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MINISTERIO DE AGRICULTURA Instituto de Investigaciones Agropecuarias
Centro Regional Intihuasi
MICROPROPAGACIÓN DE ALCACHOFAS SIN ESPINAS
(Cynara scolymus L.)
ESTACIÓN EXPERIMENTAL DEL INIA, DONOSO – HUARAL
LIMA PERÚ Autores: Claudia Vásquez Romero Técnico Agrícola Víctor Alfaro Espinoza Ing. Ejec. Agrícola
La Serena, septiembre 7 del 2009.
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INDICE
INTRODUCCIÓN…………………....................................................................1 OBJETIVOS…………………………………………………………………………1 MICROPROPAGACIÓN EN ALCACHOFAS………………………………….2 ETAPAS EN LA PROPAGACIÓN DE PLANTAS DE ALCACHOFA………..3 DESINFECCIÓN DE EXPLANTES……………………………………………….5 MEDI O DE CULTIVO………………………………………………………………5 FASE DE INICIO…………………………………………………………………….7 FASE DE MULTIPLICACIÓN…………………………………………………….10 FASE DE ENRAIZAMIENTO Y ACLIMATACIÓN…………..…………………11 OTRAS ACTIVIDADES REALIZADAS………………………………………….13 CONTACTOS REALIZADOS……………………………………………………..14
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INTRODUCCIÓN El proyecto “Aumento del potencial productivo y comercial de la agroindustria de
alcachofa mediante mejoramiento genético y optimización de factores claves en la
cadena de producción”, financiado por INNOVA CORFO, que está siendo ejecutado
por INIA, CRI Intihuasi, tiene como objetivo principal la selección y multiplicación
masiva de uno o más clones mejorados de alcachofa tipo Argentina de alto
rendimiento agroindustrial. Estos materiales seleccionados de diferentes sectores de la
región de Coquimbo, por su productividad y uniformidad, deben ser masificados a un
número tal, que permitan hacer pruebas de su comportamiento en terreno, para una
superficie media hectárea, lo que significa un número de plantas superior a 5.000.
La técnica de micropropagación permite contar con ese número de plantas de
similares características, lo que sería imposible a través del método de propagación
tradicional, otra gran ventaja que presenta este método de multiplicación es que el
material propagado se encuentra libre de patógenos.
Para realizar esta labor, el proyecto contempla la capacitación en esta técnica, a los
Investigadores y Ayudantes de Investigación que participan en la ejecución del
proyecto.
Entre los días 10 y 21 de agosto del año en curso se realizó el curso taller de
Micropropagación de Alcachofas sin Espinas (Cynara scolymus L.) en el Laboratorio
de Biotecnología de la Estación Experimental Agraria Donoso-Huaral del Instituto
Nacional de Innovación Agraria de Perú por el Programa Nacional de Investigación en
Hortalizas.
OBJETIVOS
1. Producción de Material vegetal de alcachofa con adecuadas garantías en
aspecto de identidad genética y condiciones fitosanitarias
2. Generar las condiciones para posible incorporación de paquetes tecnológicos
en el manejo de material propagado in vitro.
3. Generar las condiciones para que el INIA o las empresas agroindustriales
puedan abastecer con plantas sanas a los agricultores que entreguen su
producción a la industria procesadora de alcachofines o fondo de alcachofa.
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MICROPROPAGACIÓN EN ALCACHOFA
La alcachofa en la mayoría de los países donde se cultiva, se propaga casi
exclusivamente en forma vegetativa. El material de propagación se obtiene
directamente de plantas adultas en el mismo campo, con lo que se corre el riesgo de
propagación de plantas deficientes sanitariamente. Esto ha despertado el interés de
los investigadores en desarrollar técnicas de propagación in vitro para esta especie.
Sin embargo, para el caso de alcachofas precoces, como es el caso de Blanca de
Tudela y, por añadidura de la alcachofa tipo “Argentina”, la micropropagación no se ha
desarrollado como herramienta por una pérdida de precocidad de los materiales
propagados y por una tasa muy baja de multiplicación. A pesar de ello, la propagación
in vitro, se convierte en la única alternativa para propagar masiva y rápidamente
clones elite de alcachofa dentro de un programa de mejoramiento.
Alta concentración de hormonas en los medios de cultivo, y el uso de antioxidantes
han permitido el desarrollo de protocolos de propagación in vitro de alcachofa.
ETAPAS EN LA PROPAGACIÓN DE PLANTAS DE ALCACHOFA
1.- Selección y acondicionamiento de explantes El material vegetal a utilizar provendrá de plantas madres con hijuelos idealmente
juveniles (4 semanas) y entre 25 a 30 centímetros de longitud promedio, los cuales
deben ser colectados el mismo día que se van a preparar, ya que se ha visto
disminuciones en el porcentaje de prendimiento cuando se colectan el día anterior a la
siembra. El procedimiento resumido es el siguiente:
A.- Colecta de hijuelos desde terreno: estos son seleccionados en el campo,
descartando todo el material vegetal que presente daño visible causado por hongos,
bacterias o daño mecánico, ya que un hijuelo enfermo va a producir una gran cantidad
de explantes contaminados.
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Selección de plantas con buena cantidad y
tamaño de hijuelos.
Planta con daño causado por agentes
patógenos, no apta para propagación.
B.- Preparación del hijuelo en el campo: Los hijuelos seleccionados son preparados al
igual que para plantación, se eliminan las hojas exteriores, tierra o barro que puedan
contener en sus raíces o tallos, y el follaje es cortado a un largo aproximado de 30 cm
de longitud.
Hijuelos deshojados y cortados a 30 cm
aproximadamente.
Extracción de tierra y barro en el campo
C.- Lavado del material vegetativo: los hijuelos son llevados a laboratorio, donde son
lavados con agua potable y chorro continuo, para eliminar toda impureza orgánica o
mineral que puedan traer desde el campo.
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Lavado de hijuelos en laboratorio. Lavado de hijuelos en laboratorio.
D.- Preparación de explantes: Una vez listo el material colectado, se comienza a
deshojar hasta llegar a un tamaño de 2 a 5 cm de longitud, la base de las yemas es
cortada con cuchillo dándole una forma cuadrangular con la finalidad de facilitar la
manipulación.
Explantes deshojados. Preparación de las bases de las yemas.
Yema preparada para trabajar en cámara. Yema e instrumental necesario.
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2.- Desinfección de explantes
Todo el proceso de desinfección y manejo de las yemas se realiza con las mejores
condiciones de asepsia y materiales completamente esterilizados, para evitar
contaminación del medio de cultivo y/o muerte del meristema:
Una vez realizado el triple enjuague con agua destilada, son llevadas a la
cámara de flujo laminar para su preparación.,
Luego en la cámara de flujo las yemas se sumergen en alcohol al 70%
por 1 minuto, agitando constantemente ya que este elimina las burbujas de
aire y permite una mejor penetración del desinfectante.
La desinfección se realiza con hipoclorito de sodio al 2% por 12 minutos
agitando de vez en cuando, posteriormente se enjuaga tres veces con
agua destilada esterilizada.
Para evitar la fenolización de los tejidos, se prepara una solución de ácido
ascórbico (100 mg. en 250 cc. de agua destilada) el que es esterilizado con
filtro de 0,22 µm de porosidad, luego las yemas son introducidas en la
solución antioxidante y se mantienen en ella hasta el momento de la
disección del meristema.
Traslado de yemas a la
cámara de flujo laminar.
Desinfección de yemas con
hipoclorito de sodio.
Filtro para esterilizar
solución antioxidante.
3.- Medio de cultivo Se utiliza el medio MS (Murashige y Skoog), el cual además de las sales orgánicas e
inorgánicas que se utilizan en la preparación, lleva azúcar blanca refinada al 3% o
sacarosa, ajustando el pH a 5.7, utilizando HCl 1.0 N o NaOH 1.0 N dependiendo si se
requiere bajar o subir, la solución resultante se calienta a fuego lento para disolver el
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agar – agar, que se agrega como solidificante. Finalmente se agregan los reguladores
de crecimiento, los cuales van a depender del medio de cultivo a preparar (fase inicio,
multiplicación, enraizante, etc.), posteriormente y antes que el medio se enfríe, es
dispensado a tubos o contenedores donde se realizaran las siembras o propagación.
Todos los materiales utilizados y que ingresen a la sala de siembra incluido el medio,
deben ser esterilizados en autoclave a 121° C y 1,2 k cm-2
de presión por 20 minutos.
Preparación del medio de cultivo.
Aplicar nutrientes al medio de cultivo. Preparación del medio de cultivo a fuego
lento.
Distribución del medio de cultivo en tubos
de ensayos para siembra.
Esterilización del medio de cultivo en
autoclave.
Preparación de los materiales a esterilizar en autoclave y que serán usados en cámara
de flujo laminar para siembra de meristemas.
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Empaque con papel y polipropileno de
placas petri.
Vasos precipitados.
Empaque de bisturís y pinzas. Materiales listas para ingresar a
esterilización.
4.- Fase de inicio
Como explante se usan yemas con 3 a 4 primordios foliares. La disección se realiza
bajo lupa estereoscópica en cámara de flujo laminar. La eliminación de los primordios
externos y los cortes inducen a la acumulación de fenoles en el explante que impiden
el desarrollo y reducen drásticamente el porcentaje de prendimiento, por lo que el
corte debe ser muy rápido. Inmediatamente debe sembrase en el medio de inicio que
corresponde a medio MS suplementado con ANA (Ácido Naftaleno Acético, 0,5 ppm) y
BAP (Bencil Amino Purin, 0,2 ppm). Los tubos sembrados deben ir inmediatamente a
oscuridad por 4 días y posteriormente aclimatar los explantes a la luz hasta llegar a los
3.000 lux. Cada 7 a 10 días se debe ir subcultivando con el mismo medio de cultivo
para evitar la oxidación. Esta fase dura aproximadamente 10 semanas y las
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condiciones de trabajo corresponden a temperaturas de 23° C y fotoperiodos de 16
horas luz.
Importante es tener los materiales e implementos a utilizar en cámara de flujo laminar
listos y a la mano, ya que una vez instalados el proceso de limpiesa de tejido y
siembra debe ser lo más rapido posible para evitar fenolización.
Preparación de material a usar en
cámara.
Preparación de material a usar en
cámara.
Preparación de tejidos meristematico en cámara de flujo laminar, el trabajo en esta
etapa debe ser rápido y cuidadoso y con optimas condiciones de asepsia.
Eliminación de primordios externos
Eliminación de primordios cercanos al
meristema.
Tamaño de meristema óptimo para siembra, con un par de primordios foliares.
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Meristema protegido por un par de
primordios.
Yema de buen tamaño para siembra.
Yema extraida antes de la siembra
Yema fenolizada, no apto para sembrar. Yema en condiciones para siembra.
Siembra en medio inicio
Tipo de tubo utilizado para siembra de
yema en medio de inicio.
Siembra de yema en tubo con medio de
cultivo.
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Inmediatamente sembrados los tubos tienen que ser pustos en oscuridad para evitar
que continue la fenolización del tejido meristematico, bajo la cámara de flujo se van
ubicando en un vaso presipitado oscurecido con papel roneo y tapa de palel aluminio,
posteriormete se dejan en cámara oscura por 4 días.
Baso precipitado, protegido internamente
con papel para oscurecer.
Caja de cartón negro para mantener en
oscuridad los tubos sembrados.
Microplantas después de 10 semanas en
medio de iniciación. Microplantas después de 10 semanas en
medio de iniciación.
5.- Fase de multiplicación Cuando las microplantas alcanzan el tamaño de 2 cm, se transfieren a un medio MS
suplementado con BAP (1 ppm). Luego de 6 semanas en promedio se obtienen de 3
a 8 brotes por microplanta, los pequeños se pueden sembrar en los mismos tubos con
medio de inicio para que se desarrollen. Los brotes más grandes se pasan
nuevamente a multiplicación en contenedores más grande, los ciclos de propagación
es conveniente que no superen los 8 o 9 ya que las plantas van perdiendo vigor.
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Las microplantas se extraen del medio, se limpian y se llevan a medios de
multiplicación.
Microplantas en medio de propagación,
listas para multiplicación.
División de brotes en la multiplicación.
Microplantas de mayor tamaño, pasan a
medio de multiplicación.
Microplantas más pequeñas, pasan a
medio de inicio, para continuar desarrollo.
6.- Fase de enraizamiento y aclimatación
Se debe promover la diferenciación de los tejidos para inducir la formación de raíces,
ya que algunas especies por sus características fisiológicas no pueden enraizar
directamente “in Vitro”, para ello se usa medio MS suplementado con ANA (1 ppm).
Luego de 4 semanas cuando se observa la formación de sistema radical, las plantas
se traspasan a un medio MS suplementado con IBA (1 ppm), para proliferación de
raices. Cuando las plantas alcanzan 2 cm de raíz pueden adaptarse a condiciones
ambientales externas, en un invernadero con temperatura controlada de 23° C. La
aclimatación ocurre aproximadamente en 6 semanas.
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Tamaño de planta optimo para llevar a
enraizamiento.
Siembra en medio de enraizamiento.
Una vez terminada la etapa de enraizamiento, las plantas son extraídas de sus
contenedores, se retiran los restos de agar con ayuda de pinzas y se lavan las raíces
en agua destilada, sujetando las plántulas delicadamente para no quebrarlas ya que
esta no son muy flexibles.
El sustrato utilizado puede ser arena de río lavada y esterilizada ó también se puede
usar sustrato comercial a base de musgo, que ya viene desinfectado, este proceso de
aclimatación toma alrededor de 5 semanas, por lo tanto el tiempo mínimo para obtener
plántulas a partir de microplantas in vitro es de 6 meses hasta 8 a 10 meses.
Invernadero utilizado para aclimatación de
plantas.
Invernadero utilizado para aclimatación
de plantas.