AKR1B10阻害剤の創製 - JST...2.9 3.4 Trp112 Trp21 Val301 His111 2.9 3.0 3.1 Gln303 Tyr49 Trp220 NADP+ 2.9 2.9 Trp21 Val48 Gln50 Selectivity pocket Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical

耐性克服効果を併せ持つ抗がん剤開発を指向したAKR1B10阻害剤の創製

岐阜薬科大学生命薬学大講座生化学研究室助教遠藤智史

健康・医療新技術説明会2017@JST東京本部別館 (2017.10.03)

非小細胞肺癌に対する薬物治療

Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University

非小細胞肺癌

扁平上皮癌非扁平上皮癌

EGFR遺伝子変異陽性/

ALK遺伝子変異陽性EGFR遺伝子変異陰性/

ALK遺伝子変異陰性

白金併用療法EGFR-TKI/ALK阻害剤または白金併用療法

白金併用療法またはEGFR-TKI/ALK阻害剤

ドセタキセル、ゲムシタビン、ベメトレキセド、ニボルマブ等



1次治療

2次治療

3次治療以降

非小細胞肺癌治療薬の耐性化

➢ EGFR-TKI耐性：ほとんどの症例で治療開始から数か月～1年程度で耐性化し再燃する。

Kobayashi et al., NEJM 352:786, 2005

Engelman et al., Science 316:1039, 2007

Yano et al., Cancer res 68:9479, 2008

➢ ALK阻害剤耐性：Crizotinibで8～10か月、Alectinibで28か月程度で耐性化する。

• ALK融合遺伝子の増幅、ALKキナーゼ領域の遺伝子変異、C-Kitの増幅やEGFR活性化などが原因とされる。


非小細胞肺癌治療薬の耐性化

➢ EGFR-TKI耐性：ほとんどの症例で治療開始から数か月～1年程度で耐性化し再燃する。

Kobayashi et al., NEJM 352:786, 2005

Engelman et al., Science 316:1039, 2007

Yano et al., Cancer res 68:9479, 2008

➢ ALK阻害剤耐性：Crizotinibで8～10か月、Alectinibで28か月程度で耐性化する。

• ALK融合遺伝子の増幅、ALKキナーゼ領域の遺伝子変異、C-Kitの増幅やEGFR活性化などが原因とされる。


【目的】

1. 癌治療における新規治療薬の開発

2. 抗癌剤耐性化の克服を可能にする新薬の開発

Aldo-keto reductase (AKR) 1B10

AKRスーパーファミリーに属するNADPH依存性還元酵素●

正常組織では主にヒトの腸や副腎に分布するが、肝癌や肺癌など多くの癌種で高発現する●

Aldose reductase (AR) と71％のアミノ酸配列相同性を示し、基質特異性も類似する●

Cancer References

Upregulation HepatocarcinomaJ Hepatol 2010,

Biochim Biophys Acta 2008

Non-small cell lung cancer

(NSCLC)Clin Cancer Res 2005,

Cancer Res 2007

Uterus cancer Int J Gynecol Cancer 2007

Oral cancer Toxicol Lett 2006

Esophageal cancer J Proteome Res 2008

Gastric cancer Eur J Surg Oncol 2014

Breast cancer Int J Cancer 2012

Pancreatic cancer Mod Pathol 2012

Downregulation Prostate cancer Front Pharmacol 2012

Colon cancer Mol Biol (Mosk) 2012






レチノイン酸ホメオスタシスの調節

レチノイン酸レチナールレチノール

AKR1B10↑↑

癌細胞の

・分化抑制≒増殖亢進

分化

イソプレノイド代謝

イソプレニルアルデヒド

イソプレニルアルコール

AKR1B10↑↑イソプレニルカルボン酸

イソプレニルピロリン酸

Rasなどの低分子量Gタンパクの活性化

癌細胞の

・増殖亢進アポトーシス

癌細胞に“特徴的”な増殖能の阻害

AKR1B10

阻害剤

【癌における役割】






【癌における役割】

反応性アルデヒドの解毒還元

異常増殖抗癌剤投与

細胞障害性の

”反応性アルデヒド”の生成(4-ヒドロキシノネナール、アクロレインなど)

低毒性のアルコール体

癌細胞の

・生存能の亢進・抗がん剤感受性低下

AKR1B10↑↑

AKR1B10

阻害剤

癌細胞の生存戦略の破綻

AKR1B10阻害剤は増殖抑制効果と抗癌剤耐性克服効果を併せ持つ新規抗癌剤になると期待される


AKR1B10阻害剤の想定される用途


• AKR1B10が高発現する癌に対する抗癌剤

• 既存薬との併用によって、作用増強および耐性化抑制効果を示すアジュバンド薬

• 既存薬に対して抵抗性を獲得した癌細胞に対する抗癌剤耐性克服薬

• 研究試薬としてのAKR1B10特異的阻害剤

これまでに発表されたAKR1B10阻害剤

Non-selective AKR1B10 inhibitors

Selective AKR1B10 inhibitors

Tolrestat

IC50 for 1B10 = 54 nM

IC50 for AR = 10 nM

Gallego et al., PNAS, 2007

Isolithocholic acid

IC50 for 1B10 = 27 nM

IC50 for AR = 6,900 nM

Endo et al., ABB, 2009

Chromene derivative 1

IC50 for 1B10 = 6.0 nM

IC50 for AR = 11 nM

Endo et al., BMC, 2010

Bisdemethoxycurcumin

IC50 for 1B10 = 60 nM


Matsunaga et al., BMC, 2009

Oleanolic acid

IC50 for 1B10 = 90 nM

IC50 for AR = 124,000 nM

Takemura et al., JNP, 2011

HAHE

IC50 for 1B10 = 6.2 nM

IC50 for AR = 4900 nM

Soda et al., EJMC, 2012

Chromene derivative 5n

IC50 for 1B10 = 4.7 nM

IC50 for AR = 24 nMEndo et al., BMC, 2013

Polyhydroxy steroid 6

IC50 for 1B10 = 830 nM

IC50 for AR > 100,000 nM

Chen et al., Steroids, 2016

MK204

IC50 for 1B10 = 80 nM

IC50 for AR = 21,700 nM

Cousido-Siah et al., ACS CB, 2016

260-fold

1400-fold

790-fold85-fold

>120-fold 270-fold


新規AKR1B10阻害剤の設計及び評価




IC50 for 1B10 = 6.0 nM

IC50 for AR = 11 nM

HAHE

IC50 for 1B10 = 6.2 nM



IC50 for 1B10 = 4.7 nM

IC50 for AR = 24 nM

790-fold


IC50 for 1B10 = 60 nM


85-fold

既存のAKR1B10阻害剤の構造を参考に

新たに誘導体を設計

Chromene derivative KO101

IC50 for 1B10 = 7.5 nM

IC50 for AR = 15 nM

アルキル鎖の延長によって選択性の向上は見られなかった。。。





IC50 for 1B10 = 6.0 nM

IC50 for AR = 11 nM

HAHE

IC50 for 1B10 = 6.2 nM



IC50 for 1B10 = 4.7 nM

IC50 for AR = 24 nM

790-fold


IC50 for 1B10 = 60 nM


85-fold

Chromene derivative KO104

IC50 for 1B10 = 8.3 nM


メトキシフェニル基の除去によって、阻害活性は維持されたまま、選択性が22倍にまで上昇した！



InhibitorStructure

of R1

IC50 (nM) or

% inhibitionRatio

1B10 AR AR/1B10

KO104 3-hydroxy 8.3 ± 1.4 180 ± 1 22

KO102 4-hydroxy 4.2 ± 0.2 204 ± 4 49

KO105 2-hydroxy 6.4 ± 0.4 220 ± 19 34

KO110 4-methoxy 11.3 ± 0.9 390 ± 40 35

KO114 3-fluoro 6.0 ± 1.4 340 ± 420 57

KO112 4-fluoro 3.5 ± 0.1 277 ± 17 79

KO115 2-fluoro 7.7 ± 0.2 210 ± 13 27

KO116 3,4-difluoro 7.7 ± 1.1 310 ± 21 40

KO117 3,5-difluoro 7.8 ± 0.3 320 ± 49 41

KO118 3-methyl 7.0 ± 0.6 200 ± 14 29

23

4

5



ドッキングモデルの比較

HAHE Bisdemethoxycurcumin

Chromene derivative 5n KO102

Gln303

Trp220

Tyr49

Cys299

Phe123

Val301

Ser304

Phe116

Gln114

His111

NADP+

2.9

3.4

Trp112

Trp220

Trp21

Val301

Ser304Gln114

His111

NADP+2.9

3.13.0

Gln303

Trp220Tyr49

His111

NADP+

2.9

2.9

Trp21

Val48

Gln50

Trp220Tyr49

His111

3.0

Trp21

3.4

2.8

Trp80

Leu302

Phe116

Val301

Phe123

Pro124Lys125

Ala131Ile132

Selectivity pocketSelectivity pocket


IC50 for 1B10 = 6.2 nM


IC50 for 1B10 = 60 nM


IC50 for 1B10 = 4.7 nM

IC50 for AR = 24 nM

790-fold 85-fold

5-fold

NADP+

ドッキングモデルの比較

HAHE Bisdemethoxycurcumin

KO102

Gln303

Trp220

Tyr49

Cys299

Phe123

Val301

Ser304

Phe116

Gln114

His111

NADP+

2.9

3.4

Trp112

Trp220

Trp21

Val301

Ser304Gln114

His111

NADP+2.9

3.13.0

Gln303

Trp220Tyr49

NADP+

2.9

2.9

Trp21

Val48

Gln50

Selectivity pocketSelectivity pocket


IC50 for 1B10 = 6.2 nM


IC50 for 1B10 = 60 nM


790-fold 85-fold

Trp220Tyr49

His111

3.0

Trp21

3.4

2.8

Trp80

Leu302

Phe116

Val301

Phe123

Pro124Lys125

Ala131Ile132

NADP+

49-fold

肺癌A549細胞の遊走能に及ぼす影響

24 h

0 h

DMSO KO102 KO112

0

20

40

60

80

100

120

- KO102 KO112

Rela

tive m

igra

tio

n(%

)

(*p < 0.05 without inhibitors)

* *

Inhibitor

【Wound-healing assay】イソプレニルアルデヒド

イソプレニルアルコール

AKR1B10↑↑

イソプレニルピロリン酸

Rasなどの低分子量Gタンパクの活性化

癌細胞の

遊走能亢進

MAPK活性化

MMP発現亢進

AKR1B10Vector

MMP9

MMP2

Measurement

of distance

Incubation

for 24 h

Incubation

with inhibitors

for 24 h

6 well plate

(90% confluent cells)10 μL tip

Morikawa et al., Chem Biol Interact, 2015


肺癌A549細胞の増殖能に及ぼす影響

(*p < 0.05 with A549 cells)

(#p < 0.05 with Vehicle in A549/1B10 cells)

0

5

10

15

20

25

30

35

0 48 96

Cells

(x 1

04)

Culture (h)

*

#

0

5

10

15

20

25

30

35

0 48 96

Culture (h)

Cells

(x 1

04)

A549/1B10 cells

10 μM KO102

20 μM KO102

A549 cells

VehicleA549/1B10 cells

10 μM KO112

20 μM KO112

A549 cells

Vehicle

AKR1B10

Cell counts

Incubation with inhibitors

for 48 or 96 h

48 well plate

(2× 104 cells)

*

#


マウス尾静脈肺転移モデルにおける転移能に及ぼす影響

Vehicle

KO102 (20 µM)

KO112 (20 µM)

5 mice/group

A549-Luc cells

24 hr ivImaging

4 days

(*p < 0.05 from Vehicle)


103 104

Radiance

(photon/sec/cm2/sr)

Luminescence

(x104, photon/sec)

0 2 4 6

KO102

KO112

Control

*

*KO102

KO112

Control

非小細胞肺癌のシスプラチン耐性


シスプラチン (CDDP)

• 単独での非小細胞肺癌の奏効率は約20%と高くないが、骨髄抑制の副作用が起こりにくいため、他の抗癌剤との併用で用いられる。

• 耐性獲得しやすい。

想定されているCDDP耐性機構

• 細胞内に移行した薬剤の排出機構を強化する (MDR1などのABCトランスポー

ター)

• 細胞内に入った薬物を無毒化する機構を増強する (チオレドキシン、グルタチオン-

S-トランスフェラーゼなどの抗酸化酵素)※AKR1B10などのAKR酵素もこれに該当

• 核酸の修復機構を強化する (DNAトポイソメラーゼ、RNA結合タンパク質YB-1など)

抗癌剤耐性細胞におけるAKR1B10発現亢進

Cell Anticancer Drug Reference

Colon cancer

HT29Oxaliplatin

Mitomycin C

Front. Pharmacol. 2012

Anticancer Drugs 2011

Breast cancer

MCF-7Doxorubicin

Doxorubicin/Idarubicin

BMC Cancer 2012

PLoS One 2017

Stomach

cancer MNK45Doxorubicin

Cisplatin

Chem. Biol. Interact. 2015

Chem. Biol. Interact. 2016

Lung cancer

A549Cisplatin Free Radic. Res. 2014

Prostate cancer

Du145Docetaxel Free Radic. Res. 2016


0

20

40

60

80

100

120 40 μM CDDP

A549 A549/CDDP

Inhibitor - - - 10 20 40 - 10 20 40

KO102 KO112

Via

bilit

y (

%)

**

*

*

(#p < 0.05 from A549 cells with 40 μM CDDP)

μM

CDDP耐性細胞におけるCDDP感受性の回復

(*p < 0.05 from A549/CDDP cells without inhibitors)

WST-1 assay

Incubation with 40 μM CDDP

and inhibitors for 24 h96 well plate

(2× 104 cells)


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 48 96

A549

A549/CDDP

0

50

100

150

200

250

300

Via

ble

cells

(x10

4)

Culture (h)

Via

ble

cells

(%)

Inhibitor - - 10 20 10 20

KO102 KO112


μM

A549 A549/CDDP

* *

低濃度CDDP暴露時の細胞増殖に及ぼす影響

Cell counts

Incubation with 0.5 μM CDDP

and inhibitors for 48 or 96 h48 well plate

(2× 104 cells)


Metastatic potential

Invasive potential

Inhibitor - 10 20 10 20

KO102 KO112

μM


Meta

stati

c an

d in

vasi

ve

po

ten

tial (%

)

シスプラチン耐性A549細胞の転移能、浸潤能に及ぼす影響

Polycarbonatemembrane(8-μm pore)

A549/CDDP cells(1 x 104 cells)

Type I

collagen

Polycarbonatemembrane(8-μm pore)

A549/CDDP cells(1 x 104 cells)

【Boyden Chamber assay】

Invasive potential

Metastatic potential


0

20

40

60

80

100

120

****

***

AKR1B10が関与する抗癌剤耐性化機序


・癌細胞の生存・抗癌剤耐性能の亢進

酸化ストレス

抗癌剤暴露

AKR

1B10

毒性化合物(反応性アルデヒド)

アポトーシス

akr1b10

癌細胞におけるAKR1B10の高発現は『癌の生存戦略』だと考えられる。

AKR1B10阻害剤の想定される用途


• AKR1B10が高発現する癌に対する抗癌剤

• 既存薬との併用によって、作用増強および耐性化抑制効果を示すアジュバンド薬

• 既存薬に対して抵抗性を獲得した癌細胞に対する抗癌剤耐性克服薬

• 研究試薬としてのAKR1B10特異的阻害剤フナコシ株式会社と販売契約締結（用途：研究試薬）

Conclusion

これまでに見出したAKR1B10阻害剤の構造をもとに、現時点で最も強力で、かつ選択性も向上した新規AKR1B10阻害剤KO102とKO112の創製に成功した。

新規AKR1B10阻害剤は肺癌A549細胞の遊走能や増殖能を抑制し、ラット尾静脈肺転移モデルにおいても転移抑制効果を示した。

新規AKR1B10阻害剤はシスプラチン耐性肺癌A549細胞のシスプラチン感受性を回復させ、耐性化に伴って亢進した転移能や浸潤能を有意に抑制した。

⇒新規AKR1B10阻害剤は肺癌細胞増殖抑制効果に加えて、抗癌剤耐性抑制効果を併せ持つ新しいタイプの抗癌剤になると期待される。


本技術に関する知的財産権


• 発明の名称：２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－

カルボン酸アミド誘導体

• 出願番号：特願2016-159316

• 出願人：国立大学法人富山大学, 岐阜市

• 発明者：遠藤智史, 豊岡尚樹, 早川芳弘,

松永俊之, 五十里彰

お問い合わせ先


岐阜薬科大学

◎生命薬学大講座生化学研究室遠藤智史

TEL 058-230-8100 (内線3669)

FAX 058-230-8105

e-mail sendo＠gifu-pu.ac.jp

◎事務局庶務会計課近藤直樹

TEL 058-230-8100

FAX 058-230-8200

e-mail syomuk＠gifu-pu.ac.jp

Documents

AKR1B10阻害剤の創製 - JST...2.9 3.4 Trp112 Trp21 Val301 His111 2.9 3.0 3.1 Gln303 Tyr49 Trp220 NADP+ 2.9 2.9 Trp21 Val48 Gln50 Selectivity pocket Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical