: K iliańska Z, K rajew ska W M , Lipińska A (red.) Białka K om órek Prawidłowych i Patologicznych, ŁTN , Łódź str 241-270

14. H a d d o x M K , S t e p h e n s o n J H, M o s e r M E , G o l d b e r g N E (1978) J Biol Chem 253: 3143-3152

15. B u r k ę T M , W o l i n M S (1987) J Applied Ph ys 66: 167-17016. S a n t a M a r i a C R e v i l l a E, F a b r e g a t J, M a c h a d o

A (1989) Age 12: 1-517. C h e r r y P D , W o l i n M S (1989) Free Radical Biol M ed 7:

485-49018. F o n t e c a v e M, G r a s l u n d A, R e i c h a r d P (1987) J Biol

Chem 262: 12332-1233719. F e r e n c i k M , B e r g e n d i L, K a c a n i L (1993) W: Feher J,

Balzowics A, M atkovics B, Mezes M (red) Role of Free Radicals in Biological System Akadem iai Kiado, Budapest, str 71-81

20. M o r e l F, D o u s s i e r e J , V i g n a s i s P V (1991) European J Bioch 201: 523-546

21. H a y e s G R , L o o c k w o o d D H (1987) Proc N at Acad Scie USA 84: 8115-8119

22. N a k a m u r a Y, O h t a k i S (1989) J Endocrynology 126: 283-287

23. C h o i J H, Y u B P (1990) Age 13: 61-6424. S a m u e l s s o n B, D a h l e n SE, L i n d g r e n J A, R o u z e r

C A , S e r h a n C N (1987) Science 237: 1171-117625. S c o t t J A, R a b i t o C A (1988) Free Radical Biol M ed 5:

237-24626. K a n a b u s - K a m i ń s k a J M , G i r a r d o t J M (1984)

Archv Biochem Biophys 228: 646-65227. S e v a n i a n A, N o r d e n b r a n d K, K i m E, E r n s t e r L,

H o c h s t e i n P (1990) Free Radical Biol M ed 8: 145-15228. N o h l H (1981) Klinische Wochen 59: 1081-109129. A l l e n R G, B a l i n A K (1989) Free Radical Biol M ed 6:

631-661


30. A l e s s i o H M , G o l d f a r b A H (1988) J App Physiol 64: 1333-1336

31. B a r j a d e Q u i r o g a G, L o p e z - T o r r e s M, P e r c z - C a m p o R, A b e l a n d a M, N a v a M P , P u e r t a M L (1991) Biochem J 277: 289-292

32. S h a p i r o B M (1991) Science 252: 533-536

33. H e n r y J P , M o n n y C, M i c h e l s o n A M (1975) Biochemistry 14: 3458-3466

34. A n e s h a n s l e y D J (1983) Experientia 39: 366-36835. H a l l i w e 11 B (1978) Planta 140: 81-8836. K r o n z e J R , E l s t n e r E F (1978) Biochim Biophys Acta 528:

213-221

Domeny w błonach biologicznych i ich znaczenie fizjologiczne

Domains in biological membranes and their physiological importance

JOANNA BANDOROWICZ-PIKUŁA*

Spis treści:

I. Uwagi wstępneII. Klasyfikacja domen w błonach biologicznych

II-1. Domeny utworzone przez białkaII-2. Mikrodomeny lipidowe

III. Niektóre aspekty organizowania się fosfolipidów w domenyIII-l. Fuzja błon1II-2. Wpływ lipidów na aktywność enzymów, białek

transportujących i receptorowychIII-3. Mechanizmy oddziaływania fosfolipidów z niektó

rymi białkamiIV. Podsumowanie

Contents:

I. PrefaceII. Classification of domains in biological membranes

II-l. Domains formed by proteinsII-2. Lipid microdomains

III. Some aspects of phospholipid assembly into domain structuresIII-l. Membrane fusionIII-2. An influence of lipids on the activity of enzymatic,

transport and receptor proteinsII1-3. Mechanisms of interaction of phospholipids with

some proteinsIV. Conclusion remarks

To be functionally meaningful, (...) membrane domains must be larger than (...) the size o f an enzyme (...), 10-100 nm,( and ) to have a lifetime o f at least a typical enzyme turnover time, say 1-1000 microseconds.

Ken Jacobson i Winchil L .C . Vaz, 1992 [1 ]

Wykaz stosowanych skrótów: CL — kardiolipina; PA— kwas fosfatydowy; PC — fosfatydylocholina; PE — fosfatydyloetanoloam ina; PG — fosfatydyloglicerol; PI — fos- fatydyloinozytol; P IP — fosfatydyloinozytolo-4-fosforan; P IP 2 — fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan; PS — fosfatydyloseryna; SM — sfingomielina; D A G — 1,2-diacyloglicerol; FA — kwasy tłuszczowe; PXB — polim yksyna B; P L A 2 — fosfolipaza A2; PLC — fosfolipaza C; PK C— kinaza białkowa C.

* Dr, Zakład Biologii K om órki, Insty tu t Biologii D ośw iadczalnej im. M. Nenckiego PAN, ul. P asteura 3, 02-093 W arszawa.

I. Uwagi wstępne

M odel budowy błon biologicznych zaproponow any przez S i n g e r a i N i c o l s o n a [2], opisuje błony jako płynną m ozaikę przypadkow o rozmieszczonych składników. Podłoże m ozaiki stanowi dwuwarstwa lipidowa, w którą pozostałe składniki błony, białka strukturalne i enzymy, są wbudowane, lub z k tórą oddziałują elektrostatycznie. Dynam ikę takiej strukturze zapewniają lipidy zdolne do wykonywania ru chów warunkujących płynność dwuwarstwy. Dzięki temu pozostałe składniki błony m ają możliwość po ru szania się w płaszczyźnie błony i rotacji wokół własnej osi. Ruchy te są nieodzowne dla ich biologicznej funkcji [3, 4].

Nie jest to jednak pełny obraz błony biologicznej. Błona plazm atyczna kom órek organizm ów eukario-


wnętrzekomórki

Ryc. 1 Budowa błony biologicznej.O pracow ano na podstawie modelu płynnej m ozaiki Singera i N icolsona [2], z m odyfikacjam i [3, 5], O znaczenia: 1 — białka integralne błony i glikoproteidy; 2 — białka peryferyjne błony, tylko częściowo penetrujące w dw uw ar- stwę lipidową lub wiążące się z nią elektrostatycznie;3 — m ikrodom eny lipidowe o różnym składzie chemicznym;4 — reszty cukrowe glikoproteidów i glikolipidów eksponow ane po zewnętrznej, ekstracytoplazm atycznej stronie błony kom órkowej; 5 — elementy cytoszkieletu; niektóre z białek wchodzących w jego skład wiążą się z dw uw arstw ą lipidową błony; + i -, oznaczają ładunek w ypadkow y odpow iednio na zewnętrznej i wewnętrznej powierzchni błony plazmatycznej kom órki.

tycznych (Ryc. 1) pokryta jest płaszczem glikokalik- sowym, a od strony cytoplazmatycznej w sparta ro d zajem „rusztow ania”, utworzonego przez białka cyto- szkicletu. Błona biologiczna jest także struk tu rą asymetryczną, zarów no w rzucie prostopadłym , jak i rów noległym do płaszczyzny dwuwarstwy. Asymetria jest skutkiem specyficznych oddziaływań pomiędzy sk ładnikam i błony, które m ogą prowadzić do pow stania zróżnicowanych chemicznie i struk turaln ie rejonów w błonie o odmiennej wielkości, czasie półtrw ania i praw dopodobnie funkcji, tzw. dom en [3, 6-9].

II. Klasyfikacja domen w błonach biologicznych

Rozmieszczenie cząsteczek lipidów w liposomie o odpowiednio dużej średnicy jest uw arunkow ane ich rucham i termicznymi. Ruchy te winny sprzyjać przypadkow em u rozmieszczeniu składników również w błonie naturalnej. W tym ostatnim przypadku do chodzi jednak do zakłócenia rów nom iernego rozm ieszczenia cząsteczek, np. nagrom adzenia białek. F ak t ten spowodowany jest ograniczeniem ich ruchu bocznego [1, 4, 6, 10-12], co zapobiega „wymieszaniu się” składników i może prowadzić do utw orzenia dom en.

II-1. Dom eny utworzone przez białka

Integralne i powierzchniowe białka błony są roz

mieszczone w dwuwarstwie lipidowej w nieprzypadkowy sposób. W m ikroskali (< 103 nm 2) mamy do czynienia z kom pleksam i białek (np. zgrupowania oligomerycznych receptorów acetylocholiny), łączącymi ze sobą błony organelli kom órkow ych lub całe kom órki. W skali pośredniej (103-104 nm 2) postrzegamy „łatki”, dom eny bogate w receptory lub inne integralne czy powierzchniowe białka błonowe. D om eny te pow stają często na skutek kontaktów pomiędzy kom órkam i, adhezji lub oddziaływań z elementam i cytoszkieletu [13]. W skali m akroskopowej (> 104 nm 2) na powierzchni błony plazmatycznej kom órek nabłonkowych, erytrocytów, fibroblastów, plem ników i kom órek nowotworow ych zaobserwow ano występowanie dużych rejonów o różnym składzie lipidowym i białkowym [14, 15]. Dom eny te są stabilne przez wiele godzin i można je obserwować naw et w m ikroskopie świetlnym2. Należy podkreślić, że badając tylko skład chemiczny błon nie stwierdza się istnienia domen, a przecież muszą one wpływać na funkcjonow anie składników błony, szczególnie aktyw ność enzymów.

Dom eny bogate w specyficzne białka powstają w wyniku agregacji lub asocjacji białek na powierzchni błony pod wpływem zmian stężenia kationów lub zm ian stanu fizycznego i składu lipidowego błony. M oże dochodzić również do zakotw iczenia składników błony na elementach cytoszkieletu, czy cząsteczkach wirusów w trakcie infekcji kom órki, lub plemnikach podczas zapłodnienia kom órki jajowej, oraz tw orzenia się białkowych barier, które dzielą dwuwar- stwę lipidową na odrębne rejony [3, 9-13, 19, 20],

II-2. Mikrodomeny lipidowe

Zróżnicow ana szybkość ruchu bocznego cząsteczek lipidów prowadzi do powstania dom en lipidowych. D om eny tworzą się w efekcie nie m ieszania3 się składników będących w tej samej fazie, lub ograniczenia ruchu cząsteczek na skutek zmian tem peratury, ciśnienia, siły jonowej, stężenia kationów , czy specyficznych oddziaływań lipidów z peryferyjnymi i integralnymi białkam i błony [4, 9, 21-23] (Ryc. 2).

Jednym z podstawowych param etrów charak tery zujących zachowanie się lipidów w dwuwarstwie lipidowej błony jest tem peratura ich przejścia fazowego. W przypadku sztucznych błon, zbudow anych z jed nego rodzaju m olekularnego lipidów, w niskiej tem peraturze cząsteczki są w stanie uporządkow anym (stan krystaliczny, żel). W m iarę wzrostu tem peratury stan ten przechodzi w półpłynny (ciekło-krystaliczny). Lipidy zaczynają poruszać się na boki (dyfuzja lateral- na), rotow ać wokół własnej osi (dyfuzja rotacyjna), a także wykonywać ograniczone ruchy w płaszczyźnie

2 przegląd metod stosowanych w badaniach dom en zam ieszczono w tabeli 13 ang. immiscibility


Przypadkowe rozmieszczenie składników

T (°C ), ii, p (Pa) pH, [Ca2+], białka

Powstawaniedomen

Ryc. 2 C zynniki wpływające na tworzenie się dom en lipidowychw błonie.T — tem peratura; p — siła jonow a; p — ciśnienie.

poprzecznej błony (Jlip-flop). Jednocześnie, łańcuchy acyłowe kwasów tłuszczowych w cząsteczkach lipidów nabyw ają zdolności do wykonywania ruchów segmen- talnych, szczególnie wokół w iązania podwójnego [6, 19, 24]. Błona traci uporządkowanie. W przypadku dwu warstwy zbudowanej z więcej niż jednego rodzaju lipidu, zmiany związane z przejściem fazowym w b ło nie są kompleksowe, łącznie z nierównom iernym rozdziałem składników w płaszczyźnie błony. O braz jest jeszcze bardziej skomplikowany, kiedy dw uw arstwę lipidową penetrują białka integralne lub oddziałują z nią białka powierzchniowe [25, 26],

H a v e r s t i c k i G l a s e r [27], stosując fluorescencyjne pochodne fosfatydyloetanoloam iny, fosfatydylocholiny i kwaśnych fosfolipidów, fosfatydyloseryny i kwasu fosfatydowego, w połączeniu z m etodam i m ikroskopowym i, stwierdzili, że pod wpływem C a2 + w liposom ach o średnicy 5-15 pm i w błonie erytrocytów pow stają domeny zbudow ane tylko z kw aśnych fosfolipidów. V a n D i j c k i ws p . [28] oraz F e i g e n s o n [29] wykazali, że C a2 + i H + odpow iedzialne są za segregację anionowych fosfolipidów w liposomach, czemu towarzyszy pow stawanie kom pleksów C an(PS)m i żelifikacja pewnych rejonów błony. Konsekw encją opisanych zjawisk jest współistnienie w błonie m ikrodom en lipidowych wykazujących up o rządkow anie oraz m ikrodom en o wysokim stopniu

płynności. W błonie Acholeplasma laidlawii czy E. coli, w tem peraturze sprzyjającej wzrostowi kom órek, obserw owano obecność zżelifikowanych lipidów, szczególnie jeśli kom órkom dodano do pożywki nasycone lub iruns-nienasycone kwasy tłuszczowe. Obecność podobnych dom en stwierdzono również w błonie plazm atycznej plem ników [14, 16, 30].

Skład fosfolipidowy błon większości kom órek jest bardzo różnorodny. Charakteryzuje go wysoka zaw artość ds-jedno- lub wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, a w przypadku błon plazmatycznych, d o d atkowo wysoka zaw artość cholesterolu [4, 5]. Cholesterol w wyższym stężeniu działa jako czynnik „uplastyczniający” błony. Asocjuje z czterema cząsteczkami sfingomieliny, dwiem a fosfatydylocholiny lub jedną fosfatydyloetanoloam iny [25]. W związku z powyższym, w tem peraturze ciała organizmu, w większości błon biologicznych fosfolipidy w stanie żelu praktycznie nie występują. Zostało to potwierdzone np. w przypadku mysich fibroblastów i ludzkich erytrocytów [16].

D om eny lipidowe m ogą mieć strukturę inną niż dwu w arstw a (Tab. 2). Zdolnością do tworzenia takich dom en odznaczają się szczególnie fosfatydyloetanoloam ina i kwaśne fosfolipidy. Specyficznym przykładem dom eny lipidowej jest warstwa cząsteczek lipidów w okół integralnego białka błonowego, silnie z nim związana, tzw. annulus. W ystępowanie hipotetycznego annulusa przew idywano w przypadku C a2 + -ATPazy z b łon sarkoplazm atycznego retikulum [32]. Lipidy wchodzące w jego skład miałyby odgrywać rolę w regulacji aktywności enzymu. Hipoteza ta jest k rytykow ana przez wielu badaczy. Z drugiej strony jednak, niektórzy z nich stw ierdzają w obecności białek integralnych zm ianę ruchliwości łańcuchów acylowych lipidów, szybkości dyfuzji lateralnej cząsteczek, a także zm ianę asym etrii [6, 19].

III. Niektóre aspekty organizowania się fosfolipidów w domeny

Funkcje, jak ie pełnią błony w komórce, zależą w dużym stopniu od składu lipidowego dwuwarstwy. Znaczenie zjaw iska polimorfizmu lipidów dla fizjologii kom órki może być rozpatryw ane w kategoriach specyficznych oddziaływ ań lipidy-białka, m odulowanych przez lipidy oddziaływ ań białka-białka, i w kategoriach zm ian płynności błony. Płynność jest zjawiskiem odw rotnym do lepkości, wielkości fizycznej związanej z ograniczeniem ruchu bocznego cząsteczek [3, 4, 6, 23], W związku z tym asymetryczne rozmieszczenie fosfolipidów w błonie może mieć duże znaczenie dla fizykochemicznych właściwości dwuwarstwy. Również kwasy tłuszczowe wchodzące w skład fosfolipidów są rozmieszczone asymetrycznie. W przypadku błony erytrocytów (Ryc. 3) i fibroblastów skład kwasów tłuszczowych fosfolipidów zależy od rodzaju polarnej głowy cząsteczki. Aminofosfolipidy w pozycji sn2 bogate są w reszty kwasu arachidonow ego i innych


T abela 1.M etody stosow ane w badaniach dom en w błonach biologicznych.

Błona biologiczna lub sztuczna

Organizm , tkanka, kom órka

Z astosow ana m etoda W nioski uzyskane z obserwacji

Metody biochemiczne

błona plazm atyczna ludzkie erytrocyty 1. zastosow anie fosfolipaz o różnej specyficzności substratowej

istnienie dom en bogatych w PC

błona plazm atyczna Acholeplasma laidlawii istnienie dom en bogatych w PG; wpływ białek integralnych błony

błona plazm atyczna i błony organelli k o m ó rk o wych

kom órki neuroblastom y 2. badania m etabolizm u lipidów

nierów nom ierne rozmieszczenie PC w błonie

błony zewnętrzne i wewnętrzne

E. coli nierów nom ierne rozmieszczenie PG w błonie

błony tylakoidów chloroplasty 3. frakcjonbw anie błon biologicznych

istnienie dużych różnic w składzie chemicznym rejonów błony eksponow anych do strom y i do wnętrza tylakoidu

błona plazm atyczna em briony jeżowca istnienie dom en o różnym składzie chemicznym

błona plazm atyczna ludzkie erytrocyty 4. chemiczne sieciowanie białek i lipidów

istnienie dom en bogatych w PC i PS oraz specyficznych oddziaływań pom iędzy glikolipidam i i białkam i integralnymi

błona plazm atyczna M icrococcus luteus 5. fotochemiczne sieciowanie białek i lipidów

istnienie dom en bogatych w DAG i dim annozylo-D A G

Metody fizyko-chemiczne

błona plazm atyczna plem niki szczura 1. różnicowa kalorym etria (DSC)3

współistnienie dom en w błonie o różnej płynności

retikulum sarkoplazm atyczne

mięśnie szkieletowe królika

2. 32P -N M R b wpływ białek integralnych błony na powstawanie d o men lipidowych

błona plazm atyczna i ER w ątroba szczura 3. frakcjonow anie błon i EPR

współistnienie dom en o różnej płynności w tem peratu rze < 32°C; istnienie dom en bogatych i ubogich w cholesterol

błona plazm atyczna ludzkie erytrocyty zaobserwow anie zjawiska rozdziału składników w płaszczyźnie błony, pow staw anie dom en bogatych w cholesterol

błona plazm atyczna (rejo n bogaty w Na + ,K + -ATPazę)

organ elektryczny Torpedo marmorata

istnienie lipidowego annulusa wokół cząsteczek ATP- azy zbudow anego z cząsteczek fosfolipidów an io n o wych

liposomy błony z PS /PC lub PE/PC ; oddziaływanie z aneksy- nam i

4. E PR C wpływ aneksyn IV i VI na obniżenie dyfuzji lateralnej lipidów wywołanej przez jony C a2 + ; efekt specyficzny w stosunku do błon zbudow anych z PS

Metody mikroskopowe w połączeniu z modyfikacjami chemicznymi

błona plazm atyczna plem niki świnki morskiej 1. PXB zniszczenie struk tury błony w specyficznych rejonach, praw dopodobnie wzbogaconych w PS

błona plazm atyczna ludzkie erytrocyty 2. PXB, traw ienie PLC i im m unocytochem ia0

istnienie dom en bogatych w fosfolipidy anionow e

fragm enty błony plazm a- tycznej bogate w recep to ry dla acetylocholiny

m iotuby szczura 3. saponina, filipina istnienie dom en lipidowych o różnym składzie i p łynności


Tabela 1. (cd.)

Metody mikroskopowe w połączeniu z metodami fluorescencyjnymi

błona p lazm atyczna limfocyty myszy, kom órki C H ld limfomy, kom órki nerki chom ika (BHK )e, kom órki nabłonkow e ao rty wołu (BAE)r

1. pochodne fluorescencyjne kwasów tłuszczowych

istnienie dom en o różnej strukturze lipidów w chodzących w ich skład

błona plazm atyczna ludzkie fibroblasty; ko m órki BAEf

2. FR A P8 istnienie lipidowo-białkow ych dom en w płaszczyźnie błony o różnym składzie i różnej dyfuzji lateralnej; stwierdzenie, że połączenia między kom órkam i stanowią barierę uniem ożliwiającą ruch boczny składników w pewnych rejonach błony

błona plazm atyczna kom órki jajow e chom ika chińskiego

3. F R A P 8 w połączeniu z badaniam i m etabolicznymi

istnienie dom en lipidowych

D ane zam ieszczone w tabeli zaczerpnięto z pracy G l a s e r a [16] omawiającej m etody badania dom en w płaszczyźnie błon biologicznych, a także uwzględniono wyniki własne. aD SG , ang. differential scanning calorimetry,bN M R , ang. nuclear magnetic resonance, m agnetyczny rezonans jądrow y;°wyniki własne;dCH , ang. Chinese hamster, chomik chiński; eBHK, ang. baby hamster kidney cells; rBAE, ang. bovine aortic endothelial cells;BFR A P, ang. fluorescence recovery after photobleaching, nieinwazyjna m etoda polegająca na znakow aniu lipidów i białek sondam i fluorescencyjnym i w błonie kom órek, naśw ietlaniu określonego rejonu błony w iązką św iatła laserowego, w celu zniszczenia w tym rejonie znacznika fluorescencyjnego, i m ikroskopowej obserwacji pow rotu znacznika, dzięki ruchliwości składników błonowych [17, 18].

długołańcuchow ych, wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, podczas gdy w cząsteczkach fosfolipidów cholinowych występuje w tej pozycji przeważnie reszta kw asu palm itynowego [4-7,26], M ożna zatem przewidywać różnice w płynności obu m onow arstw błony. Istotnie, cytoplazm atyczną m onowarstw ę błony erytrocytu, bogatą w aminofosfolipidy, charakteryzuje niższa m ikrołepkość (wyższa płynność), niż m ikrolep-

Tabela 2.N iektóre właściwości fosfolipidów błon biologicznych.

kość przeciwnej monowarstwy.Asymetryczne rozmieszczenie aminofosfolipidów

w błonie jest jednym z czynników, k tó ry odpow iada za prawidłowy charakter kontaktów pom iędzy kom órkam i czy oddziaływań elementów cytoszkieletu z błoną. Dzięki temu zjawisku ulegają wytworzeniu rejony błony plazmatycznej płytek krwi biorące udział w koagulacji kom órek po ich aktywacji. Takie rejony błony

K lasafosfolipidów

P olarna głowa lipidu

Ł adunekwypadkowy

Pole powierzchni w błonie (A2)

Średnia m.cz. S truktury tw orzone w błonie

CL difosfoglicerol ujemny -100 1450 dw uw arstw ow a lub heksagonalna H„ ( + C a 2 + )

PA -O H ujemny - 7 0 750 dw uw arstw ow a lub heksagonalna H,, ( + C a 2+ w pH < 6,0 lub -C a2 + w pH < 3,0)

PC fosfocholina brak - 7 0 750 dw uw arstw a

PE fosfoetanoloam ina brak - 7 0 750 heksagonalna H n

PG fosfoglicerol ujemny - 7 0 750 dwuw arstw a

PI fosfoinozytol ujemny - 7 0 850 dw uw arstw a

PS fosfoseryna ujemny - 7 0 750 dw uw arstw a ( + C a 2 + ) lub heksagonalna H,i (w pH < 4,0)

SM fosfocholina brak - 7 0 750 dw uw arstw a

D ane zamieszczone w tabeli zaczerpnięto z m onografii G e n n i s a [6], V a n c e ’ a i V a n c e [21], K o z u b k a i w s p . [31] i W a 11 s a [22].


________komórki)

(błona kom órkow a) strona ekstracytopiaz-

(^krwinka czerwona^)

Ryc. 3 A sym etryczne rozmieszczenie fosfolipidów w płaszczyźnie poprzecznej b łony erytrocytu ludzkiego.O bjaśn ien ia sym boli znajdują się w wykazie stosow anych skrótów . O pracow ano na podstawie [7, 33, 34],

odgryw ają rolę również we wzajemnym rozpoznaw aniu się kom órek w stanach patologicznych (anemia sierpow ata, hemofilia, malaria), lub związanych z p ro cesami ich starzenia się (eliminacja z krwioobiegu starzejących się erytrocytów). We wszystkich wymienionych p rzypadkach mechanizm zjawiska polega na zniesieniu asym etrii w rozmieszczeniu fosfatydyloseryny, w w yniku zaham ow ania, przez wzrost stężenia C a2+ w cytoplazm ie, aktywności translokazy amino- fosfolipidów. Dzięki ruchowi flip-flop wyrównuje się stężenie PS w obu m onow arstw ach błony [6, 7, 35].

W ażną cechą lipidów błon biologicznych jest również możliwość regulacji lokalnych zm ian struktury błony. Z arów no zm iany tem peratury, pH, stężenia jonów , jak i peroksydacja lipidów czy specyficzne oddziaływ ania z białkam i integralnym i błony, białkami powierzchniowym i i elementami cytoszkieletu podbłonow ego, m ogą wpływać na właściwości dwuwarstwy lipidowej, np. przejście struktury dw uw arstwowej w s tru k tu rę odwróconej micelli Hj czy heksagonalną H „ [5, 6, 21, 36-38].

fatydyloetanoloam ina odznacza się bowiem innym współczynnikiem upakow ania w błonie niż lipidy tworzące dwuwarstwę (patrz Ryc. 4 i [6]). Pow staw anie s truk tu r H„ sprzyja fuzji, hemifuzji i lokalnym zm ianom kształtu błony (tworzenie wpukleń w trakcie endocytozy). Jeśli w błonie znajduje się cholesterol (30 m ol%), w obecności C a2+ nie dochodzi do segregacji cząsteczek PS i wszystkie lipidy tworzą struktury H „ [5 ] . '

Szczególnie ważną funkcję w procesie fuzji pełnią jony wapnia [39]. O dznaczają się one wyższym powinowactwem do anionowych fosfolipidów (stała dysocjacji, 0,5-1 x 10“ 1 M), w porów naniu z fosfatydylo- choliną i fosfatydyloetanoloam iną (3 x 10“ 1 M) [6]. D odatkow o w pobliżu powierzchni błony, na skutek oddziaływań pomiędzy różnoim iennym i ładunkam i kationu a warstwą przeciwjonów i lipidami anionow ymi powstaje zagęszczona warstw a C a2+ [6]. Pierwszym etapem w procesie fuzji jest zbliżenie się dwóch błon. W procesie tym przeszkodę stanowi warstwa hydratacyjna o grubości 2 nm, będąca fizyczną barierą w zbliżeniu błon. Jony wapnia i fosfatydyloseryna „pozwalają” błonom na bliski kontakt, m imo istnienia warstwy hydratacyjnej [23]. Również lipidy o niskim poziomie hydratacji, np. fosfatydyłoetanoloam ina,

Stan krystaliczny, stały, Lp (ang. crystalline state, solid)

Stan ciekło-krystaliczny, L a. (ang. liquid crystalline state, fluid)

Łańcuchy kwasów tłuszczowych w formie uporządkowanej

Przejściefazowe

Łańcuchy kwasów tłuszczowych w formie nieuporządkowanej

III-l. Fuzja błon

Fuzja b łon biologicznych jest zjawiskiem tow arzyszącym m.in. egzo- i endocytozie. Wielu badaczy uważa, że w procesie tym isto tną rolę odgrywają am inofosfolipidy jak o czynniki fuzjogenne. W liposom ach zbudow anych z tych fosfolipidów C a2+ indukuje segregację cząsteczek w płaszczyźnie błony. Dom eny fosfatydyloseryny ulegają żelifikacji, cząsteczki PS przestają stabilizow ać dwuwarstwę, zaś cząsteczki fosfatydyloetanoloam iny, zmieniając swoją konfigurację, tw orzą struktury heksagonalne H„. Fos-

Ryc. 4 Struktury tw orzone przez lipidy w błonach.A — zm iana stanu krystalicznego (stały) w ciekło-krystaliczny (płynny) i zw iązana z nią zm iana uporządkow ania łańcuchów acylowych w cząsteczkach lipidów; B — przestrzenna organizacja cząsteczek lipidów w błonach [5, 6 ].

strukturaheksagonalna

H.i


ułatw iają fuzję [40]. Praw dopodobnie zjawisko to może zachodzić na granicy dom en o różnym składzie i różnej płynności [41, 42], a także w rejonie błony o struk turze heksagonalnej H„. Lipidami tworzącymi struk tury H„ i odwróconej micelli są oprócz fosfatydyloetanoloam iny, cholesterol, kwasy tłuszczowe, lizofosfolipidy, a także w pewnych w arunkach diacyloglicerol, kardiolipina, kwas fosfatydowy i fosfatydyloseryna [6, 7, 26, 43-47].

III-2. Wpływ lipidów na aktywność enzymów, białek transportujących i receptorowych

W ykazano wprawdzie, że większość lipidów znajdujących się w pobliżu białka integralnego bardzo szybko (107 sek .-1 ) wymienia się z innymi lipidami błony, ale stw ierdzono również, że np. anionowe fosfolipidy (PS, PA), przebywają dłużej w pobliżu białek integralnych [35]. Lipidy m ogą zatem regulować aktyw ność niektórych białek np. receptora insuliny (cholesterol ham uje jego aktywność, kwasy tłuszczowe działają odwrotnie), N a + , K + -ATPazy (cholesterol ham uje aktywność enzymu), C a2 + - -A TPazy z błony plazmatycznej (enzym aktywow any jest m.in. przez kwaśne fosfolipidy i wielonienasycone kwasy tłuszczowe), receptora acetylocholiny (aktywność m odulow ana jest przez cholesterol), czy izoen- zymów kinazy białkowej C [5, 15, 26, 32, 35]. W przypadku tego ostatniego enzymu podstawową rolę w m odulacji jego aktywności odgrywa wiązanie z fosfatydy- loseryną, zaś C a2 + i diacyloglicerol podwyższają powinow actw o kinazy do tego fosfolipidu [48, 49].

III-3. Mechanizmy oddziaływania fosfolipidów z niektórymi białkami

Rozw ażania dotyczące mechanizmów oddziaływań fosfolipidów z białkami przeprow adzono w oparciu0 trzy przykłady: fosfolipaz A2 z jadu węży (grupy I, II), k tóre w ykazują specyficzność w stosunku do fosfolipidów zestryfikowanych w pozycji sn2 resztą kwasu arachidonow ego, izoform kinazy białkowej C, specyficznie oddziałujących z cząsteczkami PS oraz aneksyn, białek które w sposób zależny od stężenia jonów wapnia wiążą się z fosfolipidami anionowymi.

Jeden z lepiej poznanych m echanizm ów katalizy enzymatycznej dotyczy reakcji hydrolizy fosfolipidów przez fosfolipazę A2 z jadu węży. Tworzenie kom pleksu enzym/fosfolipid następuje przed związaniem substratu w centrum katalitycznym i jest uw arunkow ane zjawiskami zachodzącym i na granicy fazy wodnej1 dw uw arstwy lipidowej4; fosfolipaza jest aktywniejsza na granicy faz niż w roztworze [35,50,51 ]. Czynnikiem ograniczającym aktywność enzymu jest organizacja s truk tu ra lna substratu, gdyż wiązanie hydrolazy zachodzi tylko z lipidami tworzącymi uporządkow aną

4 ang. interfacial activation

strukturę dwuwarstwową. Jakiekolwiek zaburzenie takiej struktury błony (przez detergenty, kwasy tłuszczowe, lizofosfolipidy, diacyloglicerol, alkohole, czy zmianę tem peratury) obniża aktywność enzymu [35]. Ładunek grupy polarnej fosfolipidu w znaczący sposób zmienia powinowactwo enzymu do substratu, z 1 (T 13 M w przypadku fosfolipidów anionow ych, do 10“ 6 M w przypadku fosfolipidów neutralnych [52]. W iązanie substratu jest odpowiedzialne za aktywację fosfolipazy A2, bez zmiany struktury białka, k tóra jest stabilizowana przez 7 m ostków S-S [53-55].

Czas póltrw ania kom pleksu fosfolipaza A 2/lipid jest stosunkow o długi. W tym okresie białko oddziałuje z 35 cząsteczkami fosfolipidów [52, 56], poruszając się nad określonym rejonem błony i przez bardzo krótki czas wiążąc się z pojedynczą cząsteczką, k tó ra ma ulec hydrolizie. Kolejnym etapem (zależnym od C a2+ ) jest wejście substratu przez hydrofilowy kanał w białku do centrum aktywnego fosfolipazy. Z najdująca się w centrum aktywnym reszta histydyny, H48, a w jej otoczeniu reszty kwasu asparaginowego, D99 i D49, polaryzują cząsteczkę wody. Zachodzi wtedy a tak nukleo- filowy na grupę karboksylow ą w cząsteczce fosfolipidu. C a2 + w centrum aktywnym enzymu, koordynow any przez resztę D49, jest czynnikiem kierującym substrat we właściwe miejsce i stabilizującym produkt przejściowy reakcji [50, 51, 54], Stała powinowactwa procesu dla C a2+ wynosi 10~4 M.

Najlepiej scharakteryzow ana fosfolipaza A 2, enzym wew nątrzkom órkowy, odznacza się w ysoką specyficznością wobec kwasu arachidonowego. Enzym wymaga obecności C a2+ nie tylko do katalizy, ale również do wiązania z błoną. W procesie tym odgryw a rolę rejon C-końcowy białka [57], Jedna z cytosolowych fosfolipaz, specyficzna w stosunku do fosfolipidów zawierających kwas arachidonowy, charakteryzuje się obecnością rejonu oddziałującego z C a2 + , k tóry jest analogiczny do dom eny wiążącej fosfolipidy anionowe w cząsteczce kinazy białkowej C [58].

K inaza białkowa C jest zaangażow ana w regulacji wielu procesów w komórce, w tym egzocytozy, aktyw ności receptorów, ekspresji genów i proliferacji kom órek [15, 35, 59-61]. Znanych jest ponad dziesięć izoenzymów PK C o podobnej budowie cząsteczki, charakteryzującej się obecnością N -końcow ej domeny regulatorowej, zawierającej miejsca wiążące dla fosfolipidów i diacyloglicerolu oraz dom eny odpow iedzialnej za aktywność enzymatyczną. Izoenzymy te dzieli się na trzy podrodziny: o aktyw ności zależnej od C a2+ i diacyloglicerolu, zależnej tylko od diacyloglicerolu lub niezależnej od obu wym ienionych związków [62, 63]. W cytosolu enzym występuje w formie nieaktywnej. Jeśli w wyniku pobudzenia kom órki w błonie plazmatycznej powstanie 1,2-diacyloglicerol (produkt specyficznej w stosunku do fosfatydylocholiny fosfolipazy Cc), kinaza ulega zw iązaniu z błoną i aktywacji. Proces wymaga C a2+ ( ^ 10-6 M w obecności diacyloglicerolu) i cząsteczek fosfatydyloseryny;


enzym jest również aktywow any przez estry forbolu [59], Przyjmuje się, że po aktywacji kinaza białkowa C wiąże się z fosfolipidami błony (przede wszystkim z cząsteczkami fosfatydyloseryny, które grają rolę koenzymu), podczas gdy diacyloglicerol działa jak aktyw ator, być może wspólnie z fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforanem przyłączającym się do innego miejsca wiążącego w cząsteczce białka [64] i cis-nienasyco- nymi kwasami tłuszczowymi [65]. Co do liczby w iązanych cząsteczek fosfatydyloseryny przez enzym panuje wśród badaczy duża rozbieżność [15, 35, 66, 67].

B a z z i i N e l s e s t u e n [68, 69] przyczynili się do częściowego wyjaśnienia mechanizm u oddziaływania PK C z lipidami. Enzym, po związaniu z błoną, przyjmuje dwa podstawowe stany konformacyjne. Pierwszy, w obecności C a2+ (ulega odwróceniu po usunięciu kationów), drugi zaś białko przyjmuje w obecności estrów forbolu. W iązanie C a2+ przez kinazę jest procesem kooperatyw nym (wysoki współczynnik Hil- la), zależnym od obecności fosfolipidów [35, 70]. Związaniu z cząsteczką enzymu ulega co najmniej osiem jonów [71]. K inaza białkowa C wiąże się z fosfolipidami z wysokim powinowactwem. M echanizm wiązania jest sekwencyjny i prowadzi do związania ponad 10 cząsteczek aminofosfolipidów z cząsteczką białka [72, 73].

W ysoką specyficzność w stosunku do fosfolipidów anionowych wykazują aneksyny. Aneksyny (oznaczane rzymskimi cyframi od I do XIII) tworzą grupę homologicznych białek rozpuszczalnych, wiążących fosfolipidy i C a2 + . N iektóre ich właściwości zbliżają je wprawdzie do białek integralnych błony, ale powszechnie uznaje się, że oddziaływanie aneksyn z dwuwar- stwą lipidową w obecności C a2+ jest zjawiskiem powierzchniowym [74-76]. Od tej reguły są wyjątki. N a przykład odporność izoform aneksyn V i VI z tkanek wołu na ekstrakcję EGTA i możliwość solubilizacji z błony tylko z użyciem detergentu jest charakterystyczna dla białek integralnych [75], K on trowersje wzbudza także zdolność aneksyny V do tworzenia zależnych od potencjału błonowego kanałów wapniowych [77-81]. Jeden z poważniejszych zarzutów opiera się na fakcie, że segmenty o strukturze a-helikalnej w cząsteczce aneksyny V są o 6-8 reszt aminokwasow ych krótsze, niż segmenty transbłonow e o tej strukturze w cząsteczkach białek integralnych błony [77]. Co więcej, wnikanie aneksyny w hydrofobowy rejon błony, zważywszy na duże powierzchnie hydrofilowe w jej cząsteczce, wymagałoby olbrzymich zmian struktury trzeciorzędowej, a tego nigdy nie obserwowano [8, 82]. Przyjmuje się więc, że wiązanie aneksyny V z błoną polega na wywoływaniu przez to białko miejscowego zaburzenia struktury dwuwarstwy lipidowej, co prowadzi do jej zwiększonej przepuszczalności dla elektrolitów [80]. Reorganizacja dw uwarstwy lipidowej może być również, jak się wydaje, spow odow ana oddziaływaniem związanych z anek- syną jonów w apnia z grupam i fosforanowymi fos

folipidów i zm ianą geometrii ich cząsteczki lub zaburzeniem przez aneksynę lokalnego pola elektrostatycznego i utworzeniem hydrofilowych porów w błonie [8, 80, 83],

Powierzchniowy charak ter oddziaływania aneksyn z błoną został potw ierdzony przez N e w m a n a i w s p. [84, 85]. Badacze ci stwierdzili, że wiązanie aneksyny VI z m onow arstw ą lipidową w obecności C a2+ w niewielkim stopniu podwyższa ciśnienie powierzchniowe m onowarstw y utworzonej z am inofosfolipidów. Badania z zastosow aniem metody rozp raszania neu tronów 5 wykazały, że aneksyna V tworzy na powierzchni jednow arstw ow ych liposomów warstwę o grubości 3,5 nm. Znając wielkość cząsteczki białka (~ 3 ,0 nm) m ożna wnioskować, że aneksyna V nie wnika w dwuwarstwę lipidową [86]. D o podobnych konkluzji doszli P i g a u l t i ws p . [87], analizując strukturę dwuwym iarowych kryształów aneksyny V. Konsekwencje związania aneksyny V z liposom am i badano także przy użyciu spektroskopii N M R i krio- m ikroskopii elektronowej. Stw ierdzono brak wpływu białka na ruchy segm entalne łańcuchów acylowych reszt kwasów tłuszczowych fosfolipidów. Równolegle zaobserw ow ano znaczący wpływ aneksyny na zmiany konfiguracyjne w reszcie fosforanowej główki fosfolipidów [88-90] i redukcję krzywizny błony [8, 91]. Fakty te przem awiają za koncepcją, że wiązanie aneksyn z lipidami odbywa się bez penetracji białka w dw uw arstwę lipidową i w prow adza w błonie rodzaj miejscowego zaburzenia, bez zniszczenia integralności dwuwarstwy.

Oddziaływ anie aneksyny z dwuwarstw ą lipidową może dodatkow o wpływać na zm iany ruchu bocznego fosfolipidów w błonie [92] i segregację cząsteczek fosfolipidów, czyli tworzenie i rozpad dom en [71-73]. S o b o t a i ws p . [93], stosując pom iar widm EPR liposomów o zdefiniowanym składzie wykazali, że aneksyna IV i aneksyna VI rozbijają kom pleksy C an(PS)m w błonie, w wyniku pow staw ania niekowa- lencyjnych połączeń aneksyna-lipid przez m ostki w apniowe. W nieobecności aneksyn, kom pleksy C an(PS)m mogłyby tworzyć zaczątki większych dom en w płaszczyźnie błony, wzbogaconych w fosfatydyloserynę.

W tabeli 3 zebrano przykłady innych białek specyficznie oddziałujących z lipidami.

IV. Podsumowanie

W płynno-m ozaikow ym m odelu budow y błony biologicznej przyjęto założenie, że lipidy w formie dw uwarstwy tworzą środowisko dla integralnych i powierzchniowych białek błonowych, w którym cząsteczki białek m ogą poruszać się w nieskrępow any sposób. Bezpośrednią konsekwencją tego założenia jest, że białka i lipidy są w przypadkow y sposób rozmiesz-

5 SANS, ang. small-angle neutron scattering [86]


Tabela 3.N iektóre b iałka i oddziałujące z nimi klasy lipidów.

Białka Lipidy

ot-spektryna PS, PE

białko pasm a 4.1 PS

białko pasm a 4.1/glikofory- na C

PIP , P I P 2

a-ak tyn ina DAG, FA

profilina/profilaktyna P IP 2, P IP

żelzolina P IP 2

aneksyny I-X III PA > P S > PI > PE

winkulina PI, P IP 2, PS

białko z m ikrokosm ków jelitowych o m.cz. 110 kD a

PE, PS, PA, PI, PC

izoformy kinazy białkowej C PS, PA, PI, DAG, FA

kinaza pp60src oraz inne k inazy serynow o-treoninow e i ty- rozynowe

PS, DAG, PI, PIP , P IP 2, FA

białka zależne od witaminy K PS, PA, PI

zasadowe białko mielinowe PS > PL > PA > PG > PI > PE >> P C

cytochrom c C L > PS « PI > PC « PE

fosfolipazy A 2 (grupy I, II, IV) fosfolipidy zawierające kwas arachidonow y

fosfolipazy C ( i C c PI i pochodne PI (PLCj) oraz PC (PL C c), a także zawierające kwas arachidonow y

lizozym C L > P G > PE > PC > PS > PI

Tabelę opracow ano na podstawie prac przeglądowych i dośw iadczalnych dotyczących białek cytoszkieletu [6 , 94-99], białek oddziałujących z aktyną [94, 95, 100], fosfolipaz [23, 50-53], izoform kinazy białkowej C [71-73,101], aneksyn [44, 74-76] i innych białek [6 , 13, 19, 23, 94, 102-104],

czone w błonie [3]. W rzeczywistości wiele zebranych w niniejszej pracy obserwacji świadczy o czymś przeciwnym. W błonach biologicznych występuje przestrzenna regionalizacja składników. Regionalizacja ta m a charak ter m ikro- i m akrodom en, i obejmuje obie powierzchnie błony. Dom eny to wyspecjalizowane ponadcząsteczkowe struktury o różnej wielkości, istniejące w różnej skali czasowej. Pomiędzy ich chemicznym składem, stanem fizycznym, organizacją a funkcją istnieje ścisły związek [3, 9, 13]. Rozdział lipidów pomiędzy różnymi dom enam i może być wynikiem zm ian w szybkości ruchu bocznego cząsteczek, zjawiska wzajemnego nie mieszania się składników w tej samej fazie, a także oddziaływania lipidów z powierzchniowymi i integralnymi białkam i błonowymi [9]. W yspecjalizowane domeny lipidowe m ogą pełnić

w kom órce istotne funkcje, wpływać na stopień i szybkość reakcji w błonie oraz funkcjonować jako receptory dla specyficznych białek. Szczególnie dotyczy to białek powierzchniowych, których aktywność jest regulow ana w wyniku niekowalencyjnego wiązania się z lipidami błonowymi [13], Domeny lipidowe są zaangażow ane także w tak ważnych dla kom órki procesach, jak rozdział lipidów pomiędzy różne przedziały kom órkow e oraz egzo- i endocytoza [9].

Praca finansow ana z g ran tu KBN nr 6P04A01408.

Artykuł otrzymano ówrześnia 1995 r. Zaakceptowano do druku 18 września 1995 r.

Piśmiennictwo

1. J a c o b s o n K, V a z W L C (red) (1992) Comm M ol Celi Biophys 8 : 1-114

2. S i n g e r SJ , N i c o l s o n G L (1972) Science 175: 720-7313. T o c a n n e J F , C e z a n n e L, L o p e z A, P i k n o v a B,

S c h r a m V, T o u r n i e r J F , W e l b y M (1994) Chem Phys Lipids 73: 139-158

4. O p d e n K a m p J A F (red) (1994) W: Biological M em branes: Structure, Biogenesis and Dynamics. N A TO AS1 Series H: Cell Biology t 82. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New Y ork, London, Paris, Tokyo, H ong Kong, Barcelona, B udapest, str 356

5. C u l l i s PR, H o p e M J (1991) W: Vance DE, Vance J (red) New Com prehensive Biochemistry 1 20. Biochemistry of Lipids, L ipoproteins and M em branes. Elsevier, Am sterdam , London, New York, Tokyo, str 1-42

6 . G e n n i s R B (1989) W: C an to r ChR (red) Springer Advanced Texts in Biochemistry. Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, London, Paris, Tokyo, str 533

7. Z a c h o w s k i A (1993) Biochem J 294: 1-148 . B r o w n D, R o s e J (1992) Cell 58: 533-5449. W e l t i R, G l a s e r M (1994) Chem Phys Lipids 73: 121-137

10. E d i d i n M (1992) Trends Cell Biol 2: 376-38611. E d i d i n M (1992) Comm M ol Cell Biophys 8 : 73-8212. T h o m p s o n T E , S a n k a r a m MB , B i l t o n e n R L

(1992) Comm M ol Cell Biophys 8 : 1-1513. K i n n u n e n P K , K o i v A, L e h t o n e n J Y, R y t o m a a

M, M u s t o n e n P (1994) Chem Phys Lipids 73: 181-20714. A r t s E G , J a g e r S, H o e k s t r a D (1994) Biochem J 304:

211-21815. S a n d e r m a n n J r H, D u n c a n T M, M c I n t y r e J O ,

F l e i s h e r S (1993) W: W atts A (red) New Com prehensive Biochem istry t 25. Protein-L ipid Interactions. Elsevier, Am sterdam . London, New York, Tokyo, str 67-86

16. G l a s e r M (1992) Comm M ol Cell Biophys 8 : 37-5217. T o c a n n e J F (1992) Comm M ol Cell Biophys 8 : 53-7218. T o c a n n e J F , D u p o u - C e z a n n e L, L o p e z A, T o u -

r n i e r J F (1989) F EB S Lett 257: 10-1619. M o u r i t s e n O G, B i 11 o n e n R L (1993) W: W atts A (red)

New Com prehensive Biochemistry t 25. Protein-L ipid In teractions. Elsevier, Am sterdam , London, New York, Tokyo, str1-40

20. V a z W L C , A l m e i d a P F F (1993) Curr Opin Struct Biol 3: 482-488

21. V a n c e DE , V a n c e J (red) (1991) New Com prehensive Biochemistry t 20. Biochemistry of Lipids, L ipoproteins and M em branes. Elsevier, Am sterdam , London, New York, Tokyo, str 596

22. W a t t s A (red) (1993) P rotein-L ipid Interactions. New C om prehensive Biochemistry t 25. Elsevier, Am sterdam , London, New York, T okyo, str 379

23. H o e k s t r a D (red) (1994) C urrent Topics in M em branes t 40. Cell Lipids. Academic Press, San Diego, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo, T oronto , str 638

24. L e e G M , J a c o b s o n K (1994) W: H oekstra D (red) C urren t Topics in M em branes t 40. Cell Lipids. Academic


Press, San Diego, New York, Boston, L ondon, Sydney, Tokyo, 59.T oronto , str 111-142 60.

25. W o l f D E (1994) W: H oekstra D (red) C urren t Topics in M em branes t 40. Cell Lipids. Academic Press, San Diego, New York, Boston, L ondon, Sydney, Tokyo, T oronto , str 143-165

26. D e v a u x P F (1991) Biochemistry 30: 1163-1173 61.27. H a v e r s t i c k D M , G l a s e r M (1987) Proc N atl Acad Sci

USA 84: 4475-4479 62.28. V a n D i j c k P W M , d e K r u i j f f B, V e r k l e i j AJ , V a n 63.

D e e n e n L L M , d e G i e r J (1978) Biochim Biophys Acta 64.512: 84-96 65.

29. F e i g e n s o n G W (1989) Biochemistry 28: 1270-127830. A r t s E G , K u i k e n J , J a g e r S, H o e k s t r a D (1993) Eur 6 6 .

J Biochem 217: 1001-100931. K o z u b e k A, S i k o r s k i FA, S z o p a J (1993) W: Kozu- 67.

bek A (red) M olekularna organizacja kom órki. Skrypt do ćwiczeń t II. W ydawnictw o Uniw ersytetu W rocławskiego, 6 8 .W rocław, str 115

32. P i k u ł a S, E p s t e i n L, M a r t o n o s i A (1994) Biochim 69. Biophys Acta 1196: 1-13

33. V e r k l e i j AJ , Z w a a l R F A , R o e l o f s e n B, C o m - 70. f u r i u s P , K a s t e l i j n D, V a n D e e n e n L L M (1973)Biochim Biophys Acta 323: 178-193 71.

34. R o e l o f s e n B, O p d e n K a m p J A F (1994) W: H oekstraD (red) C urrent Topics in M em branes t 40. Cell Lipids. 72.Academic Press, San Diego, New York, Boston, London,Sydney, Tokyo, T oronto , str 7-46 7 3 .

35. B i e n v e n ü e A, S a i n t e M a r i e J (1994) W: H oekstraD (red) C urrent Topics in M em branes t 40. Cell Lipids. 7 4 .Academic Press, San Diego, New York, Boston, London,Sydney, Tokyo, T oronto , str 319-356 7 5 .

36. O p d e n K a m p J A F , R o e l o f s e n B, W i r t z K W A(red) (1986) Lipids and M em branes. Past, Present and Future. 76.Elsevier Science Publishers BV (Biomedical Division), Am sterdam , Oxford, New York, str 336 77

37. P a p a h a d j o p o u l o s D, N i r S, D i i z g ü n e s N (1990)J Bioenerg Biomemhr 22: 157-179 73

38. Wh i t e J M (1992) Science 258: 917-92339. J a c o b s o n K, P a p a h a d j o p o u l o s D (1975) Biochemis- 7 9 .

try 14: 152-16140. H o e k s t r a D (1982) Biochemistry 21: 2833-284041. M a s s a r i S, C o l o n n a R (1988) Ann 1st Super Sanità 24: 80.

59-7042. B u r g e r K N J , V e r k l e i j A J (1990) Experientia 46: 631-

645 81.43. S e v e r s NJ, R o b e n e k H (1983) Biochim Biophys Acta 737:

373-40844. B l a c k w o o d RA, E r n s t J D (1990) Biochem J 266: 82.

195-20045. B u r g o y n e RD, M o r g a n A (1993) Biochem J 293:

305-316 83.46. A l l a n D, K a 11 e n K - J (1994) Trends Cell Biol 4: 350-35347. R o d g e r s W, G l a s e r M (1993) Biochemistry 32: 12591- 84.

1259848. B a z z i M D , Y o u a k i m MA, N e l s e s t u e n G L (1992) 85.

Biochemistry 31: 1125-113449. Y a n g L, G l a s e r M (1995) Biochemistry 34: 1500-150650. S c o 11 D L, W h i t e S P , O t w i n o w s k i Z, Y u a n W, 8 6 .

G e l b M H, S i g l e r PB (1990) Science 250: 1541-154651. D e n n i s E A (1994) J Biol Chem 269: 13057-13060 87.52. R a m i r e z F, J a i n M K (1991) Proteins 9: 229-23953. W a i t e M (1987) W: H anahan DJ (red) H andbook of Lipid

Research t. 40. Plenum Press, New York, London, str 332 8 8 .54. W a i t e M (1991) W: Vance DE, Vance J (red) New C om p

rehensive Biochemistry t 20. Biochemistry of Lipids, Lipo- 89. p roteins and M em branes. Elsevier, Am sterdam , London, NewYork, Tokyo, str 269-296 90.

55. S c h a l k w i j k C G , M a r k i F, V a n d e n B o s c hH (1990) Biochim Biophys Acta 1044: 139-146 91.

56. B e r g O G, H u BZ, R o g e r s J, J a i n M K (1991) Biochemistry 30: 7283-7297

57. C o u s s e n s L, P a r k e r PJ , R h e e L, Y a n g - F a n g T L, 92.C h e n E, W a t e r f i e l d M D , F r a n k e U, U l l r i c hA (1986) Science 233: 859-866 93.

58. C l a r k J D , L i n LL, K r i z R W, R e m e s h a CS, S u l t z -m a n LA, L i n AY, M i l o n a N, K n o p f J K (1991) Cell 94.65: 1043-1051 95.

M D, N e l s e s t u e n G L (1990) Biochemistry 29:

M D, N e l s e s t u e n G L (1991) Biochemistry 30:

D, N e l s e s t u e n G L (1991) Biochemistry 30:

D, N e l s e s t u e n G L (1992) Biochemistry 31 :

P o l l a r d H B (1994) Biochim Biophys Acta

BA (1994) Annu Rev Biophys

A (1995) Structure 3:

M

M

N i s h i z u k a Y (1988) Nature (Lond) 334: 661-665 V a n c e D E (1991) W: Vance DE, Vance J (red), New C om prehensive Biochemistry t 20. Biochemistry of Lipids, L ipoproteins and M em branes. Elsevier, Am sterdam , London, New York, Tokyo, str 205-240A z z i A, B o s c o b o i n i k D, H e n s e y C (1992) Eur J Biochem 208: 547-557H u g H, S a r r e T F (1993) Biochem J 291: 329-343 D i v e c h e N, I r v i n e R F (1995) Cell 80: 269-270 L e e M H , B e l l R M (1991) Biochemistry 30: 1041-1049 S h i n o m u r a T, A s o a k a Y, O k a M, Y o s h i d a K, N i s h i z u k a Y (1991) Proc N a tl Acad Sci U SA 88:5149-5153 N e w t o n A, K o s h l a n d J r D E (1989) J Biol Chem 264: 14909-14915N e w t o n A, K o s h l a n d J r D E (1990) Biochemistry 29: 6656-6661B a z z i M D , N e l s e s t u e n G L (1988) Biochem Biophys Res Commun 152: 336-343B a z z i M D , N e l s e s t u e n G L (1988) Biochemistry 27: 7589-7593 B a z z i 7624-7630 B a z z i 7970-7977 B a z z i 7961-7969 B a z z i 10406-10413 R a y n a 1 P,1197: 63-93S w a i r j o MA , S e a t o n Biomol Struct 23: 193-213 L i e m a n n S, L e w i t - B e n t l e y233-238H u b e r R , R ö m i s c h J, P â q u e s E P (1990) E M BO J 9: 3867-3874H u b e r R, S c h n e i d e r M, M a y r I, R ö m i s c h J, P â q u e s E P (1990) FEBS Lett 275: 15-21 H u b e r R, B e r e n d e s R, B u r g e r A, L u e c k e H, K a r s h i k o v A (1992) W: M oss SE (red) The Annexins. Portland Press, London, Chapel Hill, str 105-124 H u b e r R, B e r e n d e s R, B u r g e r A, S c h n e i d e r M, K a r s h i k o v A, L u e c k e H, R ö m i s c h J, P â q u e s E P (1992) J M ol Biol 223: 683-704D e m a n g e P, V o g e s D, B e n z J, L i e m a n n S, G o t t i g P, B e r e n d e s R, B u r g e r A, H u b e r R (1994) Trends Biochem Sci 19: 272-276G o o s s e n s E L J , R e u t e l i n g s p e r g e r C H P M . J o n - g s m a F H M , K r a a y e n h o f R, H o r m e n s W T H (1995) FEBS Lett 359: 155-158K a r s h i k o v A, B e r e n d e s R, B u r g e r A, C a v a l i é A, L u x H - D, H u b e r R ( 1991 ) Eur Biophys J 20: 337-344 N e w m a n R, L e o n a r d K, C r u m p t o n M J (1991) FEBS Lett. 279: 21-24N e w m a n R, T u c k e r A, F e r g u s o n C, T s e r n o g l o u D, L e o n a r d K , C r u m p t o n M J (1989) J M ol Biol 206: 213-219R a v a n a t C, T o r b e t J, F r e y s s i n e t J - M (1992) J M ol Biol 226: 1271-1278P i g a u l t C , F o l l e n i u s - W u n d A, S c h m u t z M, F r e y s s i n e t J M , B r i s s o n A (1994) J M ol Biol 236: 199-208L e w i t - B e n t l e y A, M o r e r a S, H u b e r R, B o d o G (1992) Eur J Biochem 210: 73-77L e w i t - B e n t l e y A, B e n t l e y G A , F a v i e r B, L ’ H e r - m i t e G, R e n o u a r d M (1994) F EB S Lett 345: 38-42 S o p k o v a J, G a 11 a y J, V i n c e n t M, P a n c o s k a P. L e w i t - B e n t l e y A (1994) Biochemistry 33: 4490-4499 A n d r e e H A M , S t u a r t M C A , H e r m e n s W T , R e u t e l i n g s p e r g e r C H P M , H e m k e r H C , F r e d e r i c P M , W i l l e m s G M (1992) J Biol Chem 267: 17907-17912 M e e r s P, D a l e k e D, H o n g K, P a p a h a d j o p o u l o s D (1991) Biochemistry 30: 2903-2908S o b o t a A, B a n d o r o w i c z J, J e z i e r s k i A, S i k o r - s k i A F (1993) FEBS Lett MS: 178-182 B u r n P (1988) Trends Biochem Sci 13: 79-83 H e i z m a n n C W (red)(1991) Novel Calcium -B inding Prote-


ins. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo, H ong Kong, Barcelona, Budapest, str 624

96. L u n a E J, H i 11 A L (1992) Science 258: 955-96497. P u m p l i n D W , B l o c h R J (1993) Trends Cell Biol 3:

113-11798. S i k o r s k i A F, B i a ł k o w s k a K, B i s i k i r s k a B, S z o

p a J (1993) Post Biochem 3: 50-5999. S i k o r s k i AF , D i a k o w s k i W, K u c z e k M (1993) Post

Biol Korn 20: 93-110100. I s e n b e r g G (1991) J Muscle Res Cell M otil 12: 136-144101. B a z z i M D , N e l s e s t u e n G L (1987) Biochemistry 26:

115-122.

102. R e i t h m e i e r R A F (1991) W: Vance DE, Vance J (red) New C om prehensive Biochemistry t 20. Biochemistry of Lipids, L ipoproteins and M em branes. Elsevier, Am sterdam , London, New York, Tokyo, str 525-578

103. M a r s h D (1993) W: W atts A (red) New Com prehensive Biochemistry t 25. P rotein-L ipid Interactions. Elsevier, Amsterdam , London, New York, Tokyo, str 41-66

104. S a n k a r a m MB , M a r s h D (1993) W: W atts A (red) New C om prehensive Biochemistry t 25. P rotein-L ipid Interactions. Elsevier, Am sterdam , London, New York, Tokyo, str 127-162

Rola allosterycznej RNazy L w indukowanym przez interferon układzie obronnym komórki

The role of allosteric RNase L in interferon-induced defence system of the cell

ANDRZEJ WIERZBICKI*

Spis treści:

I. WprowadzenieII. Występowanie układu 2-5A/RNaza LIII. Zmiany aktywności RNazy L w czasie wzrostu i róż

nicowania komórkiIV. Budowa RNazy LV. Aktywacja enzymu i budowa Uganda 2-5AVI. Oddziaływania strukturalne aktywator — enzymVII. Swoistość substratowaVIII. Lokalizacja genu RNazy L — RNS4IX. Wykorzystanie RNazy L w diagnostyce medycznej

i leczeniu niektórych schorzeń

Wykaz stosowanych skrótów: 2-5A — oligonukleotyd o budowie p x(A)2'p5'(A)n, gdzie x = 1-^3, n = 2 h- 4; jeżeli w tekście nie jest to osobno zaznaczone, 2-5A oznacza p 3(A)2'p5'(A)2, czyli 5' trifosfo-adenylo-(2'-5')-adenylo-(2'-5')- -adenozynę; AS RNA — antysensowny RNA; 2-5AS — syntetaza 2-5A (ATP: (2'-5')oligo(A) adenylotransferaza, EC 2.7.7.1); cD N A — DNA kom plem entarny do mRNA; dsR N A — dwuniciowy RNA; EBV — wirus E psteina-B arr (Epstein-Barr virus, herpetowirus) HBV — wirus zapalenia w ątroby typu B (hepatitis B-virus); eiF2a — eukariotyczny czynnik inicjacji translacji (podjednostka alfa); EM CV — wirus zapalenia mięśnia sercowego i mózgu (encephalomyocar- ditis virus, pikornawirus); HSV — wirus opryszczki (herpes simplex virus, herpetovirus), HIV — wirus nabytego zespołu niewydolności immunologicznej (human immunodeficiency virus, retrowirus); IFV — wirus grypy (influenza virus, ortom yksow irus), M GV — wirus M engo (mengovirus, p ikornawirus); M H C — główny kom pleks antygenów zgodności tkankow ej (major histocompatibility complex); PK-1 (PKR) — aktyw ow ana przez dsRNA kinaza białkowa fosforylująca podjednostkę a czynnika eIF-2 (2-go eukariotycznego czyn-

*M gr, K atedra i Zakład Chemii Fizjologicznej, A.M. im. K aro la M arcinkowskiego, ul. Święcickiego 6,60-781 Poznań

Contents:

I. IntroductionII. Distribution of the 2-5A/RNase L systemIII. Changes in activity of the 2-5A system during cell

growth and differentiationIV. Structure of RNase LV. Activation of the enzyme and structure of the ligandVI. Structural interactions between the enzyme and the

activatorVII. Substrate specifityVIII. Localization of the RNase L geneIX. Medical correlations

nika inicjującego translację); RN aza L (= RN aza F, D R N a- za) — nukleaza hydrolizująca jednoniciowy RNA aktyw owana przez oligonukleotyd 2-5A [EC 3.1.27]; RNS4 — ludzki gen kodujący 2-5A zależną RNazę L; SFV — wirus lasu Semliki (Semliki Forest virus): VSV — wirus pęcherzykowate- go zapalenia jam y ustnej (vesicular stomatitis virus).

I. Wprowadzenie

Interferony indukują działanie układu obronnego kręgowców przed wirusami, bakteriam i, pasożytami i niektórym i nowotw oram i [1-3]. Działanie interferonów wywołuje w m etabolizm ie kom órki docelowej szereg zmian, polegających na rozpoczęciu lub wzmożeniu syntezy wielu różnych białek (do tej pory wykryto ich ponad 30 — roli części z nich jeszcze nie znamy) (Ryc. 1) [1-4]. Interferon pobudza w ewnątrzkom órkow y układ obronny indukując lub zwiększając syntezę jego części składowych: (1) syntetazy oligo- (2-5A) i RNazy L; (2) kinazy białkowej P I; (3) białek


INTERFERON

■^►(GŁÓWNY KOMPLEKS T ^ ANTYGENÓW ZGODNOŚCI

TKANKOWEJ)inne ^białką

NIEAKTYWNA SYNTETAZA OLIGO 2‘-5'A

INDUKCJA SYNTEZY ( SYNTETAZY

NIEAKTYWNA KINAZA BIAŁKOWA P1

DWUNICIOWY RNAAKTYWNA

SYNTETAZA OLIGO 2,-5,AAKTYWNA KINAZA

BIAŁKOWA P1 BiałkaMx

AKTYWNY CZYNNIK INICJUJĄCY elF-2 NIEAKTYWNY

(UFOSFORYLOWANY) CZYNNIK

INICJUJĄCY elF-2

nATP

NIEAKTYWNA AKTYWNA RNazą L .. RNaza L J B9

ZABLOKOWANIETRANSLACJIHYDROLIZA:

rRNA mRNA

WIRUSOWEGO RNA KOMORKARyc. 1 Miejsce RNazy L w układzie obronnym kom órki (zakreślone linią przerywaną).

Interferon powoduje indukcję lub zwiększenie syntezy szeregu białek: (1) syntetazy oligonukleotydów 2'-5'A, (2) kinazy białkowej P I, (3) białek Mx, (4) głównego kom pleksu antygenów zgodności tkankow ej (M HC), (5) czynników IRF, (6 ) innych białek; roli części z nich dotychczas nie znamy. (1) i (2) do swej aktyw ności w ym agają obecności aktyw ującego je dwuniciowego RNA. W ynikiem działania interferonu jest zaham ow anie nam nażania wirusa bądź podziałów kom órki.

Mx; (4) głównego kom pleksu antygenów zgodności tkankowej (MHC); (5) czynników transkrypcyjnych interferonów (IRF); (6) białek innych niż w/w; funkcji niektórych z nich dotychczas bliżej nie określono [3]. Ponieważ, wymienione wyżej jako (1 )-(6), części wew nątrzkom órkow ego układu obronnego działają w ra m ach kom órki jako odrębne całości, dlatego nazywane są układam i, np. syntetaza 2-5A w ytwarzająca oligo 2'-5'A i zależna od niej RN aza L są określane jako układ 2-5A/RNaza L (ang. system 2-5A lub system 2-5A/RNaza L), dalej: układ 2-5A. Części w ew nątrzkom órkowego układu obronnego (l)-(6) uzupełniają wzajemnie swoje działania, przy czym każda z nich przypuszczalnie zwalcza inne wirusy. U kład 2- 5A /RN aza L: (1) ham uje (i) nam nażanie M G V i EM CV (pikornawirusy); (ii) wirusa ospy bydlęcej (poxowirus) [2,5-8] i HIV (retrowirus) [3a, 9, 9a]; (iii) w ograniczonym stopniu opryszczki (HSV, herpetowirus) i pęche- rzykowatego zapalenia jam y ustnej (VSV, rabdow irus)

[6-8, 10]; (2) bierze udział w degradacji mRNA, rRNA oraz kontroli wzrostu i różnicowania kom órek [1-3,11-13]; (3) odgrywa rolę w zwalczaniu nowotworów [14, 15]. Ludzkie białko MxA ham uje nam nażanie w irusa grypy (IFV; ortom yksowirus) [12] i VSV, nie działa natom iast na pikornaw irusy (M GV i EM CV) i wirusa lasu Semliki (SFV). U myszy białko M xl wykazuje wybiórcze działanie przeciw IFV [2].

K inaza białkowa PI występuje w niewielkich ilościach w kom órkach nie poddanych działaniu interferonu. Jego działanie wywołuje znaczny przyrost ilości tego enzymu. W irusowy dwuniciowy RNA aktywuje kinazę P I, w wyniku czego najpierw ulega ona autofosforylacji, a następnie fosforyluje podjednostkę elF-2a unieczynniając ją i ham ując w ten sposób syntezę białka w komórce. W taki sposób ham ow ane jest nam nażanie VSV [16], pikornaw irusów (np. Men- go), reowirusów i adenowirusów. Substancje ham ujące aktywność kinazy P I wytwarzane są przez wirusy IFV,


polio, HIV, ospy i adenowirusy [2, 9a]. M echanizm u ham ow ania replikacji wirusów SV40, HBV (hepatitis type— B virus) i HSV (herpes simplex virus) nadal nie znamy [2].

Dwuniciowy R N A — jeden z produktów pośrednich replikacji RNA wirusów aktywuje indukow ane przez interferon syntetazy oligonukleotydów 2-5A (Ryc. 1). W ystępują one w kom órce w postaci kilku (do 4) izoenzymów, o masie cząsteczkowej (M w) 40 do 100 kD a [3, 3a, 6, 11, 17-20]. Syntetyzowane przez syntetazy oligonukleotydy 2-5A już w stężeniach nano- molowych aktyw ują nieaktywną RNazę L (m.in. [2, 3, 13,21,22]). W kom órkach HeLa poddanych działaniu interferonu i zakażonych wirusem EM CV stwierdzono obecność dwuniciowego RNA tego wirusa związanego z syntetazą 2-5A [21]. Podanie interferonu powoduje w kom órkach mysich linii L929 ok. 3-krotny wzrost ilości RNazy L i kodującego ją mRNA, z m aksymalnym efektem po ok. 14 godzinach [24], W przypadku kom órek niepoddanych działaniu interferonu i zakażonych EM CV zaktyw owana przez dwuniciowy RNA wirusa syntetaza wytwarza zwiększone ilości 2-5A, jednak ham ow ana przez wirusa RNaza L pozostaje nieaktyw na [23]. Ciągła ekspresja kodowanej przez cD N A 2-5A syntetazy ham uje replikację pikornaw irusów i nam nażanie się kom órek [21]. Ekspresja nieaktywnej formy RNazy L, wiążącej 2-5A w mysich kom órkach linii SVT2 powoduje, że podanie in terferonów a i ß nie chroni kom órek przed zakażeniem wirusem EM CV. Produkow ana w dużych ilościach uszkodzona, lecz nadal wiążąca 2-5A forma enzymu wychwytuje specyficznie swój norm alnie aktywujący ją ligand nie dopuszczając do pełnej aktywacji układu 2-5A [16].

II. Występowanie układu 2-5A/RNaza L

U kład 2-5A/RNaza L występuje u gadów, ptaków i ssaków [1, 2, 4, 13, 24-26]. Jego obecności nie stw ierdzono u ryb, owadów i roślin [25, 27]. RNaza L występuje w niewielkich ilościach (ok. 0,44 mg/kg w w ątrobie myszy [18], w nieco większych ilościach w śledzionie — 3,7 mg/kg białka [28]) w kom órkach większości tkanek jako enzym konstytutyw ny [2 ,9 ,16 , 18, 29-31], W większych ilościach RNaza L występuje w trofoblastach łożyska, gdzie stanowi składnik bariery ochronnej pomiędzy organizmem m atki i płodu[32]. Aktywność układu 2-5A/RNaza L zmienia się z wiekiem: w w ątrobie starych szczurów aktywność RNazy L jest 5-6 krotnie niższa niż w w ątrobie zwierząt dorosłych, choć ilość enzymu zmienia się tylko nieznacznie. Również aktywność syntetazy 2-5A zmienia się w czasie życia: silnie wzrasta po urodzeniu, osiąga m aksim um u osobników młodych i w wieku średnim, a później spada. N atom iast aktywność 2'-3' egzonukleazy hydrolizującej 2-5A [EC 3.1.13.4] i hamującej w ten sposób układ 2-5 A w zrasta w ciągu życia (ok. 3-krotnie) [33, 33a].

III. Zmiany aktywności RNazy L w czasie wzrostu i różnicowania komórki

W kom órkach niektórych typów ilość RNazy L podlega niewielkim w ahaniom (zmienia się do 2 razy w czasie cyklu kom órkowego) [34]; w innych zmienia się podczas wzrostu i różnicowania: jest najniższa (lub prawie niewykrywalna) w kom órkach różnicujących się, a najwyższa w kom órkach zróżnicowanych (kom órki linii now otw orow ych PC 13, F9 i L myszy, zróżnicowanie wywołane zostało kwasem retinojo- wym) [9, 34, 35]. Równoczesne podanie interferonu i aktynom ycyny D nie powoduje wzrostu ilości RNazy L, co sugeruje udział transkrypcji w procesie wzrostu aktywności tej nukleazy w kom órce [34].

R N aza L występuje zarów no w cytoplazmie (ok. 80% [30], 55% [9] całkowitej ilości enzymu), jak i w jądrze kom órkow ym (zarówno związana z m atriks jądrow ą, jak i wolna) [5, 9, 33]. W cytosolu rosnących kom órek białaczki limfatycznej (CEM i Jurkat) ilość RNazy jest stała, a w ich jądrze kom órkowym zmienna. Enzym w cytoplazmie występuje w postaci wolnej, a w jądrze 75% enzymu jest związane z oligo 2-5A. W jądrze kom órkow ym enzym występuje jako związany z m atriks jądrow ą (70%) oraz wolny. Po zakażeniu wirusem HIV-1 ludzkich kom órek T linii H9 wzrost aktywności enzymu w jądrze tłumaczony jest związaniem enzymu przez m atriks [9], Znajdujące się na terenie jądra , zawierające sekwencję TAR mRNA wirusa HIV aktyw ują syntetazę 2-5A, a równocześnie oddziałują z białkiem T at ham ującym tę aktywację i łączącym wirusowe mRNA z m atriks jądrow ą [3a, 9a,36]. O graniczona proteoliza wskazuje na odm ienność formy jądrow ej i cytosolowej (powstają różniące się elektroforetycznie fragmenty) [30]. Stwierdzono odmienne wzorce traw ienia rRNA przez enzymy z retiku- locytów królika i mysich kom órek L [37]. W różnych tkankach tego samego organizm u mogą występować izoenzymy RNazy L, różniące się swoistością substratow ą i budow ą aktywującego je oligo 2-5A (patrz — podrozdział VI) [31].

IV. Budowa RN azy L

Z arów no ludzka, jak i mysia RNaza L składa się z ok. 740 am inokw asów i ma masę cząsteczkową ok. M w = 80 kD a [13, 16, 18, 24]. Analiza sekwencji am inokwasowej (na podstawie sekwencji z baz danych i inform acji dotyczących struktury przestrzennej) pozwoliła wyodrębnić: (1) część o sekwencji podobnej do RNazy E z £ . coli (nukleazy związanej z metabolizmem m RNA i rRNA), (2) region bogaty w cysteinę, (3) 9 sekwencji ankiryno-podobnych, (4) domenę C-koń- cową o aktywności RNazy [16, 24, 26, 38], (5) domenę o budowie kinazy białkowej (wiążąca ATP) [24, 38] (Ryc. 2 i 5). Dom enę odpowiedzialną za aktywność rybonukleolityczną RNazy L tworzy ok. 130 C-koń- cowych am inokwasów . Region bogaty w Cys może być


la - homologla z RNazą E

Ib - wiązanie 2-5A- Cys I - homologia

z P-kinazą

IV - aktywność rybonukleolltyczna

h2n COOH

I - sekwencje typu anklryny --------

I I I100 200 300 400 500

I I600 700Numery aminokwasów

Ryc. 2 Schemat budowy łańcucha białkowego RNazy L. Zaznaczono części sekwencji o znanej bądź przewidywanej funkcji: I — hom ologiczna do sekwencji ankiryny (9 powtórzeń); la — hom ologiczna do RNazy E z £ . colr, Ib — wiążąca oligo 2'-5'A (aktyw ator RNazy L); II — bogata w cysteinę; III — hom ologiczna z kinazam i białkowymi; IV — C -końcow a o aktyw ności rybonukleolityczncj.

odpowiedzialny za dimeryzację enzymu, lub tworzyć palce cynkowe biorące udział w przyłączaniu substratu [24]. D om ena ankiryny to 320 am inokwasów N- końcowych. Tworzy ją 9 pow tórzeń sekwencji „an- k irynopodobnych”, wykazujących ok. 35% identyczności am inokwasów z sekwencją ankiryny z erytrocytów [38]. Sekwencje „ankirynopodobne” RNazy L są praw dopodobnie odpowiedzialne za oddziaływ ania z innymi białkami (wiele białek regulujących cykl kom órkow y i różnicowanie się kom órek posiada sekwencje tego typu) [16]. W 7 i 8 powtórzeniu ankiryny występuje sekwencja: glicyna-lizyna (w poz. 240 i 274) — treonina poprzedzone sekwencją bogatą w glicynę (Ryc. 5). Ta sekwencja am inokw asow a określana jako

pętla P (wiążąca fosforan) jest znana jako wiążącą nukleotydy adeninowe i guaninowe w wielu białkach. W RNazie L obie pętle P (aminokwasy 229-241 i 253-275) wiążą aktywujące ten enzym oligo 2-5A [16, 24, 26], Ekspresja zm odyfikowanego genu kodującego RNazę L, z którego usunięto 7 i 8 powtórzenie ankiryny, daje w efekcie enzym niezdolny do wiązania 2-5A [24]. Za obszarem ankirynopodobnym znajduje się region o sekwencji wykazującej hom ologię z sekwencją kinaz białkowych. Zachow ane są w nim wszystkie (jedenaście) obszary charakterystyczne dla kinaz białkowych; najbardziej podobna jest drożdżowa kinaza KIN82 [38]. W nieaktywnej formie enzymu występują przypuszczalnie oddziaływ ania pomiędzy

Region homologii z RNazą E

Region bogaty w cysteinę

Region wiązania 2-5A

Ryc. 5 Schemat budowy cząsteczki RNazy L. Zaznaczono regiony: I — sekwencji typu ankiryny (9 powtórzeń), obejm ujący obszary: la — hom ologii z RN azą E, Ib — wiązania oligo 2-5A; II — bogaty w cysteinę, praw dopodobnie odpow iedzialny za dimeryzację; III — hom ologiczny z kinazą P, wiążący ATP; IV — katalityczny, zaw arty pomiędzy C-końcem a regionem I.

Powtórzenia sekwencji typu ankiryny

i i iRegion

homologii z kinazą P


[2^5ABPlJednoniciowy RNA

5 “^ UpNpX

RN ABP

3'AKTYWNY NUKLEOLITYCZNIE DIMER

Ryc. 3 Proponow any schem at działania RNazy L jak o heterodim eru podjednostek (i) RNA BP — katalitycznej, hydrolizującej RNA i (ii)2-5 A BP — regulatorow ej, aktyw owanej przez 2-5 A (wg [13, 28], zmodyf.). H eterodim er przyłącza jednoniciow y RNA do podjednostki RNA BP i hydrolizuje go po przyłączeniu oligo 2-5A do podjednostki 2-5A BP. Hydroliza RNA następuje swoiście po stronie 3' sekwencji UA lub U U (N = U lub A, X = dow olna zasada). Oligo 2-5A są hydrolizow ane przez 2' fosfodiesterazę i 5' nukleotydazę.

dom eną ankiryny i wykazującym (po aktywacji) ak tywność rybonukleolityczną C-końcem: związanie 2- 5A powoduje zmiany konformacyjne uzew nętrzniające się aktywnością enzymatyczną [16, 22].

W edług [13, 28] aktywny enzym z kom órek HeLa (Ryc. 3) składa się z dwóch podjednostek o masie cząsteczkowej ok. 80 kD a każda: (1) katalitycznej, wiążącej i hydrolizującej RNA (RNA BP — RNA Binding Protein) i (2) regulatorowej (2-5A BP — 2-5A Binding Protein), wiążącej specyficznie pppA(2'p5'A)n. In vivo hydrolizę RNA przeprow adza tylko aktyw ow any dim er 2-5ABP RNA-BP, związany z pppA(2'p5'A)n; in vitro właściwość hydrolizow ania RNA wykazuje oczyszczona podjednostka RNA-BP, nie podlega ona jednak regulacji przez 2-5A [13, 28]. Oczyszczona podjednostka 2-5A BP nie hydrolizuje RNA naw et po dodaniu 2-5A. RNaza L w formie natywnej m a masę cząsteczkową 185.000 [22], 160 kD a [13,28], lub 78-80 kD a [24]. N atom iast wg [26] RNaza L jest m onomerem o wszystkich właściwościach charakterystycznych dla tego enzymu. N a przykład ekspresja ludzkiego genu RNazy L w kom órkach owadzich (norm alnie nie posiadających tego enzymu) dała w efekcie enzym o pełnych właściwościach katalitycznych i regu

lacyjnych. Rozbieżności, czy RNaza L w formie natyw nej jest mono-, czy też dimerem m ożna by wyjaśnić dim eryzacją cząsteczek enzymu w w arunkach natyw- nych (np. oddziaływaniem regionów bogatych w cysteinę).

V. Aktywacja enzymu i budowa liganda 2-5A

In vivo RNaza L jest aktyw ow ana przez oligonukleotydy o budowie px(2'p5') (A)n, gdzie x = 1h-3, n = 3+15 (Ryc. 4), w stężeniu rzędu nanom oli [m.in. 7, 25, 27, 29, 39]. Aktywacja RNazy L przez 2-5A jest odwracalna: oddysocjowanie związanego liganda powoduje zanik aktywności, a jego ponowne przyłączenie aktywuje enzym [2, 13, 22, 40, 41]. Ilość enzymu mierzy się najczęściej określając stopień wiązania znakowanego izotopow o oligonukletydu 2-5A. M etoda ta oczywiście nie wykrywa cząsteczek enzymu już związanych z oligonukleotydem . W celu określenia całkowitej ilości enzymu stosuje się procedurę denaturacji i renaturacji [24, 30]. O ligonukleotyd ppp(2'-5'A)3 wiąże się z enzymem w pojedynczym miejscu wiązania specyficznie i b. silnie z K H rzędu 10“ 11 M [18, 28],


Ryc. 4 Schemat struk tury aktyw atorów RNazy L — oligonu- kleotydów o budowie typu p x(A)2'p5'(A)n, gdzie n ^ 3; x = reszty kwasu fosforowego 1 -r- 3; charakterystyczne są nietypowe wiązania 2'-5'. (A)1-(A)3: adeniny kolejne od 5' końca. Zaznaczono obszary decydująe o (i) w iązaniu z RNa- zą L (zacienione) i (ii) aktyw acji RNazy L (obwiedzione linią przerywaną). G ru p a 3 'O H przy A(2) wpływa zarów no na wiązanie, jak i na aktywację.

S truktura 2-5A przedstaw iona jest na rycinie 4 (m.in.: [11 ,27 ,39 ,42 ,43]). O ligonukletydy ppp(2'p5') (A)n składające się z więcej niż 3 nukleotydów adenino- wych są lepszymi aktyw atoram i RNazy L niż 2-5A3 chociaż ulegają wielokrotnie szybszemu rozkładowi przez nukleazy [44]. Ludzka R N aza L aktyw ow ana jest przez oligonukleotydy 2-5A posiadające przynajmniej 1 resztę fosforanową na końcu 5' [20, 42], a mysia wymaga obecności na 5' końcu trifosforanu[42]. R N aza L nie jest aktyw ow ana ani przez dimery, ani przez nieufosforylowane na końcu 5' trim ery 2-5A (tzw. „rdzeń”) [18], lub aktyw acja jest stukrotnie mniejsza niż trim erów ufosforylowanych na końcu 5'[26]. Retikulocyty królika zawierają izoenzym RNazy L wymagający do aktywacji tetram eru 2-5A [31,37,45], a jego nerki izoenzym aktywowany przez trim er [31].

Półokres trw ania oligonukleotydów ppp2-5An wynosi ok. 50 min [2]. Są one rozkładane przez: (1) 2'-5' fosfodiesterazę do A TP i 5'AM P; (2) 5' nukleotydazę do nieaktywnego „rdzenia” 2-5A3, (3) niespecyficzne fosfatazy. Fosfodiesteraza hydrolizująca preferencyjnie od końca 2' w iązania fosfodiestrowe 2'-5' to enzym konstytutywny; interferon powoduje 4-5 krotny wzrost aktywności tej hydrolazy [33, 41]. Jej aktyw ność w zrasta z wiekiem, obniżając spraw ność systemu2-5A [33, 33a]. Oprócz hydrolizy 2-5A enzym ten hydrolizuje również koniec -CCA w tRNA, blokując w ten sposób translację. Proces ten jest odwracalny w wyniku działania nukleotydylotransferazy tRNA [41]. Ponieważ RNaza L jest aktyw ow ana tylko w obecności 2-5A, jej aktywność jest ograniczona do przedziału kom órki w którym pow stał 2-5A. Działanie enzymów hydrolizujących 2-5A może zabezpieczyć własny RNA kom órki przed całkow itą degradacją, ograniczając hydrolizę RNA do miejsc występowania dwuniciowego RNA aktywującego syntetazę 2-5A. O ligonukleotydy typu ppp2-5A z pow odu dużego ujemnego ładunku nie przechodzą przez błony kom ór

kowe i są szybko hydrolizowane. D latego w celach badawczych i docelow o leczniczych syntetyzow ane są różne ich pochodne i analogi, m.in. 2 '-0-fosfoglicerylo- we pochodne 2-5A oporne na hydrolizę przez 2'- fosfodiesterazę [18, 20, 43, 46-51]. O pracow yw ane są różne sposoby dostarczania ich do kom órek: (1) przez koprecypitację z C a 2 + , (2) m ikroiniekcję [8, 46], (3) dostarczenie analogów 2-5A za pom ocą liposom ów z białkiem A do kom órek rozpoznanych przez przeciwciała przeciwko M H C [46], (4) w postaci koniugatu z poli(l-lizyną) ułatw ione działaniem lizolecytyny (ułatwiającej przenikanie przez błonę kom órkow ą). Zw iązek powstały ze sprzężenia 2-5A z poli(l-lizyną) bardzo dobrze wiąże się z R N azą L i aktyw uje ją, jest też odporny na działanie 2'-fosfodiesterazy [2, 10]. T rim ery o budowie typu 2'-5'A w których zam iast adeniny występuje cytozyna, uracyl lub inozyna bardzo słabo wiążą się z R N azą L (np. pppl(2'-5'A)2 — ok. 10 razy słabiej [26]). Pochodne 2-5A podstaw ione w pozycji 8 pierścienia purynowego: brom owe, hydroksypropy- loadenozynowe i -O H wiążą się do RNazy L z K m rzędu 10” 9 M [50], a pochodne 8-SH znacznie słabiej — z K m = 1*10~6 M. W w arunkach doświadczenia półokres trw ania 2-5A wynosi ok. 50-60 min., n a to m iast jego syntetyczne pochodne są znacznie trwalsze, np. 8-OH pochodne podstaw ione w pozycji 8 pierścienia purynowego po 3 godz. inkubacji są rozkładane tylko w 8-10% [48]. D uża aktyw ność biologiczna i trwałość tych 2-5A analogów powoduje, że są one badane jako ew entualne środki przeciwwirusowe i przeciwnowotworowe.

VI. Oddziaływania strukturalne aktywator — enzym

W strukturze 2-5A grupa am inow a i azot 1 (N I) pierwszej adeniny (A(l), (Ryc. 4) decydują o wiązaniu z RNazą L (np. pppl(2'p5'A)2 — czyli analog 2-5A bez grupy aminowej wiąże się z enzymem 10 razy słabiej;1 = inozyna). Brak grup am inowych przy adeninie2 i 3 (czyli A(2) i A (3)) tylko nieznacznie zmniejsza wiązanie ligandu. Brak grupy am inowej w A(3) pow oduje zmniejszenie aktywacji RNazy L o ok. 104 razy [42, 47]. Analogi zbudow ane z 7-deazaadenozyny (tuberycydyny) wiązały się z enzymem z mysich kom órek L równie silnie jak 2-5A, lecz nie aktyw ow ały go, natom iast enzym z retikulocytów kró lika wiązał tetra- m er tuberycydyny (ppp5'(c7A)4) i był przez niego aktywowany. Trim ery i tetram ery zbudow ane z tuberycydyny są antagonistam i 2-5A w aktywacji RN azy L w ekstraktach kom órkow ych mysich kom órek L: azot 7 nie jest konieczny do w iązania z enzymem, lecz jest niezbędny do jego aktywacji [52]. Podstaw ienie w 2-5A w miejsce pierwszej lub drugiej adenozyny od końca 5 'jej pochodnej brom ow anej w poz. 8 (= B r8A) powoduje gwałtowny spadek zdolności w iązania się ligandu z enzymem. Podstaw ienie Br8 A na końcu 2' nie zmienia wiązania, natom iast 10 krotnie w zrasta zdol


ność ham ow ania translacji (przy niezmienionym pół- okresie trw ania) [50],

Bardzo duży wpływ na wiązanie 2-5A i aktywację RNazy L z mysich kom órek L m a także grupa 3'-OH przy resztach rybozy oligonukleotydu 2-5A: jej brak przy 5' końcow ej adenozynie (A(l), Ryc. 4) powoduje3-krotne osłabienie aktywacji, lecz nie zmienia w iązania tego liganda do R N azy L. Brak 3'-OH przy środkowej rybozie pow oduje ok. 8-krotne osłabienie wiązania i praw ie 1000-krotne osłabienie aktywacji, natom iast b rak grupy 3 '-O H przy rybozie 2' końcowej adenozyny pow oduje znaczny wzrost zarów no w iązania, jak i aktyw acji [53]. W edług [44] obecność grup 3 '-O H nie jest niezbędna do aktywacji RNazy L; tetram ery zsyntetyzow ane z kordycepiny (3'dA analogi 2-5A) w ykazują bowiem zwiększoną aktywność w h am ow aniu translacji i zw iększoną oporność na traw ienie przez nukleazy. Poniew aż w arunkiem podatności 2-5A na hydrolizę przez 2'-5' fosfodiesterazę jest obecność wolnych końcow ych grup 2' i/lub 3' i 3 '-OH drugiej rybozy, dlatego badane są również fluorowe pochodne 2-5A (podstaw ione w miejscu tych grup -OH ) [47].

Analogi 2-5A zbudow ane z nukleozydów kordycepiny 2-5(3'dA)3 („rdzeń”) połączonych tiofosforanem, niezależnie od chiralności położenia atom u siarki (Rp lub Sp) wiążą się z R N azą L z mysich kom órek linii L 929, lecz jej nie aktywują. Analogi 2-5A3 połączone tiofosforanem wiążą się z nukleazą i aktyw ują ją podobnie jak monofosforany 2-5p(3'dA)3 RpRp i SpRp; podczas gdy 2-5p(3'dA)3 RpSp i SpSp nie wiążą się i nie aktyw ują enzym u [49]. Podobnie nie aktywow ał go (5'p)2-5p(A)4 — tetram er pSpSpSp [39].

W lecznictwie duże nadzieje wiąże się z (3'dA) analogam i 2-5A z uwagi na ich rów noczesną zdolność do ham ow ania aktywności odw rotnej transkryptazy w irusa HIV-1, aktyw ację RNazy L i większą od p o rność na hydrolizę [51].

VII. Swoistość substratowa

M ysia i ludzka R N aza L hydrolizują jednoniciowy RNA (m RNA, rRNA , RNA wirusowy) po stronie 3' sekwencji U U i UA (m.in. [24,26,29]), a ludzka RN aza L również po stronie 3' reszt adenylowych nie poprzedzonych przez U [26]. Aktywacja enzymu zarów no trim erem , jak te tra i pentam erem 2-5A [26] wywołuje hydrolizę poli(rU) i poli(rA) na fragm enty o określonej długości (discrete), np. poli(rU) na odcinki o długości 5, 7, 8, 12, 16 i 22 zasad, a poli(rA) przy 10-100 krotnie wyższym stężeniu 2-5A na odcinki długości 13, 21 i 22 zasad. R N aza L nie hydrolizuje poli(rG), poli(dA), poli(dT) [26] i poli(C) [24]. D o swojej pełnej aktyw ności enzym ten w ym aga równoczesnej obecności ATP i jonów M g2 + lub M n 2 + , a także C a2+ [26, 40]. W obecności 100 nM 2-5A następuje hydroliza poli(rU) naw et przy całkow itym b raku jonów dwuwar- tościowych i ATP, przy czym A T P wydaje się pełnić

rolę wyłącznie strukturalną. Jony cynku ham ują ak tywność rybonukleolityczną nawet w obecności ATP, równocześnie bardzo silnie zwiększając wiązanie się 2-5A z enzymem (zestawienie funkcjonalnych obszarów enzymu przedstawione jest na rycinie 5) [26].

rRN A całych rybosom ów jest traw iony przez RNazę L specyficznie na fragmenty o stałej długości, które po elektroforezie dają ściśle określony wzór (podobnie jak poli (rU) i poli(rA) [26]) [16, 24, 29, 34, 37, 39, 52, 54]. W tych samych w arunkach produkty działania rybo- nukleazy T l i RNazy trzustkowej były inne. Produkty traw ienia nie odzwierciedlają wyłącznie obecności miejsc odsłoniętych i eksponowanych [37]: hydrolizowane są tylko niektóre miejsca o preferowanej sekwencji [29]. Poza tym R N aza L wiąże się w ybiórczo z polisom am i [2, 13].

W wyciągach z kom órek H eLa poddanych działaniu interferonu R N aza L preferencyjnie hydrolizuje jednoniciowy RNA połączony kowalencyjnie z dwunicio- wym RNA. Przypuszczalnym powodem tego jest sąsiedztwo miejsca aktywacji (dsRNA aktywuje syntetazę 2-5A) i miejsca znajdow ania się substratu (czyli jedno- niciowego RNA). W kom órce R N aza L może być aktywow ana i działać głównie w miejscu występowania wirusowego dwuniciowego RNA, będącego produktem pośrednim replikacji w irusa (por. rozdz. V) [40]. To zjawisko może być odpowiedzialne za ham owanie przez układ 2-5A nam nażania tylko niektórych wirusów. W ynika to być może z różnic w ich cyklach życiowych i wiąże się z różną lokalizacją kom órkow ą poszczególnych etapów ich nam nażania. Tak np. dsRNA powstający podczas nam nażania wirusa SV40 występuje głównie w jądrze kom órkow ym , VSV występuje w cytoplazmie w powiązaniu z układem m ikrotubul kom órki, a dsRNA pikornaw irusów (np. EM CV i polio) w powiązaniu z gładkim retikulum endoplaz- m atycznym [2, 55].

VIII. Lokalizacja genu RNazy L — RNS4

Ludzki gen kodujący RNazę L (RNS4) zlokalizow ano za pom ocą m etody hybrydyzacji i fluorescencji in situ (FISH) w chrom osom ie 1 (lq32). W ystępowanie aberracji w regionie lq związane jest z częstymi przypadkam i now otw orów u ludzi, np.: rak żołądka (gastric adenocarcinoma), rak jam y ustnej (oral squamous cell carcinomas) i rak sutka (breast carcinomas). To pozw ala wnioskować, że RNS4 jest być może genem supresorowym now otw orów [14].

IX. Wykorzystanie RN azy L w diagnostyce medycznej i leczeniu niektórych schorzeń

W irusy atakując organizm y wyższe potrafią zablokować skierowane przeciwko nim działanie układu 2-5A. W irus EM CV po zakażeniu kom órki ham uje RNazę L, przed czym m ożna zabezpieczyć kom órki zapobiegawczo podając interferon [3, 23]. W hodowli


ludzkich kom órek C hang wirus HSV tworzy kom - petycyjne inhibitory RNazy L (pochodne 2-5An o s tru kturze na razie bliżej nieokreślonej), ham ujące jej aktywację przez 2-5A [7]. W m ałpich kom órkach CV-1 zakażonych wirusem SV-40 występują inhibitory RNazy L o budowie oligonukleotydów 2-5A [55], podobnie w kom órkach HeLa zakażonych EM CV [23] i HIV [56].

m RNA wirusa HIV-1 zawierają po stronie 5' sekwencję TAR tworzącą dwuniciową strukturę typu „hairpin”. M oże ona aktywow ać w ew nątrzkom órkowe enzymy uaktyw niane przez dsRNA, jednak efekt ten jest znoszony przez wirusowe białko TAT wiążące się z sekwencją TAR i osłaniające ją przed rozpoznaniem [3a, 9a, 5, 32, 57-59]. W limfocytach osób chorych na AIDS stwierdzono zwiększone stężenie 2-5A; pom im o tego R N aza L z tych kom órek była nieaktywna. Ponieważ w badaniach in vitro wykazano, że podanie 2-5A w stężeniu 10-8 M nie wywołało aktywacji RNazy L, może to wskazywać, że w zainfekowanych kom órkach występuje inhibitor (o niezidentyfikowanej strukturze) tej nukleazy. Podanie Am- pligenu („niedopasowanego” dsRNA (rl13 :rC 12CJ1)n, n = 20-^30) przejściowo odtw arza jej aktywność i zmniejsza ilość wykrywanego RNA wirusa oraz polepsza stan zdrowia pacjentów [56]. Podobnie zastosowanie AZT (3'-azydo 3'-deoksytymidyny) wydłuża czas aktywności tej nukleazy [9]. Aktywność RNazy L (mierzona zdolnością do traw ienia trans- kryptów HIV) po zakażeniu HIV kom órek linii H9 rosła do 3 dnia po infekcji, a następnie wracała do poziom u wyjściowego; równocześnie kom órki w ydalały wirusy HIV. Piątego dnia po infekcji RNaza L była już nieaktyw na i nie daw ało się już stwierdzić charak terystycznych dla jej działania produktów traw ienia transkryptów wirusa HIV [9].

Planując wykorzystanie układu 2-5A w zwalczaniu zakażenia wirusem HIV proponuje się m.in.: (1) w'y- twarzanie i podaw anie analogów 2-5A (por. — punkt IV — Aktywacja i budow a liganda); (2a) immunizację w ewnątrzkom órkow ą (intracellular immunization) — np. przez wprowadzenie do komórki hybrydowego genu ludzkiej 2-5A syntetazy pod kontrolą HIV 3' LTR — rycina 6 [5, 59, 60], (2b) wprowadzenie genu a 2- interferonu (również pod kontrolą HIV-1 3' LTR) [61].

N iektóre wirusy ham ują aktywację układu o b ronnego gospodarza poprzez wytwarzanie białek ham ujących ekspresję wielu genów indukow anych przez in terferon [62, 63]. N a przykład HBV (hepatitis B-virus) ham uje indukcję syntetazy 2-5A i kinazy PI [64]. W irus ospy ham uje równocześnie układ 2-5A i kinazy P I, produkując białka będące inhibitoram i kinazy PI i indukując fosfatazę hydrolizującą 2-5A [2]. W spom niany już Ampligen wykazuje silne działanie przeciwwirusowe i osłaniające kom órki. W zainfekowanych wirusem HIV-1 limfocytach T CEM i T H9 (human T-lymphoblastoid C E M cells and human T-cell line H9) kom órki bez dodatku Ampligenu zaczynają

wydalać wirusy 3 dni po infekcji, a po trak tow ane nim po 5-6 dniach. Ampligen wiąże się z syntetazą 2-5A aktywując ją i pow odując syntezę dłuższych ( ^ 3 ) oligomerów 2-5A, będących lepszymi (niż trimery) aktyw atoram i RNazy L [57].

Tak zwany zespół przewlekłego znużenia (CSF — Chronic Fatigue Syndrome), to schorzenie tow arzyszące zakażeniu różnymi wirusami (HH V-6 human herpeswirus-6, wirus Epstein-Barr). U chorych stwierdzono zwiększone: (1) aktywność RN azy L (2-5 razy),(2) aktywność syntetazy 2-5A (3) stężenie 2-5A (do 220 razy). Podw yższona aktywność układu 2-5A wynika przypuszczalnie z przewlekłej infekcji wirusem, a zatem ciągłej aktywacji enzymu. Stosow anie Ampligenu w tych przypadkach spow odow ało spadek aktywności(1) syntetazy 2-5A, (2) RNazy L, (3) stężenia 2-5A do wartości norm alnych (mierzonych w leukocytach jęd- nojądrzastych krwi obwodowej) i popraw ę sam opoczucia pacjentów [65, 66]. Ampligen działając jako allosteryczny m odyfikator aktywności 2-5A syntetazy zmniejsza aktyw ność tego enzymu i w efekcie zmniejsza aktywność RNazy L. W przypadku zakażenia wirusem HIV sytuacja jest odw rotna: (1) aktywność syntetazy 2-5A jest obniżona (do 40 razy), (2) niewy- krywalne 2-5A i aktywność RNazy L. Zastosow anie Ampligenu pow oduje aktywację syntetazy i pow rót do normy: (1) stężenia 2-5A, (2) aktywności RNazy L [56, 66],

Prow adzone są próby zwalczania zakażenia w irusami (m.in. HIV-1) poprzez aktywację RNazy L przy użyciu związków chemicznych będących chim eram i typu: oligo 2-5A-antysensowny RNA. Związki te um ożliwiają swoiste hydrolizowanie RNA dzięki temu, że ich część antysensow na (AS RNA) łączy się z kom plem entarnym RNA, a część 2-5A aktyw uje RNazę L, k tóra hydrolizuje rozpoznany RNA. Poza swoistością taki hybrydowy oligonukleotyd jest bardziej odporny na trawienie przez nukleazy. P lanow ane wykorzystanie tych związków to: (1) zw alczanie zakażenia wirusowego (m.in. HIV-1 [20, 68]), (2) posttranskryp- cyjna kontro la ekspresji genów przez swoistą hydrolizę mRNA [67]. N a przykład chim era 2-5A z antysensow - nym RNA kom plem entarnym wobec m RN A dla k inazy białkowej PK-1 zaham ow ała ekspresję tej kinazy w kom órkach H eLa [67].

Duże znaczenie układu 2-5A pow oduje zainteresowanie nim zarów no ze względów poznawczych, jak i z uwagi na możliwe zastosow ania w leczeniu zakażeń wirusami (m.in. [2, 9, 20, 51]) i zwalczaniu now otworów (np.: [14, 15]). Obiecujące są zwłaszcza próby wykorzystania samego efektora układu 2-5A, czyli RNazy L, z pominięciem wcześniejszych etapów ak tywacji. Strategie wiodące do tego celu to: (1) synteza analogów 2-5A odpornych na hydrolizę przez wewnątrzkom órkow e nukleazy, równocześnie posiadających silniejsze właściwości aktywacyjne, (2) spow odowanie syntezy elementów układu przeciwwirusowego w momencie zakażenia wirusem (Ryc. 6) [5, 59, 60], (3)


1.WEKTOR W KOMORCE NIEZAKAZONEJ

LTRTAR

2-5SABRAK EKSPRESJI

TatTRANSKRYPCJA

2-5SATAR

Tat -transaktywacja

NIEAKTYWNA RNAza L

TRANSLACJA

BIAŁKO

AKTYWNA RNaza L

DEG RADACJA RNARyc. 6 Schem at dośw iadczenia w którym przeprow adzono we

w nątrzkom órkow ą im m unizację przeciwko wirusowi HIV. W prow adzono do kom órk i hybrydowy gen ludzkiej syntetazy 2-5A, znajdujący się pod kontro lą HIV 3'LTR. Prow adzi to do aktyw acji RNazy L w chwili zakażenia wirusem H IV (wg [5], zmodyf.).

synteza zw iązków o budowie chimer 2-5A: AS RNA [20, 67, 68],

A rtykuł otrzymano 18 kwietnia 1995 r. Zaakceptowano do druku 28 sierpnia 1995 r.

Piśmiennictwo

1. F a r r e l P J , S e n G C , D u b o i s M F , R a t n e r L, S l a t t e r y E, L e n g y e l P (1978) Proc N atl Acad Sei USA 75: 5893-5897

2. F u j i i N (1994) Progress in M olec and Subcell Biol 14: 150-1753. S e n C G , L e n g y e l P (1992) J Biol Chem 267: No. 8 ,

5017-50203a. M ü l l e r W E , H U s h i j i m a , S c h r ö d e r H C (1994)

Progr M olec Subcell Biol 14: 6 6-884. L e n g y e l P (1993) Proc N atl Acad Sei USA 90( 13): 5893-58955. S c h r ö d e r H C , S u h a d o l n i k RJ , P f e i d e r e r W,

C h a r u b a l a R, M ü l l e r W E (1992) Int J Biochem 24( 1): 55-63

6 . C h e b a t h J, B e n e c h P, R e v e l M, V i g n e r o n M (1987) N ature (Lond) 330: 587-588

7. Cayley PJ, D a v i e s J A, M c C u l l a g h K G , K e r r I M (1984) Eur J Bioch 143: 165-174

8 . D e f i l i p p i P, H u e z G, V e r h a e g e n - L e w a l l e M, d e C l e r c q E, I m a i J, T o r r e n c e P, C o n t e n t J (1986) F E B S 198(2): 326-332

9. S c h r ö d e r H C , W e n g e r R, K u c h i n o Y, M ü l l e r W (1989) J Biol Chem 264(10): 5669-5673

9a. S c h r ö d e r H C , K e l v e M, M ü l l e r W (1994) Progr M olec Subcell Biol 14, 176-197

10. B a y a r d B, B i s b a l C, L e b l e u B (1986) Biochemistry 25: 3730-3736

11. K e r r I M, B r o w n R E (1978) Proc N a tl Acad Sei U SA 75(1): 256-260

12. D e B e n e d e t t i A, P y t e l AB, B a g l i o n i C (1987) Proc N a tl Acad Sei U SA 84: 658-662

13. S a l e h z a d a T, S i l h o l M, S t e f f A M , L e b l e a u B, B i s b a l C (1993) J Biol Chem 268(11): 7733-7740

14. S q u i r e J, Z h o u A, H a s s e l BA, N i e H, S i l v e r m a n R H (1994) Genomics 19(1): 174-175

15. K n i g h t E, A n t o n E D , F a h e y D, F r i e d l a n d BK, J o n a k G (1985) Proc N atl Acad Sei U SA 82: 1151-1154

16. H a s s e l BA, Z h o u A, S o t o m a y o r C, M a r a n A, S i l v e r m a n R H (1993) E M B O -J 12(8): 3297-3304

17. H o v a n e s s i a n A G , S v a b J, M a r i e I, R o b e r t N, C h a m a r e t S, L a u r e n t A (1988) J Biol Chem 263(10): 4945-4949

18. S i l v e r m a n R H, J u n g D D , N o l a n - S o r d e n N L , D i e f f e n b a c h C W, K e d a r VP , S e n G u p t a D N (1988) J Biol Chem 263(15): 7336-7341

19. G o s h SK, K u s a r i J, B a n d y o p a d h a y a y S, S a - m a n t a H, K u m a r R, S e n G C (1991) J Biol Chem 266(23): 15293-15299

20. L e s i a k K, K h a m n e i S, T o r r e n c e P F (1993) Biocon- jug Chem 4(6): 467-472

21. G r i b a u d o G, L e m b o D, C a v a l l o G, L a n d o l f o S, L e n g y e l P (1991) J Virol 65(4): 1748-1757

22. S l a t t e r y E, G h o s h N, S a m a n t a H, L e n g y e l P (1979) Proc Acad Sei USA 76(10): 4778-4782

23. C a y l e y PJ , K n i g h t M, K e r r I M (1982) Biochem Bioph Res Comm 104(2): 376-381

24. Z h o u A , H a s s e l BA, S i l v e r m a n R H, (1993) Cell 72(5): 753-765

25. C a y l e y PJ , W h i t e RF , A n t o n i w J F , W a l e s b y NJ , K e r r I M (1982) Biochem Biophys Res Comm 108(3): 1243-1250

26. D o n g B, X u L, Z h o u A, H a s s e l BA, L e e X, T o r r e n c e P F , S i l v e r m a n R H (1994) J Biol Chem 269(19): 14153-14158

27. D e v a s h Y, G e r a A, W i l l s t D H , R e i c h m a n n M, P f l e i d e r e r W, C h a r u b a l a R, S e l a I, S u h a d o l n i k(1984) R J J Biol Chem 259: 3482-3486

28. B a y a r d B, B e t t e B o b i l l o P, A l i a u S (1994) Eur J Bioch 223(2): 403-410

29. W r e s c h n e r D, M c C a u l e y J, S k e h e l J, K e r r I (1981) Nature (Lond) 289: 414-417

30. B a y a r d BA, G a b r i o n J B (1993) Biochem J 296(Pt 1): 155-160

31. K r a u s e D, S i l v e r m a n R (1993) J Interferon Res 1 3 :13-1632. Z h a n g G Y , B e l t c h e v B, F o u r n i e r A, Z h a n g YH,

M a l a s s i n e A, B i s b a l C, E h r e s s m a n n B, D a r l i x J L, T h a n g M N (1993) Aids Res and Human Retriviruses 9(2)

33. P f e i f e r K, U s h i j i m a H, L o r e n z B, M ü l l e r WE , S c h r ö d e r H C (1993) M ech Ageing Dev 67(1-2): 101-114

33a. S c h r ö d e r HC , K e l v e M, P f e i f e r K, F l ö g e l - - M r s i c M, M ü l l e r W E G (1993) Z Gerontol 26: 232-237

34. K r a u s e D, S i l v e r m a n R, J a c o b s e n H, L e i s y S, D i f f e n b a c h C, F r i e d m a n R (1985) Eur J Biochem 146: 611-618

35. J a c o b s e n H, K r a u s e D, F r i e d m a n R M, S i l v e r m a n R H (1983) Proc N atl Acad Sei USA 80: 4954-4958

36. M ü l l e r W E G , W e g n e r R, R e u t e r P, R e n n e i s e K, S c h r ö d e r H (1989) Biochem Bioph Acta 1008: 208-212

37. W r e s c h n e r T H , J a m e s T C , S i l v e r m a n T H , K e r r I M (1981a) Nucleic Acids Research 9: 1571-1581

38. B o r k P, S a n d e r C (1993) FEBS Lett 334(2): 149-15239. C h a r a c h o n G, S o b o l R, B i s b a l C, S a l e h z a d a T,

S i l h o l M, C h a r u b a l a M, P f l e i l a n d e r W, L e b l e u B, S u h a d o l n i k R J (1990) Biochemistry 29: 2550-2556

40. N i l s e n T W, B a g l i o n i C (1979) Proc N atl Acad Sei USA 76(6): 2600-2604

41. S c h m i d t A, C h e r n a j o w s k y Y, S c u l m a n L, F e d e - r m a n P, B e r i s s i H, R e v e l M (1979) Proc N atl Acad Sei USA 76(10): 4788-4792

42. I m a i J, L e s i a k K, T o r r e n c e P F (1985) J Biol Chem 260(3): 1390-1393

43. B a y a r d B, B i s b a l C, S i l h o l M, C n o c k a e r t J, H e e z G, L e b l e u B (1984) Eur J Biochem 142: 291-298

44. S u c h a d o l n i k RJ , D e v a s h Y, R e i c h e n b a c h NL , F l i c k MB , W u J M (1983) Biochem Bioph Res Comm 111(1): 205-212

45. W i l i a m s B R G , G o l g h e r RR, B r o w n RE, G i l b e r t CS, K e r r I M (1979) Nature (Lond) 282: 582-586

46. B a y a r d B, L e s e r m a n L D , B i s b a l C, L e b l e u B(1985) Eur J Biochem 151: 319-325

47. V a n - d e n - B o o g a a r t J E , K a l i n i c h e n k o E N, P o d -


kopaeva TL, M i k h a i l o p u l o I A, A l t o n a C (1994) Eur J Biochem 221(2): 759-768

48. N a g a i K, K a n b a r a K, N a k a s h i m a H, Y a m a m o t o N, S u h a d o l n i k RJ , T a k a k u H (1993) Biochim Biophys Acta 1156(3): 321-326

49. S o b o l R W, C h a r u b a l a R, P f e i d e r e r W, S u h a d o l n i k R J (1993) Nucleic Acids Res 21(10): 2437-2443

50. L e s i a k K, T o r r e n c e P F (1987) J Biol Chem 262(5): 1961-1965

51. M o n t e r f i o r i D C , S o b o l R W, S h i W u L i t , R e - i c h e n b a c h t N L , S u h a d o l n i k RJ , C h a r u b a l a R, P f e i d e r e r W, M o d l i s z e w s k i A, R o b i n s o n WE , M i t c h e l l W M (1989) Proc N a tl Acad Sei U SA 8 6 : 7191-7194

52. J a m o u l l e J C, I m a i J, L e s i a k K, T o r r e n c e P F(1994) Biochemistry 23: 3063-3069

53. T o r r e n c e P, B r o z d a D, A l s t e r D, C h a r u b a l a R, P f e i d e r e r W (1988) J Biol Chem 263(3): 1131-1139

54. H u b b e l l H R , K a r i k o K, S u h a d o l n i k RJ , B r o d s k y I (1994) Anticancer Res 14(2A): 341-346

55. H e r s h L C, B r o w n ER, R o b e r t s K W , S w y r y d EA, K e r r M I (1984) J Biol Chem 259(10): 1731-1737

56. C a r t e r WA, B r o d s k y I, P e l l e g r i n o M G , H e n - r i q u e s H F , P a r e n t i D M , S c h u l o f RS, R o b i n s o n WE , V o l s k y DJ , P a x t o n H, K a r i k o K, S u h a d o l n i k RJ , S t r a y e r D R , L e w i n M, E i n c k L, S i m n o n G L , S c h e i b R G , M o n t e r f i o r i D C , M i t c h e l l W M , P a u l D, M e y e r W A I I I , R e i c h e n b a c h N, G i l l e s p i e D H (1987) Lancet June 6 : 1286-1292

57. U s h i j i m a H, R y t i k P G , S c h a c k e H, S c h e f f e r U, M ü l l e r WE , S c h r ö d e r H C (1993) J Interferon Res 13(2): 161-171

58. M a i t r a R K , M c M i l l a n NA, D e s a i S, M c S w i g - g e n J, H o v a n e s s i a n A, S e n G, W i l l i a m s B, S i l v e r m a n R (1994) Virology 204: 823-827

59. M ü l l e r W E , O k a m o t o T, R e u t e r P, U g a r k o v i c D, S c h r ö d e r H (1990) J Biol Chem 265(7): 3803-3808

60. S c h r ö d e r H C , U g a r k o v i c D, M e r z H, K u c h i n o Y, O k a m o t o T, M ü l l e r W (1990) F A S E B J 4: 3124-3130

61. B e d n a r i k D P , M o s c a J D , R a j N B K , P i t h a P M (1989) Proc N a tl Acad Sei U SA 8 6 : 4958-4962

62. K a l v a k o l a n u D V R , B a n d y o p a d h y a y S K , H a r t e r M L , S e n G C (1991) Proc N atl A cad Sei U SA 8 8 : 7459-7463

63. G u t c h M J, R e i c h N C (1991) Proc N a tl Acad Sei U SA 8 8 : 7913-7917

64. F o s t e r G R, A c k r i l l A M , G o l d i n R D, K e r r I M, T h o m a s H C , S t a r k G R (1991) Proc N a tl Acad Sei U SA 8 8 : 2888-2892

65. S u h a d o l n i k RJ , R e i c h e n b a c h N L , H i t z g e s P, S o b o l R W, P e t e r s o n D L , H e n r y B, A b l a s h i DV , M ü l l e r WE , S c h r ö d e r H C , C a r t e r WA , S t r a y e r D R (1994) Clin Infect Dis Jan 18 Suppl 1: S 96-104

6 6 . S u h a d o l n i k RJ , R e i c h e n b a c h N L , H i t z g e s P M , A b l a s h i D V, S t r a y e r D R , C a r t e r W A (1993) Ann N Y Acad Sei 685: 756-757

67. M a r a n A, M a i t r a R K , K u m a r A, D o n g B, X i a o W, L i G, W i l l i a m s BR, T o r r e n c e P F , S i l v e r m a n R H (1994) Science 265: 789-792

6 8 . T o r r e n c e P F , M a i t r a R K , L e s i a k K, K h a m n e i S, Z h o u A, S i l v e r m a n R H (1993) Proc N a tl Ac Sei USA 90(4): 1300-1304

Struktura i funkcja syntetaz aminoacylo-tRNA

Structure and function of aminoacyl-tRNA synthetases

MIROSŁAWA SIATECKA1, JAN BARCISZEWSKI2

Spis treści:

I. WstępII. Struktura i organizacja syntetaz aminoacylo-tRNAIII. Funkcje syntetaz aminoacylo-tRNA

III-l. Aminoacylacja tRNAIII-2. Autoregulacja III-3. Udział w dojrzewaniu RNAI1I-4. Biosynteza alarmonów111-5. Udział w biosyntezie chlorofiluIII-6. Udział w powstawaniu chorób autoimmunologi-

cznych

Wykaz stosowanych skrótów: tRNA — transferowy kwas rybonukleinowy; mRNA — informacyjny kwas rybonukleinowy; AARS — syntetazy aminoacylo-tRNA; koniec N i C — koniec aminowy i karboksylowy polipeptydu; mtRNA — mitochondrialny RNA; RNP — rybonukleo- proteiny; NADP — fosforan dwunukleotydu nikotynamido- adeninowego.

1 Mgr, 2 prof. dr hab., Instytut Chemii Bioorganicznej PAN,ul. Noskowskiego 12, 61-704 Poznań

266

Contents:

I. IntroductionII. Structure and organization of aminoacyl-tRNA syn

thetasesIII. Functions of aminoacyl-tRNA synthetases

III-l. tRNA aminoacylationIII-2. AutoregulationIII-3. RNA splicingIII-4. Alarmone biosynthesisIII-5. Role in chlorophyll biosynthesisIII-6. Autoimmunological diseases with autoantibodies

against human AARS

I. Wstęp

D okładność m echanizm u biosyntezy białka, jed nego z najważniejszych procesów kom órkow ych, polega nie tylko na specyficznym oddziaływ aniu informacyjnego RNA z transferowym RNA, ale także na przyłączeniu swoistego am inokw asu do tRNA. E tap ten katalizow any jest przez niezwykle zróżnicow ane strukturalnie syntetazy am inoacylo-tR N A (ligazy ami-

POSTĘPY BIOCHEMII 41(4), 1995http://rcin.org.pl

noacylo-tRN A ; E.C.6.1.1.-), które rozpoznają stru k turalnie podobne, specyficzne tRNA. Bardzo duża różnorodność budowy syntetaz, przy tak dużym podobieństwie katalizow anej reakcji am inoacylacji-tRNA jest fascynującym problem em badawczym. Ponieważ niektóre aspekty tego zagadnienia były już om awiane na łam ach Postępów Biochemii (H. J a k u b o w s k i — Post. Bioch. 21,95,1975), w niniejszym artykule ograniczymy się do przedstaw ienia nowych danych, unikając pow tarzania inform acji zawartych w poprzednim opracow aniu. Intensyw ne badania biochemiczne i struk tu ralne prow adzone w ciągu kilku ostatnich lat, doprow adziły do rozwiązania struktury kryształów i poznania budow y przestrzennej kilku syntetaz oraz ich kom pleksów z tRNA. Analiza tych kryształów przybliża poznanie i zrozumienie mechanizm u rozpoznaw ania kw asu nukleinowego przez białko.

II. Struktura i organizacja syntetaz am inoacylo-tRNA

W kom órce prokariotycznej występuje 20 syntetaz am inoacylo-tR N A (AARS) specyficznych dla określonego am inokw asu. K atalizują one reakcję przyłączenia swoistego am inokw asu do wszystkich izoakcep- torowych tR N A o danej specyficzności. K om órki eukariotyczne, ze względu na obecność organelli kom órkow ych takich jak m itochondria i chloroplasty, zawierają kilka syntetaz dla jednego am inokw asu. O rganellowe AARS kodow ane są w genomie ją d rowym. C ytoplazm atyczna i m itochondrialna forma syntetaz histydylo-tR N A u drożdży kodow ana jest przez jeden gen, przy czym m itochondrialny enzym ma przy końcu am inowym 20 dodatkow ych am inokw asów. Jest to sygnalna sekwencja niezbędna dla transportu enzym u do m itochondriów [1 ,2 ]. Podobnie gen syntetazy izoleucylo-tRNA (Ile RS) ilsA u Tetrahymena thermophila koduje dwa białka, cytoplazm atyczną i m itochondrialną formę IleRS, różniące się d o d a tkowym 20 am inokw asow ym peptydem przy N -końcu [3], N atom iast cytoplazm atyczne i m itochondrialne syntetazy treonylo-tR N A u drożdży kodow ane są przez dwa oddzielne geny jądrow e [1].

Z nane są również przykłady występowania syntetaz am inoacylo-tR N A w kilku formach m olekularnych dla tego sam ego aminokwasu. U ssaków znaleziono dwie formy syntetazy arginylo-tRNA (ArgRS), z k tó rych jedna występuje w postaci wolnej, a druga jest składnikiem wysokocząsteczkowego kom pleksu syntetaz i zawiera 100 dodatkow ych am inokwasów na końcu am inowym . Enzym znajdujący się w kom pleksie katalizuje syntezę arginylo-tRNA, który wykorzystywany jest następnie w biosyntezie białka, podczas gdy p ro d u k t reakcji aminoacyłacji katalizow anej przez enzym nie zaangażow any w tworzenie kom pleksu jest substratem w potranslacyjnej reakcji modyfikacji b iałek. M odyfikacja ta stanowi sygnał dla ich degradacji w reakcji zależnej od ubikwityny (Ryc. 1) [4]. Zapo-

Arginina

ArgRS (72 kDa) w kompleksie wielo-

syntetazowym

i[Arg-tRNA*9] EF-1

Rybosom

Nowosyntetyzowane białko

Ryc. 1. Udział syntetazy arginylo-tR N A w procesach kom órkowych. W olna form a ArgRS (60kDA) katalizuje syntezę A rg-tR N A Arg, substra tu do m odyfikacji białek, natom iast form a wchodząca w skład kom pleksu wielosyntetazowego katalizuję syntezę A rg-tR N A Arg (72kDA) do rybosom alnej biosyntezy białek. N aw ias kw adratow y oznacza, że utw orzony A rg-tR N A Arg tworzy natychm iast kom pleks z czynnikiem elongacyjnym 1 (EF1) bez uw alniania do cytoplazmy.

trzebowanie kom órki na arginylo-tRNA jako substrat w reakcji modyfikacji białek sugeruje, że am inoacylo- tRN A (AA-tRNA) biorący udział w rybosom alnej biosyntezie białka jest niedostępny dla innych procesów kom órkow ych [5]. Różnicowa synteza arginylo- tR N A jest przykładem ukierunkow anego przepływu produktów reakcji (ang. channeliny) występującego w kom órkach.

W ystępowanie kilku syntetaz am inoacylo-tRN A dla danego am inokw asu stwierdzono również u proka- riontów. U E. coli występują dwie syntetazy lizylo- tRN A o różnej sekwencji aminokwasowej, stanowiące produkt dwóch genów. Ekspresja jednego z tych genów, LysS, zachodzi konstytutyw nie (w sposób ciągły), podczas gdy ekspresja drugiego LysU odbywa się pod kontro lą p rom otora wrażliwego na szok tem peraturow y lub oksydacyjny [6-8]. U Bacillus subtilis znaleziono dwie syntetazy treonylo-tRNA , z których każda oddzielnie jest wystarczająca dla wzrostu kom órki. Jedna z nich występuje głównie w wegetatywnej fazie wzrostu, druga natom iast podczas sporulacji [6, 9].

Geny kodujące AARS u niższych eukariontów zasadniczo nie zawierają intronów. W yjątkiem są: cytoplazm atyczna LeuRS oraz m itochondrialne LeuRS i TyrRS u Neurospora crassa [10]. Sekwencje kodujące geny AARS u wyższych eukariontów zbudow ane są z kilku eksonów oskrzydlonych dużymi intronam i. U chom ika Mesocricetus auratus gen AspRS składa się z 16 eksonów a HisRS z 13 eksonów [10].

N a podstawie analizy dotychczas poznanych sekwencji aminokwasowych prokariotycznych i eukariotycznych syntetaz am inoacylo-tRN A m ożna stwierdzić, że podobieństw o enzymów swoistych dla tego samego am inokw asu jest stosunkow o duże i wynosi około 60%, natom iast dla różnych am inokwasów nie przekracza 20% i ogranicza się jedynie do identyczno

Arginina tRNA4'9

C Wolna forma ArgRSV (60 kDa)T0PL Arg-tRNA^9

AZ

Transferaza A Arg-tRNAA,g-białko

1Białko modyfikowane argininą

przy końcu aminowym


ści zachowywanych (conserved) fragm entów (m otywów) [1, 6, 10, 11],

Syntetazy am inoacylo-tR N A eukariontów m ają masę cząsteczkową większą od ich hom ologów prokariotycznych np. LeuRS: E. coli-91 kD a, S. cerevisiae- 124 Da; ArgRS: E. coli-64 kD a, M . auratus-15,5 kDa; HisRS: E. coli-Al kD a, S. cerevisiae-58 kD a [11]. Przyczyną tej różnorodności jest występowanie d o d a tkowych peptydów na końcu karboksylow ym lub am inowym. Sekwencje te wydają się być istotne dla przebiegu procesów kom órkow ych innych niż reakcja aminoacylacji, np. m ogą determ inow ać rodzaj hydrofobowych oddziaływań podczas tworzenia wysoko- cząsteczkowych kompleksów enzymatycznych [12-14].

Syntetazy am inoacylo-tR N A m ogą występować w postaci dwóch rodzajów kompleksów. Jeden z nich złożony jest z syntetazy oraz innych białek np. syntetaza walilo-tRN A występuje w kom pleksie z eukariotycznym czynnikiem elongacyjnym eEF-1 [15]. Drugi kompleks, określany jako kom pleks wielosyn- tetazowy, zawiera dziewięć A ARS specyficznych dla Pro, Glu, Ile, Leu, Met, Gin, Lys, Arg, Asp [ 13]. W jego skład m ogą również wchodzić inne makrocząsteczki, np. kom pleks 5S rRNA z białkiem rybosom alnym dużej podjednostki — L5 (7S RNP-7S rybonukleo- proteina) [16]. Składnik ten stymuluje p raw dopodobnie aktywność niektórych syntetaz głównie M etRS i IleRS [17]. W kom pleksie wielosyntetazowym wykrytym u Drosophila zaobserwow ano, że dziewięć aktywności syntetaz am inoacylo-tRN A było związane z występowaniem ośmiu polipeptydów. Jeden z nich wykazywał jednocześnie aktywność dwóch różnych syntetaz: G luRS i ProRS. Jest to pierwszy znany przykład chimerycznej syntetazy określanej jako syntetaza gluprolilo-tRN A [13], Funkcjonalne znaczenie kompleksowej organizacji syntetaz nie jest do końca poznane, chociaż jest zrozum iałe z punktu widzenia ukierunkow anego przepływu substratów (ang. channeling). P raw dopodobnie istnienie takich wieloenzy- m atycznych kom pleksów jest konieczne dla wydajnego funkcjonow ania aparatu translacyjnego [14].

Syntetazy am inoacylo-tR N A wykazują olbrzymie zróżnicowanie zarów no w sekwencji aminokwasowej jak i strukturze przestrzennej. Łańcuchy polipeptydo- we zawierają od 334 reszt am inokwasowych dla TrpRS E. coli do 1112 dla PheRS E. coli. Ich m asa cząsteczkowa waha się od 51 k D ad laC ysR S E. coli do 384 kD a dla AlaRS E. coli. Syntetazy am inoacylo-tRN A są m onom eram i, hom o i heterodim eram i, a także hom o- tetram eram i (Ryc. 2) [11, 18, 19].

Opierając się na wynikach analiz sekwencji am inokwasowych znanych syntetaz am inoacylo-tRNA , oraz na porów naniu struk tu r kryształów TyrRS i TrpRS z Bacillus stearothermophilus [20, 21], M etRS z E. coli [22], LysRS z E. coli [23], SerRS z Thermus thermophilus [24] i E. coli [25] oraz kom pleksów GlnRS- -tR N A Gln z E. coli [26] oraz AspRS-tRN AAsp z drożdży[27] oraz SerRS-tRN A Ser z Thermus thermophilus [28]

0 1000 2000 3000L i cz ba a m i n o k w a s ó w

O 1000 2000 3000Li czba a m i n o k w a s ó w

Ryc. 2. S truk tu ralna różnorodność dwóch klas syntetaz aminoacylo-tR N A . W ram kach podano liczbę am inokw asów w podjednostce lub w całym enzymie.

wszystkie syntetazy am inoacylo-tRN A podzielono na dwie klasy w zależności od zachowywanych am inokwasów lub peptydów występujących w strukturze tych białek. K ażda z klas obejmuje dziesięć różnych syntetaz [18] (Ryc. 3). Do klasy I należą syntetazy: ArgRS, GluRS, GlnRS, TrpRS, TyrRS, MetRS, CysRS, IleRS, LeuRS, ValRS. Zaw ierają one dwa stałe peptydy pentapeptyd Lys-M et-Ser-Lys-Ser (KM SKS) oraz tzw. sekwencję znacznikową (ang. signature seąu-

Ryc. 3. W ystępow anie konserwatyw nych fragm entów polipepty- dów w sekwencji am inokwasow ej syntetaz am inoacylo- -tRN A klasy 1 i II. H IG H i K M SK S oznaczają sekwencje am inokw asow e (zob. tekst).


ence), k tó rą stanow i dodekapeptyd, zakończony najbardziej zachowawczym tetrapeptydem His-X-Gly- -His (HX GH), gdzie X oznacza hydrofobowy am inokwas, którym jest najczęściej izoleucyna. O ba motywy HX G H i K M SK S tworzą centrum aktywne (tzw. „Rossmann fo ld ”), w którym występują na przem ian odcinki helikalne (a-helisy) i struktury (3-daszkowe (ang. (3-sheet) [19]. Podobne motywy obserwowane są w wielu innych białkach wiążących m ono i dw unuk- leotydy np. w dehydrogenazach [29]. P raw dopodobnie dwie reszty histydyny tetrapeptydu H X G H oddziałują z resztam i fosforanowymi ATP, a pentapeptyd KM SKS, oprócz wiązania ATP, jest miejscem wiązania (lub zakotw iczania) końca 3’ cząsteczek tRNA [6].

N a podstaw ie rozwiązanych dotychczas struk tu r kryształów enzymów klasy I, czyli Try RS, TyrRS z B. stearothermophilus oraz M etRS i G lnRS z E. coli w yróżniono trzy podklasy syntetaz. Pozostałe enzymy o nieznanej dotychczas strukturze przestrzennej, m ożna zakwalifikować do jednej z tych trzech podklas. Podklasę la tw orzą syntetazy am inoacylo-tR N A swoiste dla am inokw asów hydrofobowych oraz zawierających siarkę. Są to: MetRS, CysRS, ValRS, IleRS, LeuRS. Podklasę Ib stanowią syntetazy am inokwasów arom atycznych TyrRS, TrpRS, natom iast podklasę Ic syntetazy dla am inokw asów obdarzonych ładunkiem ArgRS, G lnRS, G luRS (Tab. 1) [18],

K lasa II syntetaz am inoacylo-tRN A obejm uje enzymy swoiste dla kwasu asparaginowego, asparaginy, glicyny, fenyloalaniny, proliny, seryny, treoniny, histydyny, alaniny, lizyny. Enzymy te zawierają trzy zachowawcze konserwatywne fragmenty sekwencji zwane m otyw am i (Ryc. 3). M otyw 1 stanowi 18 am inokw asow y peptyd odpowiedzialny za dimeryza- cję. Syntetazy GlyRS i AlaRS nie posiadają motywu 1.

Tabela 1.Klasyfikacja syntetaz am inoacylo-tRN A . C harakterystyczne sekwencje am iookw asow e przedstaw iono w kodzie jednoliterow ym , podklasy w kodzie trójliterowym .

Klasa AARS I II

Miejsceaminoacy-lacji nakońcowejrybozietRNA

2 ’O H 3’OH

C harakte H IG H (1) ...P...rystycznasekwencjaaminokwa-sowa

KMSKS (2) ...FRXE...(3) ...GXGXGXER...

Podklasy a b c a b c d LeuRS TyrRS ArgRS HisRS AspRS GlyRS PheRS IleRS TrpRS GlnRS ProRS AsnRS AlaRS ValRS GluRS SerRS LysRS CysRS ThrRS M etRS

U E. coli AlaRS występuje on jako tetram er, chociaż m onom er jest również aktywny. U organizm ów wyższych np. u Bombyx mori, AlaRS występuje jako m onom er [30], M otyw 2 obejmujący 23-31 am inokwasów z charakterystycznym tetrapeptydem Phe- Arg-Asp-Glu (FRNE) i motyw 3, liczący 29-34 am inokwasów z konserwatyw ną sekwencją Gly-Leu- -Glu-Arg (GLER) stanowią aktywne miejsce enzymów klasy II [31], W ydaje się, że am inokw asy w motywie 2 oddziałują z ramieniem akceptorow ym tRNA, a am inokwasy w motywie 3 zaangażow ane są w wiązanie A TP i am inokwasu [32] (Ryc. 3.). Syntetazy am inoacylo-tRNA należące do klasy II m ożna podzielić na kilka podklas różniących się konserwatywnym i m otywami sekwencyjnymi (Tab. 1). Podklasę lia stanowią enzymy ProRS, ThrRS, HisRS, SerRS, podklasę IIb AspRS, AsnRS i LysRS, a podklasę IIc syntetazy dla Gly i Ala, nie posiadające wszystkich charakterystycznych motywów strukturalnych. Do podklasy IId należy PheRS [18],

Podział syntetaz am inoacylo-tRN A na dwie klasy, w zależności od występowania charakterystycznych elementów strukturalnych, związany jest także z mechanizmem działania tych enzymów. Dotyczy to miejsca acylacji rybozy adenozyny znajdującej się przy końcu 3’ tRNA. Wszystkie syntetazy klasy I przyłączają am inokwas w pozycji 2’ rybozy, podczas gdy syntetazy klasy II z wyjątkiem PheRS w pozycji 3’ (Tab. 1) [6, 18]. Interesująca pod tym względem jest syntetaza fenyloalanylo-tRN A z T. thermophilus, przyłącza ona jednocześnie dwie cząsteczki fenyloalaniny do rybozy w pozycji 2’ i 3’ [33].

Jednym z kluczowych zagadnień w badaniach syntetaz jest mechanizm działania tych enzymów. N a drodze do rozszyfrowania tego problem u poznano organizację dom en funkcjonalnych dla syntetazy tyrozylo-tRNA z Bacillus stearothermophilus, [34] należącej do klasy I i syntetazy alanylo-tR N A z E. coli, [35] należącej do klasy II. Analizowano je wykorzystując różne m utanty delecyjne. Stw ierdzono, że na końcu am inowym enzymu znajduje się dom ena aktywacji am inokw asu oraz sekwencja, k tóra oddziałuje z ram ieniem akceptorowym tRNA. Dalej, w kierunku końca C-występuje fragment wiążący tRNA, głównie poprzez ramię i pętlę D oraz ramię antykodonow e. K arboksylowy koniec enzymu odpowiedzialny jest za dimery- zację podjednostek (Ryc. 4) [31, 34, 35]. Syntetazy am inoacylo-tR N A klasy II wydają się mieć bardziej zróżnicow aną strukturę niż syntetazy klasy I. O bserwuje się w nich odstępstwa od przedstawionej liniowej organizacji dom en funkcjonalnych (Ryc. 4).

III. Funkcje syntetaz am inoacylo-tRNA

III-l. Aminoacylacja tRNA

Podstaw ow ą funkcją syntetaz am inoacylo-tR N A jest katalizow anie reakcji przyłączania am inokwasu


Kataliza Wiązanie i rozpoznanie tRNA Oligomeryzacja

NH-

Ryc. 4. Schemat budowy syntetaz am inoacylo-tR N A . N -koniec odpowiedzialny jest za katalizę reakcji am inoacylacji, a C -koniec za oligomeryzację podjednostek enzymu.

do cząsteczki tRNA. Reakcja aminoacylacji jest dw uetapow a (Ryc. 5). W pierwszym etapie następuje ak tywacja am inokwasu (AA) przez AARS, w obecności A TP i powstanie am inoacyloadenylanu. Jest to mieszany bezwodnik, w którym grupa karboksylow a am inokw asu połączona jest z grupą fosforanową AM P. W drugim etapie am inokw as zostaje przeniesiony na cząsteczkę odpowiedniego tRNA. W większości przypadków pierwszy etap może odbywać się bez tRNA. W yjątkam i są ArgRS, GluRS, GlnRS, gdzie dla reakcji wymiany PPi-A T P konieczna jest obecność tR N A [6, 18]. Procesowi syntezy am inoacylo-tRN A towarzyszy napraw a błędów (ang. proofreading) [36,37]. IleRS oprócz syntezy izoleucylo-tRNA, może również aktywować walinę tw orząc związany z enzymem walilo-AM P. Jednakże aktyw ow ana walina nie zostaje przeniesiona na tR N A lle, ponieważ właśnie tR N A Ile katalizuje hydrolizę walilo-AM P, co zapobiega wbudow aniu błędnego am inokwasu. W procesie syntezy am inoacylo-tRNA , etap przeniesienia am inokwasu jest bardziej specyficzny niż etap aktywacji [38]. Selekcja odpowiedniego tRNA i swoistego am inokwasu odbywa się poprzez tworzenie unikatowego, specyficznego kom pleksu tRNA — syntetaza am inoacylo-tRNA. O swoistości tego procesu decydują dwa

czynniki: rozpoznaw anie i identyczność tRNA . R ozpoznawanie odnosi się do identyfikacji danego tRNA przez odpow iednią syntetazę na podstaw ie specyficznych elementów strukturalnych tRN A (ang. recognition elements). Identyczność tRNA obejm uje elementy rozpoznaw alne przez swoistą syntetazę i jednocześnie cechy strukturalne, które uniem ożliwiają rozpoznawanie tRN A przez niehom ologiczną syntetazę (ang. discrimination elements) [39]. W iększość elementów tRN A rozpoznaw anych przez syntetazy am inoacylo-tRN A znajduje się w ram ieniu akceptorow ym i antykodonie. Do wyjątków należą: tR N A Ala, tR N A Ser, tR N A Leu, których antykodon nie jest zaangażow any w bezpośrednie oddziaływanie z AARS. W an tykodonie LAU w tR N A Ile z E. coli występuje m odyfikow ana cytozyna-lizydyna, uniemożliwiająca przyłączenie metioniny. W drożdżowym tR N A Asp dla uniknięcia przyłączenia błędnego am inokw asu zasada w pozycji 37 jest modyfikowana. W tR N A Hls istotnym elementem strukturalnym jest guanozyna w pozycji G (_ 1}. Brak jest jednak bezpośredniej korelacji m iędzy ważnymi dla rozpoznaw ania przez enzym pozycjam i nukleo- tydów w tRNA, a podziałem syntetaz am inoacylo- tRN A na klasy (Tab. 2) [40].

AA-AMP + tRNA AA-tRNA + AMPRyc. 5. Schemat dwuetapowej reakcji am inoacylacji tRNA w obecności syntetazy AARS. W pierwszym etapie następuje aktyw acja

am inokw asu z wytworzeniem am inoacyloadenylanu, w drugim am inoacylacja tRNA.

270 POSTĘPY BIOCHEMII 41(4), 1995

M iejsca w iązania ATP i am inokwasuRam ię akceptorowe Ram ię i pętla T + C

R am ię i pętla antykodonu R am ię i pętla DHU F f -COOH

http://rcin.org.pl

Tabela 2.Elem enty s tru k tu ra ln e t RNA zaangażow ane w rozpoznaw aniu przez syntetazy.

Aminokwas

Klasa I AARS Met Cys Leu Ile Val Trp Tyr Arg Glu Gin

A ntykodon + + - + + + + + + +

Pętla d o d a tk o w a w tRNA - - + - - - + - - -

N ukleozyd w pozycji 73 A U A A A G A A/G G G

Aminokwas

Klasa II AARS Asp Asn Lys His Ser T hr Pro Ala Gly Phe

A ntykodon + + + + - + + - + +

Pętla d o d a tk o w a w tRNA - - - - + - - - - -

N ukleozyd w pozycji 73 G G A G -l G A A A U A

III-2. Autoregulacja

Znaleziono dow ody wskazujące, że syntetazy aminoacylo-tR N A autoregulują ekspresję swoich genów, zarów no na poziom ie transkrypcji jak i translacji. Ekspresja genu thrS E. coli, kodującego syntetazę treonylo-tR N A (ThrRS) regulow ana jest na poziom ie translacji, pod wpływem produktu końcowego [41]. G dy poziom ThrR S jest zbyt wysoki w porów naniu z zapotrzebow aniem kom órkow ym , wówczas pow stające w nadm iarze białko wiążąc się do tzw. sekwencji liderowej zlokalizow anej przed startem translacji własnego m R N A blokuje miejsce wiązania rybosom u i zatrzym uje biosyntezę. Odcinek liderowy m RNA w ykazuje sekwencyjne i strukturalne podobieństw o do cząsteczki tRN A . W yróżnić w nim m ożna 4 elementy (domeny) struk tu ry Il-rzędowej. D om ena 1 zawiera tzw. sekwencję Shine-Dalgarno, czyli miejsce wiązania do rybosom u, oraz kodon inicjacji translacji. D om ena 2 podobna jest do siedm ionukleotydowej pętli antykodonow ej tR N A Thr, zawiera antykodon treoniny C G U pętli. D om ena 3 rozdziela dom eny 2 i 4 i utrzymuje je w odpowiedniej odległości przestrzennej. D om ena 4 w ykazuje podobieństw a do ram ienia akceptorow ego i zawiera sekwencję CCA (Ryc. 6). tR N A Thr podobnie jak odcinek liderowy m RNA wykazuje powinowactwo do syntetazy treonylo-tR N A i działa jako an tyrepresor translacji. Usuwa on ThrRS z m RNA i umożliwia prawidłowe funkcjonow anie rybosom u. System represji i derepresji inicjacji translacji pozwala na utrzym anie równowagi między biosyntezą syntetazy am inoacylo-tR N A a ilością tRNA i uniknięcie kum ulow ania się wolnego tRN A w kom órce [6, 41, 42].

P odobną funkcję regulatorow ą w ykazano dla syntetazy alanylo-tR N A z E. coli, k tó ra wiąże się specyficznie do palindrom ow ej sekwencji otaczającej miejsce startu transkrypcji własnego genu. W ydaje się, że

dom ena AlaRS zaangażow ana w oddziaływanie z DNA nie jest konieczna dla katalizow ania reakcji am inoacylacji [1, 6].

Poziom drożdżowej syntetazy lizylo-tRNA zależy od ilości enzymu i tR N A Lys w kom órce [43]. Przy obniżonej aktywności LysRS i niepełnej aminoacylacji tR N A Lys następuje aktywacja białka GCN2. Analiza jego sekwencji aminokwasowej wskazuje, że białko to zawiera dom enę podobną do syntetazy histydylo- -tRNA. Przypuszcza się, że niezam inoacylowany tRNA wiąże się do regionu podobnego do HisRS i w ten sposób wpływa na wzrost aktywności domeny kinazowej białka GCN 2. D om ena HisRS w G CN 2 może wiązać też inne tRNA. Aktywne białko G CN 2 fosforyluje podjednostkę oi czynnika inicjatorowego eIF-2, pow odując obniżenie jego aktywności oraz

C A A A U U U U U

-50 CUU - AU - AG - CU - GA - U

U-40 G - C

U - A G - C A - U U - G C - G U - G

U

Domena 3-60

A A A U

110 ^ A U U— r - A U U G C G A A C C A U U U A G C a u-7° c i i i i i i i i i m i i i i i i r ;

A A G U A A C G C U U G G U A G A U C G g y G

-120U

G U C C A U G U G U U U A C - 5

A U A A G G A U A U A A A A U G - 3 ’

U

Domena 4 (ram ię akceptorowe)

Domena 1

A -20

Domena 2 (ramię antykodonu)

UC U G

uG -30

Ryc. 6. M odel struktury 11-rzędo- wej mRNA thrS (genu ThrRS) przypom inający struk turę tR N A rhr


zwiększenie syntezy innego białka GCN4. G C N 4 jest transkrypcyjnym aktyw atorem genu G CD5, kodującego syntetazę lizylo-tRNA. Synteza białka G C N 4 kontrolow ana jest na poziomie translacji przez 4 k ró tkie, otw arte ram ki odczytu znajdujące się w kierunku 5’ od startu translacji (uO R F -upstream open reading

frame) [43]. Przy obniżonej aktywności eIF-2a, inicjacja translacji jest mniej wydajna i większość krótkich uO R F jest om ijana, a translacji ulega właściwa ram ka odczytu białka G CN 4. W ynika z tego, że ufosforylo- w ana form a czynnika inicjatorowego eIF-2a pow oduje derepresję translatacji G CN4. Białko G C N 4 wiąże się do sekwencji TG A C TC genu G CD 5, aktywując transkrypcję. Zwiększenie ilości LysRS powoduje podwyższenie poziom u Lys-tR N A Lys i jednocześnie zmniejszenie ilości nieam inoacylow anego tR N A Lys. W konsekwencji zredukow any poziom wolnego tR N A Lys prow adzi do spadku aktywności kinazy G CN2, przez co fosforylacja e IF 2a pow raca do poziomu wyjściowego, a translacja G C N 4 ulega ponownej represji (Ryc. 7) [43].

III-3. Udział w dojrzewaniu RN A

N iektóre geny m itochondrialne zawierają introny, które ulegają sam owycinaniu in vitro. Jednak in vivo wydajność procesu dojrzewania RNA (ang. splicing R NA ) zależy od obecności specyficznych czynników białkowych. M ogą to być m aturazy, białka kodowane przez introny, lub też białka kodow ane przez genom jądrow y. W śród tych białek są również syntetazy

am inoacylo-tRNA [44, 45].U Neurospora crassa białko C y t-18, p roduk t genu

cyt-18, niezbędne jest do składania mtRNA. Białko to zostało zidentyfikowane jako m itochondrialna syntetaza tyrozylo-tRNA [46, 47]. Zaw iera ona na N- końcu istotną dla procesu dojrzewania RNA domenę, której nie zawierają syntetazy tyrozylo-tRN A z bakterii czy drożdży. Nie jest ona istotna dla katalizow ania reakcji aminoacylacji. W ystępowanie tej domeny sugeruje, że m itochondrialna syntetaza tyrozylo- -tRNA z N. crassa nabyła zdolność wycinania intro- nów stosunkowo późno w ewolucji lub też, że inne AARS podczas ewolucji utraciły tę końcow ą domenę. Białko Cyt-18 zaangażow ane jest w wycinanie wielu różnorodnych intronów grupy I, które w ykazują m inim alną homologię w sekwencji nukleotydowej. M otywami rozpoznaw anym i przez białko wydają się być wysoko konserwatywne elementy struk turalne katalitycznego rdzenia tych intronów, które przypom inają strukturę tRNA. In trony RNA oraz tR N A Tyr wykazują powinowactwo do miejsca wiązania w białku Cyt-18. Sugeruje się, że białko Cyt-18 wiążąc się do in tronu formuje i stabilizuje go w konformacji wymaganej dla katalitycznej aktywności rdzenia in tronu [44, 46-48]. M utacje TyrRS w dom enie odpowiedzialnej za wiązanie tRNA ham ują zarów no reakcję am inoacylacji jak i proces dojrzewania RNA, jednakże bez u traty zdolności białka do form ow ania tyrozylo-adenylanu.

U Podospora anserina znaleziono również dwufunk- cyjne m itochondrialne białko YST1, k tóre wykazuje aktywność syntetazy tyrozylo-tRNA i jest zaangażo-

tRNA Lys

fosforylacja elF-2a

derepresja translacji GCN4Ryc. 7. Model autoregulacji ekspresji genu kodującego LysRS (GCD5) u drożdży. G C N 2 — białko wykazujące aktyw ność kinazy oraz

struk turalne podobieństw o do HisRS, e łF — eukariotyczny czynnik inicjatorowy, G C N 4 — aktyw ato r transkrypcji.


wane w dojrzew aniu RNA [49].

III-4. Biosynteza alarmonów

W każdym organizm ie eukariotycznym i prokario- tycznym znajdującym się w warunkach stresowych spow odow anych np. podwyższoną tem peraturą, wysokim stężeniem alkoholu lub utleniacza, następuje indukcja syntezy białek szoku. W śród nich u E. coli zidentyfikow ano syntetazę lizylo-tRNA [7]. N iektóre syntetazy m ają zdolność katalizow ania reakcji syntezy alarm onów , czyli cząsteczek regulatorowych, które są „czujnikam i szoku” i inform ują kom órkę o zm ienionych w arunkach , pow odując rozpoczęcie tzw. „odpowiedzi na stres”. Do alarm onów zalicza się dw unuk- leotydowe oligofosforany: Ap4A, A p3G pp, Ap4G, A p3G, A p3A, których syntezę przedstawia (Ryc. 8). Jedna z cząsteczek A TP (pppA) w tych dw unuk- leotydach m oże być zastąpiona przez ppG pp, G T P, G D P , A D P. M ikrom olarne stężenie jonów cynku stym uluje syntezę alarm onów przez niektóre syntetazy np. AlaRS, PheRS, ProRS a zwłaszcza LysRS u E. coli [50]. Sugeruje się, że syntetazy am inoacylo-tRN A mogą być wrażliwe na stres oksydacyjny, ponieważ niektóre z tych enzymów posiadają grupy tiolowe łatwo ulegające utlenieniu. Takie utlenienie może obniżać aktyw ność syntetaz w reakcji aminoacylacji tRNA, natom iast podwyższona zostaje wówczas ak tywność syntezy dw unukleotydowych oligofosfora- nów [50], Inna hipoteza zakłada, że cząsteczki t RNA m ogą być czujnikam i stresu. Zm iany w m odyfikowanych nukleotydach tRNA spowodowane warunkam i

Lys + ATP

LysRS

Lys - pA - LysRS(AMP)

+pppA(ATP)

+ppGpp +pppG

( G T P ) ,

+ppG +ppA

AppppA ApppGpp AppppG ApppG ApppA

Lys + LysRS

Ryc. 8. Schemat biosyntezy alarm onów . W reakcji am inokw asu z A TP katalizowanej przez syntetazę AA RS powstaje am inoacyloadenylan jak o produkt przejściowy. Może on ulegać reakcji z różnymi pochodnym i A T P i G T P z wytworzeniem odpow iednich dw unukleotydów oligofosfora- nów uwalniając am inokw as i enzym.

stresowymi m ogą aktywować odpow iednią syntetazę do katalizow ania reakcji syntezy alarm onów [51].

III-5. Udział w biosyntezie chlorofilu

Syntetaza glutam ylo-tRN A (GluRS) jest zaangażowana w proces biosyntezy chlorofilu u roślin wyższych, glonów, cyjanobakterii i niektórych fotosyntetyzują- cych i niefotosyntetyzujących bakterii [52]. Biosynteza chlorofilu rozpoczyna się od utw orzenia glutamylo- tR N A Glu (G lutR N A olu) przy udziale syntetazy gluta-

hydroksyam ino-tetrahydropyranon(HAT)

COOHI

CHNH2

c h 2I

c h 2I

COOH

tRNAGIU, ATP

syntetazaGlu-tRNA

CH.ICH.

Ryc. 9. Schem at biosyntezy kwasu 5-aminolewulinowe- go (ALA), p rekursora związków tetrapirolow ych np. chlorofilu.

COOH

glutamin-1 -sem ialdehyd


mylo-tRNA. W następnym etapie reduktaza glutamy-lo-tRN A (G luTR) przekształca glutam ylo-tRN A Glu do glutam ino 1-semialdehydu. Następnie cząsteczka ta ulega transam inacji, a powstający kwas 5-aminolewu- linowy (ALA) jest prekursorem związków tetrapirolo- wych m.in. chlorofilu (Ryc. 9). U zielenicy Chlamydo- monas reinhardtii wykazano, że syntetaza glutamylo- tRNA tworzy stabilny kom pleks z reduktazą glutamy-lo-tRNA. K om pleks ten umożliwia bezpośrednie przeniesienie utw orzonego glutam ylo-tRN A Glu z GluRS na GluTR. Jest to mechanizm ukierunkow ania Glu- tR N A Glu dla biosyntezy chlorofilu umożliwiający uniknięcie współzaw odnictw a o produkt reakcji aminoacylacji ze szlakiem biosyntezy białek w chloroplastach [52-54],

III-6. Udział AARS w powstawaniu chorób autoimmunologicznych

W ydaje się, że jedną z przyczyn chorób związanych z au toim m unoagresją jest występowanie przeciwciał dla syntetaz am inoacylo-tR N A (anty-AARS). N iektóre syntetazy am inoacylo-tR N A np. AlaRS, GlyRS, HisRS, IleRS, SerRS, ThrR S są antygenam i dla przeciwciał znajdujących się w surowicy pacjentów cierpiących na m yositis (zapalenie mięśni), połimyositis (zapalenie wielomięśniowe) oraz derm atom yositis (zapalenie skórno-m ięśniowe) [55-61]. Przeciwciała te ham ują reakcję aminoacylacji tRNA poprzez wysoce specyficzne wiązanie się do centrum aktywnego enzymu [55-61]. W ydaje się, że są one skierowane przeciwko konform acyjnym epitopom pojedynczych syntetaz, poniew aż anty-AARS nie wiążą się do termicznie zdenaturow anych enzymów [56], Większość przeciwciał tw orzy swoiste kompleksy z jedną syn- tetazą am inoacylo-tR N A , ale w przypadku przeciwciał skierow anych przeciwko syntetazie izoleucylo-tRNA (anty-OJ), k tó ra jest składnikiem kom pleksu wielosyntetazowego, im m unoprecypitacji ulega cały kompleks. Jest to wyjątek, w którym jeden rodzaj przeciwciał rozpoznaje więcej niż jedną syntetazę [55, 56]. Ponadto znaleziono anty-AARS skierow ane jednocześnie przeciwko AlaRS i tR N A Ala [56, 57]. Najczęściej spotykanym i w surowicy są przeciwciała anty-Jo-1, skierowane przeciwko HisRS, występujące u 35-45% cierpiących na m yositis [56]. Pom im o, że surowice poszczególnych pacjentów zawierają zróżnicowane spektrum poliklonalnych anty-Jo-1, wszystkie one rozpoznają praw dopodobnie ten sam fragm ent struktury HisRS. Surowice zawierające przeciwciała anty-Jo-1, oprócz im m unoprecypitacji HisRS, w ytrącają także tR N A Hls. Przypuszcza się, że anty-Jo-1 uniemożliwiają dysocjację AARS-tRNA i w ten sposób inhibują działanie HisRS [58]. Przeciwciała anty-Jo-1 obniżają katalityczną aktyw ność ludzkiej syntetazy histydylo- -tRNA o 90% . U innych kręgowców inhibicja wynosi: 89% dla gadów , 83% dla ptaków i 52% dla ryb. Jak z tego wynika spadek aktywności HisRS powodowany

przez anty-Jo-1 maleje wraz ze wzrostem odległości filogenetycznej danej grom ady systematycznej od człowieka. W iadom o również, że aktyw ność syntetaz histydylo-tRN A z drożdży, glonów i bakterii nie zmienia się pod wpływem anty-Jo-1, co jednoznacznie sugeruje, że epitopy HisRS rozpoznaw ane przez anty-Jo-1 są stałe dla enzymów zwierzęcych.

Dotychczas niewiele w iadom o o m olekularnym mechanizmie pow staw ania myositis. Przypuszcza się, że przeciwciała powstają początkow o jak o wynik im munologicznej odpowiedzi organizm u na obecność obcego antygenu, który na zasadzie m olekularnej mimikry przypom ina strukturę białek gospodarza. Potwierdzeniem tego może być tworzenie kom pleksu syntetaz am inoacylo-tRNA i wirusowych RNA, które mają strukturę podobną do cząsteczek tR N A (ang. tR N A -like structure) [57].

A rtykuł otrzymano 15 lutego 1995 r.Zaakceptowano do druku 20 sierpnia 1995 r.

Piśmiennictwo

1. S c h i m m e l P (1987) Ann Rev Biochem 56: 125-1582. C h i u MI , M a s o n T L , F i n k G R (1992) Genetics 132:3. C s a n k C, M a r t i n d a l e D W (1992) J Biol Chem 267:

4592-45994. F e r b e r S, C i e c h a n o v e r A (1987) N ature (Land) 326:

808-8115. S i v a r a m P, D e u t s c h e r M P (1990) Proc N a tl Acad Sei

USA 87: 3665-36696 . L a p o i n t e J, G i e g e R (1991) w: T ransla tion In E ukariotes,

H. Trachsel wyd., 35-517. C h a r l i e r J, S a n c h e z R (1987) Biochem J 248: 43-518 . I t o K, K a w a k a m i K, N a k a m u r a Y (1993) Proc N atl

Acad Sei USA 90: 302-3069. P u t z e r H, B r a k h a g e A, G r u n b e r g - M a n a g o

M (1990) J Bacteriol 172: 4593-460210. M i r a n d ę M (1991) Progress in N uci Acids Ress & M ol Biol

40: 95-14211. M e i n n e l T, M e c h u l a m Y. a n d B l a n q u e t S (1995)

W: In Soll, D., R ajB handary, U. (ed.), tRNA: Structure, B iosynthesis, and Function. American Society for M icrobiology, W ashington, pp. 251-292.

12. S i v a r a m P, V e l l e k a m p G, D e u t s c h e r M P (1988) J Biol Chem 263: 18891-18896

13. C e r i n i C, K e r j a n P, A s t i e r M, G r a t e c o s D, M i r a n d ę M, S e m e r i v a M (1991) E M B O J 10:4267-4277

14. C l e m e n s M J (1990) Trends Biochem Sei 15: 172-17515. M o t o r i n YA, W o l f s o n A D , O r l o v s k y AF , G i a n -

d i 1 i n K L (1988) FEBS Lett 238: 262-26416. O g a t a K, K u r a k a s h i A, T a n a k a S, O h s u e H,

T e r a o K (\9 9 \) J Biochem 110: 1030-103617. O g a t a K, K u r a h a s h i A, K e u m o c h i N, T e r a o

K (1991) J Biochem 110: 1037-104418. M o r a s D (1992) Trends Biochem Sei 17: 159-16419. S c h i m m e l P (1991) Trends Biochem Sei 16: 1-320. B r i c k P, B h a t T N , B l o w D M (1989) J M ol Biol 208:

83-9821. D o u b l i e S, B r i c o g n e G, G i l m o r e C, C a r t e r C W

(1995) Structure 3: 17-3122. B r u n i e S, Z e l w e r C, R i s l e r J L (1990) J M ol Biol 216:

411-42423. O n e s t i S, M i l l e r AD, B r i c k P (1995) Structure 3:

163-17624. F u j i n a g a M, B e r t h e t - C o l o m i n a s C, Y a r e m -

c h u k AD, T u k a l i MA , C u s a k S (1993) J M ol Biol 234: 222-233


25. C u s a c k S, B e r t h e t - C o l o m i n a s C, H a r t l e i n M, N a s s a r N, L e b e r m a n R (1990) Nature (Lond) 347: 249-255

26. R o u l d M A , P e r o n a J J, S o l l D, S t e i t z T A (1989) Science 246: 1135-1142

27. R u f f M, K i r s h n a s w a m y S, B o e g l i n M, P o t e r s z - r a a n A, M i t s c h l e r A, P o d j a r n y A, R e e s B, T h i e r r y J C , M o r a s D (1991) Science 252: 1682-1689

28. B i o n V, Y a r e m c h u k AD , T u k a l i MA , C u s a k S (1994) Science 263: 1404-1410

29. M o r a s D (1990) N ature (Lond) 344: 195-19730. C h a n g P K , D i g n a m J D (1991) J Biol Chem 265: 20898-

2090631. B u r b a u m J J, S c h i m m e l P (1991) J Biol Chem 266:

16965-1696832. C u s a c k S, H a r t l e i n M, L e b e r m a n R (1991) Nucl

Acids Res 419: 3489-249833. S t e p a n o v V G , M o o r NA , A n k i l o v a VN, L a v r i k

O I (1992) F E B S Lett 311: 192-19434. W a y e M M W , W i n t e r G, W i l k i n s o n AJ , F e r s h t

A R (1983) E M B O J 2: 1827-182935. J a s i n M, R e g a n L, S c h i m m e l P (1983) N ature (Lond)

306: 441-44736. J a k u b o w s k i H (1991) EM BO J 10: 593-59837. C r a m e r F, F r e i s t W (1987) Acc Chem Res 20: 79-8438. S t r y e r L (1988) W: Biochem istry wyd. W.H. Freem an and

C om pany New York39. S c h u 1 m a n L H (1991) Progress in Nucl Acids Res & M ol Biol

41: 23-8840. D e l a r u e M, M o r a s D (1993) BioEssays 15: 675-68741. M o i n e H, E h r e s m a n n B, R o m b y P, E b e l J P ,

G r u n b e r g - M a n a g o M, S p r i n g e r M, E h r e s m a n n C (1990) Biochem Biophys Acta 1050: 343-350

42. R o m b y P, B r u n e i C. C a i l l e t J, S p r i n g e r M, G r u n b e r g - M a n a g o M, W e s t h o f E, E h r e s m a n n

C, E h r e s m a n n B (1992) Nucleic Acids Res 20: 5633-564043. L a n k e r S, B u s h m a n J L, H i n n e b u s c h AG, T r a -

c h s e l H, M u e l l e r P P (1992) Cell 70: 647-65744. L a m b o w i t z A M , P e r l m a n P S (1990) Trends Biochem

Sci 15: 440-44445. M a n s R M , P l e i j C W A , B o s c h L (1991) Eur J Biochem

201: 303-32446. C h e r n i a c k A D , G a r r i g a G, K i t t l e J D , A k i n s

RA, L a m b o w i t z A M (1990) Cell 62: 745-75547. G u o Q, L a m b o w i t z A M (1992) Genes & Development 6 :

1357-137248. M o h r G, L a m b o w i t z A M (1991) N ature (Lond) 354:

164-16749. K a m p e r U, K u c k U, C h e r n i a c k A D , L a m b o w i t z

A M (1992) M ol Cell Biol 12: 499-51150. Z a m e c n i k P (1983) Anal Biochem 134: 1-1051. L e e P C , B o c h n e r BR, A m e s B N (1983) Proc N atl Acad

Sci USA 80: 7496-7500.52. J a h n D, O ’ N e i l l G P , V e r k a m p E, S o l l D (1992)

Plant Physiol Biochem 30: 245-25353. J a h n D (1992) FEBS Lett 314: 77-8054. C h n g T E , W e g m a n n B, W a n g W (1990) Plant Physiol

93: 1641-164955. T a r g o t t I N, T r i e n E P , M i l l e r F W (1993) J Clinic

Invest 91: 2556-256456. T a r g o t t I N (1993) J Investig Dermatol 1: 1165-123557. T a r g o t t I N, A r n e t t F C , R e i c h l i n M (1988) Arth

ritis & Rheumatism 31: 515-52458. M a t h e w s MB , B e r n s t e i n R M (1983) N ature (Lond)

304: 177-17959. B u n n C C , M a t h e w M B (1987) Science 238: 1116-111960. T a r g o f f I N, T h i e n E P , P l o t z P H , M i l l e r F W

(1992) Arthritis & Rheumatism 35: 821-83061. S a l o m o n R, L i t t a v e r U Z (1974) N ature (Lond) 249:

32-34

Uprzejmie zaw iadam iam y PT Koleżanki i PT Kolegów o przeniesieniu siedziby Zarządu G łównego

Polskiego To w arzys tw a Biochemicznego na teren Instytutu Biologii Doświadczalnej im. M . Nenckiego

pokój 632 i 633

Obecny adres:

Polskie T o w arzys tw o Biochemiczne ul. Pasteura 3, 02-093 W arszawa

Tel. bezpośredni 658 20 99 Tel. przez centralę 659 8571 w . 352

Fax 22 5342

Dyżury biura Zarządu odbyw ać się będą jak dotychczas w e w to rk i w godz 12-18


Serynowo/treoninowe fosfatazy fosfoproteinowe w tkance mózgowej

Serine/Threonine phosphoprotein phosphatases in brain tissue

LUDMIŁA ŻYLIŃSKA1, LILLA LACHOWICZ2

Spis treści:

I. WstępII. Charakterystyka fosfataz fosfoproteinowych w tkance

nerwowejII-l. Fosfataza PP1

II-1A. Regulacja aktywności PP1 przez DARPP-32

II-2. Fosfataza PP2A 11-3. Fosfataza PP2BII-4. Fosfataza PP2C11-5. Fosfataza PP3II-6. Inhibitory fosfataz fosfoproteinowych

III. Udział defosforylacji białek w procesach neuronalnych

Wykaz stosowanych skrótów: NM D A kwas N -m etylo D-asparaginowy; PKA — kinaza białkowa zależna od cAM P; PK C — kinaza białkow a zależna od C a 2+ i fosfolipidów; C aM -kinaza II — wielofunkcyjna kinaza białkow a zależna od C a 2+ i kalm oduliny; LTP długotrw ałe wzmocnienie synaptyczne (ang. lo n g -te rm p o ten tia tio n ): LTD

długotrw ałe osłabienie synaptyczne (ang. lo n g -te rm de- p re ss io n ); cA M P — cykliczny adenozynom onofosforan; cG M P — cykliczny guanozynom onofosforan; CaM — kal- m odulina; D A R PP-32 — (ang. d o p a m in e a nd c yc lic A M P - re g u la ted p h o sp h o p ro te in ), naturalny białkowy inhibitor fosfatazy PP1; OA — kwas okadejowy (ang. o k a d a ic a c id ); D-APV — kwas D-am ino-5-fosfonowaIerianowy, an tagon ista receptorów N M D A .

I. Wstęp

O dw racalna fosforylacja białek w tkance nerwowej uw ażana jest obecnie za jeden z głównych m echanizmów kontrolujących w ew nątrzkom órkow e procesy takie jak; transport błonowy, neurosekrecja, przew odnictwo kanałów jonow ych czy sekwencja wydarzeń odpowiedzialnych za zjawisko pamięci. Fosforylacja seryny, treoniny lub reszt tyrozylowych przez specyficzne kinazy białkowe moduluje ich funkcje biologiczne, na skutek zm iany konformacji białek. W większości białek neuronalnych fosforylowana jest seryna, w niektórych treonina, w niewielu natom iast tyrozyna. Często także występuje w białkach kilka miejsc fosforylacji. Poszczególne z nich m ogą być fosforylowane

1 Dr, 2 prof. dr hab., II Zakład Biochemii Instytutu F izjologii i Biochemii, A.M. ul. Lindleya 6, 90-131 Łódź

Contents:

I. IntroductionII. Characterization of phosphoprotein phosphatases in ner-

vous tissueII-l. Phosphatase PP1

II-I A. Régulation of PP1 activity by DARPP-32II-2. Phosphatase PP2AII-3. Phosphatase PP2BII-4. Phosphatase PP2CII-5. Phosphatase PP311-6. Inhibitors of phosphoprotein phosphatases

III. The evidence of proteins déphosphorylation in neuralprocesses

przez jedną kinazę, choć wykazano też, że pojedyncze miejsca ulegają fosforylacji katalizowanej przez różne kinazy białkowe. Aktywność kinaz białkowych regulowana jest przez wiele czynników m.in. w tórne przekaźniki, allosteryczne efektory oraz fosforylację.

Defosforylacja białek, stanowiąca mechanizm wyłączający procesy urucham iane przez kinazy białkowe, przeprow adzana jest przez specyficzne fosfatazy fosfoproteinowe, jednak ich rola w tkance nerwowej nie jest, jak dotąd, w pełni poznana. W 1989 r. w tomie 39 Post Biochem [1] ukazała się praca przeglądowa poświęcona fosfatazom białkowym, natom iast niniejszy artykuł ma na celu podsum ow anie obecnie dostępnych informacji, dotyczących występowania i udziału seryno- w o/treoninow ych fosfataz białkowych w procesach zachodzących w tkance nerwowej.

Pierwszym kryterium podziału fosfataz białkowych była ich zdolność do specyficznej defosforylacji podjednostki (3 kinazy fosforylazowej oraz wrażliwość na inhibicję pow odow aną przez nanom olarne stężenia dwóch małych, term o- i kw asoodpornych białek, n a zwanych inhibitorem 1 i inhibitorem 2. Cechy te wykazywał typ 1 fosfataz (PP1). Typ 2 (PP2) preferencyjnie defosforylował podjednostkę ot kinazy fosforylazowej oraz wykazywał brak wrażliwości na inhibitory 1 i 2. Podział typu 2 na podtypy 2A, 2B i 2C nastąpił na podstawie kolejnego kryterium , jakim była obecność jonów dwuwartościowych, niezbędnych do aktywacji poszczególnych fosfataz. PP2A nie wymaga żadnych jonów , PP2B osiąga pełną aktywność w’ obecności C a2 + , natom iast PP2C zależna jest od jonów M g2 + .


Należy podkreślić, że ze względu na wszechobecność fosfataz białkowych, kryteria te mają zastosow anie dla enzymów występujących w różnych tkankach i o rganizmach.

Dotychczas poznano około 100 fosfataz białkowych, przy czym około 1/3 stanow ią fosfatazy seryno- w o/treoninow e [2, 3]. Klasyfikacja fosfataz fosfoproteinowych oraz wymienione wyżej kryteria, zap roponowane przez I n g e b r i t s e n a i w s p. [4, 5], mimo upływu lat nie straciły swojej aktualności. Z wyjątkiem PP2B, pozostałe fosfatazy defosforylują dość dużą ilość substratów . W przeciwieństwie do kinaz białkowych, nie została w yodrębniona charakterystyczna sekwencja am inokw asow a, ulegająca specyficznej defosforylacji. W oparciu o dość dużą homologię sekwencji podjednostek katalitycznych czterech typów fosfataz uważa się, że wywodzą się one z tego samego drzewa genealogicznego [6], Największą zbieżność sekwencji posiadają PP1 i PP2A, mniejszą PP2B, natom iast największe różnice obserwuje się dla typu PP2C. Z tego pow odu PP2C często trak tow ana jest, jako niezależna rodzina enzymów. Dość ciekawą informacją uzyskaną w ostatnich latach, choć na razie nie dotyczącą tkanki nerwowej, było wykazanie, że dla obu głównych typów fosfataz, równie dobrym substratem jak fosfoseryna czy fosfotreonina, może być fosfohistydyna [7].

W ostatnich latach zidentyfikowano także kilka nowych, serynowo/treoninowych enzymów, nie spełniających klasycznych kryteriów opracowanych przez I n g e b r i t s e n a i ws p . Przykładem może być fosfataza PP3, aktyw ow ana w obecności inhibitora 2 [8].

II. Charakterystyka fosfataz fosfoproteinowych z tkanki nerwowej

II-l. Fosfataza PP1

Fosfataza PP1 występuje głównie jako forma związana z błonam i (ang. particulate fraction). W ho- m ogenatach mózgowych 50% aktywności fosfatazowej sedym entuje przy 10.000 x g, a do 70% przy 100.000 x g [6]. Obecność fosfatazy PP1 w ykryto we frakcji określanej jako połączenia synaptyczne (ang. synaptic junction), k tórą uzyskiwano w procesie różnicowego ultraw irow ania hom ogenatów z różnych obszarów mózgowia [9]. Frakcja ta zawiera błony synaptyczne, m ateriał obecny w szczelinach synaptycznych oraz tzw. gęstości postsynaptyczne. Z ostatnich badań wynika, że fosfataza PP1 występuje głównie w gęstościach postsynaptycznych, gdzie stw ierdzono także duże ilości kinazy białkowej zależnej od C a 2 + i C aM [10]. W ykazano ponadto udział PP1 w procesie endogennej defosforylacji podjednostki a C aM -kinazy II. Tak więc wcześniejsze obserwacje zostały rozszerzone o dokładniejszą lokalizację fosfatazy PP1, co pozw ala na bardziej precyzyjną analizę procesów neurotransm isji. Z badań C o h e n a i ws p . [11]

wynika, że ponad 90% aktywności fosfatazowej typu 1 w ekstraktach z tkanki mózgowej, a także z w ątroby i mięśni szkieletowych królika, ulegało zaham ow aniu po 15 min. inkubacji w obecności 0.1 pM stężenia inhibitora 1 oraz 0.2 pM stężenia inhibitora 2.

O prócz aktywnej formy PP1 w cytozolu kom órek nerwowych stwierdzono także występowanie nieaktywnej fosfatazy białkowej, nazwanej PP 1-1 [12]. Początkow o określana była jako fosfataza zależna od M gATP, gdyż do aktywacji niezbędny był ten kom pleks, a także czynnik regulatorow y FA. Czynnik ten został zidentyfikowany jako zależna od cA M P i niezależna od C a2+ kinaza białkowa [13]. W synaptoso- mach kory mózgowej Y a n g i ws p . [14] wykazali obecność w cytozolu nieaktywnej formy PP1, na to miast w błonach synaptosom alnych — nieaktywnego czynnika FA. W edług autorów , aktyw acja FA następuje poprzez uwolnienie go do synaptozolu, wskutek obniżenia procentowego udziału anionow ych fosfolipidów błonowych, głównie fosfatydyloinozytolu (PI) oraz fosfatydyloseryny (PS). Nie wyklucza się możliwości, że te fosfolipidy wiążą się z dom eną katalityczną czynnika FA, powodując jego dezaktyw ację. Za degradację PS i PI w błonie odpow iedzialna jest fosfolipaza C, dlatego też autorzy sugerują, że uruchomienie przez ten enzym dalszych etapów kaskady przem ian fosfolipidowych, może stanow ić skuteczny m echanizm kontrolujący transdukcję sygnałów w centralnym układzie nerwowym. Również badania Y a n - g a i w s p. [15] wykazały, że czynnik FA jest potencja lną i unikatow ą kinazą białek M AP 2 i tau, regulującą funkcje m ikrotubul mózgowych.

II-1A. Regulacja aktywności PP1 przez DARPP-32

Cytosolowe białko D A RPP-32 (ang. dopamine and cyclic A M P-regulated phosphoprotien), występujące głównie w tkance nerwowej jest specyficzną formą inhibitora 1, hamującego fosfatazę PP1 [16]. W porów naniu z inhibitorem 1, białko to zawiera dodatkow o 36 reszt aminokwasow ych w karboksylow ym końcu cząsteczki i składa się z 202 am inokwasów. Ciężar m olekularny w żelu poliakryloam idowym z SDS oszacowano na 32 kDa, wyznaczony natom iast z sekwencji aminokwasowej wynosi 22.1 kDa. Form a aktyw na inhibitora powstaje po ufosforylowaniu przez PKA pojedynczej reszty treoniny (Thr-34). (Ryc. 1). Specyficzna defosforylacja tego miejsca przez fosfatazę PP2B, zlokalizow aną w tych samych obszarach m ózgowia co D A RPP- -32, powoduje zniesienie własności inhibitorow ych i pośrednio aktywację fosfatazy PP1 [6]. DARPP-32 występuje przede wszystkim w' neuronach posiadających receptory dopam inow e D -l [17, 18], W ekstraktach jąder ogoniastych wołu stanowi około 0.25% całkowitego białka. Jego obecność w ykazano również w zwojach podstawy mózgu, splocie naczyniów kowym, prążkowiu, istocie szarej pnia mózgu, korze


Ryc. 1. Schem at regulacji fosfatazy PP1 przez DA RPP-32.Białko D A R PP-32 związane z fosfatazą PP1 utrzym uje enzym w form ie nieaktywnej. Fosforylacja białka przez kinazę A pow oduje jego odłączenie i tym samym uaktyw nia fosfatazę. Defosforylację D A R PP-32 do postaci łączącej się ponow nie z PP1 przeprow adza kalcyneuryna (PP2B). Aktyw ne form y enzym ów biorących udział w regulacji zaznaczono gwiazdką. PK A — kinaza białkow a zależna od cyklicznego A M P(cA M P), PP2B — fosfataza fosfobiałkowa typu 2, regulow ana przez kalm odulinę. Pozostałe objaśnienia w tekście. Wg [27], [44], [47] zmodyfikowane.

mózgowej oraz — na niższym poziomie — w móżdżku [19]. S tała inhibicji dla D A RPP-32 wynosi ~ 1 nM . W centralnym układzie nerwowym szczura, w przeciwieństwie do powszechnie występującego inhibitora 1, D A R PP-32 w bardzo dużym stężeniu znajduje się przede wszystkim w zwojach podstawy mózgu. Z porównania stężenia obu białek w cyklu rozwojowym szczura wynika, że ich ekspresja zależna jest od wieku [19], Poniew aż inh ib ito r 1 i D A R PP-32 mają różną, choć nakładającą się lokalizację, może to sugerować, że ich funkcje nie są w pełni identyczne.

II-2. Fosfataza fosfoproteinowa PP2A

B adania ostatn ich lat pozwoliły na dokładniejszą charakterystykę tego enzymu. PP2A stanowi kom pleks trzech podjednostek: katalitycznej C (36-38 kDa), podjednostki towarzyszącej A (60-65 kDa) (ang. ac- cesory) i podjednostki regulatorowej B (54-74 kDa). H eterogenność PP2A, jak wykazano na podstawie analizy cD N A , wynika z obecności różnych podjednostek B (B-55 kD a, B'-54 kDa, B"-74 kDa) oraz wielu izoform podjednostek A i C [21]. O statnie prace sugerują, że podjednostka B reguluje aktywność k a ta lityczną i specyficzność substratow ą kom pleksu AC [22, 23]. Izoform y podjednostki katalitycznej C ko d o wane są przez co najmniej dwa geny. m RNA kodującego PP2A a jest około 10 razy więcej, niż m RNA dla PP2A P, natom iast m RNA dla PP2A a i PP2A P, jest dziesięciokrotnie więcej w mózgowiu i sercu, niż w innych tk an k ach [6, 21]. Obie izoformy charakteryzuje wysoki stopień hom ologii, osiągający 97% oraz niezależność od jonów dwuwartościowych. Badania D o b - r o w s k y ’ e g o i ws p . [24] wykazały natom iast, że ceram id, p ro d u k t m etabolizm u sfingolipidów, może

być specyficznym aktyw atorem fosfatazy PP2A z m ózgowia szczura. W zrost aktywności enzymu obserwowano w błonach synaptosom alnych inkubow anych w obecności polikationów takich, jak histon H 1 i sper- mina. Sperminie, obecnej w kom órce w dość dużym stężeniu (~ 1 mM), przypisuje się rolę m odulatora kom órkowej aktywności fosfatazowej [25]. W arto podkreślić, że aktywność PP1 zwykle jest przez te związki ham ow ana.

PP2A występuje w synaptosom ach zarów no jako forma cytozolowa, jak i związana z błonam i. Z szeregu badań przeprow adzonych na błonach kory mózgowia wynika, że aktyw ność PP2A stanow i 15-20% całkowitej aktywności fosfatazowej obecnej w tej frakcji, choć generalnie jest niższa, niż fosfatazy PP1. Stosunek aktywności fosfatazy PP1 do PP2A w błonach synaptosom alnych jest średnio 10 razy większy, niż obserwowany dla synaptozolu [9]. Takie zagęszczenie fosfataz wskazuje na istotny udział tych enzymów w regulacji stanu ufosforylowania białek w zakończeniach nerwowych.

II-3. Fosfataza fosfoproteinowa PP2B

Spośród wszystkich fosfataz, PP2B zw ana także kalcyneuryną, wydaje się być najlepiej zbadanym enzymem w tkance nerwowej. K alcyneuryna wyizolowana z ekstraktów mózgowych jest heterodimerem , składającym się z podjednostki katalitycznej kalcyneuryny A (61 kD a) oraz podjednostki regulatorowej — kalcyneuryny B (19 kDa), podobnej do kalm oduliny (CaM ) i zawierającej 4 miejsca wiążące C a2+ [21, 26]. Identyczność sekwencji am inokwasowej między CaM i kalcyneuryną B wynosi ~ 35% [6], W obecności fizjologicznego stężenia wapnia, kalm odulina także aktywuje PP2B, tworząc stechiom etryczny kom pleks 1:1, ze stałą powinowactwa K a = 0.1 nM [27]. Choć PP2B stanowi około 1% całkowitego białka w ekstrak tach mózgowia, to posiada aktyw ność porów nywalną z enzymem mięśni szkieletowych, gdzie jego ilość szacuje się na około 0.3% białka. Sugeruje to, że aktywność specyficzna enzymu w m ózgowiu może być niższa.

K alcyneuryna A występująca w tkance nerwowej różnych ssaków wykazuje im m unologiczną heterogenność i obecna jest w postaci przynajm niej trzech izoform [28], Dwie z nich — kalcyneuryna A a i A (3 — są produktam i dwóch różnych genów. U człowieka i wołu występuje natom iast form a (3 II, różniąca się sekwencją w N- i C -term inalnych fragm entach cząsteczki.

Funkcjonalne dom eny podjednostki katalitycznej wykazują dość konserwatywny charakter. W N -koń- cowej części występuje dom ena regulatorow a, posiadająca subdom eny wiążące CaM i kalcyneurynę B oraz subdom enę autoinhibitorow ą. W C-term inalnej części podjednostki A występuje miejsce, które in vitro ulega fosforylacji przy udziale PK C i C aM -kinazy II


[29]. Proces ten zwiększa Km dla substratów . W reak cji defosforylacji kalcyneuryny fosfataza PP2A była zdecydowanie bardziej skuteczna niż PP1. Ponieważ w oczyszczonej kalcyneurynie znajduje się około 0.6 rów now ażników endogennego fosforanu na 1 mol podjednostki A [29], powyższe obserwacje m ogą sugerować, że in vivo procesy odwracalnej fosforylacji stanow ią rzeczywisty m echanizm regulacji aktywności PP2B.

K alcyneuryna B i C aM pełnią różną rolę w m echanizmie aktyw acji PP2B przez jony wapnia. W apń zw iązany z C aM wymusza przemieszczenie subdom eny au toinhibitorow ej i zwiększa Vmax , zaś związany z kalcyneuryną B, zwiększa powinow actwo fosfatazy do substra tu [30]. Sekwencje am inokwasowe kalcyneuryny B oraz dom eny wiążącej ją w kalcyneurynie A są jedynym i z bardziej konserw atywnych obszarów w PP2B.

W N -term inalnej części kalcyneuryny B mózgowia wołu występuje m irystylow ana glicyna, ułatw iająca łączenie się enzym u z błonam i [6]. Z aproponow ano dość interesującą hipotezę, przypisującą kalcyneurynie B rolę regu la to ra w oddziaływaniach z fosfolipidami[31]. Proces zachodzący dwustopniow o w pierwszym etapie pow odow ałby wiązanie natywnej kalcyneuryny z fosfolipidami w sposób zależny od wapnia, w drugim zaś, konform acyjna zm iana podjednostki B, specyficzna wobec substratu , zmieniałyby aktyw ność enzymu.

Fosfataza PP2B znajduje się przede wszystkim w neuronach, choć w różnym stężeniu, w zależności od subpopulacji poszczególnych neuronów. W ewnątrz kom órki, w perikarionie, dendrytach, aksonach i zakończeniach aksonów , występuje w porów nyw alnych ilościach. G eneralnie zaś tkanka m ózgowa zawiera 10 do 20 razy więcej PP2B niż inne tkanki. Wysoki poziom obserwuje się w prążkowiu, jądrze ogoniastym, gałce bladej, oraz istocie szarej pnia mózgu, um iarkow ana ilość znajduje się w warstwach k o ro wych. Dość obficie natom iast kalcyneuryna występuje w zakończeniach nerwowych wzgórza. W hipokam pie najwięcej PP2B jest w kom órkach piram idalnych regionu CA1-CA2 oraz w kom órkach granularnych zakrętu zębatego. W m óżdżku najintensywniej występuje w warstwie m olekularnej, a w mniejszym stężeniu w cytoplazm ie kom órek Purkinjego [28].

II-4. Fosfataza fosfoproteinowa PP2C

Ten enzym jest najmniej poznaną fosfatazą seryno- w o/treoninow ą. W ystępuje jako m onom er o ciężarze m olekularnym 43 kD a i do pełnej aktywacji wymaga jonów M g2+ [6]. M aksym alną aktyw ność w w arunkach in vitro osiąga przy 2 mM M g2 + . Dotychczas zidentyfikow ano dwie izoformy tego enzymu — PP2C a i PP2C P [3]. Sekwencja am inokw asow a PP2C wykazuje b rak hom ologii z podjednostkam i katalitycznymi innych typów fosfataz, jak również brak jest typowej dom eny katalitycznej. W mózgowiu królika

PP2C posiada wyższą aktywność niż w mięśniach szkieletowych, co może sugerować jej specyficzną rolę w układzie nerwowym [5].

II-5. Fosfataza fosfoproteinowa P P 3

Przykładem serynowo/treoninowej fosfatazy białkowej, wykraczającej nieco poza klasyczne kryteria Ingebritsena jest enzym wyizolowany z m ózgu wołu, nazwany PP3 [8]. Białko o ciężarze m olekularnym 36 kD a nie wymagało do swej aktyw ności dw uw artoś- ciowych kationów . Zarów no kwas okadejow y jak i m ikrocystin — LR ham owały PP3 w sposób analogiczny do om ówionych wyżej typów fosfataz. Interesującym spostrzeżeniem był fakt nietypowego, bo ak tywującego działania inhibitora 2. Podjednostka (3 kinazy fosforylazowej była natom iast specyficznie defos- forylow ana przez ten enzym. C harakterystyka przy użyciu specyficznych przeciwciał, sekwencja am inokwasow a oraz badanie specyficzności substratow ej, wykluczyły możliwość, że PP3 jest izoform ą innych, poznanych dotychczas fosfataz serynow o/treoninowych.

II-6. Inhibitory fosfataz fosfoproteinowych

O prócz naturalnych białek — inhibitorów 1 i 2 oraz D A R PP-32 — regulujących aktyw ność fosfatazy fos- fobiałkowej PP1, dodatkow ym , wyjątkow o użytecznym narzędziem w identyfikacji poszczególnych typów fosfataz okazał się kwas okadejowy (OA). Jest to polieterowy kwas tłuszczowy wyizolowany z gąbki Halichondria okadaii (Ryc. 2). Sposób jego działania polega na ham ow aniu aktywności PP1 oraz PP2A[32]. Z dotychczasowych badań wynika, że kwas okadejow y nie wiąże się z centrum katalitycznym fosfataz, a łączy się praw dopodobnie z C -term inalną dom eną cząsteczki obu enzymów. Jako związek hydrofobowy łatwo przechodzi przez błony kom órkow e, jednak m olekularny mechanizm inhibicji pozostaje niewyjaśniony. Aktywność PP2A ulega całkowitemu zaham ow aniu już przy 1 nM stężeniu kw asu okadejowego. IC 50 dla PP1 wynosi 10-15 nM , zaś przy 1 pM OA obserwuje się całkowity brak aktyw ności fosfatazy[33]. Interesującą inform acją jest spostrzeżenie, że inhibitor 2 oraz kwas okadejowy działają addytywnie[11]. W ew nątrzkom órkow e stężenie PP1 i PP2A mieści się w zakresie 0.1-1.0 pM , dlatego w badaniach in vitro stosowane są często wyższe stężenia kwasu okadejow ego [34]. Przy stężeniu nie przekraczającym 5 pM OA, fosfataza PP2B wykazuje brak wrażliwości

Ryc. 2. W zór kwasu okadejowego.


na ten inhibitor [35]. W ocenie aktywności fosfatazy PP2C często wykorzystywany jest fakt całkowitej oporności tego enzymu na kwas okadejowy [33]. W podobnym celu używana jest też kalikulina A (Ryc. 3), toksyna izolow ana z gąbki Discodermia calyx, specyficznie blokująca aktywności fosfataz PP1 i PP2 [36]. M im o odmiennej struktury, efekt ham ow ania aktyw ności PP2A jest analogiczny, natom iast w przypadku PP1 skuteczność kalikuliny jest nawet 100-krotnie większa. PP1 i PP2A skutecznie ham ow ane są także przez nodularin, cykliczny pentapeptyd syntetyzow any przez glony [37]. Dość precyzyjnie pozwala różnicować fosfatazy trifluoperazyna, antagonista kal- m oduliny, stanowiącej naturalny aktyw ator fosfatazy PP2B [38]. O statn io często stosowane są podczas badania aktywności kalcyneuryny leki im m unosupre- syjne takie, jak cyklosporyna A i FK-506, będące wysoce specyficznymi inhibitoram i tego enzymu [39, 40]. Należy dodać, że om ówione przykłady inhibitorów fosfataz białkowych stanow ią użyteczne narzędzie nie tylko w badaniu układu nerwowego, ale powszechnie są stosowane do ham ow ania aktywności fosf- atazowych w innych tkankach i organizm ach.

OH

Ryc. 3. W zór kalikuliny A.

III. D efo sfo ry la cja b iałek w procesach neuronalnych

Zew nątrzkom órkow e sygnały wywołują szereg m olekularnych wydarzeń poprzez regulację stanu ufosforylowania mniej lub bardziej wyspecjalizowanych białek w układzie nerwowym. W świetle dostępnej wiedzy trudno jest wyjaśnić wszystkie mechanizmy i etapy prowadzące do pow stania końcowej odpow iedzi kom órki nerwowej, lecz część procesów należy w tej chwili do nieco bardziej poznanych. Badania H a - a v i k a i ws p . [41] wykazały wpływ fosfatazy PP2A na aktywność kluczowego enzymu w procesie biosyntezy katecholam in — hydroksylazy tyrozynowej, ulegającej in vitro fosforylacji przez kinazę A, C aM -kinazę II oraz PKC. Fosfatazy PP1 i PP2A defosforylują także neurom odulinę (B-50, GAP-43, F -l) [42], Białko to spełnia wielorakie funkcje w kom órce, począwszy od

regulacji aktywności kinazy fosfatydyloinozytolo-4-fosforanu, uwalnianiu noradrenaliny, aż do udziału w procesie LT P (ang. long term potentiatioń), synaptycznym mechanizmie odgrywającym rolę w procesie uczenia się i pamięci [43].

Proces długotrw ałego osłabienia synaptycznego (LTD, ang. long term depressioń) wiązany jest nato miast ze skutecznością przechowyw ania informacji. Zjawisko to obserwowano w hipokam pie, korze m ózgowej i móżdżku, choć najbardziej dotychczas poznany przebieg tego procesu opisano dla kom órek Purkinjego [44, 45]. Kilka form LTD -hom osynap- tyczna, heterosynaptyczna czy tzw. typ niewrażliwy na D-APV, wyróżniono w kom órkach piram idalnych C l hipokam pa. N a podstawie badań przeprow adzonych na tym regionie M u l k e y i ws p . [46] zaproponow ali dość oryginalną koncepcję, według której za wystąpienie LTD odpowiedzialne są głównie fosfatazy białkowe, natom iast kinazy białkowe indukują LTP. O ba procesy m ogą stanowić odw racalną modyfikację jednego zjawiska. Krytyczne dla ich przebiegu jest zarówno stężenie, jak i równow aga między kinazami i fosfatazami występującymi w zakończeniach postsynaptycznych oraz obecność kalm oduliny, stym ulatora zarówno PP2B jak i C aM -kinazy II. Potencjalnym substratem dla tych oddziaływań może być także receptor glutam inianow y (GluRI). Jedna z form LTD występująca w hipokam pie wymaga aktywacji postsynaptycznych receptorów N M D A , zmiany postsynap- tycznego stężenia jonów C a2+ oraz aktywacji fosfataz[27], P roponow any model zakłada, że po przedłużonej stymulacji niską częstotliwością (1 Hz), wejście wapnia poprzez kanały związane z receptoram i N M D A powoduje powstanie kom pleksu C a2+/C aM (Ryc. 4). K om pleks aktywuje kalcyneurynę, ta zaś defosforyluje inhibitor 1 reaktyw ując fosfatazę P P L Fosfataza PP1, posiadająca szeroki zakres substratów (kinazy białkowe, podjednostki receptorów niezależnych od N M D A , czy fosfobiałka, odpowiedzialne za wytworzenie przypuszczalnych retrogradow ych przekaźników) urucham ia LTD. M odel ten posiada dużo cech praw dopodobieństw a m.in. ze względu na fakt, że kalcyneuryna wykazuje zdecydowanie wyższe pow inow actwo do kom pleksu C a2+/C aM (stała dysocjacji Kd = 0.1 nM), niż C aM -kinaza II (K d = 45 nM), której przypisuje się główną rolę w w ytw arzaniu LTP [27, 47]. K alcyneuryna może więc być bardzo istotnym elementem kontrolującym bądź różnicującym sekwencję wydarzeń, prow adzących do LTP i/lub LTD. Tę koncepcję potw ierdzają wyniki uzyskane przez L i e - b e r m a n a i M o d y ’ e g o [40]. PP2B aktyw ow ana jonam i wapnia wchodzącymi poprzez kanały N M D A skracała czas ich otwarcia, natom iast efekt ten był znoszony w obecności specyficznego inhibitora kalcyneuryny — FK 506. Niezależne badania przeprow adzono na kulturze neuronów hipokam pa z zastosow aniem innego inhibitora PP2B — kalikuliny A, a także kwasu okadejowego. W yniki pozwoliły na stwierdze-


Ryc. 4. Schem at indukcji LTP i LTD.W w arunkach stym ulacji wysoką częstotliwością (50 Hz), poprzez kanały związane z receptoram i N M D A następuje wejście do kom órki dużej ilości jonów wapniowych. W ysokie stężenie pow stającego kom pleksu C a2+/C aM preferencyjnie stym uluje cyklazę adenylową, odpow iedzialną za pow stanie cyklicznego AM P. cA M P powoduje w konsekwencji aktyw ację kinazy białkowej A. Istotnym i bezpośrednim efektorem dla kom pleksu C a2+/C aM jest także C aM - -kinaza II. N a skutek fosforylacji — przeprow adzonej przez obydwie kinazy — wielu specyficznych substratów , wytw arzane jest długotrw ałe wzmocnienie postsynaptyczne (LTP). Niewielki wzrost w ew nątrzkom órkow ego C a 2+ zachodzi rów nież poprzez kanały związane z receptoram i N M D A , po stymulacji niską częstotliwością (1 Hz). P o wstający kom pleks C a2+/C aM w tych w arunkach preferencyjnie stym uluje fosfatazę PP2B. Zaktyw ow any enzym defosforyluje inhibitor 1 i/lub białko DA RPP-32, a tym sam ym pow oduje uaktywnienie fosfatazy P P L Aktywne formy fosfataz defosforylują szereg substratów , prow adząc w efekcie do wytworzenia zjawiska długotrw ałego osłabienia synaptycznego (LTD). Pozostałe objaśnienia w tekście. Wg [27], [44] i [47] zmodyfikowane.

nie, że fosfatazy PP1 i PP2A zmniejszają aktywność kanałów typu N M D A , fosforyłowanych przez seryno- w o/treoninow e kinazy białkowe [48], W korze wzrokowej w ykazano udział fosfataz PP1 i PP2A w wytw arzaniu hom osynaptycznego LTD [49]. O bie fosfatazy nie wpływały natom iast na indukcję LTP.

K alcyneuryna w układzie nerwowym uczestniczy także w procesie wzrostu kom órek nerwowych. W kulturze neuronów móżdżku szczura w obecności inh ibitora PP2B — cyklosporyny A, następow ało zaham owanie wydłużenia aksonów [39]. Wysoki poziom kalceneuryny w mózgu wskazuje, że praw dopodobnie znajduje się tam wiele substratów dla tego enzymu. Z dotychczas poznanych, oprócz kanałów N M D A , b iałka M AP-2, białka K F o nieznanej jeszcze funkcji, występuje też tzw. G -substrat, obecny w kom órkach Purkinjego i specyficznie fosforylowany przez kinazę zależną od cG M P [6]. Dość dużą grupę stanow ią białka regulujące aktywność kinaz i fosfataz. N ależą do nich w spom niane już wcześniej inhibitor 1 i D A R PP-32, a także podjednostka RII kinazy A [28]. P rzeprow adzana in vitro przez PP2B defosforylacja zależnej od CaM fosfodiesterazy cA M P ak tywuje enzym, ułatw iając degradację cAMP. W hipo-

kam pie wysokie stężenie kalcyneuryny oraz CaM - kinazy II dają podstawę do sugestii, że oba enzymy kontrolują procesy wywoływane przez neurohorm ony i neurotransm itery zachodzące przy udziale wapnia [47], Wysoce praw dopodobne jest istnienie mechanizmu kaskadow ego w którym wapń, jak o bezpośredni czynnik, aktywuje kalcyneurynę. PP2B poprzez defos- forylację dość wąskiej grupy substratów aktywuje (bądź unieczynnia) zarów no kinazy białkowe, jak i inne fosfatazy, wykazujące aktywność wobec szerszej grupy substratów . W kom órkach pobudliwych kolejne zjawiska depolaryzacji i repolaryzacji wyrażane są następującym i kolejno po sobie procesam i fosforylacji i defosforylacji. Kalcyneuryna, z największą spośród fosfataz specyficznością substratow ą, m oduluje procesy wywoływane przy udziale C a2+ i cA M P zwłaszcza wtedy, gdy te przekaźniki regulują zjawiska antagonistyczne.

W asymetrycznym wzroście neuronów ważną funkcję spełnia białko tau, którego stopień ufosforylowania determ inuje prawidłowość tego procesu [50]. W chorobie Alzheimera zaobserw ow ano natom iast jego hiperfosforylację [51], G o n g i w s p. [52] wykazali, że fizjologiczne białko tau defosforylowane jest przez fosfatazy PP1 i PP2C, natom iast tylko PP1 była aktyw na wobec formy występującej w chorobie Alzheimera.

M imo wielu posiadanych już informacji, udział serynowo/treoninowych fosfataz w defosforylacji szeregu białek istotnych dla prawidłowego funkcjonow ania kom órek nerwowych, a zwłaszcza określenie fizjologicznego bądź patologicznego znaczenia tych procesów, pozostaje jeszcze do wyjaśnienia.

PodziękowaniePraca dofinansow ana w ram ach grantu KBN 4P05A 00209 (L.L.) oraz tem atu własnego 502-11-260 (L.Ż.).

A rtykuł otrzymano 10 kwietnia 1995 r.Zaakceptowano do druku 6 września 1995 r.

P iśm iennictw o

1. P a l e ń E (1989) Post Biochem 35: 363-3692. P i n n a LA, D o n e l l a - D e a n a A (1994) Biochem Biophys

Acta 1222: 415-4313. W a l t e r G, M u m b y M (1993) Biochem Biophys Acta 1155:

207-2264. I n g e b r i t s e n TS, C o h e n P (1983) Science 221: 331-3385. I n g e b r i t s e n TS, S t e w a r t AA, C o h e n P (1983) Eur

J Biochem 132: 297-3076 . C o h e n P (1989) Annu Rev Biochem 58: 453-5087. K im Y, H u a n g J, C o h e n P, M a t t h e w s H R (1993)

J Biol Chem 268: 18513-185188 . H o n k a n e n RE, Z w i l l e r J, D a i l y SL, K h a t r a BS,

D u k e l o w M, B o y n t o n A L (1991) J Biol Chem 266: 6614-6619

9. S h i e l d s S M, I n g e b r i t s e n T S, K e l l y P T (1985) J Neurosci 5: 3414-3422

10. D o s e m e c i A, R e e s e T S (1993) J Neurochem 61: 550-55511. C o h e n P, K l u m p p S, S c h e l l i n g D L (1989) FEBS Lett

250: 596-600


12. H e m m i n g s BA, Y e l l o w l e e s D, K e r n o h a n J C, C o h e n P (1981) Eur J Biochem 119: 443-451

13. Y a n g S - D, F o n g Y - L (1985) J Biol Chem 260: 13464-1347014. Y a n g S - D , Y u J - S , F o n g Y - L , L i u J - S (1992) Biochem

Biophys Res Commun 182: 129-13615. Y a n g S - D , Y u J - S , F o n g Y - L , L a i Y - G (1991) J Prot

Chem 10: 171-18116. W a l a a s SI , A s w a d D W, G r e e n g a r d P (1983) Nature

(Lond) 301: 69-7117. W a l a a s SI , G r e e n g a r d P (1984) J Neurosci 4: 84-9818. B e r g e r B, F e b v r e t A, G r e e n g a r d P, G o l d m a n -

R a k i c P S (1990) J Comp Neurol 299: 327-34819. N a i r n AC , H e m m i n g s H C , W a l a a s SI , G r e e n

g a r d P (1988) J Neurochem 50: 257-26220. H e m m i n g s H C , G i r a u l t J A, N a i r n AC, B e r t u z z i

G, G r e e n g a r d P (1992) J Neurochem 59: 1053-106221. C o h e n P, C o h e n P T W (1989) J Biol Chem 264: 21435-

2143822. I m a o k a T, I m a z u M, U s u i H, K i n o h a r a N, T a k e -

d a M (1983) J Biol Chem 258: 1526-153523. K a m i b a y a s h i C, E s t e s R, S l a u g h t e r C, M u m -

b y M C (1991) J Biol Chem 266: 13251-1326024. D o b r o w s k y RT , K a m i b a y a s h i C, M u m b y MC ,

H a n n u n Y A (1993) J Biol Chem 268: 15523-1553025. H a n Y - F , W a n g W, S c h l e n d e r K K , G a n j e i z a -

d e h M, D o k a s L A (1992) J Neurochem 59: 364-37426. S t e w a r t A A, I n g e b r i t s e n TS , M a n a l a n A,

K l e e C B , C o h e n P (1982) F EB S Lett 137: 80-8427. M u l k e y R M , E n d o S, S h e n o l i k a r S, M a l e n k a R C

(1994) N ature (Lond) 369: 486-48828. K l e e CB, G u e r i n i D, K r i n k s M H , D e C a m i l l i P,

S o 1 i m e n a M (1990) W: A. G uido tti (red) N eurotoxicity of Excitatory Am ino Acids, Raven Press, Ltd, New York, str 95-108

29. H a s h i m o t o Y, S o d e r l i n g T R (1989) J Biol Chem 264: 16524-16529

30. S t e m m e r P M , K l e e C B (1994) Biochemistry 33: 6859-686631. P o l i t i n o M, K i n g M M (1990) J Biol Chem 265: 7619-762232. B i a l o j a n C, T a k a i A (1988) Biochem J 256: 283-29033. H a y s t e a d T A J , S i m A T R, C a r l i n g D, H o n n o r RC,

T s u k i t a n i Y, C o h e n P, H a r d i e D G (1989) Nature (Lond) 337: 78-81

34. C o h e n P, H o l m e s C F B , T s u k i t a n i Y (1990) TIB S 15: 98-102

35. S im A T R , D u n k l e y P R , J a r v i e P E , R o s t a s J A P (1991) Neurosci Lett 126: 203-206

36. I s h i h a r a H, M a r t i n BL, B r a u t i g a n DL , K a r a - k i H, O z a k i H, K a t o Y, F u s e t a n i N, W a t a b e S, H a s h i m o t o K, U e m u r a D, H a r t s h o r n e D J (1989) Biochem Biophys Res Commun 159: 871-877

37. M a t s u s h i m a R, Y o s h i z a w a S, W a t a n a b e M F , H a r a d a K , F u r u s a w a M , C a r m i c h a e l W W , F u j i - k i H (1990) Biochem Biophys Res Comun 171: 867-874

38. I n g e b r i t s e n TS, F o u l k e s J G, C o h e n P (1983) Eur J Biochem 132: 263-274

39. F e r r e i r a A, K i n c a i d R, K o s i k K S (1994) M ol Biol Cell 4: 1225-1238

40. L i e b e r m a n D N , M o d y I (1994) N ature (Lond) 369: 235-239

41. H a a v i k J, S c h e l l i n g DL , C a m p b e l l D G , A n d e r s s o n K K , F i a t m a r k T, C o h e n P (1989) FEB S Lett 251: 36-42

42. L o v i n g e r D M , C o l l e y PA, A k e r s R F , N e l s o n RB, R o u t t e n b e r g A (1986) Brain Res 399: 205-211

43. S h a r k e y K A, C o g g i n s PJ , T e t z l a f f W, Z w i e r s H, B i s b y M A, D a v i s o n J S (1990) Neurosci 38: 13-20

44. M a l e n k a R C (1994) Cell 78: 535-53845. I t o M (1989) Annu Rev Neurosci 12: 85-10246. M u l k e y R M , H e r r o n CE , M a l e n k a R C (1994) Bio-

med Res 15: 83-9047. K l e e C B (1991) Neurochem Res 16: 1059-106548. W a n g L - Y, O r s e r BA, B r a u t i g a n D L , M a c D o

n a l d J F (1994) N ature (Lond) 369: 230-23249. K i r k w o o d A, B e a r M F (1994) J Neurosci (1994) 14:

3404-341250. T u c k e r R P (1990) Brain Res Rev 15:101-12051. S t e i n e r B, M a n d e l k o w E M , B i e r n a t J, G u s t k e N,

M e y e r HE , S c h m i d t B, M i e s k e s G, S o l i n g H D , D r e c h s e l D, K i r s c h n e r M W , G o e d e r t M, M a n d e l k o w E (1990) E M BO J 9: 3539-3544

52. G o n g CX, G r u n d k e - I q b a l I, D a m u n i Z, I q b a l K (1994) F EB S Lett 341: 94-98

Informacja Redakcji Acta Biochimica PolonicaZ satysfakcją informujemy Czytelników Postępów B iochem ii, że od 1995 roku została przywrócona przez Current Contents (ISI, U.S.A.) indeksacja Acta B iochim ica Polonica.


Regulacja wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2 + w komórkach niepobudliwych

Regulation of intracellular Ca2+ concentration in nonexcitable cells

BARBARA NIEWCZAS*

Spis treści:

I. WstępII. Wewnątrzkomórkowe magazyny wapnioweIII. Procesy wychwytu i uwalniania Ca2+ z wewnątrzkomór

kowych magazynów wapniowychIII-l. Procesy wychwytu Ca2 +III-2. Procesy uwalniania Ca2+ ze struktur subkomór-

kowych szybko wymieniających Ca2 +111-2.1. Kanały zaangażowane w procesie uwal

niania Ca2 +III-2.2. Inne czynniki uwalniające Ca2 +

III-3. Procesy uwalniania Ca2+ ze struktur subkomór- kowych wolno wymieniających Ca2 +

IV. Kontrola napływu Ca2IV-1. Mechanizmy napływu Ca2+ zależnego od stopnia

opróżnienia wewnątrzkomórkowych magazynów wapniowych

IV-2. Charakterystyka pojemnościowego napływu Ca2 + • Ik w u m

IV-3. Czynniki uczestniczące w procesie pojemnościowego napływu Ca2 +IV-3.1. Cytochrom P450IV-3.2. Czynnik indukujący napływ Ca21IV-3.3. Małe białko G

IV-4. Regulacja napływu Ca2+ przez fosforylację/defo- sforylację

V. Podsumowanie

Wykaz stosowanych skrótów: [C a 2 + ]c — stężenie wolnych C a 2+ w cytoplazm ie; I k w u m — przepływ ładunków dodatnich przez kanał wapniowy aktywow any po uwolnieniu C a2+ z w ew nątrzkom órkow ych magazynów; K W U M— kanał w apniow y w błonie plazmatycznej aktywowany przez uwolnienie C a 2+ z w ew nątrzkom órkowych m agazynów; Icrac-C a2+ — release activated C a2+ current; TG— tapsigargina; tB uB H Q — 2,5-di-(t-butylo)-l,4-benzohyd- rochinon; SŚ — siateczka śródplazm atyczna; BAPTA— kwas l,2-bis-(2-aminofenoksy) etano-N ,N ,N ',N '-tetraoc- towy; IP 3-trisfosfoinozytol; IP 4 — tetrafosfoinozytol; CNW— czynnik indukujący napływ C a2 + ; G T P — guanozyno- trójfosforan; G T P (y) S-guanozyno-5',3-0-(tris) — trójfos- foran; cG M P — 3',5'-cykliczny guanozynom onofosforan; CIC R — calcium induced calcium release, czyli proces uw alniania C a 2+ z w ew nątrzkom órkowych m agazynów wapniowych (zawierających w swojej błonie receptory riano- dinowe) aktyw ow any przez sam C a2 + .

* M gr, Insty tu t Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN , Z akład Biochemii K om órki, ul. Pasteura 3, 02-093 W arszaw a

Contents:

I. IntroductionII. Intracellular calcium storesIII. Calcium uptake and release from intracellular calcium

storesIII-l. Calcium uptakeIII-2. Calcium release from rapidly exchanging calcium

subcellular structuresIII-2.1. Channels involved in calcium releaseIII-2.2. Other factors of calcium release

III-3. Calcium release from slowly exchanging calcium subcellular structures

IV. Control of calcium influxIV-1. Mechanisms of store-operated calcium influxIV-2. Characteristic of capacitative calcium influx and

1CRACIV-3. Factors engaged in capacitative calcium influx

IV-3.1. Cytochrome P450IV-3.2. Calcium influx factorIV-3.3. Small protein G

IV-4. Regulation of calcium influx by phosphorylation/dephosphorylation

V. Conclusions

I. Wstęp

K ontro la stężenia wolnych C a2+ w cytoplazmie, [C a2 + ]c, ma zasadnicze znaczenie dla funkcjonow ania kom órki. Zwykłe w kom órce niepobudzonej [C a2 + ]c nie przekracza 10“ 7 M. Tak niskie stężenie C a 2+ jest charakterystyczne dla stanu spoczynkowego kom órki. W środowisku zew nątrzkom órkow ym stężenie C a2 + jest 10000-razy wyższe. Wiele czynników swoim działaniem doprow adza do podwyższenia [C a 2 + ]c. Zaliczamy do nich zarówno bodźce natury fizycznej (światło, pole grawitacyjne itd.), jak i chemicznej (hormony, czynniki wzrostu). K om órka o wyższym stężeniu C a2 + w cytoplazmie niż to, które występuje w niej w stanie spoczynkowym określana jest m ianem kom órki za- ktywowanej. Aktywacji kom órki niepobudliwej tow arzyszą zmiany w jej m etabolizm ie (np. aktywacja glikolizy w kom órce wątrobowej), przepuszczalności błon, kształcie, a także wydzielaniu substancji zm agazynowanych w pęcherzykach wydzielniczych (np. uwal


nianie insuliny z kom órek (3 trzustki). Tak więc procesy uczestniczące w kontroli stężenia C a2+ w cytoplazmie regulują przejście kom órki ze stanu spoczynkowego w aktywny i odwrotnie. U trzym anie właściwego poziomu [C a2 + ]c jest możliwe dzięki działaniu m echanizmów kontrolujących błonowy transport C a2 + : k an a łów, pom p wapniowych, wymieniaczy jonowych, jak również związków i organelli buforujących i wiążących ten kation. Kanały, pompy, wymieniacze jonowe zaan gażowane w transporcie C a2+ występują zarów no w błonie plazmatycznej, jak i w błonach wielu struk tu r subkom órkowych. N iektóre z tych struk tu r uważa się za m agazyny C a2 + .

II. Wewnątrzkomórkowe magazyny wapniowe

Lokalizacja m agazynów wapniowych w kom órkach niepobudliwych nie jest do końca wyjaśniona. C a2 + są wychwytywane przez takie struktury i organelle ko m órkowe jak; siateczka śródplazm atyczna, kom pleks Golgiego, pęcherzyki i granule wydzielnicze, endoso- my, lizosomy, m itochondria, a także jąd ro [5-10],

Om aw iane magazyny pod względem pełnionych przez nie funkcji, jak i tem pa wymiany C a2 + pom iędzy kom partm entam i kom órkow ym i są strukturam i hete- rogennymi. M ożna wyróżnić wśród nich ultrastruk- tury szybko i wolno wymieniające C a2 + . Szybko mobilizujące zm agazynowane C a2+ są zdolne do spow odow ania wzrostu [C a2 + ]c w czasie rzędu sekundy. W olno mobilizujące do uwolnienia C a2+ po trzebują minut, a nawet godzin [11].

Przestrzenie szybko wymieniające C a2+ występują wyłącznie w siateczce śródplazmatycznej. W yróżnia się w nich subkom partm enty wrażliwe na IP 3 oraz w rażliwe na rianodinę. Jednak na pytanie — jaki jest związek funkcjonalno-strukturalny pomiędzy nimi n a dal nie znamy odpowiedzi [11],

Stwierdzono, że IP 3 i kofeina uwalniają tylko 30- 40% całkowitej ilości C a2+ zm agazynowanych w wewnętrznych przestrzeniach kom órkowych [12]. Pozostałą część stanowią organelle i struktury wolno wymieniające C a2 + . Dawniej uważano, że jedyną ich lokalizacją są m itochondria. Stw ierdzono jednak, że ilość C a2+ uwolniona przez rozprzęgacze (związki niwelujące elektrochemiczny gradient występujący w poprzek wewnętrznej błony m itochondrialnej) nie odpow iada oczekiwanej różnicy (60-70% całkowitej ilości C a2+ zm agazynowanych w wewnętrznych przestrzeniach kom órkowych) [11]. U ltrastruktury wolno wymieniające C a2+ lokalizuje się obecnie także w kompleksie Golgiego, w tej części siateczki śródplazmatycznej, k tóra nie zawiera receptorów IP 3 i rianodinowych, w pęcherzykach wydzielniczych, endosom ach i lizosomach.

III. Procesy wychwytu i uwalniania C a2 + z wewnątrzkomórkowych magazynów wapniowych

III-I. Proces wychwytu Ca2 +

W czasie grom adzenia C a2+ w w ew nątrzkom órkowych strukturach m agazynujących pokonywany jest duży gradient chemiczny. W przypadku siateczki śródplazmatycznej potrzebna energia jest czerpana z hydrolizy ATP, reakcji katalizowanej przez Ca- ATP-azy [14]. W m itochondriach siłą napędową jest potencjał błonowy wytwarzany przez łańcuch oddechowy [13], natom iast w strukturach subkom órkowych o kwaśnym odczynie światła (lizosomach, cysternach trans Golgiego, granulach wydzielniczych, endosomach) jest nią elektroneutralna wym iana przebiegająca z udziałem antyporterów H + -C a2 + (antyporter — jest to białko nośnikowe, w budowane w dwuwarst- wę lipidową błony, które umożliwia transportow anie przez błonę jednej substancji przy jednoczesnym transporcie innej w kierunku przeciwnym) [11].

1II-2. Procesy uwalniania Ca2 + ze struktur subkomórkowych szybko wymieniających Ca2 f

III-2.1. Kanały zaangażowane w procesie uwalniania Ca2 +

W yróżnia się dwie główne klasy kanałów zaangażowanych w procesie uw alniania C a2+ z u ltrastruk- tur szybko wymieniających C a2 + . Pierwszy regulowany jest przez w tórny przekaźnik — IP 3. Drugi, nato miast jest aktywow any przez rianodinę [15-17],

Kanały te odznaczają się dużym podobieństwem pod względem budowy i pełnionych przez nie funkcji. O toczone są one czterem a polipeptydowym i podjednostkam i należącymi do białek receptorowych (odpowiednio do receptora IP 3 i rianodinowego) [18-20],

Kanały receptora stym ulow anego przez IP 3 obecne są w prawie wszystkich kom órkach. O prócz wew nątrzkom órkowych magazynów C a2+ receptor IP 3 o nieco innej strukturze, zlokalizow ano także w błonie plazmatycznej [21]. Do aktywacji kanału wapniowego czułego na IP 3 dochodzi po związaniu IP 3. Zwiększa się wówczas praw dopodobieństw o jego otwarcia.

Do niedawna uw ażano, że receptory rianodinow e są zaangażowane głównie w procesie uwalniania C a2 + z siateczki sarkoplazm atycznej mięśni szkieletowych i mięśnia sercowego. Obecnie pojawia się coraz więcej doniesień, że kanały rianodinow e są również obecne w kom órkach niepobudliwych [22-24]. W yróżnia się trzy różne podtypy receptora rianodinowego:

Rr1 — charakterystyczny dla mięśni szkieletowych, RR2 — charakterystyczny dla mięśnia sercowego i Rr3 — zidentyfikow any w mózgu i innych tk an

kach [25, 26],W przeciwieństwie do receptorów rianodinowych

dwu pierwszych podtypów (informacje dotyczące tego zagadnienia znajdzie czytelnik w Post Biochem [27]), o nowo odkrytym receptorze rianodinowym typu 3, jak na razie, bardzo m ało wiadom o. Jest wrażliwy na


rianodinę, a oporny na kofeinę. Oznacza to, że m obilizacja C a2+ z wewnątrzkom órkowych magazynów, w których błonie zaw arte byłyby wyłącznie receptory rianodinow e typu 3, następow ałaby po podaniu riano- diny, a nie kofeiny. Do tej pory nie wiadom o, czy receptor rianodinowy typu 3 jest aktywow any w p ro cesie CICR (calcium induced calcium release) [16, 28-31],

III-2.2. Inne czynniki uwalniające Ca2 +

Fosfolipaza C wyizolowana z płytek krwi uczestniczy w tworzeniu zarów no niecyklicznego, jak i cyklicznego IP 3-cIP 3. Stwierdzono, że c IP 3 wstrzyknięty do fotoreceptorów Limulus uwalnia C a2+ [32, 33].

Najsilniejszym znanym czynnikiem uwalniającym C a2 + jest cykliczna A D P-ryboza (por. pracę w 4 num erze 39 tom u Post Biochem z 1993 r., str.: 210-212). E C 50, czyli stężenie cyklicznej ADP-rybozy, przy którym wykazuje połowę maksym alnego uwolnienia C a2 + z hom ogenatów kom órek jajowych jeżow ca wynosi 18nM, a w przypadku IP 3, E C 50 jest dziesięciokrotnie większe. Cykliczna A D P-ryboza wiąże się z kanałam i wapniowymi błony siateczki śródplazmatycznej w rażliwymi na rianodinę i aktywuje proces uw alniania C a2 + . Cykliczna A D P-ryboza może działań jak o endogenny regulator procesu CICR, a także jako w tórny przekaźnik mobilizujący C a2+ [34-40].

III-3. Procesy uwalniania Ca2+ ze struktur sub- komórkowych wolno wymieniających Ca2 +

C a2+ ze struk tu r subkom órkow ych wolno wymieniających C a2+ uwalniane są na ogół przez odw rócenie mechanizmu, według którego były pobierane [11]. W yjątkiem są m itochondria, w których proces ten ma bardziej skom plikow any przebieg. Może odbyw ać się poprzez odwrócenie uniportu, na drodze elektroneut- ralnego antyportu, lub z udziałem mega kanałów wrażliwych na cyklosporynę [11, 41, 42]. Pojęcia uniport i an typort oznaczają transport bierny. U niport jest procesem, w którym białko nośnikowe tran sp o rtuje substancję z jednej strony błony na drugą. Z anty- portem mamy natom iast do czynienia, gdy tran sp o rtowi jednej towarzyszy jednoczesny transport drugiej substancji w przeciwnym kierunku.

IV. Kontrola napływu C a2 +

IV-1. Mechanizmy napływu Ca2+ zależnego od stopnia opróżnienia wewnątrzkomórkowych magazynów wapniowych

W ostatnich latach we wszystkich badanych kom órkach niepobudliwych zaobserwow ano związany z opróżnieniem w ew nątrzkom órkowych magazynów wapniowych napływ C a2+ przez błonę plazm atyczną [43-50]. Zaobserwowanie zbieżności pomiędzy zapeł

nieniem wewnątrzkom órkowych magazynów w apniowych, a przepuszczalnością błony plazmatycznej potwierdzono przeprowadzając doświadczenia z tapsigar- giną i 2,5-di-(t-butylo)-l,4-benzohydrochinonem [51]. Związki te są inhibitoram i ATP-azy wapniowej znajdującej się w błonach w ewnątrzkom órkowych struktur magazynujących C a2 + . Gdy zaham ow any jest proces katalizujący napływ C a2+ do ich wewnątrzkom órkowych m agazynów zaczyna przeważać proces ich wypływu. Tak więc efektem działania tych inhibitorów jest opróżnienie wewnątrzkom órkowych magazynów wapniowych i aktywacja napływu C a2 + do kom órki [52].

M echanizm zakładający przesłanie informacji z opróżnionego wewnątrzkom órkowego magazynu wapniowego do błony plazmatycznej i następująca w konsekwencji tego zm iana jej przepuszczalności w stosunku do C a2 + , nazwano procesem pojem nościowego napływu wapnia [46],

P u t n e y w 1986 r. wysunął hipotezę o bezpośrednim strukturalnym połączeniu magazynów w apniowych z błoną plazmatyczną. Obniżenie zawartości C a2+ w wewnętrznych magazynach może powodować otworzenie połączenia typu neksus (jest to miejsce, w którym zachodzi wymiana m etaboliczna i jonow a pomiędzy sąsiadującymi kom órkam i), a wówczas C a2+ z medium zew nątrzkom órkow ego mogły by napływać do magazynów, a stam tąd do cytoplazmy. Za tego typu hipotezą przem awiała obserwacja zmiany transmisji sygnału z opróżnionych m agazynów w apniowych do błony plazmatycznej po podaniu cyto- chalazyny (czynnik wpływający na cytoszkielet) [53].

W cztery lata później I r v i n e [54] zasugerował udział receptorów: IP 3 i IP 4 w pojemnościowym napływie wapnia. Przy zapełnieniu w ew nątrzkom órkowych m agazynów wapniowych, znajdujące się w ich świetle C a2+ łączą się z receptorami IP 3. Zwiększa się wówczas powinowactwo receptora IP 3 do receptora IP 4 znajdującego się w błonie plazmatycznej. W chwili sprzężenia receptorów: IP 3 i IP 4 kanały wapniowe w błonie plazmatycznej przyjm ują konformację zam kniętą. Sytuacja zmienia się po podaniu agonisty. Następuje wtedy rozprzężenie receptorów IP 3 i IP 4, a kanały wapniowe w błonie plazmatycznej otwierają się (Ryc. 1). Później jednak techniką patch-clamp wykazano, że IP 4 jest bez wpływu na przepływ ładunków dodatnich przez kanał wapniowy aktywowany po uwolnieniu C a2+ z wew nątrzkom órkow ych m agazynów [55]. W ysnuto też hipotezę, że transm isja sygnału wapniowego związana jest ze zlaniem się wyspecjalizowanych pęcherzyków zawierających kanały w apniowe z błoną plazmatyczną. Przypuszczenie takie wysunięto na podstawie przeprow adzonego dośw iadczenia z kwasem okadejowym. Jest on inhibitorem transportu pęcherzykowego. Podany kom órkom HeLa powodował zaham ow anie napływu C a2+ indukow anego tapsigarginą [56, 57]. Wydaje się, że aktywacja napływu C a2+ przez błonę plazm atyczną


Ryc. 1. Udział receptorów 1P3 oraz IP 4 w pojem nościowym napływie wapnia.a) W ew nątrzkom órkow e m agazyny wapniowe zapełnione, sprzężenie receptorów IP 3 o raz IP 4, kanały wapniowe w błonie plazm atycznej zam knięte.b) W ew nątrzkom órkow e m agazyny wapniowe opróżnione, rozprzężenie receptorów IP 3 oraz IP 4, kanały wapniowe w błonie plazm atycznej otwarte.A — agonista, p.z. — przestrzeń zew nątrzkom órkow a, b.p — błona plazm atyczna, w.k.m.w. — w ew nątrzkom órkow e m agazyny wapniowe, I P 3, IP 4 — receptory IP 3 oraz IP 4.

nie jest wywołana przez bezpośrednie działanie IP 3 na kanały wapniowe w błonie plazmatycznej [58], ani też nie jest m odulow ana przez [C a2 + ]c [48, 59, 60].

I V - 2 . Charakterystyka pojemnościowego napływu Ca2 + i Ikwum

M etodam i biochemicznymi stwierdzono, że aktyw acja napływu C a2+ przez błonę plazmatyczną:1. nie wymaga udziału receptorów w błonie plaz

matycznej,2. może być wywołana przez różne procedury eks

perymentalne, których cechą wspólną jest, dop ro wadzenie do opróżnienia wewnętrznych m agazynów wapniowych,

3. m a miejsce tak długo, jak długo m agazyny w apniowe pozostają opróżnione i zachodzi nawet po ustaniu stymulacji przez agonistę,

4. jest niewrażliwa na klasyczne inhibitory kanałów wapniowych zależnych od potencjału, takich jak: werapamil, nifedypina

5. jest ham ow ana przez dwu- i trójwartościowe katio ny, tj. C d 2+ i L a3 + , pochodne imidazolowe typu SK&F96365 oraz przez liczne inhibitory cytochromu P450, jak: CO, ekonazol, m ikonazol, klotrim a- zol, a-naftoflawon, m etyrapon [48, 61].

6. występuje powszechnie, we wszystkich do tej pory przebadanych kom órkach [48, 61].Badając mastocyty m etodą patch-clamp wykryto

przepływ ładunków dodatnich przez błonę plazm atyczną — Ikwum [55]. Przepływ ten odpow iadał napływowi C a2+ do wnętrza kom órki przez kanał K W U M o następujących właściwościach:1. bardzo niska przewodność elektryczna (ok. 20 fS) [58],

2. wysoka selektywność w stosunku do C a2 + [55,58],3. brak zauważalnego wpływu potencjału elektryczne

go błony komórkowej na aktywność kanału [55,58].Obserwowane jest opóźnienie (rzędu 1 minuty)

pomiędzy opróżnieniem wewnątrzkom órkowych m agazynów wapniowych przez chelatory wapniowe, takie jak: EGTA, czy BAPTA a przepływem Ikwum- Zjawisko to nie jest do końca wyjaśnione [49, 62-74]

IV-3. Czynniki uczestniczące w procesie pojemnościowego napływu Ca2 +

IV-3.1. Cytochrom P450

Badania M o n t e r a i ws p . [48] zasugerowały udział m ikrosom alnego cytochrom u P450 w regulacji przepuszczalności błony plazmatycznej dla C a 2 + . In hibitory cytochrom u P450, takie jak: CO, antyok- sydanty, im idazolowe związki przeciwgrzybicze, inhibitory lipooksygenazy ham owały następującą po opróżnieniu wew nątrzkom órkowych m agazynów w apniowych aktywację kanałów wapniowych w tymocy- tach szczurzych [48]. Sugeruje się, że cytochrom P450 m oduluje proces pojemnościowego napływu wapnia poprzez m echanizm zależny od kalm oduliny (Ryc. 2). Związki antagonistyczne w stosunku do kalmoduliny, zarów no pochodne fenotiazynowe (trifluoroperazyna, flufenazyna, chloroprom azyna), jak i pochodne diben- zodiazepiny (np. klozapina) znoszą działanie inhibitorów cytochrom u P450 [48].

O pierając się na powyższych obserwacjach przedstawiono mechanizm kontrolujący przepuszczalność błony plazmatycznej w stosunku do C a2 + . Zgodnie z nim obniżenie się stężenia C a2+ w w ew nątrzkom órkowych kom partm entach magazynujących powinno prowadzić do następujących zmian:

b.p. b.p.

Ryc. 2. M odel regulacji przepuszczalności błony plazm atycznej dla C a 2+ w zależności od stopnia zapełnienia w ew nątrzkom órkowych m agazynów wapniowych.a) w ew nątrzkom órkow e m agazyny wapniowe opróżnione, aktyw acja P450,b) w ew nątrzkom órkow e m agazyny wapniowe zapełnione, zaham ow anie aktyw ności P450, CaM — kalm odulina, P450 — cytochrom P450, w.k.m.w. — w ew nątrzkom órkowe m agazyny wapniowe, b.p — błona plazm atyczna, k.w. — kanał wapniowy.


— oddysocjowania C a2+ z kom pleksu C a2 + -kal- m odulina, znajdującego się w tychże kom part- mentach,

— przywrócenia aktywności m ikrosom alnego cytochrom u P450,

— otw arcia kanałów wapniowych w błonie plazmatycznej [48].

W yjaśnienie udziału cytochrom u P450 w transmisji sygnału wapniowego w kom órkach niepobudliwych przyniosły przeprow adzone w ostatnim czasie badania kom órek śródbłonka naczyniowego (Ryc. 3). N ajw ażniejszym ich rezultatem było odkrycie wtórnego przekaźnika koniecznego do aktywacji pojemnościowego napływu wapnia. Tym wtórnym przekaźnikiem jest kwas 5,6-epoksyeikozatrienowy (5,6-EET). Powstaje on z kwasu arachidonow ego przy zaangażowaniu m ikrosom alnego cytochrom u P450. W ykazano, że induktor cytochrom u P450-P-naftoflawon zwiększa tem po napływu C a2+ do kom órek z opróżnionym i m agazynam i wapniowymi. G dy pozostawały one w stanie spoczynkowym napływ ten stym ulowany był przez 5,6-EET.

N a podstawie powyższych obserwacji zaproponowano przebieg zdarzeń po obniżeniu się stężenia C a2 + w w ew nątrzkom órkow ych przestrzeniach m agazynujących ten kation:

— aktywacja m ikrosom alnego cytochrom u P450,— synteza 5,6-EET z kwasu arachidonow ego uwol

nionego z błony plazmatycznej katalizow ana przez cytochrom P450,

— pośrednia lub bezpośrednia aktywacja kanału wapniowego w błonie plazmatycznej przez 5,6- EET lub jego m etabolit [79],

Jednakże, udział cytochrom u P450 w procesie pojemnościowego napływu wapnia jest kwestionowany przez szereg danych doświadczalnych, z których wysnuto następujące wnioski:1. ekonazol, inhibitor cytochrom u P450, być może

ham uje aktywność, a nie produkcję czynnika napływu wapnia [69],

2. brak jest korelacji pomiędzy ekspresją genów cytochrom u P450 i I k w u m [61],

3. brak jest zależności pomiędzy stałą inhibitorow ą (K J wielu związków w stosunku do cytochrom u P450, a przebiegiem procesu pojemnościowego n apływu wapnia [61],

4. inhibitory cytochrom u P450 są niespecyficznymi inhibitoram i kanałów jonowych, np. mogą ham ować kanały K + aktywow ane przez C a2+ i kanały C a2+ zależne od potencjału [70].

IV-3.2. Czynnik indukujący napływ Ca2 +

W spółcześnie najbardziej akceptow ana hipoteza tłum acząca pojemnościowy napływ wapnia zakłada tworzenie wtórnego przekaźnika, który byłby uwalniany do cytoplazmy z wew nątrzkom órkowych m agazynów wapniowych, gdy zmniejszy się w ich świetle

Ca2+

Ryc. 3. U dział cytochrom u P450 w procesie pojem nościowego napływ u wapnia.P450 — cytochrom P450, 5,6-EET — kwas 5,6-epoksyeikozatrienowy, AA — kwas arachidonow y, P L A 2 — fosfolipaza A 2, R IP 3 — receptor I P 3, b.p. — błona plazm atyczna, w.k.m.w. — w ew nątrzkom órkow e magazyny wapniowe.

stężenie C a2+ [46]. Czynnik indukujący napływ w apnia, w skrócie C N W (w literaturze anglojęzycznej C IF — calcium influx factor), bo tak przyjęło się określać ten związek, został wyizolowany z kom órek linii Ju rka t [69]. Czynnik napływu wapnia jest małym ufosforylo- wanym anionem (jego ciężar cząsteczkowy nie przekracza 500 D). N ajpraw dopodobniej nie jest peptydem (podwyższona tem peratura i działanie proteaz nie wpływa na jego aktywność). Stwierdzono, że zawiera grupy — hydroksylową lub też hydroksylową i am inową. W ykazano również, że penetruje on przez błony plazmatyczne. W ydaje się, że głównym kró tkoterm inowym efektem opróżnienia m agazynów wapniowych nie jest synteza CNW , ale raczej jego wyrzucenie z organelli do cytoplazmy. P raw dopodobnie CN W jest nieustannie produkow any w wewnętrznych m agazynach i uwalniany do cytoplazmy w chwili aktywacji kom órki [69],

Niezależne elektrofizjologiczne badania potwierdziły opisane wcześniej właściwości nowego, rozpuszczalnego przekaźnika. Badając oocyty Xenopus laevis wykazano, że kwas okadejow y — będący inhibitorem fosfatazy serynowo/treoninowej nasila pojem nościowy napływ wapnia. Stąd wnioskuje się, że przekaźnik ten jest wrażliwy na fosfatazy, a więc jest ufosforylowany [74].

IV-3.3. Małe białko G

W strzyknięcie analogu G TP-GTP(y)S do uprzednio stymulowanych agonistą kom órek gruczołów łzowych pow odow ało zaham ow anie napływu do cytoplazmy C a2+ ze środowiska zew nątrzkom órkow ego [75]. T aki efekt mógł być wywołany działaniem GTP(y)S na


małe białko G. GTP(y)S ham uje napływ C a2+ tylko, gdy zostaje wstrzyknięte przed aktywacją kom órki przez IP 3, k tó ra następuje tuż po podaniu agonisty [56], O pierając się na tych obserwacjach zaproponowano 3 hipotezy tłum aczące sposób, w jaki małe białko G aktyw uje napływ C a2 + . Być może małe białko G:

- bezpośrednio aktywuje kanał wapniowy w błonie plazm atycznej,

— pośrednio, uczestnicząc w syntezie czynnika zdolnego do dyfuzji do błony plazmatycznej, aktyw uje w niej kanał wapniowy,

— indukuje włączenie do błony plazmatycznej wyspecjalizowanych pęcherzyków zawierających w swej błonie kanały wapniowe [56].

IV-4. Regulacja napływu Ca2+ przez fosforyla- cję/defosforylację

W yniki badań przeprow adzonych na neutrofilach, płytkach, kom órkach HeLa przem awiają za udziałem etapu fosforylacji/defosforylacji w procesie pojem nościowego napływ u wapnia. Fosforylacja/defosforylacja kontroluje aktyw ność białka regulatorowego w ten sposób, że defosforylacja tego białka stymuluje napływ C a2+ [76], Z kolei inhibitory fosfataz 1 i 2A typu takie, jak: kalykulina A, tautom ycyna, czy kwas okadejowy ham ują pojem nościowy napływ wapnia [77]. W płytkach — fosforylacja/defosforylacja wydaje się odgrywać ważną rolę w regulacji napływu C a2 + wynikającego z opróżnienia kom partm entów wrażliwych na agoni- stę i mniejszą rolę w przekazywaniu sygnału powstającego w wyniku opróżnienia kom partm entów magazynujących wapń, wrażliwych na tapsigarginę [78].

V. Podsumowanie

W łaściwa regulacja [C a 2 + ]c jest podstawowym w arunkiem działania C a2+ jako wtórnego przekaźnika inform acji w komórce. W utrzym aniu praw idłowego [C a 2 + ]c biorą udział błonowe układy transportujące C a 2 + , a także związki i organelle buforujące i wiążące ten kation. Podwyższone [C a2 + ]c obserwowane w stym ulow anej kom órce jest wynikiem, z jednej strony, napływ ania C a2+ ze środowiska zew nątrzkom órkow ego, z drugiej zaś uwalniania ich z w ew nątrzkom órkow ych przestrzeni m agazynujących. K olejność przebiegu tych dwóch procesów (napływu i uw alniania) w kom órkach niepobudliwych jest ściśle określona. W zrost przepuszczalności błony plazmatycznej dla C a 2+ następuje dopiero po rozpoczęciu mobilizacji C a 2+ z ich kom órkow ych magazynów. Powstaje pytanie — w jaki sposób inform acja o stanie zapełnienia tychże m agazynów jest przesyłana do błony plazm atycznej? Prow adzone w ostatnich latach badania przyniosły częściowe wyjaśnienie. Zostało udokum entow ane mianowicie, że niezbędnym czynnikiem w przekazyw aniu tego sygnału jest związek o charakterze w tórnego przekaźnika. W jednym z eks

perymentów [79] badacze stwierdzili, że przekaźnikiem takim jest kwas 5,6-epoksyeikozatrienowy. Nie w iadom o jednak, czy kanały wapniowe w błonie plazmatycznej aktyw ow ane są bezpośrednio przez5,6-EET, czy przez jego metabolit. Powstaje także pytanie, czy 5,6-EET jest jedynym możliwym wtórnym przekaźnikiem informacji o stanie zapełnienia m agazynów wapniowych. Rysują się zatem dalsze perspektywy badań regulacji kanałów wapniowych w kom órkach niepobudliwych.

PodziękowaniaA utorka niniejszego tekstu wyraża swoją wdzięczność

panu prof. dr hab. J e r z e m u D u s z y ń s k i e m u i pani prof. d r hab. Z o f i i Z i e l i ń s k i e j za okazaną pomoc.

A rtykuł otrzymano 10 maja 1995 r. Zaakceptowano do druku 11 września 1995 r.

Piśmiennictwo

1. C a r a f o 1 i E (1982) W: Carafoli E (red) M em brane T ransport of Calcium, Academ ic Press, London str 109

2. B l a u s t e i n M P (1984) W: Blaustein M P, Lieberm an M (red) Electrogenic T ransport: Fundam ental Principles and Physiological Im plications, Raven Press, New York, 129

3. B a k e r P F (1986) W: Ritchie MJ, Keynes RD, Bolis L (red) Ion C hannels in N euronal M em branes, A. R. Liss, New York, 177

4. B e r r i d g e M J , I r v i n e R (1984) Nature (Lond) 312: 315-3205. B o r l e A B (1981) Rev Physiol Biochem Pharmacol 90: 13-1536 . A l o n s o G L , B a z e r q u e D M , A r r i g o D M, T u m i 1 a -

s c i O R (1971) J Gen Physiol 58: 340-3507. C l e m e n t e F, M e l d o l e s i J (1975) J Cell Biol 65: 88-1028 . F u j i m o t o T (1992) J Cell Biol 120: 1147-11579. B y g r a v e F L (1978) Biol Rev 53: 43-80

10. H i m p e n s B, D e S m e d t H, D r o o g m a n s G, C a s t e el s R (1992) Am J Physiol 263: C95-C105

11. P o z z a n T, R i z z u t o R, V o l p e P, M e l d o l e s i J (1994) Physiol Rev 74,3: 595-636

12. F a s o l a t o C , Z o t t i n i M , C l e m e n t i E, Z a c c h e t t i D, M e l d o l e s i J, P o z z a n T (1991) J Biol Chem 266: 2 0159- 20167

13. V a s i n g t o n F D , M u r p h y JV (1962) J Biol Chem 237: 2670-2677

14. S p a m e r C, H e i l m a n n C, G e r o k W (1987) J Biol Chem 262: 7782-7789

15. B e r r i d g e M J (1993) Nature (Lond) 361: 315-32516. F i l l M, C o r o n a d o R (1988) Trends Neurosci II: 453-45717. M e P h e r s o n PS, C a m p b e l l (1993) J Biol Chem 268:

13765-1376818. T a k e s h i m a H, N i s h i m u r a S, M a t s u m o t o T, I s -

h i d a H, K a n g a w a K (1989) Nature (Lond) 339: 439-44519. M a r k s AR, T e m p s t P, H w a n g KS, T a u b m a n MB,

I n u i M (1989) Proc N atl Acad Sci USA 8 6 : 8683-868720. F u r u i c h i T , Y o s h i k a w a S , M i y a w a k i K, W a d a K,

M a e d a N, M i k i s h i b a K (1989) Nature (Lond) 342: 32-3821. K h a n A A, S t e i n e r J P , K l e i n M G , S c h n e i d e r MF ,

S n y d e r S H (1992) Science 257: 815-81822. G a l i o n e A, M e D o u g a l l A, B u s a WB , W i l l m o t t N,

G i l l o t J, W h i t a k e r M (1993) Science 261: 348-35223. M e P h e r s o n S M, M e P h e r s o n PS, M a t h e w s L,

C a m p b e l l K P , L o n g o F J (1992) J Cell Biol 116: 1111- 1121

24. T e r a o k a H, N a k a z a t o Y, O h g a A (1991)7 Neurochem 57: 1884-1890

25. G i a n n i n i G, C l e m e n t i E, C e c i R, M a r z i a l i G, S o r r e n t i n o V (1992) Science 257: 91-94

26. M e P h e r s o n PS , C a m b e l l K P (1993) J Biol Chem 268: 13765-13768

27. B a r a ń s k a J, C z a r n y M (1991) Post Biochem 37: 129-132


28. M a r k s AR, T a u b m a n MB , S a i t o A, D a i Y, F l e i s c h e r S (1991) J Cell Biol 114: 303-312

29. F l e i s c h e r S, I n u i M (1989) Annu Rev Biophys Biophys Chem 18: 333-364

30. H a k a m a t a Y, N a k a i J, T a k e s h i m a H, I m o t o K (1992) FEBS Lett 312: 229-235

31. S o r r e n t i n o V, V o l p e P (1993) Trends Pharmacol Sci 14: 98-103

32. M a j e r u s P W, C o n n o l l y T M , B a n s a l VS, I n h o r n RC, R o s s TS, L i p s D L (1988) J Biol Chem 263: 3051-3054

33. M a j e r u s P W , C o n n o l l y T M , D e c k m y n H, R o s s T, B r o s s T E (1986) Science 234: 1519-1527

34. G a l i o n e A, W h i t e A (1994) Trends in Cell Biol 4: 431 -43635. D a r g i e PJ , A g r e M C , L e e H C (1990) Cell Regul 1:

279-29036. G a l i o n e A (1993) Science W ash DC 259: 325-32637. L e e H C (1991) J Biol Chem 266: 2276-228138. L e e H C (1993) J Biol Chem 268: 293-29939. L i G , M i l a n i D, D u n n e MJ , P r a l o n g W 'F, T h e l e r

J M , P e t e r s e n O H , W o l l h e i m C B (1991)7 Biol Chem 266: 3449-3457

40. M e s z a r o s L G, B a k J, C h u A (1993) Nature (Lond) 364: 76-78

41. B e r n a r d i P, V a s s a n e l l i S, V e r o n e s e P, C o l o n n a R, S z a b o J , Z o r a t t i M (1992) J Biol Chem 267: 2934-2939

42. N i c h o l l s D G , A k e r m a n K (1982) Biochim Biophys Acta 683: 57-88

43. B e r r i d g e MJ (1993) N ature (Lond) 361: 315-32544. T s i e n R W, T s i e n R Y (1990) Rev Cell Biol 6 : 715-76045. I r v i n e R F (1990) FEBS Lett 263: 5-946. P u t n e y J W (1990) Jr Cell Calcium 11: 611-62447. H o t h M, P e n n e r R (1992) Nature (Lond) 355: 353-35648. A l v a r e z J, M o n t e r o M, G a r c i a - S a n c h o (1991)

Biochem J 274: 193-19749. B a h n s o n T D , P a n d o l S J, D i o n n e V E (1993) J Biol

Chem 268: 10808-1081250. P u t n e y J W, B i r d G S (1993) Cell 75: 199-20151. L l o p i s J, C h o w SB, K a s s G E, G a h m A, O r r e n i u s

S (1991) Biochem J 277: 553-55652. T a k e m u r a H, H u g h e s AR, T h a s t r u p O, P u t n e y

J W (1989) J Biol Chem 264: 12266-1227253. P u t n e y JW (1986) Cell Calcium 7: 1-1254. I r v i n e R F (1990) FEBS 263: 5-955. H o t h M, P e n n e r R (1992) Nature (Lond) 355: 353-356

56. F a s o l a t o C , H o t h M, P e n n e r R (1993) J Biol Chem 268: 20737-20740

57. B e r l i n R D, P r e s t o n S F (1993) Cell Calcium 14: 379-38658. Z w e i f a c h A, L e w i s R S (1993) Proc N a tl Acad Sci USA 90:

6295-629959. M i 1 e d i R. P a r k e r (1984) J Physiol London 357: 173-18360. M o n t e r o M, A l v a r e z J, G a r c i a - S a n c h o J (1991)

Biochem J 277: 73-7961. F a s o l a t o C, I n n o c e n t i B, P o z z a n T (1994) Trends

Pharmacol Sci 15: 77-8362. H o t h M, P e n n e r R (1993) J Physiol 465: 359-38663. M e D o n a l d T V, P r e m a c k BA, G a r d n e r P (1993)

J Biol Chem 268: 3889-389664. H o t h M, F a s o l a t o C , P e n n e r R (1993) Ann N Y Acad Sci

707: 198-20965. P e n n e r R. F a s o l a t o C, H o t h M (1993) Curr Opin

Neurohiol 3: 368-37466. V a c a L, K u n z e D L (1993) Am J Physiol 264: H I 319 -H 132267. P a r e k h AB, F o g u e t M, L u b b e r t H, S t u h m e r

W (1993) J Physiol 469: 653-67168. S a r g e a n t P, C l a r k s o n W D , S a g e S O, H e e m s k e r k

J W (1992) Cell Calcium 13: 553-56469. R a n d r i a m a m p i t a C, T s i e n R Y (1993) N ature (Lond)

364: 809-81470. B r u g n a r a C, D e f r a n c e s c h i L, A l p e S L (1993) J Clin

Invest 92: 520-52671. S t a u f f e r P L , Z h a o H, L u b y - P h c l p s K, M o s s RL,

S t a r RA, M u a l l e m S (1993) J Biol Chem 268: 19769-1977572. X u X, S t a r RA, T o r t o r i c i G, M u a l l e m S (1994) J Biol

Chem 269: 12645-1265373. W h i t e K A, M a r 1 e 11 a M A (1992) Biochemistry 31: 6627-

663174. P a r e k h AB, T e r l a u H, S t u h m e r W (1993) Nature

(Lond) 364: 814-81875. B i r d G S J , P u t n e y J W (1993) J Biol Chem 266: 21486-

2148876. M o n t e r o M, G a r c i a - S a n c h o J, A l v a r e z J (1993)

J Biol Chem 268: 13055-1306177. M o n t e r o M, G a r c i a - S a n c h o J, A l v a r e z J (1994)

J Biol Chem 269: 3963-396778. K o i k e Y, O z a k i Y, Q i R, S a t o h K, K u r o t a K,

Y a t o m i Y, K u m e S (1994) Cell Calcium 15: 381 -39079. G r a i e r W F , S i m e c e k S . S t u r e k M (1995) J Physio l482:

259-274

Roczny spis treści tom 41, nr 1, 2, 3, 4, 1995

ARTYKUŁY

Anna Kurlandzka, Jan Fronk — Nobel 1 994 za białka G ............................................... 3

Jan Barciszewski — Twórcy podstaw b io logii molekularnej:Emil Fischer, Erwin Schrödinger i Oswald T. A v e r y .................................................................... 4

Antonina Harłozińska-Szmyrka — N ow otw ory jako choroba g e n ó w ............................... 7

Jolanta Kw iatkowska, Tomasz Trzeciak, Ryszard Słomski — Powtórzenia DNA . . 15

Grzegorz Węgrzyn — Czterofosforan gua- nozyny ppGpp, jako czynnik ścisłej kontroli replikacji D N A ..................................................... 23

Cezary Żekanowski — Peptydowe kwasy nukleinowe — nowa grupa analogów DNA . 32

Piotr Kupczyk, Piotr Sawiński, W ies ław Trzeciak — Podłoże molekularne niedoboru 21-hydroksylazy s te ryd o w e j.................... 38

Elżbieta Rębas, Lilia Lachowicz — Neuro- steroidy — synteza i m e tabo lizm ........... 47

Ewa Świeżewska — Prenylacja białek . . . 51

Artur Osyczka, Bohdan Turyna — Konformacja cytochromu C i jego oddziaływania z oksydazą cy toch rom ow ą ....................... 59


Magdalena W ik torek, Aleksandra Rojek, Małgorzata Czarny, Jolanta Barańska— Rola cyklu inozytolowego w przekazywaniu informacji w ją d rz e ............................................ 67

Barbara Grzelakowska-Sztabert — Regulacja cyklu komórkowego — udział b ia łkowych inhibitorów kinaz cyklino-zależnych . . 80

Krzysztof L iberek— Regulacja odpowiedzi szoku termicznego Escherichia c o / i ................ 94

Eliza Wyszko, M iros ław a Barciszewska— Struktura i w łaściwości czynnika transkryp- cyjnego IMA Xenopus /a e v is ............................... 102

M ichał Dąbrowski — Szukanie igły w stogu siana. Identyfikacja genów ulegających różnicowej e k s p re s ji.................................................. 110

Elżbieta Pluskota, Czesław S. C iern iew -ski — Regulacja syntezy cząsteczki fibrynoge- n u .............................................................................. 115

Iwona Żak — Białka m oza ikow e...................... 120

Łukasz Pułaski — Flipazy — białka transportujące fo s fo lip id y .................................................. 131

Andrzej G łowacki, Ewa M aria Koźma, Krystyna Olczyk, Eugeniusz J. Kucharz— Glikozoaminoglikany — struktura i funkcja 139

Anna Moczarska — Niektóre biochemiczne aspekty patogenezy serca ogłuszonego . . . 158

Renata Dąbrowska, M aria A. Grąziewicz— Cytoszkielet komórek niemięśniowych . . 165

Barbara M ajew ska — Białko M AP-2 i jego rola w wielu przejawach plastyczności i stanach patologicznych w ośrodkowym układzie n e rw o w y m ...............................................................175

Krystian Kaletha, M anfred Gross — W rodzony niedobór deaminazy AMP — podłoże molekularne d e fe k tu ...............................................183

Urszula Kralisz — Receptory kolagenu p łytek k r w i .....................................................................188

Piotr W idłak — Oddziaływanie białek z uszkodzonym D N A ............................................195

Hanna W ehr — Biologiczne skutki modyfikacji l ip o p ro te in ........................................................ 201

Ewa Sikora — Czy znamy już gen śmierci . 210

Karolina Michalczyk-Janitz, M ichał W itt , Jadwiga Jaruzelska — Gen SRY— pierwotny „w łączn ik” determinacji płci c z ło w ie k a ? ..............................................................212

Ryszard Słomski, Jolanta K w iatkow ska— Diagnostyka molekularna: amplifikacja sekwencji czy wzmacnianie sygnału?......................220

Łukasz Huminiecki — Terapia genowa— wektory i s tra teg ie ........................................... 230

W aldem ar Marczewski — Markery molekularne w genetyce i hodowli ro ś lin 237

Roman Gondko — Czy przemiany rodników tlenowych w organizmie przebiegają cyklicznie? .......................................................................... 243

Joanna Bandorowicz-Pikuła — Domeny w błonach biologicznych i ich znaczenie fiz jo logiczne .................................................................... 247

Andrzej Wierzbicki — Rola allosterycznej RNazy L w indukowanym przez interferon układzie obronnym k o m ó rk i...............................257

M iros ław a Siatecka, Jan Barciszewski— Struktura i funkcja syntetaz aminoacylo- t R N A ....................................................................... 266

Ludmiła Żylińska, Lilia Lachowicz — Se-rynowo/treoninowe fosfatazy fosfoproteinowe w tkance m ó zg o w e j..................................... 276

Barbara Niewczas — Regulacja wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ w komórkach n ie p o b u d liw y c h .....................................................283

W S P O M N I E N I A

Przyjaciele i uczniowie — Profesor Irena Borkowska — W spom n ien ia ......................... 2

Uczniow ie i współpracownicy — Profesor Stanisław Marian Jóźkiewicz — Wspomnienia .................................................................................. 78

Prenumerata „Postępów Biochemii” w 1996 r.Prenumerata dla instytucji — 60 złIndywidualna — 28 zł50% zniżki dla członków PTBioch.


Indeks autorów prac przeglądowych, tom 41, 1995

B

B andorow icz-P iku ła J — Insty tu t B io log ii D ośw iadczalnej im. M. N enckiego PAN, ul. Pasteura 3, 02 -0 9 3 Warszawa

Barańska J — Insty tu t B io log ii Dośw iadczalnej im. M.N enckiego PAN, ul. Pasteura 3, 02 -0 9 3 Warszawa

Barciszewska M — Insty tu t Chemii B ioorganicznej PAN, ul. N oskow skiego 12, 6 1 -7 0 4 Poznań

Barciszewski J — Insty tu t Chemii B ioorganicznej PAN, ul. N oskow skiego 12, 6 1 -7 0 4 Poznań

cC ierniew ski Cz. S. — Zakład B io fizyki, Instytu t F izjo

log ii i B iochem ii A M , ul. L indleya 3, 90-131 Łódź Czarny M — Insty tu t B io log ii Dośw iadczalnej im. M.

Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, 02 -0 9 3 Warszawa

D

Dąbrow ska R — Insty tu t B io log ii Dośw iadczalnej im. M.N enckiego PAN, ul. Pasteura 3, 0 2 -093 Warszawa

D ąbrow ski M — Pracownia H odow li Komórek i Tkanek, Ins ty tu t B io log ii Dośw iadczalnej im. M. Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, 02 -0 9 3 Warszawa

F

Fronk J — Instytu t B iochem ii UW, ul. Żw irk i i W igury 93, 02 -0 8 9 Warszawa

G

G łow acki A — Katedra i Zakład Chemii K linicznej i D iagnostyki Laboratoryjnej, Śląska Akademia M e dyczna, ul. Jagie llońska 4, 4 1 -2 0 0 Sosnow iec

G ondko R — Katedra B iofizyki Ogólnej, U niw ersytet Łódzki, ul. Babacha 12/16, 90 -237 Łódź

G rąziew icz M A — Zakład B io log ii M oleku larne j, In s ty tu t B iochem ii i B iofizyki PAN, ul. Paw ińskiego 5a, 02 -1 0 6 Warszawa

Gross M — M edizin ische P o lik lin ik der U n iw ersita t M ünchen, Pettenkofersstrasse 8a, 80336 M ünchen, Germany

G rze lakow ska-Sztabert B — Insty tu t B io log ii D ośw iadczalnej im. M. Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, 0 2 -0 9 3 Warszawa

H

Harłozińska-Szm yrka A — Zakład Im m unolog ii N o w o tw o ró w A M , ul. M iku licza-R adeckiego 7, 50 -368 W rocław

Hum iniecki Ł — W ydział B io log ii, U niw ersyte t A. M ic kiewicza, Pracownia B iochem ii S tosow anej, ul. M ię- dzychodzka 5, 60-371 Poznań

J

Jaruzelska J — Zakład Genetyki C złow ieka PAN, ul. Strzeszyńska 32, 60 -4 7 9 Poznań

K

Kaletha K — Katedra i Zakład B iochem ii A M , ul. Dębinki 1, 80-211 Gdańsk

Koźm a EM — Katedra i Zakład Chemii K lin icznej i D iagnostyki Laboratoryjnej, Śląska Akadem ia Medyczna, ul. Jagie llońska 4, 4 1 -2 0 0 Sosnow iec

Kralisz U — Zakład B io fizyki, Ins ty tu t F iz jo log ii i B io chem ii A M , ul. Lindleya 3, 90-131 Łódź

Kucharz EJ — IV Katedra i K linika C horób W ew nętrznych, Śląska Akademia Medyczna, ul. Edukacji 102, 4 3 -1 0 0 Tychy

Kupczyk P — Katedra i Zakład Chemii F izjo logicznej A M , ul. Ś w ięcick iego 6, 60-781 Poznań

Kurlandzka A — Insty tu t B iochem ii i B io fizyk i PAN, ul.Paw ińskiego 5a, 0 2 -1 0 6 Warszawa

K w ia tko w ska J — Zakład Genetyki C złow ieka PAN, ul. Strzeszyńska 32, 60 -4 7 9 Poznań

L

Lachow icz L — II Zakład B iochem ii Ins ty tu tu F izjo logii i B iochem ii A M , ul. Lindleya 6, 90-131 Łódź

Liberek K — Katedra B io log ii M o leku larne j, U niw ersytet Gdański, ul. Kładki 24, 8 0 -822 Gdańsk

M

M ajew ska B — Insty tu t B io log ii Dośw iadczalnej im. M.Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, 0 2 -0 9 3 Warszawa

M arczew sk i W — Zakład Genetyki i Syntezy M ateria łów W yjśc iow ych , Instytu t Ziemniaka, M ło ch ó w , 0 5 -832 Rozalin 7

M ich a lczyk -Jan itz K — Zakład G enetyki Człowieka PAN, ul. Strzeszyńska 32, 6 0 -479 Poznań

M oczarska A — Insty tu t B io log ii D ośw iadczalnej im. M. Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, 0 2 -0 9 3 Warszawa

N

N iew czas B — Insty tu t B io log ii D ośw iadczalnej im. M. N enckiego PAN, ul. Pasteura 3, 0 2 -0 9 3 Warszawa

O

Osyczka A — Zakład B io fizyki, Ins ty tu t B io log ii M o leku larnej UJ, al. M ick iew icza 3, 3 1 -1 2 0 Kraków

O lczyk K — Katedra i Zakład Chemii K lin icznej i D iagnostyk i Laboratoryjnej, Śląska Akademia M edyczna, ul. Jag ie llońska 4, 41 -200 Sosnow iec


p wPluskota E — Zakład B iofizyki, Instytu t F izjo logii i B io

chem ii A M , ul. Lindleya 3, 90-131 Łódź Pułaski Ł — Katedra B iofizyki M olekularnej, U niw ersyte t

Łódzki, ul. Banacha 12/16, Łódź

R

Rębas E — II Zakład B iochem ii Instytu tu F izjo logii i B iochem ii A M , ul. Lindleya 6, 90-131 Łódź

Rojek A — Instytu t B io log ii Dośw iadczalnej im. M. Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, 0 2 -0 9 3 Warszawa

sSaw iński P — Katedra i Zakład H isto log ii i Em brio logii

A M , ul. Ś w ięcick iego 6, 60-781 Poznań Siatecka B — Instytu t Chemii B ioorganicznej PAN, ul.

N oskowskiego 12, 6 1 -7 0 4 Poznań Sikora E — Instytu t B io log ii Dośw iadczalnej im. M.

Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, 0 2 -093 Warszawa Słom ski R — Zakład Genetyki Człow ieka PAN, ul.

Strzeszyńska 32, 6 0 -479 Poznań Św ieżew ska E — Zakład B iochem ii L ip idów , Instytu t

B iochem ii i B iofizyki PAN, ul. Pawińskiego 5a, 02- 106 Warszawa

W ehr H — Insty tu t Psychiatrii i N euro log ii, Zakład Genetyki, al. Sobieskiego 1/9, 02 -9 5 7 Warszawa

W ęgrzyn G — Katedra B io log ii M oleku larne j, U n iw e rsytet Gdański, ul. Kładki 24, 8 0 -822 Gdańsk

W idłak P — Zakład B io log ii N o w o tw o ró w , Insty tu t O nko log ii, 4 4 -1 0 0 G liw ice

W itt M — Zakład Genetyki C złow ieka PAN, ul. Strzeszyńska 32, 6 0 -479 Poznań

W ierzbicki A — Katedra i Zakład Chemii F izjo logicznej A M , ul. Ś w ięcick iego 6, 60-781 Poznań

W ikto rek M — Instytu t B io log ii Dośw iadczalnej im. M.N enckiego PAN, ul. Pasteura 3, 0 2 -0 9 3 Warszawa

W yszko E — Insty tu t Chemii B ioorganicznej PAN, ul. N oskow skiego 12, 6 1 -7 0 4 Poznań

ż

Żak I — Katedra B iochem ii i Chemii, Śląska Akademia M edyczna, ul. M edyków 18, 4 0 -7 5 2 Katow ice

Żekanowski C — Zakład Genetyki, Ins ty tu t M atki i D ziecka, ul. Kasprzyka 17A, 01-211 Warszawa

Żylińska L — II Zakład B iochem ii Instytu tu F iz jo log ii i B iochem ii A M , ul. Lindleya 6, 90-131 Łódź

T

Trzeciak T — Zakład Genetyki Człow ieka PAN, ul.Strzeszyńska 32, 60 -4 7 9 Poznań

Trzeciak HT — Zakład Genetyki Człow ieka PAN, ul.Strzeszyńska 32, 60 -4 7 9 Poznań

Turyna B — Zakład B iochem ii Zwierząt, Instytu t B io log ii M olekularnej UJ, al. M ick iew icza 3, 31 -1 20 Kraków

Podręcznik laboratoryjny

Instytut Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk opracował podręcznik laboratoryjny pt. ,,Inżynieria Genetyczna i Biologia Molekularna. Metody” , w którym zawarto na 170 stronach 67 metod sprawdzonych i stosowanych w IBB PAN. Wydawcą książki jest ,,TECHGEN” spółka z o.o. ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa, tel./fax 658-47-89, u którego można zamawiać i nabywać podręcznik.

292 POSTĘPY BIOCHEMII 41 (4), 1 995http://rcin.org.pl

XXXII ZJAZD POLSKIEGO TOWARZYSTWA BIOCHEMICZNEGO

Zarząd Krakowskiego Oddziału Polskiego Towarzystwa Biochemicznego pragnie poinformować, że w dniach 18— 21 września 1996 roku w Krakowie odbędzie się XXXII Zjazd PTBioch. Komitet Organizacyjny ma zaszczyt i przyjemność zaprosić wszystkich Członków Towarzystwa i Osoby zainteresowane do udziału w Zjeździe.

Obrady Zjazdu odbywać się będą na terenie Centrum Kongresowego Akademii Rolniczej w Krakowie przy ulicy 29 Listopada 46-54. Przewidujemy zakwaterowanie Uczestników Zjazdu w Domach Akademickich w pobliżu Centrum Kongresowego oraz w hotelach. Serdecznie zapraszamy!

Komunikat nr 1 w raz z kartą zgłoszenia ukaże się w październiku 1995 r.

KOMITET NAUKOW O-ORGANIZACYJNY

A. Dubin, F. Dubert, J. Frendo, M. Gumińska, T. Kędryna, A. Klein, P. Laidler. M. Leja, A. Lityńska, J. Naskalski, W. Ostrowski, J. Potempa, H. Rokita, T. Sarna, Z. Szafran, T. Stelmaszyńska-Zgliczyńska, Z. Wasylewski, Z. Żak

PROGRAM NAUKOW Y ZJAZDU

1. Genetyka molekularna człowieka.2. Zależność struktury i funkcji białek oraz kwasów nukleinowych.3. Potranslacyjna modyfikacja białek.4. Rodniki tlenowe i ich znaczenie w biologii i w medycynie.5. Proteinazy i ich inhibitory.6. Biotechnologia w medycynie i rolnictwie.7. Biochemia i środowisko.8. Biochemia kliniczna.9. Nauczanie biochemii.

10. Doniesienia różne.

KONTAKT Z ORGANIZATORAMI

KOMITET ORGANIZACYJNYXXXII ZJAZDU P.T. BIOCHEMICZNEGO

Instytut Biochemii Lekarskiej CM UJ 31 -034 Kraków, ul. Kopernika 7 tel: (012) 22-74-00, 18-85-05, fax: (012) 33-69-07

Dr hab. Piotr Laidler e-mail: [email protected] Dr Teresa Kędryna e-mail: [email protected]

POSTĘPY BIOCHEMII 41 (4), 1995 http://rcin.org.pl

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]

R e c e n z j eRecenzja książki pt. „Podstawy genetyki dla studentów i lekarzy” , pod redakcją prof. G. Drewy,w ydaw ca — V ołum ed, W rocław

Ze względu na niesłychanie szybki rozwój genetyki człowieka w ciągu ostatnich 10 lat studenci medycyny muszą obecnie zapoznaw ać się z pojęciami, które 20 lat temu nie tylko nie wchodziły do program u nauczania ale nawet nie istniały (PCR, cyklina itp.).

Dwa lata tem u Kom isja G enetyki Człowieka K om itetu Patofizjologii PAN przedstawiła „Uwagi ogólne dotyczące nauczania genetyki w Akadem iach M edycznych”, w których nauczanie podzielone jest na dw a etapy. Program pierwszego z nich ma na celu „rozwinięcie wiadom ości z zakresu genetyki ze szkoły średniej, ze szczególnym uwzględnieniem współczesnych osiągnięć genetyki ogólnej, m olekularnej i człowieka”. Drugi etap obejmuje genetykę kliniczną i nie jest związany z zakresem tej recenzji.

Recenzowana książka została przygotow ana jako podręcznik właśnie dla podstawowego etapu nauczania genetyki na Akadem iach Medycznych. We wstępie redaktor pisze „podręcznik... nie wyczerpuje wiedzy ostatnich lat, zaznajam ia jednak z problem am i genetyki nie tylko w aspekcie współczesnej biologii m olekularnej ale i genetyki człowieka”. Pisze też, że zakres podręcznika odpow iada ogólnym treściom program owym przedm iotu „biologia z genetyką” na wydziałach lekarskich.

O ile to drugie twierdzenie jest prawdziwe (w rozdziałach poruszane są hasła podane w uwagach ogólnych Komisji G enetyki Człowieka PAN) o tyle pierwsze twierdzenie w znacznym stopniu nadużywa znaczenia słowa współczesne.

G łów ną wadą recenzowanego podręcznika jest właśnie jego abso lu tna niewspółczesność. Drugą jest poważna liczba błędów. Rozdziały o genetyce klasycznej są w miarę popraw ne ale jednak nie do końca. N a pierwszej stronie wprow adzone są pojęcia m utonu i rekonu, które w zasadzie nie pojaw iają się już od ponad 20 lat w podręcznikach genetyki (jako że jednostką mutacji czy rekombinacji nie jest przecież gen). Podział genów na trzy grupy (takie, które nie kodują nic, kodują RNA i kodują białka) jest też dość unikatowy, szczególnie, że nie jest przyjęte nazywanie genami sekwencji, które są odpowiedzialne za początek replikacji chrom osom u. Enzymy restrykcyjne występują w tym rozdziale wpasow ane pomiędzy denaturację DNA i sekwencje repetytywne, co może nie jest błędem, ale nie jest też logiczne. N a str. 11 podane jest, że m itochondrialny DNA koduje białka rybosom ów (to nieprawda, z jednym wyjątkiem genu var u drożdży). N a str. 20 o snRNA podane jest, że „jest to jedyny znany przypadek, gdy funkcje enzymu spełnia RNA nie białko” co znowu nie jest prawdą. I w końcu rozdziału podaje się, że wirusy RNA nazywane są retrow irusam i, choć istnieje np. wirus grypy, wirus m ozaiki tytoniu i wiele, wiele innych, które choć m ają genomy zbudow ane z RNA na pewno nie są retrowirusam i.

W rozdziale 2 podane jest, że gen może mieć kilka do kilkunastu eksonów, wiadom o, że może być ich znacznie więcej, i tu znow u podane jest, że wycinanie tych intronów jest katalizow ane przez RNA. Podpisy pod rysunkami 7 i 8 są znowu błędne — na rysunku 7 ITS (internal transcribed sequence) podana jest jako intron, a ETS — external transcribed sequence jako ekson, obie sekwencje nie są w zasadzie, ani tym, ani tym, bo są usuwane w procesie dojrzewania pre-rRN A , ale znajdujące się po ich obu stronach odcinki nie są łączone. N a rys. 8 w podpisie jest mowa o dojrzew aniu rybosom ów w kom órkach ludzkich HeLa, ale wielkości rRNA wyraźnie dotyczą E. coli.

Tego typu analizę m ożna zrobić dla każdego rozdziału, ale kilka jest szczególnie niepoprawnych — 3. o regulacji funkcji genu, 6. o dziedziczeniu m onogenowym , 15. o genetycznych podstaw ach onkogenezy, 17. — Inżynieria genetyczna, 19. — G enetyka zachowania, 20. — Podstawy poradnictw a genetycznego, 21. — M apowanie chrom osom ów. Nie znaczy to, że pozostałe są dobre (są błędy w rozdziałach o starzeniu, o immunologii, o cytogenetyce), ale nie jest możliwa szczegółowa ich krytyka ze względu na brak miejsca.

Zrozum ienie regulacji działania genów jest bardzo ważne, ponieważ zaburzenia ekspresji genów prow adzą do wielu różnych chorób u człowieka. Zarów no rozdział o regulacji funkcji genu jak i rozdział o genetycznych podstaw ach onkogenezy w żaden sposób nie przedstawiają współczesnego stanu wiedzy na ten temat. Nie są omówione ani czynniki transkrypcyjne ani cykl kom órkowy. Zrozum ienie powiązań cyklu kom órkowego z procesem pow staw ania now otw orów jest jednym z najważniejszych osiągnięć ostatnich kilku lat. W opisie genomu retrow irusów znowu prom otory i enhancery są nazywane genami, co jest błędem. W opisie genetycznych predyspozycji do choroby nowotworowej brak opisu zespołu L i-Fraum eni, który jest świetnym przykładem — właśnie dla studentów — jak ważny jest p53.

Rozdział 6 — 0 dziedziczeniu monogenowym źle koresponduje z rozdziałem o raku, np. na str. 281 podano, że gen NF1 leży w chrom osom ie 17 (nie wspom ina się co koduje ten gen, choć obecnie to wiadomo), a na str. 82, że nie ma diagnostyki prenatalnej dla zespołu von Recklinghausena, wywoływanego przez mutacje w tym genie, choć była ona możliwa już przed 1993 r. N a str. 283 gen RB jest zlokalizow any w 13q 14, ale na str. 83 przy opisie siatków czaka jego powstanie wywołane jest przez delecję „ram ienia długiego chrom osom u 13 najczęściej prążka 14”. Bardziej


logiczne jest omówienie najpierw podstaw m olekularnych a potem chorób, ale na pewno nie m ożna podawać poszatkow anych i rozrzuconych danych. Podobnie jest z chorobą Alzheimera — na str. 358 na rysunku związany z nią gen jest zlokalizow any w chrom osom ieT4, zaś w opisie na str. 86— 87 mowa jest o genach w chrom osom ach 21 i 19. Opis m ukowiscydozy mógłby być pisany 10 lat temu, a opis dystrofii mięśniowej Duchenne’a nie wspom ina o dystrofii mięśniowej Beckera, wynikającej z mutacji w tym samym genie.

W rozdziale o podstaw ach poradnictw a genetycznego brakuje istotnych informacji. W iadom o, że studenci medycyny nie przepadają za m atem atyką, ale jednak w rozdziale tym należało przynajmniej wspomnieć o tw ierdzeniu Bayesa, bo bez niego pewne rzeczy trudno jest wyliczyć. Z drugiej strony, może w tym momencie przyszli lekarze powinni dowiedzieć się jak powinna być trak tow ana osoba zgłaszająca się po poradę genetyczną, jaki jest sens udzielania takiej informacji i jak należy interpretow ać ryzyko genetyczne. Podane przykłady interpretacji ryzyka genetycznego są zaprzeczeniem zasad stosowanych w poradnictw ie genetycznym. Świadczą też0 braku wiedzy i doświadczenia w tej dziedzinie au to ra rozdziału.

Rozdziały o cytogenetyce i m apow aniu chrom osom ów nie uwzględniają osiągnięć ostatnich lat, a powinny. Rozdział o inżynierii genetycznej — który obejmuje też pewne aspekty terapii genowej, zwanej nie wiadom o dlaczego genoterapią — zawiera bardzo wiele błędów. N a ogół nie podaje się studentom informacji o enzymach klasy III, EcoRI nie tnie w odległości 25— 27 bp od rozpoznawanej sekwencji tylko w jej obrębie. P lazm idy z serii co lE l nie zawsze posiadają geny oporności na tetracyklinę i ampicylinę. Opis wektorów opartych o faga lam bda nie uwzględnia wektorów, w których klonowany fragment zastępuje fragm ent DNA bakteriofaga, stąd też niewłaściwie podana jest wielkość fragm entu, który m ożna klonować w tym wektorze. W ektory służące do klonow ania w pro-1 eukario ta są przemieszane. Część dotycząca terapii genowej miesza teoretyczne możliwości z realnymi dokonaniam i tak, że po jej przeczytaniu bardzo trudno wiedzieć co zrobiono, o czym się myśli i jakie są perspektywy tej niesłychanie ciekawej dziedziny.

W książce brak też pewnych podstawowych definicji, koniecznych dla zrozum ienia podstaw genetyki człowieka takich jak np. allel, genotyp, fenotyp, penetracja i ekspresja. Nie są też om ówione choroby wywoływane przez priony ani przez m utacje w m itochondrialnym DNA.

Reasumując, sądzimy, że książka ta jest nieodpowiednia zarów no dla studentów jak i dla lekarzy z pow odu wielu błędów oraz ze względu na bardzo niewspółczesne podejście do wielu zagadnień.

proj. dr hab. Ewa Bartnik, Zakład Genetyki Uniwersytetu Warszawskiego doc. dr hab. Tadeusz M azurczak, Zakład Genetyki Instytutu M atki i Dziecka prof. dr hab. Andrzej Paszewski, Zakład Genetyki Instytutu Biochemii i Biofizyki P A N

Aby zaprenumerować „P o stępy Biochemii" w 1996 r. należy wpłacić odpowiednią kwotę na konto bankowe w y dawcy (Polskiego Towarzystwa Biochemicznego) za po mocą przekazu zamieszczonego na odwrocie. Zam ów ione egzemplarze będziemy wysyłać pocztą na adres po dany nam na przekazie. Ponieważ odcinek przekazu d o cierający do nas jest jednocześnie zamówieniem, prosimy o bardzo w y raźn e napi

sanie imienia, nazwiska (lub nazwy instytucji) i dokładnego adresu wraz z kodem po cztowym (DRU KO W ANYM I LITERAMI) na wszystkich trzech odcinkach przekazu.

Prenum erata k ra jo w a dla instytucji: 60.00 zł

Prenum erata k ra jo w a in dyw idua lna:28.00 zł (50% zniżki dla cz łonków Polskiego T ow a rzystwa Biochemicznego).

Prenumerując„PostępyBiochemii"wspieraszswojeczasopismo!


K w arta ln ik „ Postępy B ioch em ii "

w ydaw any z pom ocą finansow ą K om itetu Badań Naukow ych

Pokwitowanie dla wpłacającego

z ł ..............................................słow nie.............................................

Odcinek dla posiadacza rachunku

z ł..............................................s iow nie............................................

Odcinek dla poczty lub banku

z ł .........................................słownie......................................

wpłacający....................................... w płacający ..................................... wpłacający..................................

im ię, n a zw isk o , d o k ła d n y a d res z k od em p ocztow ym im ię , n a zw isk o , d o k ł a d n y adres z kodera pocztow ym im ię , nazw isko, d ok ła d n y adres z kodem p o cz to w

na rach u n ek na rachunek na rachunek

Polskie Towarzystw o Biochemiczne 02-093 Warszawa, ul. Pasteura 3P.B.K. X III/0 W -w a, Al. Jerozolimskie 37 00 44 -122 5 -1 39 11

Polskie Towarzystwo Biochemiczne 02-093 Warszawa, ul. Pasteura 3P.B.K. X Ill/O W -wa, Al. Jerozolimskie 37 0044-1225 -139-11

Polskie Towarzystwo Biochemiczne 02-093 Warszawa, ul. Pasteura 3P.B.K. X Ill/O W -wa, Al. Jerozolimskie 37 0044-1225-139-11

stem p el

podpis przyjmującego

s te m p e l

p o d p is przyjm ującego

stem p el

p o d p is przyjm ującego

Pobrano opla

Zł.

http://rcin.org.pl

W s k a z ó w k i d la a u t o r ó w

Wydawany przez Polskie Towarzystwo B iochem iczne kw arta ln ik „Postępy B iochem ii” publiku je prace przeglądow e om aw iające bieżące osiągnięcia , koncepcje i k ierunki badawcze w dziedzin ie b iochem ii i nauk pokrew nych; publiku je też noty z h is to rii b iochem ii, zasady polskiego słow n ictw a b iochem icznego, recenzje nadesłanych książek oraz spraw ozdania ze zjazdów, konferencji i szkół, w których b iorą udzia ł członkow ie Towarzystwa.

Prace przeznaczone do publikacji w „Postępach B iochem ii” mogą m ieć charakter a rtyku łów m onograficznych (do 20 stron tekstu licząc p iśm iennictw o i tabele), m in ire- views (do 10 stron tekstu), oraz krótkich not o najnowszych osiągnięciach i poglądach (do 5 stron tekstu).

Autorzy artykułu odpow iadają za praw id łow ość i ścis łość podawanych in form acji oraz poprawność cytow ania piśm iennictwa. U jęcie prac w inno być syntetyczne, a przedstaw ione zagadnien ie z ilustrow ane za pomocą tabel, rycin, (wykresy, schematy, reakcje), w zorów i fo togra fii.

Wskazany jest podzia ł a rtyku łów m onograficznych na rozdzia ły i podrozdzia ły, których rzeczowe ty tu ły tw orzą spis treści. Zgodnie z przyję tą konwencją rozdzia ły noszą cyfry rzym skie podrozdzia ły odpow iednio rzym skie i arabskie np. 1-1, I-2. Poprawność logiczna i s ty lis tyczna tekstu warunkuje jego jednoznaczność i czytelność. Autorzy przeto w inni unikać składni obcojęzycznej, gw ary laborato ry jne j, a także ograniczać stosow anie doraźnie tw orzonych skrótów, nawet jeże li bywają używane w pracach specja listycznych. Każda z nadesłanych do Redakcji prac podlega ocenie specja lis tów i opracow aniu redakcyjnemu. Redakcja zastrzega sobie m ożliw ość skrócenia tekstu i w prow adzenie zm ian nie w pływ ających na treść pracy, dekla ru je też gotowość konsultowania tekstu z Autoram i.

Przekazanie artykułu do redakcji jest rów noznacznie z ośw iadczeniem , że nadesłana praca nie była i nie będzie publikow ana w innym czasopiśm ie, jeże li zostanie og łoszona w „Postępach B iochem ii” . W przypadku, gdy Au- tor(zy) zam ierza(ją) w łączyć do swego autora artykułu ilus trac je publikow ane przez autorów prac cytowanych, należy uzyskać i przekazać nam odpow iednią zgodę na przedruk.

Redakcja prosi Autorów o przestrzeganie następujących wskazówek szczegółowych:

TEKST: Maszynopis powinien być napisany jednostronnie, czcionką wielkości standardowej, z podwójną interlinią, z lewym marginesem ok. 4 cm z trzydziestoma wierszami na stronie i 60 znakami w wierszu (litery + odstęp), odstępy pomiędzy wyrazami powinny odpowiadać jednemu znakowi (nie równać do prawego marginesu).W tekście nie należy stosować żadnych podkreśleń, ani rozstrzelonego druku. Ewentualne sugestie co do charakteru czcionki drukarskiej mogą Autorzy zaznaczyć ołówkiem na marginesach maszynopisu. W przypadku stosowania w tekście liter alfabetu greckiego trzeba na marginesie wpisać ołówkiem ich fonetyczne brzmienie.

Strona informacyjna m aszynopisu jes t n ienum erowana, zaw iera im iona i nazw isko (a) autora (ów ), nazwy, adresy wraz z numerem telefonu zakładów (w języku polskim

i angielskim ), w których pracują autorzy, adres do korespondencji nr te lefonu i ew entua ln ie fax, adresy prywatne autorów, ty tu ł artykułu w języku polskim i ang ie lskim oraz — w prawym dolnym rogu — liczbę tabel, rycin, wzorów i fo togra fii oraz skrót tytułu pracy (do 25 znaków).

Strona 1 (tytułowa) zaw iera im iona I nazw iska autorów, ty tu ł pracy w języku polskim i” ang ie lskim , rzeczowy spis treści też w obu językach, ty tu ł naukowy każdego z autorów i ich m ie jsce pracy z adresem pocztowym oraz wykaz stosowanych skrótów.Kolejno numerowane dalsze strony obejm ują tekst pracy, p iśm iennictw o, tabele, podpisy i ob jaśnien ia rycin, wzorów i fo tografii.

PIŚMIENNICTWO: Wykaz p iśm iennictw a obejm uje prace w kolejności ich cytow ania w tekście, zaznacza się je liczbam i porządkowym i u jętym i w naw iasy kwadratowe, np. [3,7,9,— 26]. Odnośniki b ib liogra ficzne w inny mieć nową uproszczoną form ę. Sposób cytow ania czasopism (1), m onografii (2), rozdzia łów z książek jednotom owych(3), rozdzia łów z tom ów serii opracowanej przez tych samych redaktorów (4), rozdzia łów z tom ów serii opracowanych przez różnych redaktorów (5) wskazują poniżej podane przykłady:

1. H ildenbrandt GR, Aronson NN (1980) B iochim Bio- phys Acta 631: 499— 502

2. Bostock CJ, Sum ner AT (1978) The Eukaryotic Chromosome, E lsevier, North-Holand, Am sterdam

3. Norberth T, P iscator M (1979) W: Friberg L, Nordberg GF, Von VB (red) Handbook on the Toxicology of Metals. E lsevier, North-Holland, Am sterdam , str 541-553

4. Delej J, Kesters K (1975) W: Florkin M, Stotz EH (red) Com prehensive B iochem istry t 29B. Elsevier, N orth-Holland Am sterdam , str 1-77

5. Franks NP, Lieb WR (1981) W: Knight CG (red) Research Monographs in Cell and Tissue Physiology, t 7. E lsevier, North-Holland, Am sterdam , str 243-272

ILUSTRACJE: Ryciny winny być gotowe do reprodukcji. Fotografie czarno-białe (kontrastowe), powinny być wykonane na papierze matowym. Pozostałe ryciny należy wykonać tuszem na białym papierze lub kalce technicznej. Wskazane jest, aby ryciny były dwukrotnie większe od przyszłej reprodukcji, tj. w skali 2:1. Cyfry i litery służące do opisu rysunku powinny mieć wysokość nie mniejszą niż 5 mm. Na rysunkach nie należy umieszczać opisów słownych, lecz posługiwać się skrótami. Osie wykresów winny być opatrzone napisem łatwo zrozumiałym. Decyzję o stopniu zmniejszenia ryciny podejmie redakcja. Ilustracji nie należy włączać w tekst maszynopisu, lecz odpowiednio ponumerować: tabele i ryciny noszą cyfry arabskie, wzory zaś rzymskie. Na marginesie tekstu należy zaznaczyć ołówkiem preferowane miejsce umieszczenia tabeli, ryciny, czy wzoru. Tabele odpowiednio porub- rykowane, winny być opatrzone jednoznacznym tytułem i ewentualnie także niezbędnymi objaśnieniami. Słowne objaśnienia znaków graficznych można umieścić w podpisie pod ryciną, rysunkowe zaś jedynie na planszy ryciny. Tytuły i objaśnienia rycin sporządza się w postaci oddzielnego wykazu. Ilustracje należy podpisać nazwiskiem pierwszego z autorów i pierwszym słowem tytułu pracy oraz oznaczyć „góra-dół” (ołówkiem na odwrocie). Ze względu na wewnętrzną spoistość artykułu wskazane jest konstruowanie orginalnych rycin i zbiorczych tabel na podstawie danych z piśmiennictwa.

M aszynopis i za łączniki (w dwu egzem plarzach), w łaśc iw ie zabezpieczone przed uszkodzeniem w czasie transportu, należy przesłać na adres:

Redakcja kw arta ln ika „Postępy B iochem ii”Instytut B io log ii Doświadczalnej im. M. Nenckiego, ul. Pasteura 3,02-093 W arszawahttp://rcin.org.pl

http://rcin.org.pl

Documents

Advances in Biochemistryrcin.org.pl/Content/30340/WA488_24008_P939_T41-z4-PB.pdfpodziałowy komórek, na pewnym etapie mają te same wspólne mechanizmy regulacji (poprzez geny wczesnej