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ANALISI DEI TRICOTECENIE INCERTEZZA DEI DATI
Amedeo PietriAmedeo PietriIstituto di Scienze degli alimenti e della nutrizione
Facoltà di Agraria UCSC - Piacenza
TRICOTECENITRICOTECENI
TIPO A
TOSSINA T-2
O
CO
H3C
HCH2OAc
CH3
O
H
OH
H
H H
OAc
O
CH
CH3
R=OH NIVALENOLOR=OH NIVALENOLO
R=H DEOSSINIVALENOLOR=H DEOSSINIVALENOLO
TIPO B
CH2OAcCH3
O
O
H3C
OHCH2OH
CH3
O
H
OH
H
H H
R
METODI PER L’ANALISI DELLE
MICOTOSSINE
Chimico-fisici
• metodi cromatografici (TLC, HPLC,
HPLC-MS, GLC, GLC-MS)
ImmunoenzimaticiImmunoenzimatici
• ELISA
• STRIPS
• Col. di immunoaffinità (IAC)
MICOTOSSINERIVELAZIONE/QUANTIFICAZIONE
Che tipo di risultato vuoi?
� Immediato (5-20 min)� Immediato (5-20 min)
� Rapido (30-120 min)
� Non-urgente (entro 24 h o alcuni giorni)
STRIP TEST
The developed test strip
can be read in a Reader
ELISADETERMINAZI
� Non richiedono la purificazione del campione
� Veloce
� Possibili interferenzeIONE
� Possibili interferenze
� Antigene - Anticorpo
COLONNE
IMMUNOAFFINITÀPrincipio di azione
PURIFICAZIO
Anticorpo Micotossina
Altri composti / Matrice
ONE
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
CON RIVELAZIONE FLUORIMETRICA
DETERMINAZI
MOLECOLE FLUORESCENTI
Ocratossina,Zearalenone,Aflatossina M1
MOLECOLE DERIVATIZZABILIIONE
MOLECOLE DERIVATIZZABILI
Aflatossine, Fumonisine (OPA), Tricoteceni (?)
CON RIVELAZIONE UV
Deossinivalenolo
CROMATOGRAFIA (GLC o HPLC)
ABBINATA ALLA
SPETTOMETRIA DI MASSA (GLC/MS o
HPLC/MS)
DETERMINAZI
MOLECOLE
Fumonisine (HPLC/MS)IONE
Fumonisine (HPLC/MS)
Ocratossina (HPLC/MS)
Tricoteceni (GLC/MS o HPLC/MS)
O
O
H 3C
O HC H 2O H
C H 3
O
H
O H
H
H H
H
D E O SSI-N IV A LEN O L O
+N
SiH 3C C H 3
C H 3
TR IM ETILSILILIM ID A ZO L O
Si
Cl
H 3C C H 3
CH 3
TR IM ETILC LO R O SIL A N O
O
O
H 3C
OC H 2
C H 3
O
H
O
H
H H
H
Si
O
Si
SiH 3C
H 3C
CH 3
H 3CC H 3
C H 3
C H 3
C H 3
C H 3
TR IM ETILSILILE TER I-D O N
Derivatizzazione DON con N-trimetisililimidazolo
Don 3-Ac-Don 15-Ac-Don
Niv
HT-2T-2
Analisi GLC-MS - Standard tricoteceni
Spettro SIM DON
Don
3-Ac-Don 15-Ac-Don
Niv
Analisi tricoteceni (GLC-MS) - Campione mais
Spettro SIM DON
RT: 0.00 - 18.02
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100R
ela
tive A
bundance
0
20
40
60
80
100
RT: 9.52AA: 620391AH: 74993
RT: 16.44AA: 1493AH: 164
RT: 10.71AA: 838715AH: 119565
RT: 11.14
NL: 1.20E5
TIC F: MS T2HT2-05
NL: 7.50E4
TIC F: + c sid=-23.00 SRM ms2 [email protected] [ 284.86-345.36] MS ICIS T2HT2-05
NL: 1.20E5
TIC F: + c sid=-23.00 SRM ms2 [email protected] [ 244.82-387.30] MS ICIS T2HT2-05
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Time (min)
0
20
40RT: 11.14AA: 2372AH: 324
T2HT2-05 #496 RT: 10.71 AV: 1 NL: 5.74E4F: + c sid=-23.00 SRM ms2 [email protected] [ 244.82-387.30]
245.0 245.2
m/z
327.0 327.2
m/z
387.0 387.2
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relative Abundance
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relative Abundance
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relative Abundance
245
327
387
Analisi HPLC-MS/MS di tossina T-2 e HT-2
REGOLAMENTO CE N. 401/2006
Se a livello comunitario non è previsto alcun metodo specifico… i laboratori sono liberi di applicare un metodo di loro scelta, a condizione che esso rispetti i criteri seguenti:
• d) Criteri di rendimento per il DON
Tenore(µg/kg) RSDr% RSDR% Recupero %
>100- ≤500 ≤20 ≤40 60-110
> 500 ≤20 ≤40 70-120
CONFRONTO TRA RISULTATI
HPLC E ELISA (Circuito AIA)
Analisi del DON (µg/kg) su 2 campioni
Camp. Media Intervallo RSDR%
1 HPLC (11) 758 365-1147 34,011 HPLC (11) 758 365-1147 34,01
1 ELISA (7) 1467 890-1875 29,07
2 HPLC (11) 1153 404-1700 40,22
2 ELISA (7) 2285 946-3240 37,58
REGOLAMENTO CE N. 401/2006
• B.6. Accettazione di una partita o sottopartita
• Accettazione, se il campione di laboratorio non
supera il limite massimo, tenendo conto
dell’incertezza della misura e della correzione dell’incertezza della misura e della correzione
per il recupero.
• Rifiuto, se il campione di laboratorio supera il
limite massimo oltre ogni ragionevole dubbio,
tenendo conto dell’incertezza della misura e
della correzione per il recupero.
REGOLAMENTO CE N. 401/2006
• Note relative ai criteri di rendimento per le micotossine
• I valori di precisione sono calcolati • I valori di precisione sono calcolati dall’equazione di Horwitz
RSDR = 2 (1-0.5logC)
RSDR è la dev. std relativa
C è il tasso di concentrazione (0.001 = 1000 mg/kg)
COME ESPRIMERE UN RISULTATO DI ANALISI
• Un risultato va espresso nella forma:
a±2u oppure a±U
Dove:
a = è la miglior stima del valore vero a = è la miglior stima del valore vero (risultato dell’analisi corretto per il recupero)
u = è l’incertezza standard (RSDR
dell’equaz. di Horwitz)
U = è l’incertezza espansa
ESEMPIOAnalisi DON (µg/kg)
• Risultato±incertezza Intervallo
• 1000±320 680 - 1320
• 1200±384 816 - 1584
• 1400±448 952 - 1848• 1400±448 952 - 1848
• 1600±477 1123 - 2077
• 1750±515 1235 - 2265
• 2000±577 1423 - 2577
• 2500±697 1803 - 3197
ACCETTAZIONE O RIFIUTO DI UNA PARTITA IN BASE AL RISULTATO DELL’ANALISI, TENENDO
CONTO DELL’INCERTEZZA DELLA MISURA
