Allgemeine Histologie

1. Embryologie2. 4 Grundgewebe: Epithel

BindegewebeMuskelNerven

3. Knochenmark und Blut4. extrazelluläre Matrix, Knochenbildung und

aktuelle Forschung5. Lymphatische Organe

Die extrazelluläre Matrix

Komponenten:- Proteine: 1. Kollagene, Elastin (unlösliche Fasern)

2. Hochvisköse Proteoglykane(Grundsubstanz)3. Lösliche Multiadhäsionsmatrixmoleküle

- ortsfeste Zellen: Fibrozyten, Chondrozyten, Osteozyten,Epithelzellen, Muskelzellen

- freie Zellen: Abwehrzellen, Leukozyten, Makrophagen, Mastzellen

- Gewebeflüssigkeit

Die extrazelluläre Matrix (Interzellularsubstanz)

Beispiele für Bindegewebe und Stützgewebe:

1. embryonales Mesenchym2. lockeres zwischen beweglicheren Geweben, z.B. Lamina

propia3. straffes dicht geordnetes (Sehnen, Cornea)

dicht ungeordnetes (Haut: Dermis)4. sehr straffes Knochen, Knorpel5. retikuläres Netzwerk von Fasern in Milz, Lymphknoten,

Knochenmark6. elastisches Ligamenten der Wirbelsäule-, Zellwand

der Arterien

Verschiedene Kombinationen der Matrix-Komponenten

bestimmen die Festigkeit des Gewebes

Aminosäuresequenz der Kollagene: Gly-Pro-X--Gly-Pro-X--usw.

Kollagen:

- häufigstes Protein im Säugetier (25% aller Proteine)- mindestens 25 verschiedene Kollagentypen- Hauptmerkmal: Tripelhelix

fibrilläre Kollagene:Typ I Knochen, Sehnen, Haut, Bänder,Typ II Knorpel, GlaskörperTyp III Retikuläre Fasern, Haut, Muskel

schichtenbildende KollageneTyp IV Basalmembram

Fibrillen assoziierte Kollagene mit unterbrochener Tripelhelix:Typ IX, XII und XIV modulieren die Fibrillendicke und die Anzahl der Proteoglykanbindungsstellen

kurzkettige KollageneTyp X Knochenwachstum

Kollagen Typ III bilden das retikuläre Bindegewebe, Stromavieler Gewebe (Leber, Milz, Lymphknoten), Unterlage für Parenchymzellen

Kollagen Typ IVUnterbrechung der Tripelhelix ermöglicht zahlreiche Biegungen und eine hohe Flexibiltät, unregelmäßiges zweidimensionales Netzwerk

Basalmembran

Elastische Fasern

Aufbau:Elastin, Fibrillin

-keine Tripelhelix, eher „random coiled“;

-reversible Dehnbarkeit-Verbindung einzelner Elastinmoleküle ergibt gummiartige Eigenschaften(2,5-fach)

Vorkommen: Arterienwände, elastischer Knorpel, Haut,Lungengewebe

2. Proteoglykane oder Grundsubstanz

1. in der extrazellulären Matrix (groß)2. auf der Oberfläche vieler Zellen (klein)

Aufbau:- Core-protein mit vielen Polysaccharidketten, den Glykosaminoglykanen

- Glykosaminoglykane: lineare Ketten aus 20-100 sulfatisiertenDisacchariden

Aggrecan:

- ein einziges Molekül kann 4 mm groß sein, und ein Volumen einnehmen, das grösser ist als das einer Bakterienzelle

- bewirkt gelartige Konsistenzdes Knorpels

Hyaluronsäure: n< 50 000-außerordentliches langes, negativ geladenes Polysaccharid-bindet viel Wasser, da viele anionische Reste Quellung

-Turgordruck im Gewebe gegen Fasern und Zellen-behindert Anheftung zwischen den Zellen-erleichtert Zellwanderung, wenn an bestimmte Rezeptoren gebunden (CD44)

2. Proteoglykane oder Grundsubstanz

1. in der extrazellulären Matrix (groß)2. auf der Oberfläche vieler Zellen (klein)

Syndekan: -kleines Zelloberflächenproteoglykan, Core-Proteindurchspannt die Plasmamembran, Wechselwirkung mit dem Cytoskelett,- extrazelluläre Domäne besitzt Bindestellen zu Kollagenen,- Verankerung der Zellen mit der Matrix (RGD-Sequenz bindet Integrine)

Beispiel 2:

3. Multiadhäsionsmatrixmoleküle

2. Fibronektin-verbindet Zellen mit Typ I, II und III KollagenRGD (Arg-Gly-Asp)

1. Laminin-verbindet Zellen mit Typ IV KollagenBasalmembran

- 3 Proteinkomponenten:

1. Kollagene: fibrillenbildende (I, II, III), schichtenbildende (IV)

Elastin (unlösliche Fasern)

2. Hochvisköse Proteoglykane: Aggrecan, Syndecan

3. Lösliche Multiadhäsionsmatrixmoleküle: Laminin, Fibronektin

Die Kombinationen verschiedener Matrix-Komponenten

bestimmt die Festigkeit des Gewebes

Bestandteile:

Ortsfeste Zellen: Chondroblasten, ChondrozytenExtrazelluläre Matrix: Kollagenfibrillen (Typ II), Proteoglykane (höchster Anteil in allen Geweben)

Eigenschaften:

Druckelastizität: Quellungsdruck der Proteoglykanekontra Zugfestigkeit der Kollagenfibrillenkeine Blutgefäße (Ausnahme: im Primordialskelett)bindegewebige Knorpelhaut (Perichondrium)

Typen:

Hyaliner KnorpelElastischer KnorpelFaserknorpel

Knorpel

Hyaliner Knorpel: Vorkommen: Gelenkknorpel, Atemwege (Nasenseptum, Trachea, Bronchialbaum), Rippenknorpel, Wachstumsplatten, Primordialskelett

Knorpel

Chondrozyten (meist in isogenen Gruppen)

"Knorpelhöhle", enthält Chondrozyten-Reste

"Knorpelkapsel"

Knorpelhof

Interterritorium: läßt im gesunden Zustand dieKollagenfibrillen der Matrix nicht erkennen

Begriff Chondron: Chondrozyt(en) + Knorpelhof

Elastischer Knorpel: Vorkommen:

Ohrmuschel, äußerer Gehörgang,kleine Kehlkopfknorpel

Chondrone: bestehen meist nur aus einer Zelle

EZM: enthält zusätzlich elastische Fasernetze,deshalb druck- und biegeelastisch

Darstellung der elastischen Fasern mit Elastica-Färbungen wie Resorcin-Fuchsin oder Orcein

Knorpel

Faserknorpel: Vorkommen:

Zwischenwirbelscheiben, Gelenklippen, Menisken, Symphyse

Chondrone: bestehen meist nur aus einer Zelle

EZM: enthält massive Kollagenfasern, im Lichtmikroskop deutlich sichtbar

Funktionell: Kombination aus straffem Bindegewebe und Knorpel; zugfest und druckelastisch

Knorpel

Bestandteile:

Ortsfeste Zellen: Osteoblasten, -zyten und -klastenExtrazelluläre Matrix: Kollagenfibrillen (Typ I), Hydroxylapatit (Calcium-, Phosphat- und Hydroxyl-ionen sind 45% des Feuchtgewichtes)

Eigenschaften:

stabil, druck- und zugfest, ständiger Umbau, durch Hormone gesteuertwichtigster Calcium-Speicher (enthält 99%)bindegewebige Hüllen: End- und Periost

Typen:

Geflechtknochen: entsteht primär, unreife Form Lamellenknochen: entsteht nach Umbau, reife Form

Knochen

Knochenentstehung

1.Chondral: aus Knorpelvorform (Extremitäten)

Perichondral: um Knorpelvorform herum

Endochondral: im Inneren der Knorpelvorform

2. Desmal: aus Bindegewebe (Schädeldach)

Die extrazelluläre Matrix bestimmt diebiomechanischen

Eigenschaften der einzelnen Gewebe

aus druckelastischem Gewebe (Knorpel)Kollagen II und Proteoglykane

stabiles, zugfestes Gewebe (Knochen)Kollagen I

enchondrale Ossifikation

Knochenentwicklung (Ossifikation):Knochen

1.Chondral: aus Knorpel-vorform (Extremitäten)

Perichondral: um Knorpelvorformherum

Endochondral: im Inneren derKnorpelvorform

2.Desmal: aus Bindegewebe(Schädeldach)

Enchondrale Ossifikation:Knochen

Zonen der Wachstumsplatte:

ReservezoneSäulenknorpel (proliferierende Chondrozyten)Blasenknorpel (hypertrophe Zellen) mit

Mineralisation der Matrix

Invasionszone mit Abbauder Knorpelmatrix, Ein-sprossen von Gefäßenund Aufbau der Knochen-matrix durch Osteoblasten

Längenwachstum

Zonen der Wachstumsplatte:

ReservezoneSäulenknorpel (proliferierende Chondrozyten)Blasenknorpel mit Mineralisation der MatrixInvasionszone mit Ossifikation

Forschung in der Anatomie ?

1. analytisch: Zellkultur, ganze Organe

Bestimmung des Expressionsmusters

(mRNA, Proteine)

Organarchitektur geht verloren

Wie kann ich einzelne Gewebe untersuchen ?

2. mikroskopisch: Organarchitektur bleibt erhalten

1. Fixierung der Gewebe

2. Einbettung/Schneiden

3. Färbung

1. Fixierung des Gewebes: -chemisch: Alkohole oder Quervernetzung durch Aldehyde

-Gefrier-Fixierung bzw. Kryofixation

Kryoschnitte: schnelle Konservierung (Ist-zustand),

Kernfärbung (30 min), Immunhistologie

Paraffinschnitte: Längere Fixierung (3 Wochen), Entfettung,

gute Morphologie

2. Einbetten/Schneiden-mit Hilfe eines Mikrotoms kann man sehr dünne Schnitte

anfertigen (ca. 5-100 µm)

-Auffangen der dünnen Schnitte auf einem Glas-Objektträger

3. histologische Färbungen

1. selektive Farbstoffe

2. Kopplung von Farbstoffen an Antikörper

Immunhistologie: Antikörper erkennen spezifisch bestimmte Makromoleküle

3. Kopplung von Fluoreszenz-

Farbstoffen an Antikörper

Lichtmikroskop

Lichtmikroskop

-Fluoreszenzmikroskop-konfokales Laser-scanning-Mikroskop-two photon Mikroskop

-Chemische Grundlage der Farbreaktionen oft nicht bekannt

z.B. Hematoxylin-Eosin (HE) Färbung:- Grundfärbung in der Histologie

- färbt negativ geladene Moleküle wie DNA, RNA an

Histologie der Milz: Kryoschnitt, Kernfärbung (HE)

- Kapsel- Rote Pulpa- Zentralarterie- Periarterioläre

lymphatischeBegleitscheide(PALS) (T-Zellen)

- Follikel (B-Zellen)- Marginalzone (B-Zellen)

Aufgabe der Milz (sekundär lymphatisches Organ) Weiße Pulpa:1. Vervielfältigung von spezifischen Lymphozyten

gegen Antigene aus dem BlutRote Pulpa: 2. Entfernung alter Erythrozyten (Blutfilter)

Wie kann ich einzelne Gewebe untersuchen, ohne dieOrganstruktur zu zerstören ?

two-photon-Mikroskopie

mikroskopisch/histologisch:

konfokale Laser-scanning-mikroskopie: 3-D Darstellung

Elektronenmikroskopie

1. Lichtmikroskopie: Kryoschnitte, Färbungen, Immunhistologie

2. Fluoreszenzmikroskopie: Kryoschnitte, Immunhistologie,Kopplung von Fluoreszenz-Farbstoffen an Antikörper

Was passiert mit den Lymphozyten in Kultur ?

T-Zellen liegen neben B-Zellen, Makrophagen, dendritischen Zellen,kein dreidimensionales Netzwerk mehr, keine extrazelluläre Matrix,keine Arteriolen, keine Stromazellen

Verlust der organisierten Struktur der lymphatischen Organe

Mikromilieu, dynamische Prozesse und Zell-Zell-Interaktionen gehen verloren

Aufgabe der Milz:1. Entfernung alter Erythrozyten (Blutfilter)

2. Vervielfältigung von spezifischen Lymphozyten gegen Antigene aus dem Blut

Antigen

Antigenpräsentation (MHC I, MHC II)

Aktivierung der T-Lymphozyten (CD8; CD4-TH1 oder TH2)

Aktivierung der B-Lymphozyten (Keimzentren)

Antikörperproduktion Termination

Proliferation

Proliferation

Lokale Immunantwort in der Ratten-Milz nach Injektion von Schaf-Erythrozyten:

B-Zellen: blauproliferierende Zellen: rot

Immunhistologie auf Kryoschnitten

Ändert sich das Mikromilieu ?Ändert sich das Expressionsmuster ?Welche Zytokine werden produziert ?

Hypothese:Ablauf einer Immunantwort wird bestimmt vom Kompartiment und dem geeigneten Mikromilieu.

Mikrodissektion eines Milz-Follikels:

Kombination aus mikroskopischer Betrachtung und molekularbiologischer Analyse:

Isolation einzelner Zellen oder Kompartimente von Kryoschnitten

Isolation einzelner Kompartimente: Follikel, PALS, Marginalzone

1. RNA-Isolierung

2. Umschreiben in cDNA

3. quantitative Analyse mittels Real-Time PCR

Lokale Immunantwort in der Ratten-Milz nach Injektion von Schaf-Erythrozyten:

Zusammenfassung:

Die Mikrodissektion ermöglicht die Isolation und Analyse einzelner Zellen oder Kompartimente aus Kryoschnitten, ohne die Organ- und Gewebsstruktur zu zerstören.

Effekte, die bei Analyse des gesamten Organesverwischen, werden in einzelnen Kompartimentendeutlich.

Kombination aus mikroskopischer Betrachtung und molekularbiologischer Analyse

Phasen der Immunantwort: sekundär lymphatische Organe

Phasen der Immunantwort:

angeboren: Makrophagen, Komplementsystem, Zytokine

1.primär lymphatische Organe: Thymus, Knochenmark

2.sekundär lymphatische Organe: Lymphknoten, Milz, Peyers Patches, Tonsillen

Herstellung des T- und B-Zellrepertoires

Antigenpräsentation und Vervielfältigung

erworben: spezifische T- und B-Zellen