AGUA DE COCO (Cocus nucifera), SUERO FETAL BOVINO, ALOE VERA Y

SUS COMBINACIONES PARA LA CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN OVINO

POR:

I.A.P.P. WENCESLAO COSME REYES

Tesis presentada como requisito parcial para obtener el grado de

Maestro en Ciencias

Área Mayor: Reproducción y Genética Animal

Universidad Autónoma de Chihuahua

Facultad de Zootecnia

Secretaría de Investigación y Posgrado

Chihuahua, Chih., México Junio de 2005

Agua de coco (Cocus nucifera), suero fetal bovino, aloe vera y sus combinaciones para la criopreservación de semen ovino. Tesis presentada por I.A.P.P. Wenceslao Cosme Reyes como requisito parcial para obtener el grado de Maestro en Ciencias, ha sido aprobada y aceptada por:

M.A. Javier Martínez Nevárez Director de la Facultad de Zootecnia Ph.D. Felipe Alonso Rodríguez Almeida Secretario de Investigación y Posgrado Ing. Francisco Javier Camarillo Acosta Coordinador Académico de Investigación y Posgrado Ph.D. Jaime Gutiérrez Alderete Presidente Fecha

Comité:

Ph.D. Jaime Gutiérrez Alderete M.C. Manuel Pérez Durán Ph.D. Jorge Alfonso Jiménez Castro M.C. Oscar Alejandro Viramontes Olivas

ii

AGRADECIMIENTOS

A Dios todopoderoso, por haberme permitido alcanzar una meta más en mi

vida.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por haberme

otorgado la beca para realizar estudios de posgrado.

A la Facultad de Zootecnia y a sus profesores por ser parte en mi formación

profesional.

A mi asesor el Ph.D. Jaime Gutiérrez Alderete, por su amistad, sus consejos y

asesoramiento para la realización de esta tesis.

En especial al M.C. Manuel Pérez Durán, quién me capacitó para poder realizar

el trabajo de laboratorio y además fue un gran apoyo para fortalecer mi

formación como profesionista.

A mi estadístico el Ph.D. Jorge Jiménez Castro y a M.C. Oscar A. Viramontes

Olivas, por las sugerencias y tiempo ofrecido en este proyecto.

A la empresa “Productos Biológicos del Pacífico” y “PAA Laboratorios, Inc.

División México,” por haber colaborado con la donación de suero fetal bovino

para la realización de esta investigación.

A mis amigos de Sonora (Carlos, Gil, Manuel, Rodolfo, Jahzeel), y paisanos

(Emmanuel, Alberto, Abad y Gamboa). A mis compañeros de la casa: Juan

Carlos Cortés, J. C. Galicia, Martín, Lety, Araceli y el charolito. Finalmente a:

Monika, Conchy, F. Serrano, Ramón, Dalia, Muro, Adriana, Elena, Coralia,

Everardo, Alfonso, José Manuel, Melchor, Tere, Nacho, Berta, Griss, Melissa y

Raquel, por haber compartido conmigo esta inolvidable aventura.

DEDICATORIAS

A mi mamá Leticia, por ser alguien muy importante en mi vida, que sin su

apoyo, no hubiera llegado a ser un profesionista.

A mi papá Carlos, por sus consejos y enseñanzas, además de ser ejemplo a

seguir.

A mis hermanos: Guadalupe, Carlos y Astrid, por ser parte de esta gran familia;

por su incondicional apoyo y por el cariño que me han mostrado.

A mis abuelitos Wenceslao y Guadalupe que aunque ya no estén conmigo, se

que siempre están pendientes de mi.

A mis abuelitos Primo y María Elena, por quererme mucho y estar pendientes

en mi formación.

A todos mis tíos, especialmente a mi tía Laura y Mary, por todo su apoyo desde

el momento que estuve fuera de la casa, a mis primos y sobrinos por sus

consejos y apoyo en el momento que más lo he necesitado.

A dos grandes profesores de la licenciatura, Lic. Andrés D. Rubio López y M.C.

José Luis Espino Martínez, por seguir siendo mis grandes amigos y por todos

sus consejos.

A MI MUNICIPIO ZONGOLICA, VERACRUZ.

CURRÍCULUM VITAE

El autor de este trabajo nació el 26 de noviembre de 1977 en la ciudad de

Orizaba, Veracruz.

1998 - 2003 Estudios en el Tecnológico Agropecuario No.

18 de Ursulo Galván, obteniendo el título de

Ingeniero Agrónomo en Producción

Pecuaria.

2003 - 2005 Estudiante graduado de la Secretaría de

Investigación y Posgrado de la Facultad de

Zootecnia, de la Universidad Autónoma de

Chihuahua.

RESUMEN

AGUA DE COCO (Cocus nucifera), SUERO FETAL BOVINO, ALOE VERA Y

SUS COMBINACIONES PARA LA CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN OVINO

Por:

I.A.P.P. WENCESLAO COSME REYES

Maestría en Ciencias

Secretaría de Investigación y Posgrado

Facultad de Zootecnia

Universidad Autónoma de Chihuahua

Presidente: Ph. D. Jaime Gutiérrez Alderete

La crioprerservación de células espermáticas permite conservar y disponer de

material genético por largos periodos de tiempo. El objetivo fue evaluar agua de

coco y su combinación con un diluyente no convencional: suero fetal bovino o

aloe vera (Aloe barbadensis, Miller), para la criopreservación de semen ovino a

largo plazo. El estudio se realizó durante los meses de octubre y noviembre de

2004 con un ovino raza Blackbelly y un total de ocho eyaculados, los cuales

fueron divididos para trabajar dos diluyentes por sesión. Se empleó 50 % de

agua de coco (AC) y 50 % de citrato de sodio al 2.9 % en combinación con

suero fetal bovino (SFB) o aloe vera (AV). Dichos diluyentes tenían

concentraciones y combinaciones desde 10 a 70 %. En total se probaron 14

diluyentes y un testigo (80-0). Se evaluó motilidad progresiva (MP) y

espermatozoides vivos (EV) en cinco periodos: al diluir el semen a 35 ºC,

finalizado el tiempo de equilibramiento, concluido el proceso de congelamiento,

48 h y 90 d poscongelamiento. El análisis de las variables MP y EV se realizó

con un modelo de regresión múltiple con intercepto igual a cero. La mayoría de

las combinaciones estuvieron dentro de los rangos aceptables, obteniendo

valores iguales o superiores al tratamiento testigo de 40 % MP, sin embargo los

diluyentes 10-70 SFB y 40-40 AV fueron mejores a los 90 d poscongelamiento

con 60 % de MP. En el otro extremo los tratamientos 20-60 AV y 10-70 AV no

cumplieron con los estándares mínimos establecidos para semen descongelado

debido a que obtuvieron 30 y 20 % de MP respectivamente, en los diferentes

tiempos de evaluación. Se concluye, que las diferentes combinaciones de AC

con el diluyente no convencional SFB, ofrecieron mejores medios apropiados

para la dilución y preservación de semen en comparación con el diluyente no

convencional AV, cuando dichas concentraciones excedían 50 % de dicho gel.

ABSTRACT

COCONUT MILK (cocus nucifera), BOVINE FETAL SERUM ALOE VERA

AND THEIR COMBINATIONS FOR THE CRIOPRESERVATION

OF OVINE SEMEN

The cryopreservation of sperm cells help us to keep and use genetic

resources for long time. The objetive was to evaluate the coconut milk and

two no conventional extenders: bovine fetal serum or aloe vera (Aloe

barbadensis, Miller), and some combinations among then Blacbelly ram

semen. This work was carried out on october and November, 2004 a

Blackbelly ram. The samples were divided for working two kind of

extenders on different time prefreezing and postfreezing. It were used 50

% of coconut milk and 50 % of sodium citrate (2.9 %). The extenders had

concentrations and combinations from 10 to 70 %, finally were divided to

prove 14 diluents and a control treatment (80-0). The progresive motility

and live sperms were evaluated on five different periods: at mixing semen

at 35 ºC, ending the equilibrium time and after freezing: 48 h and 90 d.

The data analysis was done with a multiple regression model. Most of the

combinations behad according to standard parametres, with equal or

higher values than 40 % of MP. Howerever the extanders 10-70 SFB and

40-40 AV were the best diluents at 90 d postfreezing with 60 % of MP. On

the other hand the treatments 20-60 AV and 10-70 AV were better than

the standard values for unfreezing semen on different time of evaluation.

We conclude that different combinations of coconut milk with a no

conventional diluent gave better results of semen dilution and

preservation as they are compared with the AV extender when those

concentrations were higher than 50 % of AV gel.

CONTENIDO Página

RESUMEN ………………………………………………………………………. vi

ABSTRACT ……………………………………………………………………… viii

LISTA DE CUADROS …………………………………………………………. xiii

LISTA DE GRÁFICAS …………………………………………….…………… xiv

LISTA DE CUADROS DEL APÉNDICE …………………………………….. xv

INTRODUCCIÓN ……………………………………………………………….. 1

REVISIÓN DE LITERATURA …………………………………………………. 3

Tecnología del Semen ………………………………………………. 3

Factores de Variación en la Producción Espermática ……………. 3

Edad del macho ………………………………………………… 3

Tamaño de los testículos ……………………………………… 3

Efectos alimentarios …………………………………………… 4

Efectos estacionarios ………………………………………….. 4

Recolección del Semen ……………………………………………… 5

Vagina artificial ………………………………………………….. 5

Electroeyaculación ……………………………………………… 6

Semen y sus Características ………………………………………… 6

Evaluación de la Calidad Seminal …………………………………... 7

Volumen …………………………………………………………. 7

Color ……………………………………………………………… 8

Consistencia …………………………………………………….. 8

Concentración …………………………………………………… 8

Motilidad …………………………………………………………. 9

Motilidad masal ………………………………………………….. 9

Motilidad progresiva …………………………………………….. 9

Morfología de los espermatozoides …………………………... 9

Diluyentes ……………………………………………………………… 10

Regulación de pH ……………………………………………….. 10

Protección contra el choque térmico ………………………….. 11

Sustancias crioprotectoras …………………………………….. 11

Fuentes de energía ……………………………………………... 12

Antibióticos ………………………………………………………. 12

Dilución del Semen …………………………………………………… 13

Diluyentes Convencionales ………………………………………….. 13

Diluyentes no Convencionales ………………………………………. 14

Aloe vera ………………………………………………………….. 14

Suero fetal bovino ……………………………………………….. 14

Agua de coco …………………………………………………….. 15

Glicerado y Equilibramiento …………………………………………. 16

Congelamiento, Envasado y Almacenamiento del Semen ………. 17

MATERIALES Y MÉTODOS ………………………………………………….. 19

Descripción del Área de Estudio …………………………………….. 19

Descripción de la Población ………………………………………….. 19

Diluyentes ………………………………………………………………. 19

Preparación de Diluyentes ……………………………………………. 21

Citrato de sodio ………………………………………………….. 21

Agua de coco ……………………………………………………. 21

Suero fetal bovino ……………….………………………………. 21

Aloe vera ………………………………………………………….. 21

Recolección del Semen ………………………………………………. 21

Evaluación del Semen ………………………………………………… 22

Dilución del Semen ……………………………………………………. 23

Enfriamiento del Semen ………………………………………………. 23

Segunda Dilución o Gliceración ……………………………………… 23

Envasado y Congelamiento ………………………………………….. 24

Descongelamiento …………………………………………………….. 24

Variables a Medir ………………………………………………………. 24

Análisis Estadístico de la Información ………………………………. 25

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ………………………………………………... 26

Fase de Dilución P0 …………………………………………………… 29

Finalizado el Tiempo de Equilibramiento (P1) ……………………… 32

Concluido el Proceso de Congelamiento (P2) ……………………… 33

Cuarenta y Ocho Horas Poscongelamiento (P3) ............................ 35

Noventa Días Poscongelamiento …………………..………………… 38

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ……………………………….. 43

LITERATURA CITADA ……………………………………………………….. 45

APÉNDICE ………………………………………………………………………. 50

LISTA DE CUADROS

Cuadro Página

1 DESCRIPCIÓN DE LOS TRATAMIENTOS (Trat.) CON

BASE EN AGUA DE COCO (AC) EN COMBINACION CON

DILUYENTES NO CONVENCIONALES: SUERO FETAL

BOVINO (SFB) O ALOE VERA (AV) …………………………..

20

2 PORCENTAJE DE MOTILIDAD PROGRESIVA Y

ESPERMATOZOIDES VIVOS EN CINCO PERIODOS DE

EVALUACIÓN……………………………………………………..

27

3 VALORES DE pH MEDIDOS Y CORREGIDOS AL

MOMENTO DE PREPARAR LOS DILUYENTES ……………

28

LISTA DE GRÁFICAS

Gráfica Página

1 Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un

modelo de regresión con diferentes niveles de agua de

coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones

de suero fetal bovino en el P0…………………...…………...

30

2 Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un

modelo de regresión con diferentes niveles de agua de

coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones

de aloe vera en el P0……………………...…………………..

31

3 Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un

modelo de regresión con diferentes niveles de agua de

coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones

de suero fetal bovino en el P3…………………...…………...

36

4 Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un

modelo de regresión con diferentes niveles de agua de

coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones

de aloe vera en el P3 .………………….……………………..

37

5 Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un

modelo de regresión con diferentes niveles de agua de

coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones

de suero fetal bovino en el P4 …………………..…………...

40

6 Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un

modelo de regresión con diferentes niveles de agua de

coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones

de aloe vera en el P4………………………………………….

42

LISTA DE CUADROS DEL APÉNDICE

Anexo Página

1 SISTEMA DE VALORACIÓN DE MOTILIDAD MASAL …….. 51

2 COMPOSICIÓN DEL AGUA DE COCO DE UN FRUTO DE

SEIS MESES DE MADURACIÓN ..........................................

52

1

INTRODUCCIÓN

El procesamiento de semen es una técnica que permite criopreservar y

disponer de células espermáticas por largos periodos de tiempo y con ello

preservar recursos genéticos, dado que tiene muchas aplicaciones, tanto en

biotecnología, como en la conservación de la especie y la medicina clínica

(Yoshida, 2000). Sin embargo, los intentos de diluir y almacenar el semen de

carnero han tenido un éxito limitado, a pesar de que la motilidad de los

espermatozoides puede mantenerse después de 24 h de almacenamiento, pero

disminuye la fertilidad al momento de la inseminación artificial (Córdoba et al.,

1989) debido a la susceptibilidad que presentan los espermatozoides de ovino

al proceso de criopreservación. Esta bien documentado que la población

sobreviviente al descongelamiento, se caracteriza por una pérdida de viabilidad

y un menor número de células móviles (Watson, 2000). Diversas sustancias se

han utilizado como diluyentes en la tecnología del semen ovino buscando

minimizar los efectos negativos, pero aún con las mejores técnicas y todos los

desarrollos en estos años la mejor recuperación de la célula después del

descongelamiento es apenas 50 % (Vishwanath y Shannon, 2000).

Nunes y Fernández (2001) encontraron resultados satisfactorios

utilizando 50 % de agua de coco y 50 % de citrato de sodio al 2.5 % en la

criopreservación de semen ovino, mientras que Rodríguez (1988) observó

excelentes resultados con la combinación de 40 % de gel de aloe vera y 54 %

de citrato de sodio al 3 %. En otro estudio, Madrid (2004) encontró el mejor

tratamiento cuando combinó suero fetal bovino al 30 % y 10 % de yema de

Huevo con una solución amortiguadora de 60 % de citrato de sodio al 2.9 %.

2

Teniendo conocimiento, respecto a los diluyentes antes mencionados, se

consideró que sus combinaciones podrían dar como resultado un protocolo

eficiente para el congelamiento de semen.

El objetivo fue evaluar agua de coco y diferentes combinaciones con

diluyentes no convencionales: suero fetal bovino o aloe vera, para la

criopreservación de semen ovino a largo plazo. Se pretende encontrar los

mejores niveles de estos extensores seminales, que ofrezcan las condiciones

necesarias para su preservación en buena calidad posdescongelamiento, y así

conservar el potencial genético de un buen semental y por consecuencia un

más rápido avance genético.

3

REVISIÓN DE LITERATURA

Tecnología del Semen

El semen puede ser procesado de diferentes maneras, pudiendo ser

usado: fresco (puro o diluido); refrigerado y congelado. El semen fresco y el

refrigerado presentan fertilidad más elevada. El congelado se preserva por un

período de tiempo indefinido si es mantenido en nitrógeno líquido a -196 ºC y es

de mayor aplicabilidad, comparado al semen refrigerado a 4 ºC, cuya viabilidad

máxima es de 48 h. Producto de la eyaculación normal de un reproductor, el

semen es compuesto de espermatozoides producidos en los testículos y una

fracción líquida producida por las glándulas sexuales accesorias (Nunes y

Fernández, 2001).

Factores de Variación en la Producción Espermática

Edad del macho. En el ovino la pubertad se asocia a un notable incremento en

la secreción de testosterona, la espermatogénesis y conducta de apareamiento.

El tamaño testicular aumenta cuando los corderos tienen de 8 a 10 semanas de

edad y peso corporal de 16 a 20 kg. Esto coincide con la aparición de

espermatocitos primarios y el crecimiento de los túbulos seminíferos, la cópula

con eyaculacion de espermatozoides viables ocurre entre los 4 y 6 meses de

edad, con un peso corporal de 40 a 60 % del equivalente al peso de un animal

maduro (Jainudeen et al., 2002).

Tamaño de los testículos. Algunos autores han observado mayor producción

de semen en relación a un tamaño mayor de los testículos. Los testículos

pequeños son casi siempre índice de infertilidad (Agraz, 1984). El tamaño de

los testículos ha demostrado ser un buen indicador de la capacidad

4

espermatogénica de un semental, como lo atestiguan numerosos trabajos

realizados en diferentes especies, principalmente la bovina. La medida más

práctica para evaluar el tamaño de los testículos es la circunferencia escrotal, la

cuál tiene una alta correlación con el peso y el volumen. A su vez, el peso

testicular está en función directa con la cantidad de tejido parenquimático

productor de esperma y, por lo tanto, con el volumen y la concentración

espermática del eyaculado (De la Vega et al., 2001).

Efectos alimentarios. La mala nutrición de los machos provoca una

disminución en la capacidad espermatogénica, especialmente durante la fase

de crecimiento. Por el contrario, una alimentación excesiva, produce un

descenso en la calidad del semen y una reducción en la líbido (Ramírez y Miller,

2004). Thwaites (1995) menciona que la desnutrición causa una progresiva

disminución del tono y volumen testicular, además indica que se observa un

aparente efecto de la frecuencia de eyaculados sobre el volumen testicular y

calidad seminal, ocasionando un estado de agotamiento y desnutrición del

macho, al ser sobre explotado en períodos cortos y sometidos a una

alimentación inadecuada.

Efectos estacionarios. Los pequeños rumiantes presentan, como sus

ancestros salvajes, un período de reposo sexual estacional de duración e

intensidad variable entre razas. Ambos sexos tienen una actividad sexual

disminuida en primavera y verano y máxima en otoño e invierno. Esta

estacionalidad resulta de una combinación, aún mal conocida, entre un ritmo

endógeno circanual y la interpretación por el sistema nervioso central de la

duración de la noche, vía la secreción de melatonina de origen pineal.

5

(Chemineau et al., 2003). Sin embargo Agraz (1984) menciona que el volumen

y la movilidad del semen aumentan durante el verano y el otoño, que son las

temporadas de reproducción habituales y que la recolección de semen es

posible todo el año, sin embargo, la concentración y calidad del semen

recolectado presenta importantes variaciones estacionales.

Recolección del Semen

La recogida del eyaculado deberá de efectuarse en las mejores

condiciones tanto para el semental como para el operador (Villena, 2002). Cada

eyaculación depende de varios factores tales como la frecuencia de las

eyaculaciones, edad del semental, tamaño de los testículos y el número de

eyaculaciones en el día de la recolección. Cada semana se recolecta semen de

un máximo de seis eyaculados por semental, con intervalos entre montas de 2 a

3 d (ABS, 1986). En el caso del carnero, la recolección de semen se realiza por

medio de dos métodos: vagina artificial y electroeyaculación (Evans y Maxwell,

1990).

Vagina artificial. Existe una correlación positiva entre estimulación sexual y

calidad de semen en cuanto a motilidad progresiva y volumen, es por ello que

es indispensable estimular correctamente a un semental dándole una o dos

montas falsas (Saacke, 1982). Finalmente se le expone la vagina artificial,

método más fidedigno en lo que respecta a la calidad de la muestra (Zemjanis,

1996) ya que simula las condiciones de presión y temperatura de las vaginas

naturales, constituida por un tubo de PVC rígido, un tubo elástico de hule y una

válvula por donde debe pasar el agua a 40 °C. En la extremidad de la vagina se

acopla un tubo colector graduado en décimas de ml, siendo el acto de

6

recolectar el semen un método simple, donde se asegura la hembra en celo

natural o inducido, presentándola al macho. Cuando este efectúa el salto se

asegura el prepucio con la mano, desviando el pene para dentro de la vagina

artificial. La eyaculación es instantánea. El material recolectado debe ser

protegido de la luz solar directa, del polvo, de la agitación y de cambios bruscos

de temperatura (Nunes y Fernández, 2001).

Electroeyaculación. El borrego responde a un menor voltaje y también

responde más rápidamente si le compara con el toro (Bearden y Fuquay, 1982).

El proceso de emisión está controlado por los nervios simpáticos lumbares

(hipogástrico), localizados en la parte anterior de la pelvis, mientras que los

nervios que provocan la erección y eyaculación están localizados

posteriormente y se originan en los nervios sacros, dependientes del pudendo

interno (Durán, 1980). La ventaja de la electroeyaculación radica en la

capacidad de recolectar semen sin que el macho experimente una respuesta

sexual por lo que no se necesita que una hembra esté en celo (Sorensen,

1986). Para la recolección de semen el electrodo se humedece o se lubrica con

vaselina y se inserta en el recto, procurando no lesionar la mucosa, un

ayudante debe sostenerlo presionando hacia el suelo de la pelvis. Luego se

aplican cortos estímulos (3 a 8 seg) a intervalos de 15 a 20 seg, después de

unos cuantos estímulos, fluirá la secreción de las glándulas accesorias y luego

el semen (Evans y Maxwell, 1990).

Semen y sus Características

El semen es el líquido generativo del macho ya que contiene los gametos

masculinos (espermatozoides), se deposita en la vagina de la hembra durante

7

la cópula o puede recogerse por medios artificiales para su estudio,

almacenamiento y/o uso en inseminación artificial. El semen lo forman dos

principales constituyentes: el plasma seminal y los espermatozoides. Las

principales sustancias orgánicas presentes en el semen de carnero son

fructosa, sorbitol, inositol, ácido cítrico, glicerilfosforilcolina, fosfolípidos,

prostaglandinas y proteínas. La fructosa es el azúcar más fácilmente

metabolizable y proporciona la mayor fuente de energía a los espermatozoides

del semen (Evans y Maxwell, 1990).

Evaluación de la Calidad Seminal

El método estándar para evaluar la fertilidad de machos reproductores,

aparte de la evaluación directa de su capacidad para causar preñez, es el

examen de semen (Ax et al., 2002) por lo que Villena (2002) menciona que las

pruebas de valoración del semen se agrupan en tres tipos de exámenes:

macroscópicas (volumen, color, consistencia, viscosidad, peso específico);

microscópicas (motilidad, concentración, formas anormales) y bioquímicas (pH

y pruebas metabólicas).

Volumen. El volumen se mide en forma directa dentro de un tubo de

recolección (Sorensen, 1986) y varía de .5 a 2 ml (Nunes y Fernández, 2001),

correspondiendo 74 % del mismo a líquido seminal y 26 % restante a

espermatozoides (Durán, 1980). Las variaciones en el volumen de semen

obedecen principalmente a factores como edad y condición del animal,

frecuencia de recolección y destreza del operario (Evans y Maxwell, 1990;

Villena, 2002) además incluye estado fisiológico del macho, raza, factores

higiénicos y alimentarios.

8

Color. Debe ser blanco en ovinos, desechándose el semen con coloración

rojiza o color chocolate, indicando presencia de sangre o pus, respectivamente.

Su aspecto varía de lechoso a cremoso, despreciándose el semen acuoso o

turbio, indicativo de un pequeño número de espermatozoides (Nunes y

Fernández, 2001).

Consistencia. El semen completo tal como es eyaculado, es un líquido denso,

cremoso, con la coloración propia de cada especie y consiste en una

suspensión de espermatozoides en el plasma seminal. A medida que se

suceden los saltos en una misma jornada, el semen se hace más claro por

disminución de la concentración de espermatozoides. El semen de carnero es

de consistencia lechosa o lactocremosa y coloración blanquecina. La tonalidad

amarillenta que pude aparecer se debe a la presencia de un derivado de la

riboflavina (Villena, 2002).

Concentración. Determinada en el microscopio o a través de

espectofotometría y significa la cantidad de espermatozoides en cada ml de

semen, la concentración media en carneros es de 3,500 a 4,000 mill

espermatozoides por ml (Nunes y Fernández, 2001). Por otra parte Villena

(2002) menciona que la producción espermática testicular diaria en el ovino es

de 10,900 mill de espermatozoides, en otra investigación, De Alba (1985)

demostró que 1 g de tejido testicular de carnero es capaz de manufacturar un

promedio de 12,200 mill de espermatozoides por día o sea 8,472

espermatozoides por minuto, de donde se deduce que a mayor volumen

testicular, corresponderá también mayor producción de espermatozoides.

Sorensen (1986) menciona que es necesario determinar el número de

9

espermatozoides por unidad de volumen, ya que esto multiplicado por el

volumen, permite conocer el número total de espermatozoides por eyaculado.

Motilidad. La motilidad se valora mediante el porcentaje de células móviles o

vivas. Dichas células pueden moverse en cualquier dirección sin importar la

velocidad con la que lo hagan (Sorensen, 1986). Sin embargo Evans y Maxwell

(1990) mencionan que existen varios parámetros de motilidad entre los que se

incluyen motilidad masal (M M) y motilidad progresiva (M P).

Motilidad masal. La estimación de motilidad de los espermatozoides se hace

sobre la base del vigor o potencia de la onda según sí está presente o no dicho

movimiento, y con una escala de 0 a 5 (Evans y Maxwell, 1990), la cual se

muestra en el Anexo 1.

La motilidad progresiva. Se define como la capacidad con que el

espermatozoide se mueve hacia delante y en línea recta y se determina al

examinar una gota de semen diluida hasta el grado en que se observen las

células de manera individual (Evans y Maxwell, 1990).

Morfología de los espermatozoides. Se realiza mediante preparaciones

coloreadas las cuales se observan a grandes aumentos las anomalías

morfológicas que pueden afectar aislada o simultáneamente a la cabeza, cuello,

pieza intermedia y cola del espermatozoide (Villena, 2002). El examen

morfológico del semen es una prueba de control de calidad. Cada eyaculado

contiene una serie de espermatozoides anormales, pero si la proporción de

éstos es muy alta entonces nos encontraremos ante un semen de baja fertilidad

(Evans y Maxwell, 1990). Nunes y Fernández (2001) mencionan que la

proporción de espermatozoides patológicos (sin cola, con doble cola, con doble

10

cabeza) dentro de la población espermática, no debe sobrepasar 15 %, y las

muestras que presenten estas características no se deben de utilizar para

congelar o para inseminar.

Diluyentes

Los diluyentes utilizados para la preservación de semen de carnero,

como de otras especies, generalmente deben tener un pH y capacidad

amortiguadora adecuados, osmolaridad apropiada y además deben proteger a

los espermatozoides contra el daño criogénico (Salamon y Maxwell, 2000) por

otra parte Bearden y Fuquay (1982) hacen mención que un buen diluyente no

únicamente tiene que incrementar el volumen de un eyaculado, si no que tiene

que proteger a los espermatozoides durante el enfriamiento y prolongar su vida.

Hafez (2002) incluye otras funciones de un buen diluyente: proporcionar

nutrimentos como una fuente de energía, proteger contra el efecto nocivo del

enfriamiento rápido, inhibir la proliferación bacteriana. Por último Nunes y

Fernández (2001) menciona que debe ser de bajo costo y de fácil preparación.

Regulación del pH. La glucólisis está considerada como la principal fuente de

energía de los espermatozoides, tanto en el medio aerobio como anaerobio.

Los eyaculados de alta concentración espermática y ricos en fructosa

disminuyen rápidamente su pH debido a una acumulación de ácido láctico como

consecuencia de la fructolísis (utilización de la fructosa disponible como medio

de obtener energía para el movimiento, generándose además ácido láctico

como producto de desecho) Villena (2002). El pH óptimo de los diluyentes es lo

más cercano posible a 7 (Evans y Maxwell, 1990), aunque valores de pH de 6.5

a 7.5 son bien tolerados por los espermatozoides (Salamon y Maxwell, 2000).

11

Sorensen (1986) menciona que el amortiguador de uso común es el citrato de

sodio, y que se adiciona con la finalidad de neutralizar los productos de

desecho del metabolismo espermático, principalmente del ácido láctico.

Vishwanath y Shannon (2000) mencionan, que el citrato de sodio es una sal de

elección, dadas sus propiedades quelantes de mejorar la solubilidad de la

fracción proteica de la yema de huevo.

Protección contra el choque térmico. La yema de huevo es un componente

común en los diluyentes de semen ya que protege los espermatozoides contra

el choque frío, protegiéndolos durante el congelamiento y descongelamiento

(Salamon y Maxwell, 2000) por ello, es común utilizarla en los diluyentes para

congelamiento de semen de los animales domésticos (Holt, 2000). Por otra

parte (Salamon y Maxwell, 2000) recomiendan que la cantidad a agregar de

yema de huevo a un diluyente, depende de la composición del mismo y varía

desde un 4 hasta un 20 %. Para corroborar lo anterior Gil et al. (2003)

realizaron estudios con diversas concentraciones de yema de huevo (5, 10, 15 y

20 %) y en donde no encontraron efecto positivo significativo al aumentar la

concentración de yema de huevo encima de 10 % al descongelamiento del

semen.

Sustancias crioprotectoras. Holt (2000) hace mención que Polge y Rowson

en 1952 experimentaron con éxito las propiedades de glicerol, permitiéndole

actuar como sustancia protectora para las células que son sometidas a

congelamiento profundo. Dicho descubrimiento abrió la posibilidad de conservar

semen congelado a muy bajas temperaturas por periodos de tiempo

prácticamente indefinidos, por lo que Hafez (2002) menciona que se usa casi

12

universalmente como agente crioprotector para congelar semen. Las cantidades

y métodos para añadirlo varían, dependiendo de los diluyentes, métodos de

congelamiento y especie. Por lo general, se añade glicerol al semen después

de enfriarlo a 5 ºC; sin embargo, proporciona mayor protección cuando se le

agrega inmediatamente antes de congelar. Por otra parte Salamon y Maxwell

(2000) señalan que la concentración óptima del glicerol está dentro de la gama

de 6 a 8 % para el semen congelado por el método convencional lento. Bearden

y Fuquay (1982) indican que el glicerol se une al agua disminuyendo así el

punto de congelación de las soluciones, se forma menos hielo en su presencia

a cualquier temperatura. La concentración de solutos disminuye en forma

correspondiente. El glicerol deshidrata parcialmente a los espermatozoides,

reduciendo aún más la selectividad de la congelación de agua.

Fuentes de energía. Los espermatozoides poseen la capacidad de utilizar

sustancias de su medio ambiente inmediato para la producción de energía

(Rodríguez, 1988) por lo que son capaces de utilizar azúcares simples como

glucosa, fructosa y manosa (De Alba, 1985). La fructosa es el azúcar más

utilizado y recomendable como fuente energética en los diluyentes para semen

de carnero fresco o congelado (Salamon y Maxwell, 2000).

Antibióticos. Los antibióticos se agregan con la finalidad de prevenir la

proliferación microbiana (Evans y Maxwell, 1990) destruir los organismos

patógenos o al menos reducir el número (Yoshida, 2000) y en cierto grado,

prevenir la diseminación de enfermedades (Wiemer y Ruttle, 1987) la

combinación de penicilina (1000 UI/ml) y estreptomicina 1 mg/ml es un

ingrediente estándar en los diluyentes utilizados para semen en rumiantes

13

(Asher et al., 2000 y Salamon y Maxwell, 2000).

Dilución del Semen

El semen se diluye a una proporción específica, de modo que el volumen

contenga suficientes espermatozoides para lograr una fertilidad elevada sin

desperdicio de muchas células. Las tasas de dilución son más altas para semen

no congelado que para el congelado (Hafez, 2002) en donde los distintos

componentes del plasma seminal permiten mantener activos a los

espermatozoides de un eyaculado durante un período de tiempo relativamente

corto (Villena, 2002). El semen se diluye para proteger a los espermatozoides

durante el enfriamiento, congelamiento y descongelamiento (Salamon y

Maxwell, 2000). De Alba (1985) menciona que los eyaculados normales del

carnero adulto oscilan en total de espermatozoides entre 3 - 5 X 109. Esto

solamente permitiría una dilución por eyaculado de 1:12 a 1:20 para

inseminación con semen fresco o refrigerado. Nunes Y Fernández (2001)

recomiendan diluciones para semen congelado 1:9.

Diluyentes Convencionales

En La práctica habitual de congelamiento de semen ovino se ha optado

en general por el diluyente de Salamon modificado por Evans y Maxwell, que

está compuesto por tris - yema, ácido cítrico, glucosa, glicerol, yema de huevo y

agua destilada (Mareco et al., 2004). La composición del diluyente tris – yema

es la siguiente: 3.63 g de tris (hidroximetil) aminometano, 0.50 g de fructosa,

1.99 g de ácido cítrico, 14 ml de yema de huevo, 100 000 UI de penicilina, 100

mg de estreptomicina y 100 ml de agua destilada (Salamon y Maxwell, 2000).

Los productos que se utilicen para su preparación deberán ser

14

químicamente puros y disueltos en agua destilada. El diluyente con base en

citrato–yema es el que se utiliza con más frecuencia en el mundo entero; tiene

la ventaja de ser simple, práctico y poco costoso. El citrato sódico tiene la

ventaja de procurar al espermatozoide un sistema tampón que estabiliza la

reacción del medio e impide una acidificación demasiada rápida, perjudicial

para la calidad del diluyente. La solución de citrato sódico puede ser

conservada durante 15 d en refrigeración y la adición de yema de huevo se

hace en el momento de la dilución (Derivaux, 1961). La composición del

diluyente citrato de sodio como es utilizado actualmente: 2.37 g de citrato de

sodio, 0.50 g de glucosa, 15 ml de yema de huevo, 100 000 UI de penicilina,

100 mg de estreptomicina y 100 ml de agua destilada (Salamon y Maxwell,

2000).

Diluyentes no Convencionales

Aloe vera. Se ha propuesto que el gel aloe vera (Aloe barbadensis, Miller)

promueve los procesos de cicatrización y regeneración celular, emoliente,

antiinflamatorio, regenerador de tejidos, antibiótico, laxante y hasta inductor del

estro y ovulación (Rodríguez 1988 y Jiménez et al., 1995). Rodríguez (1988)

mostró que 40 % de gel de aloe vera en combinación con 54 % de citrato de

sodio al 3 %, obtuvo 49.5 % de motilidad progresiva al descongelamiento y

tasas satisfactorias de fertilidad con inseminación intrauterina, situándolo como

un buen diluyente para semen ovino.

Suero fetal bovino. Parks et al. (1976) demostraron las propiedades del suero

sanguíneo al ser agregado en los diluyentes para proteger a los

espermatozoides contra el choque térmico, en otros estudios Chandler et al.

15

(1976) mencionan que la presencia de suero sanguíneo en cantidades de 20 %

(v/v) en el diluyente incrementa el metabolismo y las tasas de consumo de

oxígeno, con la consecuente producción de ácido láctico e incremento en las

condiciones de anaerobiosis y cambios en las características iónicas del medio,

lo que al parecer es responsable de la aglutinación característica. En recientes

estudios Madrid (2004) encontró los mejores tratamientos con base en suero

fetal bovino (SFB) con 10 % de yema de huevo en congelamiento profundo, ya

que obtuvo 65 % de motilidad progresiva (MP) y 70 % de espermatozoides

vivos (EV) en 90 d poscongelamiento.

Agua de coco. Desde que se comprobó que el agua de coco es un eficiente

diluyente para semen de mamíferos domésticos se creó la primera patente

biológica brasileña donde el Dr. José Ferreira Nunes es el autor. El punto de

partida inicio cuando fue aislada del agua de coco una molécula perteneciente

al grupo de las auxinas esto es el ácido 3-Indol-Acético (JYP), la cual le confiere

a los espermatozoides de diferentes especies un incremento en la motilidad y

porcentaje de espermatozoides vivos, aumentando también la tasa de fertilidad,

además de permitir su conservación durante periodos más largos (FUNCAP,

1999). Los Diluyentes con base en agua de coco han sido ampliamente

estudiados y utilizados en el noroeste brasileño, debido a su excelente eficacia

y bajo costo (Nunes, 1998). Por otra parte Nunes y Fernández (2001)

mencionan que el agua de coco (Cocus nucifera), perteneciente a la subfamilia

Cocosidea, de la familia Palmea, está compuesta de soluciones ácidas

naturales y estériles, conteniendo sales, proteínas, vitaminas y minerales

(Anexo 2). En la fase de maduración inicial, esto es, el fruto verde con seis

16

meses de edad, el agua presenta osmolaridad entorno de 500 miliosmoles y pH

4.5. Silva (1990) evaluó in vitro el semen de ovinos, después de realizada la

recolección, cada eyaculación fue dividida en dos porcentajes iguales, siendo

una diluida en agua de coco con osmolaridad y pH corregidos y la otra fue

diluida en leche en polvo glucosado, concluyendo que los diluyentes utilizados

demostraron eficiencia como medio de dilución para semen de ovinos.

Glicerado y Equilibramiento

La incorporación de glicerol al semen, es un proceso que debe realizarse

de manera gradual, ya que si se realiza con rapidez, destruye a los

espermatozoides, por lo que Pérez (1995) recomiendan la adición de glicerol en

forma paulatina, dividiendo la cantidad de diluyente con glicerol necesaria en

cuatro porciones (10, 20, 30 y 40 %, para un total de 100 %) y agregando cada

porción en intervalos de 15 min a 5 °C para minimizar los efectos deletéreos de

las altas concentraciones de glicerol. Por otra parte Hafez (2002) menciona que

algunos agregan el glicerol lentamente por goteo o en pequeñas cantidades en

un período de 1 h; otros recomiendan la adición en un solo paso. La mezcla de

semen y diluyente se deja reposar durante varias horas antes de congelarla,

para permitir que las células espermáticas se equilibren con el diluyente

(normalmente a 5 ºC). Un tiempo aproximadamente de 4 a 6 h es óptimo,

dependiendo del medio utilizado. Pasado este tiempo de equilibrio es evaluado

nuevamente el semen, en este momento el semen deberá tener mínimo, una

motilidad progresiva de 50 % (Giles, 1993). El propósito del equilibramiento es

permitir la traslocación del agua y por lo tanto reducir los efectos dañinos de la

nucleación del hielo intracelular durante el proceso de congelamiento y

17

descongelamiento (Vishwanath y Shannon, 2000).

Congelamiento, Envasado y Almacenamiento del Semen

Giles (1993) recomienda que una vez transcurridas las 3 h de

equilibramiento, el semen debe ser conservado de manera que permita una

aplicación fácil y rápida. Por eso el mismo es colocado en pajillas de .5 ml para

posterior refrigeración o congelamiento. Salamon y Maxwell (2000) mencionan

que el congelamiento de semen en pajillas se realiza por medio de suspensión

en vapores de nitrógeno líquido y la velocidad de enfriamiento se regula por la

distancia de las pajillas a nivel del nitrógeno líquido. En donde Lahnsteiner et al.

(2000) mencionan que la curva de enfriamiento es importante para el

congelamiento de pajillas, obteniéndose los mejores resultados cuando la

temperatura disminuye en forma de una parábola. Maxwell et al. (1995)

mencionan que dichas condiciones se consiguen al suspender las pajillas a una

altura de entre 4 y 6 cm sobre el espejo de nitrógeno líquido (-196 ºC), y la

altura que ha demostrado ser idónea para congelamiento de pajillas de .25 y .5

ml es de 4 cm.

Nunes y Fernández (2001) mencionan que el procedimiento para

envasar y congelar es simple, se asegura la pajilla por la porción superior

(extremidad cerrada), colocando la opuesta en el semen diluido y llenarla por

aspiración. Enseguida se golpea suavemente en la punta con el objetivo de que

quede una pequeña parte sin semen en la extremidad, para poder taparla

posteriormente con polvo de alcohol polivinílico. Posteriormente se congela el

semen en un termo de boca ancha exponiéndolo a vapores de de nitrógeno

líquido, para enseguida sumergir las pajillas en el nitrógeno líquido en donde

18

alcanzarán una temperatura de -196 ºC. Los espermatozoides de carnero

soportan temperaturas de congelamiento que pueden ir de -75 a -125 ºC

(Salamon y Maxwell, 2000) y una tasa de enfriamiento que puede ir de 10 a 100

ºC/min, independientemente de la cantidad de glicerol del diluyente (Fiser y

Fairtfull, 1986). Enseguida se descongela una pajilla a 35 ºC durante 40 seg y

se evalúa la concentración y la motilidad progresiva que debe ser mínimo de 35

% (Giles, 1993)

Independientemente del método de envasado, el semen congelado se

almacena sumergido en nitrógeno líquido (-196 ºC) en contenedores especiales

de diferentes capacidades que se consiguen fácilmente de manera comercial

(Evans y Maxwell, 1990). Una consideración importante cuando se almacena

semen por largos periodos de tiempo es la disminución en la fertilidad de dicho

semen durante el almacenamiento (Salamon y Maxwell, 2000). First et al.

(1961) reportaron que la motilidad de los espermatozoides disminuye durante

los primeros 2 meses de almacenaje y que después permanece sin cambios.

Por otra parte Yoshida (2000) menciona que la viabilidad del semen

criopreservado no excede los 50 años. Salamon y Maxwell (2000) señalan que

la fertilidad del semen almacenado por 27 años permanece inalterable, por lo

que durante largos periodos de tiempo es factible y posibilita el establecimiento

de bancos de recursos genéticos.

19

MATERIALES Y MÉTODOS

Descripción del Área de Estudio

Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Procesamiento de Semen de

la Facultad de Zootecnia de la Universidad Autónoma de Chihuahua, con

coordenadas de 28º 38’ latitud norte y 106º 04’ longitud oeste, a una altitud de

1,440 msnm con una precipitación media anual de 336 mm y una temperatura

media anual de 18.6 ºC (INEGI, 2001).

Descripción de la Población

Se utilizó un ovino de la raza Blackbelly como fuente de células

espermáticas, con una edad de 5 años, peso de 78 kg y circunferencia escrotal

de 31 cm, al cual se le realizó previamente un examen físico y capacidad

reproductiva. Se desparasitó interna y externamente con ivermectina (ivermetin,

laboratorio calier de Argentina), se hizo una aplicación intramuscular de

vitaminas (A, E, D) y selenito de sodio (laboratorio vitalebs). Se le proporcionó

una dieta con base en concentrado (250 g/d) con 12 % de proteína,

complementada con heno de alfalfa y agua ad libitum.

Diluyentes

Se empleó 50 % de agua de coco y 50 % de citrato de sodio al 2.9 % en

combinación con el diluyente no convencional: suero fetal bovino (SFB) o aloe

vera (AV), dichos diluyentes tuvieron concentraciones y combinaciones desde

10 a 70 %, en total se probaron 14 diluyentes y un testigo. Los tratamientos

contenía 14 % de yema de huevo, 1 mg/ml de estreptomicina, 1000 UI/ml de

penicilina, en caso de fructosa se utilizaron 1, 2 y 2.5 g/100 ml para testigo, SFB

y AV respectivamente. Los ingredientes utilizados se enlistan en el (Cuadro 1).

20

CUADRO 1. DESCRIPCIÓN DE LOS TRATAMIENTOS (Trat.) CON BASE

EN AGUA DE COCO (AC) EN COMBINACION CON DILUYENTES NO CONVENCIONALES: SUERO FETAL BOVINO (SFB) O ALOE VERA (AV)

Ingredientes (%) 1 Trat.

Diluyente no convencional

Combinación

final 2 Concentración de diluyentes

con base 100 % 3AC + citrato

de Sodio

Testigo 86 0 80-0 100 – 0

75 11 70-10 87.5 - 12.5 64 22 60-20 75 – 25 54 32 50-30 62.5 – 37.5

SFB 43 43 40-40 50 – 50 32 54 30-50 37.5 – 62.5 22 64 20-60 25 - 75 11 75 10-70 12.5 – 87.5

75 11 70-10 87.5 - 12.5 64 22 60-20 75 – 25 54 32 50-30 62.5 – 37.5

AV 43 43 40-40 50 – 50 32 54 30-50 37.5 – 62.5 22 64 20-60 25 - 75 11 75 10-70 12.5 – 87.5

1 Además de estos ingredientes todos los tratamientos contenían 14 % de yema

de huevo. 2 Al agregar a los ingredientes 14 % de volumen sobre volumen (v/v) de glicerol

sus porcentajes iniciales se modifican para quedar como se muestra en la combinación final, en donde el primer número nos indica la combinación AC más citrato de sodio y el segundo número es el diluyente no convencional.

3 El primer número es la combinación AC más citrato de sodio y el segundo número es el diluyente no convencional.

21

Preparación de Diluyentes

Citrato de sodio. Se diluyeron 2.9 g de citrato de sodio en 100 ml de agua

desionizada.

Agua de coco. Los cocos de preferencia deben ser de seis meses de

maduración ya que a esa edad contienen en su interior agua la cual, para usarla

debe ser filtrada en papel del número 42.

Suero fetal bovino. Se obtuvo en la empresa “Productos Biológicos del

Pacífico” y “PAA Laboratorios, Inc. División México”. Para poder preparar el

diluyente, el suero se descongeló a temperatura ambiente por un lapso de 12 h,

posteriormente se centrifugó a 500 rpm durante 30 min y por ultimo se filtró con

papel del número 42.

Aloe vera. Para prepararla se cortaron pencas de sábila (una fue suficiente

para preparar 100 ml), se lavaron con agua desionizada, se eliminó la cubierta

dejando expuesto el gel, el cual se licuó y filtró a través de dos gasas y por

último se depositó en un recipiente estéril.

Con un potenciómetro se midió el pH de cada diluyente, regulándose con

hidróxido de sodio 0.2 molar a todos los diluyentes con pH menor a 6.5.

Recolección del Semen

El borrego fue llevado al área de recolección contigua al laboratorio de

procesamiento de semen, en donde se utilizó una borrega como señuelo. Para

la colecta del semen se utilizó la vagina artificial, utilizando la técnica descrita

por Evans y Maxwell (1990). El tubo elástico fue de mayor longitud que el tubo

de PVC, de modo que una vez introducido en él se revirtieron sus bordes

fijándolos al tubo de PVC mediante anillos elásticos. De este modo se formó

22

una cámara de doble pared destinada a contener agua y aire, la cantidad de

agua que se añadió fue aproximadamente 2/3 del volumen del tubo y tuvo una

temperatura de 48 a 50 ºC, para que al momento de ser utilizada se encontrará

entre 42 y 45 ºC. En la extremidad de la vagina se acopló un tubo colector

graduado en décimas de ml, en el cual se depositó el semen después de la

eyaculación, siendo el acto de recolectar el semen un método simple, donde se

asegura la hembra en celo natural o inducido, presentándola al macho y cuando

éste efectúa el salto se asegura el prepucio con la mano, desviando el pene

hacia dentro de la vagina artificial, donde la eyaculación fue instantánea.

Evaluación del Semen

Después de la recolección, se retiró el tubo y se evaluó el semen

macroscópicamente donde se observo el volumen, el color y la densidad;

posteriormente se colocó en baño María a 35 °C y se tomó una muestra para

ser evaluado microscópicamente observando la motilidad progresiva, la

motilidad masal y el porcentaje de espermatozoides vivos, estos parámetros

fueron determinados visualmente con ayuda de un microscopio de luz (Leica

con monitor sony) con aumento de 400 y 100 diámetros respectivamente. Los

criterios utilizados para manejar el semen durante el procesamiento, fueron

como mínimo: 85 % de espermatozoides vivos; 80 % de motilidad progresiva; 1

ml de volumen y menos de 15 % de anormales. Los porcentajes de

espermatozoides vivos (EV) y anormales fueron determinados por medio de un

frotis, cuya preparación fue la siguiente: en un portaobjetos temperado se

colocó una pequeña gota de semen, a la cual se le agregó otra gota de

colorante eosina – nigrosina y se homogenizó con un palillo; enseguida se

23

realizó el frotis, el cual se secó al aire, para posteriormente realizar un conteo

de 100 células espermáticas en diferentes campos del frotis, con la ayuda del

microscopio conectado a un monitor con un objetivo de 40X.

Dilución del Semen

Después de la etapa de evaluación, cumpliendo los parámetros antes

establecidos de calidad seminal, prosiguió la fase de dilución, la cual tiene una

concentración para cada dosis de aproximadamente 120 millones de

espermatozoides por pajilla. Se utilizó una dilución práctica recomendada por

Nunes y Fernández (2001), donde para una parte de semen, se agregan nueve

partes de diluyente (1:9). De acuerdo al volumen del eyaculado, se agregó la

cantidad de diluyente “A” al semen.

Enfriamiento del Semen

Cuando el volumen del eyaculado del ovino era mayor o igual de 1 ml se

probaron dos tratamientos, para lo cual el eyaculado se dividió en dos

fracciones. El enfriamiento del semen fue de manera progresiva en la cámara

de refrigeración (Casson Type MRS1), donde la temperatura descendió

paulatinamente hasta llegar a 5 ºC, durante 2 h aproximadamente, de tal

manera que el semen adquirió la temperatura de 5 ºC en forma gradual (Giles,

1993). Para lograr lo antes mencionado el semen con diluyente “A” fue colocado

en baño María a 35 °C en un vaso precipitado.

Segunda Dilución o Gliceración

A la fracción “B” se le añadió 14 % de v/v de glicerol y también se enfrió de 35 a

5 ºC, una vez alcanzada esa temperatura se añadió al semen en cuatro

24

porciones (10, 20, 30 y 40 %), con un tiempo de 15 min entre la adición de cada

porción, con la finalidad de disminuir en lo posible los efectos osmóticos debido

a la adición del glicerol (Watson, 2000). El tiempo de equilibrio fue de 3 h.

Envasado y Congelamiento

El semen diluido fue envasado e identificado por tratamiento en pajillas

francesas con capacidad de 0.5 ml, las pajillas se congelaron en vapor de

nitrógeno líquido, bajando la temperatura a 80 ºC en un tiempo de 12 min, para

tal caso se usó una hielera cerrada de unicel colocando 5 cm de nitrógeno

líquido y una cama de pajillas a 5 cm del líquido y por ultimo las pajillas se

sumergieron en nitrógeno en donde alcanzaron una temperatura de -196 ºC.

Descongelamiento

Por tratamiento se descongelaron en agua a 37 ºC durante 30 seg, tres

pajillas para evaluar inmediatamente cada período de evaluación.

Variables a Medir

La evaluación de los diluyentes se realizó en cinco períodos de tiempo. Período

de dilución del semen a 35 ºC (P0), se analizó con dos finalidades: determinar

que porcentaje de espermatozoides se veían afectados al momento de agregar

el diluyente y observar el descenso al momento de finalizar el tiempo de

equilibramiento. Al finalizar el tiempo de equilibramiento (P1) se evaluó con el

objetivo de examinar la habilidad de cada diluyente al finalizar dicho tiempo. Al

concluir el proceso de congelamiento (P2) se evaluó para determinar que

porcentaje de espermatozoides sobrevivieron a este proceso. A las 48 h

poscongelamiento (P3), se evaluó con la finalidad de determinar la

25

habilidad de cada diluyente como protector durante el congelamiento profundo

(-196 °C). A los 90 d poscongelamiento (P4) se evaluó con el objetivo de

detectar cambios en la viabilidad del semen debido al tiempo de

almacenamiento.

En cada período, las variables medidas fueron: porcentaje de células con

motilidad progresiva (MP) y porcentaje de células vivas (EV).

Análisis Estadístico de la Información

Los datos se analizaron mediante un modelo de regresión múltiple con

intercepto igual a cero del paquete estadístico SAS (Statical Análisis System,

2001) donde se ajustó la cantidad de agua de coco al 100 % (Mongomery y

Runger, 1996).

Ajustándose un modelo para las variables MP y EV en los diferentes

periodos de tiempo: al diluir el semen a 35 ºC, finalizado el tiempo de

equilibramiento, concluido el proceso de congelamiento, 48 h y 90 d

poscongelamiento. Una vez obtenido los parámetros estimados de las variables

agua de coco y diluyente no convencional (SFB o AV), con la ayuda del

programa MINITAB (Versión 13) se gráfico la variable MP en los diferentes

tiempos.

26

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En total se utilizaron ocho eyaculados de un ovino las cuáles fueron

divididos para trabajar dos tratamientos por sesión, obteniendo en promedio un

volumen de 1.20 ml con 89.4 % de motilidad progresiva; 91.2 % de

espermatozoides vivos y 5.4 % de anormales. Los resultados para motilidad

progresiva (MP) y porcentaje de espermatozoides vivos (EV) se muestran en el

(Cuadro 2) en los diferentes tiempos de medición.

Los valores de pH de los distintos diluyentes corregidos al momento de

prepararlos (Cuadro 3), se encuentran dentro de los recomendados para la

criopreservación de semen ovino (Salamon y Maxwell, 2000). En lo que se

refiere al agua de coco (AC), Nunes y Fernández (2001) mencionan que en la

fase de maduración inicial, esto es, el fruto verde con seis meses de edad

presenta un pH de 4.5, aunque en esta investigación no se pudo determinar la

edad, variedad y lugar de procedencia de los cocos, a ello se le podría atribuir a

que el pH fue de 5.9 y no coincidiera con el reportado por los investigadores

brasileños.

López (2001) también midió el pH a un diluyente 100 % suero fetal

bovino (SFB) y reportó un pH de 7.5, el encontrado en esta investigación fue de

7.1. Por otra parte el mismo autor trabajó con un diluyente 100 % aloe vera (AV)

pero éste a su vez estaba compuesto únicamente de 45 % de gel de AV y el

otro 55 % era de citrato de sodio al 2.9 %, donde encontró un pH de 6.6. En

esta investigación también se midió el pH del gel de AV y se encontró que fue

de 4.7. La diferencia puede deberse a que la solución de citrato de sodio tiene

un pH de 7.6 y tal vez la concentración de sodio que manejo

27

CUADRO 2. PORCENTAJE DE MOTILIDAD PROGRESIVA Y ESPERMATOZOIDES VIVOS EN CINCO PERIODOS DE EVALUACIÓN

% de Motilidad Progresiva

% de Espermas Vivos

Trat.

Combinación

P0a

P1b

P2c

P3d

P4e

P0a

P1b

P2c

P3d

P4e

1 80 - 0 80 50 40 40 40 80 60 40 40 40 2 70 -10 SFB 80 70 40 40 40 85 75 40 40 40 3 60 -20 SFB 90 60 55 55 50 90 85 55 55 50 4 50 – 30 SFB 85 80 45 45 40 85 80 45 45 40 5 40 – 40 SFB 80 75 50 50 40 85 75 50 50 40 6 30 – 50 SFB 90 70 60 60 50 90 85 60 60 50 7 20 – 60 SFB 90 70 50 50 50 90 70 50 50 50 8 10 – 70 SFB 90 80 70 70 60 90 80 70 70 70 9 70 -10 AV 80 60 40 40 40 80 80 50 50 40

10 60 -20 AV 85 80 50 50 50 85 80 60 60 60 11 50 – 30 AV 85 60 50 50 50 85 60 50 50 50 12 40 – 40 AV 85 85 60 60 60 85 85 70 70 60 13 30 – 50 AV 85 60 50 50 50 85 60 50 50 50 14 20 – 60 AV 85 80 30 30 30 85 80 30 30 30 15 10 – 70 AV 90 60 20 20 20 90 85 20 20 20

a Al diluir el semen a 35 ºC, b finalizado el tiempo de equilibramiento, c concluido el proceso de congelamiento, d 48 h y e 90 d poscongelamiento.

28

CUADRO 3. VALORES DE pH MEDIDOS Y CORREGIDOS AL MOMENTO DE PREPARAR LOS DILUYENTES

Trat.

Combinación

pH encontrado

pH corregido

1 80 - 0 6.4 6.6 2 70 -10 SFB 6.59 6.59 3 60 -20 SFB 6.81 6.81 4 50 – 30 SFB 6.83 6.83 5 40 – 40 SFB 7 7 6 30 – 50 SFB 7.18 7.18 7 20 – 60 SFB 7.2 7.2 8 10 – 70 SFB 7.15 7.15 9 70 -10 AV 6.4 6.5

10 60 -20 AV 6.3 6.5 11 50 – 30 AV 6.2 6.6 12 40 – 40 AV 6.0 6.9 13 30 – 50 AV 5.8 6.5 14 20 – 60 AV 5.5 6.7 15 10 – 70 AV 5.3 6.7

29

López (2001) elevó el pH. Es por ello que en esta investigación todos los

diluyentes con diferentes concentraciones de AV y el diluyente testigo (80-0)

tuvieron que corregirse el pH con hidróxido de sodio 0.2 molar.

Fase de Dilución (P0)

Una vez evaluado el semen macroscópicamente (color y volumen) y

microscópicamente (MP y EV) siguiendo los criterios establecidos por Ax et al.

(2002) y determinado parámetros mínimos para su procesamiento (López,

2001), se inició la fase de dilución descrita por Nunes y Fernández (2001).

En la mayoría de los tratamientos se pudo observar una disminución en

la MP y EV entre el momento de la obtención del semen y el momento de

agregar el diluyente “A” a 35 ºC, lo cual se le atribuye al efecto de dilución

(Maxwell y Johnson, 1999) ya que los espermatozoides responden a la dilución

con un aumento inicial de la actividad metabólica seguido por una pérdida de la

motilidad y un aumento en el daño de membrana (Johnson et al., 2000) por otra

parte Watson y Martín (1976) atribuyen este efecto a una reducción en los

componentes del plasma seminal, disturbios en los componentes osmóticos y

electrolíticos en el diluyente.

Aunque la mayoría de los diluyentes conservó una motilidad arriba de 80

% (Gráfica 1 y 2), también se puede observar en ambas gráficas que al

combinar AC con SFB o AV a 35 °C (diluyente “A”), también llamado P0, que

los tratamientos 10-70 de ambos diluyentes no convencionales (SFB o AV)

fueron los que mayor motilidad progresiva presentaron. El tratamiento testigo

(80-0) presentó en este período 80 % de MP y EV, dichos valores son 5 y 15 %

menores con los comparados por Nunes y Fernández (2001) y Uchoa et al.

30

Gráfica 1. Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un modelo

de regresión con diferentes niveles de agua de coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones de suero fetal bovino en el P0.

31

Gráfica 2. Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un modelo

de regresión con diferentes niveles de agua de coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones de aloe vera en el P0.

32

(2002) al diluir semen ovino y canino respectivamente en 50 % de AC, 25 %

agua destilada y 25 % de citrato de sodio al 5 % con osmolaridad y pH

corregidos. En caso del semen ovino, dichos investigadores encontraron esa

MP al incubar el semen a 15 ºC durante 5 h; para el semen canino observó esa

MP (95 %) a los 90 min de haber diluido el semen con una osmolaridad

ajustada entre 304 y 306 miliosmoles. La diferencia con el tratamiento testigo

puede deberse a que en esta investigación no se midió ni corrigió la

osmolaridad de dicho diluyente.

Comparando los resultados de los dos diluyentes no convencionales en

P0 (Cuadro 2), puede observarse que las diferentes combinaciones de AC con

AV fue en donde mayor se observó el efecto de dilución, comparado con los

diferentes tratamientos de AC con SFB como diluyente no convencional.

Finalizado el Tiempo de Equilibramiento (P1)

Para todos los tratamientos se añadió glicerol como crioprotector (14 %

v/v) usando el método de cuatro pasos descrito por Pérez (1995) y dándoles 3 h

de tiempo de equilibrio. Comparando tratamientos con base 100 % AV (45 % de

gel AV, 55 % citrato de sodio al 2.9 %) y 100 % SFB, López (2001) hizo

combinaciones 1:1 con los diluyentes citrato-yema, leche entera

semidescremada y saliva artificial-Opuntia ficus indica (23 % extracto de nopal,

77 % saliva artificial).

Ambos tratamientos 100 % AV y SFB presentaron 70 % MP pero al

realizar las combinaciones 1:1 AV y SFB disminuyó a 60 % MP. En la presente

investigación no se mezclaron los diluyentes no convencionales; se realizaron

diferentes combinaciones de AC con un diluyente no convencional SFB o AV,

33

encontrándose motilidades menores con diversos tratamientos de 50 y 60 % de

MP (Cuadro 2), siendo estos los que mayor efecto negativo presentaron al

finalizar el tiempo de equilibramiento con 50 y 60 % de MP, sin embargo

mantuvieron valores aceptables al finalizar la etapa de equilibramiento (Giles,

1993) que es un mínimo 50 % de MP.

En este mismo período Madrid, (2004) evaluó tres niveles de yema de

huevo (10, 20 y 30 %) en sustitución del diluyente no convencional (leche,

nopal, aloe vera y suero fetal bovino), con 60 % de citrato de sodio al 2.9 %,

observando para los tratamientos con base en SFB 80 % de MP. Sus datos son

similares a los de esta investigación con el tratamiento 10-70 SFB con la misma

MP.

El tratamiento 40-40 AV no mostró ningún cambio al finalizar el periodo

de equilibramiento manteniendo la misma motilidad (85 % MP) que al agregarse

el diluyente a 35 ºC. Entre P0 y P1 puede observarse (Cuadro 2) que los

tratamientos con base en AC y su combinación con SFB disminuyeron en

promedio 16.52 % de MP y 10.57 % de EV. Para los tratamientos con base en

AC y su combinación con AV disminuyeron 18.49 % de MP y 10.92 % EV, esto

puede deberse a los efectos dañinos que ejerce la adición y el contacto con el

glicerol, cuyos efectos osmóticos y tóxicos al penetrar la membrana son bien

conocidos (Holt, 2000).

Concluido el Proceso de Congelamiento (P2)

En esta fase se analizaron los cambios entre el periodo P0 y P2 que

corresponde una vez concluido el procesamiento de semen, comparando los

valores en promedio con cada diluyente hubo una disminución de 38.84 % de

34

motilidad progresiva (MP) y 39.83 % de espermatozoides vivos (EV) para los

tratamientos con base en agua de coco (AC) y su combinación con suero fetal

bovino (SFB) y 49.5 % de MP y 44.5 % de EV para los tratamientos con base

en AC y su combinación con aloe vera (AV). Comparando ambos diluyentes

siguió ofreciendo en promedio mejores resultados en cuanto a MP y EV las

diferentes concentraciones de AC y SFB como diluyente no convencional.

Los cambios ocurridos en este período pueden deberse a que algunos

espermatozoides sufren daños irreversibles en el congelamiento profundo a -

196 ºC, concordando con investigaciones de Holt (2000) en donde hace

mención que existen efectos dañinos a los espermatozoides durante el proceso

de congelamiento, sufriendo estos una dramática pérdida de calidad al

descongelamiento. Por otra parte Salamon y Maxwell (1995) hacen mención

que el congelamiento y descongelamiento de semen ovino conduce a cambios

severos en su estructura y función. Valcárcel et al. (1994) mencionan que entre

estos cambios se encuentran: alteraciones en la MP, características de

movimientos e integridad de la membrana.

Los tratamientos que más daño le ocasionaron a los espermatozoides en

el congelamiento fueron 20-60 AV y 10-70 AV, ya que presentaron 30 y 20 % de

MP respectivamente (Cuadro 2) y por lo tanto no cumplen con los parámetros

mínimos establecidos para semen descongelado de 35 % de MP (Giles, 1993).

Por otra parte el tratamiento 10-70 SFB y 40-40 AV fueron los que mayor

protección le dieron a los espermatozoides durante el congelamiento profundo

ya que mostraron 70 y 60 % de MP respectivamente y en lo que respecta a EV

ambos tratamientos presentaron 70 %.

35

Cuarenta y Ocho Horas Poscongelamiento (P3)

Entre los periodos P2 y P3 no hubo cambios ya que son pocos días,

según lo reportado en trabajos First et al. (1961) al descongelamiento de

semen, en donde observó que la motilidad de los espermatozoides congelados

disminuye rápidamente durante los primeros meses de almacenaje y

principalmente en el primer mes y después de ese tiempo, el semen permanece

prácticamente sin cambios.

Las diferentes combinaciones y concentraciones de AC y SFB (Gráfica

3), muestran una MP aceptable, teniendo como mínimo 40 %, para el

tratamiento testigo (80-0), 70-10 SFB y 60-20 SFB, no ocurriendo lo mismo con

el tratamiento 10-70 SFB que fue el mejor con 60 % de MP, estos resultados

concuerdan con lo encontrado por Madrid (2004) el cual combinó SFB al 30 % y

10 % YH y 60 % de citrato de sodio al 2.9 %, obteniendo MP de 65 %.

En lo que se refiere a las diferentes concentraciones y combinaciones de

AC y AV no ocurrió lo mismo (Gráfica 4) que lo que se observó con el diluyente

no convencional SFB ya que cuando el tratamiento tuvo las mayores

concentraciones de AV (60 y 70 %) la MP se vio afectada, presentando apenas

30 %. Esto puede deberse a que el AV no contiene la suficiente cantidad de

proteínas y azúcares, porque aunque se haya corregido el pH, dichas

concentraciones no pudieron dar a los espermatozoides medios apropiados de

dilución como lo menciona Hafez (2002).

Los bajos porcentajes de MP y EV con los tratamientos 20-60 AV y 10-70

AV también pueden atribuirse a la densidad que presenta el gel de AV, y al

agregar el glicerol no puede diluirse perfectamente, evitando que penetre la

36

Gráfica 3. Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un modelo

de regresión con diferentes niveles de agua de coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones de suero fetal bovino en el P3.

37

Gráfica 4. Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un modelo de regresión con diferentes niveles de agua de coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones de aloe vera en el P3.

38

AV también pueden atribuirse a la densidad que presenta el gel de AV, y al

agregar el glicerol no puede diluirse perfectamente, evitando que penetre la

cantidad necesaria requerida para la protección de los espermatozoides durante

el congelamiento profundo. Sin embargo López (2001) reportó MP menores con

un diluyente 100 % AV (45 % AV, 55 % citrato de sodio al 2.9 %) con apenas 10

% de MP a las 48 h poscongelamiento, donde atribuyó que fue necesaria la

yema de huevo (YH) para el proceso de congelamiento.

Madrid (2004) agregó tres diferentes niveles de YH (10, 20 y 30 %) en

sustitución de los diluyentes no convencionales. Al combinar AV al 30 % y 10 %

de YH y 60 % de citrato de sodio al 2.9 %, encontró MP de 30 %, atribuyendo

que para preservar células espermáticas no son recomendables cantidades

menores de 20 % ya que no logran proteger en su totalidad a la membrana del

espermatozoide. Sus resultados no concuerdan con Rodríguez (1988) ya que el

utilizó 10 % de YH en un diluyente con base en AV al 40 % en combinación con

citrato de sodio, donde obtuvo 49.5 % de MP al descongelamiento.

Está investigación utilizó la cantidad recomendada por Salamon y

Maxwell (2000) de 14 ml de yema de huevo y dichos resultados coinciden con

Rodríguez (1988) encontrándose (Gráfica 4) MP arriba de 40 % cuando las

combinaciones no excedían de 50 % de gel de AV. Cardoso et al. (2000) evaluó

semen canino diluido en AC, encontrando mejores resultados al adicionar 20 %

de YH y 4 % de glicerol, mejorando la calidad espermática al descongelado.

Noventa Días Poscongelamiento (P4)

En este tiempo si hubo cambios mínimos con P3 pero únicamente para

las diferentes concentraciones y combinaciones de AC y SFB, comparando P0

39

con P4 de los mismos tratamientos se observó que en general hubo una

disminución de 45.4 % de MP y 44.7 % de EV, ya que el semen de ovino sufre

daños irreversibles al ser sometido a los efectos del congelamiento, el cuál

mayormente ocurre en la membrana espermática (Watson, 2000) por lo que

Valcárcel et al. (1994) mencionan que al descongelar el semen no es evidente

el efecto en la motilidad pero que si se reduce drásticamente la integridad de la

membrana, por lo que recomienda evaluarla por medio de tintes fluorescentes.

Por otra parte al evaluar AC y su combinación con diferentes

concentraciones de AV (Cuadro 2) puede observarse que a partir de concluido

el proceso de congelamiento (P2) ya no hubo ningún cambio en la motilidad de

los espermatozoides, dichos tratamientos se comportaron de la misma manera

como lo menciona Madrid (2004), en donde a partir de las 48 h

poscongelamiento ya no hubo cambio alguno para MP y EV. Aunque las

combinaciones con base en AC con SFB coincidieron con lo señalado por First

et al. (1961), en donde se observó que el semen fue susceptible durante los

primeros meses a sufrir daños y después permaneció prácticamente igual.

Tal vez la diferencia con el gel de AV en combinación con diferentes

niveles de AC se deba a que todos los daños irreversibles que le ocasionaron a

los espermatozoides fueron de P0 a P2 y por ello ya no hubo cambios. Los

tratamientos con base en AV tuvieron en promedio durante los cinco períodos

de evaluación (P0 a P4) una disminución de 49.58 % de MP y 44.5 % de EV,

siendo mejor en promedio todos los tratamientos, con una mínima diferencia los

de SFB para MP. En la (Gráfica 5) puede apreciarse una ligera disminución de

MP en la mayoría de las diferentes combinaciones y concentraciones de AC y

40

Gráfica 5. Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un modelo

de regresión con diferentes niveles de agua de coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones de suero fetal bovino en el P4.

41

SFB, sin embargo son aceptables, teniendo como mínimo 40 % de MP, el

tratamiento 10-70 SFB siguió siendo el mejor ahora con 60 % de MP,

coincidiendo los resultados con los obtenidos por Madrid (2004).

Con los diluyentes con base en AC y AV no ocurrió lo mismo, ya que

mantuvo la misma MP (Gráfica 6) que en P3, debido a esto la discusión de esta

gráfica será omitida, ya que es idéntica a la (Gráfica 4). Madrid (2004) con 20 %

de AV, 20 % de YH y 60 % de citrato de sodio al 2.9 % reportó 50 % de MP a

los 90 d poscongelamiento, en esta investigación se encontró la mejor MP

cuando el gel de AV tuvo 50 % con citrato de sodio (40-40 AV) encontrándose

60 % de MP (Cuadro 2), tal vez se deba a que con esas concentraciones se

encuentran los nutrientes necesarios para ayudar en la criopreservación de

células espermáticas.

En el caso de López (2001) a los 90 d poscongelamiento los

tratamientos 100 % AV y SFB apenas tenían 7 y 15 % de MP respectivamente y

los únicos tratamientos con valores aceptables para semen descongelado

fueron el control, CY y sus combinaciones 1:1 con (SOP, AV y SFB), en donde

atribuye que es necesaria la YH como protector contra el choque térmico,

coincidiendo con Holt (2000) que menciona que por ello es común utilizarla en

los diluyentes para congelamiento de semen de los animales domésticos.

42

Gráfica 6. Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un modelo

de regresión con diferentes niveles de agua de coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones de aloe vera en el P4.

43

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

La mayoría de los diluyentes fueron capaces de mantener un porcentaje

de motilidad progresiva y espermatozoides vivos aceptables durante los

procesos de dilución, congelamiento y descongelamiento de semen.

Las diferentes combinaciones de AC con diferentes concentraciones del

diluyente no convencional SFB, ofrecieron medios mas apropiados para la

dilución y preservación de semen en comparación con el diluyente no

convencional AV, cuando dichas concentraciones excedían el 50 % de gel de

aloe vera.

Para diluir el semen fresco, se pueden recomendar las concentraciones y

combinaciones 10-70 SFB y 40-40 AV ya que fueron los mejores tratamientos

debido a su estabilidad mostrada durante todo el proceso de congelamiento.

Las combinaciones 10-70 SFB y 40-40 AV fueron los mejores

tratamientos y son recomendables como componentes de medio de dilución de

semen por su eficiencia en la fase de poscongelamiento a los 90 d, en el otro

extremo los tratamientos con concentraciones 20-60 AV y 10-70 AV no son

recomendables para la criopreservación de semen ovino, ya que los resultados

muestran que fueron incapaces de mantener los estándares mínimos

recomendados como diluyentes para criopreservación de semen.

Se recomienda validar los mejores tratamientos con diferentes razas de

ovinos, incrementando el número de sementales y eyaculados por semental

para observar si cada diluyente presenta las mismas cualidades, al igual se

recomienda que al descongelar semen se evalué por medio de tintes

fluorescentes el daño que sufre la membrana espermática ya que el semen

44

ovino al descongelado presenta excelente motilidad pero muy poca fertilidad al

inseminar artificialmente con semen criopreservado. También se recomienda

probar los diluyentes que presentaron excelente motilidad a los 90 d

poscongelamiento en programas de inseminación artificial para determinar si

ofrecen valores aceptables en porcentajes de preñeces por inseminación

artificial con laparoscopia ya que está técnica presenta excelentes resultados

con semen fresco diluido y por último no se recomienda utilizar más del 50 % de

gel de aloe vera como diluyente, ya que es perjudicial para la viabilidad de los

espermatozoides.

45

LITERATURA CITADA

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49

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Wiemer, K. E y J. L. Ruttle. 1987. Semen characteristics, scrotal circumference

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Yoshida, M. 2000. Conservation of sperms: current status and new trends.

Anim. Reprod. Sci. 60-61:349-355. Zemjanis, R. 1996. Reproducción Animal: Diagnostico y Técnicas Terapéuticas.

Editorial Limusa. México, D. F. 253 pp.

50

A P É N D I C E

51

ANEXO 1. SISTEMA DE VALORACIÓN DE MOTILIDAD MASAL

Valor

Clase

Descripción

5 Muy buena Densa, con ondas de movimiento muy rápidas. No se pueden observar las células individuales. El 90 % o más de los espermatozoides son activos.

4 Buena Movimiento vigoroso, pero las ondas y los remolinos no son tan rápidos como en el anterior. Alrededor de 70 a 35 % de células activas.

3 Regular Ondas con movimiento lento. Se aprecian espermatozoides aislados. El 45 a 65 % de las células son activas.

2 Pobre No aparecen ondas aunque se observan movimientos de espermatozoides. Sólo viven el 20 a 40 % de las células espermáticas y su movilidad es pobre.

1 Muy pobre Muy pocos espermatozoides (cerca de 10 %) viven. Movimientos débiles.

0 Muertos Sin espermatozoides móviles. Adaptado de Evans y Maxwell (1990).

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ANEXO 2. COMPOSICIÓN DEL AGUA DE COCO DE UN FRUTO DE SEIS MESES DE MADURACIÓN

Aminoácidos µg/ ml Aspártico 5.4 Glutámico 78.7 Serina 65.8 Glicina 13.9 Aspargina 10.4 Treanina 26.3 Alanina 177.1 Glutamina 13.4 Lisina 22.5 Arginina 16.8 Prolina 21.6 Valina 15.1 Leucina 31.6 Fenilalanina 10.2 Tirosina 3.1 Aminobutírico 168.8 Homoserina 5.2 Histina, Metionina y Hidroxiprolina (trazas) Azúcares mg/ml Sacarosa 8.9 Glucosa 2.46 Fructosa 2.51 Vitaminas mg/ml Ácido nicotínico 0.64 Ácido pantoténico 0.52 Biotina 0.02 Riboflavina 0.01 Ácido fólico 0.003 Tiamina y Piridoxina (trazas) Minerales mg/100ml Potasio 312.0 Cloro 183.0 Sodio 105.0 Fósforo 37.0 Magnesio 30.0 Azufre 24.0 Hierro 0.1 Cobre 0.04 Calcio (trazas)

Fuente: Nunes y Fernández (2001).