Alexander McLennan, Andy Bates,Phil Turner und Mike White

Molekularbiologie

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Alexander McLennan, Andy Bates, Phil Turner und Mike White

Molekularbiologie

für Biologen, Biochemiker, Pharmazeuten und Mediziner

Übersetzt von Bärbel Häcker

Titel der OriginalausgabeMolecular Biology, BIOS Instant Notes,Fourth Edition© 2013 by Garland Science, Taylor & FrancisGroup, LLCAll Rights Reserved. Authorised translation fromthe English language edition published byGarland, a member of the Taylor & Francis Group.

AutorenAlexander McLennanUniversity of LiverpoolInstitute of Integrative BiologyLiverpoolUnited Kingdom

Andy BatesUniversity of LiverpoolInstitute of Integrative BiologyLiverpoolUnited Kingdom

Phil TurnerUniversity of LiverpoolInstitute of Integrative BiologyLiverpoolUnited Kingdom

Mike WhiteUniversity of ManchesterFaculty of Life SciencesManchesterUnited Kingdom

Übersetzt vonDr. Bärbel HäckerFeuerbacher Straße 1471229 Leonberg

Cover© Depositphotos.com/Daniel Cole;Hintergrund: © Shutterstock

© Erhan Ergin / Fotolia.com für die inder Randspalte verwendeten Symbole

1. Auflage 2013

n Alle Bücher von Wiley-VCH werden sorgfältigerarbeitet. Dennoch übernehmen Autoren,Herausgeber und Verlag in keinem Fall, einschließ-lich des vorliegenden Werkes, für die Richtigkeit vonAngaben, Hinweisen und Ratschlägen sowie füreventuelle Druckfehler irgendeine Haftung

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© 2013 Wiley-VCH Verlag & Co. KGaA,Boschstr. 12, 69469 Weinheim, Germany

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Print ISBN: 978-3-527-33476-6ePDF ISBN: 978-3-527-67210-3ePub ISBN: 978-3-527-67209-7mobi ISBN: 978-3-527-67208-0

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Gedruckt auf säurefreiem Papier.

Inhaltsverzeichnis

Vorwort XV

Liste der Abkürzungen XVII

1 Informationsmakromoleküle 11.1 Informationsverarbeitung und Molekularbiologie 11.1.1 Das zentrale Dogma 11.1.2 Rekombinante DNA-Technologie 31.2 Nukleinsäurestruktur und -funktion 51.2.1 Basen 51.2.2 Nukleoside 51.2.3 Nukleotide 61.2.4 Phosphodiesterbindungen 61.2.5 DNA/RNA-Sequenz 71.2.6 DNA-Doppelhelix 71.2.7 A-, B- und Z-Helices 91.2.8 RNA-Sekundärstruktur 111.2.9 Modifizierte Nukleinsäuren 111.2.10 Nukleinsäurefunktion 111.3 Proteinstruktur und -funktion 141.3.1 Aminosäurestruktur 141.3.2 Proteingröße und -formen 161.3.3 Primärstruktur 161.3.4 Nichtkovalente Wechselwirkungen 171.3.5 Sekundärstruktur 181.3.6 Tertiärstruktur 191.3.7 Quartärstruktur 201.3.8 Prosthetische Gruppen 211.3.9 Domänen, Motive, Familien und Evolution 211.3.10 Proteinfunktion 23

V

2 Eigenschaften von Nukleinsäuren und eukaryotische Chromosomen-struktur 29

2.1 Chemische und physikalische Eigenschaften von Nukleinsäuren 292.1.1 Stabilität von Nukleinsäuren 292.1.2 Säureeffekt 302.1.3 Alkalieffekt 302.1.3.1 DNA 302.1.3.2 RNA 302.1.4 Chemische Denaturierung 322.1.5 Viskosität 322.1.6 Schwimmdichte 322.2 Spektroskopische und thermische Eigenschaften von

Nukleinsäuren 342.2.1 UV-Absorption 342.2.2 Extinktion und Struktur 342.2.3 Mengenbestimmung der Nukleinsäuren 352.2.4 Reinheit der DNA 352.2.5 Wärmedenaturierung 362.2.6 Hybridisierung 372.3 DNA-Superspiralisierung 382.3.1 Geschlossen-zirkuläre DNA 382.3.2 Superspiralisierung 382.3.3 Topoisomer 392.3.4 Helikale und superhelikale Windungszahl 392.3.5 Interkalatoren 402.3.6 Superspiralisierungsenergie 412.3.7 Topoisomerasen 412.4 Chromatinstruktur 442.4.1 Chromatin 442.4.2 Histone 442.4.3 Nukleosomen 452.4.4 Die Rolle von H1 462.4.5 Linker-DNA 472.4.6 Die 30 nm-Faser 482.4.7 Höher geordnete Struktur 482.5 Eukaryotische Chromosomenstruktur 502.5.1 Das Mitosechromosom 502.5.2 Das Centromer 512.5.3 Telomere 512.5.4 Interphasechromosomen 512.5.5 Heterochromatin 522.5.6 Euchromatin 522.5.7 DNase-I-Überempfindlichkeit 522.5.8 CpG-Methylierung 522.5.9 Histonvarianten und -modifikation 54

VI Inhaltsverzeichnis

3 DNA-Replikation 593.1 DNA-Replikation: eine Übersicht 593.1.1 Semikonservativer Mechanismus 593.1.2 Replikons, Ursprünge und Termini 613.1.3 Semidiskontinuierliche Replikation 623.1.4 RNA-Primer 633.2 Bakterielle DNA-Replikation 643.2.1 Experimentelle Systeme 643.2.2 Initiation 653.2.3 Strangentwindung 673.2.4 Elongation 673.2.5 Termination und Aufteilung 693.3 Eukaryotische DNA-Replikation 703.3.1 Experimentelle Systeme 703.3.2 Ursprünge und Initiation 703.3.3 Replikationsgabeln 713.3.4 Kernmatrix 723.3.5 Telomerreplikation 72

4 DNA-Schäden, -Reparatur und -Rekombination 774.1 DNA-Schäden 774.1.1 DNA-Defekte 774.1.2 Oxidative Schäden 784.1.3 Alkylierung 794.1.4 Sperrige Addukte 794.2 Mutagenese 814.2.1 Mutation 814.2.2 Replikationsgenauigkeit 824.2.3 Physikalische Mutagene 834.2.4 Chemische Mutagene 834.2.5 Direkte Mutagenese 834.2.6 Indirekte Mutagenese und Transläsions-DNA-Synthese 844.3 DNA-Reparatur 874.3.1 Photoreaktivierung 874.3.2 Alkyltransferase 874.3.3 Reparatur von Strangbrüchen 874.3.4 Exzisionsreparatur 884.3.5 Fehlpaarungsreparatur 904.3.6 Erbliche Reparaturdefekte 90

5 Transkription in Bakterien 955.1 Grundlagen der Transkription 955.1.1 Transkription: eine Übersicht 955.1.2 Initiation 955.1.3 Elongation 97

Inhaltsverzeichnis VII

5.1.4 Termination 975.2 Escherichia coli-RNA-Polymerase 995.2.1 RNA-Polymerase-Holoenzym von E. coli 995.2.2 a-Untereinheit 995.2.3 b-Untereinheit 995.2.4 b’-Untereinheit 1005.2.5 s-Faktor 1005.3 Der s70-Promotor von E. coli 1015.3.1 Promotorsequenzen 1015.3.2 Promotorgröße 1025.3.3 −10-Sequenz 1025.3.4 −35-Sequenz 1025.3.5 Promotoreffizienz 1035.4 Transkriptionsinitiation, -elongation und -termination 1045.4.1 Promotorbindung 1045.4.2 DNA-Entwindung 1055.4.3 Initiation der RNA-Kette 1055.4.4 Elongation der RNA-Kette 1055.4.5 Termination der RNA-Kette 1065.4.6 Rho-abhängige Termination 108

6 Regulation der Transkription in Bakterien 1136.1 Das lac-Operon 1136.1.1 Das Operon 1136.1.2 Das Lactose(lac)-Operon 1136.1.3 Der Lac-Repressor 1146.1.4 Induktion 1156.1.5 Katabolit-Aktivatorprotein 1166.2 Das trp-Operon 1176.2.1 Das Tryptophan(trp)-Operon 1176.2.2 Der Trp-Repressor 1186.2.3 Der Attenuator 1186.2.4 Struktur der RNA-Leitsequenz 1196.2.5 Das Leitpeptid 1196.2.6 Attenuation 1196.2.7 Die Bedeutung der Attenuation 121

7 Transkription in Eukaryoten und Regulation der eukaryotischenTranskription 125

7.1 Die drei RNA-Polymerasen: Charakterisierung und Funktion 1257.1.1 Eukaryotische RNA-Polymerasen 1257.1.2 RNA-Polymerase-Untereinheiten 1267.1.3 Aktivitäten eukaryotischer RNA-Polymerasen 1267.1.4 Die CTD der RNA-Pol II 126

VIII Inhaltsverzeichnis

7.2 RNA-Pol-I-Gene: die ribosomale Wiederholung 1287.2.1 Ribosomale RNA-Gene 1287.2.2 Die Rolle des Nukleolus 1287.2.3 RNA-Pol-I-Promotoren 1297.2.4 Upstream binding factor 1297.2.5 Selektivitätsfaktor 1 1297.2.6 TBP und TAFIs 1317.3 RNA-Pol-III-Gene: 5S- und tRNA-Transkription 1327.3.1 RNA-Polymerase III 1327.3.2 tRNA-Gene 1327.3.3 5S-rRNA-Gene 1337.3.4 Alternative RNA-Pol-III-Promotoren 1357.3.5 RNA-Pol-III-Termination 1357.4 RNA-Pol-II-Gene: Promotoren und Enhancer 1367.4.1 RNA-Polymerase II 1367.4.2 Promotoren 1377.4.3 Stromaufwärtige Regulationselemente (URE) 1377.4.4 Verstärkerelemente (Enhancer) 1387.5 Allgemeine Transkriptionsfaktoren und RNA-Pol-II-Initiation 1397.5.1 Basale RNA-Pol-II-Transkriptionsfaktoren 1397.5.2 TFIID 1397.5.3 TBP 1417.5.4 TFIIA 1417.5.5 TFIIB- und RNA-Polymerasebindung 1417.5.6 Nach der RNA-Polymerase bindende Faktoren 1417.5.7 CTD-Phosphorylierung durch TFIIH 1427.5.8 Der Initiatortranskriptionskomplex 1427.6 Eukaryotische Transkriptionsfaktoren 1437.6.1 Transkriptionsfaktordomänenstruktur 1437.6.2 DNA-Bindungsdomänen 1447.6.2.1 Die Helix-Kehre-Helix-Domäne 1447.6.2.2 Die Zinkfingerdomäne 1457.6.2.3 Die basische Domäne 1467.6.3 Dimerisierungsdomänen 1467.6.3.1 Leucin-Zipper 1467.6.3.2 Die Helix-Schleife-Helix-Domäne 1477.6.4 Transkriptionsaktivierungsdomänen 1477.6.4.1 Saure Aktivierungsdomänen 1477.6.4.2 Glutaminreiche Domänen 1477.6.4.3 Prolinreiche Domänen 1477.6.5 Repressordomänen 1487.6.6 Ziele von Transkriptionsregulatoren 1487.6.7 Chromatinmodifikation 149

Inhaltsverzeichnis IX

8 Der genetische Code und tRNA 1558.1 Der genetische Code 1558.1.1 Grundlagen 1558.1.2 Entschlüsselung 1568.1.3 Degeneriertheit, Universalität und Doppeldeutigkeit 1568.1.4 Mutationswirkung 1588.1.5 Offene Leseraster (ORFs) 1598.1.6 Überlappende Gene 1598.2 tRNA-Struktur und -funktion 1618.2.1 tRNA-Primärstruktur 1618.2.2 tRNA-Sekundärstruktur 1618.2.3 tRNA-Tertiärstruktur 1638.2.4 tRNA-Funktion 1638.2.5 Aminoacylierung der tRNAs 1648.2.6 Aminoacyl-tRNA-Synthetasen 1648.2.7 Korrekturlesen 166

9 Proteinsynthese 1699.1 Aspekte der Proteinsynthese 1699.1.1 Codon-Anticodon-Wechselwirkung 1699.1.2 Wobble 1699.1.3 Ribosomenbindungsstelle 1719.1.4 Initiator-tRNA 1719.1.5 Polysomen 1719.2 Proteinsynthesemechanismus 1739.2.1 Übersicht 1739.2.2 Initiation 1749.2.3 Elongation 1789.2.4 Termination 1799.3 Initiation in Eukaryoten 1819.3.1 Übersicht 1819.3.2 Abtasten 1829.3.3 Initiation 1829.3.4 Elongation 1849.3.5 Termination 1859.4 Translationskontrolle und posttranslationale Ereignisse 1869.4.1 Translationskontrolle in Bakterien 1869.4.2 Translationskontrolle in Eukaryoten 1879.4.3 Polyproteine 1899.4.4 Protein-Targeting 1899.4.5 Proteinfaltung und -modifikation 1919.4.6 Proteinabbau 192

X Inhaltsverzeichnis

10 Genmanipulation 19710.1 DNA-Klonierung: eine Übersicht 19710.1.1 DNA-Klonierung 19710.1.2 Wirte und Vektoren 19810.1.3 Subklonierung 19910.1.4 DNA-Bibliotheken 20010.1.5 Durchsuchen von Bibliotheken 20010.1.6 Analyse eines Klons 20110.2 Präparation von DNA-Plasmiden 20310.2.1 Plasmide als Vektoren 20310.2.2 Plasmid-Minipräparation 20310.2.3 Alkalische Lyse 20310.2.4 Plasmidreinigung 20510.2.5 Ethanolfällung 20510.2.6 Cäsiumchlorid-Gradient 20510.3 Restriktionsenzyme und Elektrophorese 20710.3.1 Restriktionsendonukleasen 20710.3.2 Erkennungssequenzen 20710.3.3 Kohäsive Enden 20810.3.4 Restriktionsverdau 20910.3.5 Agarose-Gelelektrophorese 21010.3.6 Isolierung der Fragmente 21210.4 Ligation, Transformation und Analyse von Rekombinanten 21310.4.1 DNA-Ligation 21310.4.2 Rekombinante DNA-Moleküle 21410.4.3 Alkalische Phosphatase 21510.4.4 Transformation 21610.4.5 Selektion 21710.4.6 Transformationseffizienz 21710.4.7 Überprüfung auf Transformanten 21710.4.8 Wachstum und Aufbewahrung der Transformanten 21810.4.9 Gelanalyse 21810.4.10 Fragmentausrichtung 21810.4.11 Neue Subklonierungsmethoden 219

11 Klonierungsvektoren 22311.1 Plasmidvektor-Design 22311.1.1 Ligationsprodukte 22311.1.2 Blau-weiß-Screening 22311.1.3 Mehrfachklonierungsstellen 22411.1.4 Transkription klonierter eingefügter Abschnitte 22511.1.5 Expressionsvektoren 22511.1.6 Gateway® – Subklonierung durch Rekombination 22611.2 Bakteriophagen, Cosmide, YACs und BACs 22911.2.1 Bakteriophage l 229

Inhaltsverzeichnis XI

11.2.2 l-Ersatzvektoren 23011.2.3 Verpackung und Infektion 23111.2.4 Plaquebildung 23211.2.5 l-Lysogene 23211.2.6 M13-Phage-Vektoren 23311.2.7 Klonierung großer DNA-Fragmente 23311.2.8 Cosmidvektoren 23411.2.9 YAC-Vektoren 23411.2.10 Selektion in Hefe 23611.2.11 BAC-Vektoren 23711.3 Eukaryotische Vektoren 23911.3.1 Klonierung in Eukaryoten 23911.3.2 Transfektion eukaryotischer Zellen 23911.3.3 Pendelvektoren 24011.3.4 Episomale Hefeplasmide 24011.3.5 Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens 24111.3.6 Virale Transduktion 24211.3.7 Baculoviren 243

12 Analyse und Verwendung klonierter DNA 24712.1 Charakterisierung von Klonen 24712.1.1 Charakterisierung 24712.1.2 Restriktionskartierung 24812.1.3 Markierung von Nukleinsäuren 24912.1.4 Southern und Northern Blot 25012.2 Nukleinsäuresequenzierung 25212.2.1 DNA-Sequenzierung nach Sanger 25212.2.2 Schrotschusssequenzierung 25412.2.3 Emulsion-PCR 25512.2.4 Reversible Fluoreszenz-Abbruchsequenzierung 25512.2.5 Pyrosequenzierung 25612.2.6 Sequenzierung durch Ligation und andere Methoden 25712.2.7 RNA-Sequenzierung 25712.3 Polymerase-Kettenreaktion 25912.3.1 PCR 25912.3.2 Der PCR-Zyklus 25912.3.3 Matrize und Primer 26112.3.4 Enzyme 26212.3.5 PCR-Optimierung 26312.3.6 RT-PCR und RACE 26312.3.7 Echtzeit- und quantitative PCR 26412.4 Analyse klonierter Gene 26612.4.1 Sequenzorganisation 26612.4.2 S1-Nuklease-Kartierung 26712.4.3 Primer-Verlängerung 268

XII Inhaltsverzeichnis

12.4.4 Gelverzögerung 26812.4.5 DNase-I-Fußabdruck 26912.4.6 Reportergene 26912.5 Mutagenese klonierter Gene 27112.5.1 Mutagenesearten 27112.5.2 Ortsgerichtete Mutagenese 27112.5.3 Insertions-/Deletionsmutagenese 27212.5.4 Zufallsmutagenese durch PCR 273

13 Funktionelle Genomik und die neuen Technologien 27713.1 Einführung in die ’Omik-Wissenschaften 27713.1.1 Genomik 27713.1.2 Transkriptomik 27813.1.3 Proteomik 27913.1.4 Metabolomik 28013.1.5 Andere ’Omik-Wissenschaften 28013.2 Allgemeine Genexpressionsanalyse 28213.2.1 Genomweite Analyse 28213.2.2 DNA-Mikroarrays 28313.2.3 Chromatinimmunpräzipitation 28513.2.4 Gen-Knockouts 28613.2.5 RNA-Knockdown 28813.3 Proteomik 29013.3.1 Proteomik 29013.3.2 Protein-Protein-Wechselwirkungen 29213.3.3 Zwei-Hybrid-Analyse 29313.3.4 Protein-Arrays 29513.4 Zelluläre und molekulare Bildgebung 29613.4.1 Zelluläre Bildgebung 29613.4.2 Bildgebung biologischer Moleküle in fixierten Zellen 29613.4.3 Detektion von Molekülen in lebenden Zellen und Geweben 29813.4.4 Fluoreszierende Proteine und Reportergene 29913.5 Transgene und Stammzelltechnologie 30113.5.1 Genetisch veränderte und transgene Organismen 30113.5.2 Stammzellen 30213.5.3 Induzierte pluripotente Stammzellen 30313.5.4 Gen- und Zelltherapie 30413.6 Bioinformatik 30613.6.1 Definition und Anwendungsbereich 30613.6.2 Anwendungen der Bioinformatik 30713.6.3 Suche nach Sequenzähnlichkeiten 30913.6.4 Mehrfachsequenzvergleich 31213.6.5 Phylogenetische Bäume 31313.6.6 Strukturelle Bioinformatik 31413.7 System- und synthetische Biologie 318

Inhaltsverzeichnis XIII

13.7.1 Systembiologie 31813.7.2 Netzwerkbiologie 31913.7.3 Netzwerkmotive 31913.7.4 Quantitative Biologie 32013.7.5 Quantitative mathematische Modelle 32113.7.6 Integration über biologische Größenordnungen hinweg 32113.7.7 Synthetische Biologie 322

Richtig gelöst ... 327

Mehr zum Thema 331

Stichwortverzeichnis 337

XIV Inhaltsverzeichnis

Vorwort

Es gibt nur wenige wissenschaftliche Disziplinen, die sich in den Jahren seit derletzten Auflage so rasch entwickelt haben wie die Molekularbiologie. UnsereHoffnung, dass die Verbesserungen der letzten Auflage künftige Änderungeneinfacher machen würden, war somit ziemlich naiv. Unsere Bearbeitung undAktualisierung der 4. Auflage waren umfassend und betrafen alle Kapitel undThemen, so groß war die Geschwindigkeit des Fortschritts. Die ersten beidenKapitel der 3. Auflage wurden kombiniert und vereinfacht, um Überlappungen mitanderen Titeln aus der Reihe Instant Notes zu verringern; andere Kapitel wurdenneu geordnet und logischer umstrukturiert. Dies schuf Raum für die Betrachtungvon Fortschritten bei Themen wie der Next-Generation-DNA-Sequenzierung undGenomik, der allgemeinen Genexpressionsanalyse, regulatorischer RNAs, Prote-omik, Stammzellen, Systembiologie und vielen anderen Feldern. Eine Schwierig-keit bestand in der Beurteilung, was weggelassen werden konnte, um neuen Stoffunterzubringen. Wenn das Wissen sich erweitert, die Technik Fortschritte machtund die alten Methoden in „Ungnade fallen“, ist es eine Herausforderung, denLeser mit neuen Entdeckungen und mit der Leistungsfähigkeit neuer Methodenzu fesseln, jedoch gleichzeitig eine ausreichende Menge des traditionellen Hinter-grundwissens beizubehalten, damit ein Thema vollständig verstanden werdenkann. Wir sind uns dessen voll bewusst, dass es sich hier um ein einführendesLehrbuch handelt, und haben deshalb versucht, unnötige Komplexität und Detailszu vermeiden. Wir hoffen, dass uns dies gelungen ist. Wie immer sind wir auchdiesmal den vielen Lesern, die Verbesserungsvorschläge gegenüber der Vorauflagegemacht haben, sehr dankbar. Besonderen Dank schulden wir Liz Owen und VickiNoyes für ihre Geduld und ihr Verständnis während der Überarbeitung.

Alexander McLennan

Andy Bates

Phil Turner

Mike White

XV

Molekularbiologie für Biologen, Biochemiker, Pharmazeuten und Mediziner, 1. Auflage. A. McLennan, A. Bates, P. Turner undM. White © 2013 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Boschstr. 12, 69469 Weinheim, Germany

Liste der Abkürzungen

Wichtig zu wissenIn der Molekularbiologie und Genetik gibt es eine Reihe wichtiger Abkürzun-gen, die die Verständigung vereinfachen. Hier sind die in diesem Buchverwendeten Abkürzungen aufgeführt.

Kurz erklärt

ADP Adenosin-5’-diphosphatAIDS erworbenes Immunschwächesyndrom (aquired immunodeficiency syn-

drome)AMP Adenosin-5’-monophosphatAP apurinisch oder apyrimidinischARS autonom replizierende SequenzATP Adenosin-5’-triphosphatBAC künstliches Bakterienchromosom, bacterial artif icial chromosomeBER BasenexzisionsreparaturbHLH basische HLHBLAST Basic Local Alignment SearchBp BasenpaareBRF TFIIB-verwandter FaktorBSE bovine spongiforme Enzephalopathie (Rinderwahnsinn)BUdR BromdesoxyuridinbZIP basischer Leucin-ZippercAMP cyclisches AdenosinmonophosphatcDNA komplementäre DNACFTR cystic fibrosis transmembran conductance regulatorCHEF contour clamped homogenous electric field, konturgespanntes elektri-

sches FeldChIP ChromatinimmunpräzipitationCJK Creutzfeld-Jakob-KrankheitCMP Cytidin-5’-monophosphatCTD carboxyterminale Domäne

XVII

Da DaltondATP Desoxyadenosin-5’-triphosphatdCTP Desoxycytidin-5’-triphosphatddNTP Didesoxynukleotid-5’-triphosphatdGDP Desoxyguanosin-5’-diphosphatdGTP Desoxyguanosin-5’-triphosphatDNA DesoxyribonukleinsäureDNase I Desoxyribonukease IdNTP Desoxynukleosid-5’-triphosphatDOP-PCR PCR, die degenerierte Oligonukleotid-Primer verwendetDSB DoppelstrangbruchdsDNA doppelsträngige DNAdsRNA doppelsträngige RNAdTTP Desoxythymidin-5’-triphosphatEDTA EthylendiamintetraessigsäureEF ElongationsfaktoreIF eukaryotischer InitiationsfaktorER endoplasmatisches RetikulumeRF eukaryotischer FreisetzungsfaktorES embryonale StammzelleESI ElektrosprayionisationEST exprimierte SequenzmarkierungEtBr EthidiumbromidFADH FlavinadenindinukleotidFASTA Fast-AllFIGE FeldinversionsgelelektrophoreseFISH Fluoreszenz-in-situ-HybridisierungGFP grün fluoreszierendes ProteinGST Glutathion-S-TransferaseGTP Guanosin-5’-triphosphatGVO gentechnisch veränderter OrganismusHAT HistonacetyltransferaseHDAC HistondeacetylaseHDL Lipoprotein hoher DichteHIV menschliches ImmunschwächevirusHLH Helix-Schleife-HelixhnRNA heterogene nukleäre RNAhnRNP heterogenes nukleäres RibonukleoproteinHR homologe RekombinationHSP HitzeschockproteinHSVTK Herpes-simplex-Virus-Thymidin-KinaseICC ImmuncytochemieIF InitiationsfaktorIgG Immunglobulin G

XVIII Liste der Abkürzungen

IHC ImmunhistochemieInt IntegraseIP ImmunpräzipitationiPS induzierte pluripotente StammzelleIPTG Isopropyl-b-d-thiogalactopyranosidIRE iron response element, Eisen-Response-ElementIRES interne RibosomeneintrittsstelleIS InsertionssequenzISH in situ-HybridisierungISP iron sensing protein, Eisen erfassendes ProteinKAP Katabolit-Aktivatorproteinkb Kilobasenpaare in doppelsträngiger Nukleinsäure, Kilobasen in ein-

zelsträngiger NukleinsäurekDA Kilo-DaltonlncRNA lange nicht codierende RNALTR long terminal repeat, lange terminale WiederholungLUCA last universal common ancestor, letzter gemeinsamer VorfahreMALDI matrix assisted laser desorption/ionizationMBP Maltose bindendes ProteinMCS multiple KlonierungsstelleMDa Mega-DaltonMet-tRNA Methionyl-tRNAMFC MultifaktorkomplexmiRNA mikroRNAMMS MethylmethansulfonatmRNA messenger RNA, Boten-RNAMS MassenspektrometrieNAD+ NikotinamidadenindinukleotidncRNA nicht codierende RNANER Nukleotid-ExzisionsreparaturNHEJ nonhomologous end joining, nichthomologe RekombinationNMD nonsense mediated decay, Mechanismus zum Abbau mutierter RNANMN NikotinamidmononukleotidNMR KernmagnetresonanzNt NukleotideNTP Nukleosid-5’-triphosphatNTPase NukleotidtriphosphataseOE-PCR overlap extension PCR, Überhang-Extension-PCROMIM® Online Mendelian Inheritance in Man-DatenbankORC origin recognition complex, UrsprungerkennungskomplexORF open reading frame, offenes LeserasterPABI Poly(A)-Bindeprotein IPABII Poly(A)-Bindeprotein IIpADPR Poly(ADP-Ribose)

Liste der Abkürzungen XIX

PAGE Polyacrylamid-GelelektrophoresePARPI Poly(ADP-Ribose)Polymerase IPCNA ProliferationszellkernantigenPCR Polymerase-KettenreaktionPDB ProteindatenbankPDGF platelet-derived growth factor, von Thrombocyten freigesetzter Wachs-

tumsfaktorPFGE PulsfeldgelelektrophoresepiRNA piwi-assoziierte RNAPPi Pyrophosphatprä-mRNA mRNA-Vorläuferpri-mRNA primäre miRNAqPCR quantitative PCRRACE rasche Amplifizierung (Vervielfältigung) von cDNARBI Retinoblastom-GenRBS RibosomenbindungsstelleRF release factor, FreisetzungsfaktorRFLP RestriktionsfragmentlängenpolymorphismusRFP rot fluoreszierendes ProteinRISC RNA-induzierter StilllegungskomplexRITS RNA-induzierte TranskriptionsstilllegungRNA RibonukleinsäureRNAi RNA-InterferenzRNA-Pol I RNA-Polymerase IRNA-Pol II RNA-Polymerase IIRNA-Pol III RNA-Polymerase IIIRNaseA Ribonuklease ARNP RibonukleoproteinROS reaktive SauerstoffspeziesRRF Ribosomen-Recycling-FaktorrRNA ribosomale RNARt Reverse TranskriptaseRT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-KettenreaktionSCID schwere kombinierte ImmunschwächeSCNT somatischer ZellkerntransferSDA-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-GelelektrophoreseSDS NatriumdodecylsulfatSECIS Selenocystein-InsertionssequenzSILAC stable isotop labeling with amino acids in culture, Markierung von

Aminosäuren in Zellkultur mit stabilen IsotopenSINEs short interspersed elements, kurze eingestreute ElementesiRNA kurze interferierende RNASL1 Selektionsfaktor 1

XX Liste der Abkürzungen

snoRNP small nucleolar ribonucleoprotein particle, kleines nukleoläres Ribo-nukleoproteinpartikel

SSB EinzelstrangbruchSsb einzelsträngiges BindeproteinssDNA einzelsträngige DNASV40 Simian(Affen)-Virus 40TAF TBP-assoziierter FaktorTAFI TAFs für RNA-Pol I-TranskriptionTBP TATA-BindeproteinTdT Terminale Desoxynukleotidyl-TransferaseTLS Transläsions-DNA-SyntheseTm SchmelztemperaturtmRNA transfer-messenger-RNATris Tris(hydroxymethyl)aminomethantRNA Transfer-RNAUBF upstream binding factor, stromaufwärtiger BindungsfaktorUCE upstream control element, stromaufwärtiges KontrollelementURE upstream regulatory element, stromaufwärtiges RegulationselementUTP Uridin-5’-triphosphatUTR nicht translatierte RegionUV ultraviolettXist X-inaktives spezifisches TranskriptXP Xeroderma pigmentosumXP-V Xeroderma pigmentosum-VarianteYAC yeast artif icial chromosome, künstliches HefechromosomYep yeast episomal plasmid, episomales HefeplasmidY-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-b-d-galacto-pyranosid

Liste der Abkürzungen XXI

Informationsmakromoleküle 1In diesem Kapitel …… geht es um diese Themen:• Informationsverarbeitung und Molekularbiologie• Nukleinsäurestruktur und -funktion• Proteinstruktur und -funktion

1.1 Informationsverarbeitung und Molekularbiologie

1.1.1 Das zentrale Dogma

Die Molekularbiologie befasst sich mit den molekularen Wechselwirkungen, dieden biologischen Funktionen zugrunde liegen. Sie überschneidet sich beträchtlichmit der Biochemie und der Genetik, und sie scheint sich hauptsächlich mit denstrukturellen Grundlagen und der Kontrolle der Informationsverarbeitung in derZelle zu beschäftigen sowie mit den für deren Untersuchung erforderlichenTechnologien. Durch die Pionierarbeiten von Avery, MacLeod und McCarty sowievon Hershey und Chase in den 1940er- und 1950er-Jahren wurde klar bewiesen,dass die genetischen Anweisungen zur Erschaffung einer Zelle im Zellkern sitzen,innerhalb einer linearen Sequenz von Basen; diese wiederum sind Bestandteil derStruktur eines langen chemischen Polymers, der Desoxyribonukleinsäure (DNA).Im Jahre 1953 schlugen dann Crick und Watson die berühmte Doppelhelixstrukturder DNA vor, die genau darlegte, wie diese Information gespeichert und an nach-folgende Generationen weitergegeben wird. Um zu erklären, wie Zellen die imDNA-Genom verschlüsselten Anweisungen verwenden, postulierte Crick, dass derFluss der genetischen Information in nur eine Richtung verläuft: von der DNAüber eine zwischengeschaltete Nukleinsäure, die Ribonukleinsäure (RNA), zumProtein – d. h. „DNA macht RNA macht Protein“. Diese Aussage wurde zumzentralen Dogma der Molekularbiologie, ohne dass die einzelnen Schritte großbewiesen wurden. Wir wissen heute, dass diese Aussage des zentralen Dogmasweitgehend korrekt ist, auch wenn das ursprüngliche Schema inzwischen mehr-mals modifiziert worden ist. Abb. 1.1 zeigt ein Diagramm dieses Informations-flusses. Der Hauptweg führt von der DNA über die RNA zum Protein, und man

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Molekularbiologie für Biologen, Biochemiker, Pharmazeuten und Mediziner, 1. Auflage. A. McLennan, A. Bates, P. Turner undM. White © 2013 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Boschstr. 12, 69469 Weinheim, Germany

weiß heute, dass dies auch für die DNA in den kleinen unabhängigen Genomender Mitochondrien und Chloroplasten gilt. In allen Zellen wird die DNA konzep-tionell (aber nicht physikalisch) in diskrete codierende Einheiten (Gene) eingeteilt,die die Information für die einzelnen Proteine enthalten. Diese DNA wird tran-skribiert (Kap. 5 und 7), sodass RNA-Moleküle entstehen (Boten- oder messenger-RNA, mRNA), die die gleiche Sequenzinformation wie die DNA enthalten; siekönnen als Arbeitskopien der Gene angesehen werden, die in der Haupt-DNA-Blaupause vorhanden sind. Diese mRNAs werden dann entsprechend dem gene-tischen Code (Abschnitt 8.1) in Aminosäuresequenzen von Proteinen translatiert(übersetzt) (Kap. 9). Die Kombination all dieser Prozesse, die erforderlich sind, umdie Information der DNA zu entschlüsseln und ein funktionsfähiges Molekül zuerzeugen, heißt Genexpression. Wir können auch die DNA-Replikation (Kap. 3) inAbb. 1.1 mit einschließen, bei der durch Verdoppelung der Information in derAusgangs-DNA zwei Tochter-DNA-Moleküle gebildet werden; dies hat den Infor-mationsfluss und die Bewahrung der Information von einer Generation zur nächs-ten zur Folge.Man hat jedoch einige Ausnahmen von diesem Grundschema identifiziert. Viele

RNA-Moleküle werden nicht in ein Protein translatiert, sondern funktioniereneigenständig als RNAs (Abschnitt 9.4). Ihre Gene werden als RNA-Gene bezeich-net. Eine Reihe von Virusklassen besitzt keine DNA, sondern enthält ein Genom,das aus einem oder mehreren RNA-Molekülen besteht. Bei den Retroviren, zudenen auch das menschliche Immunschwächevirus (HIV, human immunodefi-ciency virus) gehört, der Verursacher des erworbenen Immunschwächesyndroms(AIDS, aquired immunodeficiency syndrome), wird das einzelsträngige RNA-Molekül

Abb. 1.1 Der Fluss der genetischen Information.

2 1 Informationsmakromoleküle

in eine doppelsträngige DNA-Kopie überführt; diese wird dann in das Genom derWirtszelle eingebaut. Dieser Vorgang wird als reverse Transkription bezeichnet.Man kennt auch eine Reihe von Viren, deren RNA-Genom direkt zu RNA kopiertwird, ohne Zuhilfenahme der DNA als Zwischenstufe (RNA-Replikation). Dazuzählen das Influenza- und das Hepatitis-C-Virus. Soweit bekannt, gibt es keineBeispiele dafür, dass ein Protein „rückwärts translatiert“ wird, um eine spezifischeRNA- oder DNA-Sequenz zu erzeugen; somit scheint der Translationsschritt deszentralen Dogmas in nur eine Richtung zu gehen. Schließlich gibt es noch einefaszinierende Ausnahme von dem Dogma, dass die RNA- und Proteinsequenzeneindeutig in der DNA verschlüsselt (codiert) sind: der Prozess des RNA-Editing.Man kennt Beispiele (hauptsächlich in Eukaryoten), bei denen die Basensequenzeiner RNA tatsächlich nach der Transkription der DNA verändert wird, sodass sie,und jedes Proteinprodukt im Falle einer mRNA, nicht mehr exakt der DNAentspricht.Die Erörterung dieser Systeme im vorliegenden Buch basiert auf dem biologi-

schen Klassifizierungssystem der drei Domänen, bei dem der letzte gemeinsameVorfahre (LUCA, last universal common ancestor) allen Lebens sich zunächst in dieBakterien (Bacteria) und den gemeinsamen Vorfahren der Archaea und Eukaryaaufspaltete. Die beiden Letztgenannten trennten sich später auf. Zwar sind Bakte-rien und Archaeen beide Prokaryoten, weil ihnen ein echter Zellkern fehlt,hinsichtlich vieler Aspekte der Informationsverarbeitung haben die Archaeenjedoch mehr Gemeinsamkeiten mit den kernhaltigen Eukaryoten. Die meistenBeispiele stammen von Bakterien und Eukaryoten.

1.1.2 Rekombinante DNA-Technologie

In den späten 1970er-Jahren erlebte die Molekularbiologie große Fortschrittedurch die Entwicklung der rekombinanten DNA-Technologie (Gentechnik). Sieerlaubte, dass Gene isoliert, sequenziert, modifiziert und von einem Organismusauf einen anderen übertragen werden; sie war von größter Bedeutung für daszunehmende Verständnis darüber, wie Zellen arbeiten. Zudem werden auf dieseWeise erzeugte transgene Mikroorganismen heute routinemäßig eingesetzt, ummenschliche Therapeutika im Großmaßstab herzustellen. Transgene Tiere undPflanzen verfügen über ein großes Potenzial, sowohl die Spannbreite nützlicherProdukte zu vergrößern als auch verbessertes Wachstum, Krankheitsresistenz oderModelle für menschliche Krankheiten usw. zu erreichen (Abschnitt 13.5). Diedauerhafte Korrektur einer Erbkrankheit mithilfe der Gentherapie ist jetzt eben-falls eine realistische Möglichkeit. In den letzten Jahren ist die für die Bestimmungder DNA-Basen verantwortliche Technologie vorangeschritten und die Kosten sindso rasch gesunken, dass es schon bald praktikabel sein wird, das vollständigeGenom eines Individuums zu sequenzieren und die Krankheitsanfälligkeit imRahmen eines routinemäßigen Gesundheitsfürsorgeprogramms zu bestimmen.Inzwischen können sogar neue Gene chemisch synthetisiert und zu vollständigenGenomen zusammengefügt werden. Im Jahre 2010 bildeten J. Craig Venter undseine Kollegen die vollständige chromosomale DNA eines kleinen Mykoplasma-

1.1 Informationsverarbeitung und Molekularbiologie 3

Bakteriums nach und fügten sie in eine „leere“ Zelle ein, deren eigenes Chromo-som entfernt worden war; auf diese Weise schufen sie einen lebenden Organismus(Abschnitt 13.7). Dieses DNA-Molekül besaß auch einige neue Eigenschaften undebnete damit den Weg für die zukünftige Möglichkeit, echtes synthetisches Lebenzu erschaffen – „Designer“-Organismen mit künstlichen Genomen, die neuebiochemische Funktionen ausführen können, die in der natürlichen Welt nichtvorkommen. Ziel ist dabei die Herstellung neuer Medikamente, Brennstoffe undanderer Produkte. Die Molekularbiologie und die um sie entstandenen Technolo-gien haben eine zentrale Rolle bei der Entwicklung von Medikamenten für Menschund Tier, in der Landwirtschaft und in der biotechnologischen Industrie gespielt;nun werden sie darauf angesetzt, die Herausforderungen der weltweiten Gesund-heit, der Umweltveränderungen und der Lebensmittelsicherheit zu bewältigen,mit denen wir im 21. Jahrhundert konfrontiert sind.

Noch einmal in Kürze

Das zentrale DogmaDas zentrale Dogma besagte ursprünglich: „DNA macht RNA macht Protein.“Dies geschieht mithilfe der Transkription bzw. der Translation. Dies stimmt imWesentlichen, obwohl es eine Reihe von Beispielen gibt, die Teilen davonwidersprechen. Retroviren schreiben RNA zurück in DNA, andere Viren kön-nen RNA direkt zu einer RNA-Kopie replizieren, wohingegen manche RNAsnach ihrer Synthese editiert werden können, sodass die sich ergebende Sequenznicht direkt durch die DNA-Sequenz spezifiziert ist.

Rekombinante DNA-Technologie (Gentechnik)Die Fähigkeit, die Genome von Mikroorganismen, Tieren und Pflanzen zumanipulieren, hat große Fortschritte für das Verständnis der Zellbiologiegebracht. Außerdem haben transgene Organismen, die DNA von anderenQuellen enthalten, viele Anwendungen in der Medizin, der Landwirtschaft undder Industrie gefunden. Die Fähigkeit, neue Genome zu synthetisieren, wirdnoch größere Fortschritte auf diesen Gebieten mit sich bringen.

TippVerwandte Themen:• (Abschnitt 1.2) Nukleinsäurestruktur und ‑funktion• (Abschnitt 1.3) Proteinstruktur und -funktion• (Kap. 5) Transkription in Bakterien• (Kap. 7) Transkription in Eukaryoten• (Kap. 8) Der genetische Code und die tRNA• (Kap. 9) Proteinsynthese

4 1 Informationsmakromoleküle

1.2 Nukleinsäurestruktur und -funktion

1.2.1 Basen

Die Basen der DNA und RNA sind heterozyklische (kohlenstoff- und stickstoff-haltige) aromatische Ringe, mit einer Reihe von Substituenten (Abb. 1.2). BeiAdenin (A) und Guanin (G) handelt es sich um Purine, bizyklische Strukturenmit zwei fusionierten Ringen; dagegen sind Cytosin (C), Uracil (U) und Thymin(T) Pyrimidinemit nur einem Ring. In der DNA ist die Base Uracil, die in der RNAvorkommt, durch Thymin ersetzt. Thymin unterscheidet sich von Uracil nurbezüglich einer Methylgruppe in der 5-Position, d. h. Thymin ist ein 5-Methylura-cil.

1.2.2 Nukleoside

In den Nukleinsäuren sind die Basen kovalent mit einem Pentosezuckerring ander 1’-Position verknüpft und bilden dabei ein Nukleosid (Abb. 1.3). Bei RNA istder Zucker eine Ribose, bei DNA eine 2’-Desoxyribose, bei der die Hydroxylgruppean der 2’-Position durch ein Wasserstoffatom ersetzt ist. Die Verknüpfung mit derBase findet an der 1-Position (N-1) der Pyrimidine und an der 9-Position (N-9) derPurine statt (Abb. 1.2). Die Kennzahl der Atome im Ribosering wird mit 1’‑, 2’-usw. bezeichnet, einfach nur um sie von den Atomen der Base zu unterscheiden.Die Bindung zwischen den jeweiligen Basen und Zuckern ist eine glykosidischeoder Glykosidbindung. Handelt es sich bei dem Zucker um Ribose, dann heißendie Nukleoside (technisch Ribonukleoside) Adenosin, Guanosin, Cytosin undUridin. Ist der Zucker aber Desoxyribose (wie in der DNA), dann sind die

Abb. 1.3 Nukleoside.

Abb. 1.2 Nukleinsäurebasen.

1.2 Nukleinsäurestruktur und -funktion 5

Nukleoside (2’-Desoxyribonukleoside) Desoxyadenosin, Desoxyguanosin usw. DieBezeichnungen „Thymidin“ und „Desoxythymidin“ können alternativ verwendetwerden.

1.2.3 Nukleotide

Ein Nukleotid ist ein Nukleosid mit einer oder mehreren Phosphatgruppen, diekovalent an der 3’‑, 5’- oder (nur in manchen Ribonukleotiden) der 2’-Positionverknüpft sind. Ist der Zucker Desoxyribose, dann heißen die Verbindungen 2’-Desoxyribonukleotide oder einfach Desoxyribonukleotide (Abb. 1.4). Chemischgesehen sind die Verbindungen Phosphatester. Im Falle der 5’-Position könnenbis zu drei Phosphate verknüpft sein und bilden dann z. B. Adenosin-5’-triphos-phat oder Desoxyguanosin-5’-triphosphat; die genannten Verbindungen werdenüblicherweise mit ATP bzw. dGTP abgekürzt. Auf die gleiche Weise erhalten wirDesoxycytidintriphosphat (dCTP), Uridintriphosphat (UTP) und Desoxythymidin-triphosphat (dTTP oder einfach TTP genannt). 5’-Mono- und -Diphosphate werdenbeispielsweise als AMP bzw. dGDP abgekürzt. Nukleosid-5’-triphosphate (NTPs)oder Desoxynukleosid-5’-triphosphate (dNTPs) sind die Bausteine der polymerenNukleinsäuren. Im Verlauf der DNA- oder RNA-Synthese werden zwei Phosphatein Form von Pyrophosphat abgespalten und es verbleibt ein Phosphat pro Nukleo-tid, das in die Nukleinsäurekette eingebaut wird (Abschnitt 3.1 und 5.1). Damit istdie sich wiederholende Einheit einer DNA- oder RNA-Kette ein Nukleotid.

1.2.4 Phosphodiesterbindungen

In einem DNA- oder RNA-Molekül sind die Desoxyribonukleotide bzw. die Ribo-nukleotide durch die kovalente Verknüpfung einer Phosphatgruppe mit der 5’-Hydroxylgruppe einer Ribose und der 3’-Hydroxylgruppe der nächsten Ribose zueinem Polymer verbunden (Abb. 1.5). Eine derartige Verknüpfung nennt manPhosphodiesterbindung, da das Phosphat chemisch als ein Diester vorliegt. Damitbesitzt eine Nukleinsäure eine Richtung oder Polarität. Eine Nukleinsäureketteegal welcher Länge (solange sie nicht ringförmig ist, Abschnitt 2.3) hat ein freies5’-Ende – das mit einer Phosphatgruppe verknüpft sein kann oder auch nicht –

Abb. 1.4 Nukleotide.

6 1 Informationsmakromoleküle