Ana Paula Mora Produção de lacase para potencial aplicação ...path.web.ua.pt/file/Ana tavares tese.pdf · crescimento celular. Realizaram-se alguns estudos para conhecer a natureza

Universidade de Aveiro 2006

Departamento de Química

Ana Paula Mora Tavares

Produção de lacase para potencial aplicação como oxidante na indústria papeleira

tese apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em Engenharia Química, realizada sob a orientação científica da Dra. Ana Maria Barreto Rebelo Xavier, Professora Auxiliar do Departamento de Química da Universidade de Aveiro e do Professor Dr. João Manuel da Costa Araúo Pereira Coutinho, Professor Associado do Departamento de Química da Universidade de Aveiro

Apoio financeiro da FCT e do FSE no âmbito do III Quadro Comunitário de Apoio

o júri

presidente Prof. Doutor Fernando Manuel Bico Marques professor catedrático do Departamento de Engenharia Cerâmica e Vidro da Universidade de Aveiro

Prof. Doutor José Joaquim C. Cruz Pinto professor catedrático do Departamento de Química da Universidade de Aveiro

Profª. Doutora Maria Ascensão Carvalho Fernandes de Miranda Reis professora associada do Departamento de Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa

Prof. Doutor Dmitry Victorovich Evtuguin professor associado do Departamento de Química da Universidade de Aveiro

Prof. Doutor João Manuel da Costa Pereira Coutinho professor associado do Departamento de Química da Universidade de Aveiro

Profª. Doutora Maria Alice Zarur Coelho professora adjunta do Departamento Engenharia Bioquímica da Universidade Federal do Rio de Janeiro

Profª. Doutora Ana Maria Rebelo Barreto Xavier professora auxiliar do Departamento de Química da Universidade de Aveiro

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agradecimentos

À Professora Doutora Ana M.R.B. Xavier agradeço pela orientação de todo este trabalho, pelo seu apoio, pela sua confiança, pela convivência e pela amizade de todos estes anos. Ao Professor Doutor João A.P. Coutinho agradeço pela orientação deste trabalho, pelo seu apoio, pela sua confiança. À Professora Doutora Maria Alice Zarur Coelho agradeço pela orientação na realização da parte experimental de produção de lacase e de biopolímeros assim como a sua orientação na parte de modelação matemática dos resultados da optimização da produção da lacase e pela sua amizade. Ao Professor Doutor Dmitry Evtuguin agradeço pela sua orientação durante o trabalho realizado com o branqueamento da pasta de papel, pela realização das análises de GPC. Ao Doutor José Gamelas agradeço pelo seu apoio na parte experimental com a pasta de papel, pela realização das análises de voltametria cíclica, de RMN e de espectroscopia UV/Vis, além da sua amizade durante este trabalho. Ao Doutor Armindo Gaspar agradeço pelo seu apoio na parte experimental com a pasta de papel. À Professora Doutora Ana Barro-Timmons agradeço pela sua ajuda durante a realização do trabalho com os biopolímeros, pelas análises de ICP, termogravimétrica, de FTIR e análise elementar. Ao Professor Doutor José A. Lopes da Silva agradeço pela sua ajuda durante a realização do trabalho com os biopolímeros, pela análise de reologia e de açúcares neutros. Aos colegas e amigos de laboratório Margarida, Marta,Sofia, Daniel, Ana Sofia, Priscila, Alexandre, Juliana, Elisabete e Alzira pela amizade e pela ajuda durante a parte experimental desta tese. À PORTUCEL, Cacia, Portugal agradeço pela disponibilização da pasta de papel utilizada neste trabalho. À Universidade de Aveiro pelo apoio financeiro através da concessão da bolsa de Doutoramento concedida durante o primeiro ano de Doutoramento. À Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) pelo apoio financeiro através da concessão da bolsa de Doutoramento e pelo apoio financeiro dos deslocamentos em congressos Internacionais. Finalmente, desejo agradecer ao meu marido que sempre me apoiou durante a realização desta tese e aos meus pais e irmã que sempre me incentivaram na concretização deste trabalho.

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palavras-chave

lacase, Trametes versicolor, modelação matemática, planeamento de experiências, biobranqueamento da pasta kraft, polioxometalatos, exopolissacarídeo.

resumo

A biocatálise enzimática apresenta um grande potencial para o branqueamento da pasta, como um tratamento alternativo ao convencional.Proporciona importantes benefícios ambientais além de introduzir propriedades únicas às fibras do papel. A chave para o sucesso na aplicação industrial está na identificação de novas enzimas e na pesquisa das condições específicas de trabalho.

Para este trabalho escolheu-se o fungo Trametes versicolor conhecido como fungo da podridão branca da madeira, que é capaz de produzir enzimas oxidativas, nomeadamente a enzima lacase. A primeira parte do trabalhoenvolveu a optimização da produção da lacase em matraz e em bioreactor e a modelação matemática dos resultados experimentais obtidos. Para a optimização da produção da lacase em matraz, diferentes indutores foram utilizados: cobre, 2.5-xilidina e uma mistura fenólica. Estudou-se também a situação de limitação de carbono. Para a fermentação em bioreactor fez-se umplaneamento factorial de experiências que consistiu de dois níveis (máximo e mínimo) e três factores: concentração de glucose, agitação e controlo do pHdo meio de cultura.

A segunda parte do trabalho envolveu a aplicação da lacase no branqueamento da pasta kraft para o fabrico de papel. Neste estudo, diferentes tipos de polioxometalatos (POMs) foram testados, juntamente com a lacase, como mediadores da deslenhificação da pasta kraft não branqueada. As condições do branqueamento estudadas foram a temperatura de reacçãoem um único estágio de branqueamento e o branqueamento em estágiosalternados: Este tipo de branqueamento permitiu uma deslenhificaçãosignificativa da pasta de papel com uma redução no índice kappa de cerca de 50% para o POM SiW11MnIII(H2O)O39

5-, após 5 estágios de branqueamento e,para o SiW11VVO40

5- após três estágios de branqueamento. Os espectros de UV-Vis e de RMN mostraram que estes dois POMs se mantiveram estáveisdurante o processo de branqueamento da pasta de papel.

Para além de produzir a lacase, o fungo T. versicolor também é conhecido como produtor de exopolissacarídeos (EPSs). A terceira parte deste trabalho constituiu na produção e optimização de um EPS. A optimização da produção do EPS foi feita através da selecção de cinco diferentes meios de cultura e doplaneamento factorial de experiências 22 com ponto central com o meio seleccionado. As variáveis estudadas no planeamento foram a concentraçãoinicial de glucose e o pH do meio de cultura. A concentração inicial de glucosefoi o principal factor para a optimização da produção do EPS e para ocrescimento celular.

Realizaram-se alguns estudos para conhecer a natureza do EPS queenvolveram análise elementar, análise dos iões por ICP, análise estrutural porFTIR, determinação do peso molecular por GPC, análise termogravimétrica,análise dos açúcares neutros e dos ácidos hexourónicos.

key words

laccase, Trametes versicolor, mathematical modelling, factorial design, kraft pulp biobleachig, polyoxometalates, exopolyssacharide.

abstract

Enzymatic biocatalyst has a significant potential for improving pulp biobleaching as an alternative treatment to conventional. It allows for the development of environmentally benign processes and may introduce unique properties into the paper fibre. The challenge for the success on the industrial application is the identification of new enzymes and the development of specific and optimized working conditions.

On this work the fungus Trametes versicolor, known as white rot fungus, which produces oxidative enzymes namely laccase was used. The first part ofthe work addresses the optimization of laccase production in Erlenmeyer andbioreactor and the mathematical modelling of the experimental results. To optimise the laccase production in Erlenmeyer different inducers were tested:copper, 2.5-xylidine and a phenolic mixture. The situation of carbon limitationwas also studied. For bioreactor fermentation a factorial design with two levels(maximum and minimum) and three factors: initial glucose concentration,agitation and medium pH was used.

The second part of the work involved the application of laccase on kraftpulp biobleaching. In this study different polyoxometalates (POMs) were tested, with laccase, as mediators on kraft pulp bleaching. The conditions of bleachingwere reaction temperature of the single bleaching stage and the multi-stage bleaching. The alternative treatment in a multi-stage process allowed a sustainable eucalypt kraft pulp delignification with more than 50% of kappa number reduction to POM SiW11MnIII(H2O)O39

5-, after five stages of bleaching, and to the POM o SiW11VVO40

5- after three stages of bleaching. The UV/VIS spectrum and RMN showed that these two POMs maintain stable during the biobleaching process of pulp paper.

In addition to the production of laccase the fungus T. versicolor is also known as exopolysaccharides (EPSs) producer. The third part of this workdeals with the optimization of the EPS production. This was optimized by a selection of five culture media and by a 22 factorial design with a central point of selected medium. The factors of factorial design were initial glucoseconcentration and initial media pH. The initial glucose concentration was found to be the most important factor in EPS production and also in cell growth.

Some studies were carried in order to characterize the EPS usingelementary analysis, ions analysis by ICP, structural analysis by FTIR, analysis of molecular weight by GPC, thermal gravimetric analysis, neutral sugars and hexouronic acids.

- v -

Índice Geral

Introdução.............................................................................................................. xx

Capítulo 1 - Revisão bibliográfica........................................................................ 1

1.1 A indústria de pasta de papel................................................................. 1

1.1.1 Composição da madeira.......................................................... 3

1.1.1.1 Celulose.................................................................... 4

1.1.1.2 Hemiceluloses ........................................................ 5

1.1.1.3 Lenhina .................................................................... 6

1.1.2 O processo de fabricação da pasta de papel............................ 11

1.1.3 Branqueamento da pasta kraft................................................. 12

1.1.3.1 O papel da lacase no branqueamento da pasta......... 14

1.1.3.2 Uso de mediadores .................................................. 15

1.1.3.2.1 Os polioxometalatos.................................. 18

1.2 A natureza dos fungos........................................................................... 22

1.2.1 Fungos da podridão branca da madeira................................... 24

1.2.2 O sistema lenhinolítico dos fungos da podridão branca da

madeira................................................................................. 24

1.2.3 O fungo Trametes versicolor.................................................. 26

1.3 Enzimas lenhinolíticas........................................................................... 27

1.3.1 Lenhina Peroxidase (LiP) ....................................................... 28

1.3.2 Manganês Peroxidades (MnP) ............................................... 29

1.3.3 Lacases .................................................................................. 29

1.3.3.1 Caracterização estrutural da lacase.......................... 29

1.3.3.2 Mecanismos de catálise da lacase........................... 31

1.3.3.3 Aplicações da lacase................................................. 32

1.3.3.4 Produção da lacase................................................... 33

1.3.4 Produção industrial de enzimas............................................... 36

1.4 Polissacarídeos produzidos por fungos.................................................. 37

1.4.1 Polissacarídeos....................................................................... 38

1.4.2 Produção de Exopolissacarídeos............................................. 42

1.4.2.1 Processo de recuperação de exopolissacarídeos

vi

de origem microbiana .............................................. 44

1.4.3 Compostos comercializados.................................................... 46

1.5 Planeamento de experiências e modelação matemática........................ 48

1.5.1 Planeamento factorial a dois níveis ....................................... 48

1.5.1.1 Cálculo dos principais efeitos e interacções............. 49

1.5.1.2 Metodologia de superfície de resposta.................... 50

1.5.2 Modelação matemática........................................................... 51

1.5.2.1 Cinética de crescimento microbiano........................ 52

1.5.2.2 Modelos para a formação do produto – A taxa

específica de produção............................................. 55

Capítulo 2 - Materiais e Métodos......................................................................... 57

2.1 Microorganismo e condições de manutenção........................................ 57

2.2 Preparação do inóculo para culturas líquidas........................................ 58

2.3 Fermentações com Trametes versicolor para a produção enzimática... 59

2.3.1 Meio de produção enzimática................................................. 59

2.3.2 Fermentações em matraz........................................................ 60

2.3.2.1 Estudo do efeito da concentração inicial de

glucose.................................................................. 60

2.3.2.2 Estudo do efeito da adição de cobre..................... 60

2.3.2.3 Fermentações com diferentes indutores................ 60

2.3.2.4 Fermentações com limitação por carbono ............61

2.3.2.5 Testes de estabilidade da lacase............................ 61

2.3.3 Fermentações em Bioreactor.................................................. 63

2.3.3.1 Planeamento factorial a dois níveis...................... 64

2.3.3.2 Modelação matemática da produção de

lacase em bioreactor............................................ 66

2.3.4 Métodos analíticos................................................................. 69

2.3.4.1 Determinação do consumo de substrato pelo

método DNS......................................................... 69

2.3.4.2 Determinação da actividade de lacase.................. 69

2.3.4.3 Determinação da actividade de manganês

vii

peroxidase (MnP) ................................................. 70

2.3.4.4 Determinação da actividade celulásica total......... 70

2.3.4.5 Determinação da proteína total pelo método

de Folin-Lowry..................................................... 71

2.3.4.6 Determinação da biomassa................................... 71

2.3.4.7 Determinação do pH............................................ 72

2.4 Aplicação da lacase na pasta kraft......................................................... 72

2.4.1 Preparação da pasta kraft........................................................ 72

2.4.2 Produção da lacase ................................................................. 72

2.4.3 Mediadores utilizados............................................................. 73

2.4.4 Branqueamento da pasta kraft em reactor............................... 73

2.4.5 Extracção alcalina da pasta..................................................... 75

2.4.6 Métodos analíticos.................................................................. 75

2.4.6.1 Determinação do índice kappa.................................... 75

2.4.6.2 Determinação da viscosidade intrínseca..................... 77

2.4.6.3 Determinação do estado de oxidação dos POMs por

espectroscopia no visível............................................ 77

2.4.6.4 Análise de espectroscopia de ressonância magnética

nuclear – RMN.......................................................... 78

2.4.6.5 Análise de voltametria cíclica................................... 79

2.5 Fermentações com Trametes versicolor para produção de

Exopolissacarídeo.................................................................................. 79

2.5.1 Meios de produção.................................................................. 79

2.5.2 Optimização do meio de cultura............................................. 80

2.5.3 Extracção do EPS do meio de cultura..................................... 82

2.5.4 Análise reológica do meio de cultura..................................... 82

2.5.5 Métodos analíticos para a caracterização do EPS................... 82

2.5.5.1 Espectroscopia de Infravermelho (FTIR)................. 82

2.5.5.2 Análise termogravimétrica....................................... 83

2.5.5.3 Análise dos açúcares neutros ................................... 84

viii

2.5.5.4 Determinação do peso molecular............................. 84

2.5.5.5 Determinação dos ácidos urónicos........................... 84

2.5.5.6 Análise elementar do EPS........................................ 85

Capítulo 3 - Resultados e discussão..................................................................... 86

3.1 Produção de lacase em matraz............................................................... 86

3.1.1 Efeito da concentração inicial de glucose............................... 86

3.1.2 Efeito da adição de cobre........................................................ 90

3.1.3 Produção de lacase com diferentes indutores......................... 92

3.1.4 Efeito da limitação por carbono com diferentes indutores......95

3.2 Produção de lacase em fermentador...................................................... 98

3.2.1 Optimização da produção da lacase por planeamento de

experiências.......................................................................... 98

3.2.2 Modelação matemática da produção de lacase em

bioreactor.............................................................................. 106

3.3 Aplicação da lacase para o biobranqueamento da pasta de papel.......... 112

3.3.1 Comparação dos mediadores da lacase para o

branqueamento da pasta.......................................................... 112

3.3.1.1 Ensaios de biobranqueamento da pasta.................... 112

3.3.1.2 Estudo de oxidação dos POMs pela lacase.............. 119

3.3.2 Branqueamento da pasta kraft com SiW11MnIII e lacase

SiW11VV e lacase num sistema de multi-estágios ............... 123

3.4 Produção de exopolissacarídeo (EPS) por Trametes versicolor............ 129

3.4.1 Selecção do meio de produção do EPS................................... 129

3.4.2 Optimização do meio de cultura YM para a produção de

EPS....................................................................................... 132

3.4.3 Análises do EPS...................................................................... 138

3.4.3.1 Análise dos açúcares neutros.................................... 138

3.4.3.2 Análise Termogravimétrica...................................... 139

3.4.3.3 Análise de cromatografia de permeação em gel

(GPC) ....................................................................... 140

3.4.3.4 Análise reológica do meio de cultura....................... 141

ix

3.4.3.5 Análise do EPS produzido no meio YM por

Espectrometria no Infravermelho com Transformada

de Fourier (FTIR) .................................................... 145

3.4.3.6 Análise do EPS por Espectrometria de Emissão

de Plasma Induzido (ICP) e por Análise elementar.. 145

Capítulo 4 – Conclusões........................................................................................ 147

Bibliografia............................................................................................................. 151

Anexos..................................................................................................................... 164

Lista de publicações............................................................................................... 168

x

LISTA DE ABREVIATURAS

ABTS Ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotriazolina-6-sulfónico)

ANOVA Análise de variância

BSA albumina de soro bovino

CBQ celobiose:quinona oxidoreductase

CDH celobiose dehidrogenase

CED cupri – etilenodiamina

DMCA N,N-dimetilacetamida

DNS ácido 3,5-dinitrosalicílico

E potencial redox efectivo

Epc potencial de pico catódico

Epa potencial de pico anódico

ENH eléctrodo normal de hidrogénio

EPR ressonância paramagnética electrónica

EPS exopolissacarídeo

FE fibrilas elementares

FTIR espectroscopia de infravermelho com transformada de

Fourier

GlOx glioxalacto oxidase

GPC cromatografia de permeação em gel

GPY meio de glucose, peptona e extracto de levedura

IPA isopolianiões

HBT 1-hidroxilbenzotriazol

HPA heteropolianiões

K constante de decaimento exponencial

Ks constante de saturação

K1 taxa de síntese da lacase

K2 taxa de decaimento da lacase

xi

L razão entre a taxa específica de crescimento no início da fase

de desaceleração e a taxa específica de crescimento na fase

exponencial (factor de sobrevivência)

LiP lenhina peroxidase

MCM meio completo para fungos

MDT meio definido para Trametes

MF mistura fenólica

MnP manganês peroxidase

MSR metodologia de superfícies de resposta

P produto

POM polioxometalato

RMN ressonância magnética nuclear

s segundo

S substrato

SLM sistema lacase-mediador

t tempo

TaK meio Tien and Kirk

TEMPO N-oxil-2,2,6,6-tetrametilpiperidina

UV/VIS espectrofotómetro de ultravioleta/visível

VAO álcool veratrílico oxidase

X biomassa

YM meio extracto de levedura e extracto de malte

α constante associada ao crescimento da biomassa

β constante não associada ao crescimento da biomassa

µ taxa específica de crescimento

ε coeficiente de extinção molar

ν velocidade de varrimento

λ comprimento de onda

xii

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1.1 - Estrutura de alguns mediadores orgânicos da lacase........................... 16

Tabela 1.2 – Formas diferencial e integrada de várias equações de

crescimentoa ....................................................................................... 53

Tabela 2.1 – Composição do meio de cultura Tien & Kirk..................................... 58

Tabela 2.2 – Composição do meio de cultura MDT................................................ 59

Tabela 2.3 – Condições de cultura para a produção de lacase por Trametes

versicolor em Erlenmeyer................................................................... 62

Tabela 2.4 - Factores e níveis estudados no planeamento factorial 23.....................65

Tabela 2.5 – Matriz do planeamento de experiências 23......................................... 66

Tabela 2.6 - Mediadores utilizados no branqueamento da pasta kraft.................... 73

Tabela 2.7 – Cor e comprimento de onda do estado reduzido e do estado

oxidado dos POMs ............................................................................ 78

Tabela 2.8 – Composição dos meios de cultura usados na produção

do EPS ............................................................................................... 80

Tabela 2.9 - Factores e níveis estudados no planeamento factorial 22

com ponto central............................................................................... 81

Tabela 2.10 – Matriz do primeiro planeamento de experiências 22 com ponto

central............................................................................................... 81

Tabela 2.11 – Matriz do segundo planeamento de experiências 22 com ponto

central .............................................................................................82

Tabela 3.1- Produtividade de lacase e aumento da produtividade de lacase

para os indutores cobre, xilidina e mistura fenólica em

condições de limitação por carbono e sem limitação por

carbono.................................................................................................. 97

Tabela 3.2 – Planeamento de experiências 23 e repostas da produção da

lacase por Trametes versicolor........................................................... 99

Tabela 3.3 – Efeitos estimados e teste ANOVA para a produção de lacase

por Trametes versicolor através do planeamento de

experiências 23 ................................................................................... 100

Tabela 3.4 – Parâmetros cinéticos da fermentação de Trametes

xiii

versicolor em matraz.......................................................................... 107

Tabela 3.5 – Parâmetros para a produção de lacase em bioreactor por

Trametes versicolor........................................................................... 112

Tabela 3.6 – Branqueamento da pasta kraft catalisado por lacase (L) na

presença de diferentes mediadores a 45ºC......................................... 114

Tabela 3.7 – Branqueamento da pasta kraft catalisado por lacase (L) na

presença de diferentes mediadores a 60 ºC...................................... 116

Tabela 3.8 – Oxidação dos polioxometalatos pela lacase........................................ 121

Tabela 3.9 – Branqueamento da pasta kraft em estágios sequenciais

catalisado por SiW11MnIII e lacase ................................................. 124

Tabela 3.10 - Branqueamento da pasta kraft em estágios sequenciais

catalisado por SiW11VV e lacase...................................................... 127

Tabela 3.11 - Resultados do cultivo de Trametes versicolor nos meios de

cultura TaK, MCM e YM................................................................ 130

Tabela 3.12 – Planeamento de experiências 22 e repostas da produção de

EPS por Trametes versicolor........................................................... 135

Tabela 3.13 - Resultados para o segundo planeamento de experiências 22

e repostas da produção de EPS por Trametes versicolor................. 135

Tabela 3.14 - Efeitos individuais calculados e ANOVA para o

planeamento de experiências 22 ...................................................... 137

Tabela 3.15 - Açúcares neutros presentes no EPS produzido por

Trametes versicolor nos meios YM, MCM e TaK.......................... 139

Tabela 3.16 - Ácidos hexourónicos presentes no EPS produzido por


Tabela 3.17 – Teor em iões e análise elementar do EPS produzido por


xiv

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.1 – Representação da cadeia principal da estrutura de celulose

(Higuchi, 1993). .............................................................................. 4

Figura 1.2 – Diagrama estrutural da celulose mostrando as ligações β-(1,4) dos

resíduos de D-glucose e as ligações de hidrogénio inter e intra

molecular (a) e representação das microfibrilas da celulose (b)

(Adaptado de Voet & Voet, 1990)..................................................... 5

Figura 1.3 – Álcoois percursores da lenhina (Adaptado de Biermann, 1996)......... 7

Figura 1.4- Estrutura de uma lenhina resinosa (Sipilä et al., 2005)........................ 8

Figura 1.5 - Principais subestruturas na lenhina; β-O-4’ (a); β-O-4’ degradada

(b); α-O-4’ acíclica (c); β-5’ cíclica e α-O-4’ (d); α-2’/6’ e β-2’6’

(e); 5,5’ (f); 4-O-5’(g); β-1’ (h); β-β’ (i); éster α-HC-

hidroxicinamato de arilglicerilo (com ligação α-4) (j); éster γ-HC-

hidroxicinamato de arilglicerilo (com ligação γ-4) (k)

(Sjöström, 1981). .................................................................................. 10

Figura 1.6 - Representação esquemática da degradação da lenhina por

lacase num sistema com mediador (Adaptado de Bourbonnais

et al., 1998). ....................................................................................... 17

Figura 1.7– Representação bola-bastão e poliedro da unidade fundamental

de MO6 (Fernandez, 2003). ................................................................ 19

Figura 1.8 – Modelos poliédricos representam as três possíveis uniões entre

duas unidades octaédricas MO6. A) união de vértice, B)

união de aresta e C) união de face (Fernandez, 2003)........................ 19

Figura 1.9 - Representação poliédrica da estrutura do anião de Keggin. O

centro externo M12O40 encapsula a unidade interna,

representada pelo tetraedro XO4n- (Jeannin, 1998)............................ 20

Figura 1.10 - Ciclos redox do POM na reacção catalítica da oxidação

da lenhina (Balakshin et al., 2001).................................................... 21

Figura 1.11 – Ciclos redox no sistema catalítico de oxidação da

lenhina com POM-lacase-O2 (Balakshin et al., 2001)........................ 22

Figura 1.12 - Esquema da função desempenhada pelas enzimas degradadoras

xv

de materiais lenhinocelulósicos dos basidiomicetos (Adaptado de

Rajarathnam et al.,1992). ................................................................. 25

Figura 1.13 – O fungo Trametes versicolor na forma de “cauda de perú”.............. 26

Figura 1.14 - Diagrama de da estrutura da lacase de Trametes versicolor.

Os três domínios (T1, T2 e T3) estão mostrados a cores

diferentes. Os átomos de cobre são as esferas azuis e a porção

de hidrato de carbono são os modelos em bola-e-bastão. A

parte cinzenta é o N-terminal e a verde o C-

terminal. O sítio T1 é a esfera isolada. (Piontek et al., 2002)............ 30

Figura 1.15 – Esquema de reacção da lacase com um substrato

(Adaptado de Call & Muck, 1997). ................................................. 31

Figura 1.16 – Uma reacção típica da lacase com um difenol

(Adapado de Thurston, 1994). ........................................................ 32

Figura 1.17 – Representação de alguns monómeros de polissacarídeos................. 39

Figura 1.18- Representação dos monómeros de α e de β D- glucose..................... 39

Figura 1.19 – Diagrama molecular de um D-glucano de origem fúngica.

Representação das ligações glicosídicas (1→4) com

ramificações (1→6). ....................................................................... 39

Figura 1.20 - Conformação de tripla hélice da cadeia de β-(1→3)-D-glucanos..... 41

Figura 1.21 – Opções de recuperação e purificação de polissacaríeos de

Trametes versicolor (Adaptado de Cui & Chisti, 2003)..................... 45

Figura 1.22 – PSP comercializado pela JHS Natural Products............................. 47

Figura 1.23 - VPS comercializado pela JHS Natural Products............................... 47

Figura 1.24 – Vários perfis cinéticos de crescimento: (A) exponencial; (B)

logístico; (C) linear; (D) rápida-aceleração/lenta-

desaceleração (Adaptado de Mitchell et al., 2004).......................... 53

Figura 2.1 – Trametes versicolor após 7 dias de crescimento em placa de Petri... 57

Figura 2.2- Bioreactor usado na produção da lacase por Trametes versicolor....... 64

Figura 2.3 - Reactor e controlador de temperatura e de agitação usado no

branqueamento da pasta kraft de papel. ............................................. 74

Figura 2.4 - Condições do branqueamento da pasta kraft com os POMs SiW11MnIII

xvi

e SiW11VV através do sistema de multi-estágios............................. 75

Figura 2.5 - EPS obtido após precipitação por etanol, lavado e liofilizado......... 83

Figura 3.1 - Actividade de lacase produzida por Trametes versicolor em

diferentes concentrações iniciais de glucose. .................................... 87

Figura 3.2 - Consumo de glucose do meio de cultura durante a produção de

lacase por Trametes versicolor em diferentes

concentrações iniciais de glucose. .......................................................... 87

Figura 3.3 - Evolução da proteína total do meio de cultura durante a

produção de lacase por Trametes versicolor em diferentes

concentrações iniciais de glucose. ............................................... 88

Figura 3.4 – Evolução do pH do meio de cultura durante a produção de

lacase por Trametes versicolor em diferentes concentrações

iniciais de glucose............................................................................... 89

Figura 3.5 – Biomassa final de Trametes versicolor, máxima actividade de

lacase e pH do meio para diferentes concentrações

iniciais de glucose.............................................................................. 90

Figura 3.6 - Efeito da adição de cobre ao primeiro dia na produção da

lacase por Trametes versicolor............................................................. 92

Figura 3.7 – Efeito da adição de cobre ao terceiro dia na produção da

lacase por Trametes versicolor............................................................. 92

Figura 3.8 – (a) Produção de lacase por Trametes versicolor na presença de

cobre, xilidia (xil) e mistura fenólica (MF). (b)

amplificação da Figura 3.7 (a).............................................................. 94

Figura 3.9 - pH do meio de cultura (a) e consumo de glucose (b) durante a

produção de lacase por Trametes versicolor com

diferentes indutores. ............................................................................. 95

Figura 3.10 – Produção de lacase por Trametes versicolor na presença de

cobre e xilidia (xil) e de cobre, xilidia (xil) e mistura fenólica

(MF) com e sem limitação por carbono (LM)...................................... 96

Figura 3.11 - Diagrama de Pareto para o planeamento factorial 23......................... 101

Figura 3.12- Correlação entre os valores observados e os valores

previstos da produção da lacase....................................................... 101

xvii

Figura 3.13 – Superfícies de resposta para o planeamento de experiências 23........ 103

Figura 3.14 - Consumo de glucose e pH do meio durante a produção de

lacase por Trametes versicolor para uma concentração inicial

de glucose de 9 g/L e sem controlo de pH. .......................................... 104

Figura 3.15 - Dados experimentais e modelados para o cultivo de Trametes

versicolor em matraz com o meio com carbono.

(X) biomassa; (S) glucose. .................................................................. 109

Figura 3.16 - Dados experimentais e modelados para o cultivo de Trametes

versicolor em matraz com o meio com limitação

por carbono. (X) biomassa; (S) glucose.................................................. 109

Figura 3.17 - Dados experimentais e modelados para a produção de lacase

em bioreactor por Trametes versicolor em diferentes condições

de fermentação: F1, F2, F5 e F6 (meios com limitação por

carbono). Os dados experimentais estão representados por

símbolos e os modelados por linhas...................................................... 110

Figura 3.18 - Dados experimentais e modelados para a produção de lacase

em bioreactor por Trametes versicolor em diferentes condições

de fermentação: F3, F4, F7 e F8 (meios com carbono). Os dados

experimentais estão representados por símbolos e os modelados

por linhas............................................................................................... 110

Figura 3.19 – Dados experimentais e modelados para o consumo de glucose

e dados modelados para o crescimento da biomassa em

bioreactor por Trametes versicolor em diferentes condições de

fermentação: F3, F4, F7 e F8 (meios com glucose). Os dados

experimentais estão representados por símbolos e os

modelados por linhas. ........................................................................ 111

Figura 3.20 – Variação da viscosidade intrínseca e do índice kappa para o

sistema de branqueamento da pasta de papel a 45ºC com

diferentes mediadores. ....................................................................... 114

Figura 3.21 – Variação da viscosidade intrínseca e do índice kappa para o

sistema de branqueamento da pasta de papel a 60ºC com

diferentes mediadores. ....................................................................... 116

xviii

Figura 3.22 – Espectros de UV-Vis da solução de SiW11MnIII antes do

branqueamento (controlo), ao final do branqueamento a 45ºC

com lacase e a 60ºC com ou sem lacase: (a) controlo; (b)

L+SiW11MnIII 45ºC; (c) L+SiW11MnIII 60ºC; (d)

SiW11MnIII 60ºC. ............................................................................... 117

Figura 3.23 – Percentual de SiW11MnIII, SiW11VV e PW11MnIII no estado

oxidado ao final da reacção para as diferentes condições de

branqueamento. .................................................................................. 118

Figura 3.24 – Espectro UV-Vis para as soluções aquosas (3.0 mmol/L) de

SiW11MnII (A) e SiW11VIV (B) a pH=4.5 e com adição de

lacase (380 U/L) a temperatura ambiente e pressão

atmosférica (a). A: 4h (b); 8 h (c); 24 h (d); 50 h (e); B: 15

min. (b); 30 min. (c); 60 min. (d); 120 min. (e).................................. 119

Figura 3.25 – Figura 3.25 – Espectro de 51V RMN da solução original de

SiW11VV (a) da solução obtida após a reacção do SiW11VIV

(3.0mmol/l) com a lacase (b)..............................................................120

Figura 3.26 – Voltametria cíclica (v=10 mV/s) dos POMs SiW11VIV (a) e

SiW11MnII (b) ([POM]=1.0 mmol/l, pH=4.5,

25ºC)................................................................................................... 123

Figura 3.27 – Espectros de UV-VIS da solução de SiW11MnIII antes do

branqueamento (a); depois de um estágio de branqueamento

POM (b); depois de dois estágios de branqueamento POM-L

(c) seguido de uma semana de armazenamento do efluente (d);

depois de cinco estágios de

branqueamento POM-L-POM-L-POM (e)......................................... 126

Figura 3.28 – Espectros de UV-Vis da solução de SiW11VV antes do

branqueamento (a), depois de um estágio POM de

branqueamento (b), depois de dois estágios POM-L (45ºC) de

branqueamento (c), depois de dois estágios POM-L (60ºC) de

branqueamento (d), e depois de três estágios

POM-L(60ºC)-POM de branqueamento (e)....................................... 127

Figura 3.29 – Espectro de 51V RMN da solução obtida após dois estágios

xix

de branqueamento: SiW11V-L (60ºC)................................................ 128

Figura 3.30 – Crescimento da biomassa (a), consumo de açúcares redutores

(b), produção de EPS (c) durante a fermentação

de Trametes versicolor nos meios TaK, MCM e YM........................ 131

Figura 3.31 – Crescimento da biomassa (a), consumo de açúcares redutores

(b) e produção de EPS (c) durante o cultivo de Trametes

versicolor em diferentes concentrações

(g/L) de glucose (G) e valores de pH................................................. 133

Figura 3.32 – Superfície de resposta para o planeamento de experiências 22......... 134

Figura 3.33 – Superfície de resposta para a produção do EPS do segundo

planeamento de experiências 22 com ponto central......................... 138

Figura 3.34 – Análise termogravimétrica do EPS produzido nos meios

YM, MCM e TaK. ............................................................................. 140

Figura 3.35 – Análise de cromatografia de permeação em gel (GPC) do

EPS produzido nos meios YM, MCM e TaK..................................... 141

Figura 3.36 – Viscosidade aparente dos meios de culturas YM (a), MCM

(b) e TaK (c) durante a produção de EPS por Trametes

versicolor. ....................................................................................... 143

Figura 3.37 – Viscosidade aparente dos meios de cultura TaK, MCM e YM

durante a produção do EPS por Trametes versicolor......................... 144

Figura 3.38 - Concentração do EPS em relação à viscosidade aparente do

meio de cultura. .................................................................................144

Figura 3.39 - Espectro de absorção na região do Infravermelho do EPS

produzido por Trametes versicolor no meio YM............................. 145

xx

Introdução

INTRODUÇÃO

A indústria da pasta e do papel tem sofrido uma grande pressão no sentido do

desenvolvimento de novas tecnologias ambientalmente aceites e de poupança de energia.

Décadas de investigação na biodegradação de polímeros lenhinocelulósicos, no avanço das

ciências biológicas e nos estudos dos mecanismos das reacções enzimáticas, têm

conduzido ao sucesso da aplicação da biotecnologia no processamento das fibras de papel.

Hoje em dia, a biotecnologia pode oferecer à indústria da pasta e do papel grandes

vantagens que podem aumentar a eficiência dos processos já existentes, na manufactura da

pasta e do papel e aprimorar a qualidade do produto através de tecnologias ecológicas à

base de microorganismos e enzimas.

Devido à sua elevada especificidade, baixos custos de investimento e à sua origem

natural, as enzimas produzidas pelos fungos da podridão branca da madeira (entre eles o do

género Trametes) têm-se tornado uma potente ferramenta de pesquisa na caracterização de

fibras. Estas enzimas são biocatalisadores competitivos que podem reduzir ou substituir o

uso de compostos químicos agressivos, que tornam esta indústria poluente em muitas

operações do fabrico da pasta e do papel. Deste modo, estas enzimas constituem uma

alternativa ecológica potencial ao branqueamento químico da pasta de papel.

Aplicações de enzimas em grande escala, com um custo efectivo, podem ser

possíveis através do aumento da capacidade da produção das enzimas em grandes

quantidades. A aceitação destas tecnologias tem vindo a crescer com o conhecimento da

microbiologia, enzimologia, biologia molecular e com o aumento da experiência industrial.

Na indústria papeleira já há um número de aplicações biotecnológicas implementadas,

nomeadamente o biobranqueamento com enzimas hidrolíticas ou oxidativas (xilanase),

aumentos de controlo dos pitches com a lipase.

O cultivo de fungos do género Trametes também tem atraído um considerável

interesse comercial devido ao grande potencial na área terapêutica. Sabe-se que na

antiguidade muitos povos já utilizavam fungos com finalidade medicinal e as suas

aplicações são mantidas até hoje na medicina popular, principalmente nos países orientais.

Actualmente, a existência de substâncias terapeuticamente activas de fungos do género

Trametes tem sido comprovada, com efeitos como actividades antiinflamatória, antiviral,

antimicrobiana, antitumoral, entre outras. Dentre estas, a actividade antitumoral tem-se

xxi

Introdução

mostrado a mais interessante dado o número crecente de pesquisas envolvendo este tema e

a busca incessante do combate ao cancro. Uma das possibilidades de obtenção de

substâncias com potencialidades terapêuticas, é a partir da produção destes fungos em

cultura submersa. Neste tipo de processo, os fungos produzem um polissacarídeo

extracelular, ou exopolissacarídeo que devido às possibilidades de aplicação na indústria

farmacêutica, tem vindo a despertar grande interesse na sua produção.

Este trabalho teve como objectivo geral estudar o fungo da podridão branca da

madeira, Trametes (Coriolus) versicolor nos processos de degradação da lenhina, na

produção de enzimas lenhinolíticas e na produção de um exopolissacarídeo. Os objectivos

específicos foram: i) optimizar a produção da enzima lacase por Trametes versicolor em

matraz através da adição de diferentes indutores (Cu, xilidina e mistura fenólica) e do

emprego da limitação por carbono no meio de cultura; ii) Determinar os efeitos da

concentração inicial de glucose, pH inicial do meio de cultura e agitação na produção de

lacase po Trametes versicolor em bioreator, através do planejamento de experiências 23;

iii) Aplicação da lacase juntamente com diferentes mediadores no branqueamento da pasta

kraft de papel; iv) Optimizar a produção do exopolissacarído por Trametes versicolor

através da seleção de diferentes meios de cultura e posterior optimização do meio de

cultura seleccionando.

xxii

Revisão Bibliográfica

Capítulo 1 - Revisão bibliográfica

1.1 A indústria de pasta de papel

A indústria da pasta e do papel compreende uma grande e crescente porção da

economia mundial. A produção de pasta e de papel tem aumentado globalmente e irá

continuar a aumentar num futuro próximo, comprovado pelo aumento contínuo da

produção e do consumo de pasta e papel nas últimas décadas. Trata-se de uma indústria de

capital intensivo que acompanha de perto os desenvolvimentos tecnológicos, procurando

responder às exigências dos consumidores, nomeadamente através do cumprimento de

critérios ambientais.

A actividade principal desta indústria tem que ver com as várias etapas do processo

produtivo do papel iniciando-se na produção de madeira (a indústria papeleira portuguesa é

responsável pela gestão directa de cerca de 200.000 ha de floresta), a sua exploração e

transformação em pasta para papel, e a transformação de pasta em diferentes tipos de

papeis. Duas visões opostas se confrontam quanto ao futuro da indústria do papel. Os

defensores das novas tecnologias de informação e comunicação prevêem o declínio da

utilização do papel, enquanto a indústria do papel contrapõe com a experiência do passado,

afirmando que a procura de papel continuará a crescer a nível mundial, induzida em parte

pelas novas aplicações decorrentes do desenvolvimento da electrónica e das

telecomunicações (Gouveia, 2005).

Entre 1980 e 1997 a média anual de crescimento da produção de papel e cartão na

Europa foi de 3,3%, acompanhando o progresso económico. Estima-se que a procura de

papel, na Europa Ocidental, cresça a uma taxa estável de 2% ao ano até 2010. Em 1998, da

produção de papel na U.E., 52% refere-se a papel de uso gráfico, 38% a papel de

embalagem e os restantes 10% são papéis para usos sanitários e outras espécies (Gouveia,

2005).

Os maiores países produtores mundiais de pasta para papel localizam-se na

América do Norte (E.U.A. e Canadá), na Ásia (República Popular da China e Japão) e na

1


Europa. Os principais países produtores de pasta para papel de zonas económicas

emergentes são o Brasil (7ª posição mundial) e a Indonésia (9ª posição mundial). Portugal

ocupa a 16ª posição (Melo & Gouveia, 2005).

A população global utilizou aproximadamente 300 milhões de toneladas de papel

em 1996 (Akhtar et al. 1997), e as estimativas mostram que este número está a aumentar

gradualmente com o passar dos anos e que poderá chegar a 420 milhões de toneladas/ano

no ano de 2010, o que corresponde a uma taxa de crescimento de 2.4% ao ano (MBendi,

2005).

Em Portugal, a indústria papeleira é um sector estratégico para a economia

nacional, e tem apresentado um desempenho particularmente positivo ao longo dos últimos

20 anos. A produção de pasta ocupa a 6ª posição e a produção de papel a 12ª, em termos da

U.E., registando-se, entre 1992 e 1998, um crescimento médio anual de 1,2% e 2,9%,

respectivamente. Trata-se de uma indústria que exporta o grosso da sua produção para os

países da U.E., com predominância das pastas branqueadas de eucalipto ao sulfato, de

grande qualidade. No ano de 2000 a produção total de pasta para papel foi de 1 774 mil

toneladas (Gouveia, 2005) e em 2004 de 1 949 mil toneladas (CELPA, 2005).

A crescente consciência ambiental e a exigência de qualidade e segurança ao nível

dos produtos de origem florestal foram, numa fase inicial, os factores que levaram o sector

a actuar de uma forma ecologicamente responsável. Como em outras indústrias de grande

escala, a indústria papeleira exerce o seu próprio impacto no meio ambiente. Embora a

situação esteja a melhorar de ano para ano, as fábricas de pasta e de papel ainda libertam

compostos de enxofre no ar e descargas de efluentes que aumentam a eutrofização e que

têm efeitos tóxicos no biota em seu redor. Compostos organoclorados são formados

durante o branqueamento químico da pasta, e têm atraído muita atenção das indústrias e

dos investigadores.

Durante as últimas décadas, vários estudos têm sido desenvolvidos na área do

branqueamento do papel, de modo a desenvolver novas tecnologias sustentáveis para

minimizar a poluição ambiental, aumentar a qualidade da pasta e obter melhorias

económicas. A biotecnologia tem emergido com grande potencial tecnológico para a

modernização da indústria da pasta e do papel, com o uso de enzimas de origem

microbiológica. Devido aos grandes problemas ambientais, têm-se criado oportunidades no

2


ramo da biotecnologia para substituir o uso de cloro nas etapas do branqueamento da pasta,

reduzindo assim, uma parte dos compostos tóxicos, assim como a coloração escura dos

efluentes, que são gerados durante o processamento da pasta e do papel, minimizando o

impacto ambiental.

Actualmente, o objectivo geral da indústria da pasta e do papel é aumentar a

eficiência do processo, reduzindo os custos, desenvolvendo processos benignos ao meio

ambiente e aumentando a qualidade do produto. A biocatálise tem apresentado um grande

potencial para melhorar o processo tradicional de manufactura da pasta e do papel, além de

introduzir propriedades únicas à fibra do papel. As fibras podem ser modificadas por

enzimas ou microorganismos para melhorar os processos químicos ou mecânicos da

indústria papeleira. O grande desafio para o sucesso comercial é identificar enzimas,

microorganismos e as condições para desenvolver às suas aplicações. A actividade

catalítica e a estabilidade de potenciais enzimas podem ser melhoradas pelos novos

métodos que estão a ser desenvolvidos. Durante os últimos anos, o número de novas

aplicações de enzimas tem crescido e algumas têm alcançado aplicações comerciais ou

aproximações, onde se inclui o branqueamento com xilanase ou microorganismos,

deslenhificação directa com enzimas oxidativas, redução do consumo de energia com

celulases, redução de pitches com lipases entre outras (Viikari & Lantto, 2002).

O uso da enzima xilanase no branqueamento da pasta de papel foi o primeiro passo

essencial da aplicação da biotecnologia, demonstrando que as enzimas são um meio

tecnológico eficiente e que podem ser introduzidos nas plantas industriais já existentes,

sem grandes investimentos. Entretanto, verificou-se que o efeito da xilanase no

branqueamento é limitado e que se obtém somente uma redução de cerca de 25% dos

compostos químicos (Bourbonnais et al., 1997). Recentemente, outras enzimas como a

lipase e a glucanase também foram testadas em aplicações de grande escala (Messer et al.,

1997).

1.1.1 Composição da madeira

A madeira é um biocompósito natural constituído principalmente por fibras. É um

tecido biológico altamente organizado a nível celular e molecular. Sua composição

3


química apresenta cerca de 20-30% de lenhina, 65-80% de polissacarídeos (dos quais 40-

50% são celulose e 20-35% são hemiceluloses), de outras substâncias de baixo peso

molecular (1-3%) representadas essencialmente por extractáveis (compostos alifáticos:

alcanos, álcoois, ácidos gordos; terpenos e terpenóides: esteróis e compostos fenólicos:

ácidos fenólicos, flavonóides, taninos, lenhanos e estilbenos), de cinzas (menos que 1%) e

por compostos minerais presentes em pequenas quantidades (Sjöström, 1981). As

quantidades relativas dos componentes da madeira variam com o tipo de madeira e com o

tipo de parede celular. Geralmente classifica-se a madeira em dois tipos: as

gimnospérmicas ou madeira dura (hardwood), ex. folhosas e as angiospérmicas ou mole

(softwood), ex. resinosas.

1.1.1.1 Celulose

A celulose é um polissacarídeo, um homopolímero linear constituído por unidades

repetidas de celobiose β-D-glucopiranose, que são ligadas umas as outras por ligações

glicosídicas β-(1→4). As suas cadeias apresentam entre 4000 a 10000 unidades de D-

glucose anidra. A Figura 1.1 mostra a cadeia principal da celulose.

Figura 1.1 – Representação da cadeia principal da estrutura de celulose (Higuchi, 1993).

A celulose está estruturalmente ligada à hemicelulose e à lenhina, não sendo assim

um substrato facilmente acessível. Fisicamente, a celulose é um material sólido e branco

que existe no estado amorfo-cristalino. A forma cristalina é resistente ao ataque químico e

à degradação microbiana enquanto que a forma amorfa é primeiramente atacada e

degradada (Biermann, 1996).

As moléculas de celulose são lineares e ligam-se umas as outras por pontes de

hidrogénio intra e intermoleculares, formando fibrilas elementares (FE) (Figura 1.2).

4


Várias FE de celulose são agregadas umas as outras formando as microfibrilas. Estas

microfibrilas são constituídas por regiões cristalinas rigorosamente ordenadas alternando

com regiões amorfas menos ordenadas. Microfibrilas formam as macrofibrilas e estas

formam fibras. As suas estruturas lineares e cristalinas são responsáveis pela rigidez

atribuída à madeira (Kirk & Fareel, 1987).

Os mais eficientes degradadores biológicos da celulose são os fungos filamentosos.

Tipicamente, as endoglucanases e as celobiohidrolases hidrolisam a celulose cristalina em

celobiose e a β-endoglucanase degrada a celobiose em glucose (Teeri, 1997).

(a)

Microfibrilas

(b)

Unidades de glucose

Ligações glicosídicas

Ligações de H

Figura 1.2 – Diagrama estrutural da celulose mostrando as ligações β-(1,4) dos resíduos de D-glucose e

as ligações de hidrogénio inter e intra molecular (a) e representação das microfibrilas da celulose (b) (Adaptado de Voet & Voet, 1990).

1.1.1.2 Hemiceluloses

As hemiceluloses são um grupo misto de polissacarídeos não celulósicos lineares

e/ou ramificado que compreende dois grandes grupos: pentosanos e hexosanos. Os

pentosanos são constituídos de unidades de pentoses (D-xilose, L-arabinose) e os

hexosanos são constituídos de unidades de hexoses (D-glucose, D-galactose, D-manose).

Também apresentam pequenas quantidades de L-ramnose, L-fucose e ainda desoxi-

5


hexoses e ácidos urónicos: ácido D-glucurónico, ácido 4-O-metil-D-glucurónico e ácido D-

galacturónico.

Os monossacarídeos ligam-se uns aos outros essencialmente por ligações

glicosídicas β-(1→4), mas também se podem encontrar ligações glicosídicas β-(1→3), β-

(1→6), α-(1→2), α-(1→3) e α-(1→6). As hemiceluloses e a lenhina são ligadas

covalentemente. Devido ao baixo grau de polimerização e à sua natureza amorfa, as

hemiceluloses são degradadas mais facilmente do que a celulose. Apesar disso, ainda é

necessário um sistema enzimático complexo para a sua degradação, devido à sua estrutura

variável e ramificada (Sjöström, 1981).

Tal como a celulose, grande parte da função das hemiceluloses é dar resistência à

parede celular, actuando como matriz de suporte para as microfibrilhas de celulose (Kirk &

Fareel, 1987). Fisicamente, são um material sólido e branco, raramente cristalino ou

fibroso. As hemiceluloses aumentam a resistência do papel e o rendimento da pasta. São

muito mais solúveis e susceptíveis a degradação química. O baixo peso molecular faz com

que sejam solúveis em soluções alcalinas diluídas a altas temperaturas, como acontece no

cozimento kraft (Biermann, 1996). A sua estrutura varia de acordo com o tipo de madeira.

Nas madeiras resinosas a hemicelulose consiste principalmente de glucomananas,

galactoglucomananas, arabinanas enquanto que nas madeiras folhosas consiste de

glucuroxilano e pequenas quantidades de glucomananas (2-5%).

1.1.1.3 Lenhina

A lenhina é o segundo maior componente celular da madeira. Ela estabelece as

ligações entre as fibras da madeira, conferindo firmeza e rigidez às fibras. Ela é encontrada

entre as células e a parede celular e é resistente ao ataque biológico, uma vez que não

apresenta ligações que sejam hidrolizáveis. É um polímero de estrutura amorfa, aromática,

altamente ramificada e insolúvel em água. Apresenta–se sob uma rede tridimensional com

ligações cruzadas (Sjöström, 1981).

É um heteropolímero complexo constituído por unidades de fenilpropano (C9) que

apresenta um elevado peso molecular (600-10000 kDa). Durante o tratamento químico, a

sua remoção permite que as fibras de celulose e hemicelulose sejam separadas facilmente

6


(Kirk & Cullen, 1998). Ela apresenta um carácter hidrofóbico, que na presença de pastas

inibe a absorção de água e o inchamento das fibras.

A lenhina é formada a partir dos álcoois p-cumarílico, coniferílico e sinapílico

(Kuad et al. 1997), os quais formam respectivamente as subunidades hidroxifenilo (H),

guaiacilo (G) e seringilo (S) que compõem a lenhina (Boudet et al., 1995). O álcool

coniferílico é percursor das unidades guaiacilo e o álcool sinapílico origina as unidades

seringilo e o álcool cumarílico dá origem às unidades p-hidroxifenilo (Kirk & Fareel,

1987). Estes percursores são formados a partir da glucose por uma variedade de reacções

enzimáticas que envolvem oxidações, reduções, aminações, descaboxilação entre outras. A

Figura 1.3 mostra os álcoois percursores da lenhina. A lenhina de madeiras moles é

constituída principalmente de unidade de G, enquanto que as duras de G e de S.

OH

CH

OCH3

CH

CH2OH

OH

CH

OCH3

CH

CH2OH

OH

CH

CH

CH2OH

H3CO

Álcool coniferílico Álcool sinapílicoÁlcool cumarílico

Figura 1.3 – Álcoois percursores da lenhina (Adaptado de Biermann, 1996).

Estudos recentes mostram que a polimerização desidrogenativa de monómeros de

lenhina é causada por uma classe de enzimas, as peroxidases ou o sistema peroxidase-

H2O2. Estas enzimas são capazes de oxidar um percursor, criando radicais livres

estabilizados por ressonância, que se polimerizam por acoplamento destes de radicais.

(Kilpeläinen et al., 1994). A combinação de radicais monoméricos com os grupos

fenólicos conduz à formação de um polímero linear, enquanto que as ramificações do

polímero ocorrem através da formação de estruturas benzil aril éter.

A Figura 1.4 mostra a estrutura da lenhina. A ligação dominante é do tipo β-O-4.

Mais de dois terços da unidade de fenilpropano na lenhina está ligada por ligações éter C-

7


O-C e as unidades restantes por ligações carbono-carbono C-C. Os principais tipos de

ligações são alquil-O-aril, alquil-O-alquil, aril-O-aril, alquil-alquil, aril-aril e alquil-aril.

Estas ligações explicam as fortes condições necessárias para a despolimerização da lenhina

e a incapacidade de originar a reversão para monómeros (Sjöström, 1981).

Figura 1.4- Estrutura de uma lenhina resinosa (Sipilä et al., 2005).

8


Os grupos funcionais da lenhina com maior influência sobre a reactividade da

lenhina consiste de grupos carbonilo, grupos hidroxilos fenólicos e grupos metoxilos

(Sjostron, 1981).

As lenhinas são diferentes consoante a espécie de madeira e variam de acordo com

o conteúdo de unidades de seringilo, guaiacilo e p-hidroxifenilo e podem ser classificadas

em várias classes de acordo com os seus elementos estruturais. A lenhina é covalentemente

associada à hemicelulose, na parede celular, por numerosos tipos de ligações. As mais

importantes são as ligações éter entre o carbono benzílico da lenhina e uma das partes do

hidrato de carbono e as ligações éster entre o carbono benzílico da lenhina e os resíduos de

ácidos (Hammel, 1997).

A lenhina é uma molécula altamente irregular que não tem nenhuma estrutura

precisa, mas contém uma série de variadas substruturas, conforme mostra a Figura 1.5.

Considerando que o polímero da lenhina é grande e altamente ramificado, deduz-se

que os mecanismos lenhinolíticos devam ser extracelulares. Estes mecanismos devem ser

oxidativos em lugar de hidrolíticos, uma vez que o polímero é interligado por ligações

estáveis de éter e de carbono-carbono. Como a lenhina consiste numa mistura

estereoirregular de unidades, os agentes lenhinolíticos certamente serão muito menos

específicos que os catalisadores biológicos típicos (Hammel, 1997). Somente uma classe

de microorganismo é capaz de degradar a lenhina, os basidiomicetes.

9


b c a

d

e f

g h i

j k

Figura 1.5 - Principais subestruturas na lenhina; β-O-4’ (a); β-O-4’ degradada (b); α-O-4’

acíclica (c); β-5’ cíclica e α-O-4’ (d); α-2’/6’ e β-2’6’ (e); 5,5’ (f); 4-O-5’(g); β-1’ (h); β-β’ (i); éster α-HC-hidroxicinamato de arilglicerilo (com ligação α-4) (j); éster γ-HC-hidroxicinamato de arilglicerilo (com ligação γ-4) (k) (Sjöström, 1981).

10


1.1.2 O processo de fabricação da pasta de papel

As pastas de madeira são o material de partida para a produção do papel. A

produção da pasta pode ser dividida em quatro partes principais: preparação de matérias-

primas, deslenhificação, branqueamento e sistema de tratamento de águas residuais.

Durante o processamento de produção da pasta, os seguintes processos podem ser

utilizados (Akhatar et al., 1997; Ander et al., 1998):

(i) mecânico → a madeira é destroçada, as cascas são trituradas e as fibras

reduzidas à uma pasta fibrosa denominada “pasta mecânica”. Neste processo não ocorre

uma separação completa das fibras dos demais constituintes, obtendo-se então uma pasta

com baixa qualidade, cuja aplicação é limitada.

(ii) termomecânico → a madeira, sob forma de aparas, sofre um aquecimento com

vapor (em torno de 140° C), seguindo para o processo de desfibramento em refinador a

disco. A pasta obtida desta forma resulta em celulose para a produção de papéis de melhor

qualidade, pois proporciona maior resistência mecânica.

(iii) semi-químico → neste processo acrescentam-se produtos químicos em baixas

porcentagens para facilitar ainda mais a desfibragem. O mais comum desses processos é

conhecido na Europa com a sigla NSSC (neutral sulphite semi chemical).

(iv) quimiotermicomecânico → a pasta derivada do processo mecânico sofre um

pré-tratamento com sulfito de sódio ou álcali antes da desfibragem.

(v) químico – kraft (ou ao sulfato) → é processo de fabricação da pasta de papel

mais utilizado. Pode ser utilizado em quase todas as espécies de madeira. A madeira é

tratada em vasos de pressão, denominados digestores, com hidróxido de sódio e sulfeto de

sódio. É um processo químico que visa dissolver a lenhina, preservando a resistência das

fibras, obtendo-se dessa maneira uma pasta forte (kraft significa forte em alemão), com

rendimento entre 50 - 60% (Kirk & Farrell, 1987).

(vi) químico – sulfito → é um processo em que os cavacos são cozidos em

digestores com um licor ácido, preparado com compostos de enxofre (SO2) e uma base

Ca(OH)2, NaOH, NH4OH etc. A pasta obtida desta maneira tem um rendimento entre 40 e

11


60 % e é de branqueamento muito fácil, apresentando uma coloração clara que permite o

seu uso mesmo sem ser branqueada. Este processo, que era muito utilizado para a

confecção de papéis para imprimir e escrever, está sendo substituído pelo processo sulfato

(principalmente após a introdução do dióxido de cloro no branqueamento), devido à

dificuldade de regeneração dos produtos químicos e as conseqüentes contaminações das

águas.

1.1.3 Branqueamento da pasta kraft

O branqueamento é um processo químico aplicado à pasta crua para aumentar a sua

brancura por remoção da lenhina residual da fibra. Neste processo deseja-se que um

mínimo possível ou nenhum dano ocorra aos polissacarídeos, particularmente a celulose,

que é a substância primária da parede celular da madeira e o constituinte chave das fibras

naturais do qual o papel é feito.

A determinação do conteúdo de lenhina na pasta é importante para a produção de

papel branco. O alto conteúdo de lenhina dificulta e encarece o branqueamento da pasta,

enquanto que o baixo conteúdo de lenhina pode favorecer o branqueamento (McDonald,

1970).

A determinação rápida do conteúdo de lenhina, durante o processamento da pasta,

nem sempre é fácil. A oxidação da madeira ou da pasta com soluções padrão de

permanganato de potássio constitui um método convencional para a determinação do

conteúdo de lenhina, e foi aprovado pela Technical Association of the Pulp and Paper

Industry (TAPPI). A lenhina da pasta reage com permanganato e a quantificação do

permanganato consumido é determinada por titulação com iodeto de potássio. Esse método

determina o Índice Kappa, que é o método industrial padrão de determinação do conteúdo

de lenhina. O Índice Kappa é definido como a quantidade de permanganato que é

consumido pela pasta. Uma vez que o permanganato é consumido pela lenhina, o Índice

Kappa é uma medida indirecta da percentagem de lenhina na pasta (Smook, 1989).

A maioria dos sistemas de deslenhificação são agressivos, particularmente quando

o nível de lenhina diminui, de forma que a deslenhificação a níveis desejáveis faz com que

ocorra alguma degradação nas propriedades da fibra.

12


Os agentes químicos oxidantes utilizados podem ser o hipoclorito de sódio

(NaClO), o oxigénio (O2), os peróxidos de hidrogénio (H2O2), o dióxido de cloro (ClO2), o

cloro (Cl2) e o ozono (O3).

Os estágios de branqueamento são designados por símbolos de acordo com o

agente químico utilizado: Z - ozono – usado na forma de gás; O – oxigénio; P – peróxido

de hidrogénio – em estado líquido em meio alcalino; D - dióxido de cloro – em solução

(ClO2); C – cloro; E - extração alcalina – usando NaOH; E/O - extração alcalina usando

oxigênio; E/P - extração alcalina usando peróxido; Q - Estágio ácido onde é adicionado um

agente quelante (EDTA ou DTPA);

Dependendo do agente de branqueamento e da sequência utilizada, o

branqueamento da pasta é denominado: STD - Standard (com uso de cloro molecular,

sequência (C+D)(EO)DED); ECF - Elementary chlorine free (sem uso do cloro molecular,

sequência D(EO)DED)¸ TCF - Totally chlorine free (sem uso de compostos clorados,

sequência OQP), entre outros (Dence & Reeve, 1996).

A sequência de branqueamento típico com ClO2 pode ser descrita com uma

sequência de operações do tipo DEDED em que são aplicados agentes químicos

sequencialmente, com extracções intermédias. Na primeira etapa (D) ocorre a oxidação e

fragmentação da lenhina, mas como a dissolução é apenas parcial, é necessário a etapa de

extracção alcalina posterior. Este procedimento é realizado duas vezes e termina com uma

terceira etapa com ClO2. No final do processo DEDED a pasta é lavada. A pasta branca

resultante é essencialmente constituída por celulose e hemiceluloses e contem quantidades

vestigiais de lenhina (0.1-0.3% no processo kraft) (Biermann, 1996; Reeve, 1989).

Uma das alternativas mais atractivas ao dióxido de cloro e ao cloro, no que respeita

ao impacto ambiental e aos custos, são o oxigénio, o peróxido de hidrogénio e o ozono.

Entretanto a limitação do uso destes compostos é geralmente a sua selectividade para a

lenhina (vs. celulose). A alta selectividade é importante para manter as propriedades de

resistência física da fibra. O oxigénio não é suficientemente selectivo para remover mais de

metade da lenhina residual da pasta kraft. O peróxido de hidrogénio não deslenhifica

efectivamente. O ozono é muito efectivo, no entanto limitações de transferência de massa

impostas pela necessidade de empregar ozono em concentrações diluídas de lenhina,

13


presentes dentro das fibras primárias da parede celulósica, dificultam a selectividade do

processo em escala industrial (Weinstock et al., 1997). No entanto, numerosas tecnologias

alternativas e de biobranqueamento estão a ser consideradas. Têm sido desenvolvidos

vários estudos visando obter um processo de tratamento da pasta que seja adaptável às

instalações já existentes e compatível com a legislação ambiental em vigor.

Estudos da biodegradação da lenhina têm grandes implicações não só no

entendimento do ciclo do carbono global, como também no desenvolvimento de técnicas

não prejudiciais ao meio ambiente para a remoção selectiva da lenhina da madeira na

indústria do papel. Diferentes tipos de microorganismos são capazes de degradar a

madeira, no entanto os fungos da podridão branca da madeira são os microorganismos

mais eficientes em degradar a lenhina, conforme discutido anteriormente. Estudos com os

fungos da podridão branca da madeira e suas enzimas têm revelado três tipos diferentes de

potenciais enzimas lenhinolíticas: lenhina peroxidase (LiP), manganês peroxidase (MnP) e

lacase. T. versicolor é um dos fungos mais extensivamente estudado na biodegradação da

lenhina. O uso de enzimas para a remoção da lenhina tem sido proposto como uma via para

a redução do consumo de dióxido de cloro na indústria do papel (Tolan & Thibault, 1997)

1.1.3.1 O papel da lacase no branqueamento da pasta

Muitas enzimas são conhecidas por actuar sobre a lenhina, especialmente as

oxidativas como é o caso da lacase. Ela pertence ao grupo da polifenol oxidase e esta

usualmente é considerada como sendo somente capaz de oxidar compostos fenólicos da

lenhina devido ao seu baixo potencial redox, quando comparada com a MnP ou LiP

(Kersten et al., 1990).

Nas últimas décadas, tem-se feito um forte esforço para se compreender os

mecanismos da biodegradação da lenhina pela lacase e para encontrar uma aplicação

enzimática industrial, principalmente no branqueamento da pasta kraft (Call & Mucke,

1997). Muitos estudos têm descrito a aplicação da lacase ao branqueamento de pasta kraft.

14


Katayama et al. (1989) produziram a primeira evidência de quebra do anel

aromático de um tipo de estrutura bifenílica da lenhina (DDVA; 2,2'-dihidroxi-3.3'-

dimetoxi - 5,5 '-dicarboxi bifenil) por T. versicolor.

1.1.3.2 Uso de mediadores

Juntamente com a lacase, certos compostos químicos, chamados de mediadores,

podem ser utilizados no branqueamento da pasta de papel, uma vez que o efeito catalítico

da lacase é insuficiente para muitos processos industriais. O tamanho molecular da lacase

não permite a sua penetração na parede celular do material lenhinocelulósico. O uso de

compostos mediadores torna possível a biodeslenhificação de pastas, uma vez que os

compostos não fenólicos da lenhina podem ser oxidados com o uso em conjunto da lacase

e de mediadores.

O sistema lacase-mediador (SLM) constitui uma alternativa promissora às

convencionais tecnologias de branqueamento da pasta de papel (Leonowicz et al. 2001).

Este sistema apresenta as seguintes vantagens (Smith & Ragauskas, 2005):

• Remove selectivamente a lenhina da pasta;

• Aumenta o rendimento da produção de pasta;

• Reduz o capital e despesas operacionais da deslenhificação;

• Minimiza a geração de ião cloreto durante o branqueamento;

• Reduz o uso de água fresca;

• Exibe verdadeiras propriedades catalíticas.

A Tabela 1.1 mostra o nome e a estrutura dos principais mediadores orgâncicos da

lacase já estudados.

Call (1994), mostrou que é possível obter mais de 55% de deslenhificação da pasta

kraft com lacase e mediador (1-hidroxilbenzotriazol (HBT)).

Na presença do mediador, HBT, um composto modelo de subestrutura de lenhina

15


β-O-4, não fenólico, foi oxidado pela lacase de T. versicolor originando quatro produtos.

Os resultados mostram que três tipos de reacções, quebra β-éter, quebra Cα-Cβ e oxidação

do Cα foram catalisadas pelo par lacase-HBT (Shingo, 1999).

O entendimento do mecanismo de oxidação da lenhina pelo SLM deverá facilitar a

comercialização desse sistema pela indústria do papel. Estes mediadores formam radicais

reactivos que podem penetrar nas fibras da pasta alcançando a lenhina melhor do que a

grande molécula de lacase. Deste modo a lenhina é degradada e sua repolimerização é

evitada. Estudos avaliam o papel de diferentes mediadores juntamente com a lacase,

principalmente em reacções de oxidação de compostos modelo da lenhina (Fabbrini et al.

2002; Bourbonnais et al., 1997; Castro, 2001). Os mediadores mais frequentemente

estudados são: HBT (Li et al. 1998; Castro et al., 2003; Majcherczyk et al., 1998¸

Bourbonnais et al., 1997), Ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotriazolina-6-sulfónico) (ABTS)

(Bourbonnais et al., 1997), N-oxil-2,2,6,6-tetrametilpiperidina (TEMPO), Ácido violúrico e

Polioxometalatos (Castro et al., 2003).

Tabela 1.1 - Estrutura de alguns mediadores orgânicos da lacase

Mediador Estrutura

1-hidroxilbenzotriazol (HBT)

Ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotriazolina-

6-sulfónico) (ABTS)

N-oxil-2,2,6,6-tetrametilpiperidina

(TEMPO)

Ácido violúrico

16


O mecanismo da oxidação da lenhina com SLM está apresentado na Figura 1.6,

onde os electrões que saem da lenhina são transferidos para o oxigénio, que apresenta o

papel de aceitador final de electrões. O mediador funciona como um transportador de

electrões difusível entre a lenhina e a enzima. Uma vez oxidado pela enzima, ele difunde-

se da porção enzimática e volta a oxidar a lenhina, que devido ao tamanho, não entra na

porção enzimática.

mediadorox mediadorred

lacase lacaseox

O2

H2O

lenhina lenhinaox

Figura 1.6 - Representação esquemática da degradação da lenhina por lacase num sistema com mediador (Adaptado de Bourbonnais et al., 1998).

Um estudo com uma série de lacases de origem fúngica demonstrou uma correlação

entre o potencial redox da enzima e actividade frente a um determinado substrato. A lacase

apresentou um potencial próximo a 0.7-0.8 V (vs. ENH). Este estudo mostrou que a

actividade da lacase face à lenhina em sistemas com mediador é dependente de uma

combinação de dois principais factores: o potencial redox da enzima e a estabilidade e

reactividade dos radicais gerados pela oxidação da lenhina com o mediador (Xu et al.,

1996).

A investigação por voltametria cíclica de alguns mediadores da lacase mostrou que

um importante papel na determinação do mecanismo da oxidação de um substrato pode

estar relacionado por um lado com a estabilidade da forma oxidada do mediador e por

outro com o seu potencial redox (Fabbrini et al., 2002).

Além da aplicação à pasta de papel, tem-se descrito o uso de mediadores e lacase

na degradação de hidratos de carbono aromático policíclicos, na síntese química e no

branqueamento de corantes têxteis (Bourbonnais et. al, 1998).

17


A deslenhificação catalítica das pastas kraft com POMs e lacase é uma tecnologia

não nociva ao meio ambiente e muito selectiva, que constitui uma alternativa promissora

ao convencional branqueamento (Call & Mucke, 1997).

1.1.3.2.1 Os polioxometalatos

As potencialidades económicas e ambientais dos polioxometalatos (POMs) tornam-

os muito promissores (Kozhevnikov, 1998). Outras capacidades específicas fazem dos

POMs uma nova tecnologia para o branqueamento e o processamento da pasta da madeira,

em particular (Evtuguin & Neto, 1997; Weinstock et al., 1997). Esta tecnologia promete

tanto vantagens económicas como ambientais sobre as actuais práticas na indústria

papeleira. O principal objectivo no uso de POMs é a sua aplicação em condições tais que

se consiga obter um alto nível de selectividade. Uma grande vantagem no uso dos POMs

como mediadores é que eles podem ser regenerados e reutilizados no processso de

deslenhificação.

Os POMs são caracterizados por apresentar um centro metálico, M, que é rodeado

por alguns átomos ou grupo de átomos. Nos POMs, os átomos ligantes são os átomos de

oxigénio. Em geral, eles apresentam unidades MOy, onde y indica o número de

coordenação de M. Além de M e O, outros elementos, que usualmente são designados

como X, podem fazer parte do estrutura do POM. Podem ser classificados como

isopolianiões (IPAs) ou heteropolianiões (HPAs).

Apresentam a fórmula geral:

[MmOY]m- (IPAs) (1.2)

[XxMmOY]n- (HPAs) (1.3)

onde x≤m, Mm = Mo, W, V, Nb, Ta e X variável = P, Si, Ge, B, As entre outros

(Gamelas et al., 2003). Xx representa o heteropoliátomo introduzido na estrutura e está

localizado no centro da molécula e Mm o adenoátomo. Os POMs apresentam uma estrutura

18


organizada em unidades discretas. Apesar das fórmulas 1.2 e 1.3 serem simples, a

composição de um grupo pode ser altamente complexa com vários elementos M fazendo

parte da estrutura. A unidade básica de construção desses POMs é o octaédro formado por

um metal rodeado de seis oxigénios (MO6). A Figura 1.7 mostra a unidade fundamental da

estrutura do POM.

Figura 1.7– Representação bola-bastão e poliedro da unidade fundamental de MO6 (Fernandez, 2003).

Essas unidades unem-se umas às outras. A Figura 1.8 mostra a união das unidades

de MO6.

Figura 1.8 – Modelos poliédricos representam as três possíveis uniões entre duas unidades octaédricas MO6. A) união de vértice, B) união de aresta e C) união de face (Fernandez, 2003).

Os POMs com estrutura de Keggin são os mais importantes e estudados

actualmente (Weinstock et al., 1997). A estrutura desses POMs é baseada em um tetraedro

19


central XO4, rodeado por doze octaedros MO6 arranjados em quatro grupos de três

octaedros cada (M3O13) (Pope, 1983). O heteroátomo encontra-se no centro formando a

estrutura tetraédrica XO4. Cada uma das unidades M3O10 compartilha os átomo de

oxigénio dos vértices com as outras três, formando assim o POM com estrutura de Keggin

e fórmula geral de:

[XM12O40]n- (XM12, forma abreviada) (1.4)

onde X é o heteroátomo (PV, AsV, GeIV, SiIV, BIII, FeIII; CoII, entre outros) e M é o adendo

átomo (MoIV; WVI). Os heteroátomos mais comuns nos aniões de Keggin são os

heteropolitungstatos [XW12O40]n- e os heteropolimolibdatos [XMo12O40]n-. O centro

externo de MmOY é livre de eléctrons metálicos se o arranjo é totalmente oxidado. A Figura

1.9 mostra a representação de um anião de Keggin.

XO4n-

M12O40

Figura 1.9 - Representação poliédrica da estrutura do anião de Keggin. O centro externo M12O40

encapsula a unidade interna, representada pelo tetraedro XO4n- (Jeannin, 1998).

Em solução, os potenciais de redução dos POMs com estrutura de Keggin são altos,

e por isso são reduzidos facilmente, mesmo em condições brandas, podendo depois ser

reoxidados pelo oxigénio, ar, ozono, H2O2, enzimas ou outro oxidante apropriado. Os

electrões são aceites pelos adenoiões do HPA (Sadakane & Steckhan, 1998). Entretanto,

apresentam algumas propriedades diferentes entre si como estabilidade, solubilidade,

acidez e potencial óxido-redução, que irão depender da espécie metálica (MoVI, WVI, etc.),

da presença ou ausência de algum outro metal incorporado, (VV, MnII, etc.) e do

heteroátomo central.

20


Uma característica dos POMs é a sua elevada solubilidade em água, que é

importante para a realização de experiências em catálise em fase líquida (Gamelas et al.,

2003; Hill, 1998 ). Outra característica bastante marcante é o potencial de óxido-redução,

que é mais influenciado pelo tipo de metal, do que pelo heteroátomo em si. Em relação aos

metais que compõe os POMs potenciais, o potencial redox é decrescente na seguinte

ordem: V >Mo>W. Os potenciais redox do POMs de Si são menores do que os de P. Uma

das maiores vantagens do uso dos POMs é que após serem reduzidos durante a reacção de

oxidação, eles podem ser reoxidados e reutilizados.

No branqueamento da pasta do papel, os POMs podem remover eléctrões dos

substratos orgânicos (reduzem-se) oxidando os fragmentos da lenhina dissolvida no licor

de branqueamento e ainda facilitando a transferência de eléctrões para o oxigénio. Na etapa

do branqueamento, aquece-se a altas temperaturas, uma mistura de água, pasta e POM

totalmente oxidado (POMoxi). Nestas condições de reacção, o POM é reduzido enquanto a

lenhina é oxidada. Após a reacção, o licor de branqueamento é separado da pasta e

reoxidado com o oxigénio conforme mostram as equações 1.5 e 1.6 (Katsoulis, 1998) e o

esquema apresentado na Figura 1.10:

Pasta + POMox → pasta branqueada + POMred +2H+ (1.5)

POMred + ½ O2 + 2H+ → POMox +CO2 + H2O (1.6)

O2

H2O

POMred POMox

lenhinaox lenhina

Figura 1.10 - Ciclos redox do POM na reacção catalítica da oxidação da lenhina (Balakshin et al. 2001).

Além dos mediadores orgânicos, os POMs também podem actuar como mediador

no processo de deslenhificação da pasta com lacase. A deslenhificação catalítica das pastas

kraft com POM e lacase (SLM) não é agressiva ao meio ambiente e é um processo

21


selectivo de deslenhificação. A Figura 1.11 mostra o mecanismo da oxidação da lenhina

pelo POM. A correspondente forma reduzida passa pela reoxidação directa pela lacase.

Do ponto de vista técnico, o SLM é eficiente e decompõe selectivamente a lenhina

residual sem significativa perda de viscosidade. Entretanto, uma das principais

desvantagens do SLM é a baixa estabilidade dos mediadores orgânicos (ABTS; HBT; etc.)

no sistema reaccional e a absorção de alguns mediadores coloridos na fibra.

Adicionalmente, considerando o alto custo dos mediadores, o SLM com mediadores

orgânicos não é viável ao contrário dos POMs que são muito efectivos como catalisadores

e podem ser reciclados no ciclo catalítico (Evtuguin et al., 1998).

Balakshin et al. (2001), demostraram pela primeira vez a possibilidade de usar o

sistema catalítico de POM com lacase para a deslenhificação da pasta kraft em condições

aeróbicas e a temperaturas moderadas (40-60 ºC). A lacase mostrou ser capaz de reoxidar

diferentes POMs, mesmo os que não são reoxidados pelo oxigénio a altas temperaturas.

O2

H2O

lacase lacaseox

POMox POMred

Lenhina Lenhinaox

Figura 1.11 – Ciclos redox no sistema catalítico de oxidação da lenhina com POM-lacase-O2 (Balakshin

et al., 2001).

1.2 A natureza dos fungos

Os fungos são organismos eucarióticos quimioorganotróficos. Apresentam dois

tipos morfológicos principais: os fungos filamentosos, assim chamados por formarem hifas

(ou filamentos revestidos de parede rígida) e as leveduras, fungos normalmente

unicelulares.

Os fungos constituem um grupo muito diversificado no que diz respeito à forma,

estrutura e capacidade metabólica. A maior parte desenvolve-se de matéria orgânica morta.

O seu crescimento é afectado por factores físicos e químicos como temperatura, humidade,

22


concentração de oxigénio, pH, micronutrientes, fontes de carbono e nitrogénio, entre

outros.

Nos fungos, os núcleos estão dispersos em um micélio (conjunto de hifas) contínuo

ou septado. Não possuem plastos ou pigmentos fotossintéticos e sua nutrição é obtida por

absorção. São saprófitas, parasitas facultativos ou biotróficos. São predominantemente

filamentosos, mas algumas espécies são leveduriformes.

Os fungos filamentosos são morfologicamente complexos e heterogéneos, e podem

exibir diferentes formas estruturais durante o seu ciclo de vida. A sua estrutura vegetativa

básica de crescimento é constituida por um filamento tubular, a hifa, que é originada a

partir de um único esporo reprodutivo (Papagianne, 2004). A colónia de um fungo

filamentoso é uma estrutura muito repetitiva. É composta de uma rede tridimensional

ramificada de hifas interconectadas e possui um indefinido número de pontos de

crescimento (Read, 1994). A área superficial relativa faz com que as hifas estejam bem

adaptadas para a absorção, segregação e excreção de substâncias. Quando crescem em

culturas submersas, os fungos filamentosos exibem diferentes formas morfológicas,

dispondo-se desde filamentos miceliares dispersos até densas massas miceliares agregadas,

chamadas de “pellets” (Papagianne, 2004). Os pellets são agregados de hifas apresentando

uma forma esférica ou elipsoidal, com uma estrutura interna variável. A forma particular

exibida é determinada não somente pelo material genético, mas também pelas condições

físicas e químicas do meio de cultura em que se encontram (Kossen, 2000; Znidarsic &

Pavko, 2001)

Reconhece-se a existência de três classes nesse grupo: basidiomicetes, ficomicetes

e ascomicetes. Os basidiomicetes (fungos superiores) são seres heterotróficos, necessitam

de meios eficientes de segregação de enzimas digestivas extracelulares. São providos de

talo pluricelular formado de hifas septadas. Seu micélio pode ter crescimento indefinido ou

formar, nos tipos mais evoluídos, corpos frutíferos de estrutura constante. A estrutura

reprodutora característica do grupo é o basídio, que é a extremidade de uma hifa dilatada,

uni ou pluricelular, e que emite ramificações, cada uma suportando em sua extremidade

um esporo, ou basidiósporo. Este grupo apresenta uma grande importância económica pois

compreende as espécies causadoras de uma série de doenças nas plantas cultivadas. Os

basidiomicetes superiores separam-se em dois grupos: os himenomicetes e os

gasteromicetes. Entre os primeiros estão os fungos destruidores da madeira.

23


1.2.1 Fungos da podridão branca da madeira

Os fungos da podridão branca da madeira e suas enzimas lenhinolíticas têm sido

muito estudados devido à sua grande eficiência em degradar a lenhina e as possíveis

aplicações na indústria papeleira (Akhtar et al., 1997), além de apresentar grande potencial

para a bioremediação de poluentes com estruturas similares a lenhina (Pointing, 2001).

Os substratos de crescimento para este tipo de fungo são a celulose e a

hemicelulose. A degradação da lenhina, que é altamente recalcitrante, ocorre no fim do

crescimento primário, através de um metabolismo secundário quando há deficiência em

nutrientes (Pointing, 2001). O ataque do fungo à lenhina é um processo oxidativo aeróbio,

onde são oxidados compostos fenólicos, metóxidos e alifáticos da lenhina através do

rompimento de anéis aromáticos e da criação de novos grupos carbonilo. Estas mudanças

na estrutura da lenhina resultam na sua despolimerização e na produção de dióxido de

carbono (Kirk & Farrell 1987).

Os fungos da podridão branca da madeira degradam a lenhina tanto selectivamente

como não selectivamente. Na degradação selectiva, tanto a lenhina como a hemicelulose

são significativamente mais degradas do que a celulose, enquanto que na degradação não-

selectiva, quantidades iguais de todos os componentes de lenhinocelulose são degradados.

Alguns fungos como Ganoderma applanatum, Heterobasidion annosum e Phellinus pini,

são capazes de realizar ambos os tipos de degradação (Blanchette, 1995).

1.2.2 O sistema lenhinolítico dos fungos da podridão branca da madeira

Vários tipos de enzimas lenhinolíticas, envolvidas na degradação da lenhina, são

produzidas pelos fungos da podridão branca da madeira. Além dessas, eles também podem

produzir celulases, xilanases e outras hemicelulases (Hatakka, 1994). Quase todos os

fungos da podridão branca da madeira produzem MnP e lacase, mas somente alguns

produzem LiP (Hatakka, 1994). LiP oxida as unidades não-fenólicas da lenhina (Kirk &

Farrell, 1987). MnP oxida Mn2+, que pode ser encontrado na madeira e no solo, a Mn3+. A

alta reactividade de Mn3+ faz oxidar os anéis fenólicos da lenhina em radicais livres

instáveis, que se decompõe espontaneamente (Hofrichter, 2002). A Lacase oxida os anéis

fenólicos em radicais fenoxílicos. Outras enzimas como a celobiose:quinona

oxidoreductase (CBQ), celobiose dehidrogenase (CDH), glioxalacto oxidase (GlOx),

24


glucose oxidase, álcool veratrílico oxidase (VAO) e algumas esterases também podem

apresentar algum papel no complexo processo da degradação da madeira, mas não actuam

sozinhas. Enquanto as enzimas lenhinolíticas oxidam compostos fenólicos e criam radicais

fenóxidos, os compostos não fenólicos são oxidados via catião radical (Call & Mucke,

1997; Garg & modi, 1999).

O sistema de degradação de materiais lenhinocelulósicos envolve uma série de

reacções. As espécies de basidiomicetos, incluindo as do género Trametes, são capazes de

realizar tal degradação, devido ao complexo enzimático lenhinocelulolítico específico. Um

esquema ilustrativo, onde se observa a função desempenhada pelas enzimas degradadoras

de materiais lenhinocelulósicos proposto por Rajarathnam et al. (1992) está apresentado na

Figura 1.12.

Celulose Hemicelulose Lenhina Proteínas

Forma alterada

Ácidos gordos

Glucose, xilose, etc.

Aminoácidos e peptídeos

Celubiose

Fenóis e compostos fenólicos

Indução de primórdios frutíferos

Fonte de C e energia

Glucose

Corpos frutíferos

Lipídeos

C1-celulase

Cx-celulase

β-Glucosidase

Hemicelulase Xilanase

Enzimas oxidativas Lacases Peroxidases lenhinases

Proteases Lipases Esterases

Figura 1.12 - Esquema da função desempenhada pelas enzimas degradadoras de materiais lenhinocelulósicos dos basidiomicetos (Adaptado de Rajarathnam et al., 1992).

25


1.2.3 O fungo Trametes versicolor

Trametes versicolor, por vezes classificado como Coriolus, Polyporus e Polysticus

é o mais comum habitante encontrado na madeira, causando a podridão branca

(Alexopoulus & Mims, 1979; Archibald et al., 1997). Este fungo pertence à classe dos

Basidiomycetes, ordem Polyporales, família Polyporaceae (Alexopoulus & Mims, 1979).

Existem cerca de 100 géneros nesta família.

É um cogumelo facilmente reconhecido pelo seu corpo frutífero (ou basidiocarpo)

que se apresenta em forma de “cauda de perú”, como mostra a Figura 1.13. As cores das

bandas podem variar dependendo da sua genética e do ambiente onde se encontram. A

maior parte das bandas são de cor castanha escura a clara, alternando- se com as bandas de

cores claras (as hifas).

Figura 1.13 – O fungo Trametes versicolor na forma de “cauda de perú”.

O seu ciclo de vida inicia-se com um esporo produzido pelo corpo frutífero

(cogumelo). Os esporos germinam e tornam-se hifas, que se agrupam formando o micélio

(fase vegetativa). Este por sua vez cresce originando o cogumelo (fase sexual)

(Alexopoulus & Mims, 1979).

T. versicolor é um dos mais eficientes fungos degradadores da madeira que

promove a deterioração simultânea da lenhina, celulose e hemicelulose (Tanaka et al.

26


1999). As enzimas oxidativas extracelulares produzidas por este fungo iniciam o ataque à

madeira. Esta espécie lenhinolítica é chamada de fungo da podridão branca porque confere

um aspecto esbranquiçado à madeira a medida que esta apodrece (Lewin & Goldstein,

1991). Estas características fazem com que este fungo e as suas enzimas lenhinolíticas

sejam estudados e/ou aplicados como alternativa ao branqueamento químico da pasta de

papel, na indústria têxtil para a remoção de cor (Swamy & Ramsay, 1999; Wong & Yu,

1999; Amaral et al. 2004), no tratamento de efluentes industriais (Modi et al. 1998) e na

bioremediação de uma série de poluentes orgânicos (Pointing, 2001).

Este fungo também é bastante usado na medicina tradicional do Este Asiático

devido às sua propriedades medicinais (Cui & Chisti, 2003). No Japão é chamado de

“Kawaratake” ou “cogumelo junto ao rio” e na China como “Yun Zhi” ou “ cogumelo

nuvem”. Na medicina tradicional este fungo é colhido, seco, moído e extraído com água

quente. Ele é usado no tratamento de infecções pulmonares, hepatite e em doentes com

cancro devido às suas propriedades imunomoduladoras (moduladoras do sistema

imunológico). Estas propriedades são atribuídas aos polissacarídeos do T. versicolor

(Sugiura et al. 1980; Ng, 1998). 1.3 Enzimas lenhinolíticas

Enzimas são proteínas globulares que actuam como catalisadores biológicos

conduzindo as reacções bioquímicas nas células dos organismos vivos. Estão grandemente

distribuídas na natureza. Quimicamente, as enzimas contêm uma ou mais cadeias de

centenas de aminoácidos numa complexa estrutura tri-dimensional, que é muito importante

para a sua acção. Como em toda a catálise, uma catálise enzimática é definida como uma

reacção de “parceria” que aumenta a velocidade de uma reacção química, sem que o

catalizador sofra mudanças em todo o processo. Esta definição implica que uma única

molécula de enzima é capaz de converter muitas moléculas de substrato durante o seu

tempo de vida. A taxa de conversão destas reacções é chamada de actividade de uma

enzima. As enzimas diferem dos catalisadores químicos em muitos aspectos, tais como: (i)

altas taxas de reacção; (ii) condições de reacção não agressivas e (iii) alta especificidade de

reacção (Call & Mucke, 1997). As enzimas são classificadas pela IUBMB (International

27


Union of Biochemistry and Molecular Biology) através do número EC, que as classifica de

acordo com a sua classe e com a reação que catalisa.

A interacção de uma enzima com o substrato pode ser pode ser ilustrada pelo

modelo “ chave -e- fechadura”. Somente um substrato (chave), que pode encaixar no

centro activo (fechadura), será convertido no centro catalítico, que é uma parte do centro

activo. A respeito desta imagem simplista, as reacções são certamente muito mais

complicadas e só podem ser descritas por modelos muito mais complexos. Ao contrário da

catálise química, as enzimas podem direccionar-se para reacções específicas através da

combinação de métodos altamente sofisticados com a engenharia genética e design

computacional de proteínas.

As enzimas são grandemente utilizadas como catalisadores na indústria, tal como

acontece na indústria da pasta do papel. Os fungos da podridão branca da madeira são os

principais produtores de enzimas lenhinolíticas. As principais enzimas lenhinolíticas são a

lacase, a manganês peroxidase e a lenhina peroxidase, mas outras enzimas como a CBQ, a

GlOx e algumas esterases também podem apresentarm um papel significativo no processo

de degradação da madeira.

1.3.1 Lenhina Peroxidase (LiP) (EC 1.11.1.14)

A LiP é uma glicoproteína hémica que catalisa uma variedade de compostos

fenólicos, não fenólicos, hidratos de carbono aromáticos e outros compostos que são

resistentes ao ataque microbiano. Requer peróxido de hidrogénio como cofactor e a

reacção ocorre através do mecanismo de oxidação de um electrão seguido por uma série de

reacções não enzimáticas (Garg & modi, 1999). Estas reacções incluem a degradação

oxidativa das ligações β-O-4, Cα-Cβ e outras ligações na lenhina. Os fungos segregam para

o meio de cultura várias isoenzimas que apresentam uma massa molecular entre 39 e 43

kDa e propriedades espectrais e catalíticas semelhantes (Kirk & Farell, 1987).

Alguns estudos mostram que, no T. versicolor, a LiP não é importante no

biobranqueamento da pasta de papel (Paice et al., 1993).

28


1.3.2 Manganês Peroxidase (MnP) (EC 1.11.1.13)

A MnP constitui o segundo grupo de glicoproteínas hémica que requer iões de

manganês livres para a sua actividade. A actuação desta enzima requer também a presença

de peróxido de hidrogénio. Inicialmente catalisa a oxidação do Mn2+ para o Mn3+, que

subsequentemente oxida vários compostos fenólicos (Garg & modi, 1999). Os fungos

também segregam várias isoenzimas da MnP para o meio de cultura, embora algumas

também possam estar ligadas à parede celular (Hatakka, 1994). A MnP purificada pode

desencadear a despolimerização de lenhinas sintéticas e também degradar clorolenhinas.

Verificou-se que inicialmente o sistema MnP pode igualar a extensão de branqueamento

obtida com o fungo, mas com o decorrer do tempo, os seus níveis diminuem.

1.3.3 Lacase (EC 1.10.3.2)

Lacase benzenodiol:oxigénio reductase, é uma polifenol oxidase, pertencente à

classe de enzimas oxidoreductase, também conhecida como oxidase de cobre azul. Pode

ser dividida principalmente em duas categorias segundo a sua origem: plantas e fungos. Foi

descoberta por Yoshida em 1883 nas plantas e caracterizada como um oxidase de cobre por

Bertrand em 1985 (Mayer & Staples, 2002). A lacase de fungos foi descoberta alguns anos

depois (Call & Mucke, 1997).

Os principais microorganismos produtores de lacase são os fungos da podridão

branca da madeira. T. versicolor é um dos mais estudados fungos da podridão branca da

madeira produtor de lacase (Garg & modi, 1999). Neste tipo de fungo, a lacase é produzida

dentro das células e excretada para o exterior dos filamentos das hifas.

O número de isoenzimas da lacase pode ser superior a 5, dependendo da espécie do

fungo e das condições ambientais de crescimento.

1.3.3.1 Caracterização estrutural da Lacase

A lacase pertence a família das enzimas de cobre azul, que pode ser definida pela

sua espectroscopia característica, pela sua sequência homologa e pela sua reactividade. Em

termos estruturais, esta enzima é uma glicoproteína que exibe uma heterogeneidade

adicional devido ao conteúdo variável de hidratos de carbono e de cobre (Yaropolov et al.,

29


1994). Compreende entre 520-550 aminoácidos, apresenta um peso molecular que varia de

60-80 kDa e é constituída por 15-20% de hidratos de carbono (Thurston, 1994).

Usualmente as lacases de fungos contêm 4 átomos de cobre distribuídos em 3 sítios

de ligação diferentes, que são identificados por densidade electrónica. O Cobre é

coordenado por duas histidinas e uma cisteína, que se encontra em um arranjo triangular

plano. Cada ião de cobre parece desempenhar um papel importante no mecanismo

catalítico (Thurston, 1994; Solomon et al., 1996). O primeiro sítio, tipo 1 (T1), é

responsável pela cor azul da enzima devido à máxima absorvância a 605 nm e é

coordenado com a cisteína; o tipo 2 (T2) não exibe sinal no visível e funciona como

aceitador de um electrão e o tipo 3 (T3) incorpora dois centros de cobre fortemente

acoplados, sendo responsável pela banda a 330 nm e funciona como aceitador de dois

electrões (Solomon et al., 1996). Diferentemente das outras oxidases de cobre, o quarto

ligante é substituído pela fenilalanina. Ela está organizada em três domínios arranjados

sequencialmente. A Figura 1.14 mostra a estrutura tridimensional da lacase obtida pelo T.

versicolor.

Figura 1.14 - Diagrama de da estrutura da lacase de Trametes versicolor. Os três domínios (T1, T2 e T3) estão mostrados a cores diferentes. Os átomos de cobre são as esferas azuis e a porção de hidrato de carbono são os modelos em bola-e-bastão. A parte cinzenta é o N-terminal e a verde o C-terminal. O sítio T1 é a esfera isolada. (Piontek et al., 2002).

30


1.3.3.2 Mecanismos de catálise da Lacase

A lacase catalisa a oxidação de uma variedade de substratos como os polifenois,

diaminas e alguns compostos inorgânicos. As reacções de oxidação com a lacase envolvem

a transferência de electrões de uma molécula para outra. Por outro lado, a lacase sozinha

não é capaz de oxidar compostos não fenólicos.

As reacções de catálise são feitas através da oxidação de um electrão do substrato

reduzido, com concomitante redução de quatro electrões do oxigénio a água (Leitner et al.,

2002). Embora o exacto papel da lacase na degradação da lenhina esteja por esclarecer,

tem-se provado que, na presença de mediadores, compostos não fenólicos da lenhina

podem ser degradados. O aceitador de electrões da lacase é o cobre e não a proteína. No

centro trinuclear de cobre, os eléctrons são transferidos para a água.

O mecanismo de reacção ainda não está, como referido, completamente

esclarecido. A partir de estudos espectrocópicos e de Ressonância Paramagnética

Electrónica (EPR) mostrou-se que a enzima é primeiro completamente reduzida, e então o

oxigénio é reduzido a duas moléculas de água juntamente com a formação de radicais

intermediários e que existem diferentes locais de ligação ao cobre. Os cobres T1 e T2 estão

envolvidos na captura e transferência electrónica (oxidações do substrato, por transferência

de electrão, ocorrem no T1) e o T2 e o T3 participam na ligação do oxigénio (Thurston,

1994; Call & Muck, 1997). A Figura 1.15 propõe um esquema de reacção.

O2 + 4H+ + 4e 2 H⎯⎯ →⎯Lacase2O

Figura 1.15 – Esquema de reacção da lacase com um substrato (Adaptado de Call & Muck, 1997).

31


As reacções típicas (de todas as oxidases azuis) podem ser descritas de acordo com

a seguinte reacção (1.1):

2 DH2+O2 2D+2H⎯⎯ →⎯Lacase

2O

4DH+O2→4D+2H2O (1.1)

Este tipo de reacção pertence aos fundamentos da biologia/bioquímica no

metabolismo do oxigénio (Call & Muck, 1997).

Uma reacção típica da lacase está apresentada na Figura 1.16 onde um difenol sofre

uma oxidação, com a perda de um electrão, para formar um radical livre. Esta espécie pode

ser convertida em quinona numa segunda catálise enzimática.

OH

OH OH

O

O

e- e-O .

Figura 1.16 – Uma reacção típica da lacase com um difenol (Adapado de Thurston, 1994).

Independentemente da sua origem, a lacase pode ser fortemente inibida por muitos

aniões que são capazes de interagir com os sítios de cobre como a azida, o cianeto e o

fluoreto. Os agentes complexantes removem o cobre do centro activo inibindo a actividade.

1.3.3.3 Aplicações da lacase

As aplicações práticas da lacase têm conduzido a um incremento da pesquisa nas

fontes produtoras da enzima, nomeadamente fungos da podridão branca, e no uso de

mediadores, que facilitam a acção catalítica do sistema. Basicamente, todas as aplicações

da lacase podem estar relacionadas com uma propriedade da enzima, que é a habilidade

para produzir um radical livre a partir de um substrato adequado. É conhecido durante as

32


últimas décadas que a lacase catalisa a oxidação directa de fenóis e aminas tais como os

clorofenóis e corantes, conforme descrito nos itens acima. Actualmente tem-se estudado a

degradação de compostos xenobióticos como os pesticidas e efluentes domésticos e

industriais.

A remoção da lenhina é um processo que tem desencadeado uma grande quantidade

de investigações, especialmente devido à sua importância na indústria da pasta do papel.

Para se aumentar a produção de etanol combustível, lacase obtida pelo T. versicolor

foi expressa em Saccharomyces cerevisiae de modo a aumentar a sua resistência à

inibidores fenólicos nos hidrolisados lenhinocelulósicos (Larsson et al. 2001).

Em análise de fármacos, um novo método baseado na lacase foi desenvolvido para

distinguir morfina de codeína em amostras de medicamentos (Bauer et al., 1999).

Lacase imobilizada tem sido utilizada com sucesso na remoção de fenóis da uva

branca para a clarificação de vinhos (Servili et al. 2000).

Em bioremediação, as enzimas de fungos tem-se mostrado muito eficazes na

degradação de uma variedade de poluentes ambientais. A lacase tem aumentado a

eficiência de processos de bioremediação (Gelo et al., 1999; Pointing, 2001) para a

degradação de triclorofenol (Leontievsky, 2000), alcenos (Niku & Viikari, 2000), efluentes

industriais (Fukuda et al., 2001), descoloração de pigmentos (Yesilada et al., 2003;

Zamora et al., 2003, Amaral et al., 2004; Blanquez et al., 2004; Couto et al., 2004a) e

degradação de herbicidas (Mougin et al.,2001).

1.3.3.4 Produção da lacase

A produção da lacase por microorganismos é uma característica de muitos

basidiomicetos, particularmente os associados à decomposição da madeira, entre eles o T.

versicolor. São muitos os factores que afectam a sua produção. Nomeadamente:

• concentração de inóculo;

• composição do meio de cultura;

• concentração e proporções relativas de carbono e nitrogénio;

• pH, temperatura, taxa de arejamento e agitação do meio de cultura;

• presença de indutor;

• aunsência de inibidores.

33


Para que a aplicação da lacase seja realizada com sucesso, é necessário que a sua

produção seja feita em grandes quantidades. Por isso, além de se estudar os factores

ambientais da produção, muitos autores têm considerado a adição de indutores ao meio de

cultura. O indutor pode ser o substrato da própria enzima ou um composto estruturalmente

análogo. No caso da lacase os compostos aromáticos são os mais promissores. Deste modo,

pode-se aumentar a produção da lacase numa grande variedade de fungos lenhinolíticos

pela indução por compostos como 2.5-xilidina, álcool veratrílico, ácido felúrico, guaiacol,

etanol, cobre e produtos secundários da indústria do papel como a xilidina e

lenhinosulfonados, entre outros.

O composto 2.5-xilidina tem sido o mais estudado e mais comum indutor da

produção de lacase. Quando comparado com álcool veratrílico em fermentação semi-sólida

por T. versicolor, xilidina mostrou ser um melhor indutor (Couto et al., 2002). Um outro

estudo desenvolvido com T. versicolor em fermentador “air lift” comparou a adição de

xilidina, etanol e álcool veratrílico na produção da lacase e mostrou que todos os indutores

aumentaram a produção enzimática, entretanto a xilidina apresentou melhores resultados

de actividade enzimática (cerca de 1500U/L), com um aumento de 14 vezes em relação ao

controlo (nenhum indutor adicionado ao meio) (Rancaño et al., 2003). A indução por

etanol e álcool veratrílico apresentou um menor aumento na actividade da lacase, não

passando de 400 U/L. Bollag & Leonowicz (1984) também verificaram que a xilidina

estimulou a produção de lacase em Fomes annosus, Pholiota mutabilis, Pleurotus

ostreatus e T. versicolor. Com o fungo T. modesta, a adição de xilidina, entre muitos

indutores testados, foi a que conduziu a maiores actividades enzimáticas (Nyanhongo et

al., 2002). A adição de ABTS juntamente com xilidina na produção de lacase por Trametes

sp. mostrou ser um indutor mais eficiente, com um aumento na actividade de 3.59 vezes

em relação ao controlo, enquanto que a xilidina sozinha apresentou um aumento de 2.84

vezes (Jang et al., 2002). A indução da produção da lacase por Pycnoporus cinnabarinus

com lenhinosulfonatos e álcool veratrílico aumentou a actividade em cerca de 2 a 3 vezes

enquanto que o guaiacol não apresentou nenhuma indução. Obteve-se um aumento de 9

vezes na actividade da lacase quando se empregou xilidina como indutor e não se observou

nenhuma alteração na estrutura da lacase (Eggert et at. 1996).

A introdução de álcool veratrílico em diferentes meios de cultura aumentou a

produção da lacase desde 1.6 até 16 vezes em diferentes fungos utilizados. Similarmente a

34


adição de guaiacol aumentou a produção enzimática até 38 vezes. Entretanto, a maior

produção de lacase foi obtida com a adição de “preparados de lenhinha” (indulina AT,

polifom, reax e lenhinosulfonato) com um aumento na produção até 100 vezes com o

fungo Phlebia floridensis (Arora & Gill, 2000). A adição de pirogalol ao quarto dia da

fermentação com T. versicolor aumentou em 3 vezes a produção da lacase (Osiadacz et al.,

1999). A adição de álcool veratrílico aumentou 10 vezes a produção da lacase pelo fungo

do género Trametes (Mansur et al., 1997)

Como a lacase é uma enzima que contém cobre, estudos têm mostrado que a sua

adição ao meio de cultura, aumenta a produção da enzima. Giardina et al. 1999,

observaram que a adição de sulfato de cobre ao meio de cultura de P. ostreatus aumentou a

actividade da enzima e que este aumento foi proporcional à quantidade de cobre

adicionado, atingindo um valor máximo com 150 µM de sulfato de cobre. Outro estudo,

também com P. ostreatus, mostrou um aumento de 8 vezes na actividade da lacase com a

adição de cobre (1mM) ao meio de cultura (Baldrian & Gabriel, 2002). Com o fungo

Trametes, o cobre induziu produção da lacase nas seguintes espécies: T. versicolor (Collins

& Dobson, 1997), T. pubescens (Galhaup & Haltrich, 2001; Galhaup et al. 2002a), T.

modesta (Nyanhongo et al., 2002) e T. hirsuta (Couto et al., 2004b).

Como todos os fungos, os fungos filamentosos são heterotróficos. Isto significa que

eles necessitam de compostos orgânicos como fonte de carbono e de energia, embora

alguns casos indiquem que alguns fungos filamentosos possam fixar dióxido de carbono

(Papagianne, 2004). Deste modo, a composição do meio de cultura também é um factor

importante na produção da lacase. Jang et al. (2002) estudaram o efeito das seguintes

fontes de carbono: glucose, glicerol, xilose, dextrana e verificaram que a glucose foi a

melhor fonte de carbono para a produção de lacase por Trametes sp. Nyanhongo et al.

(2002) avaliaram diferentes concentrações de glucose na produção da lacase por T.

modesta e observaram que a concentração ideal foi de 0.87 g/L e que concentrações acima

de 1 g/L inibem a sua produção.

Outro importante factor na produção da enzima é o pH do meio de cultura. Ele

pode afectar a actividade e estabilidade da enzima (O’Callaghan et al. 2002). A maioria

dos fungos tolera o pH num intervalo alargado de 4-9, enquanto que a enzima é mais

sensível as variações do pH (Papagianne, 2004). A maior parte das enzimas extracelulares

são produzidas em maiores quantidades a pH próximo do pH ótimo da sua actividade.

35


Jonsson et al. (1997) mostrou que o meio de crescimento tamponado em pH 6.0 foi

necessário para se obter actividade de lacase em culturas líquidas durante o cultivo de

Pichia pastoris e que a manutenção do pH foi extremamente importante para a produção

de altas concentrações de lacase. Outro estudo mostrou que o pH inicial do meio cultura de

Trametes sp. afectou a produção da lacase. Dos diferentes valores de pH testados (de 3 a

9), o pH de 4.5 foi encontrado como o óptimo (Jonsson et al. 1997) enquanto que para T.

modesta o pH ideal foi de 6.9 (Nyanhongo et al. 2002).

Em fermentações submersas, a agitação é importante para se obter uma boa mistura

do meio evitando limitações na transferência de massa e de calor. Em processos aeróbicos,

a mistura é necessária para se garantir uma suficiente transferência de oxigénio.

1.3.4 Produção industrial de enzimas

A produção industrial de enzimas faz-se principalmente pelo processo de

fermentação submersa (em meio líquido), que envolve o crescimento de microorganismos

num meio rico e com elevadas concentrações de oxigénio. Actualmente este é o método

mais divulgado. Devido ao desenvolvimento de tecnologias de fermentação em grande

escala, a produção de enzimas microbianas representa uma parcela significativa nas

indústrias de biotecnologia. As fermentações em meio líquido podem ser divididas em

diversas fases nomeadamente: preparação de inóculo, formulação do meio de cultura e

condições de fermentação. Os processos mais utilizados para a produção são o processo de

fermentação em contínuo e o processo em “feed batch”. Parâmetros operacionais como

temperatura, pH, taxa de alimentação, consumo de oxigénio e formação de dioxido de

carbono são medidos e controlados para optimizar o processo de fermentação. O primeiro

passo para a remoção da enzima do meio é a remoção das células, que normalmente é feito

por centrifugação ou microfiltração. A maioria da enzimas industriais são extracelulares e

permanecem no meio fermentado após a remoção da biomassa. A enzima remanescente é

concentrada por evaporação, filtração por membrana ou cristalização, dependendo da sua

aplicação, e comercializada.

Por outro lado, as enzimas também podem ser produzidas por fermentações em

estado sólido. As fermentações de substratos sólidos ocorrem em materiais insolúveis em

água. O mais tradicional processo para a produção de enzimas é o Koji, que foi

desenvolvido a partir da arte oriental de fermentação de grãos de cereais e de soja, por

36


fungos. Apresenta como vantagens a simplicidade, a redução nos custos energéticos e no

volume do fermentador, facilidade em arejamento e a pequena quantidade de água usada

permite a obtenção de metabólitos de forma concentrada, tornando a recuperação dos

mesmos mais rápida e económica. Entretanto, apresenta os seguintes incovenientes:

lentidão, dificuldade em dissipar energia, em controlar a homogeneidade e parâmetros de

funcionamento e de operação contínua (Pereira, 1996). Estudos mais recentes (Schutyser et

al., 2003) mostram a utilização de modelos matemáticos para uma melhor tranferência de

calor e melhor distribuição de água por pulverização está a ser desenvolvido.

1.4 Polissacarídeos produzidos por fungos

Na medicina tradicional do Este Asiático têm-se usado diversos fungos com

propriedades medicinais. Modernas práticas clínicas, desenvolvidas nos países asiáticos,

aplicam preparados a partir de fungos. Os efeitos terapêuticos têm sido demonstrado para

muitos fungos tais como: Favolus alveolarius, Phellinus linteus, Agaricus campestris,

Pestalotiopsis sp., Lentinus edodes, Pleurotus ostreatus, Tricholoma sp., T. versicolor

entre outros (Cui & Chisti, 2003). Das terapêuticas com base nos fungos, os

polissacarídeos obtidos a partir do fungo T. versicolor já se encontram comercializados.

Ambos os polissacarídeos, intracelular e extracelular, de T. versicolor são fisiologicamente

activos (Cui & Chisti, 2003). Nas práticas medicinais da China e do Japão, o fungo T.

versicolor é colhido, seco, triturado e utilizado como chá. As propriedades de cura do

extracto de T. versicolor foram noticiadas por cientistas Japoneses e Chineses e deste modo

iniciou-se um extensivo controlo nas investigações clínicas do extracto de T. versicolor.

Os compostos primários activos produzidos por T. versicolor são polissacarídeos

ligados a proteínas, também chamados de glicoproteínas, os quais são constituídos por

glucanas β-(1→4) com quantidades menores de glucanas β-(1→3) e β-(1→6). Essas

glicoproteínas são de difícil extracção, de onde a maioria dos produtos comercialmente

disponíveis no mercado contém apenas cerca de 1-2% destes polissacarídeos com

excepção do Coriolus VPS (JHS Natural Products) que contém cerca de 34%.

37


1.4.1 Polissacarídeos

Os polissacarídeos são macromoléculas complexas de hidratos de carbono,

formadas por milhares de unidades monossacarídicas ligadas entre si por ligações

glicosídicas, unidas em longas cadeias lineares ou ramificadas (polímeros de açúcares).

Estas ligações são formadas pela eliminação de moléculas de água entre o grupo hidroxilo

hemiacetil de um resíduo e um grupo hidroxilo primário ou secundário do resíduo

adjacente (Sutherland, 1985). Os polissacarídeos possuem duas funções biológicas

principais: como constituíntes de reserva e como elementos estruturais. Eles diferem entre

si nas unidades de monossacarídeos que os constituem, no comprimento da cadeia e no

grau de ramificação. São classificados como homopolissacarídeos, quando constituído por

um só tipo de unidade monomérica, e de heteropolissacarídeo, quando são constituídos por

duas ou mais unidades monoméricas diferentes.

Os polissacarídeos são caracterizados em termos de composição (tipo e quantidade

dos monómeros), estrutura primária (disposição dos monómeros e tipo de ligações química

entre eles), média da massa molecular relativa (Mr) e tipo e disposição dos substituintes.

Estes parâmetros determinam as propriedades funcionais dos polissacarídeos tais como

solubilidade em água, viscosidade e comportamento Newtoniano (Dumitriu, 1998).

A unidade monossacarídica predominante na estrutura dos polissacarídeos é a D-

glucose, seguido por D-manose, D-frutose, D e L-galactose, D-xilose, D-arabinose, D-

glucosamina, D-galactosamina, D-ácido glucurónico, N-acetil ácido murámico e N-acetil

ácido neuraminico (Dumitriu, 1998).

Os monossacarídicos podem formar uma variedade de estruturas lineares ou

ramificadas, conterem um número pequeno ou grande de resíduos monossacarídicos e

serem homogéneos ou heterogéneos. A Figura 1.17 mostra alguns desses monómeros e a

Figura 1.18 mostra a unidade do monómero de α-D-glucose e β-D-gucose.

O grupo dos glucanos, polímeros formados por moléculas de glucose, é o mais

abundante dentro dos polissacarídeos, pois inclui a celulose, o amido, o glicogénio e

muitas outras macromoléculas produzidas pelos seres vivos. A unidade básica do β-

glucano é a uma estrutura repetida de glucose ligada por ligações beta (β) formando uma

cadeia linear. As ligações vão desde carbono 1 da molécula de glucose ao carbono 3 da

próxima (β-(1→3)), do carbono 1 ao carbono 4 (β-(1→4)) ou do carbono 1 ao carbono 6

(β-(1→6)). A maioria apresenta na cadeia principal as ligações β-(1→3), β-(1→4) ou

38


mistura β-(1→3), β-(1→4) com β-(1→6) nas cadeias laterais. A estrutura básica repetitiva

de um β-glucano com cadeias laterais β-(1→6) está mostrada na Figura 1.19.

Nos polissacarídeos de fungos, os β-glucanos mais importantes são os β-(1→3)-

glucanos com cadeias laterais β-(1→6). Além destes, muitos outros tipos de

polissacarídeos podem ser sintetizados por fungos, tais como outras estruturas de β-

glucanos, α−glucanos, mananos, galactanos, fosfogalactanos e vários heteropolímeros com

manose ou galactose na cadeira principal (Karnezis et al., 2000).

Figura 1.17 – Representação de alguns monómeros de polissacarídeos

Figura 1.18- Representação dos monómeros de α e de β D- glucose

Figura 1.19 – Diagrama molecular de um D-glucano de origem fúngica. Representação das ligações glicosídicas (1→4) com ramificações (1→6).

39


Os polissacarídeos podem apresentar ligações a vários outros componentes

químicos, como lipídeos, formando os lipopolissacarídeos, ou proteínas, formando as

glicoproteínas (associação covalente de glucanos a proteínas, sendo a cadeia principal da

molécula constituída de proteína) e proteoglicanos (cadeia principal constituída de

glucanos e ligações com proteínas). Os tipos de ligações entre os monómeros, a variação

de composição, tipo e quantidade de ramificações, influenciam na estrutura secundária e

terciária dos polissacarídeos determinando suas propriedades físicas e, consequentemente,

suas actividades biológicas (Daba & Ezeronye, 2003).

Devido à capacidade de certos polissacarídeos em formar géis, eles são utilizados

em diversos sectores industriais, como o alimentar, farmacêutico, cosmético, químico,

têxtil e petrolífero, na função de emulsificantes, texturizantes, estabilizantes, espessantes,

controladores da formação de cristais de gelo, agentes gelificantes e coagulantes,

lubrificantes, entre outros (Sutherland, 1990).

Nas últimas décadas, vários polissacarídeos têm apresentado efeitos biológicos

como propriedades anti-inflamatórias, imunoestimulante, antitrombótica, antidiabética e

como protector às infecções. O primeiro polissacarídeo apresentado como tendo actividade

biológica foi o que continha β-(1→3)-glucanos. O primeiro teste foi feito em 1969 onde a

utilização deste polissacarídeo em tumores transplantados fez com que o tumor parasse de

crescer (Paulsen, 2002).

Os polissacarídeos de origem fúngica podem ser extraídos do corpo frutífero, do

micélio e do caldo fermentado por fungos, podendo variar a composição química,

estrutural e a actividade antitumoral (Mizuno et al., 1995). A maioria dos polissacarídeos

produzidos por basidiomicetos e com actividade antitumoral são o β-(1→3)-D-glucanos,

também chamados de “pleuran” (Nosál’ová et al., 2001).

A acção antitumoral dos β-(1→3)-D-glucanos parece estar relacionada com a

conformação de tripla hélice da cadeia (a estrutura em hélice é mantida pelas ligações de

hidrogénio, Figura 1.20), com a razão entre o número de ramificações e com o

comprimento da cadeia. Por esta razão nem sempre os β-glucanos presentes em fungos

apresentam actividade antitumoral (Paulsen, 2002). Os β-glucanos apresentam diferentes

modos de acção quando comparados com as terapias convencionais, inibindo o

crescimento das células cancerígenas e reforçando o sistema imunitário. As diferenças na

actividade podem também estar relacionadas com a habilidade da molécula do

40


polissacarídeo em se solubilizar na água, tamanho da molécula e forma das ramificações.

No etanto, alguns β-glucanos insolúveis em água, solúveis em soluções alcalinas diluídas,

apresentam uma importante actividade antitumoral (Bohn & BeMillar, 1995).

Unidades de glucose

Ligações glicosídicas

Ligações de H

Figura 1.20 - Conformação de tripla hélice da cadeia de β-(1→3)-D-glucanos.

As proteínas ligadas aos glucanos apresentam um maior potencial imunológico do

que os correspondentes glucanos (Daba & Ezeronye, 2003)

De acordo com Gutiérrez et al. (1996), existe uma correlação entre os

polissacarídeos componentes da parede celular, ou seja, os extraídos do corpo frutífero,

com os polissacarídeos extracelulares produzidos por fungos. Verificou-se que os

polissacarídeos extraídos do corpo frutífero apresentaram os mesmos tipos de monómeros

e de ligações que os dos polissacarídeos extracelulares obtidos em cultura submersa,

havendo, no entanto, alguma variação na proporção dos tipos de ligações presentes nos

biopolímeros.

Vários efeitos fisiológicos têm sido descritos com o uso dos polissacarídeos de T.

versicolor. Alguns dos principais efeitos são: efeitos imunosupressivos da quimioterapia,

radioterapia e transfusão de sangue; antagonização da imunosupressão induzida por

tumores; inibição da proliferação de vários tipos de cancro; aumento do apetite e de

funções vitais; acalmia do sistema nervoso central entre outras. Em adição esses

polissacarídeos podem curar os dessarranjos intestinais e também beneficiar a terapia de

infecções microbianas que enfraquece a resposta imunológica.

41


1.4.2 Produção de Exopolissacarídeos

O termo exopolissacarídeo (EPS) é utilizado para designar os polissacarídeos que

se encontram exteriores à célula ou livres no meio circundante. Os monossacarídeos mais

comumente encontrados nos EPSs são D-glucose, D-galactose, D-manose, L-fucose e L-

ramnose (Rosado et al. 2003). Os EPSs microbianos oferecem várias vantagens como a

possibilidade de uma produção controlada, velocidade e rendimento elevados, maior

pureza e consistência na composição, conduzindo a produtos específicos. Eles podem ser

utilizados como emulsificantes, estabilizantes, agentes formadores de géis, adsorventes

selectivos e como aditivo no controlo reológico. Apesar do elevado custo de produção são

utilizados comercialmente na indústria alimentar, na medicina e na indústria do petróleo

(Dumitriu, 1998).

A biossíntese dos exopolissacarídeos produzido por fungos é ainda pouco

conhecida. Karnezis et al. (2000) em uma revisão sobre a síntese de β-glucanos,

verificaram que a maioria dos exopolissacarídeos isolados de fungos são β-glucanos e que

a biossíntese envolve uma série de reacções: iniciação, alongamento da cadeia e

ramificação. A etapa de alongamento é a mais estudada e é catalisada por uma glucano-

sintetase cujas propriedades são específicas para cada espécie de fungo.

Os polissacarídeos comercializados de T. versicolor são extractos de cogumelos ou

micélio cultivado em substrato sólido (Yadav & Tripathi, 1991) ou micélio produzido em

fermentações submersas (Ng, 1998; Kim et al., 2002a; Cui & Chisti, 2003). Os mais

importantes polissacarídeos que já estão aprovados clinicamente são o polissacaropeptídeo

Krestin (PSK) e o polissacaropeptídeo PSP. Ambos são obtidos a partir do micélio

cultivado em fermentações submersas. Em alguns casos, utilizou-se o micélio formado na

superfície de meio líquido estático, para extrair-se os compostos activos, no entanto este

tipo de cultura não é satisfatória, em termos de rendimento, para a sua produção comercial

(Cui & Chisti, 2003).

Normalmente utiliza-se a glucose ou a sacarose como fonte de carbono nas

fermentações submersas, entretanto estudos com outras fontes de carbono alternativas têm

sido realizados. Num estudo comparativo entre a sacarose e a maltose encontrou-se uma

diferença significativa na produção de um EPS durante o cultivo de Paecilomyces

japonica. A concentração máxima de EPS foi encontrada no meio com maltose, enquanto

42


que a máxima concentração de biomassa apresentou um comportamento inverso (Bae et al.

2001). Kim et al. (2002b) estudou o efeito de nove fontes de carbono e verificou que a

sacarose apresentou-se como sendo a melhor fonte de carbono na produção de EPS por P.

sinclairii.

As fontes de nitrogénio incluem a peptona, o extracto de levedura, a farinha de

amendoim e uréia. Os fosfatos são usados para tamponar o meio e o sulfato de magnésio é

normalmente o único nutriente inorgânico adicionado. As fermentações são normalmente

realizadas entre 24-28ºC sob condições aeróbicas. O pH na maioria das vezes não é

controlado durante o cultivo.

Em culturas submersas, as condições favorecem um tipo de morfologia, e as

condições hidrodinâmicas apresentam um papel importante. A cultura miceliar de T.

versicolor tende a ser altamente viscosa devido aos filamentos da biomassa em suspensão e

aos polímeros extracelulares dissolvidos no meio. Neste tipo de cultivo, muitos fungos

filamentosos podem crescer como micélios livres ou como pellets e a forma do

crescimento é determinada por diversos factores tais como: meio de crescimento,

concentração do inóculo e condições físicas (Sinha et al. 2001 a). A agitação do meio de

cultura apresenta uma variedade de efeitos nos fungos, que podem incluir a ruptura da

parede celular, mudanças na morfologia, variação na eficiência e taxa de crescimento e

variação na taxa de formação do produto desejado. Park et al. (2002) estudaram o efeito da

intensidade de agitação no crescimento miceliar e na produção de um exobiopolímero por

Cordyceps militaris e observaram que a maior agitação estudada (300 rpm) não favoreceu

a produção do exobiopolímero e sim a produção miceliar. Um aumento na produção foi

obtido quando uma agitação de 150 rpm foi empregue.

Durante a excreção do EPS, a mudança na reologia do cultivo é uma consequência

directa da formação do produto. Um aumento na viscosidade ocorre com o aumento da

concentração do EPS. Durante a produção do EPS, o meio de cultivo desenvolve

características não-Newtonianas e pode-se apresentar como um fluido pseudoplástico, onde

a viscosidade diminui com o aumento da tensão de corte. Estas características resultam em

mudanças no comportamento microbiano e formação do produto devido à falta de

homogeneidade em termos de mistura, oxigenação, e transferência de massa e de calor

durante a fermentação. Devido a estas condições, a qualidade dos polissacarídos poderá ser

43


heterogénea, ou seja, mudanças no tamanho da cadeia, nas ramificações e na reologia

(Dumitriu, 1998).

1.4.2.1 Processo de recuperação de exopolissacarídeos de origem microbiana

A recuperação de exopolissacarídeos de microorganismos é importante na

determinação dos custos de produção e das suas propriedades físico-químicas. Os

principais passos na obtenção de EPS produzido por fermentação são a extracção,

precipitação e purificação. O passo limitante no processo de recuperação do EPS é a

separação das células do meio fermentado devido à grande viscosidade do meio

fermentado e ao grau de associação do EPS às células (Ex. Cápsula) (Dumitriu, 1998).

A maioria dos polissacarídeos comerciais de T. versicolor usam somente o

polímero intracelular recolhido do cogumelo ou do micélio produzido em culturas

submersas. O cogumelo contém aproximadamente 59% dos polissacaropeptídeos em peso.

A biomassa miceliar contem cerca de 30% em peso seco. Entretanto, a composição deste

polissacarídeo é dependente do método de recuperação usado. A sua extracção com água

quente parece ser necessária para se remover os polímeros activos em quantidade

suficiente para uso comercial. Tipicamente, a biomassa é extraída com água quente e o

extracto obtido é concentrado por evaporação sob vácuo ou ultrafiltração. O concentrado é

então precipitado com sulfato de amónio ou álcool. Os precipitados são redissolvidos,

dializados e podem posteriormente ser purificado por métodos de cromatografia. A solução

do produto purificado é concentrada e seca num secador spray. A remoção de substâncias

de baixo peso molecular é importante uma vez que essas substâncias além de não

apresentarem actividade fisiológica, conferirem um odor desagradável ao produto final.

O processo típico de recuperação de glicoproteínas está mostrado na Figura 1.21. A

sua recuperação dá- se por agitação do micélio com água destilada a 98ºC durante cerca de

3h. O extracto é então concentrado por evaporação. A solução concentrada é saturada com

sulfato de amónio para a precipitação do polissacaropeptídeo. O precipitado é dissolvido

em água e dessalgado por diálise. Esta solução é concentrada a 5% do volume original.

Uma segunda precipitação com sulfato do amónio é realizada. O precipitado final é

dessalgado, dissolvido em água e purificado por cromatografia. Mais uma precipitação

44


com sulfato do amónio é feita e então o precipitado dessalgado é concentrado e seco num

secador spray (Cui & Chisti, 2003).

Trametes versicolor

(Micélio ou cogumelo)

Diálise Precipitação com sal (sulfato de amónio)

Pequenas moléculas

Biomassa Extracções múltiplas

(água, 80-98ºC)

Concentração (ultrafiltração, evaporação)

Precipitação com álcool (etanol)

Precipitado (polissacarídeo bruto)

Dissolução (água)

Extracções múltiplas (água, 80-98ºC)

Diálise

Cromatografia (opcional)

Concentração Secagem

(Spray-dry)

Pequenas moléculas (resíduos)

Figura 1.21 – Opções de recuperação e purificação de polissacarídeos de Trametes versicolor

(Adaptado de Cui & Chisti, 2003)

45


1.4.3 Compostos comercializados

Os compostos comerciais obtidos a partir dos polissacarídeos de T. versicolor são o

polissacaropeptídeo (glicoproteína), PSP e o polissacaropeptídeo Krestin, PSK. Ambos

polissacarídeos são obtidos a partir da extracção do micélio de T. Versicolor, são

respectivamente produtos Japonês e Chinês. Eles apresentam actividade fisiológica similar

mas estruturalmente são diferentes. PSK e PSP são produzidos a partir das linhagens CM-

101 e Cov-1 de T. versicolor, respectivamente. Estes compostos são produzidos em

fermentações descontínuas. O tempo de fermentação do PSK é de 10 dias, enquanto que a

produção do PSP é de 64h. PSK é recuperado através da extracção da biomassa com água

quente e sulfato de amónio enquanto que o PSP é recuperado por precipitação alcoólica a

partir do extracto obtido com água quente.

PSK foi comercializado pela Kureha Chemicals, Japão. Após extensivos testes

clínicos, o PSK foi aprovado para uso no Japão em 1977, e em 1985 foi considerado o

décimo nono da lista dos produtos comercializados com mais sucesso no mundo. Ele é

uma mistura de polissacarídeos ligados covalentemente a proteínas. A análise elementar do

PSK mostrou, aproximadamente, a seguinte composição: oxigénio 47.5%, carbono 40.5%,

hidrogénio 6.2% e nitrogénio 5.2%. O extracto pulverizado tipicamente contém 34–35% de

hidrato de carbono solúvel (91– 93% β-glucana), 28–35% proteína, ∼7% humidade, 6–7%

cinzas, e os resíduos são açúcares livres e amino ácidos. D-glucose é o principal

monossacarídeo presente além de fucose, galactose, manose e xilose. Apresenta ligações

glicosídicas α-1,4 e β-1,3 na porção do polissacarídeo (Cui & Chisti, 2003).

O PSP apareceu no mercado cerca de 10 anos após o PSK. PSP é usado para

estimular as funções de imunidade antes ou após aos tratamentos operatórios de cancro e

para auxiliar a imunidade durante o tratamento do cancro. D-glucose é o principal

monossacarídeo presente, no entanto também existem raminose e arabinose. A porção

polissacarídica é altamente ramificada. A Figura 1.22 mostra o produto PSP

comercializado.

46


Figura 1.22 – PSP comercializado pela JHS Natural Products.

O Coriolus VPS é um produto de T. versicolor também comercializado pela JHS

Natural Products e é utilizado na América do Norte. Quando comparado com outros

produtos, tem uma maior concentração de polissacarídeos activos. A Figura 1.23 mostra o

produto comercializado. Segundo a JHS Natural Products, o Coriolus VPS contém

compostos mais valiosos e mais difíceis de se obter, encontrados na parede e no micélio de

T. versicolor (JHS Natural Products, 2005).

Figura 1.23 - VPS comercializado pela JHS Natural Products.

47


1.5 – Planeamento de experiências e modelação matemática

1.5.1 Planeamento factorial a dois níveis

O planeamento de experiências é uma ferramenta importante para se determinar

quais os factores (variáveis) que são importantes num determinado processo, assim como

os seus limites inferior e superior e as suas interacções, obtendo-se informações relevantes

para a optimização deste processo.

No planeamento de experiências muitos factores podem ser variados

simultaneamente, de acordo com um plano experimental. Através dele, podem-se

determinar os factores que exercem maior influência no desempenho de um determinado

processo. Existem muitas vantagens do planeamento de experiências quando comparado

com outras aproximações estatísticas, como sejam:

Habilidade de detectar e estimar as interacções dos factores em estudo;

Possibilidade de reduzir o número de testes necessários para se obter informações

suficientes;

Redução no tempo e custo do processo;

Melhoria do processo.

Quando o objectivo principal é optimizar o sistema, ou seja maximizar ou minimizar

algum tipo de resposta, uma técnica conveniente a ser utilizada é a metodologia de

superfícies de resposta (MSR).

Os métodos estatísticos requerem que as observações sejam variáveis aleatórias

distribuídas independentemente, portanto as experiências devem ser realizados de modo

aleatório. Qualquer planeamento começa com uma série inicial de experiências com o

objectivo de definir os factores e os níveis importantes. Podem-se ter factores qualitativos

(tipo de equipamento, operador, catalisador, etc.) e quantitativos (temperatura,

concentração, pH do meio, etc.). Os resultados devem ser analisados e devem introduzir-se

modificações no planeamento experimental quando necessário. Antes de se iniciar as

experiências, os objectivos e os critérios devem estar bem estabelecidos, de modo a

permitir a escolha dos factores envolvidos, a faixa de variação dos factores, os níveis

escolhidos dos factores e a variável da resposta (Calado & Montgomery, 2003).

48


O planeamento factorial é uma técnica muito utilizada quando se tem dois ou mais

factores independentes. Ele permite uma combinação de todos os factores a todos os

níveis, obtendo-se uma análise de um factor, sujeito a todas combinações. Esta técnica é

importante para se medirem os efeitos, de um ou mais factores, na resposta de um

determinado processo. O usual é realizar um planeamento com dois níveis (um limite

máximo e um mínimo) no máximo de três níveis, uma vez que mais factores aumentariam

em demasiado o número de pontos experimentais, facto esse que se quer evitar quando se

deseja realizar um planeamento. O planeamento factorial é a única maneira de prever a

interacção entre os factores estudados. A primeira coisa a fazer num planeamento factorial

é determinar quais são os factores e as respostas de interesse para o sistema que se deseja

estudar. Dependendo do problema pode haver mais do que uma resposta de interesse.

Eventualmente essas repostas também podem ser qualitativas.

Um planeamento factorial requer a execução de experiências para todas as

possíveis combinações dos níveis dos factores. A representação de um planeamento

factorial em dois níveis é 2k, onde 2 significa o número de níveis e k o número de factores.

Por exemplo: um planeamento factorial com três factores é um 23 ou seja, 2×2×2 = 8

experiências. Um planeamento factorial com apenas dois factores é um 22 ou seja, 2×2 = 4

experiências.

Este tipo de planeamento é de grande utilidade na investigação preliminar, quando

se deseja saber se determinados factores têm ou não influência sobre a resposta. São

planeamentos simples de se executar e podem ser ampliados, quando se quer conhecer

melhor a relação funcional existente entre a resposta e os factores.

1.5.1.1- Cálculo dos principais efeitos e interacções

O efeito principal de um factor1 (F1), no caso de um planeamento factorial 22 (2

factores), é por definição a média dos efeitos (resposta) deste factor1 (nível superior e no

nível inferior) nos dois níveis do factor2 (F2). Sendo y1 a resposta observada no i-ésimo

ensaio, podemos escrever o efeito de F1 como:

F1 = (1/2) ((y2 - y1) + (y4 – y3)) (2.2)

onde

49


y1 = resposta de F2 (no nível superior) no nível inferior de F1 (+,-) y2 = resposta de F2 (no nível superior) no nível superior de F1 (+,+) y3 = resposta de F2 (no nível inferior) no nível inferior de F1 (-,-) y4 = resposta de F2 (no nível inferior) no nível superior de F1 (-,+) O resultado mostra que a resposta pode aumentar ou diminuir em X valores quando

F1 passa de seu nível inferior para seu nível superior.

Se não houvesse interacção, o efeito do F1 seria o mesmo para os dois níveis do F2.

Quando as respostas de F1 são diferentes nos dois níveis de F2, significa que ocorre

interacção entre os dois factores. O efeito da interacção é dado por F1 × F2 e é dado por:

F1 × F2 = (1/2) ((y4 – y3) - (y2 - y1)) (2.3)

As equações 2.2 e 2.3 mostram que tanto os efeitos principais quanto o efeito das

interacções são calculados utilizando-se todas as respostas observadas. Cada um dos

efeitos é a diferença de duas médias. Metade das observações pertence a uma das médias,

enquanto a metade restante aparece na outra média. Não há portanto informações ociosas

no planeamento de experiências. Essa é uma importante característica nos planeamentos

factoriais a dois níveis (Neto et al., 1995)

1.5.1.2 Metodologia de superfície de resposta

A metodologia de superfície de resposta é uma técnica de optimização baseada no

emprego de planeamento factorial. É utilizada quando as variáveis de resposta são

influenciadas por muitos factores independentes e o objectivo é optimizar essas respostas.

A primeira etapa no uso da metodologia de resposta é determinar a relação

matemática entre a variável de resposta e os factores independentes. A primeira etapa é

constituída pela modelação, normalmente feita ajustando-se modelos lineares ou

quadráticos a resultados obtidos a partir de planeamentos experimentais factoriais. O

deslocamento dá-se sempre ao longo do caminho de máxima inclinação de um

determinado modelo, trajectória na qual a reposta varia de forma mais pronunciada.

A relação mais simples é uma recta. Se esse polinómio de menor grau se ajustar

bem a resposta, então a função será dada por um modelo chamado de modelo de primeira

ordem ou linear:

50


Y = β0 + β1x1 + β2x2 + ... + βkxk (2.4)

onde β são as estimativas dos parâmetros do modelo e x representam os factores

codificados.

O procedimento do uso de superfícies de resposta é sequencial, isto é, quando se

está longe do ponto óptimo de resposta, o modelo de primeira ordem ajusta-se bem aos

dados. No entanto, quando se quer determinar um ponto óptimo deve-se procurar uma

estratégia operacional que leve a isso. Quando se encontra a possível região de óptimo, o

modelo de segunda ordem deve ser adoptado. Se houver uma curvatura no sistema então

um modelo de segunda ordem ou seja, quadrático deve ser utilizado, e a expressão geral

para dois factores será:

Y = β0 + β1x1 + β2x2 + β11x12 + β22x2

2 + β12x1x2 (2.5)

Na metodologia de superfícies de resposta o número de variáveis não é uma

restrição nem o número de respostas. Esta metodologia pode ser aplicada a qualquer

número de factores independentes e pode modelar simultaneamente várias respostas. Esta

característica é importante em muitas situações práticas, principalmente na indústria onde

vários critérios têm de ser satisfeitos ao mesmo tempo (Neto et al., 1995).

1.5.2 Modelação matemática

Modelos matemáticos são uma ferramenta útil para a optimização da produção e

aumento de escala de bioreactores, devido à quantidade de informações quantitativas sobre

o rendimento e produtividade da biomassa e produtos. Também desempenham um papel

importante na síntese e projecto de sistemas de controlo, além de poderem ser utilizados

em simulação do processo.

Os modelos não estruturados constituem uma classe de modelos onde não há

qualquer interesse de descrição da estrutura da população a modelar. No caso de uma

população microbiana, nada é dito acerca da composição ou qualidade da biomassa. O

crescimento é expresso unicamente como sendo o aumento da biomassa. Esse tipo de

modelos é usado na descrição de fenómenos de crescimento, em que num dado intervalo

51


de tempo, todas as propriedades extensivas aumentem com o mesmo factor (Takamatsu et

al., 1981).

Utiliza-se modelo estruturado quando a composição da população celular muda

significativamente e que esta mudança infuencia na cinética de crescimento. No caso da

biomassa, esta é compartimentada em pequenos números de componentes. Às vezes estes

componentes podem ser um componente sintético (ARN e percursores) e um componente

estrutural (ADN e proteínas) ou então um componente assimilatório e um componente

sintético (Bailey & Ollis, 1986).

Num modelo descritivo, utiliza-se um ajuste numérico de dados experimentais para

fins interpolativos. Deve ser usado somente dentro da região onde o modelo foi testado

experimentalmente. Um modelo preditivo tem como finalidade a extrapolação de dados.

Existem diferentes tipos de modelos matemáticos para microrganismos filamentosos

descritos na literatura. Normalmente, os modelos envolvem a taxa específica de

crescimento (µ) como uma função da concentração de substrato (S), produto (P) e

biomassa (X). Os modelos descrevem a conversão de substratos em produtos através das

concentrações conhecidas dos metabólitos. Em muitos processos, a formação do produto

está relacionada com o crescimento da biomassa através da equação de Luedeking–Piret ou

suas modificações.

Crescimento e formação de produtos de fungos filamentoso estão associados num

processo complexo e não completamente esclarecido. A estrutura multicelular do micélio,

a heterogeneidade morfológica e diferenças no comprimento da hifa ao longo da

fermentação fazem com que se torne difícil construir modelos matemáticos para

fermentações de fungos. Levando-se em conta estas variações no estado da biomassa,

características estruturais devem ser adicionadas nos modelos de crescimento e formação

de produto (Papagianni, 2004).

1.5.2.1 Cinética de crescimento microbiano

Vários modelos cinéticos têm sido descritos para o crescimento de fungos

filamentosos incluindo linear, exponencial, logístico e rápida-aceleração/lenta-

desaceleração no crescimento. As curvas típicas destes modelos estão mostradas na Figura

52


1.24. As equações que descrevem estes modelos estão apresentadas na Tabela 1.2 (Ikasari

& Michell, 2000).

Bio

mas

sa

fase lag Tempo

Figura 1.24 – Vários perfis cinéticos de crescimento: (A) exponencial; (B) logístico; (C) linear; (D)

rápida-aceleração/lenta-desaceleração (Adaptado de Mitchell et al., 2004)

Tabela 1.2 – Formas diferencial e integrada de várias equações de crescimentoa

Forma diferencial Forma integrada

Linear K

dtdX

= (2.6) X = Kt + X0 (2.10)

Exponencial X

dtdX µ=

(2.7) teXX µ0= (2.11)

Logística ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−=

mXXX

dtdX 1µ

(2.8) ( )( ) t

m

m

eXXXX µ−−+

=1/1 0

(2.12)

Duas fases X

dtdX µ= , t< ta

(2.9a) teXX µ0= , t< ta (2.13a)

( )[ XLedtdX

attK −−= µ ] ,

t≥ ta

(2.9b) ( )( ⎥⎦⎤

⎢⎣⎡ −= −− tatK

A eKLXX 1exp µ ) ,

t≥ ta

(2.13b)

a X é a biomassa microbiana, t é o tempo, K é a taxa linear de crescimento, µ é a taxa específica de crescimento, X0 é a biomassa inicial, Xm é a máxima possível biomassa, ta é o tempo quando se inicia a fase de desaceleração do crescimento, L é a razão entre a taxa específica de crescimento no início da fase de desaceleração e a taxa específica de crescimento na fase exponencial e k é ia taxa específica do decaimento exponencial (Mitchell et al., 2004).

53


Quando a cinética de crescimento é directamente proporcional à concentração da

biomassa, traduz-se pela seguinte equação:

dtdX

X1

=µ (2.14)

Esta equação é válida para meios definidos, nos quais a taxa específica de

crescimento durante a fase exponencial apresenta um valor constante para um dado

microorganismo em determinadas condições de fermentação.

A tradução matemática da dependência de µ com diversos factores (substrato,

biomassa, produto, etc.) tem originado os mais diversos modelos. O proposta de Monod

(1942) para a taxa específica de crescimento é o mais conhecido e utilizado nas áreas de

biotecnologia e microbiologia. Não inclui o efeito das diferenças entre as células, nem as

alterações da composição celular. Ele representa a dependência de µ com a concentração

de um substrato limitante e tem a forma de uma equação hiperbólica:

)()(max

tSKtS

s +=

µµ (2.15)

onde µmax é a taxa específica de crescimento máxima, Ks é o parâmetro de afinidade do

microorganismo com o substrato (constante do substrato) e S a concentração do substrato.

Quanto maior a constante do substrato menor é a sua afinidade.

O trabalho de Ikasari & Mitchel (2000) desenvolveu o crescimento de um fungo

filamentoso em fermentação semi-sólida considerando duas fases de crescimento,

conforme mostrado nas equações 2.9a e 2.9b. Neste modelo cinético, a fase exponencial de

crescimento é seguida por uma fase de desaceleração no crescimento. A parte entre

parênteses da equação 2.10a representa a taxa específica de crescimento durante a fase de

desaceleração, que diminui devido a dois factores. Primeiro uma repentina desaceleração é

assumida no instante em que termina a fase exponencial para iniciar a fase de

desaceleração com o parâmetro L. Segundo, a posterior desaceleração é seguida por um

decaimento exponencial do crescimento, descrito pelo termo K.

54


1.5.2.2 Modelos para a formação do produto – A taxa específica de produção O crescimento de microorganismos é muitas vezes acompanhado pela formação de

produtos. Essa formação pode estar associada ou não ao crescimento. Os produtos podem

estar solúveis na cultura, podem emergir numa forma gasosa ou ser um componente celular

não excretado. Neste caso, há necessidade de ruptura e extracção nas células.

A formação do produto pode ocorrer de três formas diferentes:

a) associada ao crescimento: ocorre quando o produto é formado juntamente com o

crescimento celular (metabolito primário);

b) dissociada do crescimento: ocorre quando o produto só começa a formar-se no fim

da fase exponencial de crescimento (metabolito secundário);

c) cinética mista: ocorre quando o produto começa a se formar a meio da fase

exponencial de crescimento.

Segundo o modelo de Pirt (1975), o produto está associado ao metabolismo energético

como catabolito da fonte de substrato limitante. Este considera que a fonte de carbono

limitante é utilizada para a formação de produto, para a formação de biomassa e para a

manutenção celular. O modelo relaciona a taxa específica de consumo de substrato (qs)

com a taxa específica de formação de produto (qp), conforme a equação abaixo:

qp = YP/S qs = mYYY

SPSX

SP/

/

/ +µ (2.16)

O modelo também relaciona a formação de produto com o crescimento dizendo que

a formação de produto por unidade de tempo é função da taxa específica de formação deste

produto e da concentração da biomassa.

Xqdt

dPp= (2.17)

O modelo de Luedeking e Piret (2000) é um modelo muito útil pois relaciona todas

as situações reais. Ele é baseado na seguinte equação:

55


XdtdX

dtdP

βα += (2.18)

onde α é a constante associada ao crescimento e β é a constante não associada ao

crescimento e sim com a concentração de biomassa. Dividindo toda a equação pela

concentração de biomassa vem:

βαµ +=dt

dPX1 (2.19)

56

Materiais e Métodos

Capítulo 2 - Materiais e Métodos

2.1 Microorganismo e condições de manutenção

Este trabalho foi realizado com o fungo da podridão branca da madeira, Trametes

versicolor obtido pelo Instituto Nacional de Engenharia, Tecnologia e Inovação (INETI,

Portugal). Manteve-se a cultura estoque (mãe) em placas de Petri com o meio sólido Tien

and Kirk, TaK (Tien & Kirk, 1988). Armazenou-se a cultura a 4 ºC e mensalmente

transferiu-se para uma nova placa. Fez-se a transferência através de um pequeno corte

(com uma ansa previamente estéril) do meio sólido juntamente com o fungo crescido para

uma nova placa de crescimento. A composição do meio de cultura TaK está descrita na

Tabela 2.1. O fungo crescido em placa de Petri durante 7 dias é mostrado na Figura 2.1.

Utilizou-se este meio de manutenção nos ensaios de produção enzimática e de produção do

EPS.

Figura 2.1 – Trametes versicolor após 7 dias de crescimento em placa de Petri.

57


Tabela 2.1 – Composição do meio de cultura Tien & Kirk

Concentração (g/L) Nutriente

Meio líquido Meio sólido

Glucose 10 10

Extracto de malte 10 10

Peptona 2 2

Extracto de

levedura 2 2

Asparagina 1 1

KH2PO4 2 2

Tiamina 0.001 0.001

MgSO4 1 1

Agar - 20

2.2 Preparação do inóculo para culturas líquidas

Para a preparação do inóculo, fez-se uma cultura de T. versicolor crescida durante 7

dias em placas de Petri contendo o meio sólido Tak. Adicionaram-se 10,0 mL do meio de

cultura específico em cada placa de Petri. Com uma ansa de inoculação previamente

estéril, removeu-se o micélio crescido no meio sólido e suspendeu-se no meio líquido.

Transferiu-se a suspensão de micélios da placa para um matraz, a fim de obter-se uma

suspensão concentrada de micélios, o inóculo. Usaram-se determinações de peso seco,

descritas seguidamente, para determinar a concentração da suspensão. Filtrou-se 8,0 mL

desta suspensão de micélios em papel de filtro de fibra de vidro (GF/C, 0.45 µm), colocou-

se o papel de filtro numa lâmpada de infravermelho durante 2 h. Determinou-se a

concentração da suspensão e calculou-se o volume de inóculo necessário para se obter uma

concentração inicial de 70 mg/L de micélios. Para se garantir a homogeneidade da

suspensão, realizaram-se testes preliminares, fazendo-se várias réplicas da mesma

suspensão e os respectivos pesos secos e o erro obtido foi inferior a 15%. Usou-se este

método de inoculação em todas as experiências deste trabalho nos meios de cultura

específicos utilizados.

58


2.3 Fermentações com Trametes versicolor para a produção enzimática

2.3.1 Meio de produção enzimática

Para a produção da lacase em matraz e em bioreactor utilizou-se o meio definido

para Trametes (MDT) (Roy & Archibald, 1993) com algumas modificações que serão

definidas posteriormente, consoante o tipo de experiência a ser realizada. A composição do

meio MDT é apresentada na Tabela 2.2. Também se inclui na composição deste meio 1,0

mL/L da solução de elementos vestigiais apresentada na Tabela 2.2. Neste trabalho

adicionou-se Tween 80 (0.5% m/v) para estimular a excreção da enzima. Nas fermentações

sem controlo de pH, o pH do meio de cultura foi ajustado em 5.0 antes de ser autoclavado.

A glucose foi autoclavada separadamente para evitar reacção de Maillard (formação de

produtos castanhos, Crueger & Crueger, 1990). Todos os meios de cultura, soluções e

materiais foram esterilizados a 120ºC durante 20 minutos.

Tabela 2.2 – Composição do meio de cultura MDT

Composição do meio MDT Composição da solução de elementos

vestigiais do meio MDT

Nutriente Concentração

(mM) Nutriente Concentração

(µM)

Glucose 83 FeSO4.7H2O 20

Glutamina 5 CuSO4.5H2O 2

NaCl 5 ZnCl2 5

KH2PO4 5 CoCl2.6H2O 6

MgSO4.7H2O 1 NiCl2.6H2O 0.1

CaCl2 0.1 MnSO4.H2O 20

2,2-dimetilsuccinato 10 (NH4)6MO7O24.4H2O 0.5

59


2.3.2 Fermentações em matraz

Para optimizar a produção da lacase, fizeram-se modificações no meio de cultura

MDT. Variou-se a concentração inicial de glucose, adicionaram-se diferentes indutores e

empregou-se a estratégia da limitação por carbono. Estas modificações estão mais detalhas

nos tópicos abaixo e na Tabela 2.3. Para cada experiência, determinou-se a proteína total, o

valor de pH do meio de cultura, actividade da lacase, concentração de glucose e

concentração final de biomassa.

Realizaram-se as fermentações em matraz de 500 mL com 250 mL de meio de

cultura. Introduziram-se os frascos numa câmara de incubação a 28ºC com agitação orbital

de 180 rpm durante 12 dias.

2.3.2.1 Estudo do efeito da concentração inicial de glucose

Modificou-se a concentração inicial de glucose do meio MDT para as seguintes

concentrações: 0, 1.5, 2, 3, 5 e 9 g/L. 2.5-xilidina (30µM) foi adicionada como indutor da

lacase ao terceiro dia de fermentação.

2.3.2.2 Estudo do efeito da adição de cobre

Adicionou-se CuSO4.5H2O ao meio MDT obtendo-se concentrações de 2.5, 16.0,

75.0 e 150 µM no primeiro dia da experiência para testar o seu efeito como micronutriente

e no terceiro dia da experiência para testar o seu efeito como indutor da lacase. A

concentração de 75.0 µM como micronutriente foi seleccionada para as experiências

posteriores com o meio MDT.

2.3.2.3 Fermentações com diferentes indutores

Para se avaliar o efeito da adição de indutores na produção da lacase, 2.5-xilidina

(30 µM), uma mistura fenólica (450 mg/L) e etanol (20 e 40 g/L) foram testados no meio

MDT, para além do cobre em diferentes concentrações (já descrito em 2.3.2.2). A mistura

60


fenólica era composta por 150 ppm (1:1:1 mg/L) dos seguintes corantes: Procion Orange

MX-2R, Remazol Red 3B e Remazol Black GF. Três experiências foram realizadas com

estes indutores:

1. adição de xilidina ao terceiro dia;

2. adição de xilidia ao terceiro dia e de cobre (75.0 µM) ao primeiro dia;

3. adição de xilidia e mistura fenólica ao terceiro dia e de cobre (75.0 µM) ao

primeiro dia.

2.3.2.4 Fermentações com limitação por carbono

Nos estudos com limitação por carbono a glucose foi removida do meio MDT após

3 dias de cultivo. Ao terceiro dia, o meio de cultura foi filtrado esterilmente em papel de

fibra de vidro (GF/C, 0.45 µm) sob vácuo e a biomassa retida no filtro foi transferida para

um novo meio MDT sem glucose. As três experiências realizadas no item 2.3.2.3 foram

também realizadas com limitação por carbono.

2.3.2.5 Testes de estabilidade da lacase

O efeito do pH na estabilidade da lacase foi avaliado para pH 3.0 e pH 4.5. Uma

amostra do meio de cultura, ao final da fermentação, com uma actividade de lacase inicial

de 2500 U/L foi colectada. Esta amostra foi então incubada a 28 °C durante 3 dias em

tampão citrato/fosfato (0.05 mM/0.1 mM) com um pH de 3.0 e também com um pH de 4.5.

A actividade da lacase remanescente foi medida a cada dia nas condições padrões.

61


Tabela 2.3 – Condições de cultura para a produção de lacase por Trametes versicolor em matraz

Fonte de

carbono

Suplemento do meio Indutores

Glucose (g/L) Cobre (µM) Cobre

(µM)

Xilidina

(mM)

Mistura fenólica

(mg/L)

9.0 - - - -

- - - 30.0 -

1.5 - - 30.0 -

3.0 - - 30.0 -

5.0 - - 30.0 -

9.0 - - 30.0 -

9.0 2.5 - - -

9.0 16.0 - - -

9.0 75.0 - - -

9.0 150.0 - - -

9.0 - 2.5 - -

9.0 - 16.0 - -

9.0 - 75.0 - -

9.0 - 150.0 - -

9.0 - 75.0 30.0 -

- - 75.0 30.0 -

9.0 - 75.0 30.0 450.0

- - 75.0 30.0 450.0

62


2.3.3 Fermentações em Bioreactor

As fermentações foram efectuadas no bioreactor BIOLAB, B. BRAUN (capacidade

de 1L) operado em descontínuo. O bioreactor apresenta controlo de temperatura, a qual foi

mantida a 28ºC através de uma resistência de aquecimento, agitação mecânica e controlo

de pH. O arejamento fez-se através de uma alimentação contínua de ar comprimido filtrado

num filtro estéril com porosidade de 0.2 µm. Nas experiências com controlo de pH, a

fermentação foi monitorada continuamente com eléctrodo de pH, e o pH foi mantido em 5

por adição automática (através de duas bombas peristálticas) com uma solução de NaOH

1M ou com uma solução de H3PO4 1M.

Inoculou-se o fermentador com biomassa crescida durante três dias em matraz (o

crescimento da biomassa em matraz fez-se de acordo com o item 2.2). Adicionou-se 2.5-

xilidina (concentração final de 30.0 µM) juntamente com o inóculo. As experiências

decorreram durante 9 dias e o volume de trabalho foi de 1.0 L. Retiraram-se cerca de 5 mL

de amostra com seringas estéreis em cada dia e removeram-se os vestígios de células e

fragmentos celulares das amostras por filtração sob vácuo com papel de fibra de vidro ou

por centrifugação numa centrifuga Ependorff a 10000 rpm durante 10 minutos.

Determinaram-se a actividade da lacase, o pH do meio (nas experiências sem controlo de

pH), a concentração de glucose,a proteína total e no fim do ensaio a concentração da

biomassa final.

As experiências no bioreactor foram realizadas com base no planeamento

experimental que está descrito no item a seguir. Neste planeamento analisou-se o efeito da

concentração inicial de glucose, o efeito do controlo de pH do meio e o efeito da agitação

na actividade da lacase.

63


Figura 2.2- Bioreactor usado na produção da lacase por Trametes versicolor.

2.3.3.1 Planeamento factorial para a produção de lacase em bioreactor

Para optimizar a produção da lacase em bioreactor utilizou-se o planeamento

experimental (23) sem repetição, com dois níveis e três variáveis (Box et al., 1978)

perfazendo um total de 8 experiências. Neste planeamento experimental escolheram-se três

factores: controlo de pH do meio de cultura, concentração inicial de glucose e agitação. Os

factores estudados para avaliar a produção da lacase e seus respectivos níveis estão

apresentados na Tabela 2.4. Os sinais (-1) e (+1) representam os níveis inferior e superior

dos factores, respectivamente. A concentração inicial de glucose apresenta um limite

inferior de 0 g/L e um limite superior de 9 g/L (a concentração dos outros componentes do

meio MDT permanece constante), a agitação apresenta um limite inferior de 100 rpm e um

limite superior de 180 rpm. Para o pH este estudo foi qualitativo, considerando-se o limite

inferior o não controlo de pH (pH permanece em ± 3.0) e o limite superior o controlo de

pH em 5.0. A matriz do planeamento experimental encontra-se na Tabela 2.5. Os

resultados foram analisados estatisticamente de acordo com o planeamento pré-

estabelecido a fim de verificar-se qualitativamente o efeito dos factores e suas interacções

64


na produção da lacase. Os cálculos dos principais efeitos e das interacções entre os

factores, a análise estátistica e os gráficos foram realizados com o software statistica

version 5.5 (StatSoft, inc.), considerando-se os níveis de significância de 10%. A resposta

do planeamento foi a máxima actividade da lacase. Os resultados foram expressos em

gráficos de superfície de resposta, gráfico de pareto, gráfico de valor observado vs valor

previsto, assim como na tabela de análise de variância (ANOVA).

As experiências foram realizadas de forma aleatória. A melhor condição para a

produção da lacase, estimada pela MSR, foi realizada experimentalmente a fim de se

confirmar os resultados previstos.

A equação (2.1) descreve o modelo de regressão utilizado no planeamento factorial

com 3 variáveis e inclui os termos de interacção:

Ŷŷ = β0 + β1xG+β2xpH + β3xA + β12xG pH + β13xG A + β23xpH A (2.1)

onde:

Ŷŷ a resposta, i.e. a produção da lacase;

xG, xpH e xA as variáveis independentes.

e os coeficientes da regressão são:

β0 o termo de interceptação;

β1, β2 e β3o os coeficientes dos efeitos lineares;

β12, β13, β23 os coeficientes dos efeitos de interacção.

Tabela 2.4 - Factores e níveis estudados no planeamento factorial 23

Níveis Factores

(-1) (+1)

Concentração de glucose g/L (G) 0 9

Controlo de pH (pH) sem com

Agitação rpm (A) 100 180

65


Tabela 2.5 – Matriz do planeamento de experiências 23

Factores Originais Factores Codificados Experiência

A (rpm) pH G (g/L) A

(rpm)

pH G

(g/L) F1 180 sem 0 + - -

F2 100 com 0 - + -

F3 180 sem 9 + - +

F4 180 com 9 + + +

F5 100 sem 0 - - -

F6 180 com 0 + + -

F7 100 sem 9 - - +

F8 100 com 9 - + +

2.3.3.2 Modelação matemática da produção de lacase em bioreactor

Para fazer a modelação matemática em bioractor foi necessário realizar

experiências em matraz uma vez que não foi possível determinar a concentração de

biomassa ao longo da fermentação em bioreactor. Este fungo quando se encontra em meio

líquido apresenta-se como pellets fazendo com que a cultura não seja homogénea o que

não permite a determinação directa da concentração da biomassa. Fizeram-se as

fermentações em 12 matrazes, onde cada matraz correspondeu a 1 dia de fermentação, ou

seja, cada matraz representou a biomassa de 1 dia de crescimento do fungo. Cada dia, 1

matraz foi retirado do agitador e o meio de cultura foi filtrado em papel de fibra de vidro

sob vácuo e a biomassa retida no filtro foi medida por peso seco. De acordo com as

experiências do bioreactor foi necessário realizar 2 fermentações em matraz: a primeira

com glucose no meio e a segunda com supressão de glucose.

Os modelos da fermentação em bioreactor foram baseados nos parâmetros de

crescimento estimados a partir das fermentações em matraz. Para determinar os parâmetros

em matraz, o modelo de crescimento descrito por Mitchell (Mitchell et al., 2000) para

crescimento de fungos filamentos em fermentações semi-sólida foi utilizado. Os

66


parâmetros de crescimento da biomassa foram determinados de acordo com as equações

2.2 e 2.3. Este modelo considera duas fases de crescimento. A primeira, uma fase

exponencial, que é descrita pela equação de Monod (eq. 2.2a). A segunda, uma fase de

desaceleração no crescimento, que é representada pela equação de Mitchell (eq. 2.2b). O

consumo de substrato e produção da enzima são representados pelas equações 2.3 e 2.4,

respectivamente. A produção de lacase foi considerada como sendo parcialmente associada

ao crescimento, e utilizou-se o modelo de Luedeking e Piret (Luedeking & Piret, 2000)

para descrever.

( ) XSKS

dtdX

S⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

= maxµ para t < ta (2.2a)

( )( XLeSKsS

dtdX tatk −−⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛

+= maxµ ) para t ≥ ta (2.2b)

dtdX

YdtdS

SX /

1=− (2.3)

XdtdX

dtdP βα += (2.4)

onde

X: biomassa (g/L) S: substrato (g/L) t: tempo (dias) ta: tempo do fim da fase exponencial (dia 3), µmax taxa específica de crescimento máxima (d-1) Ks: constante de saturação (g/L) L: factor de sobrevivência K: constante de decaimento exponencial (d-1) α: constante associada ao crescimento (U/g) β: constante não associada ao crescimento (U g-1 d-1)

Os parâmetros calculados para a fermentação em matraz foram usados como

constantes nas equações descritas no modelo do bioreactor. Nestas equações acrescentou-

se o parâmetro A que representa a mudança ambiental do matraz para o bioreactor.

O modelo da produção de lacase, do crescimento de biomassa e de consumo de

substrato em bioreactor está representado pelas equações 2.5-2.8.

67


( ) XSKSA

dtdX

S⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

= maxµ para t < ta (2.5)

( )( XLeSKs

SAdtdX tatk −−⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛

+= maxµ ) para t ≥ ta (2.6)

dtdX

YdtdS

SX /

1=− (2.7)

PKeKdtdP X

21 −= (2.8)

onde,

K1: taxa de síntese da lacase (U por g cel por dia) K2:taxa de decaimento da lacase (dia-1)

As equações diferenciais foram resolvidas usando o programa MATLAB (The

Mathworks Inc.). Os parâmetros µmax, KS, YX/S, K, L, A, K1 e K2 foram estimados com o

programa MATLAB Optimization Toolbox através da minimização do quadrado dos

resíduos entre os dados experimentais e os modelados, usando a função objectiva mostrada

na equação (2.9). Os programas utilizados encontram-se no anexo 5. Utilizou-se o método

Simplex-Nelder & Mead no procedimento de optimização. Os erros experimentais foram

estimados em 10% através das replicatas realizadas no shaker. A significância estatística

dos parâmetros estimados foi determinada pelo test t-student com um intervalo de

confiança de 90%.

[ ] [ ]( ) [ ] [ ]( ) [ ] [ ](∑∑ −+−+−ne

i

np

jPPSSXXMinimize 2

modexp2

modexp2

modexp ) (2.9)

onde,

np: número de parâmetros

ne: número de experiências

subscrito exp: dados experimentais

subscrito mod: dados modelados

68


2.3.4 Métodos analíticos

2.3.4.1 Determinação do consumo de substrato pelo método DNS

Determinou-se a concentração de substrato (glucose) quantificando a redução do

ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) por reacção com os açucares redutores, o que se detecta

por mudança de cor, ou seja, por variações da absorvância no visível (λ=540 nm) (Miller,

1959).

A 1.0 mL de amostra devidamente diluída adicionou-se 1.0 mL de reagente de

DNS. Agitou-se no vortex e aqueceu-se a mistura em banho-maria (água a ferver) durante

5.0 minutos. Após este tempo, colocou-se o tubo contendo a mistura em banho gelado.

Adicionaram-se 10.0 mL de água destilada, agitou-se o tubo e leu-se a absorvância a 540

nm.

Para a realização da curva de calibração (Anexo 1) procedeu-se do mesmo modo,

substituindo a amostra por soluções de glucose de concentração conhecida (0.10-1.00 g/L).

2.3.4.2 Determinação da actividade da Lacase

Mediu-se a actividade da lacase nos meios fermentados através da oxidação do

ABTS pela enzima tal como descrito por Ander e Messner, 1998. Adicionaram-se 100 µL

de extracto enzimático ao tampão citrato/fosfato (0,05M/0,1M, pH 4.5) com ABTS (0,4

mM), que estavam previamente termostatizados a 40ºC durante 15 min., perfazendo um

volume final de 2.0 mL.

A actividade da lacase é determinada através da taxa de formação do produto da

oxidação do ABTS pela enzima em espectrofotómetro (Jenway 6405 UV/VIS) a 420nm. O

radical catiónico do ABTS possui um coeficiente de extinção molar (ε) a 420 nm de 36 000

M-1cm-1. Uma unidade de lacase corresponde à quantidade de enzima existente que oxida

1µmol de substrato por minuto. Para a conversão de abs/s em U/L efectua-se o seguinte

cálculo através da equação 2.10:

69


ε10f60Abs∆

LU 6

dil. ×××= (2.10)

onde,

∆ Abs: valor medido no espectrofotómetro 60: conversão de segundo para minuto fdil: factor de diluição da amostra 106: conversão de µL para L ε: coeficiente de extinção molar (M-1cm-1)

2.3.4.3 Determinação da actividade da Manganês peroxidase (MnP)

Mediu-se a actividade da MnP por 2 métodos. No primeiro, a actividade foi

determinada seguindo a variação da densidade óptica resultante da formação do complexo

malonato-Mn3+ a 270 nm, com 50 mM de tampão malonato de sódio pH 5.2, 0.2 mM de

MnSO4 e 0.1 mM de H2O2, com um coeficiente de extição molar de 11.59 mM-1cm-1

(Addleman et al., 1993). No segundo, a actividade foi determinada medindo a oxidação do

vermelho de fenol por variação da densidade óptica a 431 nm. A mistura reaccional

continha 0.2mM de MnSO4, 0.1 mM de H2O2, tampão malonato de sódio pH 4.5, 50 mM e

0.067 mM de vermelho de fenol, com um coeficiente de extição molar de 22751M-1cm-1

(Roy & Archibald, 1993).

2.3.4.4 Determinação da actividade celulásica total

Este método quantifica os açúcares redutores libertados por hidrólise enzimática da

celulose (Mandels et al. 1976).

Num tubo de ensaio colocou-se 1.0 mL de tampão citrato 0.05M pH4.8 e uma tira

de papel equivalente nº1. Adicionou-se 0.5 mL da amostra de extracto enzimático.

Incubaram-se os tubos de ensaio durante 1h a 50 ºC. Em seguida, adicionou-se 1.0 mL do

reagente de DNS. Colocaram-se os tubos num banho de água a ferver por 5 min. e em

seguida adicionaram-se 10.0 mL de água destilada. Mediu-se a absorvância a 540 nm. Uma

70


unidade de actividade enzimática corresponde à quantidade de enzima que liberta 1 mmol

de açúcar redutor por minuto.

2.3.4.5 Determinação da proteína total pelo método de Folin-Lowry

Este método baseia-se na reacção do “biureto” das proteínas com o cobre, em

condições fortemente alcalinas, com a formação dum complexo entre o cobre e os

aminoácidos aromáticos das proteínas, o qual é reduzido a um heteropolímero azul, por

adição do ácido fosfomolibdicofosfotúngstico. Desta reacção resulta a coloração azul

intensa (Haris & Angal, 1989) que pode ser quantificada espectrofotometricamente a 750

nm. Este método é sensível a concentrações de proteína acima de 0.25 mg mL-1.

Reagentes stock: A - 1% m/v de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O);

B - 2% m/v de tartarato de sódio potássio;

C - 0.2M de hidróxido de sódio;

D - 4% m/v de carbonato de sódio.

A 49.0mL do reagente C adicionam-se 49.0mL do reagente D, 1.0 mL do reagente

A e 1.0 mL do reagente B. Estes formam o reagente F, a solução cobre-alcalina,

extemporânea.

O reagente E é obtido por adição de 10.0mL do reagente Folin-Ciocalteau a

10.0mL de água. A 0.50mL de amostra, adicionaram-se 2.5 mL de reagente E deixando

reagir durante 10 minutos. De seguida, adicionaram-se 0.25mL de reagente F ficando 30

minutos a reagir. A proteína total foi determinada pela conversão da absorvância a 750 nm

contra um branco (0.5 mL de tampão da amostra em lugar da própria amostra) pela recta

de calibração respectiva (Anexo 2).

Para a realização da curva de calibração procedeu-se do mesmo modo, substituindo

a amostra por soluções de proteína (BSA) de concentração conhecida.

2.3.4.6 Determinação da biomassa

Calculou-se a concentração da biomassa por determinação do peso seco. No fim de

cada experiência filtrou-se o meio de cultura em filtros de microfibra de vidro (GF/C, 0.45

71


µm) sob vácuo. A biomassa retida no filtro foi seca em estufa a 104 ºC durante 72 h. Ao

fim desse período, os filtros foram arrefecidos num exsicador durante 2 a 3 horas e só

depois pesados O peso seco final da biomassa fez-se por subtracção do peso da membrana

seca ao peso da membrana com a biomassa. Esse método quantifica todas as células e é

indicado para meios com altas concentrações celulares e para fungos filamentosos.

2.3.4.7 Determinação do pH

Fez-se a determinação do pH do meio de cultura através de um medidor de pH

(Crison, micropH 2000), previamente calibrado com soluções tampão conhecidas (pH = 4

e pH = 7).

2.4 Aplicação da lacase na pasta kraft 2.4.1 Preparação da pasta kraft

As experiências de branqueamento da pasta de papel foram realizadas com pasta

kraft de Eucalyptus globulus fornecida pela indústria papeleira PORTUCEL, Cacia,

Portugal. A pasta apresentava um índice kappa de 12.4 e viscosidade intrínseca de 1180

cm3g-1.

Em todas as experiências, antes do branqueamento, a pasta kraft seca foi

impregnada em água destilada durante uma noite. Acertou-se o pH em 4.5 utilizando uma

solução de H2SO4 (0.8 M) e em seguida filtrou-se a pasta sob vácuo para posterior

utilização no branqueamento.

2.4.2 Produção da lacase

A lacase utilizada nas experiências de branqueamento da pasta foi produzida em matraz

ou em bioreactor nas condições optimizadas. Utilizou-se uma concentração de 6U de

lacase por g de pasta.

72


2.4.3 Mediadores utilizados

Os mediadores utilizados no branqueamento da pasta de papel encontram-se na

Tabela 2.6. Os mediadores orgânicos (Tabela 2.6) utilizados foram reagentes comerciais,

fornecidos pela Aldrich Chem. Comp. (Madrid). Os polioxometalatos foram sintetizados

em laboratório. Os métodos de síntese dos polioxometalatos estão descritos por Gamelas et

al. (2005).

Tabela 2.6 – Mediadores utilizados no branqueamento da pasta kraft.

Mediadores inorgânicos (POM) Mediadores orgânicos

[SiW11MnIII(H2O)O39]5− ou (SiW11MnIII)* ABTS

[PW11MnIII(H2O)O39]4− ou (PW11MnIII)* HBT

[SiW11VVO40]5- ou (SiW11VV)* TEMPO

[BCoIII W11(H2O)O35]6- ou (BW11CoIII)* Ácido violúrico

(PW9)2MnIIIO54 ou (PW9)2MnIII*

[SiCoIIIW11(H2O)O39]5- ou (SiW11CoIII)*

* Forma abreviada do POM

2.4.4 Branqueamento da pasta kraft em reactor

As experiências de branqueamento foram realizadas num reactor PARR modelo

4843 com 250 mL de volume total, equipado com um sistema automático de controlo de

temperatura, pressão e agitação mecânica. O reactor e o controlador podem ver-se na

Figura 2.3. A velocidade de agitação foi mantida constante. Em todas as experiências,

adicionou-se um tampão fosfato (Na2HPO4) de pH 4.5 com uma concentração final de

0.1M. A pasta kraft (7.2g à base de pasta seca), a lacase, os mediadores e a solução tampão

fosfato foram introduzidos no reactor à temperatura ambiente, com um volume final de

trabalho de 113 mL. O reactor foi pressurizado com oxigénio. O tempo requerido para

atingir a temperatura de trabalho não foi contabilizado no tempo de branqueamento. No

final da reacção, o reactor foi rapidamente arrefecido com água fria, a pasta kraft filtrada

73


sob vácuo e neste filtrado analisou-se a actividade da lacase. Finalmente a pasta foi lavada

com sucessivas adições de água destilada e foi novamente filtrada sob vácuo. Fez-se então

a extracção alcalina da pasta (descrição no item 2.4.5) e colocou-se ao ar livre para secar

durante 1 semana, para posterior análises.

Inicialmente fez-se a selecção dos mediadores. As experiências foram realizadas

em uma única etapa de branqueamento com temperatura de 45 ºC com lacase e os

seguintes mediadores: ABTS, HBT, ácido violúrico, TEMPO, SiW11MnIII, PW11MnIII e

SiW11VV e com a temperatura de 60ºC com lacase e os seguintes mediadores: SiW11MnIII,

PW11MnIII, SiW11VV, ácido violúrico, BW11CoIII, (PW9)2MnIII e Si W11CoIII.

As reacções de branqueamento decorreram durante 4h. A pressão de oxigénio foi

mantida em 0.3 MPa. Os testes em branco foram realizados com lacase sem a adição de

mediador.

Figura 2.3 – Reactor e controlador de temperatura e de agitação usado no branqueamento da pasta

kraft de papel.

As experiências com multi-estágios foram realizadas com os POMs SiW11MnIII,

SiW11VV e PW11MnIII. O primeiro estágio de branqueamento foi realizado com uma

temperatura de 110ºC e P0(O2) = 0.6 MPa durante 2h. Ao fim deste estágio, o reactor foi

arrefecido com água fria e despressurizado. Em seguida, iniciou-se o segundo estágio com

adição de lacase, temperatura de 45ºC e P0(O2) = 0.3 MPa durante 4h. Os estágios foram

alternados até perfazer um total de 5 estágios conforme mostra a Figura 2.4.

74


1º estágio 2º estágio 3º estágio 4º estágio 5º estágio

45ºC, 4h 0.3MPa lacase

110ºC 2h

0.6MPa

110ºC 2h

0.6MPa

45ºC, 4h 0.3MPa lacase

110ºC 2h

0.6MPa

Figura 2.4 – Condições do branqueamento da pasta kraft com os POMs SiW11MnIII e SiW11VV através do sistema de multi-estágios.

2.4.5 Extracção alcalina da pasta

A extracção alcalina da pasta foi realizada a 70ºC durante 1h, com uma solução de

NaOH (concentração final de 2 g/L). O volume de solução no reactor foi de 71 mL. No

final da reacção, arrefeceu-se o reactor, lavou-se a pasta com sucessivas adições de água

destilada (sob vácuo) até se obter a neutralidade no filtrado. Por fim, esfarelou-se a pasta e

colocou-se numa caixa, onde foi guardada e seca à temperatura ambiente durante 7 dias,

para posteriores análises de índice kappa e de viscosidade intrínseca.

2.4.6 Métodos analíticos

2.4.6.1 Determinação do índice kappa

Determinou-se o índice kappa da pasta através do método padrão TAPPI T 236cm-

99. Este método envolve a oxidação da pasta com o permanganato de potássio, no qual

permite determinar o grau de deslenhificação da pasta. O permanganato reage com a

lenhina da pasta e não com os polissacarídeos. O índice kappa é o volume (mL) de uma

solução de permanganato 0.1N consumido por uma grama de pasta. Os resultados são

corrigidos para 50% do consumo de permanganato adicionado.

75


Reagentes: Solução de permanganato de potássio (0.1 N) (KMnO4)

Solução de tiossulfato de sódio (0.2 N) (Na2S2O3)

Pesam-se 1.1 a 1.3 g da pasta seca. Adicionam-se 125 mL de água destilada à pasta

que é triturada. Adicionam-se sob agitação contínua 25 mL do KMnO e 25 mL do H SO .

Após 1

álculo do índice kappa:

Solução de iodeto de potássio (1.0 N) (KI)

Ácido sulfúrico (4.0 N) (H2SO4)

Indicador (solução de amido, 2 –3 %)

4 2 4

0 minutos sob agitação, adicionam-se 5 mL de KI, algumas gotas do amido

(indicador) e titulou-se com Na2S2O3. Determinou-se o volume gasto. O teste branco foi

feito sem a pasta.

C

( )( ) ( )( )twpK p −+××= −× 25013.0110 500093.0 (2.11)

( )( )1.0

Nabp ×−= (2.12)

Onde :

K = índice kappa

uantidade de KMnO4 efectivamente consumido no teste (mL)

(amostra) (g)

umido no teste do branco (mL)

p = q

w = peso da pasta

a = quantidade de Na2S2O3 consumido no teste (mL)

b = quantidade de Na2S2O3 cons

N = normalidade do Na2S2O3

t = temperatura (ºC).

76


2.4.6.2 Determinação da viscosidade intrínseca

Determinou-se a viscosidade intrínseca da pasta através do método padrão SCAN –

CM15:99. Este método é utilizado para determinar a degradação da celulose da pasta

durante o seu branqueamento ou cozimento.

Pesam-se cerca de 0.16 – 0.18 g de pasta, adicionam-se 25 mL de água destilada, 3

fios de cobre e agita-se o frasco durante 40 minutos a 600 rpm. Em seguida, adiciona-se 25

mL de solução aquosa de cupri – etilenodiamina 1M (CED). Completa-se o volume do

frasco com uma solução de CED e água destilada 1:1, tapa-se sem deixar bolhas de ar e

agita-se novamente por 30 minutos a 600 rpm. Por fim, determinou-se o tempo de

escoamento da solução de CED com a pasta no viscosímetro capilar a uma temperatura

controlada de 25º C.

Cálculo da viscosidade intrínseca

mvth ××

=η (2.13)

onde,

η: viscosidade intrínseca

h: constante do viscosímetro (s -1)

t: tempo de escoamento (s)

v: volume do frasco (mL)

m: massa de pasta (g)

2.4.6.3 Determinação do estado de oxidação dos POMs por espectroscopia no visível

Todas as medidas espectrofotométricas foram realizadas num espectrofotómetro

(Jasco V-560 UV/Vis) com célula de 10 mm a temperatura ambiente. As medidas de todas

as amostras foram determinadas imediatamente após a reacção de branqueamento.

Determinou-se o estado de oxidação dos POMs ao final das experiências com um

único estágio e temperaturas de 45 e 60ºC. Nas reacções a 110ºC não foi preciso

determinar o estado de oxidação uma vez que o POM encontra-se totalmente no estado

reduzido. A Tabela 2.7 mostra as cores dos POMs no estado reduzido e no estado oxidado.

77


Realizaram-se também estudos da re-oxidação dos POMs reduzidos SiW11MnII,

SiW11MnII e SiW11VIV por reacções com lacase sem pasta de papel. Num matrás, colocou-

se a solução aquosa do POM no estado reduzido e lacase, a temperatura ambiente e pressão

atmosférica sob agitação. Retiraram-se amostras a determinados intervalos de tempo e

mediu-se o estado de oxidação do POM por espectro de UV/Vis. Este mesmo

procedimento foi realizado no reactor de branqueamento da pasta a pressão de 0.3 MPa e

agitação mecânica a temperatura ambiente. Em ambos estudos, o POM apresentava uma

concentração de 3.0 mM, o tampão fosfato 0.1 M (pH=4.5) e a lacase numa concentração

de 380 U/L ou 1330 U/L.

Tabela 2.7 – Cor e comprimento de onda (λ) do estado reduzido e do estado oxidado dos POMs

Cor e λ (nm) POM

Estado reduzido Estado oxidado

SiW11Mn Amarela* Cor de rosa (495)

SiW11V Púrpura (490) amarela*

BW11Co Cor de rosa (550) Verde (680)

(PW9)2Mn Amarela* Castanho escuro (600)**

PW11Mn Amarela* Cor de rosa (490)

* Não apresenta máximo de absorvância bem definido; ** apresenta um ombro de absorvância

2.4.6.4 Análise de espectroscopia de ressonância magnética nuclear - RMN

As análises de RMN foram feitas num espectrómetro Brucker MSL 400 (105.2

MHz, 9.4 T, 298 K). Os desvios químicos são referenciados em relação ao VOCl3 líquido.

Fizeram-se as análises de RMN para os POMs SiW11MnIII e SiW11VV para verificar se

ocorreu alguma alteração molecular durante o branqueamento da pasta de papel.

78


2.4.6.5 Análise de voltametria cíclica

As medidas de voltametria cíclica foram feitas em um analisador electroquímico

BAS 100BW, utilizando uma célula convencional de 3 eléctrodos fornecida pela BAS Inc.

O eléctrodo de trabalho foi um eléctrodo de carbono vítreo (BAS) e os eléctrodos de

referência e auxiliar foram Ag/AgCl e Pt, respectivamente. A superfície do eléctrodo de

trabalho foi polida com alumina (0.3 µm) e lavada com água destilada antes de cada

experiência. As medidas foram feitas a temperatura ambiente, num intervalo de potencial

de +1300 mV a 0 mV. As soluções foram desgaseificadas com azoto puro durante 5

minutos antes de serem medidas e mantidas com azoto gasoso durante a voltametria. As

soluções dos POMs tinham uma concentração de 1.0×10-3 M e tampão fosfato (KH2PO4)

0.5 M (pH=4.5).

2.5 Fermentações para produção do Exopolissacarídeo

2.5.1 Meios de produção

Estudaram-se 5 meios de cultura diferentes para seleccionar o melhor meio de

cultura para a produção do exopolissacarídeo. A composição de cada meio de cultura é

apresentada na Tabela 2.8. As experiências foram realizadas em matraz es de 500 mL com

250 mL de meio de cultura, a 28ºC e 180 rpm durante 9 dias. O inóculo tinha uma

concentração inicial de 70 mg/L, conforme descrito no item 2.2. O consumo de açúcares

redutores, o crescimento da biomassa e a viscosidade do meio de cultura foram

monitorados. Retiraram-se cerca de 5 mL de amostra diariamente. Removeram-se as

células e fragmentos celulares das amostras por filtração com papel de fibra de vidro sob

vácuo. Determinou-se a viscosidade do meio e o consumo de açúcares reductores. No fim

de cada ensaio, determinaram-se a concentração da biomassa (peso seco) e a concentração

do EPS (peso seco, item 2.5.3) depois de devidamente separados por centrifugação (15000

rpm, 4ºC e 20 min.).

79


2.5.2 Optimização do meio de cultura

Após a selecção do meio de cultura mais favorável para a produção do EPS, fez-se

a sua optimização através de um primeiro planeamento de experiências 22 com um ponto

central perfazendo um total de 5 experiências. Fizeram-se as fermentações em shaker com

matraz de 500 mL contendo 250 mL do meio de cultura YM durante 8 dias. A temperatura

foi mantida a 28ºC e a agitação foi de 180 rpm. Neste planeamento escolheram-se as

variáveis concentração inicial de glucose e pH do meio de cultura. A glucose tinha um

nível inferior de 5 g/L, um nível superior de 15 g/L e o ponto central de 10 g/L. O pH tinha

um nível inferior de 4, um nível superior de 7 e o ponto central de 5.5, como mostra a

Tabela 2.9. A composição dos outros componentes do meio de cultura permaneceu

constantes

Tabela 2.8 - Composição dos meios de cultura usados na produção do EPS

Meios de cultura Componente (g/L)

MDT GPY YM MCM TaK

Glucose 9 40 10 20 10

Extracto de malte - - 3 - 10

Extracto de levedura - 3 3 2 2

Peptona - 10 5 2 2

KH2PO4 0.68 - - 0.46 2

K2HPO4 - - - 1 -

MgSO4.7H2O 0.25 - - - 1

Asparagina - - - 1

Tiamina 0.081 - - - 0.001

NaCl 0.28 - - - -

CaCl2 0.015 - - - -

Dimetilsuccinato 0.0013 - - - -

MDT, Meio definido para Trametes GPY, Meio de glucose, peptona e extracto de levedura (Khondkar et al., 2002) YM, Meio extracto de levedura e extracto de malte (Kim et al., 2002a) MCM, Meio completo para fungos (Kim et al., 2002a) TaK, meio Tien & Kirk

80


Tabela 2.9 - Factores e níveis estudados no planeamento factorial 22 com ponto central

Níveis

Factores (-1) 0 (+1)

Glucose inicial g/L (G) 5 10 15

pH do meio (pH) 4 5.5 7

A matriz do primeiro planeamento experimental encontra-se na Tabela 2.10. Os

resultados foram analisados estatisticamente de acordo com o planeamento preestabelecido

a fim de verificar qualitativamente o efeito dos factores e suas interacções na produção da

lacase. Os cálculos dos principais efeitos e das interacções entre as variáveis e os gráficos

foram realizados pelo software Statistica version 5.5 (StatSoft, inc.), considerando-se os

níveis de significância de 10%. A resposta do planeamento foi o peso seco do EPS. Os

resultados foram expressos em gráficos de superfície de resposta, assim como pela tabela

de análise de variância (ANOVA).

A equação 2.14 descreve o modelo de regressão utilizado no planeamento factorial

com 2 factores e inclui os termos de interacção:

Ŷŷ = β0 + β1xG+β2xpH + β12xG pH (2.14)

onde Ŷŷ é a resposta, i.e. o peso seco do EPS; xG, xpH são as variáveis

independentes e os coeficientes de regressão são: β0 o termo de interceptação; β1, β2 os

coeficientes dos efeitos lineares e β12, o coeficientes do efeito de interacção.

Tabela 2.10 – Matriz do primeiro planeamento de experiências 22 com ponto central

Factores originais Factores Codificados Experiência

pH G (g/L) pH G (g/L)

E1 7 5 + -

E2 4 15 - +

E3 4 5 - -

E4 7 15 + +

E5 5.5 10 0 0

81


No Segundo planeamento de experiências os níveis dos factores passaram a ser:

glucose com um nível inferior de 5 g/L, um nível superior de 25 g/L e um ponto central de

15 g/L e o pH com um nível inferior de 4, um nível superior de 7 e um ponto central de

5.5. Nesta experiência um outro ponto central foi adicionado com uma concentração de

glucose de 15 g/L e pH de 4.0 totalizando 6 experiências, como mostra a matriz apresentada

na Tabela 2.11. A resposta do planeamento foi o peso seco do EPS.

A equação 2.15 descreve o modelo de regressão utilizado no planeamento factorial

com 2 factores e inclui somente os efeitos lineares e quadráticos:

Ŷŷ = β0 + β1xG+β2xpH + β3xG2 + β4x2

pH (2.15)

onde Ŷŷ é a resposta, i.e. o peso seco do EPS; xG, xpH são as variáveis independentes; e os

coeficientes de regressão são: β0 o termo de interceptação; β1, β2 os coeficientes dos efeitos

lineares, β3, β4 os coeficientes dos efeirtos de segunda ordem.

Tabela 2.11 – Matriz do segundo planeamento de experiências 22 com ponto central

Factores originais Factores Codificados Experiência

pH G (g/L) pH G (g/L)

A1 5 4 - -

A2 5 7 - +

A3 15 5.5 0 0

A4 15 4 0 -

A5 25 4 + -

A6 25 7 + +

2.5.3 Extracção do EPS do meio de cultura

Para a extracção do EPS do meio de cultura, removeram-se as células por

centrifugação a 15000 rpm, 4ºC durante 20 min. Ao sobrenadante adicionou-se etanol (4

82


vezes), agitou-se e deixou-se durante uma noite a 4ºC. O EPS precipitado foi centrifugado

a 10000 rpm, 4ºC durante 20 minutos e o sobrenadante foi descartado. O EPS precipitado

foi sequencialmente lavado com etanol a 50, 60, 70 80 e 90%, liofilizado e o peso seco

determinado. A Figura 2.5 mostra o EPS obtido.

Figura 2.5 - EPS obtido após precipitação por etanol, lavagem e liofilização.

2.5.4 Análise reológica do meio de cultura

A viscosidade aparente dos meios de cultura foi determinada por análises em

reómetro (Rheometer AR 1000, T.A. Instruments), em diferentes tensões de corte e com

controlo de temperatura.

2.5.5 Métodos analíticos para acaracterização do EPS

2.5.5.1 Espectroscopia de Infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)

Fez-se a análise de transformada de infravermelho num aparelho MATTSON 7000

FTIR (como transformação de função de Fourier). O espectro foi obtido a partir de 2 mg de

biopolímero em 200 mg de KBr. 64 scans foram acumulados com uma resolução de 4.0

cm-1. A espectroscopia de infravermelho utilizada foi na região do infravermelho médio,

que se estende num intervalo de 4000-400 cm-1.

2.5.5.2 Análise Termogravimétrica

A análise termogravimétrica do EPS foi realizada em um termo-analisador, TGA-

50 (Shmadzu), sob atmosfera de N2 para se investigar o comportamento térmico do

biopolímero. A taxa de aquecimento foi de 10 ºC/min e aqueceu-se até 700 ºC.

83


2.5.5.3 Análise dos açúcares neutros

A quantidade relativa dos monossacarídeos foi determinada por cromatografia gás-

líquido depois da hidrólise com ácido sulfúrico e derivatização a acetato de alditol

(Blakeney et al., 1983). Analisou-se as amostras derivatizadas num cromatógrafo gasoso

(Carlo Erba 6000).

2.5.5.4 Determinação do peso molecular

O peso molecular médio dos EPSs produzidos nos meios YM, TaK e MCM foi

determinado através da cromatografia de permeação em gel (GPC – gel permeation

chromatography). As análises de GPC foram realizadas em duas colunas 10µm MIXED B

300×7.5 mm protegidas por uma pré coluna Plgel 10µm (Polymer laboratories Ltd. UK)

usando um sistema PL-GPC 110 (Polymer laboratories Ltd. UK) e detector de índice de

refração. Dissolveu-se a amostra do EPS em N,N-dimetilacetamida (DMCA) contendo

0.5% (p/v) LiCl. Manteve-se as colunas e o sistema de injecção em 70ºC. Bombeou-se o

eluente (0.5% p/v LiCl em DMAC) com caudal de 0.9 mL/min. Como GPC é um método

relativo, é necessário fazer uma curva de calibração. Deste modo, calibrou-se as colunas do

GPC com o material de referência pululana. A curva de calibração se encontra no anexo 3.

2.5.5.5 Determinação dos ácidos urónicos

Determinaram-se os ácidos urónicos do EPS produzido nos meios YM, TaK e

MCM usando o método m-fenilfenol (Blumenkrantz &Asboe_Hansen, 1973).

Pesaram-se 2-3 mg do EPS que se incubaram durante 3 horas com 200µL de H2SO4

a 72% e hidrolisadas durante 1 hora com H2SO4 1M. Diluiu-se 7 vezes 0.5 mL do

hidrolisado com água destilada. Adicionaram-se 3 mL de solução de borato de sódio 12.5

mM em H2SO4 concentrado a tubos de ensaio arrefecidos em gelo. A cada tubo

adicionaram-se 500 µL de amostra e em seguida aqueceu-se em banho fervente durante 10

minutos. Arrefeceram-se em gelo os tubos e adicionou-se 100 µL de solução de m-

fenilfenol a 0.5%. Agitaram-se os tubos e deixou-se em ausência de luz durante 30

minutos. Leu-se a absorvância das amostra a 520 nm. As amostras padrão foram feitas com

84


concentrações conhecidas do ácido D-galacturónico. Determinou-se a quantidade de ácido

urónico presente na amostra por interpolação gráfica da curva padrão (Anexo 4).

2.5.5.6 Análise elementar do EPS

A percentagem relativa de C, N e H foi determinada através de um analisador

elementar Leco CHNS-932. Uma amostra sólida de 2 mg do EPS produzido nos meios

YM, MCM e TaK foi encapsulada e colocada no forno para se iniciar a combustão. Os

ajustes para o branco e calibração são aplicados ao sinal integrado final e as respostas são

obtidas como percentagem de peso de carbono, hidrogénio e nitrogénio.

85

Resultados e Discussão

Capítulo 3 – Resultados e discussão 3.1 – Produção de lacase em matraz 3.1.1 Efeito da concentração inicial de glucose

Para verificar o efeito da fonte de carbono na produção da lacase por T. versicolor

em fermentação descontínua, empregaram-se diferentes concentrações iniciais de glucose

no meio MDT. Adicionou-se 2.5-xilidina como indutor da lacase ao terceiro dia de cada

experiência.

A Figura 3.1 mostra o efeito da concentração inicial de glucose na produção da

lacase. Os resultados mostram que uma produção significativa de lacase se inicia a partir

do quarto dia de cultivo, com actividades variando entre 100 e 500 U/L. A sua produção

foi fortemente dependente da concentração inicial de glucose do meio de cultura. Durante

a fase inicial de produção da enzima, que ainda coincide com a fase de consumo de

glucose (para concentrações acima de 2 g/L), a produção de lacase é muito baixa (dia 3).

As maiores actividades de lacase (entre 600 e 650 U/L) foram obtidas a partir do sétimo

dia de cultivo, quando a glucose não estava presente no meio de cultura, ou seja em

condições de limitação por carbono, Figura 3.2. As menores actividades de lacase foram

detectadas para as maiores concentrações iniciais de glucose empregues (5 e 9 g/L),

mostrando que altos níveis de glucose reprimem a produção da lacase. Um aumento de

quase 2 vezes na actividade da lacase foi observado quando a concentração inicial de

glucose passou de 9 g/L para nenhuma glucose no meio. Galhaup et al. (2002b), mostrou

que quando a glucose está presente acima de certas concentrações, a síntese da lacase é

reprimida em T. pubescens. A repressão da glucose em fungos e leveduras é grandemente

conhecida e acredita-se que a glucose pode inibir ou induzir os genes de produção

enzimática (Ronne, 1995).

Os dados de proteína total do meio de cultura durante a produção da lacase em

diferentes concentrações iniciais de glucose estão apresentados na Figura 3.3.

Contrariamente aos resultados obtidos para a actividade da lacase, maiores quantidades

de proteína total foram determinadas para as maiores concentrações de glucose e além

86


disso, o perfil da evolução da proteína total não coincide com o perfil da produção da

lacase para uma mesma concentração de glucose. Esses resultados indicam que outras

proteínas estão a ser sintetizadas durante o cultivo do fungo e não é possível, desta

maneira, fazer uma correlação entre a concentração de lacase e de proteína total no meio

de cultura.

0

100

200

300

400

500

600

700

0 2 4 6 8 10 12 14

Tempo (dias)

Laca

se (U

/L)

0 g/L 1,5 g/L 2,0 g/L 3,0 g/L 5 g/L 9 g/L

Laca

se(U

/L)

Tempo (dias)

Figura 3.1 - Actividade de lacase produzida por Trametes versicolor em diferentes concentrações

iniciais de glucose.

0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8 10 12 14Tempo (dias)

Glu

cose

(g/L

)iiiii

0 g/L 1,5 g/L 2 g/L 3 g/L 5 g/L 9 g/L

Glu

cose

(g/L

)

Tempo (dias)

Figura 3.2 - Consumo de glucose do meio de cultura durante a produção de lacase por Trametes versicolor em diferentes concentrações iniciais de glucose.

A evolução do pH do meio de cultura para as diferentes concentrações de glucose

está apresentada na Figura 3.4. O perfil da evolução do pH mostra que existem dois

87


comportamentos distintos para as diferentes concentrações de glucose testadas. Em todos

os casos, o pH diminui de aproximadamente 5 até 3, enquanto o fungo consome a glucose

(Figura 3.2) e estabiliza assim que a glucose termina. Depois desta estabilização, inicia-se

um novo período associado à uma subida de pH, excepto no ensaio com maior

concentração de glucose (9 g/L) onde esta somente se esgota no penúltimo dia de

fermentação. Estes resultados indicam claramente uma associação entre a queda do pH

do meio de cultura e o consumo de glucose por T. versicolor, indicando uma mudança no

metabolismo do fungo quando ocorre o consumo total da fonte de carbono. Galhaup et al.

(2002b), também mostrou uma queda de pH de 5.0 até 3.6 durante a fase de crescimento

de T. pubenscens e que o pH volta a subir rapidamente quando a glucose é totalmente

consumida do meio. De acordo com vários estudos da literatura, esta queda de pH do

meio ocorre devido à síntese de vários ácidos orgânicos como o malónico, o oxálico, o

fumárico, o succínico entre outros. Estes são produzidos através do metabolismo primário

dos basidiomicetos (Roy & Archibald, 1993; Milagres et al. 2002; Humar et al., 2001;

Urzúa et al., 1998; Hofrichter et al., 1999) e o posterior aumento do pH indica a mudança

para um metabolismo secundário alternativo.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 2 4 6 8 10 12 14Tempo (dias)

Prot

eína

tota

l (m

g/m

L)iii

iiiii

0 g/L 1,5 g/L 2 g/L 3 g/L 5 g/L 9 g/L

Prot

eína

tota

l (m

g/m

L)

Tempo (dias)

Figura 3.3 - Evolução da proteína total do meio de cultura durante a produção de lacase por

Trametes versicolor em diferentes concentrações iniciais de glucose.

A Figura 3.5 apresenta, para cada ensaio, a máxima actividade da lacase obtida, o

respectivo valor de pH e a biomassa final para as diferentes concentrações de glucose

88


estudadas. Os resultados mostram que a concentração final de biomassa, um resultado

directo do crescimento celular e do metabolismo primário, foi directamente dependente

da concentração inicial de glucose. Verifica-se também que a máxima produção de lacase

também está claramente associada ao pH do meio. De facto, existe um sincronismo

quando se compara a máxima actividade de lacase e o respectivo valor de pH, quanto

menor o pH, menor a produção de lacase. Nas experiências com elevadas concentrações

de glucose, onde o fungo realiza o seu metabolismo primário, por um maior período de

tempo, o pH diminui e provavelmente inibe a produção da lacase. Galhaup et al. (2002b)

também mostrou que a produção da lacase por T. pubescens era somente significativa

quando a glucose era totalmente consumida do meio, devido à repressão pelo substrato.

Ruel et al. (1999) sugerem que o metabolismo primário, na ausência de indutores, produz

pequenas concentrações de lacase e que a produção de enzimas lenhinolíticas está

associada com o metabolismo secundário. Portanto, a produção de lacase em elevadas

concentrações parece ser resultado do metabolismo secundário do fungo, que não é

dependente do seu crescimento, mas sim de algum estímulo externo (Moreira et al.,

1998).

3

3,5

4

4,5

5

5,5

0 2 4 6 8 10 12 14

Tempo (dias)

pH

0 g/L 1,5 g/L 2 g/L 3 g/L 5 g/L 9 g/L

Tempo (dias)

Figura 3.4- Evolução do pH do meio de cultura durante a produção de lacase por Trametes versicolor em diferentes concentrações iniciais de glucose.

89


Figura 3.5 – Biomassa final de Trametes versicolor, máxima actividade de lacase e pH do meio

para diferentes concentrações iniciais de glucose.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

5, 8,

Glucose (g/L)

Bio

mas

sa (m

g L

acas

e (U

/L

0,0 1,5 2,0 3,0 0 0

)

Lacase Biomassa

3,0

3,2

3,5

3,7

3,9

4,1

4,4

4,6

pH

pH pH

Bio

mas

sa (m

g/L)

0,0 1,5 2,0 3,0 5,0 9,0

Glucose (g/L)

3.1.2 Efeito da adição de cobre

Como a lacase é uma proteína que contem cobre na sua estrutura, um aumento da

actividade da lacase em culturas suplementadas com cobre é esperado. A adição de cobre

em diferentes meios de cultura tem sido usada para aumentar a produção da lacase por

fungos (Collins & Dobson, 1997; Galhaup et al., 2002a; Giardina et al., 1999; Baldrian &

Gabriel, 2002).

Neste estudo, para se verificar o efeito da adição de cobre como micronutriente,

na produção da lacase por T. versicolor, diferentes concentrações iniciais (2.5, 16, 75 e

150 µM) de cobre foram empregues no meio de cultura MDT (Figura 3.6). Neste

conjunto de experiências, nenhum indutor foi adicionado para estimular a produção da

lacase. A concentração óptima de cobre encontrada foi de 75 µM. Esta conduziu a um

aumento de 3 vezes na produção da lacase quando comparado com o controlo, sem

adição de cobre. Para a maior concentração de cobre (150 µM), a actividade da lacase

diminuiu, provavelmente devido a um efeito tóxico do cobre no metabolismo deste

fungo.

Contrariamente aos resultados aqui obtidos, Collins & Dobson (1997) mostraram

que um aumento na concentração de cobre desde 0.4 até 400 µM promoveu um aumento

90


de 0.5 a 2.5 U/ml na actividade da lacase produzida por T. versicolor, respectivamente.

Um outro estudo com P. ostreatus também encontrou o mesmo resultado, onde o

aumento da concentração de cobre aumentou proporcionalmente a produção de lacase

(Giardina et al., 1999). Por outro lado, Couto et al. (2004b) estudaram o efeito da adição

de cobre na produção de lacase por T. versicolor e por T. hirsuta e verificaram que um

aumento muito pouco significativo ocorreu com T. versicolor e um aumento de 3 vezes

na actividade da lacase foi obtido com T. hirsuta. Isto pode significar que o efeito do

cobre sobre a produção de lacase é dependente do fungo e da estirpe do fungo utilizada.

O efeito da adição de cobre ao terceiro dia na produção, como indutor da lacase,

está mostrado na Figura 3.7. Para todas as concentrações de cobre estudadas, a produção

da lacase foi praticamente a mesma, apresentando uma actividade máxima de cerca de

170 U/L, que corresponde a um aumento de 105 U/L em relação ao controlo (65 U/L).

As actividades máximas obtidas pela adição de cobre como micronutriente

(adição ao meio de cultura) e como indutor (adição ao 3º dia) da lacase foram muito

semelhantes. Galhaup & Haltrich (2001) estudaram o efeito da adição de cobre em

diferentes dias de cultivo (0, 4 e 8 dias) na produção da lacase por T. pubescens e

observaram um ligeiro aumento na actividade (de 55 para 65 U/mL) quando o cobre foi

adicionado ao quarto dia de cultivo, em comparação ao primeiro dia, e uma drástica

diminuição na actividade foi observada pela adição do cobre ao oitavo dia.

Trupkin et al. (2003) também estudaram o efeito do cobre como indutor da lacase

e um aumento na produção da lacase foi mostrado com o aumento das concentrações de

cobre. O trabalho sugere que o cobre é tóxico para a maioria dos fungos, mas que ele

pode agir como indutor da produção de lacase por T. versicolor e que a produção da

lacase é um mecanismo de defesa em situações de stress oxidativo.

De acordo com os resultados obtidos da adição de cobre, seleccionou-se a adição

de cobre ao primeiro dia numa concentração de 75 µM para as posteriores experiências

de indução da produção da lacase por T. versicolor.

91


0

40

80

120

160

200

0 2 4 6 8 10 1

Laca

se (U

/L)ii

i

2

Tempo (dias)

2,5 uM 16 uM 75 uM 150 uM Controlo Figura 3.6 – Efeito da adição de cobre ao primeiro dia na produção da lacase por Trametes

versicolor.

0

40

80

120

160

200

0 2 4 6 8 10 12

Laca

se (U

/L)ii

i

Tempo (dias)Tempo (dias)

Tempo (dias)

Laca

se(U

/L)

Laca

se(U

/L)

2,5 uM 75 uM 150 uM Controlo Figura 3.7 - Efeito da adição de cobre ao terceiro dia na produção da lacase por Trametes

versicolor. 3.1.3 Produção de lacase com diferentes indutores

A indução e optimização da produção de lacase tem sido extensivamente estudada

com diferentes tipos de indutores e respectivas concentrações e tempo de adição (Muñoz

et al., 1997). A maior parte desses indutores são compostos aromáticos ou fenólicos,

92


muitas vezes relacionados com a lenhina ou seus derivados. Neste trabalho, avaliou-se

cobre, 2.5-xilidina (xil), uma mistura fenólica (MF) e etanol como indutores da lacase no

meio MDT por T. versicolor. Nestas condições estudadas não foram detectadas

actividades de MnP e de LiP.

A adição de etanol ao meio de cultura não favoreceu a produção da enzima para

as duas concentrações estudadas, 20 e 40 g/L. Embora o etanol não seja um composto

aromático, ele tem sido estudado como indutor da lacase. Em oposição aos nossos

resultados, Lee et al. (1999) mostraram que a adição de etanol (40 g/L) estimulou a

produção da lacase a níveis significativos, com um aumento de 2.6 U/mL quando

comparado com meio sem adição de etanol.

A Figura 3.8 (a) mostra o efeito dos diferentes indutores no meio MDT, contendo

9 g/L de glucose e a Figura 3.8 (b) mostra a amplificação da escala da Figura 3.8 (a) para

uma melhor visualização nas diferenças da produção da lacase com indução de cobre,

xilidina e cobre + xilidina. Os picos de actividade máxima de lacase foram obtidos em

diferentes dias, dependo do indutor ou da combinação entre eles, não havendo assim

nenhuma relação com o dia da actividade máxima e a adição de diferentes indutores.

A adição de xilidina produziu uma maior actividade de lacase quando comparada

com a adição de cobre (de 170 para 360 U/L), o que corresponde um aumento de 1.9

vezes. Muitos trabalhos mostram a indução de lacase por xilidina em fungos (Garzillo et

al., 1998; Koroljova-Skorobogat’ko et al., 1998; Couto et al., 2002). Entretanto, um

efeito cooperativo entre o cobre e a xilidina foi observado. A presença simultânea de

ambos os indutores levou a um maior aumento na produção de lacase (800 U/L) do que o

efeito individual de cada um deles (4.4 vezes em relação ao cobre e 2.3 em relação à

xilidina). O mesmo efeito de cooperação entre esses indutores foi observado na produção

de lacase por T. versicolor (Collins & Dobson, 1997) e por T. hirsuta e T. versicolor em

culturas sólida (Couto et al., 2004b)

93


0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 2 4 6 8 10 12 14Tempo (dias)

Laca

se (

(U/L

)

Cu xil Cu+xil Cu+xil+MF Controlo

0

200

400

600

800

0 2 4 6 8 10 12 14

(b)

Laca

se(U

/L)

Tempo (dias)

(a)

Figura 3.8 – (a) Produção de lacase por Trametes versicolor na presença de cobre, xilidia (xil) e mistura fenólica (MF). (b) amplificação da Figura 3.8 (a).

Uma vez que a lacase actua como uma enzima oxidativa em compostos fenólicos,

uma complexa mistura fenólica (mistura de três corantes) foi empregada para favorecer o

aumento dos indutores previamente testados. Esta mistura fenólica foi utilizada por

Amaral et al. (2004) na descoloração de corantes têxteis e promoveu altas concentrações

de lacase por T. versicolor. Neste trabalho, obteve-se um aumento significativo na

actividade enzimática, de 850 U/L no meio com adição de cobre e xilidina, para 5500

U/L (6.5 vezes) na presença desta mistura fenólica (Figura 3.8).

Indutores com estruturas fenólicas parecem permitir a este tipo de fungo

reconhecer um sinal que conduz a uma intensiva resposta biológica que activa o

metabolismo secundário responsável pelo aumento da produção de enzimas

lenhinolíticas.

A Figura 3.9 mostra o valor de pH do meio de cultura e o consumo de glucose

durante a produção de lacase com os diferentes indutores. Com a adição de cobre, um

baixo consumo de glucose foi observado, com uma taxa de consumo de 0,48 g/d, quando

comparado com os demais indutores que apresentaram as seguintes taxas: 0.67 g/d para a

xilidina, 0.66 g/d para cobre, xilidina e mistura fenólica e de 0.93 g/d para cobre e

xilidina. Os resultados indicam que quando a xilidina está presente, o fungo consegue

assimilar mais rapidamente a glucose. Como nos resultados anteriores, o pH do meio

desce juntamente com o consumo da glucose até um valor aproximado e constante de 3.0,

94


excepto para o meio suplementado com cobre, onde o pH desceu e manteve-se constante

em 3.6, provavelmente devido à baixa taxa de consumo de glucose. No meio onde os três

indutores estavam presentes, o pH do meio aumentou muito rapidamente quando a

glucose foi totalmente consumida (dia 9).

2,9

3,4

3,9

4,4

4,9

5,4

5,9

0 2 4 6 8 10 12 14

Tempo (dias)

pH

Cu xil Cu + xil Cu + xil+MF

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10 12 1

Tempo (dias)G

luco

se (g

/L)

4

Cu xil Cu+xil Cu+xil+MF

a b

Figura 3.9 – pH do meio de cultura (a) e consumo de glucose (b) durante a produção de lacase por Trametes versicolor com diferentes indutores.

3.1.4 Efeito da limitação por carbono com diferentes indutores

Como mostrado no item 3.1.1, a limitação por carbono (LC) estimulou a produção

da lacase por T. versicolor. Deste modo, fez-se a estratégia da limitação por carbono para

os melhores resultados da adição de indutores: cobre+xilidina (xil) e

cobre+xilidina+mistura fenólica (MF). Os resultados com e sem limitação por carbono

estão apresentados na Figura 3.10.

A actividade da enzima com a adição de cobre+xilidina aumentou cerca de 3

vezes ou 1850 U/L (de 850 para 2700 U/L) em condições de limitação por carbono. Um

efeito similar, embora menos significativo, também ocorreu quando a mistura fenólica foi

empregue (de 5520 para 6080 U/L), o que corresponde a um aumento de 560 U/L ou 1.1

vezes na actividade máxima da lacase. Além disso, observou-se ainda uma antecipação

de 2 dias na actividade máxima da lacase.

95


0

1

3

4

6

Laca

se (U

/L)ii

ii

500

000

500

000

7500

0 2 4 6 8 10 12 14Tempo (dias)

Cu+xil+LC Cu+xil+MF+LC Cu+xilCu+xil+MF Controlo

Laca

se(U

/L)

Figura 3.10 - Produção de lacase por Trametes versicolor na presença de cobre e xilidia (xil) e de cobre, xilidia (xil) e mistura fenólica (MF) com e sem limitação por carbono (LM).

A Tabela 3.1 mostra a produtividade e o aumento da produtividade da lacase para

os diferentes indutores com e sem limitação por carbono. O emprego da estratégia da

limitação por carbono e o emprego da mistura fenólica conduziram aos melhores

resultados da produtividade da lacase. Um aumento de 75.5 vezes em relação ao controlo

foi obtido nas condições de sem limitação por carbono e um aumento de 103.9 vezes para

combinação de todos os indutores nas condições de limitação por carbono.

Os resultados indicam que compostos fenólicos estimulam o fungo a desenvolver

mecanismos de protecção aos efeitos tóxicos, fazendo com que mais enzima seja

produzida de forma a tentar eliminar a toxicidade do meio onde se encontra e/ou pelo

facto do fungo reconhecer estruturas similares da madeira. É conhecido da literatura que

os compostos mais eficientes na indução de enzimas lenhinolíticas são os preparados de

lenhina e os compostos fenólicos tais como álcoois, aldeídos e ácidos (Muñoz et al.

1997). A indução desses compostos na produção da lacase vem da capacidade natural do

fungo T. versicolor em degradar a lenhina através de mecanismos específicos de ataque

às madeiras. A presença desse tipo de indutor faz com que o fungo os reconheça e

desenvolva um metabolismo de defesa ao stress oxidativo (Trupkin et al., 2003)

produzindo uma maior quantidade de enzima.

96


Tabela 3.1 - Produtividade de lacase e aumento da produtividade de lacase para os indutores cobre, xilidina e mistura fenólica em condições de limitação por carbono e sem limitação por carbono

Indutores Produtividade (U/ (L. dia)) Aumento da

produtividade

Sem limitação por carbono

Controlo 7.3 1.0

Cobre 31.8 4.4

xilidina 60.0 8.2

Cobre + xilidina 76.0 10.4

Cobre + xilidina + Mistura

fenólica

552.1 75.5

Com limitação por carbono

Cobre + xilidina 272.3 37.3

Cobre + xilidina + Mistura

fenólica

759.8 103.9

97


3.2 – Produção de lacase em fermentador

3.2.1 – Optimização da produção da lacase por planeamento de experiências

Após estudar-se as diferentes condições de produção da lacase por T. versicolor

em matraz, fez-se um planeamento de experiências com três factores: concentração

inicial de glucose, pH do meio de cultura e agitação, e dois níveis para aplicar em

fermentador. A finalidade é a optimização da produção enzimática, uma vez que a

produção enzimática é muito dependente das condições de cultivo. A variável de resposta

foi a máxima actividade de lacase obtida durante o processo de fermentação. O

planeamento totalizou 8 experiências com as diferentes combinações dos três factores em

estudo. Os ensaios foram efectuados em conformidade com o delineamento experimental

proposto no item 2.3.3.1. Para a glucose escolheu-se um limite inferior de 0 g/L e um

limite superior de 9 g/L, para a agitação um limite inferior de 100 rpm um limite superior

de 180 rpm e para o pH um limite inferior de 3.0 e um limite superior de 5.0, onde se

considerou o limite inferior o não controlo do pH e o limite superior o controlo do pH em

5.0 ± 0.1.

Os resultados das fermentações de T. versicolor pelo planeamento de experiências

estão resumido na Tabela 3.2. Os valores obtidos mostram que os meios com glucose (9

g/L) e sem controlo de pH (experiências F3 e F7) não favoreceram a formação da lacase,

resultando em actividades inferiores a 1000 U/L e com elevadas concentrações de

biomassa (≈ 1.5 g/L).

Obtiveram-se os melhores resultados quando glucose estava presente no meio de

cultura e o pH controlado (F4 e F7), o que correspondeu a actividades acima de 7000 U/L

para ambos valores de agitação. Quando se comparam experiências similares, com a

mesma concentração de glucose e a mesma agitação (F3 e F4; F7 e F8), onde somente se

varia o pH, obteve-se um aumento na actividade máxima da lacase de 16 vezes para uma

agitação de 100 rpm (de F3 para F4) e um aumento de 9 vezes para uma agitação de 180

rpm (de F7 para F8). Em todas as experiências a produtividade da lacase seguiu a mesma

tendência que a actividade máxima.

98


A biomassa final apresentou baixos valores para os meios sem glucose, de 0.3 a

0.6 g/L, o que era esperado uma vez que não havia fonte de carbono para o crescimento.

Para as experiências com glucose no meio, a biomassa final apresentou concentrações

próximas a 1.5 g/L.

Tabela 3.2 – Planeamento de experiências 23 e repostas da produção da lacase por Trametes

versicolor

Experiência Agitação

(rpm)

Controlo

de pH

Glucose

(g/L)

Biomassa

final

(g/L)

Máxima actividade de lacase

(U/L)

Produtividade de lacase (U/(L.d))

F1 180 3 0 0.37 1493 249

F2 100 5 0 0.60 2178 260

F3 180 3 9 1.51 444 37

F4 180 5 9 1.59 7113 889

F5 100 3 0 0.29 1410 117

F6 180 5 0 0.27 1781 184

F7 100 3 9 1.28 771 70

F8 100 5 9 1.54 7217 902

Os efeitos estimados de cada factor e suas interacções para o planeamento de

experiências estão descritos na Tabela 3.3. As respostas mostram que o controlo de pH,

concentração inicial de glucose e as suas interacções apresentam um grande efeito na

actividade máxima da lacase, enquanto que a agitação não apresenta nenhum efeito

significativo na produção da lacase. A significância dos efeitos estimados foi avaliada

através da análise de variância (ANOVA). Os testes ANOVA indicam que o modelo

linear descreve adequadamente o rendimento da síntese de lacase. O efeito significativo

de cada coeficiente foi determinado através do teste p (p < 0.1), considerando 90% de

intervalo de confiança. Baixos valores de p indicam um coeficiente muito significativo.

As variáveis que apresentaram um efeito significativo similar foram o pH e a interacção

Glucose × pH. O coeficiente de regressão (R2 = 0,99625) indica também que o modelo de

primeira ordem (linear) pode representar adequadamente os dados experimentais

referentes ao rendimento em lacase.

99


Tabela 3.3 – Efeitos estimados e teste ANOVA para a produção de lacase por Trametes versicolor através do planeamento de experiências 23

Efeitos Estimado Valor

de p

Valor

de t

Soma

quadrática

(SQ)

Graus de

liberdade

df

Média

quadrática

(MQ)

F

Efeitos

principais

Controlo de

pH

3452.7 0.0579 10.9515 232214 102 1 232214 102 119.93

Glucose (G) 2170.8 0.0965 6.5420 8286928 1 8286928 42.80

Agitação (A) 186.4 0.8962 0.1643 5233 1 5233 0.0270

Interacção

de dois

factores

A x pH 64.4 0.6368 0.6416 79720 1 79720 0.4117

A x G 29.1 0.6906 0.5282 54022 1 54022 0.2790

G x pH 3014.8 0.0626 10.1239 19845630 1 19845630 102.49

Erro 193629 1 193629

Total SQ 516866 102 7

R2 = 0,99625

O diagrama de Pareto apresentado na Figura 3.11 mostra os efeitos que são

estatisticamente importantes na produção da lacase. Os efeitos cujos rectângulos

estiverem à direita da linha divisória (p = 0.1) devem ser considerados no modelo

matemático. O diagrama de Pareto mostra claramente que o factor pH apresenta o efeito

mais pronunciado na produção da lacase seguido pela interacção glucose x pH e pela

glucose. A agitação não é um factor relevante na produção da lacase. Os valores ao lado

do rectângulo representam os valores da estatística do test t.

100


Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: Laccase activityGráfico de Pareto; Variável: Actividade de lacase

2**(3-0) design; MS Residual=193628,6

p=,1

10,95115

Figura 3.11 – Diagrama de Pareto para o planeamento factorial 23.

Adicionalmente, a correlação entre os valores previstos no modelo para a

actividade máxima da lacase e os dados experimentais é apresentada na Figura 3.12. Os

resultados mostram que os dados estão muito próximos da linha, o que caracteriza um

bom ajuste, mostrando que o modelo linear descreve bem os dados experimentais.

Figura 3.12 - Correlação entre os valores observados e os valores previstos da produção da lacase.

Effect Estimate (Absolute Value)

,1643902

,5282018

,6416519

6,542022

10,1239

(1)pH

1by21 por 2

(2)Glucose

1by3

2by3

(3)Agitation

2 por 3

1 por 3

(3)agitação

14 -2 0 2 4 6 8 10 12

Efeito estimado (valor absoluto)

Observed vs. Predicted Values2**(3-0) design; MS Residual=193628,6

Pred

icte

d V

alue

s

Observed Values

-1000

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

-1000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

Valo

res

prev

isto

s

Valores observados

Valores observados vs. valores previstos

101


Os resultados do planeamento de experiências apresentados acima podem também

ser visualizados através de uma superfície, chamada de superfície de resposta, que no

caso deste trabalho, é um planeamento factorial comum e por isso tem a forma de um

plano, visto que o modelo matemático é linear. As superfícies de resposta resultantes e a

respectiva relação matemática entre a variável de resposta (actividade da lacase; z) e as

variáveis independentes (factores) estão mostradas nas Figuras 3.12a-c. Os gráficos

mostram o efeito de duas variáveis enquanto que a terceira permanece constante. A

respectiva função que representa estas figuras é dada pela seguinte equação:

Actividade da lacase (U/L): 2931.55 - 220.69 pH - 1237.77 G - 11.40 A + 350.01

pH×G + 2.46 pH×A+0.46 G×A (3.1)

As Figuras 3.13a-c representam um gráfico tri-dimensional das seguintes

variáveis: concentração de glucose e pH (a uma agitação de 180 rpm), agitação e

concentração de glucose (a um pH de 3) e agitação e pH (a uma concentração de glucose

de 9 g/L). A cor castanha representa as elevadas actividades de lacase. O modelo de

primeira ordem (linear) ajusta bem a resposta e é mostrado nas equações apresentadas na

Figura 3.13. Na Figura 3.13a observa-se que quando se usa o nível inferior de ambos os

factores (glucose de 0 g/L e sem controlo de pH) a actividade da lacase cai atingindo o

mínimo valor observado no intervalo estudado (cerca de 400 U/L). As condições óptimas

encontradas para a produção da lacase foram uma concentração de glucose e um pH de

11 g/L e 5.2, respectivamente. Nessas condições, uma actividade de lacase de cerca de

10000 U/L é prevista pelo modelo. Após obter as condições optimizadas, realizou-se uma

nova experiência nas condições óptimas (glucose inicial de 11 g/L e pH 5.2). Nestas

condições, obteve-se a máxima actividade de lacase de 11403 U/L, que está de acordo

com o valor previsto pelo modelo, o que mostra a adequação da MSR utilizada.

As Figuras 3.13b e 3.13c mostram que a agitação não apresenta nenhum efeito

individual, nem interacção com os outros factores na produção da lacase, conforme já

discutido anteriormente.

102


478,437 1368,31 2258,184 3148,06 4037,93 4927,806 5817,68 6707,553 7597,427 8487,3 above

Superfície de resposta2**(3-0) design; MS Residual=193628,6

z=2931,55-220,6875*x-1237,7638*y+350,005*x*y+2,495*180*x+,45652*180*y-2051,55

464,267 624,259 784,252 944,244 1104,236 1264,23 1424,22 1584,213 1744,206 1904,2 above


z=2931,55-1237,7638*y-11,3975*x+350,0055*3,*y+2,4956*3,*x+,4565*x*y-662,0625

(rpm)

(g/L)

773,932 1440,156 2106,38 2772,604 3438,83 4105,05 4771,276 5437,5 6103,725 6769,95 above


z=2931,55-220,6875*y-11,3975*x+350,0055*8,*y+2,4956*x*y+,4565*8,*x-9902,11

(rpm)

Figura 3.13 - Superfícies de resposta para o planeamento de experiências 23.

103


Os resultados obtidos mostram claramente que é necessário o controlo do pH do

meio de cultura para a obtenção de elevadas actividades de lacase. Durante as

fermentações sem controlo de pH e com concentrações de glucose de 9 g/L, observou-se

que o pH diminui até um valor de 3.0, e que essa diminuição do pH ocorre

simultaneamente ao consumo de glucose (Figura 3.14), como aconteceu no cultivo em

matraz descrito anteriormente.

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10 12 14

Tempo (dias)

Glu

cose

(g/L

)iiiii

3

3,4

3,8

4,2

4,6

5

pH

Glucose pH

Glu

cose

(g/L

)

Tempo (dias)

Figura 3.14 – Consumo de glucose e pH do meio durante a produção de lacase por Trametes versicolor para uma concentração inicial de glucose de 9 g/L e sem controlo de pH.

Conforme já discutido anteriormente há ácidos orgânicos que são produzidos

durante a fermentação. Os resultados mostraram que baixos valores de pH não são

favoráveis à produção de lacase por T. versicolor. Este facto pode ter duas explicações:

Pode o metabolismo da produção de lacase ser reprimido pelos baixos valores de pH; ou

mudanças conformacionais na estrutura tri-dimensional podem ser promovidas pelo

baixo pH, afectando o sítio activo da enzima e não permitindo assim a ocorrência de

reacções biocatalíticas de oxidação.

Com a finalidade de avaliar a perda de actividade da enzima a baixos pHs,

estudou-se a sua estabilidade para valores de pH de 3.0, 4.5 e 5.0 (controlo). A pH 3.0

observou-se uma perda de 50% na actividade da lacase durante o primeiro dia de

incubação, atingindo-se um valor de 80% de perda de actividade após três dias. Para o pH

de 4.5 observou-se uma perda de apenas 11% após os três dias de incubação. Para o

controlo, a pH 5.0, não foi observada qualquer redução na actividade da lacase durante os

três dias, o que mostra que pH de 5.0 é o ideal para a manutenção da actividade da lacase.

Quando se comparam os resultados para as fermentações com glucose, com e sem

104


controlo de pH (F3 e F4; F7 e F8), verifica-se pela actividade obtida que houve uma

redução correspondente de 90-93% na actividade da lacase para as fermentações sem

controlo de pH. Estes resultados parecem indicar que a hipótese considerada em relação à

pouca estabilidade da lacase a valores de pH baixos seja mais favorável, embora não

excluam por completo que haja alguma inibição metabólica de produção da lacase pelo

fungo nestas condições.

Estudos recentes, mostram que a estabilidade da lacase é muito dependente do pH

e da temperatura (Palonen et al., 2003; Galhaup et al. 2002a, Souza et al., 2002).

Nyanhongo et al. (2002) mostra que a actividade da lacase produzida por Trametes

modesta foi significativamente inibida a pH 3 e acima de 5, mostrando um óptimo a pH

4. Jonsson et al. (1997) observaram que pH abaixo de 4 é prejudicial para a produção da

lacase e sugere que essa perda é devido à susceptibilidade para proteases ácidas nessas

condições.

Galhaup et al. (2002b) relatam que para Trametes pubescens, quando a

concentração de glucose está presente no meio de cultura acima de um valor crítico (0.25

g/L), a síntese da lacase é reprimida e que a produção somente aumenta quando a glucose

é esgotada no meio. Neste estudo em bioreactor, quando o pH do meio não era controlado

e com glucose inicial de 9 g/L, a máxima produção da lacase foi obtida quando se

esgotou a glucose. No entanto, quando se controlou o pH, mesmo com 9 g/L de glucose

no meio cultura, obteve-se um grande aumento na actividade da lacase no meio.

Contrariamente ao mostrado por Galhaup et al. (2002b) para T. pubescens, a produção de

lacase não é inibida pela presença de glucose em altas concentrações, mas sim pelo baixo

valor do pH do meio de cultura, que é resultante do consumo de glucose. É importante

salientar que o estudo de Galhaup et al. (2002b) não foram efectuados em biorreactor e

portanto só estudaram situações sem controlo de pH.

Os resultados mostrados em bioreactor explicam as altas produções de lacase em

matraz em condições de limitação por carbono, quando se estuda o efeito de diferentes

concentrações iniciais de glucose. Pode-se afirmar que quando não havia glucose no

meio, em condições de limitação por carbono, se obtiveram as maiores produções de

lacase devido ao mais elevado valor de pH, e as menores actividades observadas com as

105


maiores concentrações de glucose não são devidas aos mecanismos de repressão por

glucose, mas sim ao baixo valor de pH do meio nestas condições.

3.2.2 – Modelação matemática da produção de lacase em bioreactor

Os resultados até aqui apresentados mostram a importância da adição de

indutores, assim como da concentração inicial de glucose no meio de cultura e do

controlo de pH. Para estudar o comportamento do fungo em bioreactor, nomeadamente o

crescimento celular, o consumo de glucose e a produção de lacase, foi-se avaliar o efeito

da limitação e ausência de limitação por carbono em matraz. A determinação dos

parâmetros cinéticos da fermentação em matraz foi necessária, uma vez que a biomassa

não pode ser medida directamente ao longo do tempo no bioreactor. De facto o fungo

cresce em agregados (pellets) quando se encontra num meio líquido, pelo que as culturas

não são homogéneas. Para se estimar os parâmetros da biomassa em bioreactor, assumiu-

se o crescimento em condições similares em matraz. Realizaram-se fermentações em 12

matrazes nas mesmas condições onde cada matraz correspondeu a um dia da

fermentação. Deste modo, os parâmetros cinéticos de crescimento foram obtidos e

posteriormente utilizados para a modelação matemática do bioreactor.

Para o desenvolvimento do modelo de crescimento celular, consumo de substrato

e produção enzimática em matraz, foi necessário considerar a existência de duas fases de

crescimento miceliar: uma fase rápida de crescimento exponencial seguida por uma fase

lenta de desaceleração no crescimento. Na fase exponencial de crescimento, ocorre o

metabolismo primário que está associado ao aumento da biomassa. Na fase de

desaceleração do crescimento, um diferente perfil de enzimas é produzido devido às

condições necessárias para o desenvolvimento de diferentes vias metabólicas. Este

modelo é descrito pelas equações 2.2a e 2.2b apresentadas anteriormente. Foi proposto

por Ikasari & Mitchell (2004), para fermentação em estado sólido, e é aqui adaptado para

fermentação em meio líquido, uma vez que o crescimento celular apresenta um perfil

muito semelhante ao estudado em estado sólido. As equações do modelo para as duas

fases foram desenvolvidas separadamente sendo o modelo ajustado aos dados

experimentais.

106


Os parâmetros cinéticos para a produção da lacase por T. versicolor com e sem

limitação por carbono, em matraz, estão apresentados na Tabela 3.4.

Tabela 3.4 – Parâmetros cinéticos da fermentação de Trametes versicolor em matraz

Parâmetros cinéticos Meio sem limitação por

carbono

Meio com limitação por

carbono

µmax (d-1) 0.87 0.82

Ks (g/L) 4.21 1.30

YX/S (g/g) 0.17 0.38

L 0.37 0.41

k (d-1) 0.0921 0.253

α (U/ g biomassa) 0.059 0.147

β (U/ g biomassa. d) 62.9 499

Os resultados da Tabela 3.4 mostram que a taxa específica de crescimento

máxima, µmax, é muito similar para ambos os meios de cultura: 0.87 dia-1 para o meio com

carbono e 0.82 dia-1 para o meio com limitação por carbono. Por outro lado, a constante

de saturação do substrato (Ks) é 3 vezes maior para o meio com carbono, uma vez que

esta constante está relacionada com a biomassa máxima obtida (1.7 g/L para o meio com

carbono e 0.8 g/L para o meio com limitação por carbono). O valor do parâmetro k,

constante de decaimento exponencial, obtida no meio com limitação por carbono, é 2.7

vezes maior do que no meio com carbono, o que indica que ocorre uma grande

desaceleração no crescimento celular quando o carbono está presente. Uma vez que

durante a fase exponencial de crescimento, o meio de cultura é o mesmo, o parâmetro L

(razão entre a taxa específica de crescimento no início da fase de desaceleração e a taxa

específica de crescimento durante a fase exponencial prévia), é semelhante para ambos os

meios.

Para a produção da lacase, o modelo de Luedeking-Piret (equação 2.4, capítulo 2)

foi adoptado, uma vez que a formação da lacase não é produto do metabolismo primário,

107


mas sim do metabolismo secundário. Os resultados apresentados na Tabela 3.4 mostram

que o valor da constante associada ao crescimento, α, é muito baixo (α = 0.059 ou α =

0.147 U/g de biomassa) quando comparado com o valor de β, constante não associada ao

crescimento (β = 62,9 ou β = 499 U g-1 de biomassa d-1), o que mostra que em ambos os

meios a produção da lacase somente se inicia na fase de desaceleração lenta no

crescimento, que se inicia após o terceiro dia. Este modelo de produção de lacase está de

acordo com a definição das duas fases distintas para o crescimento da biomassa

previamente adoptado.

Os resultados do modelo, juntamente com os dados experimentais para os meios

com e sem limitação por carbono para cultivo em matraz, estão apresentados nas Figuras

3.15 e 3.16. Os modelos utilizados correlacionam com grande aproximação o crescimento

da biomassa, o consumo de substrato e a síntese da lacase em cultivo submerso não

homogéneo.

Os dados das Figuras 3.15 e 3.16 mostram que a produção da lacase em matraz

somente tem inicio a partir do 5º dia de cultivo, quando o crescimento da biomassa se

encontra na fase de desaceleração, tanto para o meio com carbono como para o meio com

limitação por carbono, conforme já mostrado através dos parâmetros α e β.

Os resultados da modelação matemática em bioreactor para as oito experiências

realizadas com planeamento factorial (Tabela 2.5), onde se avalia a concentração da

biomassa, consumo de substrato e produção de lacase, são mostrados nas Figuras 3.17-

3.19. Assim como na modelação dos resultados em matraz, também aqui se obteve uma

boa descrição dos dados experimentais. O perfil da produção de lacase no meio com

limitação por carbono (F1, F2, F5 e F6) e sem limitação por carbono (F3, F4, F7 e F8) é

mostrado nas Figuras 3.17 e 3.18, respectivamente. A Figura 3.19 mostra a modelação

matemática do consumo de glucose e do crescimento da biomassa. O modelo utilizado

parece permitir uma previsão adequada do perfil de crescimento da biomassa, uma vez

que a curva do modelo descreve correctamente o único valor acessível

experimentalmente que é o da biomassa final.

Nas melhores condições de fermentação, ou seja, para o meio com glucose e

controlo de pH (F4 e F8), a produção da lacase atinge uma actividade máxima ao 5º dia,

apesar do meio de cultura apresentar ainda glucose e crescimento de biomassa. Para

108


meios sem controlo de pH (F3 e F7) o perfil da actividade da lacase apresenta um

aumento contínuo sem chegar a ser atingido um pico de actividade máxima.

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

0 2 4 6 8 10 12 14

Tempo (dias)

Bio

mas

sa (g

/L)

0

2

4

6

8

10

12

Glu

cose

(g/L

)

Experimental X Calculado X Experimental S Calculado S

0100200300400500600700800

0 2 4 6 8 10 12 14

Tempo (dias)

Laca

se (U

/L)

Experimental Calculado

Figura 3.15- Dados experimentais e modelados para o cultivo de Trametes versicolor em matraz com o meio com carbono. (X) biomassa; (S) glucose.

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

0 2 4 6 8 10

Tempo (dias)

Bio

mas

sa (

g/L)

0

2

4

6

8

10

12

14

Glu

cose

(g/

L)

Experimental X Calculado X Experimental S Calculado S

0

500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

0 2 4 6 8 1

Tempo (dias)

Laca

se (U

/L)

Experimental Calculado

0

Figura 3.16 - Dados experimentais e modelados para o cultivo de Trametes versicolor em matraz com o meio com limitação por carbono. (X) biomassa; (S) glucose.

De acordo com os resultados modelados e a concentração da biomassa final, para

as experiências com glucose, o crescimento da biomassa não foi influenciado pelas

condições estudadas, em todos os casos, a concentração final de biomassa obtida foi de

1.5 g/L aproximadamente indicando que o aumento na actividade da lacase não foi

devido ao aumento da biomassa, mas sim às diferenças nas condições de cultivo. O perfil

de crescimento da biomassa foi o mesmo para todas as condições estudadas, com a fase

estacionária a ter inicio no final da fermentação.

109


0

500

1000

1500

2000

2500

0 2 4 6 8 10

Tempo (dias)

Laca

se (U

/L)

0

500

1000

1500

2000

2500

0 2 4 6 8 10

Tempo (dias)

Laca

se (U

/L)

F1 F2

Figura 3.17 - Dados experimentais e modelados para a produção de lacase em bioreactor por

Trametes versicolor em diferentes condições de fermentação: F1, F2, F5 e F6 (meios com limitação por carbono). Os dados experimentais estão representados por símbolos e os modelados por linhas.

0

500

1000

1500

2000

2500

0 2 4 6 8 10

Tempo (dias)

Laca

se (U

/L)

0

500

1000

1500

2000

2500

0 2 4 6 8 10

Tempo (dias)

Laca

se (U

/L)

F5 F6

0

200

400

600

800

0 2 4 6 8 10Tempo (dias)

Laca

se (U

/L)m

0

2000

4000

6000

8000

0 2 4 6 8 10

Tempo (dias)

Laca

se (U

/L)

0

200

400

600

800

0 2 4 6 8 10

Tempo (dias)

Laca

se (U

/L

F3 F4

0

2000

4000

6000

8000

0 2 4 6 8 10Tempo (dias)

Laca

se (U

/L)

F8F7)

Figura 3.18 - Dados experimentais e modelados para a produção de lacase em bioreactor por

Trametes versicolor em diferentes condições de fermentação: F3, F4, F7 e F8 (meios com carbono). Os dados experimentais estão representados por símbolos e os modelados por linhas.

110


0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8 10Tempo (dias)

Glu

cose

(g/L

)

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

Bio

mas

sa (g

/L)

Sexp Scalc Xcalc Xfinal

0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8 10

Tempo (dias)

Glu

cose

(g/L

)

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

Bio

mas

sa (g

/L)


0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8 10Tempo (dias)

Glu

cose

(g/L

)

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

Bio

mas

sa (

g/L)

i


0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10

Tempo (dias)G

luco

se (g

/L)

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

Bio

mas

sa (g

/L)


F7 F8

F3 F4

Figura 3.19 - Dados experimentais e modelados para o consumo de glucose e dados modelados para o crescimento da biomassa em bioreactor por Trametes versicolor em diferentes condições de fermentação: F3, F4, F7 e F8 (meios com glucose). Os dados experimentais estão representados por símbolos e os modelados por linhas.

Os parâmetros cinéticos para a síntese da lacase (K1), degradação da lacase (K2) e

o parâmetro A estão apresentados na Tabela 3.5. Para as fermentações com limitação por

carbono, o parâmetro A foi tomado como 1, uma vez que a mudança do matraz para o

ambiente do bioreactor pode afectar somente o crescimento do fungo e não a síntese

enzimática e sob estas condições nenhum crescimento da biomassa foi observado. Dos

resultados apresentados na Tabela 3.5, é possível afirmar que a síntese de lacase por T.

versicolor é essencialmente determinada pela relação entre a presença de carbono no

meio de cultura e o controlo de pH, uma vez que nestas experiências foram obtidos

valores elevados de K1 (F4 e F8). Também se pode verificar que a influência da agitação

na fermentação não determina a produção enzimática no intervalo estudado. Os valores

de K2 apresentam um perfil similar aos obtido por K1, i.e. altos valores de K1 indicam

altos valores de K2, como esperado. Este resultado indica a existência de altos níveis de

inativação enzimática.

111


Tabela 3.5 – Parâmetros para a produção de lacase em bioreactor por Trametes versicolor

Experiência A K1 (U/ (g biomassa.d) K2 (d-1)

F1 1 1443 0.263

F2 1 1293 0.335

F3 0.51 14.3 0.026

F4 0.54 1932 0.667

F5 1 771.3 0.039

F6 1 564.4 0.084

F7 0.85 78.9 0.377

F8 0.64 2088 1.55

3.3 – Aplicação da lacase para o biobranqueamento da pasta de papel 3.3.1 – Comparação dos mediadores da lacase para o branqueamento da pasta

3.3.1.1 – Ensaios de biobranqueamento da pasta Embora a lacase seja uma enzima oxidativa, quando directamente aplicada nas

pastas não proporciona uma oxidação eficaz. A sua aplicação no branqueamento das

pastas tem sido muito estudada, mas ainda não se conseguiram resultados satisfatórios.

De facto a lacase sozinha apresenta um baixo potencial de oxidação-redução, podendo

apenas oxidar os fragmentos fenólicos da lenhina (Fabbrini et al., 2002). No entanto,

ultimamente a aplicação da lacase tem sido estudada em sistemas com mediadores

desempenhando o papel de reoxidante dos mediadores.

Neste estudo, fez-se uma comparação da aplicação da lacase nas pastas com

diferentes mediadores orgânicos, já estudados por diversos autores (Bourbonnais &

Paice, 1996; Bourbonnais et al., 1997; Bourbonnais et al., 1998; Call & Mucke, 1997;

Fabbrini et al., 2002, Ander et al., 1998; Li et al., 1999) e com mediadores inorgânicos,

nomeadamente polioxometalatos (Balakshin et al., 1998; Balakshin et al., 2001; Gamelas

et al. 2005). As principais vantagens dos POMs em relação aos mediadores orgânicos são

112


os altos potenciais redox, a capacidade de reoxidação, alta selectividade (capacidade de

deslenhificação com um mínimo de degradação dos polissacarídeos).

Todos os testes foram realizados a 45ºC e pH 4.5 que é aceitável do ponto de vista

da estabilidade/actividade da lacase. A redução do índice kappa traduz a oxidação dos

compostos insaturáveis nas pastas e a perda de viscosidade intrínseca está directamente

associada à degradação dos polissacarídeos da pasta. Esta perda de viscosidade não é

desejável para o fabrico de papel, uma vez que altera as propriedades mecânicas da pasta

branqueada. É o balanço deste binómio que dita a eficiência do processo de

branqueamento.

Na Tabela 3.6 e na Figura 3.20 encontram-se resultados dos branqueamentos da

pasta de papel com lacase e sem mediador; com lacase (L) e mediadores orgânicos

TEMPO, ABTS, HBT e ácido violúrico; e com lacase e mediadores inorgânicos POMs

(PW11MnIII, SiW11MnIII e SiW11VV). Conforme o previsto, quando a lacase se encontra

sem mediador no sistema de branqueamento de pasta de papel, os resultados da redução

no índice kappa são baixos, com apenas 11% de redução, quando comparados com o

sistema lacase-mediador (SLM), onde a redução no índice kappa variou de 13.0 a 26.2%,

dependendo do mediador utilizado. Houve sempre uma deslenhificação semelhante ao

trabalhar com este sistema SLM, sendo o melhor resultado obtido pelo ácido violúrico,

que apresenta uma maior redução no índice kappa e simultaneamente uma perda de

viscosidade de 8.4%, o que corresponde a uma boa selectividade de oxidação. Dos

mediadores testados, o TEMPO apresentou uma baixa viscosidade da pasta de 575 cm3/g

(perda de viscosidade de 51.4%), indicando uma extensa degradação dos polissacarídeos,

não sendo portanto, um mediador eficaz.

Todos os POMs estudados nestas condições apresentaram uma reduzida

deslenhificação, o que não permite distinguir qual o POM que apresenta a melhor

capacidade de branqueamento da pasta nestas condições. É importante notar que o pH

utilizado encontra-se dentro do intervalo de estabilidade (3-7) destes POMs (Tourné et

al., 1970).

113


Tabela 3.6 – Branqueamento da pasta kraft catalisado por lacase (L) na presença de diferentes mediadores a 45ºC

Sistema de branqueamento

Índice Kappa

Viscosidade Intrínseca

(cm3/g)

Redução do índice kappa

(%)

Perda de viscosidade

intrínseca (%)

POM oxidado

(%)

Pasta kraft (controlo) 12.3 1185 - - -

Lacase 10.9 1170 11.0 1.4 -

TEMPO+L 10.5 575 14.2 51.4 -

ABTS+L 10.2 1130 16.2 4.6 -

HBT+L 10.1 1100 17.5 7.2 -

Ácido violúrico +L 9.0 1085 26.2 8.4 -

PW11MnIII+L 10.2 1160 17.0 2.0 4.0

SiW11MnIII+L 10.3 1155 15.8 2.6 47

SiW11VV+L 10.6 1145 13.0 3.0 100

02468

101214

Past

a

Laca

se

L+TE

MPO

L+Si

W11

Mn

L+AB

TS

L+H

BT

L+Ac

.Vi

olúr

ico

Visc

osid

ade

intr

ínse

ca (c

m3/

g)

0200400600800100012001400

Índice kappa Viscosidade intrínseca

Índi

ce k

appa

L +

SiW

11M

nIII

L +

SiW

11VV

Índi

ce k

appa

L+S

iW11

MnI

II

Figura 3.20 – Variação da viscosidade intrínseca e do índice kappa para o sistema de branqueamento da pasta de papel a 45 ºC com diferentes mediadores.

Com a finalidade de se aumentar o grau de deslenhificação no SLM, uma vez que

os branqueamentos com POMs são referidos a elevadas temperaturas (Gaspar et al.

2003), acima de 100ºC, fez-se uma nova experiência com 60ºC no sistema reacional,

dado que a lacase não permite operar a temperaturas mais elevadas. Testaram-se ainda

114


outros POMs tais como: BW11CoIII, (PW9)2MnIII e SiW11CoIII. Conforme os resultados

apresentados na Tabela 3.7 e na Figura 3.21 o aumento da temperatura do sistema de 45

ºC para 60 ºC não favoreceu a deslenhificação da pasta ocorrendo um aumento no índice

kappa quando se utilizaram os POMs PW11MnIII+L e SiW11MnIII+L. Somente para o

POM SiW11VV+L foi observado um ligeiro aumento na redução do índice kappa, de 13%

para 15%. Os demais mediadores estudados também não apresentaram reduções

significativas no índice kappa. A menor redução do índice kappa com o aumento da

temperatura para os sistemas PW11MnIII+L e SiW11MnIII+L é justificado pelo estado de

oxidação destes POMs no fim da reacção. De facto a 60 ºC a concentração de POM no

estado oxidado é menor. Este facto pode ser explicado pela menor eficiência da lacase na

reoxidação dos POMs a 60 ºC possivelmente devido à sua inactivação ou sua parcial

desnaturação a esta temperatura mais elevada. O ligeiro aumento na redução do índice

kappa conseguido com o POM SiW11VV está relacionado com a sua grande facilidade em

ser reoxidado pela lacase, apresentando uma percentagem de reoxidação de 79% no fim

do branqueamento.

O processo de oxidação da lenhina ocorre pela acção da forma oxidada do POM,

sendo a forma reduzida resultante, reoxidada directamente pela lacase. As condições

termodinâmicas das reacções redox podem ser apresentadas da seguinte forma:

Eo lenhina < Eo POM < Eo lacase (~0.8 V) ( Balakshin et al., 2001) (3.2)

Para se compreender melhor este processo de oxidação – redução dos POMs pela

lacase fizeram-se espectros UV-Vis no final dos branqueamentos e determinou-se a

percentagem de POM no estado oxidado. Além disso, fez-se um estudo em separado, sem

a pasta de papel, de reoxidação directa dos POMs pela lacase.

115


Tabela 3.7 – Branqueamento da pasta kraft catalisado por lacase na presença de diferentes mediadores a 60 ºC

Sistema de branqueamento

Índice kappa

Viscosidade Intrínseca

(cm3/g)

Redução do índice kappa (%)

Perda de viscosidade

intrínseca (%)

POM oxidado

(%)

Pasta kraft

(controlo) 12,3 1190 - -

-

Lacase 11,1 1150 7,5 2,8 -

B W11CoIII+L 11,3 1110 9,0 6,7 -

(PW9)2III +L 10,9 1140 11,9 3,9 -

SiCoW11 +L 10,2 1060 16,5 10,6 -

Ac. violúrico+L 8,9 1110 27,1 6,5 -

SiW11MnIII 10,4 1080 15,1 9,0 12

PW11MnIII+L 10,7 1140 12,7 4,3 4

SiW11MnIII+L 10,5 1100 13,8 7,3 33

SiW11VV+L 10,4 1130 15,50 3.0 79

7,5

8,5

9,5

10,5

11,5

12,5

Pas

ta

L+B

CoW

11

Laca

se

L +(

PW

)2M

nIII

L+P

W11

Mn

L+S

iW11

MnI

II

SiW

11M

nIII

L+S

iCoW

11

L+A

c. v

iorú

lico

L +

SiW

11V

v

Índi

ce K

appa

Índice kappa Viscosidade Íntrinseca

950

1000

1050

1100

1150

1200

Visc

osid

ade

intr

ínse

ca (c

m3/

g)

L+PW

11M

nIII

SiW

11M

nIII

L+S

iW11

MnI

I

L+S

iW11

CoI

II

L+S

iW11

VV

L+BW

11C

oIII

L+(P

W) 2

MnI

II

Figura 3.21 – Variação da viscosidade intrínseca e do índice kappa para o sistema de branqueamento da pasta de papel a 60 ºC com diferentes mediadores.

116


Na Figura 3.22 pode ver-se o espectro de absorção do SiW11MnIII 100% no estado

oxidado (controlo) e os resultados obtidos com este POM no final das diferentes

condições de branqueamentos (testes a 45 ºC e a 60 ºC). A banda característica deste

POM tem um máximo de absorção a 490nm permitindo calcular a percentagem deste

POM que permanece no estado oxidado no final de cada ensaio. Os resultados mostram

que o aumento deste POM no estado oxidado seguiu a seguinte ordem: SiW11MnIII a 60

ºC (12 % no estado oxidado) < L+ SiW11MnIII a 60 ºC (33 % no estado oxidado) < L+

SiW11MnIII a 45 ºC (47 % no estado oxidado). Para o branqueamento sem lacase (60ºC)

uma pequena quantidade de POM no estado oxidado foi encontrado. Quando se

adicionou lacase ao sistema de branqueamento com o POM, a percentagem de POM no

estado oxidado aumentou para 33% a 60 ºC e para 47% a 45 ºC. Estes resultados

mostram que a oxidação da pasta é mais eficiente quando para além do POM se usa a

lacase. Por outro lado, os resultados mostram ainda que a oxidação do POM pela lacase é

mais eficiente a 45 ºC do que a 60 ºC, o que justifica os resultados apresentados

anteriormente.

0

1

2

3

100 200 300 400 500 600 700 800 900

�

Abs

.

a

bcd

Abso

rvân

cia

Comprimento de onda (nm)

Figura 3.22 – Espectros de UV-Vis da solução de SiW11MnIII antes do branqueamento (controlo)

e ao final do branqueamento em diferentes condições de reacção: (a) controlo; (b)

L+SiW11MnIII a 45ºC; (c) L+SiW11MnIII a 60ºC; (d) SiW11MnIII a 60ºC.

A Figura 3.23 compara o estado de oxidação no final da reacção para os POMs

PW11MnIII, SiW11MnIII e SiW11VV. Estes resultados também mostram que para qualquer

117


POM, o aumento da temperatura faz com que uma menor concentração de POM seja

oxidada, devido à perda de actividade da lacase com a subida da temperatura. O SiW11VV

é o POM que se reoxida de um modo mais eficaz atingindo 100% de reoxidação a 45ºC,

seguido do SiW11MnIII que atinge 47% a 45ºC e finalmente o PW11MnIII que apenas

chega a 4% de reoxidação a 45ºC.

Com a finalidade de verificar se a lacase apresentava perda de actividade com o

aumento da temperatura, a sua actividade foi determinada ao fim de cada branqueamento.

Para as experiências com SiW11MnIII, a lacase apresentou uma perda na actividade de

21% (de 380.5 U/L inicial para 300 U/L no final) para o branqueamento a 45ºC e de 58%

(de 380.5 U/L inicial para 158 U/L no fim) para o branqueamento a 60ºC. Estes

resultados estão de acordo com a percentagem de SiW11MnIII no estado oxidado a 45ºC e

a 60ºC, confirmando a perda da actividade da lacase com o aumento da temperatura. Nos

sistemas com lacase e com os POMs PW11MnIII e SiW11VV não foi possível determinar a

actividade da lacase no final da reacção, uma vez que estes POMs reagem com o

substrato que avalia a actividade enzimática.

0

20

40

60

80

100

POM

no

esta

do o

xida

do

(%)ii

iiiiii

ii

POM

(con

trol

o)

L+Si

W11

VV45

ºC

L+Si

W11

VV60

ºC

L+Si

W11

MnI

II45

ºC

L+Si

W11

MnI

II 60

ºC

SiW

11M

nIII

60ºC

L+PW

11M

nIII

45ºC

L+PW

11M

nIII

60ºC

POM

no

esta

do o

xida

do (%

)

Figura 3.23 –Percentual de SiW11MnIII, SiW11VV e PW11MnIII no estado oxidado ao final da reacção para as diferentes condições de branqueamento.

118


119

3.3.1.2 Estudo de oxidação dos POMs pela lacase

No estudo comparativo de oxidação do SiW11VIV, SiW11MnII e PW11MnII pela

lacase avaliou-se a eficiência do sistema catalítico na ausência da pasta de papel. As

condições das reacções foram seleccionadas levando-se em consideração a estabilidade

da lacase e dos POMs (temperatura ambiente, pH=4.5, concentração de POM 3.0

mmol/L, actividade inicial de lacase de 380 U/L). O estado de oxidação dos POMs

também foi monitorado através dos espectros de UV-Vis e os resultados são apresentados

na Figura 3.24. A forma reduzida do SiW11MnII apresenta uma coloração amarela, que se

foi alterando gradualmente para cor de rosa (forma oxidada) com o decorrer da reacção.

A banda de transição tem um máximo de absorção ao comprimento de onda de 490-495

nm (Figura 3.24A). Do mesmo modo, a cor rosa escuro característica do SiW11VIV na

forma reduzida alterou-se para amarela, a cor da forma oxidada, apresentando uma banda

característica no espectro visível com um máximo de absorção em 490 nm (Figura

3.24B). Um comportamento semelhante foi observado para o PW11MnII, embora com

uma baixíssima taxa de reoxidação (espectro não apresentado). A oxidação do SiW11VIV

para SiW11VV pela lacase também foi monitorada por espectroscopia 51V RMN, que

confirma que a estrutura do SiW11VV (Figura 3.25) manteve-se inalterada.

0.0

0.5

1.0

300 400 500 600 700

Wavelength (nm)

Abso

rban

ce

a

b

c

d

e

0

0.5

1

1.5

2

2.5

300 400 500 600 700

A B

Wavelength (nm)

Abs

orba

nce

a

b

c

de

Figura 3.24 – Espectro UV-Vis para as soluções aquosas (3.0 mmol/L) de SiW11MnII (A) e SiW11VIV (B) a pH=4.5 e com adição de lacase (380 U/L) a temperatura ambiente e pressão atmosférica (a). A: 4h (b); 8 h (c); 24 h (d); 50 h (e); B: 15 min. (b); 30 min. (c); 60 min. (d); 120 min. (e).

Abs

orvâ

ncia

Abso

rvân

cia

Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm)


-570-560-550-540-530ppm

a

b

Figura 3.25 – Espectro de 51V RMN da solução original de SiW11VV (a) da solução obtida após a reacção do SiW11VIV (3.0 mmol/L) com a lacase (b).

A reacção de reoxidação dos diferentes POMs pela lacase também foi estudada

variando a actividade inicial de lacase, a pressão de oxigénio e a temperatura, uma vez

que a subida de temperatura de 45ºC para 60ºC se revelou desfavorável nos

branqueamentos, testou-se a temperatura de 25ºC. A Tabela 3.8 mostra os resultados da

percentagem de cada POM no estado oxidado. O PW11MnII, apresenta a menor

reoxidação pela lacase, uma vez que mesmo no final de 24h de reacção com a lacase,

somente 5% foi oxidado. Para o mesmo período de tempo, cerca de 55% do SiW11MnII já

se encontrava na forma oxidada e após 15 min de reacção mais de 50 % do SiW11VIV já

se encontrava na sua forma oxidada. Observando a Figura 3.24B verifica-se que se

obteve uma reoxidação praticamente completa do SiW11VIV logo após 2h de reacção.

Desta forma, o poder de oxidação destes três POMs pela lacase pode ser ordenado do

seguinte modo: PW11MnII << SiW11MnII < SiW11VIV.

É interessante notar que a reoxidação do PW11MnII e do SiW11MnII foi mais eficaz

na presença da pasta kraft (Tabela 3.6 e 3.7) do que nas experiências sem a pasta (Tabela

3.8). Uma das possíveis explicações pode ser o facto de ocorrer estabilização/activação

120


da lacase com os compostos fenólicos removidos da degradação parcial da lenhina. Mai

et al. (2000), mostrou que a presença de compostos fenólicos ou derivados da lenhina

aumentam a estabilidade e actividade da lacase, e sugere que esta estabilização pode ser

devido à ligação dos compostos ao centro activo da enzima ou a outra parte da cadeia da

proteína. Deste modo, certamente a reoxidação do PW11Mn e do SiW11Mn na presença da

pasta de papel, consegue ser mais eficaz devido à lacase se encontrar mais estável.

Os resultados mostram claramente que o efeito do aumento da concentração de

lacase de 380 U/L para 1330 U/L foi o mais significativo. O aumento da pressão de

oxigénio de 0.02 MPa para 0.3 MPa também melhorou a oxidação do POM pela lacase

como se vê no resultado obtido com o SiW11MnII. A temperatura apresentou um efeito

menor na reacção de oxidação deste mesmo POM. A temperatura máxima de reacção foi

limitada em 45ºC nestas experiências, uma vez que ocorreu uma diminuição na actividade

da lacase em temperaturas superiores a 50ºC. O POM que apresentou melhores resultados

quando oxidado pela lacase foi o SiW11VIV chegando até 82% após 15 min. de reacção. O

SiW11MnII também apresentou resultados significativos, uma vez que se oxidou em cerca

de 50% após 4 horas nas melhores condições de actividade inicial de lacase, pressão de

O2 e de temperatura. O PW11MnII apresentou um resultado insignificante uma vez que só

chegou a 5% de oxidação após 24 horas.

Tabela 3.8 – Oxidação dos polioxometalatos pela lacase em diferentes condições de reacção

POM Lacase (U/L) Pressão de O2 (MPa) Temperatura (ºC) POM oxidado (%)

SiW11MnII 380 ~0.02 25 16 (55)a

SiW11MnII 1330 ~0.02 25 35 (84)a

SiW11MnII 1330 0.3 25 48 (88)a

SiW11MnII 1330 0.3 45 52 (95)a

SiW11MnII 380 0.3 45 36 (69)a

SiW11VIV 380 ~0.02 25 52 (72)b

SiW11VIV 1330 ~0.02 25 82 (96)b

PW11MnII 380 ~0.02 25 <1 (5)a

a Medidas após 4 h ou após 24 h (dados entre parênteses). b Medidas após 15 min ou após 30 min (dados entre parênteses).

121


Considerando-se os potenciais redox destes POMs, a difícil oxidação do

PW11MnII pela lacase pode smer justificada pelo seu evado potencial (E=+0.91 V vs.

ENH) (Zhang et al., 1995). Uma vez que o potencial redox da lacase é muito próximo

deste, cerca de +0.8-0.9 V (vs. ENH) (Solomon et al., 1996; Mayer & Staples, 1996), este

POM é dificilmente reoxidado por esta enzima. Para os outros dois POMs, as diferenças

significativas no comportamento de oxidação do SiW11MnII e do SiW11VIV não podem

ser formalmente explicadas pelos potenciais redox descritos na literatura, uma vez que

são muito próximos. Para o SiW11V o potencial redox efectivo (E=(Epc+Epa)/2) do par

redox VV/IV foi apresentado como +0.64 V (vs. ENH, pH=5) (Altenau et al., 1975) e, em

outro estudo, como +0.72 V (vs. ENH, pH=4.5) (Harmalker & Pope, 1986).

Recentemente, Weinstock et al. (1997) mostrou o valor de potencial rdox efectivo de E =

+0.69 V para pH=5. Para o SiW11Mn o potencial redox do par MnIII/II foi medido como

+0.65 V (vs. ENH) (Tourné et al., 1970) e, mais recentemente, como +0.70-0.73 V (vs.

ENH) (Zhang et al., 1995; Sadakane & Steckhan, 1999; Sadakane & Steckhan, 1996).

Desta forma, uma comparação dos dados sobre os potenciais redox destes dois POMs não

é clara para se avaliarem as diferenças nos resultados. Além disso, sabe-se que os

potenciais redox dos POMs podem ser muito sensíveis a factores tais como o pH, os

contra iões e outros (Grigoriev et al., 2000).

Para se tentar esclarecer as diferenças nos potenciais redox desses dois POMs

(SiW11MnII e SiW11VIV) fez-se uma análise de voltametria cíclica em condições similares

às utilizadas nas experiências de branqueamento. Pelos resultados apresentados na Figura

3.26, pode-se observar que o par VV/IV no SiW11VIV é eletroquimicamente reversível

(Figura 3.26a) apresentando um E=+0.67 V (Epa=+0.70 V, Epc=+0.64 V, Epa-Epc=60 mV).

O correspondente par MnIII/II no SiW11Mn é quase - reversível (Figura 3.24b) e apresenta

um E=+0.76 V com Epa=+0.88 V, Epc=+0.64 V, e Epa-Epc=240 mV (vs. ENH). Deste

modo, a fácil oxidação do SiW11VIV pela lacase está relacionada com a sua alta

reversibilidade e com o baixo potencial de oxidação (Epa=+0.70V) do vanádio, quando

comparado com o do manganês, que apresenta um potencial de oxidação de Epa=+0.88V,

o que torna a sua reoxidação pela lacase mais difícil do que para o vanádio.

122


020040060080010001200

Potential (mV) vs. Ag/AgCl

1 µAa

b

Potencial (mV) vs. Ag/AgCl

Figura 3.26 – Voltametria cíclica (v=10 mV/s) dos POMs SiW11VIV (a) e SiW11MnII (b) ([POM]=1.0 mmol/L, pH=4.5, 25ºC).

3.3.2 – Branqueamento da pasta kraft com SiW11MnIII e lacase SiW11VV e lacase num sistema de multi-estágios

Como mostrado nos resultados anteriores, os POMs SiW11MnIII e SiW11VV são

facilmente reoxidados pela lacase a baixas temperaturas. Entretanto, sabe-se que estes

POMs actuam de forma mais eficiente quando as reacções de branqueamento com pasta

ocorrem a temperaturas superiores a 100ºC. Para se tentar solucionar esta

incompatibilidade de temperaturas óptimas, para o POM e para a lacase, realizou-se um

estudo catalítico de deslenhificação da pasta de papel em estágios separados e alternados.

Realizou-se o primeiro estágio de branqueamento com a temperatura óptima para o POM

(estágio POM a 110ºC) na ausência de lacase, seguido de um segundo estágio de

reoxidação do POM com a adição de lacase (estágio L) em difentes temperaturas (30, 45

e 60 ºC). Neste processo utilizaram-se os POMs SiW11MnIII, SiW11VV e PW11MnIII.

Os resultados obtidos com os estágios sequenciais de branqueamento com o

SiW11MnIII estão mostrados na Tabela 3.9. O tratamento prosseguiu até um total de 5

estágios POM e L alternados. Com um único estágio de branqueamento, o estágio POM,

pouca redução no índice kappa foi observada, resultando numa deslenhificação de apenas

23%, além do POM estar predominantemente no estado reduzido no final da reacção

(somente 4% encontrava-se no estado oxidado).

123


Quando a lacase foi adicionada no segundo estágio (L), um aumento de 5% no

grau de deslenhificação foi obtido e o POM passou a estar 68% no estado oxidado no

final do segundo estágio, o que foi importante para se obter uma maior deslenhificação

no estágio posterior. Adicionalmente, realizou-se um espectro de UV-vis do efluente

deste branqueamento depois de armazenado por uns dias (Figura 3.27). Nesta altura

quase 100% do POM se encontrava no estado oxidado. De qualquer modo, os dois

estágios de branqueamento mostraram melhores resultados, com um aumento de

aproximadamente duas vezes no grau de deslenhificação, do que um único estágio de

POM+L 45ºC (já apresentados na Tabela 3.8) por outro lado, demostrou uma menor

selectividade devido a maior perda na viscosidade.

Tabela 3.9 – Branqueamento da pasta kraft em estágios sequenciais catalisado por SiW11MnIII

(POM) e lacase

Sistema de

branqueamento

Índice

Kappa

Viscosidade

Intrínseca

(cm3/g)

Redução no

índice kappa

(%)

Perda de

viscosidade

Intrínseca

(%)

SiW11MnIII

(%, oxid.)

Pasta kraft 12.3 1185 - - -

Sem catalisador 10.6 1140 14 4 -

POM 9.5 1130 23 5 4*

POM-L (45ºC) 8.9 1080 28 9 68* (98)**

POM-L-(45ºC)-

POM

6.9 1075 44 9 7*

POM-L-(45ºC)-

POM-L(45ºC)-POM

6.0 1020 51 14 11*

POM-L (30ºC)-

POM

7.1 1065 42 10 -

POM-L (60ºC)-

POM

7.5 1065 39 10 -

PW11Mn-L 9.0 1085 27 8 4*

* Dados para o último estágio da sequência.** Solução armazenada durante uma semana.

Ao fim do terceiro estágio de branqueamento (POM-L-POM), uma grande

deslenhificação foi obtida, com 44% de redução no índice kappa e ao mesmo tempo

124


houve baixa perda de viscosidade, apenas 9%. A adição de mais um estágio POM na

sequência de branqueamento não demonstrou uma perda de viscosidade tão significativa

como quando se adicionou um estágio L. Este facto sugere que os estágios L são

responsáveis por uma maior perda de viscosidade. De facto esta enzima, para além de

oxidar o POM, oxida também a celulose pelo que promove a perda de viscosidade da

pasta de papel (Thurston, 1994; Accunzo & Galli, 2003).

Após 5 estágios consecutivos de branqueamento (POM-L-POM-L-POM),

obtveram-se os melhores resultados, com um índice kappa de 6.0, que corresponde mais

de 50% de deslenhificação da pasta, com apenas 14% de perda de viscosidade da pasta

(Tabela 3.9).

Para avaliar se a temperatura do estágio L apresenta algum efeito neste processo

de branqueamento em multi-estágios, testou-se a temperatura do estágio L também a

30ºC. Os resultados mostraram que a variação da temperatura no estágio L de 45ºC para

30 ºC e 60ºC não apresentaram nenhum benefício para os três estágios de branqueamento

da pasta (Tabela 3.9). Isto pode ser explicado pela menor reoxidação do SiW11MnII a

30ºC do que a 45ºC e pela parcial desnaturação da lacase a 60ºC.

Os espectros UV-Vis, apresentados na Figura 3.27, foram determinados para um

estágio, para dois estágios e para cinco estágios de branqueamento. Observa-se que nos

branqueamentos que não terminam num estágio L, o POM encontra-se praticamente todo

no estado reduzido (Figura 3.27 b, e).

O PW11MnIII também foi testado nas experiências de multi-estágios. Com dois

estágios de branqueamento, o grau de deslenhificação obtido foi similar ao SiW11MnIII

nas mesmas condições experimentais (Tabela 3.9). No entanto, a reoxidação do

PW11MnIII após o estágio com a lacase foi muito baixa, apenas 4% no estado oxidado, o

que não justificou o uso deste catalisador com 3 e 5 estágios de branqueamento.

É importante notar que a diminuição do índice kappa da pasta não branqueada é

determinada não somente pela oxidação da lenhina, mas também devido à hidrólise dos

resíduos de ácido hexourónico (HexA) ligados aos polissacarídeos da pasta. A pasta kraft

de eucalipto contém cerca de 30-40 mmol de HexA/kg de pasta seca, o que corresponde a

3-4 unidades de índice kappa (Furtado et al., 2001). Então, a 110ºC e pH 4.5 uma parcial

125


hidrólise do HexA contribui para a diminuição do índice kappa. Este facto foi confirmado

pela experiência em branco sem a adição de nenhum catalisador (Tabela 3.9).

0

0,5

1

1,5

300 400 500 600 700

Wavelength (nm)

Abs

orba

nce

c

d

b

a

e


Abso

rvân

cia

Figura 3.27 – Espectros de UV-VIS da solução de SiW11MnIII antes do branqueamento (a); depois

de um estágio de branqueamento POM (b); depois de dois estágios de branqueamento POM-L (c) seguido de uma semana de armazenamento do efluente (d); depois de cinco estágios de branqueamento POM-L-POM-L-POM (e).

O mesmo tratamento de branqueamento da pasta em multi-estágios foi aplicado

para o POM SiW11VV. Os resultados mostrados na Tabela 3.10 indicam que este POM foi

mais eficiente na deslenhificação da pasta do que o SiW11MnIII, entretanto apresentou

uma menor selectividade. Os resultados mais próximos entre estes dois POMs foram

obtidos com dois estágios de branqueamento (POM-L), Tabelas 3.9 e 3.10. Com apenas

três estágios de branqueamento, o SiW11VV apresentou o mesmo grau de deslenhificação,

cerca de 50%, do que o SiW11MnIII com cinco estágios de branqueamento. O aumento da

temperatura também não favoreceu o branqueamento.

126


Tabela 3.10 - Branqueamento da pasta kraft em estágios sequenciais catalisado por SiW11VV e lacase

Sistema de

branqueamento

Índice

Kappa

Viscosidade

Intrínseca

(cm3/g)

Redução no

índice kappa

(%)

Perda de

Viscosidade

Intrínseca (%)

SiW11VV

oxidado

(%)

Pasta Kraft 12.3 1185 --- --- ---

POM 9.0 1055 26 11 6

POM-L (45ºC) 8.2 1035 33 13 98

POM-L (60ºC) 7.7 1010 37 15 80

POM-L (45ºC)-POM 6.9 1005 44 15 15

POM-L (60ºC)-POM 6.2 935 50 21 12

Similarmente ao SiW11Mn, o SiW11V foi encontrado predominantemente na

forma reduzida após os estágios POM e POM-L-POM, como mostrado na Figura 3.28,

que apresenta os espectros de UV/Vis no final das reações. Após o estágio POM-L cerca

de 80-100 % do SiW11V ficou no estado oxidado que corresponde a uma taxa de

reoxidação mais rápida do que para o SiW11Mn nas mesmas condições reacionais. O

espectro de RMN confirma a estabilidade do SiW11V após as reacções em multi-estágios

(Figura 3.28).

Figura 3.28 – Espectros de UV-Vis da solução de SiW11VV antes do branqueamento (a), depois

de um estágio POM de branqueamento (b), depois de dois estágios POM-L (45ºC) de branqueamento (c), depois de dois estágios POM-L (60ºC) de branqueamento (d), e depois de três estágios POM-L (60ºC)-POM de branqueamento (e).

0

0.5

1

1.5

2

2.5

300 400 500 600 700 800

Wavelength (nm)

Abs

orba

nce

a

b

c

d

e


Abso

rvân

cia

127


A menor selectividade do SiW11VV no branqueamento da pasta quando

comparada com o SiW11MnIII pode ser explicada pela parcial dissociação, com a

libertação dos iões VO2+ do SiW11VV em condições acidificadas que favorecem a

degradação dos polissacarídeos da pasta de papel. Emboras as espécies de VO2+ não

terem sido detectadas pela análise de RMN (Figura 3.29) ao fim do branqueamento, a sua

formação durante o branqueamento pode ter ocorrido. Esses iões causam a

despolimerização oxidativa da pasta de papel. Os iões livres VO2+ apresentam um

potencial de redução mais alto, Eº= 0.9 V, do que o POM correspondente, além de exibir

um forte actividade catalítica em reacções com compostos orgânicos. Deste modo, VO2+

pode ser considerado como uma das espécies catalíticas mais activas, além de apresentar

um efeito pronunciado na oxidação da celulose durante a catálise do branqueamento da

pasta com o SiW11VV (Shatalov et al., 2000).

-600-580-560-540-520-500ppm

Figura 3.29 – Espectro de 51V RMN da solução obtida após dois estágios de branqueamento:

SiW11V-L (60ºC).

128


3.4 – Produção de exopolissacarídeo (EPS) por Trametes versicolor

3.4.1 Selecção do meio de produção do exopolissacarídeo

Com a finalidade de seleccionar o melhor meio de cultura para a produção de EPS

por T. versicolor estudaram-se em cinco diferentes meios já descritos: meio Tien & Kirk

(TaK) (utilizado na manutenção do fungo); meio definido para Trametes (MDT) (meio

utilizado na produção da lacase); meio extracto de malte e levedura (YM); meio completo

para fungos (MCM) e meio glucose extracto de levedura e peptona (GPY).

Dos cinco meios testados no cultivo, nenhuma produção de EPS por T. versicolor

foi observada para os meios MDT e GPY. O meio MDT, por ser um meio definido e

pobre, provavelmente não possui as fontes de nutrientes necessárias para sintetizar o EPS

pelo fungo. Por outro lado, o meio GPY apresenta uma alta concentração de glucose (40

g/L) que provavelmente inibe ou reprime o mecanismo de produção do EPS pelo fungo.

Os outros três meios usados, TaK, YM e MCM mostraram-se promissores para a

produção do EPS.

A Figura 3.30 mostra o crescimento da biomassa (a), o consumo de açúcares

redutores (b) e a produção do EPS (c) para os meios MCM, TaK e YM. Os resultados

mostram que a concentração dos açúcares redutores diminui durante a fermentação com o

correspondente aumento da biomassa. A curva da biomassa (Figura 30a) apresenta uma

fase de crescimento linear da biomassa entre o segundo e o quarto dia de cultivo e uma

fase de desaceleração no crescimento entre o quarto e o sétimo dia de cultivo. Este perfil

de crescimento da biomassa, com duas fases, foi o mesmo observado durante a produção

de lacase pelo T. versicolor neste estudo.

A produção do EPS somente se iniciou ao quarto dia de cultivo (Figura 3.30c), o

que mostra que a formação deste EPS não é associada à fase exponencial de crescimento

da biomassa (Figura 3.30a). A produção do EPS desencadeia-se quando termina o

crescimento celular mais activo e as células iniciam a fase de desaceleração do

crescimento. Este comportamento é típico dos produtos que não são produzidos pelo

metabolismo primário, cuja produção é associada com o crescimento exponencial da

biomassa, mas sim dos produtos do metabolismo secundário. Usualmente, os produtos

129


secundários dos fungos filamentosos estão relacionados com a produção dos metabólitos

secundários no início da fase de desaceleração no crescimento (Waites et al. 2001).

Comparando-se a produção do EPS nos três meios de cultura (Figura 3.30c),

observa-se que a produção termina após o sétimo dia de cultivo para os três meios

estudados. A produção máxima é obtida numa concentração de aproximadamente 700

mg/L (Tabela 3.11) no último dia de cultivo para o meio YM, enquanto que para os

meios TaK e MCM a concentração máxima de EPS obtida foi de 590 e 460 mg/L,

respectivamente. É de salientar que para ambos os meios a produção do EPS terminou

antes do consumo total de substrato.

A produção do EPS obtida com o meio YM (700 mg/L; Tabela 3.11) foi superior

do que a mostrada por Kim et al. (2002a) para o cultivo de C. versicolor, cuja máxima

produção do EPS no meio YM foi de 504 mg/L.

Tabela 3.11 - Resultados do cultivo de Trametes versicolor nos meios de cultura TaK, MCM e

YM.

Meio de cultura Parâmetros de cultivo

TaK MCM YM

Concentração máxima da biomassa (g/L) 4.4 3.3 3.8

Concentração máxima do EPS (mg/L) 590 460 700

Máxima viscosidade aparente (mPa.s) 26.0 16.0 47.1

Máxima produtividade do EPS (g/L d-1) 0.073 0.068 0.094

Rendimento (g de biomassa/g de açúcares

redutores consumidos)

0.24 0.17 0.23

Máximo EPS/biomassa (g/g) 0.16 0.14 0.24

130


(a)

(c)

(b)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

0 2 4 6 8 1

Bio

mas

sa (g

/L

0

)

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

0 2 4 6 8 1

Açú

care

s re

duto

res

(g/L

0

)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 2 4 6 8 1

Tempo (dias)

EPS

(g/L

)

0

TaK MCM YM Figura 3.30 – Crescimento da biomassa (a), consumo de açúcares redutores (b), produção de EPS

(c) durante a fermentação de Trametes versicolor nos meios TaK, MCM e YM.

A Tabela 3.11 mostra os resultados do cultivo de T. versicolor para a produção do

EPS nos meios de cultivo TaK, MCM e YM. Embora a alta concentração e o rendimento

da biomassa (g de biomassa/g de açúcares redutores consumidos) sejam obtidos com o

meio TaK, a máxima concentração e a máxima produtividade de EPS são conseguidas

usando-se o meio YM, conforme discutido anteriormente. Calculando-se a razão máxima

131


de EPS/biomassa (g/g), claramente se mostra que o meio YM apresenta os melhores

resultados com 0.24 g/g que é 1.5 e 1.7 vezes superior quando comparado com os meios

TaK e MCM, respectivamente. Por outro lado, TaK é o melhor meio para a produção de

biomassa, com concentrações finais de 4.4 g/L, enquanto que os meios YM e MCM

obtiveram concentrações finais de biomassa de apenas 3.8 e 3.3 g/L, respectivamente.

Estudos com o fungo do género Tremella mostraram que o YM foi o melhor meio

para a produção de polissacarídeo extracelular em termos de rendimento do polímero,

tanto para cultivos líquidos como para cultivos sólidos, quando comparado com o meio

GPY e com o meio potato dextrose agar (PDA) (Khondkar et al. 2002).

3.4.2 Optimização do meio de cultura YM para a produção de EPS

Os resultados discutidos anteriormente indicaram que YM foi o melhor meio de

cultura para a produção de EPS por T. versicolor e por isso foi seleccionado para a

optimização da produção do EPS. Os resultados apresentados para a produção da lacase

mostraram que, a concentração de glucose como fonte de carbono e o pH do meio de

cultura como um factor físico, são as duas principais condições de cultivo que podem

afectar tanto o crescimento celular como a formação do produto. Para optimizar o pH e a

concentração de glucose para a produção do EPS, o cultivo de T. versicolor foi estudado

no meio YM, partindo-se um planeamento de experiências 22 com um ponto central. Para

a glucose escolheu-se um nível inferior de 5 g/L, um nível superior de 15 g/L e um ponto

central de 10 g/L. Para o pH testou-se um nível inferior de 4, um nível superior de 7 e um

ponto central de 5.5.

A Figura 3.31 mostra os resultados da produção do EPS por T. versicolor em

diferentes valores de pH e concentrações iniciais de glucose no meio de cultura,

conforme o planeamento de experiências. Os meios com a maior concentração inicial de

glucose apresentaram um maior crescimento celular e maior produção de biopolímero. Os

meios com valor de pH de 4 apresentaram um consumo de açúcares redutores mais lento

pelo fungo, entretanto este facto resultou numa maior quantidade de biomassa formada.

Para os meios com concentração inicial de glucose 15 g/L, nota-se claramente que o valor

de pH de 4 favoreceu a produção da biomassa enquanto que o pH de 7 favoreceu a

132


produção do EPS. Para os meios com concentração inicial de glucose de 5 g/L já não é

possível notar-se este facto, uma vez que a produção do EPS pelo fungo é muito

aproximada durante o cultivo.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0 2 4 6 8 10

Bio

mas

sa (g

/

0

4

8

12

16

20

0 2 4 6 8 1

Açú

care

s re

duto

res

(g/L

)(a)

0

0

200

400

600

800

0 2 4 6 8 1

Tempo (dias)

EPS

(mg/

L)

G5 pH4 G5 pH7 G10 pH 5.5 G15 pH4 G15 pH7

Bio

mas

sa (g

/L)

Açú

care

s re

duct

ores

(g/L

)EP

S (m

g/L)

(b)

(c)

0

Figura 3.31 – Crescimento da biomassa (a), consumo de açúcares redutores (b) e produção de EPS (c) durante o cultivo de Trametes versicolor em diferentes concentrações (g/L) de glucose (G) e valores de pH.

133


A optimização do EPS foi realizada através do planeamento de experiências 22

com um ponto central conforme se encontra no gráfico de superfície de resposta na

Figura 3.32 e na Tabela 3.12. A resposta do planeamento foi a máxima produção de EPS

produzida no decorrer do cultivo. De acordo com a Figura 3.32 o pH não exerce uma

grande influencia na máxima produção do EPS, ao contrário do aumento da concentração

inicial de glucose que apresentou um grande aumento na máxima produção do EPS.

366,961 398,288 429,615 460,942 492,27 523,597 554,924 586,251 617,579 648,906 above

Superfície de Resposta; Variável: EPS2**(2-0) design; MS Residual=4898,45

DV: EPS

EPS=334,52+5,97*G-15,1*pH+3,03*G*pH

(mg/L)

Figura 3.32 – Superfície de resposta para o planeamento de experiências 22.

De acordo com os resultados deste planeamento de experiências não foi possível

obter o ponto de máxima curvatura para a máxima produção de EPS com os níveis de pH

e de glucose seleccionados. Deste modo, um segundo planeamento de experiências foi

realizado, onde os níveis dos factores passaram a ser: glucose com um nível inferior de 5

g/L, um nível superior de 25 g/L e um ponto central de 15 g/L e o pH com um nível

inferior de 4, um nível superior de 7 e um ponto central de 5.5.

134


Tabela 3.12 – Planeamento de experiências 22 e repostas da produção de EPS por Trametes versicolor

Experiência pH

inicial

Glucose

inicial

(g/L)

Biomassa

final (g/L)

Máxima concentração

de EPS (mg/L)

E1 4 5 3.0 380

E2 7 5 2.0 380

E3 5.5 10 3.4 415

E4 4 15 4.8 561

E5 7 15 3.6 652

Os resultados do segundo planeamento de experiências para a produção do EPS

estão mostrados na Tabela 3.13.

Tabela 3.13 - Resultados para o segundo planeamento de experiências 22 e repostas da produção de EPS por Trametes versicolor

Experiência Glucose

inicial

(g/L)

pH

inicial

Biomassa

final

(g/L)

Máxima

concentração

de EPS (mg/L)

Produtividade

do EPS (mg

/(L.d))

A1 5 4 3.0 380 47.5

A2 5 7 2.7 380 47.5

A3 15 5.5 4.2 640 80.0

A4 15 4 3.8 520 74.3

A5 25 4 2.5 274 34.3

A6 25 7 2.3 300 37.5

A análise dos resultados da Tabela 3.13 mostra que os meios com uma

concentração inicial de glucose de 15 g/L promoveram as melhores produções e

135


produtividades do EPS, com 640 mg/L e 80 mg /(L.d) respectivamente, assim como o

melhor crescimento celular. Esses resultados indicam que esta concentração de glucose

foi a mais favorável para a produção do EPS provavelmente devido à uma concentração

celular elevada nestas condições. Para a maior concentração inicial de glucose, 25 g/L, a

produção do EPS não foi estimulada, resultando em baixas concentrações, menores que

300 mg/L e também em baixos crescimentos celulares. Elevadas concentrações de

glucose (acima de 20 g/L) provavelmente afectam o metabolismo da síntese do EPS por

T. versicolor assim como o próprio crescimento celular. Fang & Zhong (2002) sugerem

que na presença de altas concentrações de glucose (acima de 50 g/L) o crescimento do

fungo Ganoderma lucidum e a produção de um polissacarídeo intracelular foram inibidos

devido à pressão osmótica desfavorável do meio de cultura, entretanto a alta

concentração de glucose favoreceu a produção de polissacarídeo extracelular. Num outro

estudo, a produção do EPS pelo fungo Paecilomyces japonica também mostrou que a

concentração da fonte de carbono é um factor importante para a produção de um

biopolímero e para o crescimento do fungo, além de influenciar a morfologia do fungo e

a reologia do meio, que determina as características de transporte em altas concentrações

(acima de 40 g/L) (Sinha et al. 2001b).

Nesse segundo planeamento de experiências, o modelo de superfície de resposta

de segunda ordem é adoptado e mais um ponto no planeamento (ponto A4, Tabela 3.13)

foi adicionado. Este ponto correspondeu a mais um ponto central para não afectar as

estimativas usuais dos efeitos. O modelo usado contém somente os termos lineares (L) e

quadráticos (Q) dos efeitos principais. O modelo que contém os termos lineares e

quadráticos dos efeitos principais e a interacção dos dois factores também foi aplicado e

mostrou-se inadequado para representar os dados experimentais obtidos.

A significância de cada coeficiente foi determinada através do valor de p (p <

0.1), considerando-se 90% de intervalo de confiança, onde os baixos valores de p indicam

um valor significativo do efeito de cada factor (Tabela 3.14).

136


Tabela 3.14- Efeitos individuais calculados e ANOVA para o planeamento de experiências 22

Efeitos Estimado Valor de t Valor de p SS df MS F

Glucose

(L)

-93.0 -7.1538 0.0884 8649.00 1 8649.00 51.1775

Glucose

(Q)

-386.0 -12.1218 0.0524 24832.67 1 24832.67 146.9389

pH (L) 13.0 1.0000 0.500 169.00 1 169.00 1.0000

pH (Q) -227.0 -5.8205 0.1083 5725.44 1 5725.44 33.8784

Error 169.00 1 169.00

Total SS 97203.33 5

R2=0.99826

O gráfico de superfície de resposta (Figura 3.33) mostra o efeito da variação da

concentração inicial de glucose e do pH na produção do EPS. Tanto a variação da glucose

como a do pH afectaram a concentração máxima do EPS obtido. Neste caso foi possível

observar a curvatura do plano, ou seja, verificou-se a existência dos temos quadráticos no

modelo de regressão. As curvas de nível da Figura 3.33 servem para definir melhor a

região de máximo do rendimento. O máximo valor previsto para a produção do EPS foi

de 642.9 mg/L a uma concentração de glucose de 13.8 g/L e de pH de 5.5. A equação 3.3

representa o modelo da superfície de resposta para a produção do EPS (Figura 3.32):

EPS (mg/L) = -1274.28+53.25×G-1.93×G2+559.22×pH-50.44×pH2 (3.3)

137


-9,248 55,949 121,146 186,343 251,539 316,736 381,933 447,13 512,326 577,523 above

Superfície de Resposta; Variável: EPS2 factores, 6 experiências; MS Residual=169,

DV: EPS

Figura 3.33 – Superfície de resposta para a produção do EPS do segundo planeamento de experiências 22 com ponto central.

3.4.3 Análises do EPS

3.4.3.1 Análise dos açúcares neutros

A análise dos açúcares neutros presentes no EPS produzido nos três diferentes

meios YM, MCM e TaK foi realizada usando-se a metodologia de Blakeney et al. (1983)

e os resultados estão resumidos na Tabela 3.15. O açúcar predominante no EPS

produzido nos três meios de cultura foi a glucose, com quantidades relativas de 98%,

95% e 88% para os meios YM, TaK e MCM, respectivamente. Pequenas quantidades de

manose e xilose também foram detectadas no EPS produzido nestes meios em diferentes

quantidades. O EPS produzido no meio MCM contem 3% de outros açúcares, que

incluem a ramnose, a arabinose, a galactose e a fucose. Estes resultados indicam que o

meio de cultura influencia a composição dos açúcares neutros do EPS produzido por T.

versicolor. Entretanto, sem levar em consideração o meio de cultura, o açúcar

predominante é a glucose que está de acordo com os dados previamente publicados por

Miayazaki et al. (1974) para este fungo, onde o açúcar predominante foi a glucose com

138


um conteúdo estimado de 97.2%. Também Sugira et al. (1980) referiram que a glucose é

o principal açúcar do EPS extraído do micélio deste fungo.

Tabela 3.15- Açúcares neutros presentes no EPS produzido por Trametes versicolor nos meios

YM, MCM e TaK

Açúcares neutros (%, p/p) Meios

Glucose Manose Xilose Outros(*)

MCM 88% 7.4% 1.6% 3%

YM 98% 1.2% 0.8% traços (§)

TaK 95% 3.4% 1.6% traços (§)

(*) Ramnose, Arabinose, Galactose, Fucose (§) ≤ 0.1%

Os ácidos hexurónicos presentes no EPS produzido pelo T. versicolor foram

quantificados pelo total de ácido galacturónico (Anexo A4). Os resultados estão

apresentados na Tabela 3.16. Nota-se que o teor em ácidos hexurónicos do EPS

produzido no meio TaK é inferior aos dos outros EPSs produzidos nos meios YM e

MCM.

Tabela 3.16 - Ácidos hexourónicos presentes no EPS produzido por Trametes versicolor nos meios YM, MCM e TaK

Meio Ácidos Hexurónicos (mg/mg EPS)

MCM 59.6

YM 53.4

TaK 31.8

3.4.3.2 Análise Termogravimétrica

A análise termogravimétrica do EPS produzido nos meios YM, MCM e TaK pode

ser observada na Figura 3.34. O EPS foi termicamente estável até uma temperatura de

139


280°C para os meios TaK e YM e de 250ºC para o meio MCM. Acima destas

temperaturas a decomposição do EPS ocorreu em dois estágios: o primeiro ocorreu entre

aproximadamente 270ºC e 350ºC observando-se uma rápida perda de peso, que

representa uma perda de massa do EPS de 50%, 60% e 57% para o EPS produzido nos

meios YM, TaK e MCM, respectivamente; o segundo estágio de decomposição iniciou-se

a partir de 350°C até 560°C, onde uma decomposição mais lenta e gradual do EPS foi

registada, possivelmente devido à decomposição dos agregados de polissacarídeos. A

partir de 700°C nenhuma perda de peso foi observada, indicando um resíduo inorgânico

de 7.5 % para o EPS produzido nos meios YM e TaK e de 1.5% para o EPS produzido no

meio MCM.

0

20

40

60

80

100

120

0 200 400 600 800 1000

Temperatura (ºC)

Perd

a de

mas

sa (%

)

a

cb

Figura 3.34 – Análise termogravimétrica do EPS produzido nos meios YM (a), TaK (b) e MCM (c).

3.4.3.3 Análise de cromatografia de permeação em gel (GPC)

A distribuição do peso molecular médio do EPS obtido nos meios YM, MCM e

TaK está apresentada no cromatrograma da Figura 3.35. Os perfis da distribuição do peso

molecular foram muito semelhantes para o EPS produzido nos meios TaK e MCM,

enquanto que o EPS do meio YM apresentou um perfil de distribuição mais distinto, com

uma banda mais alargada o que pode representar a presença de agregados.

Os pesos moleculares médios obtidos foram: 67 KDa para o meio YM, 21 KDa

para o meio TaK e 25 KDa para o meio MCM. Comparando estes valores dos pesos

moleculares médios, com os polissacarídeos de T. versicolor PSK e PSP que apresentam

140


um peso molecular de 100 KDa (Cui & Chisti 2003), o peso molecular médio do EPS

produzido no meio YM foi o que mais se aproximou a este valor .

Distribuição de massas

0

15

30

45

60

75

90

105

120

135

150

12 13 14 15 16 17 18 19 20

Volume de retenção Vr

Res

post

a - I

nten

sida

de R

I/m

miii

iiiii

YM MCM TaK

Distribuição de massasR

espo

sta

-In

tens

idad

e R

I/m

m

Volume de retenção (mL)

Figura 3.35 – Análise de cromatografia de permeação em gel (GPC) do EPS produzido nos meios YM, MCM e TaK.

3.4.3.4 Análise reológica do meio de cultura

O comportamento reológico dos meios de cultura YM, MCM e TaK durante a

produção do EPS por T. versicolor está mostrado na Figura 3.36. Em termos qualitativos,

o comportamento reológico foi similar para todos os meios de cultura. Durante os quatro

primeiros dias, antes que significativa quantidade de EPS no meio fosse produzida, o

comportamento reológico do meio apresentou-se essencialmente Newtoniano. Após este

período, ocorreu uma mudança no comportamento reológico dos meios, passando de

Newtoniano para o comportamento Pseudoplástico, que é o comportamento esperado

para dispersões de polissacarídeos em meio aquoso (Whistler et al. 1997), onde o grau da

pseudoplasticidade do polímero é dependente da concentração presente.

141


A Figura 3.37 mostra a viscosidade aparente dos três meios de cultura durante

toda fermentação para uma taxa de cisalhamento de 10s-1. Os resultados mostram que a

viscosidade aparente do cultivo aumenta rapidamente a partir do quarto dia da

fermentação. Para o meio YM a viscosidade aparente aumentou continuamente até o

oitavo dia de cultivo, em concordância com os resultados obtidos de peso seco do EPS ao

longo da fermentação (3.31c).

Para os meios MCM e TaK a viscosidade aparente aumentou até ao sexto e sétimo

dia respectivamente (Figura 3.37), permanecendo a viscosidade constante até ao fim da

fermentação para o meio MCM enquanto que para o meio TaK houve uma ligeira

diminuição na viscosidade.

142


(a)

0,00

0,01

0,10

1,00

10,00

0,01 0,1 1 10 100 1000

Velocidade de corte (s-1)

Vis

cosi

dade

apa

rent

e (P

a.s)

Meio YM dia 4 dia 5 dia 6dia 7 dia 8 dia 9

Visc

osid

ade

apar

ente

(Pa

.s)

(b)

0,00

0,01

0,10

1,00

10,00

0,01 0,1 1 10 100 1000

Velocidade de corte (s-1)

Visc

osid

ade

apar

ente

(Pa.

s)i

Meio MCM dia 2 dia 4dia 6 dia 7 dia 8

Visc

osid

ade

apar

ente

(Pa

.s)

(c)

0,00

0,01

0,10

1,00

10,00

0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000Velocidade de corte (s-1)

Visc

osid

ade

apar

ente

(P

Meio TaK dia 3 dia 4 dia 5dia 6 dia 7 dia 8 dia 9

Visc

osid

ade

apar

ente

(Pa

.s)

Figura 3.36 – Viscosidade aparente dos meios de culturas YM (a), MCM (b) e TaK (c) durante a produção de EPS por Trametes versicolor.

143


0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0 2 4 6 8Tempo (dias)

Visc

osid

ade

apar

ente

(P

a.s)

iiiiii

iiii

Visc

osid

ade

apar

ente

(Pa.

s)

10

TaK MCM YM

Figura 3.37 – Viscosidade aparente dos meios de cultura TaK, MCM e YM durante a produção do EPS por Trametes versicolor.

Comparando-se as Figuras 3.31c e 3.37 observa-se uma boa relação entre a

concentração do EPS e a viscosidade do meio de cultura. Uma vez que a quantificação do

EPS por peso seco é uma metodologia trabalhosa e que demora bastante tempo, a

avaliação da produção do EPS durante o tempo de fermentação pode ser determinada

através da análise reológica do meio de cultura, sendo esta metodologia com muito mais

precisão e rapidez. Deste modo, procurou-se uma correlação entre o peso seco do EPS e a

viscosidade aparente do meio de cultura YM e obteve-se uma correlação logarítmica

mostrada na Figura 3.38 e pela equação 3.4 (R2= 0.9903):

Y = 235.64 ln (X) + 1495.5 (3.4)

onde X é a concentração do EPS (mg/L) e Y é a viscosidade aparente (Pa.s).

y = 235,64Ln(x) + 1495,5R2 = 0,9903

0

200

400

600

800

1000

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05Viscosidade aparente (Pa.s)

EPS

( mg/

L)iii

i

EPS

(mg/

mL)

Figura 3.38 – Concentração do EPS em relação à viscosidade aparente do meio de cultura.

144


3.4.3.5 Análise do EPS produzido no meio YM por Espectrometria no Infravermelho

com Transformada de Fourier (FTIR)

O espectro de FTIR obtido a partir do EPS produzido no meio YM está mostrado

na Figura 3.39. O espectro é consistente com os espectros obtidos de polissacarídeos, de

acordo com as seguintes bandas observadas: banda a 3400 cm-1 larga e forte devido aos

grupos hidroxilo (υ O-H) e humidade residual do EPS; pequena banda a 2925 cm-1

característica da vibração dos grupos metino e metileno (υ C-H); banda a 1076 cm-1

típica das ligações éter (υ C-O-C) e finalmente uma pequena banda a 894 cm-1 indicando

a presença de ligações glicosídicas, banda das estruturas polissacarídicas. A banda a 1635

cm-1 pode ser designada por δ N-H, sendo correspondente à vibração de grupos de

proteína residual ou à presença de humidade residual.

Figura 3.39 – Espectro de absorção na região do Infravermelho do EPS produzido por Trametes versicolor no meio YM.

Espectro de IV da F6O

0

10

20

30

40

50

60

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500-1)

Tran

smitâ

ncia

(%)

Tran

smitâ

ncia

(%)

Núm ero de onda (cmNúmero de onda (cm-1)

3.4.3.6 Análise do EPS por Espectrometria de Emissão de Plasma Induzido (ICP) e por

Análise elementar

O teor em iões do EPS produzido nos meios YM, MCM e TaK está apresentado

na Tabela 3.17. O EPS que apresentou uma maior quantidade de iões foi o produzido no

145


meio MCM, seguido pelo EPS produzido no meio TaK e no meio YM. Estes resultados

não puderam ser associados com a análise termogravimétrica uma vez que no meio MCM

o EPS apresentou uma menor quantidade de resíduos (1.5%) quando comparado com o

EPS produzido nos meios YM e TaK com 7.5% de massa residual (Figura 3.34).

Os dados da análise elementar do EPS mostram que este apresenta praticamente a

mesma composição em C, N e H para os três meios de produção. O EPS é composto por

uma maior percentagem em C, aproximadamente 35%, uma concentração em H entre 5 e

7% e um baixo teor em N com cerca de 1%.

Tabela 3.17 – Teor em iões e análise elementar do EPS produzido por Trametes versicolor nos meios YM, MCM e TaK

Iões (mg/g) (ICP) Análise elementar (%) Meios

P Fe Mg Ca Na K C H N

YM 2,08 0,15 0,15 1,52 0,69 2,29 34,45 5,65 0,9

MCM 8,10 0,27 8,32 2,57 0,91 10,4 35,98 7,05 0,97

TaK 8,66 0,08 5,24 6,75 0,09 1,01 35,91 6,4 1,1

146

Conclusões

Capítulo 4 - Conclusões Através deste trabalho, pode-se concluir que o fungo da podridão branca da

madeira, Trametes versicolor, foi capaz de produzir a enzima lacase em concentrações

significativas em matraz e em bioreactor:

I. A concentração inicial de glucose foi extremamente importante para a optimização da

produção da lacase em matraz, as menores actividades de lacase foram observadas

para as maiores concentrações iniciais de glucose (5 e 9 g/L), mostrando que altos

níveis de glucose reprimem a produção da lacase, enquanto que a limitação por

carbono favoreceu a produção enzimática;

II. O perfil da evolução da concentração de proteína total do meio de cultura não

coincide com o perfil da produção da lacase, o que indica que o fungo produz outras

proteínas certamente necessárias ao seu desenvolvimento;

III. A queda do pH durante a produção da lacase está directamente relacionada com o

consumo de glucose por T. versicolor devido à produção de ácidos orgânicos pelo

fungo;

IV. A adição do cobre ao meio de cultura foi mais favorável como micronutriente do que

como indutor da produção da lacase;

V. Dos diferentes indutores testados na produção da lacase, o etanol não favoreceu a

produção da enzima enquanto que o cobre, 2.5-xilidina e a mistura fenólica

apresentaram um aumento na actividade da lacase, e uma maior actividade foi obtida

quando foi empregue em simultâneo a mistura fenólica com 2.5 xilidina e cobre em

condições de limitação por carbono.

A optimização da produção da lacase em bioreactor por planeamento de experiências

apresentou as maiores actividades enzimáticas:

I. Controlo de pH, concentração inicial de glucose e as suas interacções apresentam um

grande efeito na actividade máxima da lacase;

147

Conclusões

II. A máxima actividade de lacase foi obtida quando o pH do meio de cultura estava

controlado e a concentração inicial de glucose era de 9 g/L;

III. A agitação não apresenta nenhum efeito significativo na produção da lacase;

IV. Com a modelação matemática da produção da lacase em bioreactor foi possível

determinar os parâmetros cinéticos da fermentação e de estimar-se o crescimento da

biomassa ao longo do tempo;

V. A lacase é produzida durante a fase de desaceleração do crescimento da biomassa, ou

seja, durante o metabolismo secundário do fungo.

Para além da optimização da produção, aplicou-se a lacase produzida pelo T. versicolor

no branqueamento da pasta kraft de papel onde diferentes mediadores da enzima e

diferentes condições experimentais foram avaliados:

I. Dos mediadores orgânicos (TEMPO, ABTS, HBT e ácido violúrico) e inorgânicos

POMs (PW11MnIII, SiW11MnIII, BW11CoIII, (PW9)2MnIII, SiW11CoIII e SiW11VV )

testados num único estágio de branqueamento, os POMs SiW11MnIII e SiW11VV

apresentaram os melhores resultados de branqueamento com uma maior

selectividade;

II. Os espectros de UV-Vis e de voltametria cíclica da soluções de SiW11MnIII e de

SiW11VV mostram que estes POMs são facilmente reoxidados pela lacase,

principalmente para o SiW11VV;

III. Os POMs actuam mais facilmente no branqueamento da pasta a temperaturas

elevadas (110ºC) enquanto que a lacase actua preferencialmente a baixas

temperaturas (45ºC);

IV. Os branqueamentos em estágios sequenciais, com a oxidação da lenhina pelo POM a

110ºC e a reoxidação do POM pela lacase num estágio separado a 45ºC,

apresentaram uma redução no índice kappa da pasta de cerca de 50% para o POM

SiW11MnIII com 5 estágios de branqueamento e para o SiW11VV com apenas 3

estágios de branqueamento, com uma pequena perda da viscosidade intrínseca

reduzida para ambos os POMs utilizados;

148

Conclusões

V. O SiW11MnIII apresentou-se como sendo o catalisador mais selectivo enquanto que o

SiW11VV apresentou-se como sendo o mais efectivo no branqueamento da pasta

durante o branqueamento em estágios sequenciais.

Para a selecção, optimização e análise do exopolissacarídeo produzido por T.

versicolor foram estudados:

I. Os meios de cultura apresentam um papel importante na produção do

exopolissacarídeo. Dos cinco diferentes meios de cultura empregados (MCM, TaK,

YM, GPY e MDT), os meios MDT e GPY não favoreceram a produção do EPS

enquanto que os meios MCM, TaK e YM produziram EPS. Destes três, o meio YM

foi o que apresentou a maior produção de EPS;

II. As análises de reologia dos meios MCM, TaK e YM mostram que qualitativamente

estes três meios são similares, apresentando um comportamento pseudoplástico a

partir do quarto dia de fermentação. A análise de reologia do meio de cultura surge

como sendo uma metodologia rápida e eficaz para o acompanhamento da produção

do EPS ao longo da fermentação;

III. A metodologia do planeamento de experiências permitiu optimizar a produção do

EPS no meio de cultura YM. Para a maior e menor concentração inicial de glucose (5

e 25 g/L) a produção do EPS não foi favorecida. Com a concentração de 15g/L de

glucose é que se optimizou a produção de EPS;

IV. O açúcar predominante no EPS produzido nos meios de cultura MCM, TaK e YM é a

glucose embora também existam pequenas quantidades de manose e xilose. O EPS

produzido no meio MCM contem 3% de outros açúcares, que incluem ramnose,

arabinose, galactose e fucose;

V. O EPS foi termicamente estável até uma temperatura de 250-280°C para os meios

MCM e YM. Acima destas temperaturas a decomposição do EPS ocorreu em dois

estágios: no primeiro uma rápida perda de peso é observada, enquanto que no

segundo estágio se observou uma lenta decomposição. A partir de 700°C nenhuma

perda de peso é obtida;

VI. Os pesos moleculares médios do EPS nos diferentes meios são 67 KDa para o meio

YM, 21 KDa para o meio TaK e 25 KDa para o meio MCM;

149

Conclusões

VII. O EPS no meio YM apresenta grupos hidroxilas (υ O-H), grupos metino e metileno

(υ C-H), ligações de éter (υ C-O-C), ligações glicosídicas e ligações δ N-H, que

correspondem à vibração de grupos de proteína residual ou a presença de humidade

residual.

150

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163

Anexos

ANEXOS

A1. Curva de calibração para o método de DNS de determinação de açúcares

redutores

Abs = 0,4341 Gluc - 0,0115R2 = 0,9995

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Glucose (g/L)

Abs

i

Abs

orvâ

ncia

164

Anexos

A2. Curva de calibração para o método de Lowry de determinação de proteína total

Ptn = 0,7835 Abs - 0,177R2 = 0,9933

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

Absorvância

Prot

eína

tota

l (m

g/m

L)iii

iiiiii

Prot

eína

tota

l (m

g/m

L)

165

Anexos

A3. Curva de calibração do GPC para a determinação do peso molecular médio do

EPS

Curva de calibração com pululana

Log Mp= -0,5864Vr + 13,614R2 = 0,9994

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

13 14 15 16 17 18 19 20

Vr, ml

RI r

esp

Res

post

a -

Inte

nsid

ade

R I/

mm

166

Anexos

A4. Curva de calibração para a determinação dos ácidos hexourónicos

Abs = 0,0091 Ác. Galac + 0,0054R2 = 0,9967

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0 10 20 30 40 50

Ácido D-galacturónico (µg)

Abs

orvâ

ncia

iiii

Abs

orvâ

ncia

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LISTA DE PUBLICAÇÕES

A.P.M. Tavares, M.A.Z. Coelho, J.A.P. Coutinho, A.M.R.B. Xavier. Optimization and modelling of laccase production by Trametes versicolor in bioreactor using statistical experimental design, Applied Biochemistry and Biotechnology, in press (2006). A.P.M. Tavares, M.S.M. Agapito, M.A.Z. Coelho, J. A. Lopes da Silva, A. Barros-Timmons, J.A.P. Coutinho, A.M.R.B. Xavier. Selection and optimization of culture medium for exopolysaccharide production by Coriolus (Trametes) versicolor, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 21 (8-9) 1499-1507 (2005). A.P.M. Tavares, M.A.Z. Coelho, J.A.P. Coutinho, A.M.R.B. Xavier. Laccase improvement in submerged cultivation: induced production and kinetic modelling. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 80 (6) 669-676 (2005). J.A.F. Gamelas, A.P.M. Tavares, D.V. Evtuguin, A.M.B. Xavier. Oxygen bleaching of kraft pulp with polyoxometalates and laccase applying multi-stage process: comparative study. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 33: 57-64 (2005). P.F.F. Amaral, D.L.A. Fernandes, A.P.M. Tavares, A.M.R.B. Xavier, M.C. Cammarota, J.A.P. Coutinho, M.A.Z. Coelho. Dye decolorization performed by Trametes versicolor from textile wastewater. Environmental Technology, 25: 1313-1320 (2004).

A.P.M. Tavares, J.A.F. Gamelas, A. Gaspar, D.V. Evtuguin, A.M.R.B. Xavier. A novel approach for the oxidative catalysis employing polyoxometalate-laccase system: application to the oxygen bleaching of kraft pulp. Catalysis Communications, 5 485-489 (2004).

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Ana Paula Mora Produção de lacase para potencial aplicação ...path.web.ua.pt/file/Ana tavares tese.pdf · crescimento celular. Realizaram-se alguns estudos para conhecer a natureza