ANALISI DEI RAPPORTI TRA ISOTOPI ANALISI DEI RAPPORTI TRA ISOTOPI STABILI DI BIOELEMENTISTABILI DI BIOELEMENTI

IN ALIMENTI (OLIO)IN ALIMENTI (OLIO)

Federica CaminFederica Camin

Istituto Agrario di San Michele all’Adige (Trento)Istituto Agrario di San Michele all’Adige (Trento)

Isotopo ( = stesso posto

ISOTOPI (in totale circa ISOTOPI (in totale circa 1700) 1700)

Stabili (260)

Radioattivi

Isotopi di uno stesso elemento = hanno lo stesso n° di protoni (e quindi di elettroni) ma

un diverso n° di neutroni

diversa massadiversa massa

hanno lo stesso n° atomico (ZZ) ma un diverso n° di massa (AA)

Frazionamento isotopico

La variazione naturale di abbondanza isotopica nelle molecole è conseguenza delle diverse proprietà chimico-fisiche degli isotopi di uno stesso elemento.

Massadifferente

Effetto cinetico Effetto termodinamico(Differente velocità di reazione) (Differente energia libera)

Rapporti isotopici normalmente indagati negli alimenti

D/H, 13C/12C, 15N/14N, 18O/16O, 34S/32S

ElementoIsotopo

stabileAbbondanza

naturale % media

Standard di riferimento internazionale

Idrogeno

1H 99.985 V-SMOW (Vienna –Standard Mean Ocean Water)2H 0.015

Carbonio12C 98.892 V-PDB (Vienna-Pee Dee Belemnite)

Carbonato di calcio fossile13C 1.108

Azoto14N 99.6337

AIR (Azoto dell’aria)15N 0.3663

Ossigeno

16O 99.7587V-SMOW (Vienna –Standard Mean

Ocean Water)17O 0.0375

18O 0.2039

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/16O

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(CO

2,N

2,C

O)

1000‰

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R

RR R è il rapporto tra l’isotopo meno

abbondante rispetto a quello più abbondante

Misura di D/H: Risonanza Magnetica Nucleare del D (SNIF 2H-NMR)

•I = 1 => nucleo con distribuzione non simmetrica => breve T1 e T2

•Bassa sensibilità (D poco abbondante e <<)

•FT con impulso a 90°

•Solo molecole semplici (alcool, glicerina, acido acetico)

•Grandi quantità di campione (per alcool: 3 g)

•Sistema di lock, di solito alla frequenza del fluoro, per evitare drift del campo magnetico

•Disaccoppiamento del protone

•S/N > 150 (ca. 200 scansioni per spettro)

•8 spettri per un tempo totale di ca. 4 ore

•Processore di dati spettrali dedicato

Misura di D/H: Risonanza Magnetica Nucleare del D (SNIF 2H-NMR)

Spettrometro a 9.4T (400 MHz) (Bruker, Karlsruhe, Germania) dotato di campionatore automatico e corredato di sonda specifica per l'osservazione del "deuterio" (61.4 MHz per B0=9.4T), avente un canale di disaccoppiamento del protone e un canale di stabilizzazione del campo magnetico (lock) alla frequenza del fluoro.

(D/H)I CH2DCH2OH

(D/H)II CH3CHDOH

R = 2 (D/H)II / (D/H)I

- 80 - 70 - 60 - 50 - 40 - 30 - 20 - 10 0

13C (‰)

Gas naturali

Petrolio

piante CAM (vaniglia)

atm CO2

Scala che illustra qualitativamente la composizione isotopica del carbonio di alcune

sostanze naturali

13C (PDB)

CO2 in zone boschive13C = - 11 ‰

CO2 Tecnogenico

13C= - 30 ‰ piante C3 (vite, alberi da frutta, erba, olivo)

-22

‰

-33

‰

piante C4 (canna, mais)

-10

‰

-15

‰

Carbonati

(N2,NOx)

Denitrificazione

Residui organici (+10/+30 ‰)

Ammonio (NH4+)

Materiale organico (R-NH2)

Nitrati (NO3-)

Consumo daparte della pianta

MineraliLiscivamento

Precipitazioni

PARAMETRI CHE INFLUENZANO IL RAPPORTO 15N/14N NEI COMPOSTI VEGETALIPARAMETRI CHE INFLUENZANO IL RAPPORTO 15N/14N NEI COMPOSTI VEGETALI

Fissazione N2 atmosferico (0‰)

-3/+1‰

-0,5‰

±1‰Nitrificazione-12/-29‰

PARAMETRI CHE INFLUENZANO IL RAPPORTO D/H NEI COMPOSTI VEGETALI

Composizione isotopica dell'acqua di falda effetto latitudine

ciclo planetario dell'acqua

effetto geografico - continentale

effetto altitudine

Evapotraspirazione fogliare effetto climatico

(temperatura - umidità relativa)

bietola, fragola ( 91 ÷ 93 ppm )

piante a ciclo C3 mele, pere, ciliegie ecc ( 96 ÷ 108 ppm ) ( 95 ÷ 101 ppm )

Provenienza vegetaledel l’alcool vite

( 98 ÷ 108 ppm )

piante a ciclo C (canna da zucchero, mais)4 ( 110 ÷ 115 ppm )

condensazione

condensazione

FATTORI CHE INFLUENZANO I RAPPORTI ISOTOPICI DEI PRODOTTI ANIMALI

I rapporti isotopici dei prodotti animali dipendono dal tipo di alimentazione e dall’origine dell’acqua

L’ape assume gli zuccheri presenti nel nettare e li elabora senza alternarne i rapporti isotopici.

CHE INFORMAZIONI DANNO I RAPPORTI ISOTOPICI ?

tipo di isotopo è influenzato da…. e può perciò determinare…

13C/12C, D/H Metabolismo (C3,C4, CAM)

Aggiunta illecita di zucchero di canna e/o barbabietola (ad esempio a vino e succhi di frutta) Tenore di mais nella dieta animale 18O/16O, D/H Origine dell’acqua Annacquamento (ad es. nel vino)

13C/12C , D/H Sintesi chimicaAggiunta di sostanze di sintesi

18O/16O, D/H, 15N14N, 13C/12C

Origine geografica Caratterizzazione di prodotti ad origine protetta econtrollata

Analisi dei rapporti tra isotopi stabili di bioelementi (D/H, 13C/12C, 15N/14N, 18O/16O, 34S/32S)

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Possibili applicazioni delle analisi isotopiche agli Possibili applicazioni delle analisi isotopiche agli oli d’olivaoli d’oliva

– Identificazioni di sofisticazioni con oli di altre specie vegetali o con oli di sintesi

– Identificazioni di sofisticazioni con oli di provenienza geografica diversa rispetto a quella dichiarata (oli DOP)

Stato applicativo delle analisi isotopiche nel settore degli oli

Gaffney et al., 1979, Rossel, 1991 13C di diversi tipi di oli:

mais (ca. –12‰), girasole (ca. -27‰), soia (ca. – 28‰), palma (ca. – 27‰), cocco (ca. –25‰) ed arachidi (ca. –28‰)

Bianchi et al., 1993 13C di oli di diverse cultivar di olive

13C olio d’oliva: -27,18/-28,57‰

3C non dipende dalla varietà delle olive, né dal loro grado di maturazione

Angerosa et al., 1999 13C su olio, frazione sterolica e alcoli alifatici, 18O su olio

•Distinzione tra Stati Meditterranei (Spagna, Italia, Marocco, Tunisia)

•Accenni di discriminazione tra zone Italiane, areali marini e areali interni

Zhang et al., 1998 D/H su glicerolo con SNIF-NMR

OLI D’OLIVA A DOPNormative di riferimento:Normative di riferimento:

- in ambito nazionale, la legge n. 169 del 05.02.1992 che ha sancito l'istituzione della DOC degli oli di tal tipo

- in ambito comunitario, il Reg. CEE n. 2081/92 che offre la possibilità di estendere la tutela giuridica offerta dalla legge nazionale sulle DOC all'intero territorio della UE secondo le modalità della DOP e dell'indicazione geografica protetta (IGP).

Requisiti minimi che deve possedere il disciplinare di produzione per una DOPRequisiti minimi che deve possedere il disciplinare di produzione per una DOP

a) la delimitazione della zona geografica;

b) l’indicazione degli elementi comprovanti che la produzione, la trasformazione e l’elaborazione del prodotto hanno luogo nella zona delimitata;

c) la descrizione del metodo di ottenimento del prodotto;

d) gli elementi che comprovano il legame con l'ambiente geografico in particolare gli oliveti siti nelle zone di produzione di oli a denominazione di origine controllata, destinati alla produzione degli oli suddetti, devono essere iscritti in apposito albo pubblico degli oliveti, istituito presso ogni camera di commercio, industria, artigianato, agricoltura;

e) i riferimenti relativi alle strutture di controllo: è stato infatti istituito il Comitato nazionale per la tutela della denominazione di origine controllata degli oli.

Allegato 3

PRODOTTO REGOLAMENTO REGIONE

Aprutino Pescarese (DOP)*Reg. CEE n. 1263/96(GUCE L. 163/96 del 02.07.1996) Abruzzo

Colline Teatine (DOP)Reg. CEE n. 1065/97(GUCE L. 156/97 del 13.06.1997) Abruzzo

Bruzio (DOP)Reg. CEE n. 1065/97(GUCE L. 156/97 del 13.06.1997) Calabria

Lametia (DOP)Reg. CEE n. 2107/99(GUCE L. 258/97 del 05.10.1999) Calabria

Cilento (DOP)*Reg. CEE n. 1065/97(GUCE L. 156/97 del 13.06.1997) Campania

Colline Salernitane (DOP)*Reg. CEE n. 1065/97(GUCE L. 156/97 del 13.06.1997) Campania

Penisola Sorrentina (DOP)Reg. CEE n. 1065/97(GUCE L. 156/97 del 13.06.1997) Campania

Brisighella (DOP)*Reg. CEE n. 1263/96(GUCE L. 163/96 del 02.07.1996) Emilia Romagna

Canino (DOP)Reg. CEE n. 1263/96(GUCE L. 163/96 del 02.07.1996) Lazio

Sabina (DOP)Reg. CEE n. 1263/96(GUCE L. 163/96 del 02.07.1996) Lazio

Riviera Ligure (DOP)*Reg. CEE n. 123/97(GUCE L. 122/97 del 24.01.1997) Liguria

Laghi Lombardi (DOP)*Reg. CEE n. 2325/97(GUCE L. 322/97 del 25.11.1997) Lombardia

Garda (DOP)*Reg. CEE n. 2325/97(GUCE L. 322/97 del 25.11.1997)

Lombardia, Veneto,Trentino Alto Adige

Collina di Brindisi (DOP)*Reg. CEE n. 1263/96(GUCE L. 163/96 del 02.07.1996) Puglia

Dauno (DOP)*Reg. CEE n. 2325/97(GUCE L. 322/97 del 25.11.1997) Puglia

Terra d'Otranto (DOP)*Reg. CEE n. 1065/97(GUCE L. 156/97 del 13.06.1997) Puglia

Terra di Bari (DOP)*Reg. CEE n. 2325/97(GUCE L. 322/97 del 25.11.1997) Puglia

Monti Iblei (DOP)*Reg. CEE n. 2325/97(GUCE L. 322/97 del 25.11.1997) Sicilia

Valli Trapanesi (DOP)Reg. CEE n. 2325/97(GUCE L. 322/97 del 25.11.1997) Sicilia

Toscano (IGP)*Reg. CEE n. 644/98(GUCE L. 87/98 del 21.03.1998) Toscana

Oli aventi certificazione DOP al 30 settembre 2000

Metodi analitici di accertamento dell’origine Metodi analitici di accertamento dell’origine geografica su oli d’olivageografica su oli d’oliva

•Panel Test, analisi di composti responsabili dell’aroma (Aparicio et al., 1996, J.Agric. Food Chem)

•Metodi chemiometrici applicati a diversi componenti dell’olio d’oliva (acidi grassi, steroli, alcoli alifatici e triterpenici, sostanza fenoliche, tocoferoli, trigliceridi e aromi). Forina e Tiscornia, 1982. Tsimidou et al., 1987. Alessandri et al., 1997. Webster et al., 2000

•spettroscopia 13C-NMR e 1H-NMR ad alto campo (600 MHz) eseguita sull’olio tal quale (Sacchi et al., 1998; Mannina et al., 2000; Mannina et al., 2001)

•analisi dei rapporti tra isotopi stabili

Lavoro svolto da IASMA

Nell’ambito della convenzione con il Ministero delle Politiche Agricole e Forestali:

COSTITUZIONE DI BANCHE DATI ISOTOPICHE ANNUALI (dal 1998)

•1998/1999: 80 campioni (Garda - Lombardia, Veneto, Trentino -, Liguria, Abruzzo, Toscana, Campania, Puglia, Sicilia, Sardegna)

•2000/2001: 100 campioni (Garda, Liguria, Emilia Romagna, Toscana, Umbria, Lazio, Abruzzo, Campania, Puglia, Sardegna, Sicilia)

•2001/2002: 84 campioni (Garda, Liguria, Emilia Romagna, Toscana, Umbria, Lazio, Abruzzo, Campania, Puglia, Sardegna, Sicilia): in via di completamento.

•2002/2003: in via di raccolta campioni

Analisi effettuate

a) 80 °C, 1h 30' b) 170 ml NaOH 5N

a) 170 ml HCl 5N b) Raffreddare a temp. Amb.

3 estrazioni con 100 ml etere etilico + etere di petrolio 1:1

a) pH neutro b) rotavapor 50-55 °C

ELIMINATA

riprendere con alcool buongustoin più volte; in tot. circa 150 ml;

a) Ridurre il volume a circa 10 ml b) purificazione della glicerina mediante rotavapor a temperatura mediante Buchi Glass Oven a a 40-45 °C

50 g.OLIO

SAPONIFICAZIONE

FASEORGANICA

FASE ACQUOSA

RESIDUO

SOLUZIONE DIGLICERINA IN ALCOOL

GLICERINA PURA

DETERMINAZIONE 13C / 12C

DETERMINAZIONE

18O / 16O

DETERMINAZIONE13C / 12C

Valutazione statistica dei dati

• Analisi univariata: determinazione di media, dev. std., minimo massimo, analisi della distribuzione dei dati

(rappresentazione in box-plot wishker) e ANOVA (Test di differenze significative tra medie come Test di Tukey)

• Analisi bivariata: correlazione tra variabili

• Analisi multivariata ‘descrittiva’: Principal Component Analysis

• Analisi multivariata discriminante:

Stepwise Discriminant Analysis: selezione delle variabili più significative

Analisi Discriminante Canonica con rappresentazione grafica bidimensionale dei risultati

Analisi Discriminante di riclassificazione