AFLATOKSIN

DISUSUN OLEH

YANTI 09308141006CHARISA GLESIANDRA 09308141012MORIZ EKA PANJALU 09308141019TITIS ADHIARAMANTI 09308141039

AFLATOKSIN

• Merupakan mikotoksin yang dihasilkan oleh Aspergillus flavus.

• Aflatoksin merupakan metabolit sekunder, sehingga dihasilkan pada saat fase stasioner

• Jenis aflatoksin terdiri dari aflatoksin B dan G

STRUKTUR AFLATOKSIN

SINTESIS AFLATOKSIN

SINTESIS AFLATOKSIN

SUMBER KARBON DALAM PRODUKSI AFLATOKSIN

• Sumber karbon yang baik– Glukosa– Sukrosa– Fruktosa

• Sumber karbon yang tidak baik– Laktosa– Galaktosa– Maltosa– Xylosa– Sorbosa– Sorbitol– Mannitol– glIserol– Asetate– Suksinat– malate

PEMBUATAN BIBIT• Menumbuhkan Aspergillus flavus pada media

potato dextrose agar miring dan menginkubasinya pada suhu 25oC selama 5-21 hari untuk pembibitan

• Menambahkan 3-5ml aquades dan mengusap permukaan surface secara perlahan untuk mengambil spora yang akan digunakan sebagai inokulum

• Selanjutnya spora tersebut siap untuk diinokulasikan pada media baik media agar maupun media liquid

SURFACE CULTURE

SURFACE CULTURE• Suspensi spora yang telah tersedia dari hasil

pembibitansebanyak 1 ml diinokulasikan pada permukaan media potato dextrose agar (500 ml) pada labu erlenmeyer

• Kemudian labu erlenmeyer tersebut diinkubasikan pada suhu 28oC dengan pH 3,3

• Setelah 11 hari seluruh labu erlenmeyer akan berisikan spora yang berlimpah.

• Spora tersebut kemudian dikeluarkan dengan cara memukul dasar labu secara perlahan agar tidak merusak spora

SURFACE CULTURE

• Untuk memanen dan memisahkan spora dari konidiofor, 100 ml aquades ditambahkan ke dalam labu dan diaduk perlahan

• Selanjutnya larutan tersebut dituangkan kedalam labu erlenmeyer yang steril dan dikukus untuk mengcegah terjadinya perkecambahan

• Spora tersebut kemudian dicuci dengan aquades dan diekstraksi dengan 150ml metanol untuk memisahkan aflatoksin dari spora tersebut.

SUBMERGED CULTURE

PRODUKSI AFLATOKSIN PADA MEDIUM STATIS

• Inokulum yanhg digunakan terdiri dari 0,5 ml dari berat suspensi spora ( 5ml aquades ditambahkan pada slant yang berumur 2-3minggu)

• Inokulum tersebut kemudian dinokulasikan pada labu erlenmeyer dengan media potato dextrose broth sebanyak 500ml dengan pH 3,3

• Kemudian labu erlenmeyer tersebut diinkubasikan secara statis pada suhu 28oC selama 4 hari

• Setelah 4 hari, sampel di bersihkan dan di ekstraksi

PRODUKSI AFLATOKSIN PADA MEDIUM STATIS

• sampel yang telah dibersihkan tersebut kemudian diikonsentrasikan pada vacum sebanyak 505ml kemudian diekstraksi tiga kali dengan kloroform sebanyak 500ml

• Produk mentah/kasar sebanyak 136mg didapatkan dengan terjadinya evaporasi/ penguapan kloroform dari kombinasi ekstrak yang dikromatografikan pada asam silikat dengan 1% etil alcohol pada kloroform

PRODUKSI AFLATOKSIN PADA SWIRLED MEDIUM

• 0,5ml inokulum diinokulasikan ke dalam labu erlenmeyer yang berisi 500ml medium potato dextrose broth

• Selanjutnya diinkubasikan selama 4 hari dengan suhu 30oC dengan pH 3,3 pada rotary shaker dengan aerasi sebesar 0,3 volume/volume-minute dan agitasi sebesar 600 rev/min

• Setelah 4 hari sampel kemudian dibersihkan dan di ekstraksi

RECOVERY AFLATOKSIN• Aflatoksin diekstraksi dengan mencampurkan

50ml larutan sampel dengan campuran methanol-aquades (55:45, v/v) sebanyak 250 ml pada Waring Blendor selama 2 menit

• Hasil dari campuran tersebut disentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan 3,000 rev/min,

• Cairan supernatant disaring menggunakan kertas saring steril secara aseptik

RECOVERY AFLATOKSIN

• Kemudian filtrat diekstrak dengan 100 ml hexane pada corong pemisah untuk memisahkan lipid yang kemudian dicuci dengan 50 ml campuran methanol-aquades (55:45, v/v).

• Kemudian hasil pemisahan tersebut dicuci dan dikonsentrasikan pada vacum untuk memisahkan/menghilangkan methanol sehingga di dapatkan alfatoksin murni

ASSAY AFLATOKSIN• Fluorescence (pendaran) yang mengindikasikan

keberadaan aflatoksin diukur dengan menggunakan Turner fluorometer model 110

• Sebelum pembacaan dilakukan, instrumen tersebut di set hingga angka nol dengan solvent blank (aquades)

• Kertas kromatogram dipasang descending (menghadap ke bawah)

• Larutan diambil dengan menggunakan mikropipet

ASSAY AFLATOKSIN• Digunakan 2 pelarut, yaitu pelarut (A) lapisan atas yang

terdiri dari 1-butanol-glacial acetic acid-deionized water dan pelarut (B) yang terdiri dari benzene-toluene-cyclohexane-95% ethyl alcohol-water (3:3:5:8:3)

• RF (Ratio fluorescence) aflatoksin yang dapat terbaca pada pelarut A sebesar 0.68-0.75

• Sedangkan pelarut B memisahkan aflatoxins G (RF, 0.34-0.43) dan B (RF, 0.49-0.58)

• Zona yang mengandung aflatoksin dapat diketahui dengan melihat pendaran aflatoksin pada Chromato-Viewer dengan panjang gelombang cahaya sebesar 366 mµ

ASSAY AFLATOKSIN• Lapisan tipis chromatoplates di-running dengan

menggunakan metode W. A. Pons, Jr• Plates/lapisan tersebut dilapisi/diselubungi dengan

silika gel dengan ketebalan 0.3 mm• Kemudian dicuci dengan menggunakan kloroform

yang mengandung 3% methanol (v/v)• Selanjutnya lapisan tersebut diperiksa dengan

menggunakan Chromato-Viewer.• Hasilnya 4 jenis aflatoksin yaitu B1 (Rf 0.47), B2 (Rf

0.43), G1 (Rf 0.38) dan G2 (Rf 0.33) akan terpisah dan dapat terbaca