Akademia Wiedzy Synevo Polska

zaprasza na szkolenie online …

Badania genetyczne

w niepłodności

Prelegent i autor prezentacji:

dr n. med. Agnieszka Sobczyńska-Tomaszewska

Pracownia Diagnostyki Genetycznej i Poradnia Genetyczna

Niepłodność

2. Ginekologia

3. Andrologia

. .

Program webinaru

Brak wystąpienia ciąży w okresie 12-miesięcznego współżycia

seksualnego partnerów w celach prokreacyjnych (WHO)

Co to jest niepłodność?

Niepłodność: problem dotyczy 10-15% par w wieku prokreacyjnym

Płodność

Niepłodność żeńska czy męska?

U około 15% mężczyzn i 10% kobiet z niepłodnością przyczynami są nieprawidłowości genetyczne

(cytogenetyczne i molekularne).

10% 35%

czynnik męski

35 – 45%

czynnik żeński

20%

czynnik męski i żeński

idiopatyczna

Ciężki, zazwyczaj przewlekły przebieg

Częste współistnienie upośledzenia umysłowego

i / lub fizycznego

Wysoki koszt diagnostyki i leczenia

Zwiększone ryzyko ponownego wystąpienia choroby w rodzinie

Choroba genetycznie uwarunkowana, to …

Choroba/predyspozycja przekazywana przez pokolenia,

spowodowana mutacją jednego lub kilku genów

lub też aberracją chromosomową.

Badanie cytogenetyczne (tzw. kariotyp)

Badanie CGH – porównawcza hybrydyzacja

genomowa (ang. comparative genomic

hybridization ) - umożliwia analizę całego genomu

w jednym badaniu z bardzo dużą rozdzielczością,

pozwala na identyfikację niezrównoważonych

aberracji chromosomowych (delecji/duplikacji),

które nie mogły by być rozpoznane klasycznymi

metodami cytogenetycznymi.

Aberracja chromosomowa

Nieprawidłowa liczba (47,XXY; 45,X0) lub

nieprawidłowa budowa chromosomów (delecje, translokacje)

Barwienie barwnikiem

Giemsy – ciemne prążki –

regiony bogate w AT.

Kreskami zaznaczone

położenie centromeru.

Dzięki uprzejmości

dr Aliny Ilnickiej

Zestaw 46

chromosomów

ludzkich -

kariotyp

Badanie kariotypu = badanie cytogenetyczne

Ocena ilościowa i jakościowa garnituru chromosomalnego człowieka

Analiza cytogenetyczna chromosomów barwionych metodą GTG o rozdzielczości 550 prążków.

46XX - żeński

46XY - męski

pary z niepłodnością męską

dziewczynki z niskorosłością (podejrzenie zespołu Turnera)

chłopcy z zaburzeniami dojrzewania (podejrzenie zespołu

Klinefeltera)

dzieci z niepełnosprawnością intelektualną

dzieci z wadami wrodzonymi

Kiedy wykonujemy badanie kariotypu?

Dzika sekwencja ...AGACCATAGGCACTAGAACC...

Podstawienie ...AGACCATAGACACTAGAACC...

Wstawienie ...AGACCATAGCTGCACTAGAACC...

Delecja ...AGACCATAG ***CACTAGAACC...

Analiza molekularna

Mutacje to dziedziczne zmiany w genomie organizmu, które mogą

wywoływać określony efekt fenotypowy, na poziomie molekularnym

mutacje dotyczą zmiany w sekwencji lub organizacji DNA.

Np. mutacje w genie CFTR, mutacja Leiden, ...

Rodzaj diagnostyki genetycznej a źródło DNA

Diagnostyka

Preimplantacyjna Komórki zarodka, komórki linii płciowej

Diagnostyka

prenatalna

Komórki trofoblastu, komórki płynu owodniowego, leukocyty z krwi pępowinowej

Diagnostyka

postnatalna

Dowolne komórki jądrzaste, fragmenty tkanek

Badania molekularne: 1-4 ml krwi żylnej do probówki

morfologicznej (EDTA) lub kilka kropli na bibułę

Badania cytogenetyczne (kariotyp): 5 ml do probówki

z heparyną litową

Sposób pobrania

1. Niepłodność

Ginekologia

3. Andrologia

.

.

Około 30% wszystkich ciąż jest

tracona w trakcie poronień, większość

przed momentem klinicznego

rozpoznania ciąży.

8-15% klinicznie rozpoznanych ciąż

ulega poronieniu.

80% poronień przed 12 tyg. ciąży.

Poronienia

pozostałe przyczyny: infekcje,

nieprawidłowości dróg rodnych,

ekspozycja na toksyny, choroby

endokrynologiczne

i immunologiczne

50% poronień jest

wynikiem nieprawidłowości

chromosomowych

Poronienia - rekomendowane badania genetyczne:

badanie kariotypu u obydwojga rodziców – jeden

z partnerów spośród 3-5% par z poronieniami nawracającymi

jest nosicielem zrównoważonej strukturalnej anomalii

chromosomalnej (m.in. translokacja robertsonowska)

1.

Poronienia - rekomendowane badania genetyczne:

cytogenetyczne badanie zarodka lub kosmówki –

nieprawidłowy kariotyp poronionego płodu jest dobrą

prognozą dla kolejnej ciąży

2.

Poronienia - rekomendowane badania genetyczne:

wywiad w kier. trombofilii – badanie mutacji Leiden i genu

protrombiny

3.

Poronienia - rekomendowane badania genetyczne:

porada genetyczna – ewentualne wskazanie do diagnostyki

prenatalnej

4.

Badanie

materiału

poronnego

Badanie materiału poronnego

W około 50-60% przypadków wykrywa się nieprawidłowości chromosomowe:

trisomie 50%

poliploidie 25%

monosomie 15%

inne nieprawidłowości

strukturalne 10%

Metoda QF-PCR pozwala na szybkie, a zarazem wiarygodne

diagnozowanie najczęściej występujących zaburzeń genetycznych

będących głównymi przyczynami poronień, tj. aberracji liczbowych

chromosomów: 13, 15, 16, 18, 21 i 22 oraz aneuploidii

chromosomów płciowych (m. in. zespół Turnera).

Metoda QF-PCR

Metoda ta jest oparta na analizie powtórzeń regionów STR.

Jej ogromną zaletą jest eliminacja błędu oznaczenia w przypadku,

gdy badany zarodek/płód jest płci żeńskiej – metoda pozwala na

wykrycie kontaminacji materiału poronnego materiałem pacjentki.

Metoda QF-PCR

Zakrzepica żył

Spowolnienie przepływu krwi w naczyniach żylnych, zakrzepica żył głębokich

Wieloczynnikowa choroba wywołana interakcją czynników środowiskowych

(np.: siedzący tryb życia, otyłość, palenie tytoniu) i genetycznych

Objawy: ból i obrzęk kończyn, zaczerwienienie i zasinienie.

Zakrzepica żył

Ryzyko wystąpienia choroby dla:

heterozygot mutacji R506Q: 5-7x wyższe niż w populacji ogólnej,

heterozygot stosujących antykoncepcję doustną: 30-50x;

dla homozygot R506Q: ryzyko 80x

Dodatkowe badania: geny F2 (protrombina) i MTHFR (reduktaza

5,10- metylenotetrahydrofolianu)

Częstość występowania mutacji typu Leiden w genie czynnika V: 1-7%

Wskazania do wykonania badań (biochemicznych i genetycznych)

w kierunku trombofilii

zakrzepica żylna bez uchwytnej przyczyny przed 45-50. r. ż.

zakrzepica żylna u osoby obciążonym wywiadem rodzinnym (zakrzepica w rodzinie)

zakrzepica nawracająca

zakrzepica o nietypowej lokalizacji (np. żyły jamy brzusznej)

zakrzepica rozwijająca się w czasie ciąży

zakrzepica w trakcie stosowania doustnej antykoncepcji lub hormonalnej terapii

zastępczej

nawykowe poronienia lub urodzenie martwego płodu

badanie osoby asymptomatycznej z obciążonym wywiadem rodzinnym

Wskazania do wykonania badań w kierunku

trombofilii

Przedwczesne wygasanie funkcji jajników (POF)

a zespół łamliwego chromosomu X (FRAX)

ekson 1 intron 1

sekwencja prawidłowa (6-59 kopii CGG)

premutacja (60-220 kopii CGG)

pełna mutacja (ponad 220 kopii CGG)

niestabilna sekwencja (CGG)n

sekwencja eksonowa

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 15 16 17

-(CGG)n- sekwencje eksonowe kodujące białko

sekwencje intronowe

sekwencja eksonowa niekodująca

Schemat genu FMR1

Najczęstsza dziedziczna przyczyna upośledzenia umysłowego: U chłopców i druga co do częstości wśród przyczyn

genetycznych (po zespole Downa).

W większości przypadków nie jest prawidłowo rozpoznawana, zwłaszcza u kobiet.

Częstość występowania FRAX, to …

1:1200-3600 u chłopców,

1:4000-6000 u dziewczynek

Nowotwór sutka

i/lub jajnika

Rak piersi – najczęściej diagnozowany nowotwór

złośliwy u kobiet; 5-10%: postacie rodzinne

mutacja BRCA1

27% 70% 40%

mutacja BRCA2

Prawdopodo-bieństwo rozwoju nowotworu piersi

Prawdopodobieństwo rozwoju nowotworu piersi raka jajnika

Prawdopodobieństwo rozwoju nowotworu raka jajnika

56%

Prawdopodo-bieństwo rozwoju nowotworu piersi

BRCA1 i BRCA2 – geny naprawy DNA; mutacje stanowią

predyspozycję do rozwoju nowotworu

Nowotwór sutka i/lub jajnika

Rekomendacje EMQN:

W związku z heterogennością populacji europejskiej

należy badać cały region kodujący.

I etap diagnostyki

Identyfikacja mutacji: 5382insC,

C61G

i 4153delA + 150 mutacji rzadkich

Wykrycie mutacji:

profilaktyka przeciwnowotworowa, m.in.

chirurgiczna; przeciwwskazanie do stosowania

terapii hormonalnej, m.in. antykoncepcji

Rekomendacje Polskiego Towarzystwa

Ginekologicznego

Do grup wysokiego ryzyka zachorowania kwalifikuje się rodziny,

u których:

wystąpiły 3 lub więcej zachorowania na raka gruczołu sutkowego

lub/i jajnika u krewnych I i II stopnia (włączając w to pacjentkę)

u jednej i tej samej pacjentki lub u jej krewnej I lub II stopnia

wystąpiły jednoczasowo lub w różnym czasie zachorowania

na raka gruczołu sutkowego i jajnika

jeżeli u pacjentki stwierdzono wcześniej mutację genu BRCA1

Rekomendacje Polskiego Towarzystwa

Ginekologicznego c.d.

jeżeli wśród krewnych I i II stopnia (włączając w to pacjentkę)

wystąpiły 2 zachorowania na raka gruczołu sutkowego lub/i

jajnika – w tym 1 zachorowanie przed 50. rokiem życia

jeżeli pacjentka lub jedna z jej krewnych I stopnia zachorowała

na raka gruczołu sutkowego lub jajnika przed 40. rokiem życia

Rekomendacje Polskiego Towarzystwa

Ginekologicznego

Zalecenia dla kobiet nosicielek mutacji w genie BRCA1/BRCA2

Comiesięczna samokontrola piersi

Badanie palpacyjne piersi przez lekarza co 6 miesięcy

Badanie obrazowe piersi (USG, mammografia, rezonans

magnetyczny - w zależności od wieku i budowy piersi)

co 6 miesięcy (od 25 r. ż. USG, rezonans magnetyczny,

od 35 r. ż. mammografia)

Rekomendacje Polskiego Towarzystwa

Ginekologicznego

Badanie ginekologiczne co 6 miesięcy (od 30 r. ż.)

USG przezpochwowe co 6 miesięcy (od 30 r. ż.)

Oznaczenie poziomu markera CA 125 w surowicy krwi

co 6 miesięcy (od 30 r.ż.)

W oparciu o Rekomendacje PTG (2004) oraz Rekomendacje Europejskiego Towarzystwa

Onkologii Medycznej (ESMO 2011).

1. Niepłodność

2. Ginekologia

Andrologia

.

.

Parametry prawidłowego nasienia zgodnie

z rekomendacjami EAA, 2012

niepłodność męska

pseudohermafrodytyzm (NR5A1)

zaburzenia determinacji płci

(SOX9, SRY, NROB1)

wnętrostwo (HOXA10, INSL3, GREAT)

CBAVD

zaburzenia rozwoju

narządów rozrodczych

hypogonadyzm hypogonadotropowy

(GNRH, KAL, PC1, GNRHR, LEP, PCSK1)

deficyt gonadotropin

(LHB, CGLHR, HESX1, LHX3, PROP1)

zaburzenia syntezy steroidów

(StAR, CYP21, TDD, CYP17)

zaburzenia metabolizmu steroidów

(SRD5, SRD5A)

zaburzenia hormonalne

dystrofia miotoniczna (DMPK)

zespół Noonana (PTPN11)

anemia sierpowata + ßtalasemia (HBB)

zespół Kartagenera +

zespół nieruchomych rzęsek (DNA1, DNAH5)

anemia Fanconiego (FANCA)

zaburzenia wytwarzania i

dojrzewania plemników ( PGK2, SP10, LDH C4)

zaburzenia spermatogenezy

i funkcjonowania plemników

zespół Klinefeltera (XXY lub XXXY)

mieszana dysgenezja gonadialna

(45,X/46,XY)

translokacje, inwersje, delecje

defekty molekularne aberracje chromosomowe

niepłodność

męska

zaburzenia rozwojowe,

hormonalne,

defekty spermatogenezy

Najczęstsze genetyczne przyczyny

niepłodności męskiej

gen CFTR

region AZF

Region AZF

region AZFb (sY127, sY134)

Yp

Yq

SRY (sY14)

heterochromatyna

region pseudoautosomalny

centromer

region AZFa (sY84, sY86)

region AZFc (sY254, sY255)

region pseudoautosomalny

Delecje regionu AZF

Nie wykryto ich u pacjentów z normozoospermią ->

potwierdzenie zależności przyczynowo-skutkowej

Wykryto u pacjentów z azoospermią (8-12%) oraz

oligozoospermią (3-7%)

• Bardzo rzadko występują u pacjentów > 5 mln plemników/ml (0,7%)

• Częstość występowania poszczególnych delecji:

• AZFc 65-70%

• AZFb, AZFb+c lub AZFa+b+c 25-30%

• AZFa 5%

Delecje regionu AZF

Część plemników pacjentów z delAZFc ma nieprawidłowości

chromosomów płci potencjalne ryzyko potomstwa z 45,X0

Turner’s syndrome oraz innymi anomaliami chromosomów płci

ZFX/Y

SRY

AZFc

AZFa

AZFb

(Internationla Journal of Andrology, 27:240-249;2004)

AZFa objawy zespołu samych komórek

Sertolego, azoospermia, należy

spodziewać się problemów z uzyskaniem

plemników do procedury ICSI

AZFb objawy zespołu samych komórek

Sertolego lub zatrzymanie

spermatogenezy, azoospermia,

ponieważ nie udaje się uzyskać

plemników w trakcie TESE, ICSI nie jest

rekomendowane dla pacjentów z tego

typu defektem

AZFc zaburzenia spermatogenezy,

azoospermia lub zaawansowana

oligozospermia

region AZFb (sY127, sY134)

Yp

Yq

SRY (sY14)

heterochromatyna

region pseudoautosomalny

centromer

region AZFa (sY84, sY86)

region AZFc (sY254, sY255)

region pseudoautosomalny

Fertil Steril. 2006 Feb;85(2):441-5. „Y-chromosome microdeletions and recurrent pregnancy loss”.

OBJECTIVE: To determine the prevalence of Y-chromosome microdeletions in recurrent pregnancy

loss (RPL) couples as compared with couples with male factor infertility and fertile couples.

PATIENT(S): 17 men from RPL couples, 18 men from couples with a live birth and no history of

miscarriages, and 10 men from couples with male factor infertility.

RESULT(S): 14 of the 17 men (82%) tested had microdeletions in one or more of the four segments

studied. Two of the 10 male factor infertility patients (20%) had microdeletions in 2 different

segments. None of the 18 fertile men had any microdeletions in the 4 segments of the proximal AZFc

region studied.

CONCLUSION(S): The prevalence of the Y-chromosome microdeletions in the proximal AZFc region

was much higher in men from RPL couples than from fertile or infertile couples.

Wysoka częstość AZFc delecji u partnerów kobiet z nawracającymi poronieniami

Delecja gr/gr jest również potencjalnym czynnikiem ryzyka raka

jąder.

Pierwotne guzy jąder (ang. testicular germ cell tumor) są jednym

z najczęstszych nowotworów złośliwych u młodych mężczyzn

w wieku 20-44 lata.

W 2006 r. ten typ nowotworu stwierdzono u 21% młodych

mężczyzn chorych na nowotwory złośliwy (wg danych Krajowego Rejestru

Nowotworów, Centrum Onkologii-Instytut, Warszawa).

Delecja gr/gr – subregion AZFc

Pacjenci z delecją gr/gr mają 7-8-krotnie wyższe ryzyko rozwoju

oligozoospermii (OR = 7.9, 95%, CI: 1.8-33.8; p < 0.001)

Przyczyn rozwoju guzów jąder jest wiele.

Istotną rolę odgrywają tu różne czynniki genetyczne – ryzyko

rozwoju pierwotnego guza jąder jest 4-6-krotnie wyższe u synów

osób chorych i 8-10-krotnie u braci osób chorych.

Obecność deletions gr/gr jest predyspozycją do wystąpienia

delecji AZFc w następnym pokoleniu.

Delecja gr/gr – subregion AZFc

Badanie nieprawidłowości chromosomalnych

w nasieniu

Badanie z zastosowaniem metody FISH

Aneuploidie, szczególnie dotyczące chromosomów płci

są związane z ciężkimi zaburzeniami spermatogenezy

(3,6-10 mln plemników/ml) i są identyfikowane często

u mężczyzn z translokacjami

Badanie cytogenetyczne plemników NIE JEST BADANIEM

DIAGNOSTYCZNYM, jest wciąż badaniem naukowym.

CFTR-opatie (zgodnie z WHO, 2000)

Mutacje w genie CFTR

Klasyczna postać CF z niewydolnością zewnątrz wydzielniczą trzustki

Klasyczna postać CF z wydolnością zewnątrzwydzielniczą trzustki

Atypowe postaci CF

Noworodkowa hypertrypsynogenemia

Izolowana postać azoospermii obstrukcyjnej (włączając CBAVD)

Przewlekłe zapalenie trzustki

Aspergillosa oskrzelowo-płucna

Rozstrzenie oskrzeli

Stwardniające zapalenie dróg żółciowych

CBAVD

50-82% pacjentów ma mutację CFTR w co najmniej jednej kopii genu (w jednym allelu genu)

Azoospermia, objętość nasienia < 1,5ml, pH <7,0

F508del/R117H + IVS8-5T mukowiscydoza

F508del/R117H CBAVD (niepłodność męska)

Allel 1 Allel 2

ciężka ciężka mukowiscydoza pełnoobjawowa

ciężka łagodna mukowiscydoza łagodna,

choroby CFTR-zależne

(w tym CBAVD)

ciężka 5T choroby CFTR-zależne

(w tym CBAVD)

5T 5T choroby CFTR-zależne

(w tym CBAVD)

Najczęściej identyfikowane genotypy w CBAVD: F508del/R117H+7T lub 9T F508del/5T + 12TG lub 13TG F508del/D1152H

CBAVD

50-82% pacjentów ma mutację CFTR w co najmniej jednej kopii genu (w jednym allelu genu)

ekson 8 intron 8 ekson 9 intron 9 ekson 10

DNA

5T GTGTGTTTTTAACAG

9T GTGTGTTTTTTTTTAACAG 7T GTGTGTTTTTTTAACAG

ekson 8 ekson 9 ekson 10

CFTR mRNA

7T lub 9T

ekson 8 ekson10

5T

(-) ekson 9 CFTR mRNA

Wpływ sekwencji poliT na składanie eksonów

3T, 2T

Wpływ sekwencji poliT i (TG)n

na składanie eksonów

Rekomendacje American College

of Medical Genetics

Badanie powinno być proponowane:

Populacji kaukaskiej (rasa biała) pochodzenia

nie-żydowskiego

Żydom Aszkenazyjskim

Badanie nosicielstwa mutacji CFTR

test prekoncepcyjny

Badanie nosicielstwa mutacji CFTR

test prekoncepcyjny

3120+1G>A A455E G85E R334W 1717-1G>A

3659delC F508del R347P 1898+1G>A 3849+10kbC>T

I507del N1303K R553X 2184delA 621+1G>T

G542X R1162X R560T 2789+5G>A 711+1G>T

G551D R117H W1282X

USA: zestaw 23 mutacji z częstością powyżej 0.1%:

częstość choroby: 1/2500

częstość nosicielstwa: 1/25

Test prekoncepcyjny w kierunku

mukowiscydozy w Polsce - ???

Zakres badania zgodny z zaleceniami

Polskiego Towarzystwa Mukowiscydozy

F508del R334W 1717-1G>A 2143delT

G542X R347P R117H+IVS8-T dele2,3(21kb)

R553X W1282X 3849+10kbC>T 2184insA

G551D N1303K 2183delAA>G K710X

Min.16 mutacji:

Wybór metody:

SEKWENCJONOWANIE: czułość 99,9%

Pozwala na wykrycie zarówno mutacji szukanych

(z podstawowego panelu) jak też mutacji rzadkich.

Badania zalecane przed ART

BADANIE KOBIETA MĘŻCZYZNA

Kariotyp W przypadkach pierwotnej dysfunkcji jajników, w nawykowych poronieniach, zawsze przed ART

Szczególnie w przypadku azoospermii i oligozoospermii, zawsze przed ART

Analiza aneuploidii w plemnikach Po chemio- i radio- terapii

Analiza mikrodelecji regionu AZF chromosomu Y

W przypadkach azoospermii nieobstrukcyjnej i ciężkiej oligozoospermii (<106plemników/ml)

Analiza mutacji genu CFTR W przypadkach gdy u partnera zidentyfikowano mutacje CFTR, zawsze przed ART

W przypadkach CBAVD i CUAVD – R117H i IVS8-5T!!!,

zawsze przed ART.

Analiza mutacji genu KAL1 W przypadkach hipogonadyzmu hipogonadotropowego (HH)

W przypadkach azoospermii z HH

Analiza mutacji genu AR W przypadkach azoospermii i ciężkiej oligo

Analiza mutacji genu FMR1 (zespół łamliwego chromosomu X)

W przypadkach oligo –amenorrhoea, w wyniku pierwotnej dysfunkcji jajników, w przypadkach słabej odpowiedzi jajników na stymulację przed ART oraz u pacjentek z premutacją

Rekomendacje EAA, 2012

Porada genetyczna

1 • Zaplanowanie procesu diagnostycznego

2

• Ocena ryzyka wystąpienia innych problemów genetycznych (wywiad rodzinny, pochodzenie etniczne)

3

• Oferta porady dla krewnych Pacjenta

4 • Zaplanowanie postępowania terapeutycznego, wyboru metody ART

5

• Ocena ryzyka dla potomstwa -> ryzyko transmisji defektu od rodzica do potomstwa, -> ryzyko aberracji/mutacji de novo, -> potencjalne pozostałe ryzyka związane z procedurami IVF / ICSI)

6

• Zaplanowanie ewentualnej diagnostyki PGD i prenatalnej

7 • Omówienie aspektów bioetycznych i psychologicznych

Diagnostyka prenatalna

Materiał do badań genetycznych:

- trofoblast:11-14 Hbd

- komórki płynu owodniowego:15-17 Hbd

Molekularna diagnostyka prenatalna jest możliwa wyłącznie po wcześniejszym

określeniu defektu genetycznego u rodziców!

Wskazania do diagnostyki cytogenetycznej (kariotyp):

wiek matki > 35 lat; wiek ojca > 55 lat;

nieprawidłowy obraz USG;

aberracje chromosomowe w rodzinie.

Możliwość wykonania szybkiego testu MLPA w kierunku najczęstszych wad

płodu: zespół Downa, Edwardsa i Pataua – wynik po 3 dniach.

Kontakt:

MEDGEN Pracownia Badań Genetycznych i Poradnia Genetyczna ul. Orzycka 27, 02-695 Warszawa www.medgen.pl diagnostyka@medgen.pl dr Kamila Czerska 515-14-14-14; kamila.czerska@medgen.pl dr Agnieszka Sobczyńska-Tomaszewska 506-069-568; agnieszka.sobczynska@medgen.pl

SYNEVO Laboratoria Medicover Ul. Dzika 4, 00-194 Warszawa dr Andrzej Marszałek 604-172-806; andrzej.marszałek@synevo.pl

Dziękujemy