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ALLYSON SANTOS DE SOUZA
PROSPECÇÃO DA BIODIVERSIDADE CRÍPTICA E PADRÕES
BIOGEOGRÁFICOS EM PEIXES DO LITORAL E ILHAS OCEÂNICAS
DO ATLÂNTICO OCIDENTAL
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Sistemática e Evolução
do Centro de Biociências da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte como parte
dos requisitos necessários à obtenção do
título de Doutor em Sistemática e Evolução,
com ênfase em Padrões e Processos
Evolutivos.
Orientador:
Prof. Dr. Wagner Franco Molina
Natal/RN 2017
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências – CB
Souza, Allyson Santos de.
Prospecção da biodiversidade críptica e padrões
biogeográficos em peixes do litoral e ilhas oceânicas
do Atlântico Ocidental / Allyson Santos de Souza. -
Natal, 2017.
108 f.: il.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de
Pós-graduação em Sistemática e Evolução.
Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina.
1. Pomacentridae - Tese. 2. Carangidae - Tese. 3.
Taxonomia - Tese. 4. Delimitação de espécies - Tese.
I. Molina, Wagner Franco. II. Universidade Federal do
Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU
567
ALLYSON SANTOS DE SOUZA
PROSPECÇÃO DA BIODIVERSIDADE CRÍPTICA E PADRÕES
BIOGEOGRÁFICOS EM PEIXES DO LITORAL E ILHAS OCEÂNICAS
DO ATLÂNTICO OCIDENTAL
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Sistemática e Evolução
do Centro de Biociências da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte como parte
dos requisitos necessários à obtenção do
título de Doutor em Sistemática e Evolução,
com ênfase em Padrões e Processos
Evolutivos.
Aprovado em: 30 de março de 2017.
Comissão Examinadora:
Dr. José Garcia Júnior – IFRN
Dr. Paulo Augusto de Lima Filho – IFRN
Dr. Carlos Alfredo Galindo Blaha – UFRN
Dr. Sérgio Maia Queiroz Lima - UFRN
AGRADECIMENTOS
Primeiramente gostaria de dizer que esta conquista só foi possível devido a
ajuda de muitos, encarnados e desencarnados.
Agradeço primeiramente aos meus pais, Azuílo de Souza e Rosália Santos,
por nunca medirem esforços para fornecer-me boa educação, desde quando os
teares ainda eram manuais e de madeira;
À Ana Paula Santos de Medeiros pelo apoio e incentivo ao doutorado, além
da paciência, companheirismo e cumplicidade;
Ao professor Wagner Franco Molina pela orientação, confiança, paciência,
serenidade e aprendizado, científico e moral;
Aos amigos do Laboratório de Genética de Recursos Marinhos, incluindo
Antônio Jales Moraes Vasconcelos, que foi quem me introduziu no laboratório, em
2003, e na genética de peixes;
Aos meus ex-professores do Externato Tico e Teco, Colégio Diocesano
Seridoense e Centro Educacional José Augusto;
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte;
À Marinha do Brasil/SECIRM;
Ao Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade;
À Reserva Biológica do Atol das Rocas;
Ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis;
À Academia Brasileira de Ciências;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES);
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq);
Muito obrigado.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................ 12
Padrões da biodiversidade atlântica brasileira.............................................. 12
Estruturas geográficas e geomorfológicas da costa brasileira...................... 14
Análises genéticas e morfométricas na detecção da biodiversidade............17
OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 19
Objetivos específicos 19
MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 20
Análises moleculares.....................................................................................20
Análises morfométricas................................................................................. 21
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 23
CAPÍTULO 1
A reappraisal of Stegastes species occurring in the South Atlantic using
morphological and molecular data ........................................................................ 30
ABSTRACT................................................................................................... 31
INTRODUCTION........................................................................................... 32
MATERIAL AND METHODS…..................................................................... 33
Specimen collection.......................................................................................33
Counts, traditional and geometric multivariate morphometry………………...37
DNA extraction, PCR amplification and DNA sequencing………………....... 37
Analysis of sequences………………...………………...………………...…… 39
RESULTS………………...………………...………………...………………...… 39
Quantification of Fin Rays and Lateral-line Scales………………...…………. 39
Principal Component Analysis………………...………………...……………… 40
Geometric morphometric analysis………………...………………...…………. 43
Genetic variation………………...………………...………………...…………… 44
Comparative genetic analyses………………...………………...……………… 45
DISCUSSION………………...………………...………………...………………. 49
CONCLUSION………………...………………...………………...……………... 52
REFERENCES………………...………………...………………...…………….. 53
Supplementary material Table 1………………...………………...…………… 60
CAPÍTULO 2
Estrutura genética multipopulacional de Abudefduf saxatilis no oeste do
Atlântico Sul e ilhas oceânicas ............................................................................. 61
RESUMO………………...………………...………………...…………………… 62
INTRODUÇÃO………………...………………...………………...…………….. 63
MATERIAL E MÉTODOS………………...………………...………………...…. 64
Coleta dos espécimes………………...………………...………………...…….. 64
Análises moleculares………………...………………...………………...……… 64
RESULTADOS………………...………………...………………...…………….. 68
Sequências 16S e COI………………...………………...……………………… 68
Sequências da Região Hipervariável 1 (RHV1) ………………...……………. 68
DISCUSSÃO………………...………………...…………………………………. 77
REFERÊNCIAS………………...………………...………………………………. 81
Material suplementar..........................................………………...…………… 85
CAPÍTULO 3
Estruturação populacional panmítica do xaréu-preto, Caranx lugubris Poey
1860 em áreas do Atlântico Ocidental ................................................................... 89
RESUMO………………...………………...………………………...…………… 90
INTRODUÇÃO………………...………………...………………………...……... 91
MATERIAL E MÉTODOS………………...………………...…………………… 92
Coleta dos espécimes………………...………………...……………………….. 92
Análises moleculares………………...………………...………………………... 93
RESULTADOS………………...………………...………………………...…….. 95
DISCUSSÃO………………...………………...………………………...……….. 96
REFERÊNCIAS………………...………………...………………………...…... 101
Material suplementar………………...………………...………………………. 106
CONCLUSÕES GERAIS ........................................................................................107
LISTA DE FIGURAS
INTRODUÇÃO
Figura 1. Atlântico Sul .............................................................................................. 15
CAPÍTULO 1
Figura 1. Map showing the geographic distributions of Stegastes variabilis and S.
fuscus (red), S. rocasensis (blue), S. sanctipauli (green) and S. trindadensis (yellow).
.................................................................................................................................. 34
Figura 2. Specimens of A Stegastes variabilis Castelnau 1855, B S. fuscus Cuvier
1830, C S. sanctipauli Lubbock and Edwards 1981, D S. rocasensis Emery 1972, E
S. trindadensis Gasparini, Moura and Sazima 1999, F S. pictus Castelnau 1855..... 35
Figura 3. Dispersion diagram of individual scores in the Principal Components
Analysis of Stegastes fuscus (blue diamonds), S. rocasensis (Fernando de Noronha
archipelago, pink squares), S. rocasensis (Rocas atoll, yellow triangles), S.
sanctipauli (X), S. variabilis (violet squares with an asterisk), and S. trindadensis
(green circles) ............................................................................................................ 43
Figura 4. Analysis of the canonical variables of body shape data of Stegastes fuscus
(blue diamonds), S. rocasensis (Fernando de Noronha archipelago, pink squares), S.
rocasensis (Rocas atoll, yellow triangles), S. sanctipauli (X), S. trindadensis (green
circles) and S. variabilis (violet squares with an asterisk) .......................................... 44
Figura 5. Neighbor-joining tree derived from COI sequences of Stegastes .............. 47
Figura 6. Maximum likelihood tree based on the combination of 16S, COI, CytB, rag1
and rhod (2,580 pb) sequences of Stegastes. ........................................................... 48
CAPÍTULO 2
Figura 1. Locais de coleta de Abudefduf saxatilis no oeste do Atlântico Sul e ilhas
oceânicas .................................................................................................................. 67
Figura 2. Rede de haplótipos de Abudefduf saxatilis baseado em sequências da
RHV1 ......................................................................................................................... 71
Figura 3. Árvore de maximum likelihood baseado em sequências RHV1 de
Abudefduf saxatilis .................................................................................................... 72
Figura 4. Árvore de maximum likelihood baseada em sequências 16S de
Abudefduf ................................................................................................................. 73
Figura 5. Árvore de maximum likelihood baseada em sequências COI de
Abudefduf ................................................................................................................. 73
Figura 6. Estruturação genético populacional de Abudefduf saxatilis ao longo da
costa leste da América do Sul e ilhas oceânicas brasileiras ..................................... 76
CAPÍTULO 3
Figura 1. Áreas de coleta dos espécimes de Caranx lugubris .................................. 92
Figura 2. Morfótipos I (a) e II (b) de Caranx lugubris (sensu Jacobina et al., 2014),
coletados no entorno do Arquipélago de São Pedro e São Paulo ............................ 93
Figura 3. Rede de haplótipos baseadas em sequências parciais da Região
Hipervariável 1 (DNAmt) de Caranx lugubris............................................................. 96
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Tabela 1. Stegastes specimens analyzed and GenBank accession numbers of
mitochondrial and nuclear sequences used in phylogenetic estimates ..................... 36
Tabela 2. Primers used to amplify sequences of mitochondrial and nuclear genes of
Stegastes species ..................................................................................................... 38
Tabela 3. Frequency distribution of counts for 7 species of Stegastes from the
Western Atlantic ........................................................................................................ 41
Tabela 4. Variable loadings from sheared principal components analysis for
morphometric characters of Stegastes species ......................................................... 42
Tabela 5. Mean pairwise distances (p-distance) (lower diagonal) and mean number
of intraspecific (in parentheses) and interspecific (upper diagonal) nucleotide
differences with their respective standard errors based on partial sequences of 16S,
COI, CytB, rag1 and rhodopsin genes (2,580 bp) ..................................................... 46
Supplementary material Table 1. Genetic divergence (Kimura-2-parameter) among
Stegastes species (lower diagonal) with their respective standard errors (upper
diagonal) based on partial sequences of COI (658 bps) .......................................... 60
CAPÍTULO 2
Tabela 1. Pontos de coleta e número amostral de Abudefduf saxatilis ao longo da
costa oeste da América do Sul .................................................................................. 66
Tabela 2. Índices de diversidade genética e neutralidade em Abudefduf saxatilis
baseado em RHV1 ................................................................................................... 70
Tabela 3. Estimativas de FST entre diferentes populações geográficas de
Abudefduf saxatilis baseadas em RHV1 ................................................................. 74
Tabela 4. Análise hierárquica da variância molecular (AMOVA) baseado na RHV1
de Abudefduf saxatilis .............................................................................................. 75
Tabela suplementar 1. Distribuição dos haplótipos encontrados nas sequências
Região Hipervariável 1 de Abudefduf saxatilis. ......................................................... 85
CAPÍTULO 3
Tabela 1. Diversidade genética de Caranx lugubris ...............................................100
Tabela suplementar 1. Distribuição de haplótipos em Caranx lugubris .................106
RESUMO
O extenso litoral brasileiro é multipartido em diferentes ecossistemas, compostos por
estuários, manguezais, sistemas recifais, ilhas costeiras e oceânicas. Estes
ambientes possuem uma ictiofauna bastante diversificada composta por 1.297
espécies, das quais aproximadamente 25% representam espécies endêmicas.
Esses níveis de biodiversidade podem ser incertos, devido a ocorrência de espécies
crípticas e politípicas e pela ausência de estudos populacionais, sobretudo em
espécies recifais. Neste sentido, foram analisados aspectos populacionais,
taxonômicos e filogenéticos de espécies das famílias Pomacentridae (Perciformes) e
Carangidae (Carangiformes), distribuídos ao longo da costa e ilhas oceânicas
brasileiras. As análises moleculares e morfométricas realizadas em S. variabilis, S.
fuscus, S. rocasensis, S. sanctipauli e S. fuscus trindadensis indicaram sinonímia
entre S. rocasensis e S. sanctipauli, e entre S. fuscus e S. fuscus trindadensis. Além
disso, revelaram a presença de uma possível espécie críptica que tem sido
confundida com S. variabilis. As análises populacionais em Abudefduf saxatilis no
Atlântico Ocidental, incluindo as ilhas oceânicas, revelam um quadro de panmixia
desde a Venezuela até o sudeste do Brasil, enquanto que as populações insulares
possuem diferentes níveis de estruturação genética, sobretudo a da Ilha de
Trindade. As análises genéticas na espécie politípica Caranx lugubris indicaram uma
grande população panmítica no Atlântico Ocidental, lançando novos dados sobre a
origem dos morfótipos que ocorrem no entorno do Arquipélago de São Pedro e São
Paulo. Os dados obtidos aprofundam o conhecimento da fauna íctica insular do
Atlântico e servem de subsídios para o manejo e conservação de espécies dessas
importantes e particulares regiões oceânicas.
Palavras-chave: Pomacentridae, Carangidae, taxonomia, delimitação de espécies
ABSTRACT
The extensive Brazilian coast is multi-party in different ecosystems, composed by
estuaries, mangroves, reef systems, oceanic and coastal islands. These
environments detain a largely diversified ichthyofauna composed by 1,297 species, in
which 25% represents endemic species. These levels of biodiversity can be
uncertain, because of the occurrence of cryptic and polytypic species and the
absence of population studies, especially in reef species. In this sense, population,
taxonomical and phylogenetical aspects were analyzed form species of the
Pomacentridae (Perciformes) and Carangidae (Carangiformes) families, along the
coast and oceanic islands of Brazil. The molecular and morphometric analyzes were
performed in S. variabilis, S. fuscus, S. rocasensis, S. sanctipauli and S. fuscus
trindadensis indicated synonym among S. rocasensis and S. sanctipauli, and
between S. fuscus and S. fuscus trindadensis. Besides that, revealed the presence
of a possible cryptic species which has been confused with S. variabilis. The
population analyzes in Abudefduf saxatilis at the Western Atlantic, including the
oceanic islands, reveals a status of panmixia from Venezuela to the Southeast of
Brazil, while the island populations have different levels of genetic structuration,
specially the population of the Trindade island. The genetic analyzes in the polytypic
species Caranx lugubris indicated a large panmitic population in the Western Atlantic,
revealing new data about the origins of the morphotypes that occurs in the
surroundings of the Saint Paul Rocks archipelago. The data obtained expands the
knowledge over the insular ichthyic fauna of the Atlantic and serves as subsidy to the
conservation and management of species of these particular and important oceanic
regions.
Keywords: Pomacentridae, Carangidae, taxonomy, species delimitation
12
INTRODUÇÃO GERAL
Padrões da biodiversidade atlântica brasileira
O extenso litoral do Brasil é composto por diferentes ecossistemas costeiros,
o que acaba por favorecer a ocorrência de uma diversificada ictiofauna. No entanto,
os valores de biodiversidade podem ser dúbios devido a ocorrência de espécies
crípticas e politípicas em diversos grupos. O uso de marcadores moleculares e
morfométricos podem contribuir na detecção da biodiversidade críptica, fornecendo
subsídios para seu manejo e conservação.
A ictiofauna brasileira é composta por aproximadamente 1.298 espécies, das
quais 456 pertencem à Ordem Perciformes e 45 à Carangiformes (Menezes et al.,
2003; Nelson et al., 2016). Incluindo os arquipélagos de São Pedro e São Paulo
(ASPSP), Fernando de Noronha (FN), o Atol das Rocas (AR) e Ilha de Trindade (IT),
esta ictiofauna é composta por aproximadamente 25% de espécies endêmicas.
Quando apenas a zona costeira é considerada, o nível de endemismo cai para
10,5%. Dentre estes ambientes insulares brasileiros, o Arquipélago de São Pedro e
São Paulo possui a maior taxa de endemismos (9,3%) (Floeter et al., 2008). No
entanto, o real número de táxons, principalmente endêmicos, é incerto devido ao
limitado conhecimento sobre aspectos genéticos de espécies e populações,
sobretudo as insulares, e devido ao registro crescente de espécies crípticas e/ou
politípicas.
No Brasil, a ocorrência de diversidade críptica e espécies politípicas
envolvendo espécies das Ordens Perciformes (Luiz-Júnior, 2003; Rangel et al.,
2004; Lima et al., 2005; Mendes, 2007; Rangel & Mendes, 2009; Lima-Filho et al.,
2012, 2016; Souza et al., 2015) e Carangiformes (Jacobina et al., 2014; Duarte et al.,
2017) vêm sendo documentadas, sobretudo nas regiões insulares.
Dentre os Perciformes, a família Pomacentridae se destaca por constituir um
dos grupos marinhos mais representativos (Wainwright & Bellwood, 2002) e
diversificados grupos nos ambientes recifais, com 406 espécies (Eschmeyer & Fong,
2017).
A definição taxonômica de diversas espécies de Pomacentridae se mostra
complicada devido à ocorrência de complexos de espécies e marcantes variações
nos padrões de coloração entre indivíduos e entre áreas de distribuição de uma
13
mesma espécie (Greenfield & Woods, 1974; Allen, 1991; Planes & Doherty, 1997;
Novelli et al., 2000; Souza et al., 2011).
Nas ilhas oceânicas brasileiras ocorrem três espécies endêmicas de
Pomacentridae, que são Stegastes rocasensis, no Atol das Rocas e Arquipélago de
Fernando de Noronha, S. sanctipauli, no Arquipélago de São Pedro e São Paulo, e
S. fuscus trindadensis, na Ilha de Trindade. Apesar de serem consideradas espécies
válidas, seus status taxonômicos estão estabelecidos apenas com base em análises
morfológicas tradicionais. Análises com marcadores moleculares do tipo RAPD
(Random Amplification of Polymorphic DNA) realizadas em S. pictus, S. variabilis, S.
fuscus, S. rocasensis e S. sanctipauli não encontraram distinção genética entre as
espécies insulares (Dias-Júnior & Molina, 2008). A utilização de outros marcadores
moleculares é necessária para a avaliação do status taxonômico destas formas,
sobretudo pela ocorrência de vários complexos de espécies nesta família (Greenfield
& Woods, 1974).
Uma das espécies mais abundantes da família Pomacentridae, Abudefduf
saxatilis, conhecida como Sargentinho, constitui o único representante do gênero na
costa e ilhas oceânicas brasileiras. Sua ocorrência vai desde Indo-Pacífico até o
Atlântico tropical e é uma das espécies mais comuns nos ambientes recifais
brasileiros (Gasparini & Floeter, 2001; Feitoza et al., 2003; Menezes, 2003, 2011;
Vaske et al., 2005). Mesmo assim, pouco se sabe sobre sua estrutura populacional
na costa oeste do Atlântico.
No intuito de se obter informações acerca da sua estrutura populacional,
análises morfológicas multivariadas em diferentes populações costeiras e insulares
de A. saxatilis revelaram uma marcante plasticidade fenotípica interpopulacional e
uma variação clinal, no sentido norte-sul do Atlântico, envolvendo diferentes
elementos seriais (Molina et al., 2006). Variações populacionais através de
marcadores moleculares RAPD, em espécimes coletados na costa dos estados da
Bahia e Rio Grande do Norte, além do Arquipélago de São Pedro e São Paulo,
sugerem a existência de significativo isolamento populacional da população desta
região insular (Rodrigues & Molina, 2007). Esses dados corroboram com as
divergências morfológicas populacionais entre essas regiões (Molina et al., 2006).
No Caribe, análises morfométricas indicaram variações morfológicas sobretudo
relacionadas à natação e alimentação, enquanto as análises genéticas sugeriram
um quadro de panmixia ao longo de 1.800 km da costa mexicana Atlântica (Piñeros
14
et al., 2015). Diante da extensão da distribuição espacial desta espécie, a utilização
de outros marcadores genéticos poderá ser mais útil para um melhor esclarecimento
sobre a estrutura populacional na costa e ilhas oceânicas do Brasil.
Já a Ordem Carangiformes é constituída por seis famílias, Nematistiidae,
Coryphaenidae, Rachycentridae, Echeneidae, Menidae e Carangidae (Nelson et al.,
2016), e contêm 161 espécies (Eschmeyer & Fong, 2017), muitas delas
representando importantes recursos para a indústria pesqueira e aquacultura
comercial (Jory et al., 1985; Olson & Galvan-Magana, 2002; Smith-Vaniz, 2002;
Laidley et. al., 2004; Smith-Vaniz & Carpenter, 2007; McMaster & Gopakumar,
2016).
Entre as espécies pelágicas, a família Carangidae é representada no litoral
brasileiro por 35 espécies, dentre elas Caranx lugubris (Menezes, 2003). Esta
espécie possui distribuição circuntropical, incluindo o Arquipélago de São Pedro e
São Paulo (Brasil). Neste arquipélago, foi descrita a ocorrência de dois padrões
morfológicos (morfótipos I e II) de C. lugubris, caracterizados principalmente quanto
ao forma do corpo e dos olhos e indícios de diversificação citogenética (Jacobina et
al., 2014). As causas da ocorrência destes morfótipos, apesar dos esforços, ainda
são inconclusivas. Alguns fatores podem estar relacionados à sua origem, tais como
como isolamento populacional e adaptação ambiental, invasões interoceânicas de
diferentes linhagens de C. lugubris ou hibridação. Apesar de esparsos estudos, a
ocorrência esporádica de híbridos naturais (Murakami et al., 2007; Santos et al.,
2011), complexos de espécies (Smith-Vaniz & Carpenter, 2007), e indícios de
ocorrência de espécies crípticas (Duarte et al., 2017) envolvendo espécies do
gênero Caranx foram documentadas e podem estar implicadas na origem dos
conspícuos padrões morfológicos desta espécie.
Desta forma, análises complementares utilizando outros marcadores
genéticos poderiam contribuir para a identificação da causalidade dos morfótipos no
entorno do Arquipélago de São Pedro e São Paulo, assim como revelar a estrutura
populacional de C. lugubris no Atlântico Sul.
Estruturas geográficas e geomorfológicas da costa brasileira
O Brasil possui o mais extenso litoral inter e subtropical do mundo,
estendendo-se por aproximadamente 8.000 quilômetros (km) de costa (Ab’Saber,
15
2003; Simões & Hazin, 2005) e cobrindo aproximadamente 38 graus de amplitude
latitudinal (Mattox et al., 2014). Toda essa extensão abrange diferentes
ecossistemas, tais como estuários, manguezais, lagoas costeiras, litorais arenosos e
rochosos, sistemas recifais, ilhas costeiras e oceânicas. O Brasil possui um domínio
oceânico com mais de 3,5 milhões de km² (Carvalho, 2005; Serafim, 2007), o que
corresponde a cerca de 41% da área territorial terrestre. A extensão da sua
plataforma continental varia de oito quilômetros, na altura do litoral da Bahia, a 370
quilômetros, na região da foz do rio Amazonas. A quebra entre a plataforma e o
talude continental ocorre entre 75 e 80 metros de profundidade (MMA, 2010) (Figura
1).
Quatro ilhas e/ou arquipélagos oceânicos fazem parte do território nacional e
são consideradas Unidades de Conservação, sendo elas, o Atol das Rocas (03°51'S,
33°48'O), arquipélagos de Fernando de Noronha (03°51'S, 32°25'O) e São Pedro e
São Paulo (0°55'N, 29°20'O), e Ilha de Trindade (20o30’S, 29o19’O) (Figura 1). O
Atol das Rocas possui aproximadamente 7,5 km2 e constitui o único atol presente no
Atlântico Sul (Kikuchi, 2002; Almeida, 2006), distante aproximadamente 233
quilômetros da costa do Rio Grande do Norte.
Figura 1. Atlântico Sul. IM - Ilha Margarita (Venezuela); ASPSP - Arquipélago de São Pedro e São
Paulo; AR - Atol das Rocas; FN - Arquipélago de Fernando de Noronha; IT - Ilha de Trindade;
Tracejado - Áreas sob estudo; Imagem modificada de GEBCO World Map 2014. Disponível em:
http://www.gebco.net.
16
Ao leste do Atol das Rocas, distante 156 km, está localizado o arquipélago
de Fernando de Noronha e sua área total é de aproximadamente 16,4 km2.
Fernando de Noronha encontra-se a uma distância de 360 km da costa do Rio
Grande do Norte e, junto com Atol das Rocas, faz parte da chamada Cadeia de
Fernando de Noronha. Esta cadeia é formada por pelo menos cinco montes
submarinos que se estendem no sentido Leste-Oeste e dos quais apenas o Atol das
Rocas e Fernando de Noronha encontram-se atualmente emersos (Mabesoone &
Coutinho, 1970; Almeida, 2006).
O arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP) está localizado a 1.000
km da costa brasileira e a 630 km a oeste de Fernando de Noronha. ASPSP possui
área total de aproximadamente 17.000 m2 e é composto por seis ilhas maiores,
quatro menores e vários rochedos emersos (Almeida, 2006; Viana et al., 2009).
As ilhas Trindade e Martin Vaz são as ilhas oceânicas mais isoladas em
relação ao continente sul-americano. Trindade possui um território de 13,5 km² e
encontra-se a aproximadamente 1.170 km da costa brasileira. Já Martin Vaz mede
cerca de 800 m de comprimento, 500 de largura e 175 de altura, localiza-se a 47 km
a leste da Ilha de Trindade. Entre a costa brasileira e estas duas ilhas há nove
montes submarinos que, juntos, estão orientados no sentido leste-oeste e compõe a
chamada Cadeia Vitória-Trindade (Almeida, 2006).
Apesar da aparente ausência de barreiras físicas que interfiram na
interligação da ictiofauna ao longo de todas essas localidades, algumas espécies
exibem diferentes amplitudes de distribuição geográfica. Enquanto que algumas
espécies de Carangidae, como C. lugubris, distribuem-se circuntropicalmente
(Menezes et al., 2003), outras limitam-se ao Atlântico tropical e partes do Indo-
Pacífico, como A. saxatilis (Menezes et al., 2003). Já espécies do gênero Stegastes,
possuem distribuição restrita ao pequeno Arquipélago de São Pedro e São Paulo
(Lubbock & Edwards, 1981)
Percebe-se que, apesar dos ambientes marinhos não apresentarem
barreiras que interrompam totalmente a dispersão e o fluxo entre populações, fatores
biológicos e físicos que podem interferir na conectividade e nos padrões de
distribuição das espécies. Fatores biológicos, como duração do período pelágico
larval e o potencial migratório das espécies, e físicos, como o desague de água doce
e sedimentos de grandes rios, e a intensidade e temperatura das correntes
oceânicas, podem modelar a biogeografia de diferentes regiões (Floeter et al., 2008;
17
Rodrigues et al., 2014; Souza et al., 2015). Dentre os fatores físicos, o imenso
desague de água doce e sedimentos do rio Amazonas têm sido apontado como uma
importante barreira biogeográfica e provável responsável pela maior parte do
endemismo encontrado nos ambientes costeiros brasileiros (Rocha, 2003). Além
deste, a ação das correntes oceânicas é outro fator importante na distribuição
biogeográfica. Uma das principais correntes no Atlântico Ocidental é a corrente Sul
Equatorial, que flui no sentido leste-oeste, passando por Fernando de Noronha, Atol
das Rocas, e alcançando a costa nordeste do Brasil, onde bifurca-se, formando a
Corrente do Brasil (sentido nordeste-sudeste do Brasil) e a Corrente Norte do Brasil.
A Corrente Norte do Brasil continua fluindo no sentido leste-oeste/noroeste,
passando pela costa norte brasileira e alcançando a Venezuela. Ao passar pela foz
do rio Amazonas, a força da corrente acaba direcionando o desague do Amazonas
para o noroeste, na direção da Guiana Francesa, onde o sedimento vai decantando
ao longo de uma extensa área (Castro & Miranda, 1998; Rocha, 2003; Lumpkin &
Garzoli, 2005). No extremo sul do Brasil, a Corrente das Malvinas tem sido apontada
como responsável pela estruturação populacional de algumas espécies (Santos et
al., 2006; Rodrigues et al., 2014).
Apesar do conhecimento de vários fatores que influenciam na distribuição
geográfica da ictiofauna brasileira a causalidade de muitos padrões biogeográficos
continua largamente desconhecidos para um grande número de espécies.
Análises genéticas e morfométricas na detecção da biodiversidade
A utilização de marcadores moleculares de DNA e análises morfométricas
vêm contribuindo de forma contundente na resolução de incertezas taxonômicas,
delineamentos populacionais e identificação de espécies crípticas e politípicas em
diversos grupos de peixes marinhos, incluindo espécies da família Pomacentridae e
Carangidae (Murakami et al., 2007; Schultz et al., 2007; Lima-Filho et al., 2012,
2016; Jacobina et al., 2014; Martinez-Takeshita et al., 2015; Souza et al., 2015;
Duarte et al., 2017).
No Brasil, incertezas taxonômicas não resolvidas devido à grande
sobreposição de caracteres merísticos, sobretudo em grupos que possuem
complexo de espécies como os Pomacentridae (Greenfield & Woods, 1974),
puderam ser melhor esclarecidas através de marcadores moleculares (Dias-Júnior e
18
Molina, 2008). O uso combinado de diferentes abordagens auxilia no entendimento
do processo evolutivo. Em algumas espécies marinhas, como Bathygobius
soporator, análises citogenéticas populacionais e morfológicas tanto variações
cromossômicas, como intensa plasticidade fenotípica, associada a condições
ecológicas particulares (Lima-Filho et al., 2012).
Algumas vezes diferentes abordagens evolutivas se mostram
complementares em evidenciar diferenciações populacionais. Em Abudefduf saxatilis
diferenças populacionais morfológicas foram evidenciadas em populações de
diferentes regiões costeiras e ilhas oceânicas brasileiras por análises morfométricas
e marcadores moleculares (Molina et al., 2006; Rodrigues & Molina, 2007). Em
outros casos, apesar da ocorrência de conspícuos padrões diferenciais de
coloração, análises genéticas revelaram ausência de distinção genética entre
diferentes colomorfos de Cephalopholis fulva, bem como um quadro de panmixia no
litoral brasileiro, incluindo as ilhas oceânicas (Souza et al., 2015).
Mais recentemente, a identificação taxonômica clássica e morfometria
multivariada não conseguiram distinguir uma possível espécie críptica dentre os
espécimes de Caranx crysos coletados na costa do Rio de Janeiro (Brasil), embora
sua existência tenha se tornado evidente a partir das análises genéticas (Duarte et
al., 2017). Além deste caso, análises moleculares também vêm complementando
análises morfométricas em outras espécies do gênero Caranx, inclusive na
identificação de híbridos no Havaí, Oceano Pacífico (Murakami et al., 2007; Santos
et al., 2011).
Diante do exposto, percebe-se que a utilização de marcadores moleculares e
morfométricos têm se mostrado uma poderosa ferramenta no estudo da ictiofauna
marinha. Além disso, os estudos acima descritos refletem o quão resolutivo podem
ser esses marcadores na exploração da biodiversidade de diferentes grupos,
incluindo os representantes das famílias abrangidas pelo presente estudo,
Pomacentridae e Carangidae.
19
OBJETIVO GERAL
O presente trabalho tem como objetivo a análise da diversidade inter e
intraespecífica de algumas espécies recifais das famílias Pomacentridae e
Carangidae provenientes de regiões costeiras e insulares (Arquipélagos de
Fernando de Noronha, São Pedro e São Paulo, Atol das Rocas e Ilha de Trindade)
do Atlântico Ocidental e região meso-Atlântica, por meio de análises moleculares e
morfométricas.
Objetivos específicos
• Avaliar o status taxonômico de espécies do gênero de Stegastes que
ocorrem na costa e ilhas oceânicas brasileiras através de morfometria
tradicional, morfometria geométrica multivariada e sequenciamento
parcial dos genes 16S, Citocromo c oxidase subunidade I, Citocromo B
(DNAmt), Rodopsina e rag1 (DNAn);
• Analisar as relações filogenéticas e validação taxonômica das espécies
insulares, S. rocasensis, S. sanctipauli e S. trindadensis, e costeiras, S.
variabilis e S. fuscus;
• Analisar a estrutura populacional da espécie Abudefduf saxatilis no
Atlântico ocidental e suas ilhas oceânicas, através do sequenciamento
da Região hipervariável 1 da Região Controle (DNAmt);
• Analisar a estrutura populacional da espécie Caranx lugubris de
diferentes regiões oceânicas e da costa brasileira através de
sequências parciais dos genes Rodopsina (DNAn), 16S, Citocromo B,
Citocromo c oxidase subunidade I, e Região Hipervariável 1 da Região
Controle (DNAmt), contribuindo para a análise da ocorrência simpátrica
e sintópica de diferentes morfótipos de C. lugubris no entorno do
Arquipélago de São Pedro e São Paulo.
20
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta dos espécimes
Os espécimes foram coletados com a utilização de anzóis e tarrafas em
diversas localidades ao longo do Atlântico ocidental, desde Ilha Margarita, na
Venezuela, até o sudeste do Brasil, incluindo as regiões insulares do Atol das
Rocas, arquipélagos de Fernando de Noronha, São Pedro e São Paulo, e Ilha de
Trindade.
Amostras biológicas (tecido muscular ou de nadadeira) foram retiradas,
acondicionadas em microtubos (2,0 ml) contendo álcool etílico (100%) e
armazenadas à -20°C para posterior análise em laboratório.
Análises moleculares
O DNA foi extraído de acordo com o protocolo preconizado por Sambrook et
al. (1989) ou Miller et al. (1988). Para as análises utilizamos genes e regiões do DNA
mitocondrial (Região Hipervariável 1 da Região Controle, 16S ribossomal RNA,
Citocromo c oxidase subunidade I e Citocromo B, e nucleares (Nuclear
recombination-activating gene 1 e Rodopsina), as quais foram amplificadas por meio
de reações em cadeia da polimerase (PCR).
Os produtos de PCR (5 μl) foram purificados com as enzimas exonuclease I
(3,3 U/reação) e fosfatase alcalina de camarão (SAP) (0,66 U/reação) (GE
Healthcare), no termociclador, submetendo o mix à ciclos de 30 minutos em 37ºC e
15 minutos em 80ºC conforme indicação do fabricante. As amostras foram
sequenciadas pela empresa ACTGene Análises Moleculares Ltda através do
sequenciador automático ABI-PRISM 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Os eletroferogramas obtidos foram conferidos com o auxílio do software
BioEdit (Hall, 1999) e alinhadas de forma múltipla e automática através do MUSCLE
(Edgar, 2004) por meio do software MEGA 7 (Kumar et al., 2016).
A saturação entre as transições e transversões nas sequências foram
verificadas pelo software DAMBE (Xia & Xie, 2001). O software jModelTest 2.1.4
(Darriba et al., 2012) foi utilizado para selecionar o melhor modelo evolutivo para as
sequências baseado em Akaike information criterion.
21
Árvores de haplótipos foram geradas através do software Network 4.5
utilizando o método median joining (Bandelt et al., 1999). As relações filogenéticas e
filogeográficas foram avaliadas através do software MEGA 7 (Kumar et al., 2016)
pelos métodos de neighbor-joining e maximum likelihood. A significância dos
agrupamentos foi estimada utilizando 1.000 réplicas de bootstrap.
Os níveis de diversidade genética, testes de neutralidade, através das
estatísticas Fs (Fu, 1997) e D (Tajima, 1989), estruturação populacional através da
estimativa de FST (Wright, 1978), análise hierárquica da variância molecular
(AMOVA) (Excoffier et al., 1992), e Teste de Mantel (Mantel, 1967) foram obtidas
através do Arlequin 3.5 (Excoffier & Lischer, 2010).
Análises morfométricas
Indivíduos sem injúrias foram utilizados nas análises morfométricas.
Contagens merísticas dos raios ramificados das nadadeiras dorsal, peitoral, anal e
das escamas da linha lateral foram obtidas.
A morfometria tradicional, a partir da mensuração de distâncias lineares,
permitiu a investigação de variações entre os espécimes, comparadas através da
Análise dos Componentes Principais (ACP) (Morrison, 1976), utilizando o software
SHEAR (MacLeod, 1990).
Foram realizadas dezesseis medições utilizando um paquímetro digital:
comprimento padrão, comprimento da cabeça, comprimento do focinho ou distância
pré-orbital, diâmetro ocular, altura máxima do corpo, comprimento pré-dorsal,
tamanho do último espinho da nadadeira-dorsal, comprimento do maior raio dorsal,
comprimento da base da nadadeira anal, comprimento do espinho da segunda
nadadeira anal, comprimento do raio anal mais longo, comprimento da nadadeira
peitoral, comprimento da nadadeira pélvica, comprimento da nadadeira caudal,
profundidade do pedúnculo caudal e largura interorbital.
Para explorar a variação de forma corporal no morfo-espaço foram utilizadas
análises através de morfometria geométrica. Os exemplares foram fotografados em
visão lateral esquerda com uma câmera digital Sony H10 de 8.1 megapixels, sob
distância e posição padronizadas. Nove landmarks foram digitalizados através do
software tpsDig v2.16 (Rohlf, 2010a) e as imagens ordenadas em um único arquivo
com o formato TPS através do software tpsUtil (Rohlf, 2010b). Em seguida, foi
22
realizada a superposição Procrustes (Dryden & Mardia, 1998), Análise de Variância
Multivariada (MANOVA) e Análise de Variáveis Canônicas (CVA). A partir da variável
canônica de maior influência na variação morfológica, foram obtidos grides de
deformação para identificar, com maior clareza, as variações vetoriais existentes
entre as espécies.
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Capítulo 1 A reappraisal of Stegastes species occurring in the South
Atlantic using morphological and molecular data
31
ABSTRACT
The taxonomic status of Pomacentridae species can be difficult to determine, due to
the high diversity, and in some cases, poorly understood characters, such as color
patterns. Although Stegastes rocasensis, endemic to the Rocas atoll and Fernando
de Noronha archipelago, and S. sanctipauli, endemic to the São Pedro and São
Paulo archipelago, differ in color pattern, they exhibit similar morphological
characters and largely overlapping counts of fin rays and lateral-line scales. Another
nominal insular species, S. trindadensis, has recently been synonymized with S.
fuscus but retained as a valid subspecies by some authors. Counts and
morphometric analyses and mitochondrial DNA (COI, 16S rRNA, CytB) and nuclear
DNA (rag1 and Rhodopsin) comparisons of three insular species (S. rocasensis, S.
sanctipauli and S. trindadensis) and three other South Atlantic species (S. fuscus, S.
variabilis and S. pictus) were carried out in the present study. Analyses of the
principal components obtained by traditional multivariate morphometry indicate that
the species in general have similar body morphology. Molecular analyses revealed
conspicuous similarity between S. rocasensis and S. sanctipauli and between S.
trindadensis and S. fuscus and a clear divergence between S. variabilis from
Northeast Brazil and S. variabilis from the Caribbean region. Our data suggest that S.
sanctipauli is a synonym of S. rocasensis, support the synonymy of S. trindadensis
with S. fuscus, and reveal the presence of a likely cryptic species in the Caribbean
that has been confused historically with S. variabilis.
Keywords: Pomacentridae, damselfish, species delimitation, taxonomy, insular
species
32
INTRODUCTION
Genetic analyses have revealed a large number of cryptic species in different
groups of fish (e.g., [1, 2]). The term “cryptic” species, although the definition is not
unanimous, generally refers to two or more distinct species that are nominally
classified as one due to the difficult-to-distinguish morphologies [3]. Morphological
variations with no genetic differences have been explained as phenotypic plasticity,
recent isolation, incomplete limits between species, or the product of selection [4]. On
the other hand, so-called polytypic species, in which genetically similar individuals of
one species display conspicuously different coloration or morphology, occur more
frequently [4, 5].
Inconsistencies between color patterns with morphology and genetic markers
are relatively common and have been reported for a number of fish families including
Pomacentridae [6-8]. This family, whose members are known as damselfishes, is one
of the most represented marine groups in reef environments [9]. Indeed,
damselfishes are a diverse group, with 399 species [10], whose taxonomic definition
is complicated by the occurrence of species complexes and marked variations in
coloration patterns among individuals and geographic areas [11-14].
The western Atlantic contains Pomacentridae representatives of the genera
Abudefduf (1 sp.), Microspathodon (1 sp.), Chromis (5 spp.), and Stegastes (7 spp.)
[13, 15-19]. Some Stegastes species are considered endemic of insular
environments of the South Atlantic, such as S. rocasensis Emery 1972, in the Rocas
Atoll (RA) and Fernando de Noronha Archipelago (FNA), and S. sanctipauli Lubbock
and Edwards 1981, exclusive to St. Paul’s Rocks. The first two oceanic formations
are part of an alignment of submarine volcanoes that make up the Fernando de
Noronha Chain [20, 21]. More southward, in the Trindade and Martim Vaz
Archipelago (TI), located in the easternmost part of the submarine mountain chain
called Vitoria-Trindade and Martim Vaz, 1,167 km off the coast of Espírito Santo
State, southeastern Brazil, S. trindadensis Gasparini, Moura and Sazima 1999, was
described and considered endemic to TI [20, 21].
Extensively overlapping morphometric characters in Stegastes (including the
synonyms Brachypomacentrus Bleeker and Eupomacentrus Bleeker), a
morphologically conservative group [22], in addition to cytogenetic [23] and dominant
marker similarities [24], reveal uncertainty regarding the taxonomic status and
33
phylogenetic relationships of S. rocasensis, S. sanctipauli and S. trindadensis, and
the last was recognized as a synonym of S. fuscus Cuvier 1830 by Gasparini and
Floater [16], Carter and Kaufman [25] and Pinheiro et al. [26]. Based only on
morphological criteria, S. rocasensis and S. sanctipauli have been considered similar
to each other and to S. variabilis Castelnau 1855 [22, 27]. Although scarce biological
information is available [14, 28, 29], there is some genetic data or information on its
evolutionary history [23, 30, 31]. In order to clarify the taxonomic status and
relationships of these three insular species and test the current hypotheses of
ancestrality [22, 27], counts comparisons of serial elements, traditional and geometric
multivariate morphometric analyses, and analyses of mitochondrial (16S ribosomal
RNA – 16S, Cytochrome oxidase subunit 1 – COI, and Cytochrome B – CytB) and
nuclear gene sequences (Nuclear recombination-activating gene 1 - rag1 and
Rhodopsin - rhod) were performed.
MATERIAL AND METHODS
Specimen collection
Individuals of Stegastes fuscus (MZUEL 8958, 22 specimens, 43.9-65.0 mm
SL; coast of Rio Grande do Norte state (RN) – 5o16’S, 35o22’W); S. rocasensis
(MZUEL 8956, 9, 36.6-66.5 mm SL; Rocas atoll (RA) - 3o51’S, 33o49’W); S.
rocasensis (MZUEL 8960, 18, 42.7-78.2 mm SL; Fernando de Noronha archipelago
(FNA) - 3o50’S, 32o24’W); S. sanctipauli (MZUEL 8959, 18, 58.3-80.1 mm SL; São
Pedro and São Paulo archipelago (SPSPA) - 3°50'S, 32°24'W); S. trindadensis
(MZUEL 13908, 12; Trindade island (TI) - 20o30’S - 29o19’W) and S. variabilis
(MZUEL 8957, 18, 33.3-57.2 mm SL; coast of Rio Grande do Norte state (RN) -
5o16’S - 35o22’W) were analyzed (Fig. 1 and 2). Fragments of muscle tissue or fins
were removed and stocked in microtubes (1.5 ml) with absolute ethanol and stored at
-20°C. Voucher specimens were fixed in 10% formaldehyde, preserved in 70%
ethanol and deposited in the Museu de Zoologia from Universidade Estadual de
Londrina (MZUEL - Table 1).
34
Fig. 1 Map showing the geographic distributions of Stegastes variabilis and S. fuscus
(red), S. rocasensis (blue), S. sanctipauli (green) and S. trindadensis (yellow). FNA -
Fernando de Noronha archipelago; RA - Rocas atoll; SPSPA - São Pedro e São
Paulo archipelago; TI - Trindade island.
35
Fig. 2 Specimens of A. Stegastes variabilis Castelnau 1855, B. S. fuscus Cuvier
1830, C S. sanctipauli Lubbock and Edwards 1981, D. S. rocasensis Emery 1972, E.
S. trindadensis Gasparini, Moura and Sazima 1999, F. S. pictus Castelnau 1855.
Figures indicated by lower case letters correspond to the juveniles of the respective
species. Bars 1 cm
36
Table 1. Stegastes specimens analyzed and GenBank accession numbers of mitochondrial and nuclear sequences used in phylogenetic
estimates
Taxonomic
identification
Collection
sites
n Deposited
vouchers*
GenBank access number**
16S COI CytB rag1 rhod
S. pictus RA 3 MZUEL 08955 KM077255-57 KM077183-85 KM077201-03 KM077219-21 KM077237-39
S. variabilis RN 3 MZUEL 08957 KM077258-60 KM077186-88 KM077204-06 KM077222-24 KM077240-42
S. fuscus RN 3 MZUEL 08958 KM077261-63 KM077189-91 KM077207-09 KM077225-27 KM077243-45
S. rocasensis RA 3 MZUEL 08956 KM077264-66 KM077192-94 KM077210-12 KM077228-30 KM077246-48
S. rocasensis FNA 3 MZUEL 08960 KM077267-69 KM077195-97 KM077213-15 KM077231-33 KM077249-51
S. sanctipauli SPSPA 3 MZUEL 08959 KM077270-72 KM077198-200 KM077216-18 KM077234-36 KM077252-54
S. trindadensis TI 3 MZUEL 13908 KX066003-05 KX066006-08 KX066009-11 KX066012-14 KX066015-17
Macrodon
ancylodon***
- 1 - AY253541 JQ365417 AY253604 KP722921 KP723010
Haemulon
aurolineatum***
- 1 - JQ740958 JQ741187 JQ741415 KF141251 EF095619
* Museu de Zoologia from Universidade Estadual de Londrina (MZUEL); ** Sequences obtained in this study. RA Rocas atoll; RN Rio Grande do Norte state; FNA
Fernando de Noronha archipelago; SPSPA São Pedro and São Paulo archipelago; TI Trindade island; *** Sequences from GenBank
37
Counts, traditional and geometric multivariate morphometry
Injury-free adults of the species identified as Stegastes fuscus (n=31); S.
variabilis (n=18), S. rocasensis (n=5; RA); S. rocasensis (n=18; FNA); S. sanctipauli
(n=17); and S. trindadensis (n=26) were used in morphometric analyses. Counts of
branched rays in dorsal, pectoral and anal fins and lateral-line scales were obtained
for all the specimens.
Multivariate morphometry based on measuring linear distances made it
possible to investigate variations among species of Stegastes, compared by Principal
Component Analysis (PCA) [32], using SHEAR software [33]. Sixteen
measurements were taken with a digital caliper: standard length, head length, snout
length, orbit diameter, greatest body depth, predorsal length, length of last dorsal-fin
spine, length of longest dorsal ray, anal-fin base length, length of second anal-fin
spine, length of longest anal ray, pectoral-fin length, pelvic-fin length, caudal-fin
length, caudal-peduncle depth, and interorbital width.
Geometric morphometrics analyses were used to explore the variation in
body shape in morphospace. Left side view photographs of the specimens were
taken with an 8.1 megapixel Sony H10 camera, at a standard distance and position.
Nine landmarks were digitized: 1. distal extremity of the premaxillary bone; 2. origin
of dorsal fin; 3. end of dorsal fin; 4. origin of the anal fin; 5. end of the anal fin; 6.
origin of the ventral fin; 7. insertion of pectoral fin; 8. posterior and 9. anterior orbit
using tpsDig v2.16 software [34] and the images were ordered into a single TPS
format with tpsUtil software [35]. Next, Procrustes superimposition [36], Multivariate
Analysis of Variance (MANOVA) and Canonical Variables Analysis (CVA) were
carried out. Deformation grids were obtained from the canonical variables that most
influenced morphological variation, in order to more clearly identify vector variations
between species.
DNA extraction, PCR amplification and DNA sequencing
Molecular analyses involved extracting DNA from three individuals of
Stegastes fuscus, S. variabilis, S. pictus, S. sanctipauli, and S. trindadensis and six
of S. rocasensis (three from Rocas atoll and three from Fernando de Noronha
archipelago).
38
Total DNA was extracted from muscle tissue according to proteinase
K/phenol-chloroform protocols [37] Fragments of three mitochondrial genes (16S,
COI, and CytB) and two nuclear genes (rag1 and rhod) from each individual were
amplified using the polymerase chain reaction method (PCR). The PCRs were
prepared to a final volume of 25 μl containing: 1.0 μl of total DNA (50 ng/μl), 3.0 U of
Taq polymerase, 1.0 μl of 50 mM MgCl2, 1.0 μl of 10× buffer, 1.0 μl of 10 mM dNTP
(deoxyribonucleotide triphosphate), 1.0 μl of each primer (10 μM), and ultrapure
water to complete the final volume of the reaction. The thermal profiles for PCR were
as follows: 95oC for 5 min, followed by 35 cycles at 95oC for 30 s, annealing
temperature for 45 s (Table 2), and 72oC for 45 s, with final elongation at 72oC for 7
min.
The PCR products (5 μl) were purified with exonuclease I enzymes (3.3
U/reaction) and shrimp alkaline phosphatase (0.66 U/reaction) (GE Healthcare), in a
thermal cycler, submitting the mix to a 30-min cycle at 37oC and 15 min at 80oC. The
samples were sequenced in ACTGene Análises Moleculares Ltda. through the ABI-
PRISM 3500 Genetic Analyzer automatic DNA sequencer (Applied Biosystems).
Table 2. Primers used to amplify sequences of mitochondrial and nuclear genes of
Stegastes species.
Gene primers Tm oC References
16S L1987 (5’- GCC TCG CCT GTT TAC CAA AAA C - 3’)
H2609 (5’- CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T - 3’)
52 [65]
COI COI-FishF2 (5’- TCG ACT AAT CAT AAA GAT ATC GGC
AC - 3’)
COI-FishR2 (5’- ACT TCA GGG TGA CCG AAG AAT
CAG AA - 3’;
50 [66]
CytB FishcytB-F (5' - ACC ACC GTT GTT ATT CAA CTA CAA
GAA C– 3’)
CytBI-5R (5' – GGT CTT TGT AGG AGA AGT ATG GGT
GGA A– 3’)
52 [67]
rhod Rod-F2w (5' – AGC AAC TTC CGC TTC GGT GAG AA –
3’)
Rod-R4n (5' – GGA ACT GCT TGT TCA TGC AGA TGT
AGA T – 3’)
60
[67]
rag1 RAG1-F3 (5’-GCC TCA GAA AAC ATG GTG CT -3’)
RAG1-R3 (5’- CCA CAC AGG TTT CAT CTG GA -3’) 50
[68]
Tm Melting Temperatures
39
Analysis of sequences
The electroferograms obtained were verified using BioEdit software [38]. The
sequences of each gene were aligned using MUSCLE [39] in the MEGA 6 software
package [40]. The sequences of mitochondrial (16S, COI and CytB) and nuclear
genes (rag1 and rhodopsin) from each individual were concatenated, forming a
single nucleotide sequence. Sites with gaps were excluded from all genetic analyses.
Sequences of the COI gene of 22 additional Stegastes species or
populations were obtained from BOLD (www.boldsystem.org) and used for the
comparative analyses. The mean genetic divergence rates (Kimura-2-parameter
model) and the neighbor-joining tree were obtained with the MEGA 6 software [40].
The relationships among insular species (S. sanctipauli, S. rocasensis and S.
trindadensis) were determined by the Maximum Likelihood Method using MEGA 6
software [40]. The best evolutionary method for the sequences was determined by
jModelTest2 software [41] using the Akaike information criterion. Macrodon
ancylodon (Sciaenidae) and Haemulon aurolineatum (Haemulidae) were used as
outgroups. These families are outgroup candidates because they, along with the
Pomacentridae, are members of order Perciformes [42, 10]. The number of
polymorphic sites along the sequences was estimated using DnaSP 5 software [43],
while mean genetic divergence rates (p-distances) and the mean number of intra and
interspecific nucleotide differences were estimated by MEGA 6 software [40].
RESULTS
Quantification of Fin Rays and Lateral-line Scales
Frequency distributions of counts of fin rays and lateral-line scales are
presented in Table 3. There is great similarity among species, except for S. pictus,
which modally exhibits fewer pectoral-fin rays than the other species. Numerical
differences were observed between counts taken in populations of S. variabilis from
Brazil and those described for Caribbean region [44]. Counts do not discriminate
among S. fuscus, S. variabilis, S. rocasensis and S. sanctipauli.
40
Principal Component Analysis (PCA)
The first principal component retained 88.6% of data variance, whereas in
the second and third axes (sPC2 and sPC3), it was 2.6% and 2.1%, respectively
(Table 4). The first PC is positively related to all measurements and was interpreted
as being related to size, while the second and third, with positive and negative
values, respectively, represent the shape. The individual scores for the species
revealed partial overlapping among them in these components (Fig. 3). However, in
the second axis, S. variabilis was completely separated from S. rocasensis, S.
trindadensis and S. sanctipauli, but with greater similarity to S. fuscus, whereas S.
fuscus presented intermediate scores between these species. The individuals
identified as S. sanctipauli and S. rocasensis are not separated morphometrically
along sPC2 and sPC3. In the third axis S. trindadensis is separated from S.
rocasensis (Fig. 3). The samples identified as S. rocasensis from Fernando de
Noronha archipelago and S. rocasensis from Rocas atoll are not separated in any of
the axes, nor is the sample of S. sanctipauli.
The variables that discriminate S. fuscus and S. variabilis from S. rocasensis,
S. trindadensis and S. sanctipauli by the second PC are caudal peduncle depth,
interorbital width and body depth (positive loadings, Table 4). By contrast, the
variables with the highest values in S. rocasensis, S. trindadensis and S. sanctipauli
are length of the longest anal ray, length of the second anal spine, snout length, and
length of the longest dorsal ray (negative loadings in Table 4). Stegastes trindadensis
differs from both populations of S. rocasensis by having a longer pelvic fin, last dorsal
spine, anal-fin base, and longest dorsal ray (positive loadings, Table 4), and shorter
snout, smaller orbit diameter, and shorter head (negative values, Table 4).
41
Table 3. Frequency distribution of counts for 7 species of Stegastes from the
Western Atlantic
Dorsal rays
Species N 12 13 14 15 16 17 Variation Mean
S. sanctipauli* 21 - - 1 20 - - 14-15 14.9
S. sanctipauli 11 - - 1 10 - - 14-15 14.9
S. rocasensis* 36 - 1 3 31 1 - 13-16 14.9
S. rocasensis (RA) 9 - - 2 6 1 - 14-16 14.8
S. fuscus 18 - - 2 15 1 - 15-16 14.9
S. variabilis* 57 - - 3 23 29 2 14-17 15.5
S. variabilis 10 - - 4 6 - - 14-15 14.6
S. pictus 13 - - - 7 6 - 15-16 15.5
S. trindadensis* 23 - - - - - - 14-17 -
S. trindadensis 12 - - - - - 12 17 17
Anal rays
Species N 11 12 13 14 15 16 Variation Mean
S. sanctipauli* 21 - - 21 - - - 13 13.0
S. sanctipauli 11 - - 9 2 - - 13-14 13.2
S. rocasensis* 36 - - 36 - - - 13 13.0
S. rocasensis (RA) 9 - - 7 2 - - 13-14 13.2
S. fuscus 18 - 3 9 6 - - 12-14 13.2
S. variabilis* 57 - 1 20 32 4 - 12-15 13.7
S. variabilis 10 - 3 7 - - - 12-13 12.7
S. pictus 13 - 1 4 7 1 - 12-15 13.6
S. trindadensis* 23 - - - - - - 13-15 -
S. trindadensis 12 - - 1 7 4 - 13-15 14.2
Pectoral rays
Species N 17 18 19 20 21 22 Variation Mean
S. sanctipauli* 21 - - 2 18 1 - 19-21 19.9
S. sanctipauli 11 - - 1 10 - - 19-20 19.9
S. rocasensis* 36 - - 2 31 3 - 19-21 20.0
S. rocasensis (RA) 9 - - 1 8 - - 19-20 19.9
S. fuscus 18 - - 2 8 8 - 19-21 20.3
S. variabilis* 57 - 1 16 38 2 - 18-21 19.7
S. variabilis 10 - - 1 7 2 - 19-21 20.1
S. pictus 13 1 11 1 - - - 17-19 18.0
S. trindadensis* - - - - - - - 19-21 -
S. trindadensis 12 - 1 11 - - - 18-19 18.9
Lateral line-scales
Species N 16 17 18 19 20 21 Variation Mean
S. sanctipauli* 12 - - - 2 19 - 19-20 19.8
S. sanctipauli 11 - - - - 11 - 20 20.0
S. rocasensis* 36 - - 2 4 29 1 18-21 19.8
S. rocasensis (RA) 9 - - - 2 7 - 19-20 19.8
S. fuscus 18 - - - - 15 3 20-21 20.2
S. variabilis* 57 - - 2 28 27 - 18-20 19.4
S. variabilis 10 - - - 1 9 - 19-20 19.9
S. pictus 13 - - - 1 12 - 19-20 19.9
S. trindadensis* 23 - - - - - - 19-21 -
S. trindadensis 12 - - - 1 10 1 19-21 20.0
Literature data for S. variabilis and S. pictus [44], S. rocasensis [22], S. sanctipauli [27] and S.
trindadensis [17] are highlighted with an asterisk; RA Rocas Atoll.
42
Table 4. Variable loadings from sheared principal components analysis for
morphometric characters of Stegastes species
Principal component PC1 sPC2 sPC3
Percentage of variance 88.63 2.640 2.118
Variables
Standard length 0.258112 -0.001448 -0.210450
Head length 0.241320 0.047276 -0.232662
Snout length 0.303126 -0.296250 -0.552961
Orbit diameter 0.200732 -0.020172 -0.235335
Greatest body depth 0.255074 0.319120 -0.100978
Predorsal length 0.246296 0.030081 -0.044675
Length of last dorsal spine 0.240925 0.016873 0.384464
Length of longest dorsal ray 0.276920 -0.264052 0.202150
Anal fin base length 0.237181 0.094722 0.219734
Length of second anal spine 0.245731 -0.383452 0.149272
Length of longest anal ray 0.261460 -0.477297 0.144833
Pectoral fin length 0.241844 0.114243 0.014072
Pelvic fin length 0.201796 0.123833 0.466247
Caudal fin length 0.271083 -0.167673 -0.092469
Caudal peduncle depth 0.241178 0.406146 0.017068
Interorbital width 0.258160 0.360734 -0.140756
43
Fig. 3 Dispersion diagram of individual scores in the Principal Components Analysis
of Stegastes fuscus (blue diamonds), S. rocasensis (Fernando de Noronha
archipelago, pink squares), S. rocasensis (Rocas atoll, yellow triangles), S.
sanctipauli (X), S. variabilis (violet squares with an asterisk), and S. trindadensis
(green circles), in the space defined by sPC2 and sPC3.
Geometric morphometric analysis
Canonical variables 1 and 2 contributed more to the shape variation among
samples of Stegastes (Procrustes MANOVA: SS = 0.086; df = 70; F = 11.93; p =
<0.001; Pillai’s trace = 2.37; Pillai’s trace p = <0.001), accounting for 83.7% (CV1 =
57.3; CV2 = 26.4; p <0.001). The individual scores of the species demonstrate a
marked overlap in the morphospace of S. fuscus and S. variabilis along the two axes.
Stegastes sanctipauli individuals overlapped with those of S. rocasensis (RA; FNA)
(Fig. 4). Stegastes rocasensis individuals of RA and FNA were more discriminated
between each other than with the sample of SPSPA. The deformation grids obtained
from CV2 show morphological distinctions between S. fuscus and S. variabilis
relative to landmarks 1-3 and 6-9, which are related to the position of the fins (anal,
44
dorsal, pelvic and pectoral), mouth and eyes (Fig. 4a). The warped outlines
generated from CV1 data demonstrate the morphological diversification of S.
rocasensis and S. sanctipauli in relation to the position of landmarks 2-7 (Fig. 4b),
which correspond primarily to variations in anterior and posterior body height. Body
variations between S. fuscus and S. trindadensis show differences in pectoral- and
anal-fin position, as well as body length and height (Fig. 4c).
Fig. 4 Analysis of the canonical variables of body shape data of Stegastes fuscus
(blue diamonds), S. rocasensis (Fernando de Noronha archipelago, pink squares), S.
rocasensis (Rocas atoll, yellow triangles), S. sanctipauli (X), S. trindadensis (green
circles) and S. variabilis (violet squares with an asterisk), between the CV1 and CV2
axes (CV1=57.3% and CV2=26.4%). The deformation grids illustrate the variation in
body shape of a Stegastes fuscus and S. variabilis, b S. rocasensis and S.
sanctipauli, and c S. fuscus and S. trindadensis on CV1.
Genetic variation
For genetic diversity analyses 90 nucleotide sequences were generated, 18
for each of the five molecular markers analyzed. The access numbers of sequences
in GenBank are listed in Table 1. After the alignments the sequences resulted in 540
45
base pairs (bp) of gene 16S, 668 bp of CytB, 633 bp of COI, 290 bp of rag1 and 449
bp of rhodopsin. The concatenation of five fragments resulted in consensus
sequences of 2,580 bp, which were used in genetic comparisons.
Stegastes sanctipauli (SPSPA) and S. rocasensis (FNA/RA) specimens
shared identical haplotypes for all the genes, except for one specimen of S.
rocasensis from the FNA, which exhibited a mutation (ts G A) in the CytB gene.
Stegastes variabilis showed more genetic differences in relation to S. rocasensis, S.
sanctipauli and S. trindadensis than to the coastal species S. fuscus. The mean
number of intraspecific nucleotide differences ranged from 0 to 2 (Table 5). The
nucleotide diversity of concatenated sequences was extremely low in S. rocasensis
from FNA and RA, and absent in S. sanctipauli and S. rocasensis from RA (0 ± 0.0).
The highest mean nucleotide differences in the species under study was found
between S. pictus and S. variabilis (228 ± 13).
Comparative genetic analyses
A neighbor-joining analysis of the COI sequences with 27
species/populations shows that the genetic distance among species ranges from
0.000 0.000 to 0.207 0.021 (Supplementary Material - Table 1). Genetic distance
values of 0.000 0.000 were observed between Stegastes rocasensis from literature
and present study, between S. rocasensis and S. sanctipauli, and between S. pictus
from literature and present study. A genetic distance of 0.001 0.001 was observed
between S. trindadensis and a sample of S. fuscus analyzed in the present study.
Between S. variabilis and a sample of S. fuscus analyzed in the present study a
genetic distance of 0.040 0.008 was observed. The relationship among samples is
showed in the Fig. 5.
Maximum likelihood using the concatenated sequences of 16S, COI, CytB,
rag1 and rhod genes produced resolved clusters with high bootstrap values that
clarify the relationships among Atlantic species of Stegastes (Fig. 6). In both
analyses (COI and concatenated sequences) the data clearly demonstrate a clade
formed by S. rocasensis (RA and FNA) and S. sanctipauli, whose individuals are
genetically the same, as well as almost complete genetic similarity between S. fuscus
and S. trindadensis. Stegastes variabilis and S. pictus show a low genetic similarity
with insular forms.
46
Table 5. Mean pairwise distances (p-distance) (lower diagonal) and mean number of intraspecific (in parentheses) and interspecific
(upper diagonal) nucleotide differences with their respective standard errors based on partial sequences of 16S, COI, CytB, rag1 and
rhodopsin genes (2,580 bp).
Species 1.
(0.6 ± 0.6)
2.
(2 ± 1.1)
3.
(1.3 ± 0.9)
4.
(0 ± 0.0)
5.
(0.6 ± 0.6)
6.
(0.0 ± 0.0)
7.
(0.0 ± 0.0)
1. S. pictus - 213±13 206±12 204±12 204±12 204±12 206±12
2. S. variabilis 0.087±0.005 - 202±13 214±13 214±13 214±13 201±13
3. S. fuscus 0.084±0.004 0.083±0.005 - 88±8.0 89±8.0 88±8.0 3.6±1.8
4. S. rocasensis RA 0.084±0.005 0.088±0.005 0.036±0.004 - 0.3±0.3 0.0±0.0 87±8.0
5. S. rocasensis FNA 0.084±0.005 0.088±0.005 0.036±0.004 0.000±0.000 - 0.3±0.3 87±8.0
6. S. sanctipauli 0.084±0.005 0.088±0.005 0.036±0.004 0.000±0.000 0.000±0.000 - 87±8.0
7. S. trindadensis 0.084±0.004 0.088±0.005 0.001±0.004 0.035±0.003 0.035±0.003 0.035±0.003 -
Analysis based on 1000 bootstrap replications; Gaps were considered a pairwise deletion; RA Rocas atoll, FNA Fernando de Noronha archipelago.
47
Fig. 5 Neighbor-joining tree derived from COI sequences of Stegastes. Analysis based on
the Kimura-2-parameter evolutionary model with 1000 bootstrap replicates (only values
higher than 70 shown); SPSPA São Pedro and São Paulo archipelago, RA Rocas atoll, FNA
Fernando de Noronha archipelago, TI Trindade island.; Numbers below branches indicate
bootstrap percentages; Numbers before species names refer to BOLD sequences; The COI
sequences obtained in this study are highlighted.
48
Fig. 6 Maximum likelihood tree based on the combination of 16S, COI, CytB, rag1
and rhod (2,580 pb) sequences of Stegastes. Analysis based on the GTR+G
evolutionary model with 1000 bootstrap replicates. Highlighted are the close
relationships between the insular species S. rocasensis and S. sanctipauli and
between S. fuscus and S. trindadensis. SPSPA São Pedro and São Paulo
archipelago; RA Rocas atoll; FNA Fernando de Noronha archipelago; TI Trindade
island. Numbers below branches indicate maximum likelihood bootstrap percentages.
49
DISCUSSION
Morphological approaches, associated with mitochondrial- and nuclear-gene
analyses between continental and insular species of Stegastes in the western
Atlantic displayed putative incongruities with respect to the taxonomic status
attributed to the insular species S. rocasensis, S. sanctipauli, and S. trindadensis.
Classification of Stegastes species is particularly dependent on color
patterns, given that they exhibit conservative morphology [12]. Indeed, discrimination
of some species through the exclusive use of phenotypic criteria has been
problematic [45], since it reveals limited or ambiguous morphological characters or
those with significant plasticity. Furthermore, phenotypic variations are not always
effective phylogenetic characters, given that they may reflect adaptations to different
ecological regimes to which the species are subjected in their distribution area [46].
Aspects of coloration have masked the marked morphological similarities
between Stegastes rocasensis and S. sanctipauli as observed in the present study.
The juveniles and adults of the former are notably bicolored (blue dorsally and yellow
ventrally), exhibiting dark lines on the side of the body in large individuals. Stegastes
sanctipauli exhibits bright yellow to dark green or yellowish-brown coloration in
adults, whereas juveniles have yellow heads and bodies, darkening slightly on the
dorsal portion. Dark lines are observed on the flanks below the lateral line. The
presence of a body with yellow color patterns is also shared with S. variabilis. On the
other hand, juvenile Stegastes fuscus exhibits bright-blue coloration on the dorsum,
becoming lighter ventrally, and adults are largely brown. Stegastes trindadensis
displays similar coloration to that of the continental species S. fuscus, from which it is
distinguished in the juvenile phase by the yellow coloration of the beginning of the
dorsal fin [14].
In the Fernando de Noronha archipelago, Rocas atoll and São Pedro and
São Paulo archipelago, the abundance of S. rocasensis and S. sanctipauli individuals
is directly related to the structural composition of the environment and diversity of the
substrate cover [47]. In this respect, these insular regions can mobilize phenotypic
responses adaptive to different selective pressures, both in terms of body shape and
coloration of individuals from each region. Abnormal body coloration has been
described in individual species of Stegastes [48], including four of those analyzed
here: S. fuscus, S. variabilis, S. rocasensis and S. pictus [14, 15 ,50]. These
50
variations can be due to non-genetic factors [14], or even, in this or other genera,
intrapopulational characteristics, without being necessarily supported, however, by
very high levels of genetic differentiation [51].
Menezes and Figueiredo [52] underscored the greater similarity in coloration
and morphological characters between S. fuscus, S. rocasensis and S. sanctipauli,
compared to other species of Stegastes on the Brazilian coast. Indeed, the modal
values of counts in the three species are largely concordant, with marked overlapping
of minimum and maximum values. However, this did not occur with S. pictus, which
show a lower value for pectoral rays (18).
Analyses of the principal components obtained by traditional multivariate
morphometry indicated that the species in general have similar body morphology. In
relation to insular forms, S. rocasensis from RA and FNA exhibit overlapping
morphological aspects. These two populations of S. rocasensis demonstrated
markedly similar morphology to that of S. sanctipauli, and accurate ordering on the
sPC2 and sPC3 axes. In fact, both species display morphological patterns more
similar to each other than to the other species of Stegastes analyzed. On the other
hand, the continental species S. variabilis exhibits only partial discrimination of
insular individuals, which could suggest the effect of different environmental
pressures.
Although morphological diversification occurs between Stegastes species,
they share conservative body patterns. Similarly to multivariate analyses, geometric
morphometry analyses also show significant morphological similarity between S.
rocasensis (FNA) and S. sanctipauli. Curiously, subtle body differences were more
common between S. rocasensis individuals from RA and FNA, than with S.
sanctipauli. This may be caused by distinct environmental factors, causing a
disruptive selection of morphotypes adapted to local conditions. Indeed, as a
response to environmental characteristics, many fish species demonstrate
considerable phenotypic plasticity that increases their aptitude to a determinate
environment [53]. When compared to other insular ecosystems, the low habitat
diversity of Rocas atoll [54] may have driven the morphological changes observed in
the population of S. rocasensis from RA due to the different ecological resources in
the systems [46, 55,56].
Variations in body shape between the species of Stegastes analyzed were
significant in terms of the positions of the dorsal and anal fins, and body height.
51
These ecomorphological divergences suggest adaptations related to the swimming
process, with direct implications on habitat use [57], biotic interactions [58] and
foraging [59]. On the other hand, morphological changes in position and mouth size
could reflect different degrees of food specialization, especially in relation to the type
and potential size of the prey [60]. The phenotypic plasticity identified in populations
of S. rocasensis from RA, FNA and SPSPA indicate an intense environmental effect
on the local adaptive patterns of each population. Indeed, in the damselfish
Abudefduf saxatilis, counts and multivariate morphometry analyses between different
populations, revealed clinal variation between northeastern/RA-SPSPA regions and
the southern coast of Brazil, in addition to marked morphological differences between
the populations of Rocas atoll, Fernando de Noronha archipelago and São Pedro
and São Paulo archipelago [61]. This condition has been identified in other Atlantic
species, such as the frillfin goby (Bathygobius soporator), which exhibits significant
morphological variations between contiguous populations along the Brazilian coast,
the action of ecological factors being the likely mobilizers of morphological
diversification [46].
In groups with marked phenotypic plasticity, such as Pomacentridae, genetic
analyses are particularly revealing regarding population structuring [51], or defining
the biological status of groups whose morphological characteristics have not been
resolved. Analyses of 16S, COI, CytB, rag1 and rhod gene sequences, widely used
in phylogenetic evaluation, enabled the assessment of taxonomic status and the level
of genetic divergence between the insular forms S. rocasensis, S. sanctipauli and S.
trindadensis in relation to other congeneric species. In this respect, despite the
various sequences used, S. rocasensis and S. sanctipauli showed no genetic
divergence between them, suggesting that they represent a single species. Similarly,
a very low genetic divergence was identified between S. fuscus and S. trindadensis
(0.1%). Our genetic data support the synonymy of S. trindadensis with S. fuscus and
do not support subspecific division within that species.
Analyses with the COI sequences of Stegastes species confirm that samples
of S. rocasensis (our data and also data from the literature) and S. sanctipauli are
genetically identical. The genetic distance between our samples of S. trindadensis
and S. fuscus also show that they are almost identical. A single record in the BOLD
database identified as S. fuscus does not match our sequences of S. fuscus but
matches sequences of S. diencaeus and appears to be a misidentification. A
52
comparison between our data for S. pictus and the BOLD data shows no difference
between them. On the other hand, a comparison of our COI data of samples of S.
variabilis from northeast Brazil with sequences of S. variabilis from the Caribbean
area showed a genetic distance between them of d= 0.040 0.008. Barcoding
studies with fishes showed that the genetic distance (based on the Kimura-2-
parameter model) between species usually is around 2% [62]; thus, the present data
on S. variabilis suggest the possible occurrence of a cryptic species. Although counts
of more Brazilian specimens of S. variabilis are needed, Table 3 indicates that there
may be modal differences in some counts between Brazilian and Caribbean
populations.
Stegastes sanctipauli was described as endemic to SPSPA, an insular region
approximately 600 km from FNA and 700 km from RA, an occurrence site of S.
rocasensis. The occurrence of S. rocasensis in the remote SPSPA [63] can indicate
color polymorphisms or evidence of sporadic recruitment between these two areas.
Nevertheless, it demonstrates a more geographically or morphologically diffuse
situation than was previously believed. Thus, the evidence that S. rocasensis and S.
sanctipauli are the same species suggests the occurrence of color polymorphism
maintained by different selective pressures between these insular regions. Recent
evidence of phylogeographic patterns in the Brown Chromis (Chromis multilineata)
demonstrates gene flow, involving FNA and SPSPA [51]. Despite the suggestion of
greater isolation in the SPSPA population, also identified for S. sanctipauli [24], the
population of this species exhibits moderate genetic structuring between the insular
regions and other coastal populations. Our morphological and genetic data show that
the physical distance between the sites of S. rocasensis and S. sanctipauli
apparently do not preclude gene flow between these occurrence areas.
CONCLUSION
It cannot be ruled out that S. rocasensis, S. sanctipauli and S. fuscus from
Trindade Island (S. trindadensis) may represent species in statu nascendi [64], where
reproductive isolation remains incomplete, but the absence of genetic differentiation
and distinct morphological characters between S. rocasensis and S. sanctipauli and
between S. trindadensis and S. fuscus is strong evidence for the recognition of two
53
vs. four species. On the other hand, the differentiation observed between Brazilian
and Caribbean S. variabilis is strong evidence of a putative new species.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors thank the National Counsel of Technological and Scientific
Development (CNPq - Proc. 141234/2009-1; 309879/2013-2; 442664/2015-0) for
financial support, and for the research scholarship awarded to ASS and RXS, and
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade for the specimen
collection license (#19135-5).
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60
Supplementary material Table 1. Genetic divergence (Kimura-2-parameter) among Stegastes species (lower diagonal) with their
respective standard errors (upper diagonal) based on partial sequences of COI (658 bps).
Species 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
1 Stegastes_adustus
0,017 0,016 0,013 0,009 0,017 0,014 0,009 0,014 0,017 0,017 0,018 0,016 0,016 0,017 0,018 0,017 0,016 0,014 0,018 0,013 0,013 0,014 0,014 0,016 0,012 0,012
2 Stegastes_albifasciatus 0,158
0,017 0,018 0,018 0,016 0,018 0,018 0,018 0,016 0,008 0,015 0,012 0,018 0,018 0,016 0,018 0,018 0,016 0,015 0,017 0,016 0,017 0,017 0,019 0,019 0,020
3 Stegastes_arcifrons 0,132 0,152
0,014 0,016 0,018 0,014 0,016 0,012 0,017 0,017 0,018 0,019 0,015 0,017 0,017 0,016 0,015 0,014 0,018 0,012 0,012 0,012 0,012 0,013 0,016 0,015
4 Stegastes_beebei 0,105 0,170 0,111
0,013 0,016 0,012 0,013 0,014 0,017 0,019 0,018 0,018 0,015 0,017 0,019 0,017 0,016 0,014 0,017 0,012 0,013 0,014 0,014 0,015 0,015 0,014
5 Stegastes_diencaeus 0,057 0,175 0,134 0,103
0,018 0,013 0,000 0,015 0,016 0,018 0,018 0,017 0,015 0,017 0,019 0,017 0,016 0,015 0,018 0,014 0,014 0,015 0,015 0,016 0,010 0,011
6 Stegastes_faciolatus 0,157 0,148 0,162 0,148 0,172
0,019 0,018 0,018 0,018 0,016 0,020 0,017 0,018 0,019 0,016 0,021 0,020 0,016 0,019 0,018 0,017 0,018 0,018 0,020 0,019 0,019
7 Stegastes_flavilatus 0,106 0,177 0,118 0,091 0,094 0,188
0,013 0,015 0,017 0,018 0,018 0,018 0,016 0,016 0,020 0,016 0,015 0,015 0,018 0,014 0,015 0,016 0,016 0,017 0,013 0,014
8 Stegastes_fuscus 0,057 0,175 0,134 0,102 0,000 0,172 0,093
0,015 0,016 0,018 0,018 0,016 0,015 0,017 0,018 0,017 0,016 0,015 0,018 0,014 0,014 0,015 0,015 0,016 0,010 0,011
9 Stegastes_fuscus_PP 0,116 0,157 0,080 0,103 0,114 0,160 0,127 0,114
0,017 0,017 0,018 0,017 0,014 0,019 0,017 0,016 0,016 0,011 0,016 0,009 0,009 0,009 0,009 0,001 0,014 0,014
10 Stegastes_leucostictus 0,153 0,159 0,157 0,151 0,151 0,167 0,149 0,151 0,149
0,017 0,016 0,017 0,016 0,016 0,017 0,017 0,017 0,016 0,017 0,015 0,017 0,018 0,018 0,017 0,017 0,016
11 Stegastes_limbatus 0,162 0,045 0,155 0,176 0,181 0,149 0,186 0,180 0,156 0,171
0,015 0,012 0,018 0,020 0,017 0,019 0,018 0,017 0,015 0,017 0,016 0,016 0,016 0,018 0,019 0,019
12 Stegastes_lividus 0,175 0,128 0,175 0,159 0,173 0,185 0,172 0,172 0,160 0,164 0,128
0,015 0,017 0,017 0,019 0,019 0,018 0,016 0,004 0,017 0,017 0,018 0,018 0,018 0,019 0,020
13 Stegastes_nigricans 0,153 0,084 0,172 0,177 0,166 0,160 0,184 0,163 0,158 0,173 0,079 0,126
0,018 0,018 0,017 0,019 0,018 0,016 0,014 0,017 0,016 0,017 0,017 0,018 0,018 0,019
14 Stegastes_otophorus 0,137 0,178 0,122 0,123 0,128 0,173 0,136 0,128 0,113 0,133 0,176 0,168 0,171
0,018 0,018 0,018 0,017 0,014 0,017 0,014 0,014 0,015 0,015 0,015 0,015 0,015
15 Stegastes_partitus 0,157 0,182 0,152 0,167 0,164 0,187 0,149 0,163 0,173 0,158 0,197 0,166 0,183 0,172
0,018 0,012 0,011 0,016 0,017 0,016 0,017 0,018 0,018 0,020 0,019 0,019
16 Stegastes_pelicieri 0,169 0,146 0,151 0,168 0,178 0,134 0,194 0,177 0,142 0,171 0,150 0,169 0,155 0,173 0,173
0,020 0,018 0,018 0,018 0,018 0,017 0,018 0,018 0,018 0,021 0,021
17 Stegastes_pictus_PP 0,148 0,180 0,136 0,150 0,155 0,207 0,138 0,155 0,144 0,161 0,184 0,174 0,185 0,160 0,078 0,185
0,000 0,017 0,019 0,015 0,016 0,016 0,016 0,016 0,017 0,017
18 Stegastes_pictus 0,141 0,176 0,133 0,141 0,148 0,197 0,130 0,148 0,144 0,155 0,177 0,170 0,176 0,154 0,074 0,176 0,000
0,016 0,018 0,014 0,015 0,016 0,016 0,016 0,016 0,017
19 Stegastes_planifrons 0,118 0,151 0,100 0,111 0,126 0,146 0,131 0,126 0,064 0,146 0,167 0,154 0,159 0,123 0,154 0,155 0,151 0,144
0,016 0,011 0,010 0,010 0,010 0,012 0,015 0,016
20 Stegastes_punctatus 0,177 0,117 0,163 0,156 0,170 0,172 0,166 0,170 0,144 0,169 0,122 0,011 0,121 0,161 0,168 0,166 0,180 0,175 0,151
0,016 0,016 0,017 0,017 0,018 0,019 0,019
21 Stegastes_rectifraenum 0,106 0,151 0,079 0,092 0,107 0,154 0,113 0,107 0,051 0,136 0,152 0,160 0,169 0,115 0,142 0,151 0,131 0,127 0,070 0,151
0,008 0,008 0,008 0,010 0,015 0,015
22 Stegastes_rocasensis 0,116 0,147 0,075 0,105 0,120 0,144 0,128 0,120 0,051 0,153 0,146 0,162 0,154 0,118 0,152 0,141 0,139 0,132 0,060 0,151 0,043
0,000 0,000 0,010 0,016 0,017
23 Stegastes_rocasensis_PP 0,120 0,148 0,076 0,109 0,123 0,149 0,134 0,123 0,051 0,156 0,150 0,164 0,160 0,120 0,160 0,146 0,139 0,139 0,064 0,152 0,044 0,000
0,000 0,010 0,017 0,017
24 Stegastes_sanctipauli_PP 0,120 0,148 0,076 0,109 0,123 0,149 0,134 0,123 0,051 0,156 0,150 0,164 0,160 0,120 0,160 0,146 0,139 0,139 0,064 0,152 0,044 0,000 0,000
0,010 0,017 0,017
25 Stegastes_trindadensis 0,123 0,167 0,085 0,109 0,118 0,165 0,127 0,118 0,001 0,141 0,160 0,157 0,161 0,111 0,174 0,139 0,140 0,140 0,069 0,149 0,052 0,049 0,049 0,049
0,015 0,015
26 Stegastes_variabilis 0,085 0,188 0,130 0,120 0,063 0,174 0,105 0,063 0,112 0,167 0,191 0,187 0,180 0,135 0,169 0,201 0,148 0,143 0,132 0,181 0,124 0,132 0,136 0,136 0,113
0,008
27 Stegastes_variailis_PP 0,088 0,200 0,132 0,119 0,071 0,173 0,107 0,071 0,118 0,149 0,192 0,191 0,187 0,137 0,165 0,191 0,155 0,155 0,145 0,183 0,130 0,140 0,140 0,140 0,123 0,040
PP present paper.
61
Capítulo 2
Estrutura genética multipopulacional de Abudefduf
saxatilis no oeste do Atlântico Sul e ilhas oceânicas
62
Estrutura genética multipopulacional de Abudefduf saxatilis no oeste do
Atlântico Sul e ilhas oceânicas
RESUMO
Abudefduf saxatilis constitui uma espécie anfi-Atlântica, distribuindo-se desde o
Caribe a toda a costa brasileira e ilhas oceânicas do Arquipélago de São Pedro e
São Paulo, Arquipélago de Fernando de Noronha, Atol das Rocas e Ilha de
Trindade. Estudos prévios em A. saxatilis sugerem a existência de diferenciação
genética e morfológica entre populações costeiras e ilhas meso-Atlânticas. Aqui
foram analisadas, através de sequências da Região Hipervariável 1 do DNAmt, a
estrutura populacional de A. saxatilis em 12 diferentes regiões geográficas do
Atlântico Ocidental, abrangendo da Venezuela ao sudeste do Brasil e ilhas
oceânicas Fernando de Noronha, São Pedro e São Paulo, Trindade e Atol das
Rocas. Nossos resultados sugerem a existência de estruturação genética em quatro
grupos genéticos. O primeiro é constituído por todas as populações costeiras, outro
pelos indivíduos de Fernando de Noronha e Atol das Rocas, um grupo conspícuo
formado pelos indivíduos de São Pedro e São Paulo, e o último, altamente
estruturado, formado pela população da Ilha de Trindade. Apesar do alto potencial
dispersivo desta espécie, um elevado padrão de autorecrutamento parece estar
envolvido na manutenção de perfis genéticos particulares nas ilhas oceânicas
brasileiras.
Palavras-chave: Pomacentridae, marcadores moleculares, fluxo gênico,
Sergeant-major
63
INTRODUÇÃO
Os representantes da família Pomacentridae estão entre os grupos mais
comuns nos ambientes recifais (Allen & Adrim, 1992; Nelson, 2016). No Atlântico
Ocidental algumas espécies apresentam uma ampla distribuição geográfica, como
Chromis multilineata, Microspathodon chrysurus e Abudefduf saxatilis (Menezes &
Figueiredo, 1985; Robins et al., 1986; Carpenter & Niem, 2001;). Esta última espécie
é o único representante do gênero Abudefduf no Atlântico Sul, e exibe uma das mais
amplas distribuições dentre todos os pomacentrídeos.
Abudefduf saxatilis pode ser encontrada em ambos os lados do Atlântico,
ocupando desde a latitude 43ºN até 35ºS (Carpenter & Niem, 2001). No Atlântico
Ocidental distribui-se do litoral do Canadá até o Uruguai Scott & Scott, 1988;
(Carpenter & Niem, 2001). No litoral brasileiro ocupa toda a costa, incluindo as ilhas
oceânicas do Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), Arquipélago de
Fernando de Noronha (AFN), Atol das Rocas (AR) e Ilha de Trindade (IT) (Gasparini
& Floeter, 2001; Vaske et al., 2005; Macieira et al., 2015).
Estudos sobre a estrutura populacional de A. saxatilis ao longo da costa da
América do Sul são escassos. Análises filogeográficas das populações de A.
saxatilis da costa oeste do Atlântico, através de sequências Citocromo B (CytB) e
Citocromo c oxidase subunidade I (COI) indicam pelo menos duas linhagens
filogenéticas, indicando divergências entre as populações costeiras (Belize, Panamá,
Venezuela e Brasil) da localizada na Ilha de Ascensão (Bermingham et al., 1997). No
Atlântico Sul o uso de marcadores do tipo RAPD (Random Amplified Polymorphic
Dna) em duas populações do litoral nordeste do Brasil e ASPSP identificou uma
maior similaridade genética entre as populações costeiras (Rio Grande do Norte e
Bahia) em relação à população insular do ASPSP (Rodrigues & Molina, 2007). A
variação morfológica das populações da espécie, incluindo áreas do nordeste e
sudeste do Brasil (estados do Ceará, Rio Grande do Norte, Bahia, Rio de Janeiro e
Santa Catarina), e ilhas oceânicas brasileiras (Atol das Rocas e Arquipélago de São
Pedro e São Paulo) por meio de morfometria multivariada indicaram uma marcante
plasticidade fenotípica interpopulacional e uma clina envolvendo diferentes
elementos seriais no sentido norte sul do Atlântico (Molina et al., 2006).
Recentemente, análises morfométricas e genéticas em populações de A.
saxatilis ao longo de 1.800 km da costa mexicana, utilizando microssatélites e
sequências mitocondriais (Citocromo B e Região Controle), evidenciou variações
64
morfológicas interregionais, apesar da ocorrência de um padrão de panmixia de
populações de A. saxatilis (Piñeros et al., 2015).
A fim de analisar a variação genética da espécie no Atlântico Ocidental,
foram analisados indivíduos de Abudefduf saxatilis de 12 regiões geográficas, que
abrangiam desde o litoral da Venezuela (11ºN), ao norte, ao litoral do Estado de São
Paulo, Brasil (23ºS), ao sul, incluindo quatro ilhas oceânicas brasileiras, totalizando
cerca de seis mil e quinhentos quilômetros de linha de costa.
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta dos espécimes
Foram obtidas amostras biológicas (tecido muscular ou de nadadeiras) de
265 exemplares de Abudefduf saxatilis (Figura 1), os quais foram capturados com o
auxílio de tarrafa (rede de pesca). A área de amostragem abrangeu desde a Ilha
Margarita (IM), na Venezuela, até o sudeste do Brasil. Na costa brasileira os
espécimes foram coletados no litoral dos Estados do Ceará (CE), Rio Grande do
Norte (RN), Pernambuco (PE), Bahia (BA), Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ)
e São Paulo (SP), adicionalmente exemplares foram coletados no Arquipélago de
Fernando de Noronha (AFN), Atol das Rocas (AR), Arquipélago de São Pedro e São
Paulo (ASPSP) e Ilha de Trindade (IT) (Tabela 1, Figura 1). As coletas foram
realizadas no período de 2010 a 2015 e os pontos de coleta mais extremos cobriram
mais de 6.500 km de distância. Os espécimes foram taxonomicamente identificados
de acordo com Carpenter & Niem (2001). As amostras de tecidos foram
acondicionados em microtubos de 2,0 ml contendo álcool etílico (100%) e estocadas
em temperatura de -20°C.
Análises moleculares
O DNA total foi extraído de acordo com Sambrook et al. (1989). Para as
análises populacionais, a Região Hipervariável 1 (RHV1) da Região Controle do
DNA mitocondrial foi amplificado utilizando os primers “A” e “E” descritos por Lee et
al. (1995).
Os primers L1987 e H2609 (Palumbi et al., 1991), e FishF2 e FishR2 (Ward
et al., 2005) foram utilizados para amplificar os genes RNAr 16S (16S) e Citocromo c
65
oxidase subunidade 1 (COI), respectivamente. Sequências 16S e COI,
previamente depositadas no GenBank foram utilizadas nas comparação com as
amostras de A. saxatilis utilizados no presente trabalho.
Para as reações em cadeia da polimerase (PCR) foram utilizadas as
condições de Souza et al. (2015). Os produtos de PCR (5 μl) foram purificados com
as enzimas exonuclease I (3,3 U/reação) e fosfatase alcalina de camarão (0,66
U/reação) (GE Healthcare), no termociclador, submetendo as misturas a ciclos de 30
min em 37ºC e 15 min em 80ºC. As amostras foram sequenciadas pela empresa
ACTGene Análises Moleculares Ltda através do sequenciador automático de DNA
ABI-Prism 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Os eletroferogramas obtidos foram conferidos com o auxílio do software
BioEdit (Hall, 1999) e alinhadas de forma múltipla e automática através do MUSCLE
(Edgar, 2004) por meio do software MEGA7 (Kumar et al., 2016). Sítios onde gaps
foram inseridos automaticamente foram considerados nas análises.
A saturação entre as transições e transversões nas sequências foram
verificadas pelo software DAMBE (Xia & Xie, 2001). O software jModelTest 2.1.4
(Darriba et al., 2012) foi utilizado para selecionar o melhor modelo evolutivo paras as
sequências baseado em Akaike information criterion.
As redes de haplótipos foram geradas através do software Network 4.5
utilizando o método median joining (Bandelt et al., 1999).
As relações genéticas entre as amostras foram avaliadas através do método
de maximum likelihood utilizando o software MEGA7 (Kumar et al., 2016). A
significâncias dos agrupamentos em todas as árvores geradas foram estimadas
utilizando analises de bootstrap baseadas em 1.000 réplicas.
Os níveis de diversidade genética, testes de neutralidade, através das
estatísticas de Fs (Fu, 1997) e D (Tajima, 1989), estruturação populacional através
da estimativa de FST (Wright, 1978), análise hierárquica da variância molecular
(AMOVA) (Excoffier et al., 1992), e o teste de Mantel (Mantel, 1967), foram
estimados através do software Arlequin 3.5 (Excoffier & Lischer, 2010).
66
Tabela 1. Pontos de coleta e número amostral de Abudefduf saxatilis ao longo da
costa oeste da América do Sul.
Localidades geográficas Abreviatura Coordenadas
geográficas N
Ilha Margarita (Venezuela) IM 10º57’N, 64º00’O 29
Ceará (Brasil) CE 03º42’S, 38º30’O 22
Rio Grande do Norte (Brasil) RN 05º16’S, 35º22’O 20
Arquipélago de Fernando de Noronha (Brasil) AFN 03º50’S, 32º24’O 21
Atol das Rocas (Brasil) AR 03º51’S, 33º49’O 21
Arquipélago de São Pedro e São Paulo (Brasil) ASPSP 00º55’N, 29º20’O 26
Pernambuco (Brasil) PE 08º00’S, 34º50’O 23
Bahia (Brasil) BA 13º00’S, 38º29’O 23
Espírito Santo (Brasil) ES 20º20’S, 40º14’O 13
Rio de Janeiro (Brasil) RJ 22º45’S, 41º52’O 18
São Paulo (Brasil) SP 23º27’S, 45º03’O 24
Ilha de Trindade (Brasil) IT 20º30’S, 29º19’O 25
Total 265
N – Número amostral.
67
Figura 1. Locais de coleta de Abudefduf saxatilis no oeste do Atlântico Sul e ilhas
oceânicas. Venezuela: Ilha Margarita (IM); Brasil: Ceará (CE), Rio Grande do Norte
(RN), Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN), Atol das Rocas (AR),
Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), Pernambuco (PE), Bahia (BA),
Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ), São Paulo (SP), Ilha de Trindade (IT).
Tracejado – Delimitação da área sob estudo; Em detalhe um exemplar da espécie
Abudefduf saxatilis.
68
RESULTADOS
Sequências 16S e COI
O alinhamento automático resultou em sequências consenso de 478 pares
de bases (pb) para o gene 16S e 657 pb para o gene COI. Para as análises de
maximum likelihood foram utilizados os modelos de substituição nucleotídica
GTR+I e GTR+G para as sequências 16S e COI, respectivamente.
Sequências da Região Hipervariável 1 (RHV1)
Foram coletados 265 espécimes de Abudefduf saxatilis oriundos de doze
localidades distribuídas no Atlântico Ocidental. A análise das sequências RHV1
revelou apenas 165 haplótipos distintos (Números de acesso dos haplótipos no
Genbank: KX812544 - KX812708). Os fragmentos sequenciados possuem 415 pb,
nos quais foram encontrados 180 substituições, sendo 34 transversões e 146
transições. O gráfico das transições/transversões versus distância genética não
indicou a presença de saturação nas sequências (dado não mostrado). O modelo
GTR+G foi selecionado como melhor modelo de substituição nucleotídica para as
sequências RHV1. O conteúdo de bases A/T foi claramente maior (63,06%) que
G/C (G=22,32%, C=14,61%, T=35.60% e A=27,46%).
As diversidades haplotípica (h) e nucleotídica (π) variaram entre 0,886 e 1, e
entre 0,018 e 0,094, respectivamente. A distribuição de cada haplótipo nas
populações pode ser verificado na tabela suplementar 1 (Tabela S1). Os indivíduos
coletados em IT foram os que exibiram os menores índices (Tabela 2). A rede de
haplótipos mostrou que quase todos os haplótipos de maior frequência são
compartilhados entre várias localidades geográficas. No entanto, dos 9
haplótipos exclusivos encontrados na Ilha de Trindade, 8 uniram-se a um
indivíduo exclusivo do RJ e formaram um agrupamento distinto que sugere
significativo isolamento populacional (Figura 2).
Os índices de neutralidade Tajima’s D e Fu’s Fs foram negativos para todas
as populações, sendo significativos para a maioria (Tabela 2).
A árvore de maximum likelihood (ML) baseada em sequências RHV1 se
mostrou politômica envolvendo a maioria dos indivíduos analisados. Os
agrupamentos com valores de bootstrap maiores que 80 exibiram indivíduos de
69
diferentes regiões geográficas. Entretanto, um ramo com elevado suporte
agrupou os 24 indivíduos coletados na IT e um indivíduo coletado no RJ
demonstrando um claro sinal de diferenciação populacional (Figura 3).
Dentre as 12 localidades geográficas analisadas, os valores FST
sugeriram a existência de pelo menos quatro populações com estruturações
genéticas que variaram de pequena à muito grande. As localidades costeiras
integram uma grande população panmítica, incluindo a população da Ilha
Margarita (Venezuela), enquanto que as quatro regiões insulares sugerem três
populações com diferentes graus de isolamento genético. A primeira, formada
AFN e AR, outra pelos indivíduos do ASPSP, e uma última última por indivíduos
da IT. Excepcionalmente, IT foi a localidade que apresentou os maiores valores
de FST, variando entre 0,36 a 0,68, caracterizando uma grande diferenciação
genética (Tabela 3). Apesar da elevada divergência genética a análise das
sequências 16S e COI demonstraram que os espécimes analisados possuem
inteira identidade com outras amostras de A. saxatilis previamente depositadas
no Genbank. Além disso, como pode ser observado nas árvores de maximum
likelihood (Figuras 4 e 5), todos os espécimes de A. saxatilis agrupam-se entre si
formando ramos suportados por valores de boostrap de 99 para ambos os
genes.
Os teste de AMOVA corroboram os valores de FST (Tabela 3) quanto a
existência de quatro grupos genéticos de A. saxatilis na costa da América do Sul
(costa, AFN/AR, ASPSP e IT). Estes grupos divergem entre si por uma diferença
de 20,17%. Nesta conformação de quatro grupos, a diferença média entre as
populações dentro dos grupos foi de apenas 1,87% (Tabela 4). A representação da
estruturação genética encontrada em A. saxatilis ao longo da costa leste do Atlântico
está representada na Figura 6.
Considerando as 12 regiões geográficas amostradas, o teste de Mantel não
encontrou correlação entre as distâncias genética e geográfica (p = 0,172).
Entretanto, quando a população da ilha Margarita (Venezuela) é retirada da análise,
esta associação passa a ser significativa (p = 0,039).
70
Tabela 2. Índices de diversidade genética e neutralidade em Abudefduf saxatilis
baseado em RHV1.
Localidades
geográficas n H h ± sd π ± sd Tajima’s D Fu’s Fs
IM (Venezuela) 29 26 0,992 ± 0,011 0,094 ± 0,048 -1,7449* -9,6230*
CE 22 22 1,000 ± 0,013 0,042 ± 0,023 -2,0143* -18,9883*
RN 20 20 1,000 ± 0,015 0,036 ± 0,020 -1,8133* -17,8188*
AFN 21 18 0,981 ± 0,022 0,058 ± 0,031 -0,9659 -6,7198*
AR 21 17 0,966 ± 0,030 0,070 ± 0,037 -0,6820 -4,0104
ASPSP 26 13 0,920 ± 0,030 0,021 ± 0,012 -1,7756* -4,2852*
PE 23 21 0,988 ± 0,018 0,054 ± 0,029 -1,2492 -11,3235*
BA 23 21 0,992 ± 0,015 0,061 ± 0,032 -0,7858 -10,0965*
ES 13 10 0,961 ± 0,041 0,038 ± 0,021 -1,5852* -2,3121
RJ 18 16 0,980 ± 0,028 0,053 ± 0,029 -1,6910* -6,3465*
ES 24 21 0,989 ± 0,015 0,044 ± 0,024 -1,7751* -12,0738*
IT 25 9 0,886 ± 0,030 0,018 ± 0,011 -1,6727* -1,1223
Todas 265 162 0,990 ± 0,001 0,057 ± 0,029 -1,956* -24,1607*
n = Número de indivíduos; H = Número de haplótipos; h = Diversidade haplotípica; π = Diversidade
nucleotídica; sd = Desvio padrão. Venezuela: Ilha Margarita (IM); Brasil: Ceará (CE), Rio Grande do
Norte (RN), Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN), Atol das Rocas (AR), Arquipélago de São
Pedro e São Paulo (ASPSP), Pernambuco (PE), Bahia (BA), Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ),
São Paulo (SP), Ilha de Trindade (IT); *p ≤ 0.05.
71
Figura 2. Rede de haplótipos de Abudefduf saxatilis baseado em sequências da
RHV1. O tamanho dos círculos é proporcional à frequência do haplótipo, e as cores
indicam as localidades onde o haplótipo é encontrado. Ilha Margarita (IM), Ceará
(CE), Rio Grande do Norte (RN), Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN), Atol
das Rocas (AR), Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), Pernambuco
(PE), Bahia (BA), Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ), São Paulo (SP), Ilha de
Trindade (IT).
72
Figura 3. Árvore de maximum likelihood baseado
em sequências RHV1 de Abudefduf saxatilis. Ilha
Margarita (IM), Ceará (CE), Rio Grande do Norte
(RN), Arquipélago de Fernando de Noronha
(AFN), Atol das Rocas (AR), Arquipélago de São
Pedro e São Paulo (ASPSP), Pernambuco (PE),
Bahia (BA), Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro
(RJ), São Paulo (SP), Ilha de Trindade (IT); Grupo
externo = Chromis multilineata (GenBank:
KM211600-KM211603). Outros haplótipos =
Haplótipos que não formaram qualquer
agrupamento e exibiram-se na forma de ramos
politômicos. Apenas ramos com valores de
bootstrap maiores que 80 são exibidos.
73
Figura 4. Árvore de maximum likelihood baseada em sequências 16S de
Abudefduf. Números acima dos ramos correspondem às porcentagens de
bootstrap. Números antes dos nomes referem-se aos números de acesso do
Genbank. Negrito = Sequências geradas no presente estudo.
Figura 5. Árvore de maximum likelihood baseada em sequências COI de
Abudefduf. Números acima dos ramos correspondem às porcentagens de
bootstrap. Números antes dos nomes referem-se aos códigos de acesso do
Genbank. Negrito = Sequências geradas no presente estudo.
74
Tabela 3. Estimativas de FST entre diferentes populações geográficas de
Abudefduf saxatilis baseadas em RHV1.
Locais 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
1. IM -
2. CE 0,02 -
3. RN 0,04 0,00 -
4. AFN 0,04 0,11 0,11 -
5. AR 0,01 0,07 0,11 0,01 -
6. ASPSP 0,06 0,03 0,04 0,17 0,14 -
7. PE 0,00 -0,00 0,01 0,05 0,04 0,06 -
8. BA 0,01 0,03 0,10 0,07 0,03 0,13 0,02 -
9. ES 0,01 -0,03 -0,01 0,10 0,06 0,05 -0,00 0,04 -
10. RJ 0,00 -0,01 0,01 0,08 0,04 0,05 -0,00 0,02 -0,02 -
11. SP 0,01 -0,01 0,00 0,11 0,07 0,06 -0,00 0,04 -0,01 -0,01 -
12. IT 0,36 0,55 0,60 0,49 0,43 0,68 0,50 0,46 0,60 0,50 0,53
Ilha Margarita (IM), Ceará (CE), Rio Grande do Norte (RN), Arquipélago de Fernando de Noronha
(AFN), Atol das Rocas (AR), Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), Pernambuco (PE),
Bahia (BA), Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ), São Paulo (SP), Ilha de Trindade (IT); Negrito -
p ≤ 0,05.
75
Tabela 4. Análise hierárquica da variância molecular (AMOVA) baseado na RHV1
de Abudefduf saxatilis.
Comparações Fonte de variação Porcentagem
de variação
Estatística
ɸ
Valor
p
(IM, CE, RN, AFN, AR, ASPSP,
PE, BA, ES, RJ, SP, IT)
Entre as populações 14,92 ɸst = 0,149 0,000
Within populations 85,08 - -
((IT) x (IM, CE, RN, AFN, AR,
ASPSP, PE, BA, ES, RJ, SP))
Entre grupos 38,64 ɸct = 0,386 0,099
Entre as populações
dentro dos grupos
3,01 ɸsc = 0,049 0,000
Dentro das
populações
58,35 ɸst = 0,416 0,000
((IT) x (AFN, AR, ASPSP) x (IM,
CE, RN, PE, BA, ES, RJ, SP))
Entre grupos 18,74 ɸct = 0,187 0,010
Entre as populações
dentro dos grupos
3,34 ɸsc = 0,041 0,000
Dentro das
populações
77,92 ɸst = 0,220 0,000
((IT) x (AFN, AR) x (ASPSP) x
(IM, CE, RN, PE, BA, ES, RJ,
SP))
Entre grupos 20,17 ɸct = 0,201 0,002
Entre as populações
dentro dos grupos
1,87 ɸsc = 0,023 0,000
Dentro das
populações
77,96 ɸst = 0,220 0,000
Ilha Margarita (IM), Ceará (CE), Rio Grande do Norte (RN), Arquipélago de Fernando de Noronha
(AFN), Atol das Rocas (AR), Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), Pernambuco (PE),
Bahia (BA), Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ), São Paulo (SP), Ilha de Trindade (IT).
76
Figura 6. Estruturação genético populacional de Abudefduf saxatilis ao longo da
costa leste da América do Sul e ilhas oceânicas brasileiras. Ilha Margarita (IM),
Ceará (CE), Rio Grande do Norte (RN), Arquipélago de Fernando de Noronha
(AFN), Atol das Rocas (AR), Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP),
Pernambuco (PE), Bahia (BA), Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ), São
Paulo (SP), Ilha de Trindade (IT).
77
DISCUSSÃO
A espécies A. saxatilis no Atlântico Ocidental exibe um diversificado padrão
de estruturação genética, até então não identificado em outras regiões do Atlântico.
A Região Hipervariável 1 das populações de Abudefduf saxatilis apresentaram altos
índices de diversidade haplotípica e nucleotídica, cujos menores valores estavam
presentes entre os indivíduos da Ilha de Trindade e Arquipélago de São Pedro e São
Paulo (Tabela 2). Possivelmente isto decorra do grau de isolamento geográfico
destas populações. Este isolamento é confirmado pelos altos índices FST de Wright
(Wright, 1978), sobretudo para a população de insular de Trindade.
A. saxatilis forma pelo menos quatro populações na costa da América do
Sul: uma formada pelas regiões geográficas costeiras
(IM+CE+RN+PE+BA+ES+RJ+SP), uma por AR+AFN e outra por ASPSP, estas
isoladas por pequena/moderada diferenciação genética; e uma última população
formada por IT, a qual apresentou alto grau de isolamento genético destacado por
todas as análises. De fato, valores de FST semelhantes aos encontrados em A.
saxatilis de AFN e AR já foram documentados para outras espécies que habitam
estas ilhas, como Chromis multilineata e Cephalopholis fulva (Cunha et al., 2014;
Souza et al., 2015), o que reforça a ideia de que o isolamento genético daquelas
populações, apesar de pequeno, é significativo.
A rede de haplótipos demonstrou uma alta diversidade haplotípica de A.
saxatilis, o compartilhamento de haplótipos mais frequentes entre várias regiões
geográficas e a existência de alta frequência de haplótipos únicos. O único
agrupamento perceptível na rede de haplótipos envolveu oito haplótipos da IT, dos
dez encontrados para esta população, e um haplótipo oriundo do RJ (Figure 2).
O isolamento da população de IT também ficou evidente na árvore de
maximum likelihood (Figura 3), o qual foi suportado por alto valor de bootstrap.
Nesta análise, a maioria dos haplótipos formaram ramos politômicos individuais não
informativos e, devido a isso, foram agrupados no ramo “outros haplótipos” para uma
melhor representação da árvore. Os demais agrupamentos formados suportados por
valores de bootstrap acima de 80 não indicaram nenhuma estruturação
populacional, pois são compostos por haplótipos oriundos de diferentes regiões
geográficas.
A análise de AMOVA sugere a existência de pelos menos quatro grupos
genéticos: ((IT) x (AFN, AR) x (ASPSP) x (IM, CE, RN, PE, BA, ES, RJ, SP)). A
78
porcentagem de variação entre estes grupos é de 20,17% (ɸct = 0,201, p = 0,002) e
de apenas 1,87% Entre as populações dentro dos grupos (ɸsc = 0,023, p = 0,022)
(Tabela 4).
A ausência de estruturação entre as populações da ilha Margarita e da costa
brasileira, apesar de estarem “separadas” por pelo menos 3.400 km de distância
podem constituir um reflexo de um elevado fluxo gênico no passado, ou a
manutenção estocástica de fluxo gênico no presente Neste caso, a barreira física
promovida pelo desague de água doce e sedimentos do Rio Amazonas pode não
desempenhar um papel importante no isolamento das populações brasileiras e
caribenha de A. saxatilis.
Na condição atual de elevação do nível do oceano Atlântico, a pluma de
água doce desaguada pelo Rio Amazonas estende-se sobre a água salgada até
cerca de 500 km mar adentro e até uma profundidade de 30 metros. No entanto,
regiões entre 50 e 70 metros de profundidade possuem pouca sedimentação e
salinidade normal, permitindo sua colonização por esponjas e peixes recifais
(Collette & Rutzler, 1977; Rocha et al., 2000; Rocha, 2003). A apesar de A. saxatilis
ainda não ter sido registrado habitando essas áreas, é possível que ela o faça, já
que há registros de ocorrência de A. saxatilis a 50 metros de profundidade (Rocha &
Myers, 2015). Desta forma, estas esponjas poderiam servir de habitat disponível à
ampliação da área de ocupação de A. saxatilis e, por um processo de “stepping
stones” (Kimura, 1953) por entre as esponjas, conectando as populações ao norte e
ao sul do Rio Amazonas, homogeneizando-as. Além disso, indivíduos juvenis e
adultos de A. saxatilis já foram registrados sob algas e objetos à deriva (Castro et al.,
2002), o que, dependendo da frequência de ocorrência e da força das correntes
oceânicas, pode contribuir no aumento do fluxo gênico entre diferentes regiões
geográficas.
O isolamento pela distância entre as regiões costeiras e destas com as
insulares é corroborado pelo teste de Mantel. No entanto, isso ocorre apenas
quando a população de Ilha Margarita (Venezuela) é removida da análise.
A homogeneidade populacional pode ser influenciada pela ação das
correntes oceânicas, as quais poderiam carrear larvas de A. saxatilis durante seu
período pelágico, o qual pode chegar a 55 dias (Shulman & Bermingham, 1995).
Uma das principais correntes no Atlântico Ocidental é a Corrente Sul Equatorial
(CSE), que flui no sentido leste-oeste, passando pelo AFN, AR e alcançando a costa
nordeste do Brasil, onde bifurca-se, formando a Corrente do Brasil (sentido
79
nordeste/sudeste do Brasil) e a Corrente Norte do Brasil (CNB). A CNB continua
fluindo no sentido leste-oeste, passando pela costa norte brasileira e alcançando a
Venezuela, já com o nome de Corrente das Guianas (CG) (Castro & Miranda, 1998;
Lumpkin & Garzoli, 2005). No entanto, efeitos de autorecrutamento de larvas
parecem favorecer a diferenciação populacional nas regiões insulares brasileiras
(Molina et al. 2006; Cunha et al., 2014).
De fato, apesar das características da CSE e da pequena distância entre o
AFN/AR e o litoral favorecerem a panmixia, no entanto, significativa estruturação
genética se mostra presente entre estas regiões (Tabela 3). O isolamento geográfico
das ilhas oceânicas, atrelado à fatores biológicos e ao autorecrutamento larval, este
último já atribuído anteriormente aos A. saxatilis do AR e ASPSP (Molina et al.,
2006; Rodrigues & Molina, 2007), parecem ser responsáveis pela modelagem
genética das populações insulares analisadas.
Os padrões de estruturação populacionais de A. saxatilis do Golfo do México
e mar do Caribe, analisadas através de Citocromo B, Região Controle (DNAmt) e
microssatélites encontraram um padrão de panmixia em populações distribuídas ao
longo de 1.800 km na costa Atlântica mexicana (Piñeros et al., 2015). Esta
homogeneidade genética entre as regiões costeiras de distribuição da espécie é
similar ao observado para as regiões costeiras do litoral do Brasil. Isto retrata a
manutenção de fluxo gênico entre localidades circunvizinhas desta espécie, e
destaca o caráter particular das estruturações populacionais encontradas nas
regiões insulares do Brasil, sobretudo Trindade. Apesar da forte diferenciação
populacional apontada para a Ilha de Trindade, as sequências 16S e COI confirmam
a identidade genética dos espécimes daquela região com A. saxatilis.
A Ilha de Trindade, assim como Atol das Rocas e Fernando de Noronha
estão indiretamente conectados à costa brasileira através de montes oceânicos
submarinos atualmente submersos. Junto com pelo menos cinco montes
submarinos, Atol das Rocas e Fernando de Noronha fazem parte da Cadeia de
Fernando de Noronha, a qual se estende no sentido leste-oeste (Mabesoone &
Coutinho, 1970; Almeida, 2006). Já a Ilha de Trindade, junto com a ilha de Martim
Vaz e mais cinco montes submarinos, faz parte de outra cadeia chamada Cadeia
Vitória-Trindade, também orientada no sentido leste-oeste (ver Macieira et al., 2015).
Estes montes submarinos podem ter desempenhado um papel importante na
manutenção do fluxo gênico entre as populações costeiras e insulares,
80
principalmente ao longo das regressões marinhas durante o Pleistoceno (Bernat et
al., 1983; Hearty, 1998; Barreto et al., 2002).
Com a diminuição dos níveis dos oceanos, muitos destes montes
submarinos tornaram-se habitáveis, o que pode ter favorecido o processo de
stepping stones nessas regiões. No entanto, isto parece não ter ocorrido com A.
saxatilis, ou apenas não foi detectado através das sequências da Região
Hipervariável 1, pois todas as ilhas apresentaram significativos níveis de
diferenciação populacional, sobretudo a Ilha de Trindade.
Os altos níveis de diferenciação populacional encontrados na Ilha de
Trindade são inéditos e nunca antes registrados em peixes recifais da costa
brasileira. Este registro reitera a necessidade de preservação destas áreas
estratégicas para a manutenção da biodiverdidade e reforça a ideia de que o
conhecimento prévio da variabilidade genética a nível populacional é fundamental
para a conservação dos recursos genéticos naturais e da biodiversidade.
81
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85
Tabela suplementar 1. Distribuição dos haplótipos encontrados nas sequências
Região Hipervariável 1 de Abudefduf saxatilis.
Haplótipos IM CE RN AFN AR ASPSP PE BA ES RJ SP IT TOTAL
1 1 1 1 1 1 1 6
2 1 1
3 1 1
4 2 1 1 3 1 3 2 13
5 2 2
6 1 1
7 2 1 3
8 1 1
9 1 1
10 1 1
11 2 1 3
12 1 1
13 1 1 3 4 1 10
14 1 1
15 1 1 1 3
16 1 1
17 1 1
18 1 1 1 2
19 1 1
20 1 1
21 1 1 1 3 2 8
22 1 1
23 1 1
24 1 1
25 1 1
26 1 1
27 1 1
28 1 1
29 1 1
30 1 1
31 1 1 1 1 4
32 1 1
33 1 1
34 1 1
35 1 1
36 1 1
37 1 1 2
38 1 1 2
39 1 1
40 1 1 2
41 1 1 2
42 1 1
43 1 1
44 1 1
45 1 1
46 1 1
86
47 1 1
48 1 1
49 1 1
50 1 1
51 1 1
52 1 1
53 1 1 1 3
54 1 1 2
55 1 1
56 1 1
57 1 1
58 1 1
59 2 2
60 1 1
61 1 1
62 1 1
63 1 1
64 1 1
65 1 1
66 1 1
67 1 1
68 1 1
69 1 1
70 1 1
71 1 1
72 1 1
73 1 2 3
74 1 1
75 1 1
76 1 1
77 1 1
78 1 1
79 1 1
80 1 1
81 1 1
82 1 1
83 1 1
84 1 5 1 1 2 1 2 13
85 1 1
86 1 1
87 1 1
88 1 1
89 2 2
90 1 1
91 1 1
92 2 2
93 5 5
94 2 2
95 1 1 2
87
96 1 1
97 1 1
98 1 1
99 1 1
100 1 1 2
101 1 1
102 1 1
103 1 1 2
104 1 1
105 1 1
106 1 1
107 1 1
108 1 1
109 1 1
110 1 1
111 1 1
112 1 1
113 1 1 2
114 1 1 2
115 2 2
116 1 1
117 1 1
118 1 1
119 1 1 2
120 2 2
121 1 1
122 1 1
123 1 1
124 1 1
125 1 1
126 1 1
127 1 1
128 1 1
129 1 1
130 1 1
131 2 2
132 1 1
133 1 1
134 1 1
135 1 1
136 1 1
137 1 1
138 1 1
139 1 1
140 1 1
141 1 1
142 1 1
143 1 1
144 1 1
88
145 1 1
146 1 1
147 1 1
148 2 2
149 1 1
150 1 1
151 1 1
152 1 1
153 1 1
154 1 1
155 1 1
156 1 1
157 2 2
158 4 4
159 5 5
160 1 1
161 5 5
162 4 4
163 2 2
164 1 1
165 1 1
Ilha Margarita (IM), Ceará (CE), Rio Grande do Norte (RN), Arquipélago de Fernando de Noronha
(AFN), Atol das Rocas (AR), Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), Pernambuco (PE),
Bahia (BA), Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ), São Paulo (SP), Ilha de Trindade (IT).
89
Capítulo 3
Estruturação populacional panmítica do xaréu-preto,
Caranx lugubris Poey 1860 em áreas do Atlântico Ocidental
90
Estruturação populacional panmítica do xaréu-preto, Caranx lugubris Poey
1860 em áreas do Atlântico Ocidental
RESUMO
Carangidae constitui um grupo diversificado cujos representantes podem se distribuir
por amplos espaços oceânicos. Uma dessas espécies, Caranx lugubris destaca-se
por apresentar distribuição circuntropical, que no Atlântico inclui a costa e ilhas
oceânicas brasileiras. No arquipélago de São Pedro e São Paulo indivíduos de C.
lugubris foram previamente categorizados em morfótipos I e II em relação a
variações cromossômicas e morfológicas. A origem destes morfótipos e a estrutura
populacional da espécie em território brasileiro são desconhecidos. Aqui, indivíduos
de C. lugubris de três localidades do Atlântico, Arquipélago de São Pedro e São
Paulo (morfótipos I e II), costa do estado do Rio Grande do Norte e Ilha de Trindade
tiveram suas sequências parciais do gene nuclear Rodopsina, mitocondriais 16S,
Citocromo B, Citocromo c oxidase subunidade I, e Região Hipervariável 1 da Região
Controle do DNA mitocondrial analisadas. Indivíduos do Arquipélago de São Pedro e
São Paulo têm altos índices de diversidade haplotípica e nucleotídica, sugerindo que
esta região possa desempenhar importante papel na manutenção da variabilidade
genética da espécie. A ausência de divergências genéticas entre os morfótipos I e II,
e de estruturação populacional entre as três regiões geográficas analisadas, revelam
um quadro de panmixia. Apesar de descartadas algumas hipóteses, as análises
genéticas foram inconclusivas quanto a origem dos morfótipos. Para isso, a
utilização de outros marcadores moleculares, e a análise de amostras de outras
regiões oceânicas poderão contribuir para esclarecer sua ocorrência.
Palavras-chave: Carangidae, Black jack, morfótipos, panmixia, fluxo gênico
91
INTRODUÇÃO
A família Carangidae é formada por 148 espécies (Eschmeyer & Fong,
2017), distribuídas em 30 gêneros (Nelson et al., 2016). Essencialmente pelágicos,
algumas espécies apresentam extensa distribuição geográfica, variando desde pan-
Atlântica até circunglobal (Gasparini & Floeter, 2001; Feitoza et al., 2003; Swart et
al., 2016), podendo ser encontradas em todos os oceanos (Smith-Vaniz, 2002;
Nelson et al., 2016). Apesar de intensivamente exploradas na pesca tradicional e
comercial (Smith-Vaniz, 2002), seus padrões de estruturação populacional,
sobretudo das espécies do gênero Caranx, são muito esparsas. Este é um dos
gêneros mais diversificados na família (Nelson et al., 2016), no qual estão incluídas
espécies com extensa distribuição geográfica, o que favorece a sobreposição de
formas filogeneticamente próximas, com ocorrência esporádica de híbridos naturais
(Murakami et al., 2007; Santos et al., 2011) e complexos de espécies (Smith-Vaniz &
Carpenter, 2007).
Caranx lugubris Poey 1860, Black Jack, uma espécie de grande porte que
apresenta distribuição circuntropical (Oceanos Atlântico, Índico e Pacífico), incluindo
a costa e ilhas oceânicas brasileiras, tais como Ilha de Trindade e Arquipélago de
São Pedro e São Paulo (Feitoza et al., 2003; Gasparini & Floeter, 2001; Garcia-
Júnior et al., 2015).
No arquipélago de São Pedro e São Paulo, indivíduos de C. lugubris
apresentam dois padrões morfológicos caracterizados principalmente quanto ao
formato do corpo e tamanho dos olhos (morfótipos I e II), e indícios de diversificação
citogenética (Jacobina et al., 2014). O morfótipo I é caracterizado por um corpo mais
robusto, no plano dorso-ventral e olhos menores, enquanto que o morfótipo II tem o
corpo mais esguio e olhos maiores. Os morfótipos apresentam características
citogenéticas similares, exceto quanto ao número de sítios DNAr 5S. Enquanto o
morfótipo I apresentava marcações em dois pares de cromossomos, no morfótipo II
estes sítios estavam localizados em três pares de cromossomos (Jacobina et al.,
2014). As variações citogenômicas em poucos indivíduos e a caracterização
morfológica dos dois morfótipos ensejam análises complementares sobre a
ocorrência de perfis genéticos diferenciados entre os morfótipos.
O presente trabalho tem por objetivo analisar a estrutura genética de Caranx
lugubris em diferentes regiões oceânicas e da costa brasileira através de sequências
parciais do gene nuclear Rodopsina (Rhod), dos genes mitocondriais 16S e
92
Citocromo B (CytB), Citocromo c oxidase subunidade I (COI), e Região Hipervariável
1 (RHV1) da Região Controle, contribuindo para a análise da ocorrência simpátrica e
sintópica de diferentes morfótipos de C. lugubris no entorno do ASPSP.
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta dos espécimes
Amostras de tecido de espécimes de C. lugubris foram coletados em três
regiões geográficas do Atlântico Ocidental e regiões insulares meso-Atlânticas
(Figura 1) entre os anos de 2013 e 2014. De um total de 34 amostras, 20 foram de
indivíduos do Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), sendo 10 do
morfótipo I e 10 do morfótipo II (Figura 2), 8 espécimes da Ilha de Trindade (IT) e 6
espécimes da costa do estado do Rio Grande do Norte (RN), litoral nordeste do
Brasil (Figura 1). Após a coleta, fragmentos hepáticos e de nadadeiras foram
acondicionados em microtubos (2,0 ml) com álcool etílico (100%) e armazenados em
temperatura de -20°C. Os espécimes foram taxonômicamente identificados de
acordo com Smith-Vaniz (2002).
Figura 1. Áreas de coleta dos espécimes de Caranx lugubris. ASPSP - Arquipélago
de São Pedro e São Paulo, RN - Rio Grande do Norte, IT - Ilha de Trindade;
Tracejado - Representação da estrutura populacional encontrada.
93
Figura 2. Morfótipos I (a) e II (b) de Caranx lugubris (sensu Jacobina et al., 2014),
coletados no entorno do Arquipélago de São Pedro e São Paulo.
Análises moleculares
O DNA total foi extraído de acordo com o protocolo (modificado) de extração
salina proposto por Miller et al. (1988). Fragmentos de Rhod, COI, 16S, CytB e
RHV1 foram amplificados através do método de Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR) de acordo com Souza et al. (2015). Os primers e as temperaturas de
anelamento utilizados nas PCRs foram os seguintes: Rodopsina – Primers Rod-F2w
e Rod-R4n, 60ºC (Jiménez et al., 2007), Citocromo c oxidase subunidade I – Primers
94
FishF2 e FishR2, 50ºC (Ward et al., 2005), 16S - Primers L1987 e H2609, 52ºC
(Palumbi et al., 1991), Citocromo B – Primers FishcytB-F e CytBI-5R, 52ºC (Jiménez
et al., 2007) e Região Hipervariável 1 – Primers A e E, 52ºC (Lee et al., 1995).
Os produtos de PCR (5 μl) foram purificados com as enzimas exonuclease I
(3,3 U/reação) e fosfatase alcalina de camarão (SAP) (0,66 U/reação) (GE
Healthcare), no termociclador, submetendo o mix à ciclos de 30 minutos em 37ºC e
15 minutos em 80ºC. As amostras foram sequenciadas pela empresa ACTGene
Análises Moleculares Ltda através do sequenciador automático ABI-PRISM 3500
Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Os eletroferogramas obtidos foram conferidos com o auxílio do software
BioEdit (Hall, 1999) e as sequências de cada gene foram separadamente alinhadas
de forma múltipla e automática através do MUSCLE (Edgar, 2004) por meio do
software MEGA6 (Tamura et al., 2013).
As sequências 16S e COI geradas foram submetidas à ferramenta
Nucleotide BLAST (Disponível em https://blast.ncbi.nlm.nih.gov), pertencente ao
NCBI (National Center for Biotechnology Information), a fim de estimar a similaridade
genética com sequências previamente depositadas no Genbank (Disponível em
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). As sequências COI foram submetidas ao
Identification System (Disponível em
http://www.boldsystems.org/index.php/IDS_OpenIdEngine) para também estimar a
similaridade com sequências previamente depositadas no BOLD (The Barcode of
Life Data System; Ratnasingham & Hebert, 2007).
A rede de haplótipos foi implementada utilizando o método median joining
através do software Network 4.5 (Bandelt et al., 1999). Os níveis de diversidade
genética, testes de neutralidade, através das estatísticas Fs (Fu, 1997) e D (Tajima,
1989), e a estruturação populacional, através da estimativa de FST (Wright, 1978)
foram analisados através do software Arlequin 3.5 (Excoffier & Lischer, 2010).
Árvores baseadas no método de verossimilhança foram geradas através do software
MEGA6 (Tamura et al., 2013) a fim de evidenciar o relacionamento entre os
morfótipos I e II, e entre as diferentes regiões geográficas amostradas. Em todas as
análises os sítios com gaps, inserções e deleções foram considerados.
95
RESULTADOS
Foram sequenciados e analisados fragmentos de 443 pares de bases (pb)
do gene Rhod, 655 pb do COI, 583 pb do 16S, 645 pb do CytB e 423 pb da RHV1,
totalizando 2.749 pb.
As análises realizadas através do Nucleotide BLAST e BOLD Identification
System revelaram que as sequências 16S e COI geradas eram compatíveis
exclusivamente com sequências de C. lugubris. Devido a ocorrência de sítios
polimórficos entre os indivíduos as estimadas de similaridade genética variaram
entre 99 e 100%.
As análises populacionais envolvendo as localidades de ASPSP, RN e
Trindade foram realizadas a partir de sequências Região Hipervariável 1 (RHV1).
Além da RHV1, os morfótipos I e II do ASPSP tiveram as sequências dos genes
Rhod, COI, 16S e CytB analisadas, revelando-se bastante conservados para C.
lugubris, sobretudo Rhod, o qual exibiu apenas um único haplótipo para todos os
espécimes sequenciados (N=20). Os demais genes apresentaram-se também muito
conservados com apenas dois haplótipos distintos para 16S e COI, e três para CytB.
A Região Hipervariável 1 apresentou uma alta variabilidade haplotípica e
nucleotídica (Tabela 1), e foi utilizada para as análises populacionais.
Nenhuma das quatro sequências de DNA analisadas exibiu diferenças
genéticas entre os morfótipos I dos II encontrados em ASPSP. Nas análises
intrapopulacionais envolvendo apenas ASPSP, a rede de haplótipos inferiu que um
indivíduo do morfótipo I é o haplótipo mais basal, porém não ficou evidenciado
diferenciações genéticas entre indivíduos dos dois morfótipos encontrados no
ASPSP (Figura 3a). A rede de haplótipos entre indivíduos do ASPSP, RN e IT,
indicou um haplótipo basal compartilhado entre ASPSP e RN. Além disso, não foi
identificada estruturação populacional entre as três localidades analisadas (Figura
3b). As redes de haplótipos com formato de estrela e os testes de neutralidade
indicaram expansão demográfica (Figura 3; Tabela 1).
As árvores de maximum likelihood revelam agrupamentos indistintos dos
morfótipos I e II e dos indivíduos do ASPSP, RN e IT (dados não mostrados). Os
valores FST não foram significativos entre as três localidades analisadas (ASPSP, RN
e IT).
96
Figura 3. Rede de haplótipos baseadas em sequências parciais da Região
Hipervariável 1 (DNAmt) de Caranx lugubris. ASPSP = Arquipélago de São Pedro e
São Paulo; IT = Ilha de Trindade; RN = Rio Grande do Norte; Arcos = Frequência
dos haplótipos.
DISCUSSÃO
Apesar da grande importância econômica e ecológica das espécies do
gênero Caranx, análises sobre a estrutura genética populacional neste gênero são
escassas (e.g. Santos et al., 2011; Duarte et al., 2017), limitando sua aplicação na
formulação de políticas públicas de conservação e manejo.
A alta variabilidade genética (Tabela 1) e a ocorrência de morfótipos distintos
de C. lugubris em partes da sua distribuição (ASPSP), ratificam a necessidade de
análises populacionais mais elaboradas. Como explicação para a peculiar ocorrência
destes morfótipos foram sugeridas variadas causas, tais como dimorfismo sexual,
isolamento populacional e adaptação ambiental, hibridização e invasões
interoceânicas de linhagens de C. lugubris a partir do Índico.
Uma das possibilidades aventadas, a ocorrência de dimorfismo sexual, foi
originalmente descartada, diante da ocorrência de machos e fêmeas com ambos os
morfótipos (Jacobina et al., 2014).
Estruturação genética regional ou divergência genética poderiam estar
associadas à conspícua variação morfológica de C. lugubris no ASPSP. Contudo, as
análises realizadas com base em sequências Rhod, COI, 16S, CytB e RHV1 não
evidenciaram qualquer diferenciação genética entre os morfótipos I e II, nem entre
97
os indivíduos das regiões costeira do Rio Grande do Norte e oceânicas do ASPSP e
Ilha de Trindade, sugerindo um cenário panmítico.
Em contraste com a variação morfológica intra-regional presente em parte
da distribuição de C. lugubris, análises genéticas em indivíduos de Caranx crysos da
costa do estado do Rio de Janeiro (Brasil) sugeriram a existência de uma possível
espécie críptica dentre os indivíduos analisados, a qual não foi percebida através da
identificação taxonômica clássica e morfometria multivariada dos indivíduos
coletados (Duarte et al., 2017). Estas variações fenotípicas e genéticas neste gênero
apoiam a complexidade de variação e assincronia destes padrões em espécies de
Caranx.
A ocorrência de hábitos migradores (Riede, 2004) e presença de ovos e
larvas pelágicas (Briggs, 1960) favorecem o atual quadro de panmixia observado
entre indivíduos de C. lugubris nas vastas áreas amostradas no Atlântico. Cenários
semelhantes de panmixia foram encontrados em outras espécies da família
Carangidae, tais como Caranx ignobilis e C. melampygus (Santos et al., 2011),
Trachurus trachurus (Comesaña et al., 2008), T. murphyi (Cárdenas et al., 2009), e
T. japonicus (Song et al., 2013). A homogeneidade genética apresentada por C.
lugubris e outras espécies deste gênero, com amplo potencial dispersivo, sugere a
avaliação de diversificação genética utilizando modelos geográficos que envolvam
grandes áreas da distribuição. De fato, análises populacionais interoceânicas na
espécie Seriola lalandi revelaram a existência de marcada estruturação populacional
ao longo dos oceanos Atlântico, Pacífico e Índico (Swart et al., 2016).
Apesar da ausência de estruturação populacional em C. lugubris, os
elevados índices de diversidade dos indivíduos do arquipélago (Tabela 1) quando
comparados com os das demais regiões geográficas analisadas (RN e Trindade)
sugerem que o ASPSP pode desempenhar importante papel na manutenção da
variabilidade genética da espécie. De fato, o arquipélago de São Pedro e São Paulo
localiza-se na latitude 0º55’, pouco acima da linha do Equador, distante 950 km da
costa do Brasil e 1800 km da costa africana. Por ser uma região sob forte influência
das correntes equatoriais (ver Rocha, 2003), é possível que sua localização favoreça
o acúmulo de indivíduos/ovos/larvas oriundas de populações de ambos os lados do
Atlântico.
As distribuições geográficas de algumas espécies de peixes, como a moreia
M. pavonina com ocorrência na costa brasileira e ASPSP, e M. melanotis presente
na costa africana e no ASPSP (Feitoza et al., 2003; Wirtz et al., 2013), demonstram
98
sua atuação na manutenção de indivíduos de ambos os lados do Atlântico. Além
disso, é possível que o regime de correntes reinantes no Atlântico Sul propicie que
caso indivíduos de linhagens oriundas do oceano Índico ultrapassem a barreira da
Corrente de Benguela, estes possam ser direcionados a aportar nesta região. Caso
seja confirmado, isto poderia ajudar a explicar a maior diversidade haplotípica nesta
região insular, haja visto que estudos recentes sugerem que invasões através da
África do Sul têm contribuído para a diversidade de peixes do Atlântico (Floeter et
al., 2008).
Espécies com grande amplitude de distribuição propicia áreas de
sobreposição que podem favorecer a ocorrência de hibridizações entre espécies
próximas. No gênero Caranx já foram documentados casos de hibridação (Murakami
et al., 2007; Santos et al., 2011) e complexo de espécies (Smith-Vaniz & Carpenter
2007), que poderiam ser causas da ocorrência dos morfótipos encontrados no
arquipélago de São Pedro e São Paulo.
As análises realizadas através do Nucleotide BLAST e Identification System
revelaram que as sequências 16S e COI obtidas são compatíveis com espécimes de
C. lugubris do arquipélago de São Pedro e São Paulo (Oceano Atlântico), da ilha
Moorea (Polinésia Francesa, Pacífico) e dos bancos de Protea (África do Sul,
Índico). A ausência de divergência genética demonstra o conservadorismo destas
sequências, e aparente ausência de espécies crípticas, apesar da existência de
efetivas barreiras biogeográficas ao longo da sua distribuição.
Diante da herança matrilinear do DNA mitocondrial, a ocorrência de
hibridação interespecífica envolvendo C. lugubris poderia ser detectada com base
nas sequências COI e 16S caso a atuação materna fosse provida por outra espécie.
De fato, híbridos no gênero Caranx já foram descritos para as ilhas do Havaí
(Pacífico) através do sequenciamento de genes mitocondriais. Híbridos de Caranx
ignobilis x C. melampygus e C. melampygus x C. sexfasciatus diferenciam-se da
espécie C. melampygus em apenas uma mutação no gene COI e uma no gene 16S
(Murakami et al., 2007). Uma vez que esta variação nucleotídica está dentro do
intervalo de variação encontrado dentre as espécies de peixes para o gene COI
(Ward et al., 2005) e no suporte provido pela análise de outros genes mitocondriais,
como ATPase 6 e ATPase 8 (Santos et al., 2011), identificou-se C. melampygus
como a linhagem materna destes híbridos.
Diferentemente do que acontece entre Caranx hippos, C. caninus e C.
fischeri (Smith-Vaniz & Carpenter, 2007), até o momento não existem indicações de
99
que C. lugubris constitua um complexo de espécies no Atlântico. Essa condição tem
pouco suporte taxonômico, bem como das evidências genéticas aqui apresentadas,
embora divergências genéticas interoceânicas mais marcantes não possam ser
descartadas.
Algumas evidências têm apontado que o isolamento geográfico associado a
fatores ambientais intrínsecos do ASPSP podem atuar sobre algumas espécies,
favorecendo a fixação de padrões fenotípicos peculiares em peixes de diferentes
famílias. Neste sentido, já foram registrados fenótipos cromáticos atípicos para as
espécies Holacanthus ciliaris (Pomacanthidae) e Chromis multilineata
(Pomacentridae) (Feitoza et al., 2003; Luiz-Júnior, 2003; Cunha et al., 2014), ou
variações morfológicas em Abudefduf saxatilis (Pomacentridae) (Molina et al., 2006).
Mais recentemente, análises genéticas em espécies do gênero Stegastes revelaram
que S. sanctipauli, até então considerada endêmica do ASPSP, constitui na
realidade uma sinonímia de S. rocasensis, com distribuição também no arquipélago
de Fernando de Noronha e no Atol das Rocas (Souza et al., 2016). As interpretações
de dualidade entre essas formas se baseavam exclusivamente no conjunto de
variações morfológicas e cromáticas da população de S. rocasensis presente no
ASPSP.
Estes casos ilustram brevemente os padrões de variação que podem ocorrer
em decorrência das condições físicas e ambientais a que estão sujeitas as espécies
naquela região insular. As reduzidas dimensões territoriais (ver Motoki et al., 2009) e
condições ambientais particulares do ASPSP poderiam intensificar competições inter
e intraespecíficas, promovendo adaptações morfológicas relacionadas à natação e
alimentação (Bond, 1979; Breda et al., 2005; Piorski et al., 2005; Lima-Filho et al.,
2012). Embora pouco provável está hipótese merece uma análise mais detalhada.
Os resultados obtidos indicam uma condição de panmixia em C. lugubris nas
regiões oceânicas amostradas do Atlântico e sugerem um papel do ASPSP como
área estratégica para a manutenção da diversidade genética da espécie. Além disso,
aparentemente os morfótipos não decorrem de divergências genéticas, contudo,
outros marcadores genéticos e amostras de C. lugubris provenientes de outras
regiões oceânicas poderão vir a contribuir para esclarecer sua ocorrência.
100
Tabela 1. Diversidade genética de Caranx lugubris.
N h S Hd ± sd π ± sd D FS
Genes/ASPSP (Morf. I + II)
Rodopsina 20 1 0 0 0 - -
16S 4 2 1 0,500 ± 0,265 0,0008 ± 0,0009 - -
Citocromo c oxidade subunidade I 6 2 1 0,333 ± 0,215 0,0005 ± 0,0006 - -
Citocromo B 20 3 2 0,194 ± 0,114 0,0003 ± 0,0004 - -
RHV1/Regiões geográficas
ASPSP (Morf. I + II) 19 19 56 1,000 ± 0,017 0,110 ± 0,060 -2,307* -14,204*
Ilha de Trindade 8 7 13 0,964 ± 0,077 0,070 ± 0,044 -0,554** -2,181**
Rio Grande do Norte 6 4 5 0,866 ± 0,129 0,029 ± 0,022 -0,825** -0,624**
Todas as populações 33 28 65 0,986 ± 0,012 0,013 ± 0,007 -2,375* -22,603*
N - Número de indivíduos; h - Número de haplótipos; S - Número de sítios polimórficos; Hd - Diversidade haplotípica; π - Diversidade nucleotídica; sd - Desvio
padrão; D - Estatística Tajima (Tajima, 1989); Fs - Estatística Fu (Fu, 1997); RHV1 - Região Hipervariável 1; ASPSP - Arquipélago de São Pedro e São Paulo; Morf.
- Morfótipo; *p = 0; **p > 0,05; A distribuição dos haplótipos e os números de acesso ao Genbank encontram-se na Tabela suplementar 1.
101
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106
Tabela suplementar 1. Distribuição de haplótipos em Caranx lugubris.
Genes Haplótipos ASPSP RN IT Total Genbank
Rodopsina Hap1 20 (10 indivíduos Morf. I, 10 indivíduos Morf. II)
20 submetido
16S Hap1 3 (2 indivíduos Morf. I, 1 indivíduo Morf. II)
3 submetido
Hap2 1 (Morf. I) 1 submetido
COI Hap1 5 (3 indivíduos Morf. I, 2 indivíduos Morf. II)
5 submetido
Hap2 1 (Morf. II) 1 submetido
Citocromo B Hap1 18 (9 indivíduos Morf. I, 9 indivíduos Morf. II)
18 submetido
Hap2 1 (Morf. I) 1 submetido
Hap3 1 (Morf. I) 1 submetido
RHV1 Hap1 1 (Morf. II) 1 submetido
Hap2 1 (Morf. II) 1 submetido
Hap3 1 (Morf. II) 1 submetido
Hap4 1 (Morf. II) 1 submetido
Hap5 1 (Morf. II) 1 submetido
Hap6 1 (Morf. II) 1 submetido
Hap7 1 (Morf. II) 1 submetido
Hap8 1 (Morf. II) 1 submetido
Hap9 1 (Morf. II) 1 submetido
Hap10 1 (Morf. II) 2 3 submetido
Hap11 1 (Morf. I) 1 submetido
Hap12 1 (Morf. I) 1 submetido
Hap13 1 (Morf. I) 1 submetido
Hap14 1 (Morf. I) 1 submetido
Hap15 1 (Morf. I) 1 submetido
Hap16 1 (Morf. I) 1 submetido
Hap17 1 (Morf. I) 1 submetido
Hap18 1 (Morf. I) 1 submetido
Hap19 1 (Morf. I) 1 submetido
Hap20 1 1 submetido
Hap21 1 1 submetido
Hap22 2 2 submetido
Hap23 1 1 submetido
Hap24 1 1 submetido
Hap25 2 1 3 submetido
Hap26 1 1 submetido
Hap27 1 1 submetido
Hap28 1 1 submetido
ASPSP - Arquipélago de São Pedro e São Paulo; RN - Rio Grande do Norte; IT - Ilha de Trindade;
COI -Citocromo c oxidase subunidade I; RHV1 - Região Hipervariável 1; Morf. - Morfótipo.
107
CONCLUSÕES GERAIS
• Os genes mitocondriais 16S, CytB e COI mostraram-se eficientes como
marcadores taxonômicos moleculares para o gênero Stegastes;
• Stegastes sanctipauli e S. rocasensis constituem uma mesma espécie;
• O nível de diferenciação genética entre S. fuscus trindadensis e S. fuscus
não é suficiente para manutenção do status de espécie para a população da
Ilha de Trindade;
• As variações morfológicas entre Stegastes “sanctipauli” e S. rocasensis, e
entre S. fuscus e S. fuscus “trindadensis” estão em parte atreladas a
condições ecológicas diferenciadas entre as regiões de ocorrência das
populações;
• A diferenciação genética encontrada em diferentes pontos de distribuição de
S. variabilis sugere a ocorrência de uma nova espécie no Atlântico;
• As populações costeiras de Abudefduf saxatilis, desde a Venezuela até o
sudeste do Brasil, representam uma população panmítica, enquanto que as
populações insulares apresentam estruturação genética em diferentes
níveis, sobretudo a da Ilha de Trindade;
• A espécie C. lugubris constitui uma população panmítica envolvendo a costa
do estado do Rio Grande do Norte, Ilha de Trindade e Arquipélago de São
Pedro e São Paulo;
• Os morfótipos I e II exibidos pela espécie Caranx lugubris no entorno do
Arquipélago de São Pedro e São Paulo não possuem divergências genéticas
para as sequências analisadas;
108
• O Arquipélago de São Pedro e São Paulo representa um ambiente
estratégico para a manutenção da biodiversidade brasileira;
• A distância do litoral sul-americano e as ilhas é diretamente proporcional ao
aumento da divergência genética entre as populações insulares e costeiras;
• Os ambientes insulares brasileiros possuem nível reduzido de fluxo gênico
com outras regiões insulares e a costa sul-americana;
• Os resultados obtidos podem ser utilizados como subsídios para o manejo e
conservação das espécies e ambientes insulares do Atlântico Ocidental.