Aislamiento del productoAislamiento del producto

Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento.

En este caso particular consideramos como producto:

ProteínaCAROLINA VITA

Aislamiento de una proteínaAislamiento de una proteína

Se requiere conocimiento de la Se requiere conocimiento de la proteínaproteína– De que tipo de célula provieneDe que tipo de célula proviene– De que parte de la célulaDe que parte de la célula– Qué hace esa proteínaQué hace esa proteína

Particularmente útil si se conoce :Particularmente útil si se conoce :– TamañoTamaño– ComposiciónComposición

Aislamiento de una proteínaAislamiento de una proteína

Selección de la fuente proteicaSelección de la fuente proteica

Ej: de tejidos de animalales como pollos, Ej: de tejidos de animalales como pollos, cerdos, vacas, ratas son los elegidoscerdos, vacas, ratas son los elegidos

Distribución de la proteina (mayor Distribución de la proteina (mayor concentración)concentración)

Ej: microorganismosEj: microorganismos1.1. bacterias: bacterias: E. coliE. coli2.2. Levaduras: Levaduras: Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae   Tecnicas de clonado molecularTecnicas de clonado molecular

Métodos de solubilizaciónMétodos de solubilización

  Es el primer paso obligado de la Es el primer paso obligado de la purificación purificación

la proteína debe estar en la proteína debe estar en solución solución

Estabilizacón de la proteinaEstabilizacón de la proteinaExistencia de agentes que provocan un Existencia de agentes que provocan un

daño irreversible daño irreversible  pH pH TT Proteasas Proteasas Interfase agua–aire Interfase agua–aire Adsorción a la pared de los Adsorción a la pared de los

recipientesrecipientes Crecimiento de microorganismos  Crecimiento de microorganismos  

En el caso de proteína intracelular En el caso de proteína intracelular muy baja concentracion y muy baja concentracion y acompanada de millares de proteinas acompanada de millares de proteinas y otras macromoleculasy otras macromoleculas

En el caso de proteínas En el caso de proteínas extracelulares pueden estar en baja extracelulares pueden estar en baja concentración y también concentración y también acompañada o ser el principal acompañada o ser el principal producto extracelularproducto extracelular

EstrategiaEstrategia

Remover del organismo la proteína Remover del organismo la proteína pura en la menor cantidad de pasos pura en la menor cantidad de pasos con la menor pérdida de actividad con la menor pérdida de actividad posibleposible

ObjetivoObjetivo Purificación de una proteína de interésPurificación de una proteína de interés

Para ello se cuenta con Para ello se cuenta con métodosmétodos de de purificaciónpurificación

Los métodos se utilizan en etapas Los métodos se utilizan en etapas Serie de pasos independientes que Serie de pasos independientes que

utilizan las caracteristicas utilizan las caracteristicas fisicoquimicas de las proteínas para fisicoquimicas de las proteínas para separarlas de otras proteínas o de otras separarlas de otras proteínas o de otras sustanciassustancias

Metodos de purificaciónMetodos de purificación

Basado en las siguientes propiedades Basado en las siguientes propiedades proteicas:proteicas:

Tamaño Tamaño SolubilidadSolubilidad CargaCarga AdsorciónAdsorción Afinidad Afinidad

CaracterístiCaracterística ca  

ProcedimientosProcedimientos

Tamaño Dialisis – ultrafiltración Electroforesis en gel Cromatografia de exclusión molecular Ultracentrifufacion 

Solubidad Precipitación con Sales “ Solventes organicos ‘’ por pH

Polaridad Cromatografia de absorción C. En papel C. En fase reversa C. De interaccion hidrofóbica

Carga Cromatografia de intercambio iónico Electroforesis Isoelectroenfoque

Selectividad Cromatografia de afinidad 

TamañoTamañoDiálisisDiálisis

Utiliza membrana semipermeable donde Utiliza membrana semipermeable donde

moleculas de agua y las de solutos moleculas de agua y las de solutos pequeños la atraviesenpequeños la atraviesen

LAS LAS PROTEÍNAS PROTEÍNAS SON SON

RETENIDASRETENIDAS

DiálisisDiálisis

TamañoTamaño

UltrafiltracionUltrafiltracionSe utiliza una membrana semipermeable Se utiliza una membrana semipermeable

que retiene las proteínasque retiene las proteínas

La presión o fuerza centrífuga se usa La presión o fuerza centrífuga se usa para separar por filtración el medio para separar por filtración el medio acuoso y las moléculas de tamaño acuoso y las moléculas de tamaño pequeñopequeño

• Uso de celofán o membranasUso de celofán o membranas

CentrifugaciónCentrifugación

Método separación y análisisMétodo separación y análisis

Centrifugation en gradiente de Centrifugation en gradiente de densidaddensidad

Gradientes continuos de sacarosaGradientes continuos de sacarosa tubo de centrifugatubo de centrifuga

Recuperación del materia:Recuperación del materia:

Se perfora el tubo o bien se congela y Se perfora el tubo o bien se congela y se corta en capasse corta en capas

CentrifugaciónCentrifugación

Los componentes de la mezcla se Los componentes de la mezcla se separan por:separan por:

PesoPeso TamañoTamaño DensidadDensidad FormaForma

Coeficiente de Coeficiente de sedimentaciónsedimentación

S = M (1-VS = M (1-V) ) N fN f

M: peso molecularM: peso molecularV: Volumen espécificoV: Volumen espécifico: : densidad de la solucióndensidad de la soluciónN : numero de avogadroN : numero de avogadroF: coeficiente de fricciónF: coeficiente de fricción

Las proteínas migran de forma proporcional Las proteínas migran de forma proporcional a este coeficientea este coeficiente

SolubilidadSolubilidad

Muy utilizados en los primeros pasos Muy utilizados en los primeros pasos de la purificaciónde la purificación

Mantiene nativa a la proteinaMantiene nativa a la proteina Redisolucion sin perdida de actividadRedisolucion sin perdida de actividad

SolubilidadSolubilidad

Proteina composicion de aa Proteina composicion de aa le le otorga un comportamiento diferenteotorga un comportamiento diferente

La solubilidaad de la proteína La solubilidaad de la proteína depende:depende:

Interacción intraproteinaInteracción intraproteina Interaccíon proteína-proteínaInteraccíon proteína-proteína Interacción proteína- disolvente Interacción proteína- disolvente

SolubilidadSolubilidad

Interacciones mencionadas dependen Interacciones mencionadas dependen de:de:

pHpH Fuerza iónicaFuerza iónica DisolventeDisolvente TemperaturaTemperatura

Solubilidad-pHSolubilidad-pH

La carga neta de las proteína depende del La carga neta de las proteína depende del contenido de aa ácidos y de aa básicoscontenido de aa ácidos y de aa básicos

El valor del pH donde la carga neta de la El valor del pH donde la carga neta de la proteína es cero proteína es cero pI pI (punto isoelectrico)(punto isoelectrico)

Solubilidad es míninaSolubilidad es mínina

Ej: Ej: contenido de aa ácidos contenido de aa ácidos pI bajo (4-5)pI bajo (4-5)

Solubilidad-pHSolubilidad-pH

Solubilidad-Fuera iónicaSolubilidad-Fuera iónica

Salting inSalting in

Salting outSalting out

Salting inSalting in

Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 – 0.02 M)

aumenta con la [ sales] Salting inSalting in

Las proteínas en HLas proteínas en H22O tienden a formar O tienden a formar

COMPLEJOS electrostáticos COMPLEJOS electrostáticos precipitan precipitan

Al aumentar la [sales]

proteina se rodea de contraiones

más soluble por > interacción proteína-solvente

Salting outSalting out

La solubilidad a alta fuerza iónica (mayor a 0.02 M) disminuye con la [sales] Salting outSalting out

La alta [sal] remueve la esfera de La alta [sal] remueve la esfera de solvatación de la proteínasolvatación de la proteína

Sales capturan el H2O > interacción prot-prot

Solubilidad-DisolventesSolubilidad-Disolventes

Adición de disolventes neutros miscibles Adición de disolventes neutros miscibles en agua en agua (ACETONA, ETANOL)(ACETONA, ETANOL)

Se usan en distintas proporcionesSe usan en distintas proporciones   Bajan el poder de solvatación de las Bajan el poder de solvatación de las

soluciones acuosassoluciones acuosas

Solubilidad- TemperaturaSolubilidad- Temperatura

0-40 0-40 ooC C >T > solubilidad.>T > solubilidad. 40-5040-50ooC C inestabilidad inestabilidad

DESNATURALIZAN (DESNATURALIZAN ( solubilidad) solubilidad)