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FACULDADE DE MEDICINA DE SÃO JOSÉ DO RIO
PRETO/FAMERP
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENFERMAGEM
Ana Laura Batista Zamorel
Diversidade genética de Klebsiella pneumoniae
produtora de KPC associadas a ITU em um hospital
terciário de São José do Rio Preto
São José do Rio Preto
2017
FACULDADE DE MEDICINA DE SÃO JOSÉ DO RIO
PRETO/FAMERP
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENFERMAGEM
Ana Laura Batista Zamorel
Diversidade genética de Klebsiella pneumoniae
produtora de KPC associadas a ITU em um hospital
terciário de São José do Rio Preto
São Jose do Rio Preto
2017
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado à Faculdade de Medicina de
São José do Rio Preto para obtenção do
grau em Enfermagem
Ficha Catalográfica
Ana Laura Batista Zamorel
Diversidade genética de Klebsiella pneumoniae produtora de KPC
associadas a ITU em um hospital terciário de São José do Rio Preto
36 p.
São José do Rio Preto, 2017.
Trabalho de Conclusão de Curso (TCC) – Faculdade de Medicina
de São José do Rio Preto – FAMERP
Orientadora: Profa. Dra. Mara Correa Lelles Nogueira
1. ITU ; 2. K. pneumoniae; KPC; 3. Tipagem molecular
FACULDADE DE MEDICINA DE SÃO JOSÉ DO RIO PRETO
CURSO D GRADUAÇÃO EM ENFERMAGEM
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
COMISSÃO EXAMINADORA
Data 30/11/2017
Orientador: Profa. Dra. Mara Correa Lelles Nogueira
Co-orientador : Me. Franciele Maira M. B. Tomaz
1° Examinador: Dr. Tiago Casella
2° Examinador: Andressa Batista Zequini de Morais
i
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA ........................................................................................................................ II
AGRADECIMENTO ................................................................................................................ II
EPÍGRAFE ............................................................................................................................... III
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. VI
LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES ............................................................................... VII
RESUMO .............................................................................................................................. VIII
ABSTRACT .............................................................................................................................. X
1.0 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 10
1.1 INFECÇÕES DO TRATO URINÁRIO (ITU) .................................................................. 10
1.1.3 TRATAMENTO .............................................................................................................. 13
2.0 JUSTIFICATIVA ............................................................................................................... 15
3.0 OBJETIVOS ....................................................................................................................... 16
4.0 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 17
4.1 SELEÇÃO DOS ISOLADOS KLEBSIELLA PNEUMONIAE PRODUTORAS DE KPC 17
4.2 LEVANTAMENTO DE DADOS DEMOGRÁFICOS, CLÍNICOS E
MICROBIOLÓGICOS RELACIONADOS AOS PACIENTES E ÀS INFECÇÕES ............. 17
4.3 ARMAZENAMENTO E MANUTENÇÃO DOS ISOLADOS ......................................... 17
4.4 TIPAGEM MOLECULAR POR PFGE ............................................................................. 18
4.5 ANÁLISE DA SIMILARIDADE GENÉTICA ................................................................. 19
5.1 DADOS DEMOGRÁFICOS .............................................................................................. 20
5.2 DADOS CLÍNICOS ........................................................................................................... 22
5.3 DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE AOS
ANTIMICROBIANOS ............................................................................................................. 26
6.0 CONCLUSÕES .................................................................................................................. 30
REFERÊNCIA ......................................................................................................................... 31
ii
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a todos aqueles que me deram força para chegar até aqui.
ii
AGRADECIMENTO
Primeiramente, agradeço a Deus que iluminou о meu caminho durante esta caminhada.
Em especial, agradeço a Profª. Dra. Mara, por todo aprendizado, confiança e por ter me
aceito em seu laboratório.
À Maira, pelas contribuições e orientações para a realização deste trabalho.
Aos meus pais, Flávia e Fabio e ao meu padrasto Carlos, pelo apoio e por estarem
comigo em todos os momentos.
Ao meu namorado, João, pelo seu companheirismo, amor, carinho e pela ajuda na
realização deste trabalho.
A todos do laboratório CIM – FAMERP, em especial à Naiady, que me acolheu e me
ajudou em todos os momentos no laboratório.
Finalmente, agradeço a Profª Dra, Vânia Paschoal pelas orientações para realização
deste trabalho.
iii
EPÍGRAFE
“Aprendi que deveríamos ser gratos a Deus por não nos dar tudo o que lhe pedimos”
William Shakespeare
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Porcentagem dos pacientes do sexo masculino e feminino acometidos
por ITU devido a Klebsiella pneumoniae produtora de KPC no período
de março de 2015 a julho de 2016 ...........................................................
21
Figura 2 - Localidade dos pacientes acometidos por ITU por Klebsiella.
pneumoniae produtora de KPC no período de março de 2015 a julho de
2016 .........................................................................................................
21
Figura 3 - Motivo das admissões dos pacientes internados que desenvolveram
ITU por Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC ..............................
22
Figura 4 - Percentual de hipertensão em pacientes com ITU por K. pneumoniae
produtora de KPC ...................................................................................
23
Figura 5 - Percentual de diabéticos em pacientes com ITU por Klebsiella
pneumoniae produtoras de KPC ..............................................................
23
Figura 6 - Evolução dos pacientes com diagnóstico de ITU por Klebsiella
pneumoniae produtoras de KPC .............................................................
24
Figura 7 - Utilização de cateter vesical de demora nos pacientes com ITU por
Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC..............................................
25
Figura 8 - Distribuição temporal dos casos de ITU por Klebsiella pneumoniae
produtoras de KPC ...................................................................................
25
Figura 9 - Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos dos pacientes
acometidos por ITU.................................................................................
27
Figura 10 - Diversidade genética mostrada no dendrograma gerado por PFGE dos
isolados selecionados da coleção de cultura do Laboratório da
Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto no período de 2015 a
2016...........................................................................................................
29
vii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES
% - Porcentagem
Cº – Graus Celsius
µg – Micrograma
µL – Microlitro
AK – Amicacina
AME – aminoglycoside modifying enzyme
AMP - Ampicilina
CAZ – Ceftazidima
CIP - Ciprofloxacina
CN - Gentamicina
CRO – Ceftriaxona
DNA - Ácido desoxirribonucléico
ESBL - “Extended-spectrum β-lactamase”
ETP - Ertapenem
EUA - Estados Unidos da América
FAMERP - Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto
FEP – Cefepime
FOX - Cefoxitina
HB - Hospital de Base
IMP – Imipenem
ITU – infecção do trato urinário
IRAS - Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde
viii
KF- Cefalotina
KPC - “Klebsiella pneumoniae carbapenemase”
MDR – Multi Drog Resistent
MEM - Meropenem
mg – Miligrama
mL – Mililitro
NOR – Norfloxacino
Nº - Número
PCR - “Polymerase chain reaction”
PFGE - “Pulsed Field Gel Electrophoresis”
RNAse - Ribonuclease
TGC - Tigeciclina
TSB - “Tryptic Soy Broth”
TZP – Piperacina/tazobac
U – Unidade
UFC – Unidade formadora de colônia
UPGMA - Unweighted pair group method with arithmetic mean
viii
ZAMOREL, Ana Laura Batista. Diversidade genética de Klebsiella pneumoniae produtora de
KPC associadas a ITU em um hospital terciário de São José do Rio Preto. Trabalho de
Conclusão de Curso. Curso de Bacharelado em Enfermagem. Faculdade de Medicina de São
José do Rio Preto - FAMERP, 2017.
RESUMO
Introdução: As infecções do trato urinário (ITU) estão entre as infecções bacterianas mais
comuns, na comunidade e nas instituições de assistência à saúde. Estas acometem indivíduos
de todos os sexos e idades. Nos hospitais, são as principais infecções relacionadas à assistência
à saúde, acometendo principalmente indivíduos que já possuem alguma comorbidade
anatômica e funcional. Entre os principais agentes de ITU no ambiente hospitalar, destaca-se
Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC, por sua resistência à antibioticoterapia e associação
com altas taxas de morbidade e mortalidade. Objetivos: Identificar as características
demográficas e clínicas dos pacientes acometidos por ITU por Klebsiella pneumoniae
produtoras de KPC em um hospital terciário de São José do Rio Preto, e analisar a diversidade
genética de cepas. Métodos: Para o estudo, foram selecionadas 91 cepas de Klebsiella
pneumoniae produtoras de KPC, isoladas de diferentes pacientes admitidos no Hospital de Base
de São José do Rio Preto (HB), no período de março de 2015 a julho de 2016. Após a seleção
dos isolados, foi realizada a tipagem molecular por PFGE. Os dados demográficos e clínicos de
cada paciente foram consultados do prontuário eletrônico do HB. Resultados: Dos 91 pacientes
inclusos neste estudo, a prevalência de ITU foi maior no sexo masculino e idosos. Do total,
76% eram hipertensos, 31% eram diabéticos e 26% utilizaram cateter vesical de demora durante
a internação. Após a urocultura positiva e o início do tratamento com antimicrobianos, 50% dos
pacientes continuaram internados, 45% evoluíram a óbito e 5% receberam alta. As linhagens
apresentaram alta resistência aos antimicrobianos, e evidenciou-se ampla diversidade de
Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC genética nos perfis obtidos por PFGE. Conclusão:
ix
A infecção do trato urinário por Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC acomete a
população mais idosa e com predomínio do sexo masculino. A hipertensão arterial e diabetes
mellitus não são comorbidades comuns nos pacientes acometidos por ITU e, além disso, cateter
vesical de demora é um fator de risco. As ITU estudadas são causadas por linhagens de
Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC geneticamente distintas, provavelmente originadas
da própria microbiota do paciente.
PALAVRAS CHAVE: ITU; K. pneumoniae; Tipagem molecular.
x
ZAMOREL, Ana Laura Batista Genetic diversity of Klebsiella pneumoniae producing- isolated
KPC from a tertiary hospital of São José do Rio Preto. Monograph for Bachelor Degree in
Nursing. Faculty of Medicine of São José do Rio Preto - FAMERP, 2017.
ABSTRACT
Introduction: Urinary tract infections (UTIs) are among the most common bacterial infections
acquired in the community and in hospital environments. They affect individuals of both sexes
and all ages. In hospitals, they are the main infections related to health care, mainly affecting
individuals who already have some anatomical and functional comorbidity. Among the main
UTI agents in the hospital setting, we highlight Klebsiella pneumoniae producing-KPC, due to
its resistance to antibiotic therapy and association with high rates of morbidity and mortality.
Objectives: To identify the demographic and clinical characteristics of patients with UTI by K
pneumoniae producing-KPC in a tertiary hospital in São José do Rio Preto, and to analyze the
genetic diversity of strains. Methods: Ninety-one Klebsiella pneumoniae strains of producing-
isolated KPC, from different patients admitted at Base Hospital of São José do Rio Preto, from
March 2015 to July 2016 were selected for the study. After the selection of isolates, molecular
typing by PFGE performed. The demographic and clinical data of each patient were checked in
the HB electronic medical record Results: Of the 91 patients included in this study, the
prevalence of UTI was higher in males and elderlies. Of the total, 76% were hypertensive, 31%
were diabetic, and 26% used a permanent vesical catheter during hospitalization. After positive
uroculture and the beginning of antimicrobial treatment, 50% of the patients remained
hospitalized, 45% died and 5% were discharged. The lineages showed high resistance to
antimicrobial agents, and a wide genetic diversity was stood out in the profiles obtained by
PFGE. Conclusion: Infection of the urinary tract by Klebsiella pneumoniae producing-KPC
affects the older population, predominantly male sex . High blood pressure and diabetes
xi
mellitus are not common comorbidities in patients with UTIs and, in addition, permanent
bladder catheter is a risk factor. The studied UTIs are caused by genetically distinct strains of
Klebsiella pneumoniae, probably originating from the patient's own microbiota.
Keywords: ITU; K. Pneumoniae; molecular typing
10
1.0 INTRODUÇÃO
1.1 INFECÇÕES DO TRATO URINÁRIO (ITU)
As infecções do trato urinário (ITU) estão entre as infecções bacterianas mais comuns
na população. Acometem indivíduos na comunidade e em hospitais, de todas as idades, desde
os primeiros anos de vida até a velhice¹. Estima-se que 150 milhões de ITU ocorram anualmente
em todo o mundo2. No ano de 2013 nos EUA, aproximadamente 160 mil homens de 65 anos
ou mais e 2 milhões de mulheres de diversas idades buscaram atendimento de emergência
devido à ITU3.
Nos neonatos até os seis meses de idade, acomete principalmente o sexo masculino
devido às malformações congênitas, como as válvulas de uretra posterior4. Após esse período
há uma diminuição na incidência em razão da anatomia e fisiologia masculina, como o maior
comprimento uretral, o maior fluxo urinário e o fator antibacteriano prostático. Porém, após os
60 anos de idade a incidência aumenta, podendo atingir entre 3% a 4% dos homens, devido a
quadros de hiperplasia prostática5.
Em relação as mulheres, as infecções são infrequentes em meninas de 2 a 13 anos de
idade, contudo, se torna frequente no início da adolescência, principalmente após o início da
atividade sexual, durante a gravidez e menopausa6. As mulheres possuem maior predisposição
em adquirir ITU devido às características anatômicas do seu trato urinário, que apresenta uretra
curta e abertura uretral próxima da cavidade vaginal e retal, que são regiões corporais que
abrigam grandes comunidades bacterianas. A grande proximidade da uretra até a bexiga torna
possível para a colonização bacteriana atingir facilmente a bexiga antes de ser removida por
micção5.
A ITU caracteriza-se pela presença de colonização microbiana da urina podendo ser
definida como7:
11
- ITU assintomática: Infecção do trato urinário que se caracteriza pela presença de
bactéria no trato urinário, com ausência de sintomas e, geralmente, sem necessidade de terapia
antimicrobiana7.
- ITU sintomática: Infecção do trato urinário em paciente com, ou sem, cateter vesical
de demora que apresente sintomatologia e um resultado positivo na cultura de urina7.
- ITU relacionada à assistência à saúde associada a cateter vesical: Qualquer infecção
urinária sintomática que o paciente tenha utilizado cateter vesical de demora dois dias7.
- ITU relacionada à assistência à saúde não associada a cateter: Infecção urinária
sintomática em que o paciente não esteja em uso de cateter vesical de demora7.
Outras infecções do sistema urinário: Qualquer infecção do trato urinário, não estando
relacionada a procedimento urológico, diagnosticada após a admissão em serviço de saúde8.
Clinicamente, as ITU são classificadas como simples ou complicadas. As não
complicadas afetam indivíduos saudáveis e que não possuem anormalidades estruturais. As ITU
complicadas estão associadas a fatores que comprometem o trato urinário, incluindo obstrução
urinária, retenção urinária causada por doenças neurológicas, imunossupressão, insuficiência
renal, transplante renal, gravidez e presença de corpos estranhos, como cálculos, cateteres
internos ou outros dispositivos de drenagem9.
Os principais fatores de risco para desenvolver uma infecção do trato urinário são:
diabetes, gravidez, doença arterial coronariana, obstrução do trato urinário, cateterização
urinária, relação sexual, uso de diafragma, geléia espermicida, prostatismo, menopausa,
transplante renal e outros10.
O diagnóstico da ITU baseia-se em sintomas clínicos e um resultado positivo na cultura
de urina, com um valor mínimo de 100 mil unidades formadoras de colônias por mililitros de
urina (UFC/mL)12. Em relação aos pacientes com o uso de cateteres urinário de demora, o valor
12
mínimo para um resultado positivo é de 100 mil unidades formadoras de colônias por mililitros
de urina (UFC/mL)13.
O Ministério da Saúde (portaria nº2616/98) classifica as ITU como hospitalares ou da
comunidade, de acordo com o local que foram adquiridas. A ITU da comunidade é a infecção
constatada no momento da admissão hospitalar e não está relacionada com internações
anteriores. A infecção hospitalar, por sua vez, é adquira após a internação, manifestando-se
durante a hospitalização ou após a alta, e está na maioria das vezes associada ao uso de cateteres
urinários de demora. Algumas práticas contribuem para que a infecção ocorra devido a
cateteres urinários de demora, sendo elas: a aplicação de técnicas inapropriadas, a não
higienização das mãos, uso de materiais contaminados e tempo de permanência do cateter
urinário superior a real necessidade15. As ITU hospitalares são as principais infecções
relacionadas à assistência à saúde (IRAS)16.
1.1.2 PATOGÊNESE
As infecções do trato urinário são causadas por bactérias Gram-negativas e Gram-
positivas, e por fungos. O agente mais comum para ITU simples e complicadas é a Escherichia
coli17 mas, outros agentes, tais como Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis,
Streptococcus do grupo B e Candida spp desempenham papel importante18.
De acordo com Bouamri e colaboradores (2015), Klebsiella pneumoniae é o agente
etiológico de 6 a 17% das ITU, dependendo da localização geográfica. Nos últimos anos, este
patógeno ganhou especial importância devido as altas taxas de ITU hospitalares causadas por
linhagens resistentes a várias classes de antibióticos, o que dificulta o tratamento e aumenta as
taxas de morbi-mortalidade19. Pacientes de grupos de risco, como portadores de bexiga
neuropática ou diabetes mellitus, são os mais acometidos20.
13
Klebsiella pneumoniae é um bacilo Gram-negativo da família Enterobacteriaceae. É
naturalmente encontrado nas mucosas da nasofaringe e trato gastrointestinal de seres humanos
e animais21,22,23. Destaca-se entre as espécies de Enterobacteriaceae mais frequentemente
associadas às infecções oportunistas, principalmente em indivíduos imunossuprimidos ou com
doenças de base. No ambiente hospitalar, pacientes colonizados ou com infecções atuam como
reservatórios de cepas que são transmitidos horizontalmente, pelas mãos dos profissionais da
saúde e fômites. Essa transmissão é favorecida pela capacidade de sobrevivência desta bactéria
no ambiente, é uma importante causa de surtos tanto por um único como por múltiplos clones
de Klebsiella pneumoniae24.
A colonização por Klebsiella pneumoniae no trato urinário pode ser através da via
ascendente, hematogênica ou linfática. A via ascendente ocorre frequentemente em mulheres
devido a fatores anatômicos, e aproximação retal e perineal. O agente etiológico pertencente à
microbiota intestinal entra no trato urinário através da uretra e por via ascendente coloniza a
bexiga urinária, e por vezes até a pelve renal. Na pelve renal, o agente pode se espalhar pelo
parênquima renal e causar pielonefrite. A via hematogênica é raramente encontrada, acomete
principalmente recém-nascidos e pacientes imunocomprometidos e a disseminação acontece
via corrente sanguínea até o parênquima renal. A infecção via linfática ocorre por infecção
intestinal grave, obstrução intestinal e abscessos intra ou retroperitoneais25.
1.1.3 TRATAMENTO
A terapia antimicrobiana para a ITU varia de acordo com a apresentação da infecção e
o agente etiológico da mesma. Inicialmente o tratamento é de forma empírica, até que se tenha
o resultado da cultura de urina e o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. É importante
selecionar um antibiótico de resposta rápida e eficaz, evitando recorrência e resistência
antimicrobiana26.
14
Os antibióticos β-lactâmicos, principalmente cefalosporinas de terceira e quarta geração
e carbapenêmicos são as principais opções para o tratamento de infecções por Klebsiella.
pneumoniae27,28. Entretanto, a produção de β-lactamases de espectro estendido (ESBL) que
confere resistência às penicilinas, cefalosporinas de terceira geração e ao aztreonam, é um
desafio terapêutico desde os anos 8029. Desde então, os carbapenêmicos passaram a ser usados
com frequência, como última opção para o tratamento de infecções graves por bacilos Gram-
negativos multirresistentes30. Como resultado, nas últimas décadas, Klebsiella. pneumoniae
resistentes aos carbapenêmicos tornaram-se uma grande ameaça à saúde pública, uma vez que
as infecções por esses organismos estão associadas a morbidade e mortalidade significativas31.
1.2 RESISTÊNCIA AOS CARBAPENÊMICOS
O principal mecanismo de resistência aos carbapenêmicos é a produção de uma serino-
carbapenemase da classe A de Ambler e grupo funcional 2f, denominada “Klebsiella
pneumoniae carbapenemase” (KPC)32. Esta enzima hidrolisa os carbapenêmicos, oximino-
cefalosporinas, cefamicinas e não são inibidas por inibidores das β-lactamases tais como o ácido
clavulânico, sulbactam e tazobactam.33.
O primeiro caso de infecção por Klebsiella pneumoniae produtora de carbapenemase
(KPC), ocorreu no ano de 1996 na Carolina do Norte (Estados Unidos) em pacientes de terapia
intensiva34. Posteriormente, entre os anos de 2001 e 2002 foram documentados em Nova York
transferências de mecanismos de resistência e infecções tanto por Klebsiella pneumoniae e
outras Enterobacteriaceae35.
O primeiro caso de infecção intercontinental ocorreu no ano de 2005 em Paris (França),
por um paciente previamente tratado em Nova York. Em seguida, diversos relatos foram
encontrados por transmissão associada à migração geográfica especialmente em Israel e Grécia.
Na América Latina, o primeiro caso registrado foi em Medellin (Colômbia) em 200534.
No Brasil, o primeiro caso foi descrito em 200635. Atualmente, bactérias produtoras da
15
enzima KPC encontram-se amplamente disseminadas no país, e diversas publicações relatam a
ocorrência de surtos e casos de infecção em vários estados brasileiros36,37,38,39;40,41. Esta
realidade é preocupante, pois as opções terapêuticas são limitadas, o que resulta em alta
mortalidade. O tratamento é restrito ao uso de polimixinas, tigeciclina e aminoglicosídeos,
associadas ou não ao imipenem42,43.
2.0 JUSTIFICATIVA
O primeiro caso de infecção por Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC foi
diagnosticado em abril de 2011 no Hospital de Base de São José do Rio Preto. Até o mês de
fevereiro de 2017, foram confirmados 2868 casos. Entre estes casos, a maioria foi identificada
como infecções do trato urinário, em pacientes admitidos em enfermarias clínicas e cirúrgicas
e unidades de terapia intensiva (Comissão de Controle de Infecção Hospitalar do HB,
comunicação pessoal, março de 2017).
No presente estudo, 91 cepas de Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC isoladas de
urina de pacientes atendidos no HB em 2015 e 2016 foram investigadas, visando determinar o
perfil de similaridade genética. As características demográficas e clínicas dos pacientes
acometidos pelas infecções também foram avaliadas. As informações geradas neste estudo
serão importantes para aumentar o conhecimento sobre as infecções urinárias causadas por
Klebsiella. pneumoniae produtoras de KPC na instituição, contribuindo para o melhor
direcionamento da terapia antimicrobiana e melhoria do prognóstico dos pacientes.
16
3.0 OBJETIVOS
Identificar as características demográficas e clínicas dos pacientes acometidos por
ITU por Klebsiella. pneumoniae produtoras de KPC em um hospital terciário de São José do
Rio Preto e analisar a diversidade genética de cepas.
17
4.0 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Seleção dos isolados Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC
Foram selecionadas para o estudo, 91 cepas de Klebsiella pneumoniae produtoras de
KPC, resistentes aos antimicrobianos carbapenêmicos, de diferentes pacientes acometidos por
ITU, admitidos no Hospital de Base de São José do Rio Preto, no período de março de 2015 a
julho de 2016. O protocolo previamente padronizado44, foi utilizado para confirmação da
presença do gene blaKPC em todos os isolados selecionados para este estudo.
Estas bactérias foram mantidas em coleção de cultura no Centro de Investigação de
Microorganismos da FAMERP, após serem coletadas no Setor de Microbiologia do Laboratório
Central do HB, onde foram identificadas e avaliadas, pelo equipamento Vitek®2 Compact
System (Biomerieux, France), quanto ao perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, segundo
a técnica de microdiluição em caldo automatizado, de acordo com procedimentos de rotina. A
interpretação dos resultados dos testes de suscetibilidade foi realizada de acordo com o CLSI
(2013)45 e as recomendações da Anvisa (NT 01/2013)46.
4.2 Levantamento de dados demográficos, clínicos e microbiológicos relacionados
aos pacientes e às infecções
Através do sistema eletrônico do HB, foram consultados os prontuários de cada paciente
incluído neste estudo.
As informações coletadas foram organizados em uma planilha no programa
Microsoffcom os dados relacionados a cada cepa, contendo identificação da amostra, número
do prontuário do paciente, data do isolamento, origem do isolado, espécime clínico, idade do
paciente, motivo da admissão e evolução do paciente.
4.3 Armazenamento e manutenção dos isolados
Depois de identificado e realizado os testes de susceptibilidade aos antimicrobianos, os
isolados selecionados foram mantidos em coleção de cultura a -80ºC. Para isso, uma colônia
18
isolada obtida da placa foi inoculada em caldo TSB (“Tryptic Soy Broth”, BACTOTM, França)
a 37 ºC por 16 a 18 horas. Após este período, 0,8 mL de cada cultura foram transferidos para
criotubos esterilizados previamente rotulados, onde foram adicionados 0,2 mL de glicerol à
50% esterilizado por autoclavagem a 121ºC por 15 minutos. Para cada isolado o
armazenamento foi realizado em duplicata e cada criotubo foi identificado com uma sigla. Os
isolados foram identificados como KP, um número da coleção de cultura e data de
armazenamento.
4.4 Tipagem molecular por PFGE
Aproximadamente 10 colônias de cada amostra bacteriana foram inoculadas em 10 ml
de TSB (“Tryptic Soy Broth”, BACTOTM Becton Dickinson,) e incubadas a 37 ºC por 18 a 24
horas em agitação. Após incubação, os tubos foram centrifugados a 8000 g por 10 minutos. Em
seguida, o sobrenadante foi descartado e as células bacterianas foram suspensas em 1 mL de
solução salina e transferidas para um tubo de microcentrífuga (1,5 mL) de peso conhecido. Os
tubos foram centrifugados a 8000 g por aproximadamente 03 minutos e o sobrenadante foi
cuidadosamente aspirado e desprezado. Com a finalidade de se determinar o peso da massa
celular os tubos foram novamente pesados. O centrifugado foi diluído em salina na proporção
de 1:1, isto é, o volume da solução salina em μl foi equivalente ao peso do centrifugado em μg.
Um volume de 5 μL desta solução foi transferido para outro tubo, onde foram adicionados 300
μL da solução tampão TEN (Tris 100 mM; pH 7,5; EDTA 100 mM; NaCl 150 mM; água
destilada). Essa nova solução foi homogeneizada e misturada a 340 μL de agarose 2% ("low
melting" - Invitrogen, Carlsbad, EUA) para a formação de blocos de agarose contendo o DNA
cromossômico ("plugs"). Os blocos foram incubados por um período mínimo de cinco horas
em solução EC (Tris 6 mM, pH 7,5; NaCl 1 M; EDTA 10 mM ; Brij 58 0,5%; Sarcosil 0,5%;
Deoxicolato 0,2% e água destilada) a 37 °C e, a seguir incubados, a 50 °C em 2 mL de solução
ES (EDTA 0,4 M, pH 9,3; Sarcosil 1,0%) contendo proteinase K (20 mg/mL, Promega
19
Corporation, Madison, EUA) numa proporção de 1:1 (2 mg de proteinase K para 2 mL de ES)
por um período de 12 horas. Após este período de incubação os blocos foram lavados quatro
vezes com solução CHEF-TE (Tris 100 mM, pH 7,5; EDTA 100 mM) e armazenados nessa
solução até serem submetidos à digestão enzimática e posterior eletroforese.
O DNA bacteriano das amostras estudadas foi digerido com a enzima de restrição Xba
(Fermentas Life Sciences, MD, EUA), 10 U por amostra, por 12 a 18 horas à temperatura de
37 °C. A eletroforese foi realizada em gel de agarose a 1% no sistema CHEF-DR II (Bio-Rad,
Richmond, CA, EUA) e o padrão de variação da corrente elétrica ("switch time") foi de 5 a 60
segundos. A eletroforese foi realizada por um período de 22 horas, em solução 0,5X TBE (Tris
89 mM; ácido bórico 89 mM; EDTA, 2 mM) a uma temperatura de 13 °C, utilizando uma
corrente elétrica de 200 volts (6 V/cm) com peso molecular Lambda Ladder PFG marker 50
µg/mL (New England Biolabs, Beverly, Mass, EUA). O gel foi revelado com brometo de etídio
(0,8 μL/mL) por uma hora, descorados em água destilada por mais uma hora e fotografado sob
luz ultravioleta.
4.5 Análise da similaridade genética
Na avaliação da similaridade genética entre os isolados, os padrões de identidade
genética gerados por PFGE foram analisados com o auxílio do programa Bionumerics (Applied
Maths, Saint-Martens-Latem, Bélgica) e foram usados na construção de dendrogramas,
empregando-se um coeficiente de correlação de Dice de 5%, com tolerância 2,0% e otimização
de 1,0%47.
20
5.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Dados demográficos
Tem-se observado que as ITU estão entre as infecções bacterianas mais comuns
relacionada à assistência à saúde48,. Este quadro infeccioso acomete ambos os sexos e todas as
idades. Nossos resultados (Figura 1) indicam que entre os 91 pacientes incluídos neste estudo,
a prevalência de ITU foi maior no sexo masculino (58%), com idade média de 60 ±18 anos. Os
demais (42%), eram do sexo feminino, com idade média de 68 ±16 anos. Estes resultados, por
sua vez, contrapõem aqueles encontrados na literatura. O estudo de GALVEZ e seus
colaboradores (2016), avaliou 2.517 pacientes diagnosticados com ITU por diferentes
patógenos. Desse total, 64,6% eram mulheres com idade média de 55 anos, e os demais 35,4%
eram homens com idade média de 63 anos. Já no estudo de HUNCK e seus colaboradores
(2016), 54% dos 121 pacientes diagnosticados com ITU por Klebsiella pneumoniae produtoras
de KPC eram mulheres. Existem muitas razões para considerar que as mulheres são mais
acometidas por ITU que os homens: a extensão anatômica uretral em mulheres é mais curta
quando comparada à do homem e a proximidade da vagina e do anus predispõem um maior
risco de infecção urinária5. Nossos resultados foram discrepantes em relação àqueles
encontrados na literatura, visto que o motivo da admissão dos pacientes foram por diferentes
patologias, não somente por ITU. Sendo assim, outros fatores podem estar envolvidos para a
predominância do sexo masculino.
21
Figura 1: Porcentagem dos pacientes do sexo masculino e feminino acometidos por ITU devido
a Klebsiella pneumoniae produtora de KPC no período de março de 2015 a julho de 2016
A figura 2 ilustra que entre os 91 pacientes incluídos neste estudo, 27% residiam no
município de São José do Rio Preto e os demais, em municípios limítrofes. O Hospital de Base
de São José de Rio Preto - SP é um hospital terciário, referência para 102 municípios e 85%
dos seus atendimentos são através do Sistema Único de Saúde, o que explica a predominância
de pacientes de diferentes localidades51.
Figura 2: Localidade dos pacientes acometidos por ITU por Klebsiella pneumoniae produtora
de KPC atendidos no HB, no período de março de 2015 a julho de 2016.
73%
27%
Município de Residência
Região de São José do Rio Preto São José do Rio Preto
42%
58%
Sexo
Feminino Masculino
22
5.2 Dados Clínicos
Entre os 91 pacientes incluídos no estudo, 76 estavam internados no Hospital de Base
quando a ITU foi diagnosticada e a amostra de urina coletada para cultura. Dez pacientes faziam
acompanhamento no ambulatório, mas já haviam sido admitidos no HB, e 5 eram indivíduos
da comunidade (externos) que enviaram amostras de urina para urocultura.
Os pacientes que foram admitidos no HB foram encaminhados para diferentes
especialidades do hospital, sendo: 80% pela clínica médica, 11% para cirurgia, 5% para
tratamento de neoplasias, 3% devido a trauma e 1% para realização de exames (Fig. 3).
Figura 3: Motivo das admissões dos pacientes internados que desenvolveram ITU por
Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC.
Em relação à hipertensão arterial, dos 91 pacientes incluídos neste estudo, 75% eram
hipertensos (Figura 4). No Brasil, as pessoas de 60 anos ou mais constituem a faixa etária com
maior crescimento populacional e que apresentam predomínio de doenças crônicas, incluindo
a hipertensão, diabetes mellitus, insuficiência renal, obesidade e doenças neurológicas e
cardiovasculares, dentre outras52. No nosso estudo, a média de idade dos pacientes foi de 63
anos, o que os inclui no grupo acima citado. Apesar de não ter sido encontrada na literatura
evidências de que a frequência de ITU seja maior em indivíduos hipertensos quando comparado
a indivíduos normais da mesma faixa etária, sabe-se que a progressão ou a exacerbação da
11%
80%
3% 5% 1%
Motivo da internação
Cirurgia Clínica médica Trauma Neoplasia Exames
23
hipertensão é acompanhada de hospitalizações frequentes e longos períodos de internações,
aumentando o risco em adquirir ITU por eventos adversos relacionado a assistência à saúde52.
.
Figura 4: Percentual de hipertensão em pacientes com ITU por Klebsiella pneumoniae
produtora de KPC.
Entre os 91 pacientes incluídos no estudo, 69% eram não diabéticos (Figura 5). Estes
dados estão de acordo com o estudo realizado por AKAB 2004, com 182 pacientes que relata
uma maior prevalência de ITU nos pacientes não diabéticos, que totalizam 68%.
Figura 5: Percentual de diabéticos em pacientes com ITU por Klebsiella pneumoniae
produtora de KPC.
A Figura 6 mostra a evolução dos 91 pacientes após a urocultura positiva e o início
do tratamento com antimicrobianos, 50% dos pacientes continuaram internados, 45%
75%
25%
Pressão arterial
Hipertenso Normotenso
31%
69%
Diabetes mellitus
Diabético Não Diabético
24
evoluíram a óbito e 5% receberam alta. Estes dados confirmam a gravidade dos quadros clínicos
dos pacientes estudados.
Figura 6: Evolução dos pacientes com diagnóstico de ITU por Klebsiella pneumoniae
produtoras de KPC.
Quanto ao uso de cateter vesical de demora, 26% dos pacientes com ITU à utilizaram
durante a internação (Figura 7). Dos 76 pacientes internados apenas 7 tiveram o diagnóstico
inicial de ITU, o restante apresentou infecção urinária no decorrer da internação. Durante a
internação, o paciente é submetido a diversas terapias, como as antimicrobianas e/ou as
invasivas. E estas, por sua vez, acabam agredindo a barreira natural da pele e mucosas,
aumentando o risco de infecções oportunistas. Segundo Nicolle (2014), as ITU hospitalares
estão relacionadas a procedimentos realizados durante a internação, sendo que 80% encontra-
se pertencendo ao uso de cateteres urinários de demora. Estima-se que de 15% a 25% dos
pacientes hospitalizados e 85% dos pacientes internados em terapia intensiva utilizam cateteres
urinários56. Os riscos a cada dia em adquirir infecção urinária é de 3% a 10%. Este fato
demonstra a importância de profissionais capacitados, materiais de qualidade e utilização de
sonda vesical de demora apenas quando houver necessidade56..
45%
50%
5%
Evolução
Óbito Internação Alta
25
Figura 7: Utilização de cateter vesical de demora nos pacientes com ITU por Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC.
A Figura 8 demonstra a distribuição mensal da ocorrência de ITU por Klebsiella
pneumoniae produtoras KPC. Em 2015 foram confirmados 37 casos, o que representa 40,37%
do total no período. O mês de maior incidência foi o mês maio, representando 13,18% do total,
seguido de abril e julho com 8,70%, março com 5,40% e por último agosto com 4,39%. Em
2016 foram registrados 54 casos (59,63%) que ocorreram nos meses de junho (16,48%), março
(13,18%), abril e maio (10,98%), julho (5,49%) e janeiro (2,19%).
Figura 8: Distribuição temporal dos casos de ITU por Klebsiella pneumoniae produtoras de
KPC
25%
75%
Cateter vesical de demora
Sim Não
5,40%8,70%
13,18%
8,70%4,39%
2,19%
13,18%10,98%10,98%
16,48%5,49%
mar/15
mai/15
jul/15
set/15
nov/15
jan/16
mar/16
mai/16
jul/16
Distribuição temporal
26
5.3 Determinação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos
Na figura 9 a resistência aos β-lactâmicos ceftriaxona e piperacilina/tazobactam foi
observada em todos os 91 isolados. Com relação à resistência aos outros antimicrobianos desta
classe, os resultados foram variáveis, sendo observadas diferentes porcentagens de resistência.
Entre os 90 isolados testados para meropenem, 98,88% apresentaram resistência. Todos os 90
isolados testados para ertapenem apresentaram resistência. No que se diz respeito aos isolados
testados para imipenem, 97,29% dos 74 isolados apresentaram resistência. E, por último, o
único isolado testado para cefepime apresentou resistência. A alta resistência aos β-lactâmicos
já é esperada, pois a enzima KPC hidrolisa todos os β-lactâmicos, incluindo as penicilinas,
cefalosporinas e monobactâmicos57.
Em relação aos aminoglicosídeos, foram observadas diferentes porcentagens de
resistência entre os isolados. A resistência à gentamicina foi observada em 85% dos isolados, e
a resistência à amicacina em 3,3%. No estudo de SHENG e colaboradores (2012), das 11
Klebsiella pneumoniae resistentes aos carbapenêmicos, aproximadamente 64% eram resistentes
à amicacina. A alta resistência aos aminoglicosídeos é muito preocupante, visto que a
ANVISA, no ano de 2013, preconizou entre as opções para o tratamento das infecções graves
por Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC, como infecções urinárias associadas à sepse,
ou ainda, infecções de corrente sanguínea e pneumonia associada à ventilação mecânica, o uso
de aminoglicosídeos em terapia combinada com a polimixina (B ou E), com ou sem
carbapenêmico (imipenem ou meropenem).
Em relação às quinolonas, observou-se que 3% demonstraram resistência à
ciprofloxacina e 100% dos 23 isolados testados demonstraram resistência à norfloxacina. No
estudo de SHENG e colaboradores (2012) observou-se, diferente dos nossos resultados, que
73% das 11 Klebsiella pneumoniae resistentes aos carbapenêmicos, eram resistentes à
ciprofloxacina.
27
Quanto à amoxicilina/clavulanato, foi observado resistência em todos os isolados. Em
relação a resistência aos outros antimicrobianos, dos 68 isolados testados para ampicilina,
98,5% demonstrou resistência. No que se diz respeito aos isolados testados para tigeciclina,
88,8% dos 90 isolados apresentaram resistência. Dos 69 isolados testados para colistina, 72%
demonstraram resistência. E, por fim, os 72 isolados testados para polimixina B, 29%
apresentaram resistência.
Um estudo realizado por Pereira e colaboradores (2014), também encontrou
resistência à polimixina B e à tigeciclina. Dentre as 113 Klebsiella pneumoniae estudadas, 9,7%
apresentaram resistência à polimixina B e 38,1% à tigeciclina. A resistência a esses dois
antimicrobianos é muito preocupante, visto que estes tem sido as últimas opções de terapia
antimicrobiana para tratar pacientes com infecções graves por Klebsiella pneumoniae
resistentes aos carbapenêmicos. Esse fato ratifica a importância do uso racional dos
antimicrobianos, preservando assim, sua utilidade.
Figura 9: Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos dos pacientes acometidos por ITU.
5.4 Tipagem molecular por PFGE
A figura 10 mostra o dendograma construído após a análise dos perfis de PFGE das
91 Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC incluídas neste estudo. Observa-se uma grande
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Resistente
Intermediário
Sensível
28
diversidade de perfis de PFGE, apresentando similaridade genética entre 23.1 e 100%.
Sabe-se que a maior parte das ITU são causadas por bactérias que compõe a
microbiota do paciente, ou seja, tem origem endógena62, o que explica a diversidade de cepas
de Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC observada neste estudo. Além disso, a maioria
dos pacientes são originados de outros municípios, e podem ter sido colonizados por Klebsiella
pneumoniae produtoras de KPC durante internações em outras instituições de assistência à
saúde. Apenas dois pacientes apresentaram cepas idênticas (100% de similaridade), o que
sugere transmissão horizontal.
29
Figura 10: Diversidade genética mostrada no dendrograma gerado por PFGE dos isolados
selecionados da coleção de cultura do Laboratório da Faculdade de Medicina de São José do
Rio Preto no período de 2015 a 2016.
72.7
45.9
31.3
83.7
74.5
64.3
60.3
54.2
91.4
79.4
69.5
94.1
56.6
52.5
63.2
75.0
57.4
49.5
88.2
64.6
76.5
93.3
81.9
73.2
80.0
66.2
57.8
73.3
62.1
73.3
85.7
78.0
86.7
83.8
80.6
96.3
78.6
74.0
69.0
93.3
84.4
76.9
93.2
71.5
65.2
58.4
54.2
48.0
62.9
48.1
40.7
73.3
78.6
66.1
81.5
78.7
63.9
76.9
77.3
68.0
60.6
54.5
49.2
42.5
41.4
39.6
63.2
64.0
54.8
74.3
59.0
50.8
76.9
91.7
85.2
75.6
93.3
69.7
80.0
91.7
84.6
74.0
70.0
63.4
49.8
37.7
29.7
50.0
23.1
PFGE
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
PFGE
0 20
40
60
80
10
0
Kp59
Kp60
Kp55
Kp 44
Kp 07
Kp 11
Kp 10
Kp62
Kp 04
Kp 38
Kp64
Kp89
Kp63
Kp86
Kp57
Kp58
Kp61
Kp91
Kp 50
Kp 52
Kp 02
Kp 14
Kp54
Kp 20
Kp 22
Kp 03
Kp 06
Kp 01
Kp 25
Kp 29
Kp 13
Kp90
Kp 23
Kp 21
Kp 24
Kp 31
Kp 33
Kp 32
Kp 36
Kp 37
Kp 34
Kp 35
Kp 26
Kp 27
Kp 16
Kp 17
Kp 15
Kp 19
Kp 05
Kp 09
Kp 08
Kp 28
Kp 30
Kp88
Kp 47
Kp76
Kp 42
Kp 43
Kp72
Kp74
Kp 39
Kp 40
Kp 48
Kp 45
Kp 49
Kp 46
Kp69
Kp 18
Kp 51
Kp56
Kp79
Kp65
Kp77
Kp71
Kp78
Kp 12
Kp73
Kp87
Kp66
Kp68
Kp53
Kp67
Kp75
Kp83
Kp85
Kp80
Kp81
Kp82
Kp84
Kp 41
Kp70
30
6.0 CONCLUSÕES
Em relação as ITU por Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC, conclui-se que:
A infecção do trato urinário por Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC,
acomete a população mais idosa e com predomínio do sexo masculino.
Hipertensão arterial e diabetes mellitus não são comorbidades comuns nos
pacientes acometidos por ITU causada por Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC.
A utilização da sonda vesical de demora é um procedimento comum entre os
pacientes acometidos por ITU causada por Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC.
As ITU estudadas são causadas por linhagens de Klebsiella pneumoniae
produtoras de KPC geneticamente distintas, provavelmente originadas da própria microbiota
do paciente.
31
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