UNIVERSIDAD DE SAN MARTIN DE PORRESFACULTAD DE MEDICINA HUMANA

DIFERENCIACIN BIOQUIMICA DE BACTERIAS GRAM POSITIVASII/2015

SAAVEDRA VSQUEZ DIANA ALEJANDRA

GILES SAAVEDRA, JUAN

PRCTICA N05:METODOLOGAPruebas bioqumicas para Staphylococcus y Streptococcus1. Observar el tipo de hemolsis que se forma en las placas de agar sangre2. Realiza la prueba de catalasa con una colonia de la placa de agar sangre (AS) y con una del manitol salado (MS).3. Para la prueba de coagulasa, en dos tubos con un mL de plasma cada uno, depositar en uno 0,5 mL del cultivo de Staphylococcus aureus y en otro un mL de S.epidermidis. Incubar 30 minutos a 37 C.4. Prepara frotis de las colonias que han desarrollado en AS y en MS.

Fermentacin del manitol El agar manitol salado es un medio altamente selectivo para el aislamiento de estafilococos patgenos en cultivos mixtos, ya que se aprovecha la capacidad de los estafilococos de desarrollar en presencia de NaCl al 7,5% y la de fermentar manitol; en este caso se observar la formacin de un halo amarillo en el agar circundante a las colonias.

Coagulacin del plasma Staphylococcus aureus produce una protena llamada coagulasa, capaz de aglutinar el plasma tratado con oxalato, citrato o heparina en presencia de un factor contenido en el suero. Este factor srico reacciona con la coagulasa, activando el fibringeno y produciendo un coagulo o trombo de fibrina. La coagulasa se presenta en forma unida (adherida a la clula) y en forma libre. El estudio de la actividad coagulasa se puede llevar a cabo en un tubo de ensayo (para coagulasa libre) y en portaobjetos (coagulasa nido), tambin llamado factor de agregacin la prueba en tubo se hace poniendo 1 mL de plasma al que se le agrega una asada de un cultivo nocturno de S.aureus. Se incuba la mezcla a 37 C durante 4 horas y se considera positivo ante cualquier grado de coagulacin.

Prueba de catalasa La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. Se encuentra presente en la mayora de los microorganismos aerbicos y anaerbicos facultativos, excluyendo los estreptococos. La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida con desprendimiento de burbujas: la enzima catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno molecular. Esta prueba se emplea para diferenciar los gneros Micrococcus y Staphylococcus (catalasa positivo) del gnero Streptococcus (catalasa negativo).

RESULTADOS Pruebas bioqumicas para Staphylococcus y Streptococcus: Fermentacin de manitol Hemlisis en agar sangre Prueba de catalasa Coagulacin del plasma

FERMENTACIN DE MANITOLImagen N01: medio de cultivo manitol salado, color rosado (manitol no fermentado)

Imagen N02: medio de cultivo manitol salado, color amarillo (manitol fermentado)

PRUEBA HEMLISIS DE SANGREImagen N03: Medio de cultivo agar sangre hemolticos

Imagen N04: Medio de cultivo agar sangre hemolticos

PRUEBA DE CATALASAImagen N05: Catalasa positivo Imagen N06: catalasa negativo

PRUEBA COAGULASAImagen N07: coagulasa negativa Imagen N08: coagulasa positiva, se aprecia la formacin de coagulo

DISCUSIONES: AGAR MANITOL SALADOSe trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina, en esta prctica nosotros lo usamos para la diferenciacin entre estafilococos y estreptococos por el cambio de color en el indicador de PH (rojo de fenol). Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y fermentan el manitol, producen cidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol.Los Staphylococus aureus hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante.Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o rosada.

PRUEBA HEMOLISIS DE SANGRE

Las colonias de S.aureus son grandes, lisas, enteras, presentan consistencia cremosa.El gnero Streptococcus es exigente y por lo tanto debe ser cultivado en medios ricos que le aporten los nutrientes necesarios, por ejemplo, agar sangre ovina. El efecto que tiene los estreptococos sobre el agar sangre (hemlisis). Nos sirve para poder clasificar este grupo de grmenes en: hemolticos: son aquellos que producen una hemlisis total de los glbulos rojos, observndose como un halo transparente alrededor de las colonias. hemolticos: son aquellos que producen hemlisis parcial, la cual se observa como un halo con tonalidad verdosa alrededor de las colonias.Gamma hemolticos: son aquellos que no producen hemlisis sobre agar sangre

El Streptococcus pneumoniae a pesar de ser patgeno es hemoltico

PRUEBA DE CATALASALa enzima catalasa, desdobla el perxido de hidrogeno en agua y oxgeno. La reaccin se manifiesta como desprendimiento de burbujasCatalasa positivo Catalasa negativoStaphylococcus StreptococcusMicrococcus Enterococcus Planococcus AerococcusStomacoccus Planococcus

PRUEBA DE COAGULASAPermite separar S.aureus , que posee coagulasa, de las otras especies de estafilococos que genricamente se denominan coagulasa negativos.El Sthaphylococcus aureus produce una protena llamada coagulasa, capaz de aglutinar el plasma. El factor srico reacciona con la coagulasa, activando el fibringeno y produciendo el coagulo.

La prueba de la coagulasa es usada especficamente para diferenciar las especies del genero staphylococccus:

S. aureus Positiva

S. epidermidis Negativa

CONCLUSIONES: En la prueba de agar manitol salado se diferencia los estafilococos de estreptococos, ya que los estreptococos no sobreviven en este medio. Adems tambin se puede diferenciar segn el tipo de estafilococo ya que las colonias se vuelven amarillas cuando es un Staphylococus aureus por que el medio es cido y se fermenta manitol, y se vuelven fucsias cuando no fermentan manitol, puede ser un estafilococo cualquiera menos el aureus. Se logr determinar la presencia de la catalasa en el cultivo de Staphylococcus spp por medio de la prueba de la catalasa Slo los S. aureus dan positiva a la prueba de coagulasa La coagulasa es una protena producida por varios microorganismos que permite la conversin del fibringeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distingir entre diferentes tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la muestra contiene Staphylococcus aureus. El agar sangre es una combinacin de un agar base (agar nutritivo) con el agregado de 5% de sangre ovina, tambin puede usarse sangre humana, para cultivos en una placa de Agar. El agar sangre aporta muchos factores de enriquecimiento. Se usa tambin para ver la capacidad hemoltica de los microorganismos patgenos (que es un factor de virulencia). Observando los halos hemolticos alrededor de las colonias se determina el tipo de hemlisis que posee:alfa: halos verdosos (reduccin de la hemoglobina de los glbulos rojos a metahemoglobina en el medio)beta: halos incoloros (hemolisis total)gamma: inexistencia de halos (sin hemolisis)

BIBLIOGRAFA: Madigan M.T., Martinko J.M. y Parker J. (2004) Brock: Biologa de los Microorganismos 10ma Edicin Prescott L.M., Harley J.P. y Klein D.A. (2003) Microbiologa 4ta Edicin MacFaddin JF. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. Ed. Mdica Panamericana; 2003. 856 p. Koneman EW, Allen S. Koneman. Diagnostico Microbiologico/ Microbiological diagnosis: Texto Y Atlas En Color/ Text and Color Atlas. Ed. Mdica Panamericana; 2008. 1699 p.