Embed Size (px)
Citation preview
KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
Vilma Armoškaitė
Žaliosios arbatos ištraukų kokybės analizė ir
antioksidacinio aktyvumo tyrimas
(Magistrinis baigiamasis darbas)
Darbo vadovai:
prof. V. Briedis
doc. K. Ramanauskienė
KAUNAS, 2009
2
Padėka
Uţ suteiktas kokybiško darbo sąlygas ir materialinę bazę atlikti mokslinį tiriamąjį darbą
„Ţaliosios arbatos ištraukų kokybės analizė ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas“ dėkoju Vaistų
technologijos ir socialinės farmacijos katedros vedėjui prof. A. Savickui ir visam kolektyvui.
Uţ pagalbą dėkoju:
• KMU Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedros lektorei G.
Kasparavičienei uţ konsultacijas, rengiant bei tobulinant spektrofotometrinių tyrimų metodiką;
• VDU Chemijos katedros Gamtos Mokslų fakulteto Biochemiojos ir Biotechnologijų
tyrimų laboratorijos vadovui prof. habil. dr. A. Maruškai uţ pagalbą, optimizuojant
spektrofotometrinių ir efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) tyrimų metodiką.
3
TURINYS
ĮVADAS .............................................................................................................................................. 5
1. LITERATŪROS APŢVALGA ....................................................................................................... 8 1.1 Arbatos, jų rūšys bei ţaliosios arbatos kaip gėrimo paplitimas pasaulyje. Arbata –Europos
farmakopėjos (Eur. Ph.) straipsnių objektas .................................................................................... 8 1.2. Arbatmedis. Jo paplitimo arealai .............................................................................................. 8 1.3. Camellia sinensis L. ţaliavos cheminė sudėtis ......................................................................... 9
1.4. Ţaliosios arbatos gydomosios savybės. Camellia sinensis L. ţaliavos aktualumas
medicininiuose tyrimuose ................................................................................................................ 9 1.5. Arbatos ţaliavos pramoninė paruoša ir paruoša vaistinėje ..................................................... 11 1.6. Arbatos standartiniai gamybos būdai (uţpilai ir nuovirai) ir jų palyginimas su buitiniu arbatos
ruošimo metodu ............................................................................................................................. 12
1.7. Pagrindiniai ekstrakcijos dėsniai bei ypatumai, jų svarba buitinių ištraukų, uţpilų ir nuovirų
gamybos technologijoje ................................................................................................................. 13 1.8. Fenoliniai junginiai, jų poklasis – flavonoidai. Fenolinių junginių ir flavonoidų struktūra,
panaudojimas, analizės metodai .................................................................................................... 15 1.9. Laisvieji radikalai ir jų poveikis organizmui. Aktyviosios deguonies formos ....................... 17 1.10. Antioksidaciniai procesai bei medţiagos. Antioksidantai ţaliojoje arbatoje ....................... 19
2. EKSPERIMENTINĖ DALIS ........................................................................................................ 21
2.1.Medţiagos ir metodai .............................................................................................................. 21 2.1.1. Medţiagos ir tirpikliai ..................................................................................................... 21
2.1.2. Ţaliosios arbatos vandeninių ištraukų paruošimas .......................................................... 22 2.1.3. Ţaliosios arbatos metanolinių ekstraktų paruošimas ....................................................... 22 2.1.4. Nuodţiūvio nustatymas (pagal Eur. Ph. 01/2002, 2.2.32) ............................................... 23
2.1.5. Fenolinių junginių kiekio nustatymas, pritaikant spektrofotometrinį metodą ................. 23
2.1.6. Bendro antioksidacinio aktyvumo nustatymas, atliekamas, naudojant DPPH* radikalo ir
ABTS* radikalo surišimo testą .................................................................................................. 24
2.1.7. Ţaliosios arbatos kokybinės sudėties nustatymas ESC metodu ...................................... 26
2.2. Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas ............................................................................................ 28 2.2.1. Ţaliosios arbatos ţaliavos vandeninių buitiniu metodu paruoštų ištraukų sauso likučio,
fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimo rezultatų aptarimas. ............................ 28 2.2.2. Uţpilų ir nuovirų kokybės, priklausomos nuo technologinių parametrų, tyrimas .......... 30
2.2.3 Ţaliosios arbatos ţaliavų veikliųjų medţiagų kokybės ir kiekybės tyrimas, pritaikant ESC
metodą ....................................................................................................................................... 33 2.2.4. Ţaliosios arbatos kietojo preparato, ţaliosios arbatos ekstrakto kapsulių ,,Sanitas“,
kokybės tyrimas ......................................................................................................................... 37 IŠVADOS .......................................................................................................................................... 39
LITERATŪROS SĄRAŠAS ............................................................................................................. 40 PRIEDAI ........................................................................................................................................... 44
4
SUTRUMPINIMŲ SĄRAŠAS
AGA – Amerikos Gastroenterologų asociacija
BAM – biologiškai aktyvios medţiagos
DAD – diodų matrica
DC – dujų chromatografija
DNR – deoksiribonukleino rūgštis
ECG – epigalokatechinai
ESC - efektyvioji skysčių chromatografija
Eur. Ph. – Europos farmakopėja
GC – galokatechinai
KFE - kietafazė ekstrakcija
MTL – maţo tankio lipoproteinai
MS – masių spektroskopinis
PBS - phosphate buffered saline/fosforo ir druskos buferinis tirpalas
r. - rūgštis
SC – skysčių chromatografija
UG - ultragarsas
UV – ultravioletinė spinduliuotė
TFR – trifluoracto rūgštis
AŢ – augalinė ţaliava
5
ĮVADAS
Problemos aktualumas ir naujumas
Lietuvoje ir visame pasaulyje šiuo metu ţalioji arbata yra vienas populiariausių gėrimų,
tačiau jos kokybės bei kiekybės tyrimų nėra gausu.
Ţalioji arbata yra svarbi tiek kasdieninio vartojimo, tiek mokslinių tyrimų poţiūriu. Iš vienos
pusės - tai vienas populiariausių gėrimų pasaulyje, iš kitos – tai svarbus ir populiarus mokslinių
tyrimų objektas.
Šiuo metu mokslininkai itin susidomėję ţaliosios arbatos poveikiu sveikatai. Keletas naujų
tyrimų atskleidė įdomių ir informatyvių faktų apie arbatos gydomąsias savybes. Atlikti tyrimai
rodo, kad arbata turi teigiamą poveikį kepenų, inkstų, krūtų vėţio prevencijai, padeda atsikratyti
antsvorio, maţina maţo tankio lipoproteinų (MTL) kiekius kraujyje, gerina kraujotaką, tonizuoja
bei gerina kasdieninę savijautą [1].
Aktualumas
Esant labai dideliam ţaliųjų arbatų asortimentui, sunku tokioje įvairovėje atsirinkti, kuri
arbata yra kokybiška. Todėl šio tyrimo metu buvo siekiama ištirti keturias ţaliosios arbatos
ţaliavas, pasirinktas iš gausaus jų asortimento rinkoje, įvertinti jų kokybę ir kiekybinę sudėtį,
nustatyti ţaliosios arbatos vandeninių ištraukų ruošimo būdą, garantuojantį optimalų ţaliosios
arbatos veikliųjų komponentų išsiekstrahavimą.
Moksliniu poţiūriu aktualu tai, kad ţalioji arbata pasiţymi antioksidacinėmis,
tonizuojančiomis, sutraukiančiomis savybėmis. Šios savybės gali būti ir yra panaudojamos įvairių
ligų prevencijai ir gydymui.
Tyrimo problema - ţaliosios arbatos ištraukų paruošimo technologijos, siekiant išgauti kuo
didesnius veikliųjų medţiagų kiekius, ţaliosios arbatos ţaliavų veikliųjų medţiagų kokybinė
sudėties ir kiekybinio jų įvertinimo tyrimų trūkumas Lietuvoje.
Tyrimo tikslas - ţaliosios arbatos vandeninių ištraukų fenolinių junginių kokybinė bei
kiekybinė analizė ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas
Tyrimo objektas – ţaliosios arbatos vandeninės ištraukos. Tyrimui įgyvendinti pasirinktos
keturios ţaliosios arbatos ţaliavų rūšys (1 pav):
1. Banča (kilmės šalis Japonija);
2. Maxima (kilmės šalis Šri Lanka);
3. Majski (kilmės šalis Kinija);
4. Dilmah (kilmės šalis Šri Lanka).
6
Tyrimo uždaviniai:
1) Buitiniu metodu pagaminti ţaliosios arbatos vandenines ištraukas, atlikti ekstrahavimo
laiko ir ţaliavos rūšies įtakos ištraukų kokybei tyrimą, t.y. ištirti:
a) Sausą likutį (gravimetriniu metodu);
b) Bendrą fenolinių junginių kiekį (spektrofotometrijos metodu);
b) Antioksidacinį aktyvumą (spektrofotometrijos metodu).
2) Pagaminti vandenines ţaliosios arbatos ištraukas standartiniu gamybos metodu (uţpilus ir
nuovirus). Įvertinti ţaliavos rūšies ir infundavimo įrangos įtaką ţaliosios arbatos uţpilų ir
nuovirų kokybei.
3) Palyginti buitiniu metodu ruošiamų vandeninių ištraukų ir standartiniu gamybos būdu
(uţpilai ir nuovirai) paruoštų vandeninių ištraukų kokybę pagal bendrą fenolinių junginių
kiekį ir sausą likutį.
4) Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu (ESC) identifikuoti veikliuosius ţaliosios
arbatos ţaliavų junginius, priskirti antioksidacines savybes atskiriems junginiams.
1) 2)
3) 4)
7
1 pav. Tyrimo objektai. 1 - Arbata „Banča“, 2 - Arbata „Maxima“, 3 – Arbata „Majski“, 4 –
Arbata „Dilmah“, 5 – Ţaliosios arbatos ekstrakto „Sanitas“ kapsulės
5)
8
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1 Arbatos, jų rūšys bei žaliosios arbatos kaip gėrimo paplitimas pasaulyje. Arbata –
Europos farmakopėjos (Eur. Ph.) straipsnių objektas
Arbata – tai gėrimas, ruošiamas dţiovintus maţalapio
kininio arbatmedţio (Camellia sinensis sinensis), didţialapio
analogo (Camellia assamica) ir jų hibridų lapus ir pumpurus
kelioms minutėms uţpylus karštu vandeniu. Arbata taip pat
vadinami perdirbti ir išdţiovinti kininio arbatmedţio lapai
(arbatţolės) [1]. Tai antras pagal populiarumą gėrimas pasaulyje
po gryno vandens [2].
Augalinių arbatų (Plantae ad ptisanam) sudėtyje yra vienas ar daugiau ţolinių komponentų.
Augalinės arbatos įvardijamos kaip natūralūs vaistiniai preparatai, vartojami į vidų vandeninių
ištraukų forma, pagaminta maceracijos, infuzijos ar nuovirų gamybos metodu. Uţpilai, nuovirai ir
maceratai gaminami prieš pat vartojimą (ex tempore) [35].
Išskiriamos dvi arbatos rūšys:
1) Juodoji arbata ruošiama renkant nuo jaunų ūglių lapelius, juos vytinant. Vytinimo metu
arbatos lapeliai nepilnai dţiovinami, juose sumaţėja vandens kiekis. Suvytinti lapai sukami (talpinami
tarp dviejų būgnų, kurie lapus suspaudţia ir ţaliava netenka dar daugiau vandens). Vanduo ar sultys
nusėda ant lapelių, vyksta oksidacijos procesai. Fermentavimo proceso metu lapeliai laikomi drėgnai ir
vėsiai, atsiranda juoda spalva ir aromatas. Galutinėje stadijoje tokia lapų masę dţiovinama karštu oru.
2) Ţalioji arbata gaminama be fermentacijos stadijos. Dţiovinant karštu oru, inaktyvuojami
fermentai, aromatingųjų medţiagų lieka maţiau, lapeliai lieka ţalios spalvos.
1.2. Arbatmedis. Jo paplitimo arealai
Klasifikacija:
Karalystė – augalų (Plantae), eilė – erikinių (Ericaceae), šeima – arbatmedinių (Theaceae),
gentis – arbatmedinių (Camellia), rūšis – kininis arbatmedis (Camellia sinensis L.).
Ţalioji bei juodoji arbata gaminama iš kininio arbatmedţio (Camellia sinensis) lapų. Tai visad
ţaliuojantis krūmas, kuris tėvynėje gali uţaugti iki 10 m aukščio. Kultivuojami krūmai turi pusiau apvalią
formą, nes taip yra karpomi. Kultivuojant šie krūmai išauga iki 1 m aukščio. Augalo lapai išsidėsto
praţanginiu būdu, jie yra trumpakočiai, odiški, elipsiškos formos, kraštai dantyti. Ţiedai taisyklingi, balti,
išsidėsto lapų paţastyse. Tėvynė – Kinija, auginama Indijoje, Šri Lankoje, Japonijoje. Kultivuojami nuo
9
XVI a. Augalinė ţaliava (AŢ)– lapai. Paruošos renkamos nuo trimečių augalų. Skinami viršutiniai 2-3
lapeliai [33].
1.3. Camellia sinensis L. žaliavos cheminė sudėtis
1) Purino grupės alkaloidai 4 proc. Pagrindinis iš jų – kofeinas (iki 4 proc.), teobrominas (0,2
proc.), teofilinas (0,4 proc.);
2) Fenoliniai junginiai 2,5 – 5 proc. Jiems priskiriami flavonoidai, fenolinės rūgštys,
katechinai;
a) Flavonoidai (iš jų gausiausia katechinų grupė):
1) galokatechinai (GC); 2) epigalokatechinai (ECG); 3) epigalokatechin-3-galatai; 4)
galokatechingalatai; 5)epikatechingalatai [11].
b) Fenolinės rūgštys (galo r. (rūgštis), chlorogeninė r., kavos r.) ;
3) Aminorūgštys 1 proc.;
4) Eteriniai aliejai iki 0,02 proc.;
5) Mineralinės medţiagos (kalio jonai, chloridai);
6) Rauginės medţiagos 10 – 20 proc. (suteikia sutraukiantį skonį) [34].
1.4. Žaliosios arbatos gydomosios savybės. Camellia sinensis L. žaliavos aktualumas
medicininiuose tyrimuose
Ţalioji arbata paskutiniu metu tapo didelio susidomėjimo bei intensyvių mokslinių tyrimų
objektu. Pagrindinės suinteresuotumo ja prieţastys - poveikių organizmui gausa ir įvairovė.
Arbatos poveikiai organizmui:
1) dėl kofeino pasiţymi tonizuojančiu, suţadinančiu poveikiu, gerina širdies darbą,
teobrominas ir teofilinas skatina diurezę;
2) dėl flavonoidų šie junginiai dalyvauja oksidacijos - redukcijos reakcijose, maţina kapiliarų
pralaidumą, didina jų elastingumą, apsaugo askorbo rūgštį nuo oksidacijos;
3) dėl fluoridų apsaugo dantis nuo karieso;
4) rauginės medţiagos pasiţymi sutraukiančiu poveikiu, todėl stabdo viduriavimą.
Nepageidaujami arbatos efektai: suerzintamas skrandis, dėl rauginių medţiagų gali pasireikšti
vidurių obstipacija. Nepatartina vaistų uţgerti arbata, nes rauginės medţiagos sąveikauja su vaistais
virškinamajame trakte, maţindamos vaistų aktyvumą ir jų pasisavinimo galimybes. Geriant arbatą,
ţmogus gauna kofeino, kurio perteklius nėra naudingas. Nepatariama išgerti per dieną daugiau kaip
10 puodelių ţaliosios arbatos,. Arbata šiek tiek maţina geleţies rezorbciją, tačiau tik gaunamą su
augaliniu maistu, ir neveikia geleţies, gaunamos su gyvuliniais maisto produktais (hemo pavidalu),
pasisavinimo. Dėl šios prieţasties vegetarams nerekomenduotina gerti daug arbatos [26].
10
Medicininio pobūdžio moksliniai tyrimai, atliekami su žaliosios arbatos augaline
žaliava
Alabamos universiteto mokslininkas dr. Santosh K. Katiyar kartu su bendradarbiais,
atlikdami tyrimus mėgintuvėlyje ir su pelėmis, nustatė, kad arbatoje esantys fenoliniai junginiai turi
savybę slopinti krūties vėţio ląstelių augimą ir lėtinti metastazių išplitimą į kitus organus.
Nustatyta, kad veikiant metastazavusias krūties vėţio ląsteles ţaliosios arbatos fenoliniais
junginiais, galima jas net sunaikinti. Maitinant peles ţaliosios arbatos kiekiais, perskaičiuotais pagal
ţmogaus suvartojamos arbatos kiekį, buvo nuslopintas vėţio išplitimas plaučiuose, o pelių
išgyvenamumas padidėjo [24].
Medicinos mokslų dr. Constance E. Ruhl ir dr. James E. Everhart atlikto tyrimo publikacija
atspausdinta Amerikos gastroenterologų asociacijos (AGA) ţurnale „Gastroenterologija“. Joje
teigiama, kad ţmonės, turintys didesnę riziką sirgti kepenų ligomis, gali ţymiai sumaţinti šią riziką,
išgerdami per dieną daugiau nei du puodelius kavos ar arbatos. Šis profilaktinis efektas pasireiškia
tik ţmonėms, turintiems didesnę riziką sirgti kepenų ligomis dėl daţno alkoholio vartojimo,
antsvorio ar diabeto. Tyrime dalyvavo 9849 dalyviai. Tiriamieji suvartojo nuo 0 iki 16 puodelių per
dieną, vidutiniškai - po du puodelius per dieną. Nustatyta, kad tiems, kurie išgerdavo daugiau nei du
puodelius kavos ar arbatos kasdien, lėtinės kepenų ligos išsivystė perpus rečiau, negu tiems, kurie
išgerdavo maţiau nei vieną puodelį per dieną. Per pastaruosius keletą metų vis stiprėjo prielaida,
kad kava ir arbata maţina cirozės ir kepenų vėţio riziką. Šis tyrimas patvirtina galimą kavos bei
arbatos profilaktinį efektą lėtinėms kepenų ligoms ir cirozei. Ţaliosios arbatos tegiamas poveikis
kepenims grindţiamas kofeino poveikiu, tačiau galutinis veikimo mechanizmas nėra aiškus [24].
Nustatyta, kad ţalioji arbata apsaugo širdį, išlaikydama vainikines arterijas lankstesnes bei
atsipalaidavusias, dėl to jos gali lengviau atlaikyti kraujo spaudimo pokyčius. Ultragarsu (UG)
nustatyta, kad 14 ţaliąją arbatą gėrusių tiriamųjų širdies kraujagyslės po 30 minučių buvo labiau
išsiplėtusios nei gėrusiųjų kofeiną arba karštą vandenį. Tai paaiškinama ţaliosios arbatos poveikiu
kraujagysles sudarančioms ląstelėms, kurios išskiria specialias kraujagysles atpalaiduojančias ir jų
spindį plečiančias medţiagas. Arbatoje esantys flavonoidai veikia kaip antioksidantai, apsaugantys
organizmą nuo uţdegimo ir krešulių formavimosi (pirminės širdies priepuolių prieţasties) [27].
Arbatoje esantys antioksidantai tiesiogiai padeda maţinti aterosklerozės plitimą.
Antioksidantai trukdo susidaryti laisvųjų radikalų pertekliui, slopina MTL oksidaciją. Arbatoje
esantys antioksidantai maţina riziką susirgti širdies ir kraujagyslių ligomis (pasireiškia
kardioprotekcinis poveikis). Tiriant sergamumo daţnumą tų ţmonių, kurie geria arbatą, ir tų, kurie
jos negeria, rastas skirtumas. Geriantys arbatą rečiau suserga širdies infarktu ir išeminiu insultu uţ
jos negeriančius. Tiriant grupes ţmonių, kur vieni per dieną suvartojo vidutiniškai pora puodelių
ţaliosios arbatos, insulto rizika sumaţėjo 73 proc. palyginti su tais, kurie jų suvartojo vidutiniškai
11
vieną puodelį per dieną [14]. Išgeriantiems vieną puodelį arbatos per dieną širdies infarkto rizika
sumaţėja 44 proc. palyginti su tais, kurie arbatos visai negeria.
Arbatţolių flavonoidai maţina cholesterolio koncentraciją kraujo plazmoje. Norvegijoje
ištirta, kad išgeriant per dieną vieną puodelį arbatos cholesterolio kiekis sumaţėjo 6 proc., išgeriant
vieną arba du puodelius - 12 proc., išgeriant 3-7 puodelius - 19 proc., lyginant su visiškai
negeriančiais arbatos [15]. Nustatyta, kad arbata sumaţina cholesterolio koncentraciją ne tik tų
ţmonių, kurių kraujo plazmoje cholesterolio per daug, bet ir tų, kurių koncentracija normali.
Analizuojant duomenis apie arbatos įtaką įvairios lokalizacijos piktybinių ligų rizikai
maţinti, inkstų akmenligei gydyti, matyti, kad 2-3 puodeliai arbatos per dieną sumaţina inkstų
akmenligės riziką apie 30 proc. Ţaliosios arbatos veikliosioms medţiagoms būdingos
antimutageninės ir antikancerogeninės savybės [36].
Vertinant ţaliąją arbatą kokybinės sudėties atţvilgiu, svarbiausios jos veikliosios medţiagos
- katechinai – jų sausose ţaliosios arbatos arbatţolėse būna iki 30 proc., o viename jos puodelyje -
iki 200 miligramų [11].
1.5. Arbatos žaliavos pramoninė paruoša ir paruoša vaistinėje
Vaistaţolių mišinys - tai kelių susmulkintų vaistaţolių ar vieno vaistinio augalo ţaliavos mišinys,
kartais su eterinių aliejų, druskų ir kitais priedais. Būna išimčių, kai vaistaţolės vartojamos
nesusmulkintos. Vaistaţolių smulkinimas priklauso nuo mišinio paskirties. Kiekviena ţaliavos
rūšis smulkinama atskirai (smulkinama visa AŢ, nieko neišmetant). Lapai, ţolės, ţievės karpomi arba
pjaustomi specialiomis mašinomis. Smulkumo laipsnis priklauso nuo mišinio paskirties [22].
AŢ mišiniai, skirti uţpilams bei nuovirams gaminti, ruošiami pagal farmakopėjos straipsnio
"Infusa et decocta" reikalavimus. Susmulkinus ţaliavą, nuo jos visada sijojamos dulkės (sieto angelių
diametras 0,2 mm). Susmulkintos ir per sietus išsijotos ţaliavos sumaišomos tarpusavyje plačioje
grūstuvėje, dubenyje ar ant popieriaus lapo. Maišoma šaukštu, lopetėle ar kitais tinkamais
įrankiais. Pirmiausia sveriama ţaliava, kurios mišinio sudėtyje yra daugiausia. Paruošto mišinio
negalima kratyti, nes jis gali išsisluoksniuoti (dalelės skiriasi savo tankiu ir dydţiu). Dţiovinant
temperatūra turi būti ne didesnė kaip 60° C [3]. Vaistinėje tikrinant vaistaţolių mišinių kokybę,
nustatoma bendra vaistaţolių išvaizda, spalva, kvapas, kurie turi būti būdingi pavartotiems
ingredientams .
Analizei imamas nuo 1 iki 10 g vidutinis mėginys (priklausomai nuo mišinio smulkumo bei
lengvumo), identifikuojamos jo sudėtinės dalys. Vaistaţolių smulkinimo kokybė nustatoma mišinį
nusijojus per atitinkamus sietus.
Veikliosios medţiagos bei drėgmė kiekybiškai nustatoma kontrolinėse analitinėse
laboratorijose ar metodais, nurodytais farmakopėjiniuose straipsniuose bei standartuose [31].
12
1.6. Arbatos standartiniai gamybos būdai (užpilai ir nuovirai) ir jų palyginimas su
buitiniu arbatos ruošimo metodu
Uţpilai ir nuovirai - tai vandeninės vaistaţolių ištraukos arba specialių, tam tikslui skirtų
ekstraktų vandeniniai tirpalai, skirti gerti ir vartoti iš išorės. Į vandenines ištraukas gali būti
dedamos medţiagos, turinčios skirtingų fizinių ir cheminių savybių.
Uţpilų ir nuovirų gamybos stadijos: vaistinės augalinės ţaliavos smulkinimas, dulkių
nusijojimas, ekstrahavimas (kaitinant ir aušinant), košimas, pagamintos ištraukos tūrio patikslinimas,
įpakavimas ir apipavidalinimas. Lapai ir ţolė smulkinami ne didesnėmis kaip 5 mm dalelėmis.
Šaknys, šakniastiebiai, stiebai ir ţievė smulkinami ne didesnėmis kaip 3 mm dalelėmis, o vaisiai ir
sėklos - ne didesnėmis kaip 0,5 mm. Jei ţaliavos smulkumas pageidautinas kitoks - tai turėtų būti
nurodyta norminiuose dokumentuose [34]. Susmulkinta AŢ sijojama nuo dulkių ir sveriama. Jeigu
vaistinės augalinės ţaliavos kiekis nenurodomas recepte, ištrauka gaminama santykiu 1:10. Jei
augalinėje ţaliavoje veikliųjų medţiagų yra daugiau kaip standartinėje, ţaliavos kiekis
apskaičiuojamas vartojant formulę:
X= A•V/B (1 formulė)
X - nestandartinės ţaliavos kiekis, gramais,
A - recepte išrašytos standartinės ţaliavos kiekis, gramais,
V - veikliosios medţiagos kiekis 1 grame standartinės ţaliavos,
B - faktinis veikliosios medţiagos kiekis 1 grame nestandartinės ţaliavos.
Vandens kiekis, reikalingas pagaminti uţpilą ar nuovirą, apskaičiuojamas vartojant sugerties
koeficientą Ks. Tai tiek vandens mililitrų, kiek negrįţtamai sugeria 1 g vaistinės augalinės ţaliavos.
Ks apskaičiuoti daugeliui vaistinių augalinių ţaliavų:
X = V + M•Ks (2 formulė)
X - vandens kiekis, reikalingas ištraukai gaminti ml,
M - augalinės ţaliavos masė (g),
V - recepte išrašytas uţpilo ar nuoviro tūris,
Ks - sugerties koeficientas.
Gaminant augalines ištraukas karštuoju būdu, svarbi kaitinimo ir aušinimo trukmė. Uţpilai
kaitinami 15 min., aušinami - 45 min., nuovirai kaitinami 30 min., aušinami 10 min [23, 25].
AŢ sveriama, dedama į infundirinį indelį, uţpilama apskaičiuotu išgryninto vandens kiekiu,
indelis uţdengiamas ir statomas į infundavimo aparato vandens vonią. Kaitinama nuolatos pamaišant.
Ištraukos aušinamos kambario temperatūroje, atvėsintos perkošiamos per dvigubą marlės sluoksnį,
pamatuojamas ir, jei reikia, pripilama išgrynintojo vandens [30].
13
1.7. Pagrindiniai ekstrakcijos dėsniai bei ypatumai, jų svarba buitinių ištraukų, užpilų
ir nuovirų gamybos technologijoje
Gaminant uţpilus ir nuovirus, remiamasi ekstrahavimo teoriniais pagrindais. Ekstrahavimo
procesas prasideda nuo ekstrahuojamos augalinės ţaliavos suvilgymo ekstrahentu – vandeniu.
Uţpilų ir nuovirų gamyboje naudojama išdţiovinta AŢ.
Ekstrahavimo proceso stadijos: 1. Brinkinimas; 2. Desorbcija; 3. Išplovimas; 4. Dializė; 5.
Difuzija; 6. Osmosas.
Sausa AŢ, uţpilta vandeniu, išbrinksta. Vanduo ekstrahuojamas medţiagas pirmiausia
išplauna iš išorėje esančių ir paţeistų ląstelių. Vėliau vanduo patenka per poras į ląstelių sieneles ir
ląstelių sienelių vidų, ištirpina ir desorbuoja čia esančias biologiškai aktyvias medţiagas (BAM).
Ląstelių viduje susidaro koncentruotas tirpalas ir didelis osmosinis slėgis. Atsiranda skirtingos
koncentracijos ląsteles viduje ir išorėje - dėl to įvyksta difuzijos procesas. Šiuo atveju vyksta
molekulinė difuzija - molekulės skverbiasi iš ląsteles į ekstrahentą [9]. Molekulinė difuzija
apibūdinama Fiko lygtimi:
S=D•F•(C –c) /x•t (3 formulė)
S - difundavusios medţiagos kiekis kg;
C-c - koncentracijos skirtumas ląstelėje ir ekstrahente;
F - fazių susilietimo paviršius, m2;
D - difuzijos koeficientas, m2/s;
t - difuzijos laikas, s.
Ekstrahavimo procesas skirstomas į 3 stadijas:
1. Vidinė molekulinė difuzija iš ląstelės per apvalkalėlį į ribinį sluoksnį;
2. Molekulinė difuzija ribiniame sluoksnyje;
3. Konvekcinė difuzija ekstrahento sraute.
Veiksniai, darantys įtaką ekstrahavimo procesui:
1) Ţaliavos kokybės faktoriai;
2) Masės pernašą ţaliavos dalelių viduje ir ekstrahente veikiantys faktoriai.
Ţaliavos kokybės faktoriai
AŽ smulkumas. Remiantis bendrais uţpilų gamybos reikalavimais, AŢ naudojama šių
vaistų formų gamyboje turi būti susmulkinta pagal ţaliavos smulkumui keliamus reikalavimus.
Paprastai AŢ vaistinėje gaunamos susmulkintu pavidalu. Nuo histologinės augalinės ţaliavos
sandaros priklauso ekstrahavimo proceso efektyvumas. Optimalus AŢ smulkumo laipsnis
nustatomas sietais. Arbatţolių lapams šis dydis yra ne didesnis negu 5 mm (naudojamas sietas Nr.
50).
14
Ţaliavos smulkumas stipriai daro įtaką veikliųjų medţiagų išplovimui iš augalinės ţaliavos,
nes padidėja susilietimo paviršius su ekstrahentu, todėl difuzija greitėja. Per daug susmulkinus
ţaliavą, ekstrahavimo procesas lėtėja dėl per daug suardytų ţaliavos ląstelių, iš kurių išplaunamos
medţiagos, lėtinančios ekstrahavimo procesą. Į ištrauką patenka daug smulkių, netirpių dalelių,
kurias sunku nusodinti. Per daug susmulkinus ţaliavą, kuri kaupia gleives, gali susidaryti geliai, ir
ekstrakcijos procesas taip pat nevyks. Kai AŢ per stambiai susmulkinta, sulėtėja ekstrahavimo
procesas, nes tirpikliui sunku prasiskverbti į ląsteles ir išplaunama maţai veikliųjų medţiagų.
Susmulkinta AŢ turi būti atskiriama nuo dulkių [29].
Smulkinimo būdas. 1969 m. Buvo nustatyta nustatė, kad, ekstrahuojant saldyšaknės
ţaliavą, supjaustytą skersai, išsiplauna daugiau veikliųjų medţiagų nei ekstrahuojant išilgai
supjaustytą ţaliavą.
Kadangi malimo būdu labiau suardomos ląstelės, todėl BAM greičiau išsiskiria iš ţaliavos.
Padidėjus ţaliavos paviršiaus plotui lengviau sugeriamas ekstrahentas, pagreitėja difuzija, todėl
didesnė koncentracija veikliųjų medţiagų pereina į ištrauką.
Drėgmės kiekis. Ţaliavoje esantis per didelis drėgmės kiekis maţina veikliųjų medţiagų
kiekį, ir išsiekstrahuoja maţiau veikliųjų medţiagų. Didėjant drėgmei, blogėja ţaliavos kokybė.
Faktoriai, darantys įtaka masės pernašai ţaliavos dalelių viduje bei ekstrahente
Hidrodinaminės sąlygos. Difuzija vyksta dėl koncentracijų skirtumo, todėl ekstrahavimo
proceso metu būtina palaikyti kuo didesnį koncentracijų gradientą. Maišymo metu fazių sąlyčio
vietoje galima palaikyti didelį koncentracijų skirtumą. Tada daleles skalauja maţesnės
koncentracijos tirpalas ir sudaromos sąlygos vykti molekulinei difuzijai iš ţaliavos dalelių į
ekstrahentą. Pačiame ekstrahente vyksta konvekcinė difuzija.
Temperatūra. Esant aukštesnei temperatūrai, ekstrahavimas vyksta greičiau. Pagerėja
medţiagų tirpumas, intensyviau vyksta molekulinė difuzija. Tačiau atsiranda pavojus suirti
termolabilioms medţiagoms, gali išgaruoti eteriniai aliejai, kristalizuotis krakmolas, koagulioti
baltymai. Ištirta, kad ekstrahavimas vyksta greičiau, jei prieš tai AŢ buvo uţšaldyta. Ledo kristalai
suardo audinio struktūrą, ir tirpiklis lengviau prasiskverbia į ląstelių sieneles - susidaro geresnės
sąlygos difuzijai.
Žaliavos ir ekstrahento santykis. Identifikuojamas parametras - ţaliavos sugėrimo
koeficientas. Gaminat uţpilus ir nuovirus, būtina skaičiuoti tirpiklio kiekį, kurį sugers AŢ.
Sugėrimo koeficientas priklauso nuo ţaliavos smulkumo laipsnio. Sugėrimo koeficientai yra
nurodyti lentelėse arba naudojami atskiroms augalo morfologinės dalims (lapams, ţievei ir t.t.).
Ekstrahavimo trukmė. Labai ilgas ekstrahavimo laikas neekonomiškas, nes, laikui bėgant,
ekstrahavimo greitis maţėja. Prieţastis - išplaunamos medţiagos pirmiausia iš suardytų ląstelių, o
po to iš nepaţeistų sunkiai prieinamų vietų, todėl ekstrahavimo greitis pradeda maţėti.
15
Ekstrahento pH. Remiantis veikliųjų medţiagų sudėtimi, reikia atsiţvelgti į tai, kokioje pH
terpėje ekstrahuojamos medţiagos geriausiai tirpsta. Terpės pH gali būti koreguojama (pridedama
organinių rūgščių arba šarmų) [30].
1.8. Fenoliniai junginiai, jų poklasis – flavonoidai. Fenolinių junginių ir flavonoidų
struktūra, panaudojimas, analizės metodai
Flavonoidai ir fenolinės rūgštys – tai augalinės kilmės antriniai metabolitai,
sudarantys itin gausią junginių grupę, aptinkamą beveik visuose induočiuose augaluose [13].
Fenolinių rūgščių grupei priskiriami hidroksibenzoatai ir hidroksicinamatai (fenilpropanoidai).
Hidroksibenzoatams būdinga C6-C1 struktūra. Atskirų hidroksibenzoatų skirtumus nulemia
aromatinio ţiedo metilinimas bei hidroksilinimas. Fenilpropanoidams charakteringa C6-C3
struktūra. Augaluose randama chlorogeno, ferulo, kavos rūgštys [26].
Flavonoidai (lot. „flavus“ – geltonas) – tai fenolio junginiai, daţnai pigmentai,
aptinkami augaluose. Daugelio augalų geltona ar oranţinė spalva priklauso nuo flavonoidų, todėl
pastebėjus jų geltoną spalvą, šie junginiai buvo pavadinti atitinkamu lotynišku pavadinimu [20].
Cheminiu – struktūriniu poţiūriu – tai 2 – fenil – benzo – γ pirono dariniai su C6 - C3 - C6 anglies
atomų struktūros dariniai. Aglikonui būdinga dviejų aromatinių benzeno ţiedų (A ir B) struktūra.
Šie ţiedai sujungiami trijų anglies atomų grandine, kuri per deguonies atomą suformuoja
heterociklą, įvardijamą ţiedu C.
Flavonoidai skirstomi į atskiras klases pagal C ţiedo modifikacijas į:
1) 2-fenilbenzopiranai (antocianidinai, flavonai, flavonoliai, flavan-3-oliai (katechinai),
flavanonai);
2) 3-benzopiranai (izoflavonai).
A ir B ţieduose modifikuojant pakaitus (t.y. prijungiant prie hidroksigrupių cukrus,
gliukuronidus, jas metilinant, acetilinant, sulfatuojant), atsiranda skirtingos flavonoidų klasės.
Gamtoje flavanoidai randami O- ir C- glikozidų pavidalu (tokia forma yra atsparesnė
laisvųjų radikalų poveikiui bei dėl pagerėjusių hidrofilinių savybių – labiau tirpi vandenyje).
Cukrinė dalis daţniausiai sudaryta iš heksozių (gliukozė, galaktozė, ksilozė, arabinozė) arba
disacharidų (rutinozė) [32].
Flavonoidų esama visose augalų dalyse, bet gausiausia jų ţieduose, lapuose, vaisiuose.
Dauguma flavonoidų veikia panašiai kaip kai kurie vitaminai, jie malšina spazmus, skatina šlapimo
ir tulţies skyrimąsi, stabdo kraujavimą, slopina virusų dauginimąsi. Daugelis jų turi stiprių
antioksidacinių savybių [20].
16
2 pav. Bendra struktūrinė flavanoidų formulė: du benzeno ţiedai (vadinami „A“ ir „B“),
sujungti trijų anglies atomų grandine (paţymėta 1, 2, 3). Ši grandinė ţiede „A“gali jungtis su
hidroksilo grupe, taip formuodama ţiedą „C“.
Dabar yra ţinoma daugiau kaip 4000 flavonoidų, priklausančių 12 poklasių [33].
3 pav. Arbatos svarbiausi flavonoidai – katechinai, jų struktūra ir įvairovė.
Flavonoidų išskyrimas iš AŢ yra sudėtingas ir daug laiko reikalaujantis procesas.
Daţniausiai flavonoidai iš augalinės ţaliavos ekstrahuojami metanoliu, etanoliu, vandeniu ar šių
tirpiklių mišiniais. Organinėmis rūgštimis reguliuojamas tokių tirpiklių arba jų mišinių pH [28].
Iš AŢ gauti ekstraktai – tai mišinys įvairiausių fenolinių (ir ne tik) junginių. Taigi reikia
atlikti papildomus ekstrakcijos ţingsnius, kad būtų pašalinti nepageidaujami raugai, vaškai,
17
chlorofilas. Priemaišinėms medţiagoms pašalinti naudojama savo paprastumu ir plačiu pritaikymu
garsėjanti kietafazė ekstrakcija (KFE).
Kiekybiniam fenolinių junginių kiekiui augalinėje ţaliavoje nustatyti yra sukurta nemaţai
spektrofotometrinių metodų. Spektrofotometrinės analizės yra pagrįstos spinduliuotės sugerties
principais ir yra taikomos įvairių struktūrinių junginių grupių nustatymui fenoliniuose mišiniuose
[21].
Pagrindiniai chromatografiniai metodai, naudojami flavonoidų aptikimui ir nustatymui yra
šie: skysčių chromatografija (SC), dujų chromatorgafija (DC), plonasluoksnė chromatografija (PC)
ir ESC [4]. ESC - plačiausiai naudojama tiek kiekybinei, tiek kokybinei fenolinių junginių ir
flavonoidų analizei. ESC pasiţymi palyginus trumpa analizės trukme, sudėtingų mišinių skirstymo,
sistemos automatizavimo ir sudėtinių analitės dalių keitimo galimybėmis.
Populiariausių naudojamų judrios fazės sudėčių kombinacijos sudaromos iš acetonitrilo
(ACN) – vandens, metanolio – vandens.
Šios sistemos rūgštinamos, siekiant nuslopinti hidroksilinių grupių jonizaciją; gauti
simetriškesnes smailes su maţu dreifu. Itin svarbu identifikuoti, kokiu pavidalu tiriamajame objekte
esti flavonoidai (aglikonų ar glikozidų) pavidalu, kadangi pagal tai parenkami eliuentai ir
sudaromas gradientas (organinių/neorganinių tirpiklių santykis) [8].
Biologiniuose skysčiuose (serume, plazmoje ir šlapime) flavonoidai egzistuoja glukuronidų
ir sulfatų pavidalu. Medicinoje, maisto produktuose, augaluose, arbatose jie egzistuoja
kompleksinių juginių pavidalu. Pagal tai parenkama atitinkama tirpiklių sistema bei pritaikoma
analizavimui aparatūra [7].
1.9. Laisvieji radikalai ir jų poveikis organizmui. Aktyviosios deguonies formos
Laisvieji radikalai - aktyviosios molekulės, atakuojančios ląstelių membranas, DNR
(genetinę ląstelių informaciją), sukeliančios vėţines bei degeneracines ligas, skatinančios
aterosklerozę ir širdies ligas [5]. Laisvieji radikalai ir aktyvios deguonies formos įvardijami kaip
daugelio chroninių ligų pavojingiausi ir svarbiausi veiksniai. Radikalai ir aktyvios deguonies
formos yra tarpininkai tarp lėtinių, uţdegiminių ir imuninių ligų, cukrinio diabeto, kraujagyslių,
kataraktos, artrito, įvairialypės sklerozės, miokardo, išemijos paţeidimų, smegenų disfunkcijos bei
senėjimo procesų.
Daugelis laisvųjų radikalų yra nestabilūs, kadangi nesuporuoti elektronai linkę, ieškodami
elektrono - porininko, intensyviai reaguoti su kitomis molekulėmis. Imuninei sistemai laisvieji
radikalai reikalingi tam, kad organizmas galėtų kovoti su bakterijomis ar virusais, tačiau jų
perteklius organizmui yra ţalingas, kadangi jie kenkia DNR, baltymams ir lipidams – svarbiausioms
ţmogaus organizmo biomolekumėms. Tokie ţalingo pobūdţio oksidaciniai poveikiai yra
apibūdinami kaip patobiocheminiai mechanizmai, dalyvaujantys įvairių ligų progresinėse stadijose.
18
Laisvųjų radikalų kiekis sveikame organizme turi būti minimalus – toks, kad sukeltų teigiamą
poveikį, padėtų kovoti su mikroorganizmais. Molekulės ir jų dalys, kurios susidaro organizme dėl
išorinio kenksmingų medţiagų poveikio, pvz., UV (ultravioletinės spinduliuotės), nikotino, oro
teršalų ar sunkiųjų metalų, ksenobiotikų tampa labai aktyviais ir itin kenksmingais radikalais.
Antioksidacinės sistemos sutrikimai, nepalankios aplinkos sąlygos sukelia nevaldomą
aktyvių deguonies formų kiekio ląstelėje didėjimą. D. Harmanas (Harman) dar 1972 m. pasiūlė
mintį, kad svarbiausi senėjimą lemiantys veiksniai yra ląstelėje nuolat generuojamos reaktyvios
deguonies formos, kurių didţioji dalis susidaro mitochondrijose.
Aktyvios deguonies formos
Deguoniui suţadinti (pereiti iš tripletinės būsenos į singulentinę) reikia energijos, o tolesnės
reakcijos yra egzoterminės prigimties. Organizme susidaro įvairios aktyvios deguonies formos,
pernešant H nuo donoro (reduktoriaus) O2 molekulei.
1 lentelė. Aktyvių deguonies formų gausa ir įvairovė.
Aktyvi deguonies forma Formulė
Tripletinis deguonis .O-O
.
Singuletinis deguonis 1O2 O-O:
Superoksido anijonradikalas O2*-
.O-O:
Hidroksilas arba perhidroksilo radikalas .O-O:H
Vandenilio peroksidas H:O-O:H
Hidroksiradikalas H:O.
Biologiškai pavojingiausi yra: 1) singulentinis deguonis (jo formos gali susidaryti, veikiant
UV); 2) superoksidas 3) vandenilio peroksidas; 4) hidroksiradikalas; 5) azoto monoksido ir
peroksinitrilo radikalai. Šios aktyvios deguonies rūšys lemia nuodingumą ir vadinamos oksidantais.
Oksidacinis stresas – tai būsena, kurios metu antioksidacinės sistemos nepajėgia kovoti
aktyviomos deguonies formomis, todėl jų sukeltos grandininės reakcijos sutrikdo organizmo veiklą
[6].
Aktyvių deguonies rūšių dalyvavimas ligų patogenezėje:
1. MTL pakitimai dėl oksidacijos, kurią sukelia laisvieji radikalai;
2. Aktyviai dalyvauja kancerogeniniuose procesuose;
3. Cukriniu diabetu suserga pacientai dėl padidėjusio oksidacinio streso – atokoferolio, bendro
glutationo, vitamino C kiekio plazmoje sumaţėja (antioksidacinių sistemų sumaţėjimas nulemia jų
nepajėgumą kovoti su laisvaisiais radikalais).
4. Dalyvauja akių ligų patogenezėje – kataraktos vystymesi;
5. Lėtinis inkstų nepakankamumas dėl nefronų negrįţtamo pakitimo – vystosi uremija;
19
6. Miokardo išemijos – reoksigenacijos metu aktyvios deguonies formos ţalingai veikia
audinius;
7. Sąnarių ligos – reumatoidinio artrito vystymasis;
8. CNS jautrumas: neuronų ląstelių membranos lipidai turi didelį kiekį polinesočių riebiųjų
rūgščių, kurios yra pagrindinis laisvųjų radikalų substratas, tuo tarpu albumino, kuris gali veikti
kaip antioksidantas koncentracija cerebraliniame skystyje labai maţa. Taigi smegenys yra itin
jautrios laisvųjų radikalų poveikiui.
9. Alzheimer„io liga, amiopatinė lateralinė sklerozė, Parkinsono liga, degeneracinių ligų
atsiradimas (vėţys ir širdies ligos).
Molekuliniu lygmeniu laisvieji radikalai vykdo tokias neigiamas reakcijas.
2 lentelė. Laisvųjų radikalų poveikis ląstelės struktūroms.
Makromolekulė Poveikis makromolekulei
Baltymai 1. Greitas irimas;
2. Sumaţėjęs fermentų aktyvumas;
3. Membranos paţeidimas.
Lipidai 1. Membranos paţeidimas;
2. MTL oksidacija;
3. Antrinių produktų (aldehidų) susidarymas.
DNR 1. Mutacijos.
Angliavandeniai 1. Receptorių pokyčiai.
Visi makromolekuliniai pokyčiai nulemia pokyčius ląsteliniame, dėl to vyksta membranų
paţeidimai, dėl DNR pokyčių sutrinka visas baltymų apykaitos ciklas, pakinta genetinė informacija,
sudarydama galimybą atsirasti mutacijoms [14].
1.10. Antioksidaciniai procesai bei medžiagos. Antioksidantai žaliojoje arbatoje
Antioksidantai – tai medţiagos, saugančios nuo ţalingo oksidacinių reakcijų poveikio,
galinčios sumaţinti laisvųjų radikalų veikimą ir stabdyti jų susidarymą. Lėtina senėjimo procesus,
sumaţina riziką sirgti lėtinėmis ligomis, išlaiko ląstelių strutūrą ir vientisumą. Juos galima
sugrupuoti į 3 grupes:
1. Junginiai, prijungiantys laisvuosius radikalus (karotinoidai, flavonoidai);
2. Fermentai, ardantys aktyviąsias deguonies formas – antioksidaciniai fermentai;
3. Antioksidaciniai vitaminai (vitaminai C ir E) [5].
Įprastomis sąlygomis kūno ląstelės apsaugotos antioksidantais. Jei šių medţiagų organizme
pritrūksta arba padaugėja laisvųjų radikalų kiekis, ląstelės suardomos arba sensta, nes negali
20
regeneruoti. Odoje dėl pagreitinto odos senėjimo anksti atsiranda raukšlių, oda tampa suglebusi ir
pavargusi. Fermentai antioksidantai: superoksido dismutazė superoksidą paverčia vandenilio
peroksidu, kurio suirimą katalizuoja katalazė, glutationo peroksidazė – pagrindinis fermentas,
neutralizuojantis peroksido radikalinį poveikį. Taip pat yra grupė antioksidantų, kurie nutraukia
grandinines radikalines reakcijas (veikia nefermentiniu būdu). Tai yra maţos molekulės, kurios gali
priimti elektroną iš radikalo, taip jį nukenksmindamos.
Antioksidantai, tokie kaip vitaminai C ir E, yra pagrindinės gynybos priemonės prieš
aktyvias deguonies formas, tačiau vaisiuose bei darţovėse didţiausią antioksidantų aktyvumą lemia
fenolinės rūgštys ir flavonoidai, maţiau – vitaminai C, E ir β-karotinai.
Lipidinės terpės antioksidantai, stabdantys laisvųjų radikalų susidarymą arba šalinatys juos
membranose, lipoproteinų dalelėse, taip pat apsaugo lipidus po peroksidacijos (vitaminas E,
redukuotas koenzimas Q10, flavonoidai, antocianinai) [6].
Antioksidantai, nutraukiantys grandinines laisvųjų radikalų susidarymo reakcijas
vandeninėje terpėje (vitaminas C, plazmoje esantys baltymai su tiolio grupe – albuminas,
transferinas).
Flavonoidai – pagrindiniai junginiai augalinėje ţaliavoje, pasiţymintys
antioksidaciniu poveikiu. Veikdami kaip antioksidantai, jie neutralizuoja laisvųjų radikalų perteklių,
kuris ţmogaus organizme susidaro medţiagų apykaitos metu.
Antioksidaciniu aktyvumu augalinėse ţaliavose pasiţymi šie fenoliniai junginiai:
flavonoidai (kvercetinas, izokvercetinas, kemferolis, astragalinas, rutinas, katechinas), flavonoidų
pogrupiai: izoflavonai (daidzeinas, genisteinas), katechinai, antocianinai, fenolinės rūgštys,
ksantoinai, stilbenai,antrakvinonai kafeeokvininės rūgštys, vitaminai (askorbo rūgštis, α-
tokoferolis), rozmarininė rūgštis, karnozininė rūgštis, karnozolis [37].
21
2. EKSPERIMENTINĖ DALIS
2.1.Medžiagos ir metodai
2.1.1. Medžiagos ir tirpikliai
Tirpikliai:
1) Bidistiliuotas vanduo (Vytauto Didţiojo Universiteto laboratorija, ruošiamas vandens
valymo sistema Firstreem Cyclo, Anglija );
2) CH3OH – metanolis, 99,5% (BARTA a CIHLAR, spol. s r. o. Čekija);
3) C2H5OH – etanolis, 96 % (UAB „Stumbras“ Lietuva);
4) Acetonas (Lachema, Čekija).
Rūgštys:
1) TFR – trifluoracto rūgštis, 98% (Merck, Vokietija);
2) H3PO4 – fosrofo rūgštis, 85% (Reachim, Rusija).
Reagentai:
1) Folin – Ciocalteau fenolinis reagentas (Sigma, Šveicarija);
2) DPPH* – 2,2- difenil-1-pikrilhidrazil hidratas (Sigma-Aldrich, JAV);
3) ABTS* - 2,2„-azino-bis-(3-etilenbenztiazolin-6-sulfono rūgštis (Sigma-Adrich, JAV);
5) KH2PO4 – kalio dihidrofosfatas (Carl Roth GmbH Co. Lauersruhe, Vokietija);
6) KCl – kalio chloridas (BDH Laboratory Suplies Poole, Didţioji Britanija);
7) K2S2O8 – kalio persulfatas (Merck, Vokietija);
8) Na2SO4 – natrio sulfatas (Reachim, Rusja);
9) NaCl – natrio chloridas (Carl Roth GmbH Co. Lauersruhe, Vokietija);
10) Na2CO3 – natrio karbonatas (Merck, Vokietija).
Medţiagos standartams:
1) Kofeinas 3 mg/25 ml tirpinta metanolyje (Sigma, Vokietija);
2) Galo rūgštis 2 mg/25 ml tirpinta metanolyje (Sigma, Vokietija);
3) Rutinas 2 mg/25 ml tirpinta metanolyje (Sigma, Vokietija);
4) Epigalokatechinas 3 mg/25 ml metanolyje (Sigma, Vokietija).
Analizei naudota ţaliosios arbatos ţaliava, pirkta 2008 metais įprastinėje prekybvietėje.
Ţaliavos rūšių pasirinkimo pagrindimas: ţaliavos parenkamos pagal statistinius prekybos tinklo
,,VP Market“ prekybos duomenis, vertinant arbatų populiarumo bei kainos rodiklius. Pagrindinės
ţaliavų ypatybės: turi būti grynos, be jokių priemaišų (kvapą, skonį suteikiančių medţiagų), rūšiniu
poţiūriu tai turi būti vienarūšė arbata (C. sinensis L.), o ne vaistaţolių mišinys.
22
2.1.2. Žaliosios arbatos vandeninių ištraukų paruošimas
Ţaliosios arbatos vandeninių ištraukų gamybos metodai:
1) Buitinis ţaliosios arbatos paruošimo metodas. Tokia vandeninė ištrauka ruošiama
santykiu 1:10, atsiţvelgiant į ţaliosios arbatos lapų sugerties koeficientą 2. Gamybos technologija:
smulkinti arbatos lapeliai (kurių diametras ne didesnis nei 5 mm, pagal straipsnį FS-B22:2002 ir
Eur.Ph.01/2002,2.1.4) uţpilami verdančiu 100oC temperatūros vandeniu. Aušinama, ir atskiras
arbatos porcijos paimamos po 10, 20, 30 minučių nuo arbatţolių uţpylimo vandeniu momento.
2) Uţpilo gamyba. Pagal straipsnį FS-B23:2002 uţpilas ruošiamas atitinkamais santykiais
(kaip ir buitiniu metodu), atsiţvelgiant į ţaliavos sugerties koeficientą. AŢ dedama į infundirę,
kurioje yra įpiltas atitinkamas kiekis vandens (taip pat apskaičiuojamas pagal ţaliavos kiekį,
atsiţvelgiant į sugerties koeficientą). Uţpilas kaitinamas 15 min., aušinamas 45 min.
3) Nuoviro gamyba. Pagal straipsnį FS-B23:2002. Gamybos technologija analogiška uţpilų
gamybai. Skiriasi kaitinimo (30 min.) ir aušinimo (15 min.) laikai.
Uţpilų bei nuovirų gamybai naudojamos infundirės, besiskiriančios krepšelio tinklelio porų
diametru.
3 pav. Infundirės, naudojamos uţpilų bei nuovirų gamyboje, jų technologiniai skirtumai.
2.1.3. Žaliosios arbatos metanolinių ekstraktų paruošimas
Metanolinių ţaliosios arbatos ekstraktų paruoša: 1 gramas susmulkintos augalinės ţaliavos
uţpilama 10 ml 75 % metanoliu ir paliekama 24 valandoms purtytis purtyklėje. Gautas ekstraktas
filtuojamas per filtrinį popierių ir paruošiamas kietafazės ekstrakcijos etapui.
23
Kietafazė ekstrakcija
Kietafazės ekstrakcijos metodas skirtas išvalyti analizuojamiems junginiams, sukoncentruoti
juos bei suformuoti atitinkamą analizuojamos ištraukos tūrį [13].
Kietafazė metanolinių ţaliosios arbatos ekstraktų analizė atlika naudojant kietafazės
ekstrakcijos vakuuminį kolektorių „Supelco Visiprep“ (JAV) ir 1 ml tūrio 0,1 g sorbento KFE
šerdeles „LiChlorut RP - 18“ (Merck, Vokietija). Pradinės analizės sąlygos buvo paimtos iš
gamintojo katalogo ir pavaizduotos 3 lentelėje:
3 lentelė. Kietafazės ekstrakcijos sąlygos.
KFE ţingsniai KFE sąlygos
Šerdelės kondicionavimas 1 ml 75 % CH3OH
Šerdelės kondicionavimas 3 ml H2O pH 2 (privesta su TFR)
Bandinio išplovimas Ţaliosios arbatos vandeninė ištrauka 1:10
(1 g sausos medţiagos/10 ml vandens)
Priemaišų plovimas 3 ml H2O pH=2 (privesta su TFR)
Švirkšto dţiovinimas 5 min. vakuumuojama
Analičių reabsorbcija 1 ml 75 % CH3OH
2.1.4. Nuodžiūvio nustatymas (pagal Eur. Ph. 01/2002, 2.2.32)
Į 105oC iškaitintą porcelianinę lėkštelę pilama 2 ml atitinkamos arbatos vandeninės
ištraukos ir tokia lėkštelė su arbata kaitinama 105oC temperatūroje 2 valandas. Nuodţiūvis
apskaičiuojamas, iš iškaitintos lėkštelės su arbata masės atimant tik iškaitintos lėkštelės (be arbatos)
masę [18].
2.1.5. Fenolinių junginių kiekio nustatymas, pritaikant spektrofotometrinį metodą
Pastaruoju metu fenolinių junginių analizei skiriamas didelis dėmesys dėl plataus jų
panaudojimo masto vaistų, kosmetikos, maisto
pramonėse [2].
Būtina paminėti, kad flavonoidų ir fenolinių
junginių analizei augaliniuose ekstraktuose reikalingi
efektyvūs, jautrūs ir atrankūs metodai, leidţiantys
aptikti ne tik kokybinę, bet ir tikslią kiekybinę
informaciją, kuri yra pakankamai informatyvi atskirų
fenolinių junginių, jų poklasio - flavonoidų ir jų
glikozidų kiekių įvairovei ţaliavos ėminiuose įvertinti.
Spektrofotometrinė analizė pagrįsta
elektromagnetinio srauto absorbcija analizuojamosios
medţiagos molekulėmis, jonais ar kompleksais UV, regimajame ir infraraudonajame spektre. Šio
4 pav. Spektrofotometras „Unicam
Helios alfa“ (Unicam, Cambridge, UK)
24
analizės metodo pranašumas yra tas, kad tiriamoji medţiaga nesuardoma, o tyrimo metodikos
lengvai modifikuojamos ir automatizuojamos. Spektrine analize galima nustatyti nedidelius
medţiagų kiekius netgi pakankamai sudėtingose sistemose.
Suminiai fenolinių junginių kiekiai nustatyti spektrofotometrijos metodu, naudojant
„Unicam Helios alfa“ (Unicam, Cambridge, UK) spektrofotometrą. Bendras fenolinių junginių
kiekis nustatomas ekstraktą veikiant Folin – Ciocalteau ir natrio karbonato tirpalais. Duomenys
įvertinti pagal galo rūgšties etaloninio tirpalo gradavimo grafiko tiesinės regresijos lygtį. Galo
rūgštis pasirenkama dėl literatūros šaltiniuose nurodytos jos svarbos ţaliosios arbatos sudėtyje bei
galimybės nustatyti ją kiekybiškai [12]. Fenolinių junginių kiekis nustatomas su Folin – Ciocalteau
reagentu, kai standartas – galo rūgštis. Folin - Ciocalteau reagentas skiedţiamas vandeniu santykiu
1:10 ir 5 ml šio skiedinio pilama į 1 ml tiriamosios vandeninės ištraukos. Melsva spalva išgaunama,
pridėjus 4 ml 7,5 proc. Na2SO4 tirpalo distiliuotame vandenyje. Spektrofotometrija vykdoma po 30
min., esant 765 nm bangos ilgiui.
2.1.6. Bendro antioksidacinio aktyvumo nustatymas, atliekamas, naudojant DPPH*
radikalo ir ABTS* radikalo surišimo testą
Fenoliniams junginiams būdingas antioksidacinis aktyvumas dėl jų gebėjimo deaktyvuoti
laisvuosius radikalus. Laisvajam radikalui atiduodamas vandenilio atomas arba elektronas.
Antioksidaciniam aktyvumui įvertinti taikomas spektrofotometrinis DPPH*
radikalų deaktyvinimo
nustatymo metodas. Šio metodo privalumai - nesudėtingas, nebrangus, greitas ir tikslus.
Antioksidantas atiduoda vandenilio atomą ir taip neutralizuoja pavojingą laisvųjų radikalų poveikį
(R•). Paveikti DPPH
*, radikalai virsta stabiliais DPPH – H tipo junginiais [16] (5 pav.).
DPPH*
turi išskirtinį pranašumą tarp kitų radikalų testų, kadangi jie yra labai paprasti, greiti,
atkuriami ir jų veikimo mechanizmas yra ţinomas. Tačiau DPPH*
testo trūkumas, kaip ir visų kitų
metodų, naudojant dirbtinius radikalus, yra tiesioginės koreliacijos trūkumas tarp pripaţinto
antioksidantinio aktyvumo ir jo apsauginių savybių tikrame tyrimo objekte - ţaliojoje arbatoje.
Be laisvųjų radikalų surišimo testų, kurie naudoja dirbtinius radikalus, yra ir kitų sisteminių
testų, kurie naudoja natūralių rūšių radikalus, tokius kaip O2* (generuojama fermentinės sistemos),
OH* ir kt.
Skirtingai nuo DPPH*
(nustatomas tiesiogiai be paruošimo), ABTS*
turi būti generuojamas
fermentiškai (peroksidazė, mioglobinas) arba cheminėmis (mangano dioksidas, kalio persulfatas)
reakcijomis. Kitas svarbus skirtumas tarp šių dviejų tipų radikalų, kad DPPH*
gali būti ištirpintas
tik organiniuose tirpikliuose (ypač tinka alkoholiai), tuo tarpu ABTS*
gali būti tirpinamas ir
vandeniniuose, ir organiniuose tirpikliuose [17].
Antioksidacinis aktyvumas nustatomas pagal DPPH* radikalo sujungimą [14]. DPPH
*
tirpalo paruošimas: 0,01183 g DPPH* iki 100 ml uţpilama 96% etanoliu. Sumaišoma 2,5 ml šio
25
tirpalo ir 0,5 ml tiriamos ţaliosios abatos vandeninės ištraukos. Po 16 min spektrofotometru, esant
bangos ilgiui 515 nm, matuojama absorbcija, kai palyginamasis tirpalas - 96% etanolis.
Antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas inaktyvuoto DPPH* radikalo kiekio procentais (DPPH
*
inaktyv. proc.).
Suminis antioksidacinio aktyvumo nustatymas AŢ apskaičiuojamas naudojantis formule:
.)%.(%100 procinaktDPPHA
AA
B
AB
(4 formulė)
Čia:
AB – palyginamojo (tuščiojo) tirpalo absorbcijos dydis
AA – tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis
ABTS* radikalas gaunamas reaguojant ABTS
* su kalio persulfatu. Radikalas gaminamas
laikant ABTS* ir K2S2O8 mišinį tamsoje 16 valandų. Gamybos technologija: gaminami 2 tipų
tirpalai: 1) 0,0549 g ABTS*
reagento tirpinama 50 ml PBS (phosphate buffered saline) tirpalo; 2)
0,0038 g K2S2O8 tirpinama 0,2 ml vandens. Šių tirpalų mišinys, išlaikytas 15 - 16 valandų kambario
temperatūroje, naudojamas kaip reagentas antioksidaciniam aktyvumui ištirti. Katijoninė radikalo
forma stabili išlieka 2 paras. Antioksidaciniam aktyvumui įvertinti ABTS* praskiedţiamas fosforo ir
druskos buferiniu tiepalu (PBS). Antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas ABTS* inaktyvinimo
procentais ir apskaičiuojamas pagal tą pačią formulę kaip ir taikant DPPH* radikalo sujungimo
metodą.
ABTS* metodikai būtina pagaminti PBS (pH 7,4 – fosfatinis druskos buferis). PBS gamybos
technologija – 8,18 g NaCl, 0,27 g KH2PO4, 1,42 g Na2HPO4 ir 0,15 g KCl ištirpiama 1 litre ultra
švaraus vandens. Jei tirpalo pH maţesnis uţ 7,4, pilama koncentruoto NaOH tirpalo iki reikalingos
pH reikšmės.
ABTS
+e- -e
-
S-O
3+NH
4
N
S
N
C2H
5
S
N
N
C2H
5H4 N+O
3-S
O S
.+
S-O
3+NH
4
N
S
N
C2H
5
S
N
N
C2H
5
H4 N+3-
SO
N
S
N
C2H
5
H4 N+3-
S-O
3+NH
4
S
N
N
C2H
5
+
+ROH
ABTS.+
+ RO.
N
N
NO2
NO2
O2N
...
..
+ AH
N
NH
NO2
NO2
O2N
+ A.
5 pav. ABTS
* ir DPPH
* surišimo reakcijos.
26
2.1.7. Žaliosios arbatos kokybinės sudėties nustatymas ESC metodu
Plačiausiai fenolinių junginių kiekybinei ir kokybinei analizei naudojama ESC, susieta su
diodų matricos (DAD), UV ir masių spektroskopiniu (MS) detektoriais.
ESC pasirinktas kaip patikimas daugiakomponenčių mišinių tyrimo metodas. Šis analizės
metodas leidţia kokybiškai ir kiekybiškai analizuoti tam tikrų gamtinių junginių augalinių ištraukų
sudedamąsias dalis. Atsiţvelgiant į ekstrahuotų komponentų sulaikymo laiką kolonėlėje, smailių
plotus, bei tam tikrų smailių plotų santykius, o taip pat pagal rezultatus, gautus lyginant smailes su
flavonoidų ir kitų fenolinių etalonų ESC smailėmis, galima daryti išvadas apie arbatų kokybinius
bei kiekybinius parametrus. Nors ESC metodas literatūroje aprašomas kaip tinkamesnis, pigesnis ir
paprastesnis metodas fenolinių junginių analizei, tačiau šio metodo trūkumai yra ilgas analizės
laikas, didelės tirpalų sąnaudos bei maţa skiriamoji geba. Nustatant fenolinius junginius
tiriamajame tirpale ESC metodu, daţnai naudojamas gradientinis skirstymas. Atvirkščių fazių
chromatografijai tinka C8 arba C18 kolonėlės. Eliuavimui naudojamas vanduo ir metanolis.
Atskyrimui tinkamiausias pH palaikomas į eliuentus pridedant skruzdţių rūgšties, acto rūgšties,
TFA (trifluoracto rūgštis) ar fosfatinių buferių [11]. Pastaruoju atveju, atsiţvelgiant į straipsnius,
pasirenkamas H3PO4 parūgštintas H2O pH privedamas iki 3).
6 pav. ESC sistema su reakcijos detektoriumi.
ESC analizė atlikta naudojant ESC sistemą, kurios pagrindinės dalys yra: judrios fazės
rezervuarai, siurblys, injektorius, C18 kolonėlė, UV detektorius, DPPH* tiekimo siurblys su
reakcijos kilpa, kompiuteris (registruoja duomenis).
27
Detalesnė ESC įrangos apţvalga:
1) Švirkštinis periodinio veikimo siurblys „Phoenic 20 CU“ (Carlo Ebra instruments,
Italija); degazatorius „Series 1100“ (Hewlett Packard, Japonija);
2) Nuolatinio veikimo siurblys „Series 1100“ (Hewlett Packart, Japonija);
3) Autoinjektorius „Series 200“ (Prekin Elmer, JAV);
4) UV detektorius „Spectra 200“ (Spectra Physics, JAV);
5) Kolonėlė C18, uţplikdyta silikageliniu sorbentu su oktadecilsilanolinėmis grupėmis.
Parametrai: ilgis 250 mm, skersmuo 3mm, įkrovos dalelių skersmuo 5 μm (Knauer, Vokietija);
6) UV – regimosios šviesos detektorius „Spectra 100“ (Spectra Physics, JAV);
Duomenys registruojami ir analizuojami programa ChromStar 3.25S versija.
ESC sąlygos optimizuojamos pagal esamą įrangą.
28
2.2. Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas
2.2.1. Žaliosios arbatos žaliavos vandeninių buitiniu metodu paruoštų ištraukų sauso
likučio, fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimo rezultatų aptarimas.
Spektrofotometrijos metodu nustatyti suminiai fenolinių junginių kiekiai, antioksidacinis
aktyvumas, gravimetriniu metodu nustatytas ţaliosios arbatos skirtingų rūšių nuodţiūvis (sausas
likutis). Sausas likutis parodo bendrą iš arbatos ţaliavos išsiekstrahavusių medţiagų kiekį. Jį
tikslinga tirti, norint suţinoti, koks yra veikliųjų medţiagų (šiuo atveju - fenoliniai junginiai)
santykis su visomis išsiekstrahuojančiomis medţiagomis.
Tyrimo rezultatai parodė, kad didţiausias fenolinių junginių kiekis būdingas arbatai
„Majski“ (60 mg/g), atitinkamai fenolinių junginių kiekis maţėja arbatose „Banča“ (29,41 mg/g),
„Dilmah“ ir „Maxima“ (kiekiai labai panašūs, atitinkamai 25,73 ir 25 mg/g).
Sausas likutis didţiausas arbatoje „Majski“ (221,67 mg/g), atitinkamai maţiausias arbatos
„Maxima“ buitiniu metodu po 30 min. ekstrahavimo pagamintoje ištraukoje (146,67 mg/g).
Antioksidacinis aktyvumas didţiausias arbatos „Banča“ (73,44 proc. pagal DPPH* ir 74,25 proc.
pagal ABTS* radikalus), atitinkamai maţėja arbatose „Majski“, „Dilmah“, „Maxima“.
0
50
100
150
200
250
10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30
B anča Maxima Majs ki Dilmah
Arba tos
Ko
nc
en
tra
cij
a,
mg
/g
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
An
tio
ks
ida
cin
is a
kty
vu
ma
s
bendras fenolinių
junginių kiekis
mg/gs aus as likutis
mg/g
DPPH (% )
7 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio, bendro antioksidacinio aktyvumo ir sauso likučio
palyginimas ţaliosios arbatos ţaliavų buitiniu metodu paruoštose vandeninėse ištraukose.
29
Sauso likučio ir fenolinių junginių kiekiai tiesiogiai proporcingi (7 pav., 4 lentelė). Kuo
daugiau išsiekstrahuoja bendrai įvairių medţiagų, tuo daugiau išsiekstrahuoja ir vienos iš tų
medţiagų frakcijų – fenolinių junginių.
Ekstrahavimo laiko ir fenolinių junginių bei sauso likučio kiekio sąryšis tiesioginis (kuo
ilgiau vyksta ekstrahavimas (jis baigiamas po 30 min.), tuo didesni sauso likučio bei fenolinių
junginių kiekiai). Tuo tarpu ekstrahavimo laikas ir antioksidacinis aktyvumas ne visada yra
tiesiogiai proporcingi (arbatose ,,Maxima“ bei ,,Dilmah“, ilgėjant ekstrakcijos laikui,
antioksidacinis aktyvumas maţėja). Taigi galima daryti išvadą, kad fenolinių junginių kiekis ne
visada tiesiogiai susijęs su jų kokybe. Dėl to tikslinga atlikti detalesnius kokybinius bei kiekybinius
buitinių arbatų ištraukų tyrimus.
4 lentelė. Ţaliosios arbatos ištraukų bendro fenolinių junginių, antioksidacinio aktyvumo ir
sauso likučio tyrimo rezultai skaitine išraiška.
Pagal tyrimo rezultatus, galima spręsti, kad sauso likučio kiekis didėja, ilgėjant
ekstrahavimosi laikui. Sauso likučio kiekis priklauso ir nuo laiko, ir nuo arbatos rūšies (didţiausias
kiekis – 221,67 mg/g yra arbatoje „Majski“ po 30 min. ekstrahavimosi). Bendras fenolinių junginių
kiekis tiesiogiai koreliuoja su sauso likučio kiekiu – kuo didesnis sauso likučio kiekis, tuo didesnis
fenolinių junginių kiekis („Majski“ arbatos atveju šie parametrai atitinkamai yra 60,00 mg/g ir
221,67 mg/g (po 30 min. ekstrakcijos)).
Vėlesnėse tyrimo stadijose buvo lyginamas antioksidacinių vandeninių ţaliosios arbatos
ištraukų tyrimo efektyvumas ir, esant kurio nors metodo netobulumui, jis buvo optimizuojamas.
Tyrimo objektas DPPH (%) Bendras fenolinių junginių kiekis mg/g Sausas likutis mg/g
Banča po 10 min. 68,41 22,439 95
Banča po 20 min. 71,95 25,74 145
Banča po 30 min. 73,44 29,413 158,33
Maxima po 10 min. 54,47 18,218 123,33
Maxima po 20 min. 48,62 22,98 153,33
Maxima po 30 min. 43,55 25,006 168
Majski po 10 min. 59,86 38,869 146,67
Majski po 20 min. 65,02 54,953 197,67
Majski po 30 min. 66,7 60,004 221,67
Dilmah po 10 min. 56,34 20,078 121,67
Dilmah po 20 min. 53,64 23,262 146,67
Dilmah po 30 min. 50 25,731 148,67
30
8 pav. Buitiniu metodu paruoštų ţaliosios arbatos ištraukų bendro antioksidacinio aktyvumo
tyrimo palyginimas, tiriant skirtingais radikalų surišimo testais (DPPH* ir ABTS
*).
Bendras antioksidacinio aktyvumo testas reikšmingas, nes nusako tiriamųjų objektų
gebėjimą surišti laisvuosius radikalus organizme (pagrindinius vėţinių susirgimų, mutagenezės
iniciatorius). Tiriant abejais metodais, pastebėti panašūs dėsningumai atitinkamose arbatose. Prieš
tai optimizuotas tyrimas ABTS* radikalu, kadangi arbatose esantys veiklieji junginiai dideliu
procentingumu sureaguodavo su radikalo tirpalu. Kad to išvengti ir tyrimą padaryti efektyviu,
arbatų buitiniu metodu paruoštos ištraukos buvo skiedţiamos 2 kartus ir tik po to veikiamos laisvojo
radikalo ABTS* tirpalu. Iš gautų duomenų, įvertinus praskiedimą, buvo apskaičiuojamas
antioksidacinis aktyvumas. Abejais tyrimų atvejais akivaizdu, kad didţiausiu antioksidaciniu
aktyvumu pasiţymi arbata „Banča“. Antioksidacinis aktyvumas atitinkamai maţėja arbatose
„Majski“, „Dilmah“, „Maxima“. Ekstrahavimo laiko ir antioksidacinio aktyvumo sąryšis priklauso
nuo arbatos rūšies. Arbatose „Banča“ ir „Majski“ antioksidacinis aktyvumas didėja, ilgėjant
ekstrahavimo laikui, tuo tarpu arbatose „Maxima“ ir „Dilmah“ antioksidacinis aktyvumas maţėja,
ilgėjant ekstrahavimo laikui.
2.2.2. Užpilų ir nuovirų kokybės, priklausomos nuo technologinių parametrų, tyrimas
Pagamintų ţaliosios arbatos uţpilų ir nuovirų kokybė pirminiame etape buvo įvertinta,
nustatant sauso likučio kiekius gravimetriniu metodu. Uţpilai bei nuovirai buvo gaminami,
naudojant dviejų tipų porcelianines infundires, kurių krepšelio tinklelio porų diametras skyrėsi (3
pav., 22 psl.). Esant tinkleliui su didesnėmis poromis, išsiekstrahavusių medţiagų kiekis buvo apie
2 kartus didesnis, lyginant su tinkleliu, kurio krepšelio ţaliavai sudėti tinklelio angelių diametras
buvo maţesnis. Lyginant uţpilų bei nuovirų sauso likučio kiekį su buitiniu metodu ruoštomis
ţaliosios arbatos ţaliavos vandeninėmis ištraukomis, galima daryti išvadą, kad, esant tinkleliui su
didesniu porų diametru, sauso likučio bei fenolinių junginių kiekis uţpiluose bei nuoviruose
didesnis uţ buitiniu metodu paruoštas ţaliosios arbatos ţaliavos vandenines ištraukas. Šiame
31
procese itin aktualūs difuzijos/ekstrahavimo parametrai (13-15 psl.). Tuo tarpu naudojant infundires
su didenio porų diametro tinkleliu, sauso likučio kiekis uţpiluose bei nuoviruose buvo maţesnis uţ
buitiniu metodu ruoštų vandeninių ištraukų bei uţpilų ir nuovirų, ruoštų infundirėse su didesnio
angelių diametro tinkleliu atitinkamas charakteristikas. Fenolinių junginių tyrimui pasirinkta uţpilus
bei nuovirus gaminti infundirėje su didesnio angelių diametro tinkleliu, kadangi, tiriant arbatų
uţpilus bei nuovirus, nustatyta, kad infundirėje su tokiu tinkleliu išsiekstrahuoja daugiau medţiagų.
Tyrimo metu buvo nustatyta, kad technologinis parametras, infundavimo krepšelio tinklelio porų
skersmuo, daro įtaką ţaliosios arbatos nuovirų bei uţpilų kokybei (9 pav). 9 paveiksle matyti, kad
uţpilus bei nuovirus gaminant infundirėje su krepšeliu, kurio tinklelio porų diametras maţesnis,
išsiekstrahavusių medţiagų kiekis sumaţėja 45 – 55 proc.
0
50
100
150
200
250
Banča Maxima Majski Dilmah
mg
/g užpilai
nuovirai
0
50
100
150
200
250
Banča Maxima Majski Dilmah
mg
/g užpilai
nuovirai
9 pav. Ţaliosios arbatos ţaliavos uţpilų bei nuovirų sauso likučio kiekio priklausomybė nuo
infundirės krepšelio tinklelių tipo.
Skaitine išraiška pastebimi ţenkliai skirtingi rezultatai, lyginant sauso likučio kiekį, gautą iš
skirtingų infundirių. Vertinant rūšinį ţaliosios arbatos ţaliavų sauso likučio kiekių skirtumą,
atrandami sutapimai su buitiniu metodu ruošiamomis ištraukomis (t.y. sauso likučio kiekio
pasiskirstymas yra panašus tiek buitiniu metodu ruošiamose arbatose, tiek uţpiluose, tiek
nuoviruose). Dėl to galima daryti išvadą, kad bendras išsiekstrahavusių medţiagų sumaţėjimas,
ruošiant uţpilus bei nuovirus infundirėje su tankesniu ţaliavos krepšelio tinkleliu, yra tiesiogiai
susijęs su įrangos technologiniais parametrais.
5 lentelė. Sauso likučio skirtingose ţaliosios arbatos ţaliavų uţpiluose bei nuoviruose,
naudojant skirtingas infundires, palyginimas.
Infundirė su didesniu
tinkelio porų diametru
Infundirė su maţesniu
tinkelio porų diametru
32
Gavus sauso likčio kiekio rezultatus, tiriant uţpilus bei nuovirus, pagamintus su
skirtingomis infundirėmis, galima daryti išvadą, kad technologiniai parametrai itin aktualūs uţpilų
bei nuovirų kokybei. Infundirėje su didesnio porų diametro tinkleliu pagamintuose uţpiluose ir
nuoviruose buvo atitinkamai vidutiniškai 2,13 daugiau bendrų išsisekstrahavusių medţiagų negu
infundirėje, kurios krepšelio tinklelio poros turėjo maţesnį skersmenį.
Ţaliosios arbatos ţaliavos uţpilų bei nuovirų bendras fenolinių junginių kiekis buvo
tiriamas, siekiant įvertinti atskirų ţaliųjų arbatų rūšių kokybę ir ją palyginti su buitiniu metodu
paruoštomis vandeninėmis ištraukomis.
0
10
20
30
40
50
60
70
Banča Maxima Majski Dilmah
mg
/g užpilai
nuovirai
10 pav. Fenolinių junginių kiekis ţaliosios arbatos uţpiluose bei nuoviruose.
Kaip matyti iš 10 paveiksle pateiktų tyrimo rezultatų, ţaliosios arbatos uţpilų ir nuovirų
fenolinių junginių kiekis priklauso ne tik nuo paruošiamos ištraukos formos (t.y. uţpilų ar nuovirų),
bet ir nuo ţaliavos rūšies. Didţiausias kiekis fenolinių junginių nustatytas arbatoje „Majski“ tiek
uţpilų, tiek nuovirų atveju (atitinkamai 65.71 ir 66,22 mg/g fenolinių junginių). Rūšiniu atţvilgiu,
duomenys atitinka buitiniu metodu paruoštų arbatų tyrimo rezultatus. Lyginant uţpilus bei nuovirus
kaip vaistinę formą su buitiniu metodu paruoštomis arbatomis, gaunamos aukštesnės kokybės (ji
apibūdinama fenolinių junginių kiekiu) ištraukos. Nuovirų pranašumas uţpilų atţvilgiu aiškinamas
ilgesne virimo trukme (30 min.). Nuovirų ir uţpilų pranašumas buitiniu metodu gautų ištaukų
atţvilgiu aiškinamas geriau šiam procesui pritaikyta aparatūra bei virimo/aušinimo optimaliu
santykiu.
Infundirė su krepšeliu ţaliavai, kai
tinklelio porų diametras didesnis
Uţpilas (mg/g) Nuoviras (mg/g)
Banča 159,25 165,35
Maxima 169,3 175,4
Majski 235,95 245,37
Dilmah 153,23 154,6
Infundirė su krepšeliu ţaliavai, kai
tinklelio porų diametras maţesnis
Uţpilas (mg/g) Nuoviras (mg/g)
Banča 75,45 76,25
Maxima 82,27 83,56
Majski 105,3 110,47
Dilmah 72,69 75,99
33
2.2.3 Žaliosios arbatos žaliavų veikliųjų medžiagų kokybės ir kiekybės tyrimas,
pritaikant ESC metodą
Kokybiškai junginiai identifikuojami ESC metodu, kuris pagrįstas etalono sulaikymo
trukmės atitikimu su analitės sulaikymo trukme. Tam, kad būtų atlikas kokybinis tyrimas, reikia
optimizuoti literatūroje rastas ESC sąlygas pagal esamą aparatūrą. Turi būti koreguojami šie
parametrai – tyrimo bendras laikas, tiriamosios ištraukos skiedimas, gradientas
(organinio/neorganinio tirpiklio procentinė sudėtis), detekcijai naudojamos bangos ilgis (nm).
Optimizuojant tyrimo sąlygas, padidinamas atskirų komponentų atskiriamumas, padedantis geriau
identifikuoti junginius (11 pav.).
11 pav. Ţaliosios arbatos „Banča“ vandeninės ištraukos po 10 min. veikliųjų medţiagų
identifikavimo ESC metodu rezultatai.
Literatūroje rastos sąlygos netenkina, kadangi medţiagų atskiriamumo kriterijus yra labai
maţas, taip pat meţiagos pradeda per vėlai išeiti (t.y. galima daryti išvadą, kad parinktos
netinkamos pradinės sąlygos, netinkama pradinė eliuentų mišinio sudėtis).
6 lentelė. Pradinių ESC tyrimo sąlygų ir optimizuotų tyrimo sąlygų palyginimas.
Pagal literatūros duomenis Po optimizavimo
Gradientas CH3OH (%) H2O (%) CH3OH (%) H2O (%)
0 min. 20
10 min. 30
20 min. 40
20-24 min. 40
33 min. 90
38 min. 100
80
70
60
60
10
0
0 min. 27
20 min. 40
45 min. 70
50 min. 80
51 min. 27
73
60
30
20
73
Tėkmės greitis, ml/min. 0,4 0,3
Injekcijos tūris, μl 5 2
Detekcija, nm 270 270
0 10 20 30 40 50
0
100
200
300
Ab
so
rbcija
, m
V
Laikas, min.
_____- Pagal literatūros
duomenis
_____ - Po optimizavimo
34
Po optimizavimo, pakeičiami šie parametrai :
1) Gradientas - jį koreguojant, pasiekiama geresnis medţiagų atsiskyrimas ir greitesnis junginių
išėjimo laikas iš kolonėlės;
2) Injekcijos tūris – maţinamas, taupant analitę;
3) Tėkmės greitis – maţinamas dėl kolonėlės uţsikimšimo ir susidarančio per didelio slėgio;
4) Bangos ilgis nekeičiamas, kadangi literatūroje jis įvardijamas kaip optimalus bangos ilgis
katechinams aptikti (6 lentelė).
Veiklieji junginiai tiriamuosiuose objektuose identifikuojami, naudojant išorinius standartus.
Pasirinkti 2 flavonoidai (epigalokatechinas, rutinas), 1 fenolinė rūgštis (galo rūgštis) ir 1
metilksantinas – kofeinas. Flavonoidai bei fenolinė rūgštis priskirtini fenolinių junginių grupei.
Junginiai identifikuojami, nustačius identiškus tiriamuosiuose objektuose esančių junginių ir
standartų sulaikymo laikus.
0 10 20 30 40 50 60
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Ab
so
bcija
, m
V
Laikas, min.
kofeinas
0 10 20 30 40 50 60
0
20
40
60
80A
bso
rcija
, m
V
Laikas, min.
galo r.
0 10 20 30 40 50 60 70
0
20
40
60
Ab
so
rbcija
, m
V
Laikas, min.
epigalokatechinas
0 10 20 30 40 50 60
0
20
40
60
Ab
so
rbcija
, m
V
Laikas, min.
rutinas
12 pav. Junginių identifikavimas ESC metodu, naudojant išorinius standartus ţaliosios
arbatos „Banča“ vandeninėje buitiniu metodu paruoštoje ištraukoje po 30 min.
Kaip pavaizduota 12 pav., identifikuoti 4 junginiai, kadangi tiriamajame objekte esančių 4
smailių išėjimo laikai atitinka standartų išėjimo laikus.
1) 2)
3) 4)
35
Atitinkamai chromatogramoje paţymimos identifikuotos medţiagos (tų medţiagų smailės).
13 pav. pavaizduota „Banča“ vandeninės, buitiniu metodu paruoštos ištraukos chromatograma su
joje atpaţintais veikliaisiais ţaliosios arbatos komponentais.
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
10
20
30
40
50
60
70A
bso
rbcija
, m
V
Laikas, min.
12
3
4
13 pav. ESC metodu ţaliosios arbatos „Banča“ vandeninėje buitiniu metodu paruoštoje
ištraukoje (po 30 min.) identifikuoti junginiai: 1 - galo r., 2 - epigalokatechinas, 3 – kofeinas, 4 –
rutinas.
Galo r. – 15,793 min.
Epigalokatechinas – 18,953 min.
Kofeinas – 24, 324 min.
Rutinas – 42, 523 min.
Siekiant išsiaiškinti, kurie junginiai pasiţymi antioksidaciniu aktyvumu, uţrašant ESC
chromatogramą, paraleliai uţrašoma ir antioksidacinio aktyvumo chromatograma, vykdant tyrimą
DPPH* radikalo surišimo metodu. DPPH
* radikalo tirpalas ruošiamas tokiu būdu – 0,5 mg DPPH
*
tirpinama 50 ml acetonnitrile ir skiedţiama santykiu 1:2 50 mM koncentracijos fosfatiniu buferiu
(pH 7,6).
0 10 20
0
20
40
Ab
so
rbcija
, m
V
Laikas, min.
galo r.
kofeinas
epigalokatechinas
36
14 pav. Ţaliosios arbatos „Banča“ vandeninės ištraukos ESC antioksidacinio aktyvumo
tyrimas. Antioksidacinis aktyvumas uţrašomas galo rūgščiai ir epigalokatechinui. Kofeinui toks
aktyvumas nenustatytas. Taigi pasitvirtina literatūros duomenys, kad šie junginiai – vieni
svarbiausių ţaliosios arbatos antioksidantų.
Tiriant ESC metodu kiekybę, pasirenkamas vienas iš identifikuotų junginių (galo rūgštis),
siekiant nustatyti jos koncentraciją ţaliavoje. Suintegravus arbatų chromatogramas, nustatomi galo
rūgšties uţimamų smailių plotai ir, sudarius kalibracinį grafiką (priedas Nr.1), apskaičiuojama galo
rūgšties koncentracija ţaliavoje.
15 pav. Suintegruota arbatos „Banča“ vandeninės ištraukos ESC chromatograma.
15 pav. ties 18,082 min. išėjimo laiku identifikuojama galo rūgšties smailė. Pasinaudojant
ChromStar 3.25S programa, integravimo būdu, suţinomas šios smailės plotas. Atitinkamai galo
rūgšties smailių plotai išmatuojami ir kitų arbatų vandenininėse ištraukose. Pagal šių plotų ir galo
rūgšties (standarto) plotų santykį, galima suţinoti galo rūgšties kiekį tiriamuosiuose objektuose (7
lentelė). Skaičiuojant galo rūgštis koncentraciją bandiniuose, įvertinamas jų praskiedimas ir
injekuojamo bandinio kiekis.
7 lentelė. Galo rūgšties koncentracija ţaliosios arbatos ţaliavoje, tiriant vandenines ištraukas
po 30 min.
arbata smailių plotas koncentracija, μg/g
Banča po 30 min. 1156380000 132,09
Maxima po 30 min. 581840000 62,44
Majski po 30 min. 848170000 94.73
Dilmah po 30 min. 757680000 83.76
37
Iš 7 lentelės duomenų akivaizdu, kad didţiausia galo rūgšties koncentracija yra vandeninėse
arbatos „Banča“ ištraukose. Atitinkamai šio junginio kiekis maţėja arbatose „Majski“, „Dilmah“,
„Maxima“. Taigi išlaikomos pagrindinės tendencijos, atrastos spektrofotometriniame fenolinių
junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrime, t.y. kuo didesnis fenolinių junginių kiekis bei
antioksidacinis aktyvumas, tuo didesnis vieno iš fenolinių junginių komponentų – galo rūgšties,
kiekis ţaliavoje. Lyginant bendrą fenolinių junginių koncentraciją, nustatytą spektrofotometriškai
(Folin – Ciocalteu metodu, kai gradavimo grafikas sudaromas pagal galo r.) su galo rūgšties
koncentracija, gauta ESC, nustatomas ţymus koncentracijų skirtumas – galo rūgštis sudaro 0,16 –
0,45 proc. visų fenolinių junginių kiekio.
2.2.4. Žaliosios arbatos kietojo preparato, žaliosios arbatos ekstrakto kapsulių
,,Sanitas“, kokybės tyrimas
Lietuvos rinkoje pateikiamas vienintelis lietuviškas ţaliosios arbatos kietas preparatas
(kapsulės), kurių kokybė įvertinta tuo pačiu kokybės parametru (fenolinių junginių kiekiu) kaip ir
ţaliosios arbatos vandeninės ištraukos. Įdomumo dėlei buvo tiriama, koks fenolinių junginių kiekis
yra vienoje kapsulėje ir kiek viena kapsulė atitinka ţaliosios arbatos ţaliavos gramų, vertinant
išsiekstrahavusius fenolinius junginius.
16 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio vandeninėse ţaliosios arbatos ţaliavų ištraukose ir
vienoje „Sanitas“ kapsulėje palyginimas.
Kapsulių ,,Sanitas“ pakuotės lapelyje teigiama, kad kiekvienoje kapsulėje yra 200 mg
ţaliosios arbatos ekstrakto, standartizuoto pagal fenolinius junginius. Vartojant po 1 kapsulę
organizmas gauna 150 mg fenolinių. Tai atitinka 2-3 puodelius ţaliosios arbatos [19]. Pagal atliktus
tyrimus, pastebėta, kad vienoje ţaliosios arbatos kapsulėje nustaytas 2,5 karto maţesnis fenolinių
junginių kiekis (apie 87 mg). Vis dėlto palyginus pakuotės lapelyje įvardintus ir realiai kapsulės
vienete rastus kiekius, vienareikšmiškai tvirtinti, kad kapsulės „Sanitas“ nėra kokybiškos nereikėtų,
29,41 25
60
25,73
86,68
0
20
40
60
80
100
Banča 1 g Maxima 1 g Majski 1 g Dilmah 1 g Kapsulė, 1
vnt.
mg
38
kadangi reikia įvertinti atitinkamus nuostolius (ekstrakto prilipimą prie filtrinio popieriaus,
pašalinant talką, ne visišką ekstrakto ištirpimą vandenyje) [10]. Lyginant kapsulių „Sanitas“ bendrą
fenolinių junginių kiekį su ţaliųjų arbatų ţaliavų ištraukų kiekiu, galima daryti išvadą, kad vienoje
kapsulėje esantis fenolinių junginių kiekis išsiekstrahuoja iš 1,5 – 3,3 g ţaliavos (priklausomai nuo
rūšies).
39
IŠVADOS
1. Pagamintos ţaliosios arbatos vandeninės ištraukos ir vertinta jų kokybė. Ištyrus
buitiniu metodu pagamintas ţaliosios arbatos ţaliavos vandenines ištraukas, nustatyta, kad
didţiausias sausas likutis bei fenolinių junginių kiekis būdingas arbatai „Majski” (atitinkamai
221,67 mg/g ir 65 mg/g), o antioksidacinis aktyvumas – arbatai „Banča” (73,44 proc. pagal DPPH*
ir 74,25 proc. pagal ABTS*), nors joje fenolinių junginių kiekis yra dvigubai maţesnis negu
arbatoje ,,Majski“. Taigi remiantis tyrimo rezultatais, tikslinga atlikti išsamesnę veikliųjų medţiagų
analizę, siekiant nustatyti atskirų junginių antioksidacinį aktyvumą.
2. Ilgėjant ekstrahavimo laikui, buitiniu metodu paruoštose vandeninėsė ţaliosios
arbatos ištraukose, išsiekstrahavusių medţiagų kiekis didėja (ištraukos vertintos po 10, 20, 30 min.).
Didţiausias medţiagų kiekis išsiekstrahuoja po 10 minučių, po to medţiagų išsiskyrimas lėtėja ir
20 minučių laikotarpyje ekstraktyvinių medţiagų kiekis padidėja 25-40 proc.
3. Pagaminus uţpilus bei nuovirus, ištirta, kad išsiekstrahavusių medţiagų kiekis
priklauso nuo infundirių krepšelio ţaliavai sudėti tipo. Kuo didesnis infundirės tinklelio porų
diametras, tuo uţpilų bei nuovirų sauso likučio bei fenolinių junginių kiekiai didesni.
4. Tyrimo rezultatų duomenimis standartiniai gamybos būdai (uţpilų, nuovirų
gamyba) yra pranašesni uţ buitinį arbatos gamybos būdą.
5. Nuovirų fenolinių junginių ir sauso likučio kiekis buvo didesni nei uţpiluose.
Taigi nuovirai – kokybiškiausia vandeninių ištraukų forma. Vertinant sausą likutį ir fenolinių
junginių kiekį nuovirai 7-10 proc. efektyvesnė forma uţ buitiniu būdu paruoštas arbatas ir 1-5 proc.
uţ uţpilus.
6. Atlikus ESC, identifikuoti keturi veiklieji ţaliosios arbatos komponetai (galo r.,
epigalokatechinas, kofeinas, rutinas). Remiantis tyrimų duomenimis, nustatyta, kad galo r. ir
epigalokatechinas pasiţymi antioksidacinėmis savybėmis.
40
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Chochlačiovas V. Viskas apie arbatą. Vilnius: Mokslas; 1992. p. 10-11.
2. Cheng TO. All teas are not created equal. The Chinese Green tea and cardiovascular
health. International Journal of Cardiology 2006; 108: 301-8.
3. Ragaţinskienė O, Rimkienė S, Sasnauskas V. Vaistinių augalų enciklopedija. Kaunas:
Lutute; 2005. p.16-17.
4. Briedis V, Kasparavičienė G. Kai kurie antioksidantų veikimo aspektai, maţinant
neigiamą laisvųjų radikalų poveikį. Biomedicina 2002; 2: 187-9.
5. Mildaţienė V, Jarmalaitė S, Daugelavičius R. Ląstelės biologija. Kaunas: Vytauto
Didţiojo universiteto leidykla; 2004. p. 171-8, 293-312, 318-321.
6. Praškevičius A, Ivanovienė L, Stasiūnienė N, Burneckienė J, Rodovičius H. Biochemija:
bendrasis vadovėlis. Kaunas: Vitae Litera; 2006. p. 274-9.
7. Rijke E, Out P. Analytical separation and detection methods for flavonoids. Journal of
Chromatography 2006; 1112: 31-63.
8. Maruška A, Kornyšova O, Machtejevas E. Efektyviosios skysčių chromatografijos
pagrindai: vadovėlis. Kaunas: Vytauto Didţiojo universiteto leidykla; 2005.
9. Leskauskas BJ, Savickas A, Švambaris LK, Valančius Z. Vaistų technologija (trečias
tomas). Kaunas: Kauno medicinos universiteto leidykla; 2002. p. 188-195.
10. Ramanauskienė K, Savickas A, Masteikova R, Muselik A, Chalupova Z. Evaluation of
quality of capsules with dry green tea extract and the investigation of their antioxidant
activity (stendinis pranešimas); 2004.
11. Bonoli M, Pelillo M, Toschi TG, Lercker G. Analysis of green tea catechins:
comparative study between HPLC and HPCE. Food Chemistry 2003; 8: 631-8.
12. Povilaitytė V, Cuvelier M-E, Berset C. Antioxidant properties of Moldavian dragonhead
(Dracocephalum moldavica L.). Journal of Food Lipids 2001; 8 (1): 45-64.
13. Zgorka G, Hojnas A. The application of solid phase extraction and reversed phase high-
performance liquid chromatography for simultaneous isolation and determination of
flavonoids and phenolic acids. Chromatographia 2003; Suppl.57: S80.
14. Coyle CH, Phillips BJ, Morrisroe SN. Antioxidant effect of green tea and it„s
polyphenols on bladder cells. Life Sciences 2008; 83: 12-8.
15. Katiyar SK, Mukhtar H. Tea antioxidants in cancer chemoprevention. Journal of Cellular
Biochemistry 1997; Suppl. 27: 59-67.
41
16. Manian R, Anusuya N, Siddhuraju P, Manian S. The antioxidant activity and free radical
scavening potential of two different solvent extracts of Camellia sinensis (L.) O. Kuntz,
Ficus bengalensis L. and Ficus racemosa L. Food Chemistry 2008; 107: 1000-7.
17. Locatelli M, Gindro R, Travaglia F. Study of the DPPH scavening activity: development
of free software for the correct interpretation of data. Food Chemistry 2009; 114: 889-
97.
18. European Pharmacopoeia 6.0. EDQM. 2007. p. 41-3, 46-7, 53-4, 682-4 (01/2008:1435,
01/2008:0765, 01/2008:0765, 01/2008:20229, 01/2008:20225, 01/2008:20232.
19. Preparato ,,Ţaliosios arbatos ekstraktas“ pakuotės lapelis, gamintojas - ,,Sanitas“.
20. Janulis V, Puodţiūnienė G, Bernatonienė R, Malinauskas F, Jakštas V. Vaistinių
augalinių ţaliavų analizė. Kaunas: Kauno medicinos universiteto leidykla; 2006. p. 71 –
81.
21. Marksienė R. Optiniai analizės metodai. Kaunas: Kauno medicinos universiteto leidykla;
2008. p. 19-44.
22. Chan EWC, Lim YY, Chew YL. Antioxidant activity of Camelia sinensis leaves and tea
from lowland in Malaysia, Food Chemistry 2007; 102: 1214 – 1222.
23. Intenetinė prieiga:
http://chestofbooks.com/health/materia-medica-drugs/Manual-Of-Pharmacology/Infusa.html
24. Intenetinė prieiga:
http://ml.lms.lt/index.php?option=com_content&task=view&id=805
25. Internetinė prieiga:
http://chestofbooks.com/health/materia-medica-drugs/Manual-Of-
Pharmacology/Decocta.html
26. Havsteen BH. The biochemistry and medical significance of the flavonoids.
Pharmacology & Therapeutics 2002; 96: 67– 185.
27. Kono S. Green tea and gastric cancer in Japan. The New England Journal of Medicine
2001; 39 (2): 104-11.
28. Yao LH, Jiang YM, Caffin N, D„Arcy B, Datta N, Liu X, Singanusong, Xu Y. Phenolic
compounds in teas from Australian supermarkets. Food Chemistry 2006; 96: 614 – 620.
29. Stach D, Schmitz OJ. Decrease in concentration of free catechins in tea over time
determined by micellar electrokinetic chromatography. Journal Of Chromatography
2001; 924: 519-522.
30. Sharma V, Gulati A, Ravindranath SD. Extractibility of tea catechins as a function of
manufacture procedure and temperarure of infusion. Food Chemistry 2005; 93: 141-148.
31. Fawole O, Ndhalala A, Finnie J, Van Staden J. Anti-inflammatory and phytochemical
42
properties of twelve medicinal plants used for treating gastro-intestinal ailments in South
Africa. Journal of chromatography 2006; 200: 237-243.
32. Evans WC, Evans D. Trease and Evans Pharmacognosy. Edinburgh: Saunders; 2002. p.
25, 223, 383-8, 484.
33. Heinrich M, Barnes J, Gibbons S, Williamson EM. Fundamentals of pharmacognosy and
phytotherapy. Edinburgh: Churchill Livingstone; 2004. p. 75-7; 105, 282-3.
34. Aulton E. Pharmaceutics: The design and manufacture of medicines. Edinburgh:
Churchill Livingstone; 2007. p. 372-3.
35. Daunoras G, Gendronis A, Grincevičius J. Farmakopėjos straipsnių rikinys.
Kaunas: Kauno medicinos universiteto spaudos ir leidybos centro leidykla; 2002. p. 6-
18.
36. Xu C, Shu W-S, Qiu Z-Q, Chen J-A, Zhao Q, Cao J. Protective effects of green tea
polyphenols against subacute hepatotoxicity induced by microcystin-LR in mice.
Enviromental Toxicity and Pharmacology 2007; 24: 140-8.
37. Horzic D, Komes D, Belscak A, Ganic KK, Ivekovic D, Karlovic D. The composition of
polyphenols and methylxantine in teas and herbal infusions. Food Chemistry 2009; 115:
441-8.
43
PUBLIKACIJOS DARBO TEMA
1. Vitalis Briedis,; Arūnas Savickas,; Kristina Ramanauskienė,; Giedrė Kasparavičienė,;
Vilma Armoškaitė,. Quality evaluation of green tea aqueous extracts, and investigation of their
antioxidant activity / Vitalis Briedis, Arūnas Savickas, Kristina Ramanauskienė, Giedrė
Kasparavičienė, Vilma Armoškaitė // The 12th International Congress PHYTOPHARM 2008 : 2-4
July 2008, Saint-Petersburg, Russia : abstracts book=[XII международный съезд "ФИТОФАРМ
2008" : 2-4 июля 2008, С-Петербург, Россия] / Komarov Botanical Institute of Russian Academy
of Science, Interregional Center "Adaptogen" et al. Saint-Petersburg : Saint Petersburg State
University (СПбГУ), 2008, p. 55.
Prieiga per internetą: http://www.spbu.ru/News/conference/2008-07-04.pdf
2. Konferencija. Vitalis Briedis, Kristina Ramanauskienė, Vilma Armoškaitė. Lietuvos
sveikatos mokslų ir jaunųjų tyrėjų konferencija. Ţaliosios arbatos vandeninių ištraukų kokybės
analizė ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas. 2009, Kaunas.
44
PRIEDAI
1) Galo rūgšties gradavimo grafikas spektrofotometriniam tyrimui.
Kalibracinis galo r. grafikas
y = 12.453x
R2 = 0.9483
y = 12.453x
R2 = 0.9483
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18
Koncentracija, mg/ml
Ab
so
rcij
a,
mV
2) Galo rūgšties gradavimo grafikas ESC tyrimui.
y = 8249498,84x - 66704001,23
R2 = 1,00
0
2000000000
4000000000
6000000000
8000000000
10000000000
12000000000
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
C, mikrogramai/g
sm
ail
ių p
lota
i
45
SANTRAUKA
Ţaliosios arbatos ištraukų kokybės analizė
ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas
Raktažodžiai: ţalioji arbata, vandeninės ištraukos, uţpilai, nuovirai, fenoliniai junginiai.
Tiriami ţaliosios arbatos fenoliniai junginiai bei antioksidacinis aktyvumas su tikslu įvertinti
bei pritaikyti jį antioksidacinėmis savybėmis pasiţyminčių preparatų, priešvėţinių preparatų
kūrime. Taip pat tiriamos ir vertinamos keturios Lietuvos rinkoje pirktos arbatos bei jų savybės.
Darbo tikslas:
Ištirti buitiniu metodu pagamintų vandeninių ţaliosios arbatos ištraukų, uţpilų ir nuovirų,
pagamintų iš Lietuvos rinkoje populiariausių ţaliosios arbatos ţaliavos rūšių, veikliąsias
medţiagas bei antioksidacinį aktyvumą. Įvertinti ţaliosios arbatos ekstraktą.
Metodika:
1. Tyrimo objektas - arbata „Banča“ bei jos analogai – arbatos ,,Maxima“, „Majski“,
„Dilmah“.
2. Vandeninių ištraukų gamyba.
1) Gaminama ţaliosios arbatos ţaliavos buitiniu metodu paruošta ištrauka ir vertinama
kokybė po 10 min., 20 min., 30 min. ekstrahavimo;
2) Gaminami ţaliosios arbatos ţaliavos uţpilai ir nuovirai.
3. Spektrofotometrija pagal Folin – Ciocalteau metodiką (vertinamas bendras fenolinių
junginių kiekis).
4. Spektrofotometrija pagal radikalus DPPH* (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) ir ABTS
*
(2,2„-azino-bis-(3-etilenbenztiazolin-6-sulfono rūgštis)) – vertinamas antioksidacinis aktyvumas.
5. Sausos liekanos tyrimas gravimetriniu metodu.
6. Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC).
Rezultatai:
Spektrofotometriškai ištirta, kad didţiausias fenolinių junginių kiekis yra arbatoje „Majski“,
atitinkamai maţėja arbatose „Banča“, „Maxima“, „Dilmah“. Uţpiluose bei nuoviruose nustatytas
didesnis kiekis fenolinių junginių, palyginus su paprastu arbatų paruošimu. Tyrimais nustatyta, kad
didţiausias nuodţiūvis yra arbatos „Majski“. Antioksidacinis aktyvumas didesnis arbatų „Banča“ ir
,,Majski“, tačiau ir kitų arbatų ištraukos pasiţymėjo antioksidaciniu veikimu. ESC metodu
identifikuota galo rūgštis, epigalokatechinas, rutinas ir kofeinas. Nustatyta, kad galo rūgštis ir
epigalokatechinas pasiţymi antioksidaciniu aktyvumu.
Išvados:
1. Tyrimų rezultatai parodė, kad uţpiluose ir nuoviruose fenolinių junginių kiekis
didesnis nei ţaliosios arbatosbuitiniu metodu paruoštose ištraukose, vadinasi, ekstrahavimo laikas ir
įranga yra vienas iš faktorių, darančių įtaką ţaliosios arbatos ištraukų kokybei.
2. Tyrimų rezultatai parodė, kad, ilgėjant ekstrahavimo laikui, daugėja išsiekstrahavusių
medţiagų, bet jų išsiekstrahavimo greitis lėtėja, kokybinė sudėtis maţai kinta.
3. Visos ţaliosios arbatos ištraukos pasiţymi antioksidaciniu aktyvumu ir gali būti
naudojamos kaip antioksidacinių savybių turintys preparatai.
46
SUMMARY
The analysis of quality and antioxidant activity of green tea extracts
Keywords: green tea, aqueous extracts, infusions, decoctions, phenolic compounds.
Antioxidant activity and phenolic compounds have been analyzed in purpose to evaluate and
apply green teas in the creation of medicinal products, distinguished by antioxidant and anticancer
activity. Also four species of teas have been bought in Lithuanian market and their features have
been analyzed and evaluated.
Purpose of work:
To analyze traditional every-day aqueous extracts, infusions and decoctions of green tea
stock, made of species, bought in Lithuanian markets, to indicate active substances and evaluate
antioxidant activity. To evaluate extract of green tea in capsules.
Methods:
1. Object of analysis – tea , „Banca“ and it„s analogues – teas „Maxima“, „Majski“,
„Dilmah“.
2. Preparation of aqueous extracts.
1) Traditional method of tea making from the stock of green teas has been used to preapare
aqueous extracts. The quality of these extracts has been evaluated after 10, 20, 30 min.
2) Infusions and decoctions of green tea have been produced.
3. Spectrophotometry (Folin – Ciocalteau method) – common amont of phenolic
compouns has been evaluated.
4. Spectrophophotometry DPPH* (2,2-biphenil-1-pikrilhydrazil) ir ABTS
* (2,2„-azin-bis-
(3-etilenbenzthiazolin-6-sulfonic acid)) radicals are used for evaluation of common antioxidant
activity.
5. The evaluation of dry residuals according to gravimetric analysis has been calculated.
6. Effective liquid chromatography.
Results:
It has been evaluated by spectrophotometric methods that the highest amount of phenolic
compounds is in the tea „Majski“ and respectively lowers in such teas as Banca, Maxima, Dilmah.
Higher lewels of phenolic compounds have been evaluated in infusions and decoctions in
comparison to traditional method of tea preparation. It has been reported that highest dry residual is
in tea Majski. Antioxidant activity is higher in teas Banca and Majski, but on the other hand all teas
have been noted to have antioxidant features. Using effective liquid chromatography these
substances have been identified: gallic acid, epigallocatechin, rutin and caffein. It has been
estimated that gallic acid and epigallocatechin have antioxidant activity.
Conclusions:
1. Test results show that infusions and decoctions have higher levels of phenolic
compounds than traditional form of tea preparation, thus extaction time and equipment are the
features, which influences the quality of green teas.
2. Test results show that the amount of extractives increases accordingly to the time of
extraction, but the rate of extraction and their quality features vary irrelevantly.
3. All aqueous extractions of green tea distinguish antioxidant activity and may be used
as preparations, which have antioxidant features.
