1

INDEX Bloc 1. Espectroscòpia A. Espectroscòpia atòmica (I). Absorció atòmica: Determinació del contingut de

Cu en begudes alcohòliques ........................................................................................ 2 B. Espectroscòpia atòmica (II). Emissió atòmica: Determinació del contingut de

K en aigua potable ....................................................................................................... 3 C. Espectrofotometria UV-Vis (I). Determinació Fe en un comprimit

multivitamínic ............................................................................................................... 4 D. Espectrofotometria UV-Vis (II). Determinació del pKa d’un indicador

àcid/base ...................................................................................................................... 6 E. Espectrofotometria UV-Vis (III). Determinació turbidimètrica de sulfat ........................ 8 F. Espectrofotometria UV-Vis (IV). Anàlisi de multicomponents: Determinació

simultània de mescles de Co(II) i Ni(II) amb 4-(2-Piridilazo)Resorcinol (PAR) ......... 10 Bloc 2. Cromatografia G. HPLC (I). Simulació a l’ordinador ............................................................................... 13 H. HPLC (II). Determinació de cafeïna en cafè soluble .................................................. 18 I. HPLC (III). Determinació de sulfonamides en medicaments d’ús veterinari .............. 19 J. CG(I). Influència de la temperatura a les separacions en cromatografia de gasos ... 21 K. CG(II). Determinació de metanol en begudes alcohòliques ....................................... 23

Anàlisi i determinació propietats CURS 2013-2014

Dr Santiago Maspoch– Grup 1

Dra Maria Muñoz– Grup 2 Dra Cristina Palet i Dr Manel Alcalà– Grup 3

Dra Maria Isabel Pividori– Grup 4

2

A. ESPECTROSCÒPIA ATÒMICA (I). ABSORCIÓ ATÒMICA: DETERMINACIÓ DEL CONTINGUT DE Cu EN BEGUDES ALCOHÒLIQUES Introducció Les tècniques d'ús analític basades en l'espectroscòpia atòmica es poden classificar en tres grans grups: emissió, absorció i fluorescència. En aquest curs, s'introdueix a un nivell pràctic l’espectroscòpia d’absorció i d’emissió atòmica. En aquesta pràctica, concretament, s’emprarà l’Espectroscòpia d’Absorció Atòmica aplicada a la determinació del coure (Cu) en begudes alcohòliques (concretament en una beguda d’aiguardent). Principi En aquesta pràctica es determina el contingut de Cu en un AIGUARDENT (el trobareu al laboratori!) per espectrofotometria d'Absorció Atòmica. Aspiració directa de la mostra i lectura 324,7 nm. Procediment El Cu es determinarà tan per interpol·lació directa d’una recta de calibrat com mitjançant un calibrat d’addició estàndard. Estandardització de la dissolució de coure Reactius i dissolucions: Teniu preparades les següents dissolucions: - dissolució de 0,025 M d'EDTA - tampó acètic/acetat 1 M, pH = 5 - PAN 0,1 % (w/v) en etanol Per a cada grup:

- Prepareu 250 mL d'una solució estàndard de 1.000 ppm de Cu (II) en aigua a partir de CuSO4·5H2O i estandarditzeu-la seguint el següent mètode:

Pipetegeu en un erlenmeier 25,0 mL de la dissolució de coure. Afegiu-hi aproximadament 25,0 mL d'etanol, 3-4 mL de la dissolució tampó acètic/acetat i 3-4 gotes de la dissolució de PAN. Diluïu-ho, aproximadament, fins a 60,0 mL amb aigua destil·lada. Valoreu-ho amb una solució d'EDTA fins que el color canviï de violeta a verd. RECORDEU: per poder fer una bona estandardització, cal fer 4-5 valoracions. Preparació de patrons i tractament de la mostra 1) A partir de la dissolució patró de 1.000 ppm de Cu(II), prepareu els patrons de la recta de calibrat corresponent (en matrassos aforats de 10,0 mL, i enrasant amb aigua destil·lada). Es tracta de tenir quatre patrons de calibrat de concentracions entre 1 i 4 ppm. (Per preparar aquestes solucions cal que feu dilucions intermèdies de la dissolució patró) 2) Prepareu també una altra recta de calibrat pel mètode d’addició estàndard. En aquest cas en 5 matrassos aforats de 25,0 mL, tot afegint 20,0 mL de mostra a cada matràs. Les addicions de patró han de ser també entre 1 i 4 ppm. 3) Mostra. Poseu uns 5,0 mL d’aiguardent en un vial per analitzar-la directament.

3

4) Analitzeu amb l’equip d’Absorció Atòmica, tot fent la lectura dels patrons de cada calibrat i de la mostra, a la longitud d’ona del Cu: 324,7 nm. És convenient que, entre lectura i lectura, aneu repetint el zero. 5) Amb les dades recollides, construïu les rectes de calibratge i calculeu la concentració de Cu a l’aiguardent pels dos mètodes. Compareu si els pendents de les dues rectes de calibrat son iguals o diferents. En aquest cas, discutiu quin dels dos calibrats és més adequat per determinar Cu i perquè. Compareu també les desviacions estàndard de les concentracions obtingudes en cada cas.

4

B. ESPECTROSCÒPIA ATÒMICA (II). EMISSIÓ ATÒMICA: DETERMINACIÓ DEL CONTINGUT DE K EN AIGUA POTABLE Introducció En aquesta pràctica s'introdueix l’espectroscòpia de Emissió Atòmica amb flama, aplicada a la determinació de la presència de potassi (K+) en aigua potable. Principi En aquesta pràctica es determina el contingut de K+ en aigua potable (de l’aixeta, d’alguna font, de beguda,...). Aspiració directa de la mostra i lectura a 765 nm (K) Procediment El K es determinarà per interpolació de la corresponent recta de calibrat. Preparació dissolucions patró 1) Preparar 1L dissolució estàndard de K+, contenint 1.000 mg de metall/L, mitjançant pesada de precisió de la seva sal de clorur (KCl). 2) A partir d’aquesta dissolució, i en les etapes que calgui, es prepararan els patrons de la recta de calibrat. Les concentracions proposades són: 2, 4, 6, 8, 10 mg/L (contingudes en matrassos de 25 mL). Aquestes solucions patrons contindran també una concentració de l’ordre de 15 mg/L de Li+, emprat com a buffer iònic. 3) Equip: Un cop connectat i estabilitzat l’instrument, amb un patró intermedi (uns 8-10 ppm) que hagueu preparat (comentar-ho amb el professor de pràctiques) s’ajusta la longitud d’ona al voltant del valor nominal (setup òptic) . Una vegada ajustat el valor òptim, es mesura la intensitat d’emissió de les dissolucions patró i de la mostra. PRECAUCIÓ: en funció de la sensibilitat del instrument es possible que s’hagi de modificar el rang de concentracions dels patrons de la recta. Així mateix, és possible que la dissolució de mostra s’hagi de diluir per a que el valor d’emissió quedi aproximadament a la meitat de la recta de calibrat. Resultats. Els resultats s’expressaran en forma de mg/L amb els corresponents intervals de confiança. Bibliografia Panreac, Métodos analíticos en alimentaria. Aguas. 1984

5

C. ESPECTROFOTOMETRIA UV-Vis (I). DETERMINACIÓ ESPECTROFOTOMÈTRICA DE Fe EN UN COMPRIMIT MULTIVITAMÍNIC Introducció i Objectiu En aquesta pràctica s'aplica la reacció de complexació del ferro amb la o-fenantrolina per a la determinació del contingut total d'aquest metall en un complex multivitamínic . L’objectiu és que serveixi d'exemple d’una determinació quantitativa d’una mostra real, que implica tractament de mostra, preparació d’una corba de calibrat i el càlcul tan de la regressió lineal de la recta patró com de la interpol·lació de la mostra i els intervals de confiança corresponents. Consideracions prèvies La mostra es presenta en forma de comprimits. La primera etapa del procediment consisteix en dissoldre tot el ferro present, per la qual cosa el comprimit multivitamínic s'ha de tractar en un medi àcid fort per tal d’assegurar-ne la seva dissolució total. L'excés d'àcid inicial obliga a controlar adequadament el pH de les dissolucions finals, de tal manera que s’haurà d’assegurar que sigui proper a pH=4,0. Procediment Reactius: . Clorhidrat d'hidroxilamina. Dissolució aquosa al 8% (m/v) . Àcid acètic concentrat . Acetat de sodi 2M . Dissolució tampó d’àcid acètic i acetat de sodi, a pH 4,75 . 1,10-fenantrolina clorhidrat: es dissolen 0,12 g i s'enrasa a 50 mL amb aigua

destil·lada (donat que es parteix del clorhidrat, es pot dissoldre’l directament en aigua, amb una gota d'àcid clorhídric diluït). Prepareu una dissolució per parella.

. Patró de Fe(II) (0,04 mg de Fe/mL): es prepara dissolent en aigua els grams corresponents de la sal mixta de ferro Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O, qualitat reactiu analític, en un matràs volumètric de 0,5 litres, que prèviament conté 1 mL d’àcid sulfúric concentrat (H2SO4). Prepareu una única dissolució per totes les parelles que treballeu alhora. A partir de aquesta, que cada parella prepari una dissolució estoc de treball diluint a la meitat.

. HCl 6M Tractament de la mostra Es pesa un comprimit d'un complement vitamínic que contingui ferro (ull tenim dos tipus, versió Júnior i versió per Adults, convindrà que les parelles triïn un o altre). Es col·loca el comprimit escollit en un vas de precipitats de 100 mL en el qual hem introduït una mica d’ aigua i es bull suaument durant uns 15 minuts amb 25 mL de HCI 6M, en un bany de sorra (fins canvi de color de la solució). Un cop s’ha dissolt el comprimit i la solució s’ha refredat, es filtra directament en un matràs volumètric de 100 mL. El vas de precipitats i el filtre es renten diverses vegades amb petites porcions d'aigua per assegurar-ne una transferència quantitativa (atenció a les observacions dels professor respecte al traspàs quantitatiu de mostra!). Es dilueix fins l’enràs tot mesclant adequadament la solució (movent el matràs circularment). Finalment, un cop enrasat, es tapa el matràs i s'agita la solució per homogeneïtzar-ne el contingut. Es repeteix el procediment amb un altre comprimit del mateix tipus, tot fent un replicat, fet que ens permetrà determinar la reproductibilitat/repetibilitat del tractament de mostra.

6

Preparació dels patrons Amb una pipeta es transfereixen 10 mL de dissolució patró de Fe a un vas de precipitats i es mesura el pH (amb un elèctrode de vidre o paper indicador). S'afegeix, gota a gota, dissolució d'acetat, fins que el pH sigui d’ aproximadament 4,0. Es compten les gotes (o el volum) requerides. Amb una pipeta es transfereixen 5 mL de dissolució patró de Fe a una matràs volumètric de 25 mL i s'afegeix la meitat del nombre de gotes de dissolució d'acetat que el que s’han determinat en el pas anterior. S'afegeixen 1 mL de la dissolució tampó d’acètic/acetat, 0,5 mL de la dissolució d'hidroxilamina i 1 mL de la dissolució de o-fenantrolina; es dilueix amb aigua fins a l'enrasament i es barreja completament. Anàlogament es preparen dissolucions amb 4, 3, 2 i 1 mL de la dissolució patró de ferro La dissolució d'acetat s'afegeix en la mateixa proporció que el volum de la dissolució de Fe (si es necessiten 30 gotes de la dissolució d'acetat per a 10 mL de la dissolució de Fe, 5 mL de la dissolució demanen 15 gotes, i així anar fent). ACLARIMENT: com a mínim posar 1 gota de dissolució d’acetat. S'HA DE PREPARAR UN BLANC. Aquest consisteix en una dissolució que contingui la mateixa quantitat de tampó acètic/acetat, hidroxilamina i 1,10-fenantrolina que les dissolucions patrons de ferro. Amb aquest blanc s'ajusta el 100% de transmitància o el zero d’absorbància. Mentre, s’ha deixat que les dissolucions patró de ferro preparades reposin 10-15 minuts. Primer cal determinar la longitud d’ona analítica (de màxima absorbància del complex Fe-1,10-fenantrolina). Per fer-ho, mesureu l’absorbància d’un dels patrons a diferents longituds d’ona, dins del rang de 490 a 520 nm (recordeu de fer el blanc a cada longitud d’ona! Escombrat cada 5 nm). A continuació, es mesura l'absorbància de cada dissolució patró a la longitud d’ona analítica escollida. Preparació de la mostra Cal preparar un blanc de la mostra, un blanc per cada volum de mostra escollit (sense addició de 1,10-fenantrolina), mesurar el seu valor d’absorbància i corregir-lo al valor obtingut per cada mostra. Recordeu que no s’ ha de ajustar el 100 % T en aquesta dissolució, és a dir que no s’ha de fer el zero d’absorbància. Es determina quantes gotes de la dissolució d'acetat es requereixen per portar 10 mL de la dissolució de la pastilla de ferro a pH 4,0. Calculeu la concentració de Fe esperada (mireu etiqueta del producte), i calculeu el volum de mostra per tal de que la seva absorbància caigui a la zona central de la recta de calibrat. Seguidament, abans d’enrasar, s'afegeix la quantitat que pertoca de la dissolució d'acetat (en gotes), 1 mL de la dissolució tampó, 0,5 mL de la dissolució d'hidroxilamina i 1 mL de la dissolució de 1,10-fenantrolina (tal com s’havia fet pels patrons), es dilueix fins l'enrasament i es barreja completament. Es mesura l’ absorbància desprès de que la dissolució reposi 10-15 minuts. Tractament dels resultats obtinguts Es representa gràficament la mesura de l'absorbància de cada dissolució front la quantitat de Fe en els patrons (expressada en ppm). S’ajusten els punts experimentals a una recta de regressió per mínims quadrats. El valor de la mostra ha de caure cap a la meitat de la recta de calibrat. Si no és això, cal repetir la preparació de la mostra tot corregint el volum de mostra emprat. L'absorbància mesurada correspondrà únicament a l’absorbància del complex Fe-fenantrolina format.

7

A partir dels paràmetres d'aquesta recta es calcula la quantitat de Fe a la pastilla i el seu interval de confiança corresponent. L'informe ha de consistir d'una primera part, redactada com un butlletí analític, que ha d'incloure una descripció inequívoca i completa de la mostra analitzada, i el mètode analític utilitzat. A continuació cal presentar els resultats del calibrat obtingut i els resultats de les anàlisis de la mostra, en què s'hi ha d'incloure l’interval de confiança. Cal incloure també comentaris i observacions respecte el procediment de l'atac de la mostra. Bibliografia ATKINS, R.C. J. Chem. Ed. 52, 550 (1975) HARRIS, D.C. Anàlisis químico cuantitativo. S.l.: Iberoamérica, 1992.

8

D. ESPECTROFOTOMETRIA UV-Vis (II). DETERMINACIÓ DEL pKa D’UN INDICADOR ACID-BASE

Objectiu

L’ objectiu d’aquesta pràctica es la determinació de la constant d’acidesa d’un indicador acid-base, en concret el verd de bromocresol.

Introducció

Els indicadors utilitzats en las valoracions àcid-base son àcids o bases febles caracteritzats pel fet que la forma àcida té un color diferent al de la forma bàsica. Degut a aquesta propietat i a la seva relativament baixa solubilitat en dissolucions aquoses, els mètodes més adequats per la determinació de la seva constat d’equilibri son els mètodes espectrofotomètrics.

D’acord en la llei de Beer-Lambert, l’absorbància de una dissolució a una longitud d’ona, ve expressada per:

(1)

on ε = Absortivitat molar del solut (L/cm mol); b= el camí òptic (en cm); C = concentració molar del solut (mol/L).

Pel càlcul de la constant d’acidesa es prepararan una sèrie de dissolucions que continguin una concentració total d’indicador constant (Ct). D’aquesta manera es procurarà aconseguir condicions d’acidesa en les quals només existeixi en dissolució una de les dues formes (l’àcida o la bàsica), de tal manera que es compleixi que:

(2)

(3)

També es prepararà una dissolució en la que las dues formes existeixin en equilibri, tot complint la llei de Beer-Lambert, segons:

(4)

9

(5)

(6)

Reajustant las tres equacions anteriors, s’obté:

(7)

Representant el logaritme del quocient d’absorbàncies en front del pH, s’obté una recta. L’ordenada a l’origen es el valor del pKa.

Procediment experimental

Dissolucions i reactius

. Verd de bromocresol: 0.2% (w/v) en etanol

. 0,4 M de HCl (àcid clorhídric)

. 0,4 M de NaOH (hidròxid de sodi)

. 0,4 M NaAc (acetat de sodi)

Dissolucions estàndard per a calibrar pHmetres.

Preparació de les dissolucions

El verd de bromocresol té un interval de viratge de pH entre 3,8 i 5,4, la qual cosa permet pressuposar un valor de pKa entre 4-5. Aleshores, caldrà emprar un tampó que ajusti el pH en aquesta zona, i tirem el tampó d’àcid acètic/acetat (pKa= 4,75). En totes les dissolucions la força iònica es mantindrà aproximadament constant e igual a 0,1 M.

En matrassos de 100 mL es prepararan les següents dissolucions, enrasant amb aigua destil·lada:

1. BLANC forma àcida: 25 mL de HCl 0,4 M; 1 mL d’etanol 2. 25 mL de HCl 0,4 M; 1 mL d’indicador 3. 20 mL de HCl 0,4 M; 25 mL de NaAc 0,4 M; 1 mL d’indicador 4. 15 mL de HCl 0,4 M; 25 mL de NaAc 0,4 M; 1 mL d’indicador 5. 12 mL de HCl 0,4 M; 25 mL de NaAc 0,4 M; 1 mL d’indicador 6. 10 mL de HCl 0,4 M; 25 mL de NaAc 0,4 M; 1 mL d’indicador 7. 5 mL de HCl 0,4 M; 25 mL de NaAc 0,4 M; 1 mL d’indicador 8. 25 mL de NaOH 0,4 M; 1 mL d’indicador 9. BLANC forma bàsica: 25 mL de NaOH 0,4 M; 1 mL d’etanol

Es registraran els espectres de las dissolucions 2 i 8 que corresponen a las especies àcida i bàsica pures (fent el zero amb el blanc corresponent), en un rang de longituds d’ona de 400 a 650 nm (escombrat cada 10 nm). Es determinarà el màxim de longitud d’ona de cada espècie i es mesurarà las absorbàncies de totes les dissolucions a aquestes dues longitud d’ona (fent el blanc amb un dels dos blancs anteriors). Es mesurarà també el pH de totes les dissolucions.

10

Aquests valors experimentals es substituiran a la equació (7) i es representaran gràficament. El valor de pKa i el seu interval de confiança es calcularan a partir dels valors de las rectes de regressió per mínims quadrats. En el informe es discutirà si una de las dues longituds d’ona (màxim forma àcida o màxim forma bàsica) es mes adequada que l’altre i perquè, i es compararà el valor experimental amb el trobat a la bibliografia.

11

E. ESPECTROFOTOMETRIA UV-Vis (III). DETERMINACIÓ DE SULFATS (MÈTODE TURBIDIMÈTRIC) Objectiu L'objectiu de la pràctica és mostrar un exemple d’anàlisi quantitativa turbidimètrica. Per altra banda, la naturalesa de la propietat mesurada fa que l'obtenció d'un resultat correcte demani una manipulació molt acurada de les dissolucions; per aixó és un bon exemple tant per a la mesura de l'habilitat de l'analista, com per a la introducció dels conceptes de repetitivitat i reproducibilitat en una discussió posterior dels resultats. Consideracions prèvies Des d'un punt de vista pràctic, la turbidimetria és molt semblant a la colorimetria, per no s'ha d'oblidar que el fonament del mètode és molt diferent, ja que en l'espectrofotometria d'absorció es mesura la potencia radiant absorbida pels components, mentre que en la turbidimetria es determina la radiació dispersada per la matèria en suspensió. Per aconseguir la màxima precisió serà necessari utilitzar una longitud d'ona en la qual no absorbeixin cap dels soluts colorats presents a la fase líquida. A part d'això, la longitud d'ona no té una importància crítica, encara que cal tenir en compte que la dispersió és més intensa a radiacions de longituds d'ona més curtes. El mètode turbidimètric es basa en la precipitació de l’ió sulfat amb l’ió bari, en condicions en que es formen cristalls de sulfat de bari de mida uniforme. Aquests cristalls han de mantenir-se en suspensió homogènia durant un període de temps suficient per mesurar la transmitància de la dissolució. Per facilitar l'estabilitat de la suspensió s'afegeix a la dissolució un col·loide protector, en el nostre cas, goma aràbiga. El contingut en sulfat de cada mostra s'obté per intepol·lació en la corba de calibrat que s'obté prèviament. Experimental Reactius i dissolucions Dissolució patró: 100 mL de dissolució de sulfat de sodi de 1.000 ppm d’ió sulfat. A partir d'aquesta dissolució es preparen, per dilució adequada, 100 mL d'una dissolució que contingui 50 ppm de SO4

2-. Dissolució precipitant: la trobareu ja preparada al laboratori. Es prepara dissolent 20 g d'acetat de bari en una barreja de 75 mL d’àcid acètic 10N i 25 mL de solució de goma aràbiga al 5%, i filtrant la dissolució resultant. El pH d'aquesta dissolució ha de ser aproximadament 3,7. Aquesta dissolució precipitant ha de ser acabada de preparar. Procediment a) Obtenció de la corba de calibrat en matrassos aforats de 50 mL. S’agafen 0; 1; 2; 3, 5 i 10 mL de la dissolució patró de sulfats de 50 ppm. Se'ls hi afegeix uns 20 mL d'aigua destil·lada, 1 mL de dissolució precipitant (lentament i amb agitació suau) i s'enrasa amb aigua destil·lada. S’homogeneïtza agitant suaument i es deixa reposar 2 minuts. A partir d'aquest moment, poden fer-se les mesures de transmitància a 425 nm. La suspensió ha de ser estable almenys 15 minuts però és recomanable fer les mesures de seguida i sempre deixant passar el mateix temps entre preparació de la suspensió i lectura

12

d’absorbància. Fer 3 mesures de cada patró de calibrat. Es representa l'absorbància aparent enfront de la concentració d'ió sulfat (teniu en compte que cap espècie absorbeix res, simplement tenim dispersió de la llum incident degut a la presència de sòlids en suspensió, per tan mesurem quina és la llum transmesa al seu través). Es calcula la recta de regressió i els intervals de confiança de l'ordenada d'origen i el pendent. b) Quantificació de la concentració d'ió sulfat en una mostra d'aigua potable. S'opera exactament igual que com s'ha indicat en l'obtenció de la corba de calibrat, utilitzant un volum adequat d'aigua potable (mostra problema). Habitualment és suficient agafant 2-5 mL però depenent de la concentració de sulfats pot ser necessari prendre un volum més gran (vegeu les dades que conté l’etiqueta de l’aigua). S'han de fer tres replicats de la mateixa mostra i s’ha d'expressar el contingut mig en sulfat que s'ha trobat amb el seu interval de confiança. Comprovar que la mostra es situa a la part central de la recta de calibrat. (Podeu portar mostra de casa!). L'informe ha de constar de dues parts: un butlletí d'anàlisis, amb un contingut anàleg al de la pràctica de la determinació de ferro, i un full de comentaris, en que s'ha de respondre a les qüestions següents:

- ¿Quina es la repetibilitat del mètode? ¿Com l’has calculat? - ¿Que passaria si un del soluts de l’aigua absorbeix a la longitud d’ona analítica? - Els valors d’absorbància son molt mes baixos que en els mètodes de absorció

estàndard ¿per què?. Raona la resposta - Cita i comenta breument algun exemple que relacioni la dispersió de la radiació

solar amb canvis climàtics Bibliografia Paulino Estrada, “Manual de control analítico de la potabilidad de las aguas de consumo humano”, Ed. Diaz de Santos 1986

13

F. ESPECTROFOTOMETRIA UV-Vis (III). ANÀLISI DE MULTICOMPONENTS: DETERMINACIÓ SIMULTÀNIA DE MESCLES DE Co (II) i Ni (II) AMB 4-(2-PIRIDILAZO)RESORCINOL (PAR) El cobalt (II) i el niquel (II) reaccionen de manera molt similar, trobant-se sovint junts en dissolució, pel que s’han emprat diversos reactius cromogènics per a la seva determinació simultània. El 4-(2-piridilazo)resorcinol (PAR) forma complexos acolorits amb els metalls de transició, amb espectres d’absorbància molt semblants, de forma que és un reactiu genèric per a la determinació indiscriminada d’aquest metalls fent servir una única longitud d’ona, . Aquest reactiu també es pot fer servir per a la determinació simultània de mescles binàries de cobalt (II) i niquel (II) mesurant a diferents longituds d’ona. En un sistema de dos components, si es compleix la llei de Beer a cada longitud d’ona (Am,), tenim que l’absorbància de la mescla es pot expressar com:

on a1 i a2 són els coeficients d’absortivitat dels components 1 i 2, respectivament; b el camí òptic, i c1 i c2 les seves concentracions. L’absorbància de les dissolucions patró de cadascun dels components purs vindrà donada per:

0,

0, iii bcaA (on i = 1 ó 2)

Substituint en la primera equació i operant s’obté:

02

20,1

0,2

01

10,1

,

c

c

A

A

c

c

A

Am

Representant, per a vàries longituds d’ona, el quocient 0,1

,

A

Am en front de

0,1

0,2

A

A s’obté una

recta de pendent 02

2

c

c i ordenada a l’origen

01

1

c

c

PROCEDIMENT Reactius i dissolucions Teniu preparades les següents dissolucions i reactius -- dissolució patró de Co(II), preparada a partir de Co(NO3)2·6H2O -- dissolució patró de Ni(II), preparada a partir de Ni(NO3)2·6H2O -- 4-(2-piridilazo)resorcinol, sal sòdica 0,20 % w/v -- dissolució 1 M d'acetat de sodi

Obtenció dels espectres patró Prepareu, en tres matrassos de 50 mL, tres dissolucions de cada ió, de concentració perfectament coneguda i pròximes a 0,3 mg/L, 0,4 mg/L i 0,5mg/L A cadascuna s’afegeixen 5 mL de dissolució d’acetat de sodi i 2 mL de la dissolució de PAR i s’enrasa amb aigua destil·lada.

2,21,1, bcabcaAm

14

Prepareu una dissolució de PAR que es farà servir com blanc: pipetegeu 2 mL de PAR i 5 mL de la dissolució d’acetat de sodi i enraseu fins a 50 mL amb aigua destil·lada. Es mesura l’espectre entre 450 i 580 nm fent servir com referència la dissolució diluïda de PAR. Es divideix cada espectre per la seva concentració i es fa el promig de les tres mesures per a cada ió. D’aquesta manera obtenim, per a cada ió, l’espectre patró per a una concentració de 1 mg/L. S’obté el valor de l’absorbància a 480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 540, 545, 550 nm per a cada dissolució patró dels cations i es promitgen el tres valors (PRECAUCIÓ: només es poden promitjar valors semblants, si una dissolució dona valors significativament diferents no s’ha d’emprar i, en tot cas, s’ha de raonar aquesta

discrepància). Si denominem 01,k aquests valors per al compost 1, i tenim en compte que

c10= c2

0 = 1, l’eqüació anterior queda:

201,

02,

101,

, Ck

kC

k

Am

Preparació de les mescles binàries

En matrassos de 50 mL prepareu 3 dissolucions amb una composició en mg/L com s’indica a la taula. Afegiu 2 mL de PAR i 5 mL de la dissolució d’acetat de sodi i enraseu. Llegiu a les mateixes longituds d’ona que en el cas dels patrons.

Fent servir els valors del Ni com a divisor de l’equació, calculeu la concentració de Ni i Co a cadascuna de les mescles binàries i compareu amb els valors experimentals teòrics.

Escriviu les fórmules de tots els reactius que heu fet servir a la pràctica.

ANEXE: REGRESSIÓ LINEAL MÚLTIPLE CLÁSSICA (CLS) Es basa en el compliment de la llei de Beer- Lambert per cadascun dels components de la mescla en tot el rang de treball, i en l’aditivitat de les absorbàncies de les mescles. L’error en el model es considera que és degut a les dades espectrals. Si tenim una mescla amb p components que compleixen la llei de Beer, l’absorbància Aj, mesurada a la longitud d’ona j, es pot escriure com:

Aj = εj1lC1 + εj2lC2 +······+εjplCp

on l és el camí òptic, constant per totes les longituds d’ona, εji és l’absortivitat molar del component i a la longitud d’ona j. Agrupant els termes d’absortividad molar i camí òptic en les constants Kji, tenim:

Aj = kj1C1 + kj2C2 +······+kjpCp + e1

Níquel / Cobalt

0,2 / 0,4 (mg/L) 0,4 / 0,4 (mg/L) 0,4 / 0,2 (mg/L)

15

Si es realitza la mesura a k longituds d’ona, aconseguint que k ≥ p, s’obtenen k equacions:

A1 = k11C1 + k12C2 +······+k1pCp + e1

A2 = k21C1 + k22C2 +······+k2pCp + e2

…………………………………………………………….

Ak = kk1C1 + kk2C2 +······+kkpCp + e2

que poden expressar-se en forma matricial de la manera següent:

a = K C + e on a és el vector de les absorbàncies de la mostra-mescla de dimensions (k×1), K és la matriu de les constants (que tenen el significat dels espectres dels components purs a concentració unitat i amb un camí òptic unitat) de dimensions (k×p), C és el vector de concentracions de dimensions (p×1), i e és el vector dels residuals model de dimensions (k×1). Emprant un model com el descrit fins ara, s’obliga a l’equació a passar per l’origen, de manera que petites diferències en la línea base poden repercutir de forma significativa sobre els valors trobats. Per evitar-ho és possible considerar una ordenada a l’origen per la regressió que permeti l’ajust dels errors deguts a la línea base. Per això, es pot augmentar la dimensió de les matrius i afegir a la matriu K una columna d’uns i considerar una concentració ficticia, C0, que doni una mesura de la desviació respecte el zero. D’aquesta forma, l’equació que descriu l’absorció a una determinada longitud d’ona resta com:

A1 = k10C0 + k11C1 +······+k1pCp + e1

on Kj0 = 1. En forma matricial:

; ;

Experimentalment coneixem els valors d’absorbància de la mescla (a). Els valors de k pel niquel i pel cobalt els hem determinat a partir de les dissolucions pures de cadascun. Per tan, per calcular les concentracions, només s’ha de ressoldre l’equació, calculant la matriu pseudo inversa la qual es multiplica segons:

a = K c Kta = KtK c

(KtK)-1Kta = (KtK)-1 KtK c = c

Es pot demostrar que aquesta manera de ressoldre un sistema d’equacions correspon a un ajust per mínims quadrats, i la ressolució per mínims quadrats d’una recta no és més que un cas especial en que només hi ha una concentració incògnita.

16

Hi ha programes que permeten ressoldre automàticament tots els passos. Emprant fulls de càlcul Excel s’ha danar pas a pas (o escriure el macro corresponent). 1) es construeix la matriu K 2) es transposa la matriu K 3) es multiplica Kt x K . Per aconseguir-ho, empra la funció MMULT: sel·leccionar tantes caselles com les que ha de tenir la matriu resutant de la multiplicació. Insertar MMULT, indicar les dues matrius, apretar control+majus+intro (o acceptar) i així es calcularà la matriu completa. Si no es clica contrl+mayus només s’escriurà la primera casella. 4) Invertir la matriu (KtK). En aquet cas, s’empra la funció MINVERSA i un procediment igual al descrit anteriorment 5) Es multiplica (KtK)-1 per ( KtK) Al ser un mètode per mínims quadrats es podria també calcular un intèrval de confiança per cada valor calculat, tot i que això no és l’objectiu d’aquesta pràctica. Comentaris: . Comparar els resultats obtinguts emprant ajust de la linea base i sense ajustar. Si el valor de la linea base ajustat és important, a què s’atribueix? . Comparar els resultats obtinguts pel mètode gràfic i per CLS. Discutir avantatges i inconvenients de cada mètode.

Bibliografia

M. Blanco, J. Coello, H. Ituriaga, S. Maspoch i J. Riba, “Quim. Anal.” 9, 269-279 (1990)

D.C. Harris, Quantitative Chemical Analysis, 8th ed, Freeman, 2010

17

G: CROMATOGRAFIA LÍQUIDA D’ALTA RESOLUCIÓ (HPLC) (I): SIMULACIÓ DE SEPARACIONS A L’ORDINADOR 1 **ACCÉS AL SIMULADOR online

‐ Obriu el navegador d’internet i entreu al web: http://www.hplcsimulator.org/simulator.php

‐ “Cliqueu” a Launch HPLC Simulator

‐ Accepteu els missatges que surtin per pantalla fins que aparegui el simulador.

2 **DESCRIPCIÓ DE LES CARACTERÍSTIQUES DEL SIMULADOR La finestra del simulador té 3 seccions: A: controls del cromatògraf, B: cromatograma, i C: mostra analitzada

A: controls del cromatògraf

Composició fase mòbil

Opcions gràfiques Característiques del cromatògraf

Propietats generals Característiques de la columna

A

B

C

18

Composició fase mòbil

Dissolvent A: aigua Dissolvent B: acetonitril o metanol Mode elució: isocràtic o gradient

% v/v dissolvent B: 0-100% Mode elució: isocràtic o gradient Fraccions de temps i % B. Volum de pre-columna amb i sense mescla. Volum d’espera (Total dwell volume): (non-mixing volume + mixing volume)

Temps d’espera (Dwell time): (non-mixing volume + mixing volume) / flow rate

Característiques del cromatògraf

Temperatura columna HPLC (ºC) Volum injecció (μL) Cabal (mL/min) Velocitat lineal del cabal (cm/s) HETP: Alçada equivalent plat teòric (cm) Número de plats Pressió de columna Propietats generals

Viscositat de la fase mòbil (cP) Coeficient de difusió mitjà (cm2/seg) Time constant: ajusta la freqüència de mostreig del detector Signal offset: ajusta la línia base del cromatograma Noise: ajusta la desviació estàndard del soroll del detector Initial/final time: rang cromatograma Data points: número de punts del cromatograma

19

Característiques de

la columna

Una única opció de columna C18 Longitud i diàmetre columna en mm Mida de partícula del rebliment de columna en micres Void fraction: en tant per u: fracció de volum dins la columna que no és ocupada per les partícules i si per la fase mòbil. Void volume/time: volum que ocupa la fase mòbil dins la columna i temps que triga en eluir una fracció de solvent per la columna Termes A B C reduïts de Van Deemter: h = A + B/v + Cv, on h: alçada reduïda de plat teòric, v: velocitat lineal reduïda de fase mòbil. B: cromatograma En una escala 2D es representa la senyal mesurada pel detector respecte el temps d’anàlisi. A mesura que modifiqueu els paràmetres A, el cromatograma s’actualitzarà automàticament amb el resultat de la simulació.

C: mostra analitzada

Components de la mostra

Podem prepara mostres de fins a 22 components diferents Concentració analit (micromolar, μM) k’: factor de retenció tR: temps de retenció (s) total: amplada de pic (s) W: quantitat d’analit injectada (micro molar, μM)

20

3 **DESENVOLUPAMENT DE LA PRÀCTICA Els objectius d’aquesta pràctica de simulació d’un cromatògraf HPLC són:

‐ Entendre totes les parts d’un cromatògraf HPLC així com les diferents configuracions que es poden modular.

‐ Descriure totes les possibles relacions de causa-efecte que es poden donar entre les configuracions de l’HPLC i un anàlisi cromatogràfic.

‐ Esbrinar una configuració de l’HPLC que permeti una correcta separació cromatogràfica d’una mostra problema.

Exercici 1: L’apartat 2 **DESCRIPCIÓ DE LES CARACTERÍSTIQUES DEL SIMULADOR conté les següents seccions: A: controls del cromatògraf B: cromatograma C: mostra analitzada Un cop hàgiu analitzat i entès el funcionament del simulador, descriureu (un per un) l’efecte que provoquen tots els paràmetres continguts en l’apartat A sobre el cromatograma B. En tots els casos analitzareu la mostra C que apareix per defecte al iniciar el simulador. La descripció dels causa-efecte es farà en base als següents punts a estudiar: 1) resolució cromatogràfica, 2) temps de retenció i amplada de pics, c) sensibilitat . Com a exemple, aquestes descripcions NO PODRÀN SER del tipus: “quan augmenta la proporció del solvent B, disminueixen els temps de retenció” Sinó que HAURAN DE SER: “quan augmenta la proporció del solvent B, disminueixen els temps de retenció, degut a que...” És a dir que totes les conclusions han d’estar adientment raonades. Consulteu si cal bibliografia relacionada amb Mètodes Cromatogràfics (per exemple “Técnicas analíticas de separación, M.Valcarcel”) Exercici 2: Tancar el simulador i reiniciar-lo de nou. Preparar una mostra C de 5 analits (2+2+1 químicament similars) indicant unes concentracions similars a les de la mostra inicial. Esbrinar una configuració de l’HPLC que permeti una correcta separació cromatogràfica d’una mostra problema. Descriure el mètode cromatogràfic escollit així com la justificació de cada paràmetre en termes generals (no caldrà una descripció exhaustiva com a l’Exercici 1).

21

H. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA D’ALTA RESOLUCIÓ (HPLC) (II): DETERMINACIÓ DE CAFEÏNA EN CAFÈ SOLUBLE L’objectiu de la pràctica és la determinació del contingut de cafeïna en mostres de cafè soluble, tant del tipus normal con descafeïnat, o d’un refresc de cola amb i sense cafeïna. Preparació dels patrons. Dissolució patró de 1.000 ppm: Es pesen 0,1000 g de cafeïna patró i es dissolen amb aigua MilliQ a 100 mL. A partir d’aquí es prepara una dissolució de 100 ppm (100 mL). I a partir d’aquesta es preparen dissolucions de 10, 20, 30, 40 i 50 ppm de cafeïna en aforats de 50 mL amb aigua MilliQ. Preparació de les mostres. Cafè normal. Es pesa 250 mg de cafè soluble (normal) i s’enrasa en un matràs aforat de 250 mL amb aigua MilliQ. Cafè descafeïnat: Es pesa 1,000 g de cafè soluble (descafeïnat) i s’enrasa en un matràs aforat de 100 mL amb aigua MilliQ. Fase mòbil (500 mL). A = Àcid Acètic 0,1 M C = aigua MilliQ B = Acetat de sodi 0,1 M D = metanol (qualitat HPLC) (8 % A + 12 % B + 40 % C + 40 % D) (Les dissolucions A i B estan preparades al laboratori) Elimineu les micropartícules que hi puguin haver filtrant a traves d’una membrana de mida de porus adient. Desgasifiqueu uns 5 min per eliminar els gasos dissolts (CO2, N2, etc.), ja que podrien crear problemes en l’estabilitat del flux. Prepareu uns 200 mL d’aigua MilliQ filtrada i desairejada per rentar l’equip de HPLC. Paràmetres del cromatògraf. Columna: C18 Cabal: 1 mL/min Volum d’injecció: 20 L Longitud d’ona del detector: 272 nm Connecteu i purgueu el sistema de bombes. Seleccioneu les condicions de flux adient i deixeu circular aigua filtrada i desairejada durant uns 15 min per netejar el sistema. Passeu per la columna la fase mòbil per tal d’equilibrar-la, durant uns 15 min. Després de l’estabilització del sistema, injecteu els patrons. Mesureu l’àrea de pic i construïu una recta de calibrat. Injecteu les mostres i trobeu la seva concentració per interpolació a la recta de calibrat. Calculeu el contingut de cafeïna als sobres de cafè (en %) Abans d’injectar al cromatògraf, els patrons i les mostres s’han de passar per un filtre de 45 m. En finalitzar, cal deixar l’equip rentant amb acetonitril.

22

I. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA D’ALTA RESOLUCIÓ (HPLC) (III): DETERMINACIÓ DE SULFONAMIDES EN MEDICAMENTS D’ÚS VETERINARI Les sulfonamides constitueixen una família important de compostos, àmpliament estesa en la pràctica humana en pacients al·lèrgics als antibiòtics, i especialment utilitzada en el camp de la indústria veterinària pel tractament d’infeccions urinàries. Algunes de les sulfonamides que s’utilitzen amb major freqüència són el sulfatiazol (SFT), la sulfadiazina (SDZ), la sulfamerazina (SMRZ) i la sulfametazina (SMTZ). Les seves estructures es mostren a la Figura 1. Curiosament, i malgrat ser espècies estructuralment i farmacològicament molt semblants, freqüentment s’administren conjuntament en preparacions que són mescles binàries i ternàries de diferent continguts i composició. La raó d’això es perquè es puguin superar problemes que es donen en els ronyons per precipitació de les mateixes sulfonamides o dels seus metabòlits acetilats, els quals són encara més insolubles. Aleshores la combinació de varies sulfonamides redueix la incidència d’aquest problema, ja que cada compost ingerit com una part de la dosi total, actua independentment de del punt de vista de solubilitat. Com a conseqüència, forces combinacions de sulfonamides estan disponibles com a

productes comercials, i per tant és important desenvolupar mètodes amb els quals es pugui determinar el seu contingut.

Figura 1. Estructures de les sulfonamides d’estudi: el sulfatiazol (SFT), la sulfadiazina (SDZ), la sulfamerazina (SMRZ) i la sulfametazina (SMTZ)

OBJECTIU

En aquesta pràctica, es quantificarà el contingut de sulfonamides de mostres comercials de medicaments veterinaris. També, es determinarà la influència de la composició de la fase mòbil en la resolució de les mescles de sulfonamides corresponents. Mostres i reactius

La mostra a analitzar és: GranadilSulfa® (Industrial Veterinaria, S.A., Barcelona, Espanya), constituïda per una mescla ternària de sulfonamides amb la següent composició (segons indica l’etiqueta del producte):

SO2NHNH2

N

NSDZ

N

N

CH3

SMRZ

N

NCH3

CH3

SMTZ

SFT

R

S

N

GranadilSulfa® SFT: 100 mg/mL SMRZ: 50 mg/mL SDZ: 50 mg/mL SMTZ: 100 mg/mL

23

PROCEDIMENT Condicions: El mètode es basa en el proposat per Goeht et al1 que determinaven sulfonamides en sèrum. Les condicions o paràmetres del HPLC que emprareu les trobeu en el quadre següent:

- Prepareu la fase mòbil. Cal que entre tots prepareu 2 dissolucions que farem servir

de fases mòbils a diferents composicions. Les preparem contenint diferents percentatges d’una dissolució d’àcid acètic al 1% (HAc) i d’una dissolució d’acetonitril (ACN): 70:30 i 88:12 (250 mL de cadascuna). Com exemple, la fase mòbil pel primer cas (HAc:ACN 70:30) es prepara seguint el següent procediment: a partir d’àcid acètic concentrat (96%) prepareu 1 litre de dissolució d’acètic a l’1 %. En una proveta mescleu 175 mL de la dissolució d’acètic i 75 mL d’acetonitril. Seguiu un procediment similar per l’altra fase mòbil proposada.

- Elimineu les micropartícules que hi puguin haver en les dues solucions de fase mòbil preparades. Per aconseguir-ho, filtreu-les emprant una membrana polimèrica de mida de porus adient. Desgasifiqueu-les uns 5 min per eliminar els gasos dissolts (CO2, N2, etc.), ja que podrien crear problemes en l’estabilitat del flux.

- Connecteu i purgueu el sistema de bombes. - Seleccioneu les condicions de flux adient (mireu el quadre anterior) i deixeu circular

la fase mòbil per la columna el temps necessari per equilibrar-la (normalment uns 15 min).

Tractament de la mostra i inici de l’anàlisi Diluïu la mostra amb aigua, unes 2.000 vegades (cal preparar la dilució cada dia). Filtreu uns mL de la mostra diluïda a un vial d’on l’agafareu per injectar-la al HPLC. Aleshores, un cop la mostra està diluïda i filtrada, la injecteu a l’equip tot omplint la vàlvula d’injecció, i prèvia elecció d’una fase mòbil de les dues preparades. Canvieu la fase mòbil i torneu a injectar la mostra. En canviar la fase mòbil s’ha d’esperar un temps per reequilibrar el sistema (uns 15 min). Observeu els canvis en el cromatograma, apunteu-los i comenteu-los adientment. A continuació, amb fase mòbil que us doni millor resolució de pics proveu la influència de l’acidesa. Si teniu temps, prepareu una fase mòbil amb acètic al 0.5 % - acetonitril i compareu els resultats obtinguts. Preparació dels patrons i anàlisi qualitatiu Prepareu dissolucions patró individuals d’uns 100 ppm de cada sulfonamida per pesada (no cal ni matràs, ho necessitem per fer un anàlisi qualitatiu!). Cada sulfonamida es dissol bé amb NaOH 0,1 M, si partim de les sulfonamides, o bé amb aigua, si partim de les seves sals sòdiques. Identifiqueu els pics de la mostra a partir de la injecció d’aquests patrons purs, en les millors condicions de composició de fase mòbil per separar la

1Simple High-Pressure Liquid Chromatographic Determination of Trisulfapyrimidines in Human Serum, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 67, nº.3, 1978, 404-406

Columna: C18, 5m Fase mòbil: àcid acètic 1% : acetonitril Cabal: 1,5 mL/min Detecció: UV a 254 nm

24

mescla. Comproveu l’eficàcia de la separació preparant una mescla contenint 1 mL de cada sulfonamida i identificar els tR. Un cop feta l’anàlisi qualitativa feu l’anàlisi quantitativa. Anàlisi quantitativa A partir de les dissolucions patró de cada sulfonamida, es preparen les dissolucions de treball a les concentracions apropiades per dilució amb aigua. S’han de preparar patrons que continguin totes les diferents sulfonamides d’estudi, per poder construir un calibrat per cadascuna. El calibrat d’una sulfonamida s’obtindrà representant l’àrea del pic que correspon a la sulfonamida en qüestió, en front de concentració. Cal treballar en un interval de concentració de manera que el valor nominal de la mostra quedi més o menys al mig. NO HO OBLIDEU: Cada dissolució patró de la recta de calibrat contindrà les quatre sulfonamides a analitzar. Injecteu els patrons i quantifiqueu la mostra. Atenció, si heu partit de la sal sòdica de les sulfonamides, penseu que al medicament els resultats estan expressats com “ppm de sulfonamida”, no com “ppm de sal sòdica de la sulfonamida”.

25

J. CROMATOGRAFIA DE GASOS (GC) (I): INFLUÈNCIA DE LA TEMPERATURA A LES SEPARACIONS Quan s'utilitzen detectors de tipus general, el millor mètode per caracteritzar els diferents productes és el temps de retenció, és a dir, el temps transcorregut entre la injecció i el màxim del pic cromatogràfic. En una sèrie homòloga de compostos orgànics cal esperar que el temps de retenció tingui una relació lineal amb el punt d'ebullició, el qual està relacionat amb la longitud de la cadena. En aquesta pràctica determinareu els temps de retenció de tres alcohols escollint les condicions òptimes de treball per tal de obtenir una bona resolució dels pics cromatogràfics amb columna semicapil·lar i detector de conductivitat tèrmica (TCD, HP 4890). Posteriorment es determinarà qualitativament el contingut d’una mostra problema que conté dos dels alcohols analitzats anteriorment. Condicions del cromatògraf HP 4890 Columna TRACSIL-METAWAX: semicapil·lar de 15 m de longitud, 0,53 mm de

diàmetre intern i amb una mida de fase estacionària de 1,00 μm (temperatura màxima d’utilització 220ºC)

Temperatura inicial del forn 50ºC Temperatura de l'injector 220ºC Temperatura del detector (TCD) 220ºC Cabals N2: (columna)10-20 mL min-1 (detector) aproximadament 1,5 vegades el de la columna Determineu les condicions de treball per a una separació òptima dels analits. Si cal, feu servir una rampa de temperatura. Mesureu el cabal de gas portador que passa per la columna i pel canal de referència del cromatògraf HP 4890 amb detector de TCD, amb un fluxímetre. Seguiu les instruccions del Procediment Normalitzat de Treball (PNT) adjunt a l’equip. Anàlisi qualitativa Fem servir primer un barreja de quatre alcohols: etanol, butanol, n-pentanol i etilenglicol. Aquesta mescla d’alcohols la preparem tot agafant 0,5 mL de cadascun dels alcohols seleccionats, i ho diluïu 5-10 vegades amb acetona. Feu injeccions de 0,5 l d’aquesta mescla a l’injector del GC. S’han de buscar les condicions per a una bona separació dels tres. 1) Busqueu els punts d’ebullició dels alcohols i decidiu primer quina creieu que és la temperatura inicial que caldria fer servir per aconseguir la separació dels 4 alcohols. Segons sigui el cromatograma obtingut a la primera injecció, aneu modificant la temperatura per optimitzar la separació, si s’escau. 2) Probablement el compost amb el punt d’ebullició més alt trigui a sortir molt. Aleshores us proposem que intenteu millorar la seva separació (fer que trigui menys a sortir) aplicant un gradient de temperatura. A partir del resultats obtinguts a l’apartat anterior, podeu triar quines seran les millors condicions per fer el programa de temperatures. Una primera rampa de temperatura que podeu provar seria el següent programa: una Tinicial= 70 ºC (tinicial=1 min) i una Tfinal de 200 ºC (tfinal=0,2 min), amb un augment de la T a la

26

velocitat de 20 ºC/min. A partir dels resultats trobats, i consultant amb el professor, prepareu altres gradients. Finalment trieu les millors condicions de temperatura inicial i final i la millor rampa de T per aconseguir la separació dels alcohols d’estudi: etanol, butanol, n-pentanol i etilenglicol.

27

K. CROMATOGRAFIA DE GASOS (GC) (II): DETERMINACIÓ D’ETANOL EN BEGUDES ALCOHÒLIQUES Objectiu Determinació del contingut d’etanol en el mateix AIGUARDENT on es determina el coure (també el trobareu al laboratori!). Es pretén que el propi estudiant, basant-se en els seus coneixements, i amb unes pautes generals i l’experiència adquirida, desenvolupi per ell mateix el procediment concret d’anàlisi. Introducció En la pràctica anterior (J) s’ha estudiat com optimitzar la separació d’alcohols de punt d’ebullició relativament alt. El problema que es planteja en aquesta pràctica és tan sols la separació d’EtOH i H2O, i la determinació quantitativa d’un de ells (concretament de l’etanol, EtOH) a partir d’un calibrat per quocients d’àrea dels components de la mostra i d’un patró intern adequat. En l’informe s’haurà de discutir críticament els avantatges i els problemes d’ambdós mètodes (calibrat convencional i calibrat per patró intern). Reactius i dissolucions . EtOH absolut . Etilenglicol Procediment Procediment A a.- Preparar en un matràs de 100 mL una dilució de 10 vegades d’un aiguardent (“orujo”)

en aigua. b.- Amb el patró de més alta concentració, s’estudiaran las condicions cromatogràfiques

que permeten una bona separació del pics d’etanol i del aigua. Es comença amb una temperatura de columna de 40-50ºC. Les condicions de temperatura d’injecció, temperatura del detector, el cabal de gasos i el volum d’injecció seran las mateixes que a la pràctica anterior.

c.- Una vegada establertes aquestes condicions, es prepararan 5 dissolucions patró

contenint exactament 10, 20, 25, 30, 40 % d’etanol en volum (en matrassos de 25 mL). S’injectarà un volum adient (≤ 1 µL, uns 0,2 µL) al cromatògraf ajustant la sensibilitat de l’integrador per tal d’obtenir un bon senyal (amb pics ben definits).

d.- Es construirà una corba de calibrat representant l’àrea EtOH/(àrea EtOH + àrea aigua)

en front del % d’EtOH. Aquesta corba s’ajustarà a un polinomi de 2º grau. S’injectarà el mateix volum de mostra i es calcularà el % d’etanol per interpolació.

Procediment B e.- En un matràs de 100 mL afegir-hi els 10 mL de l’aiguardent, 1 mL de patró intern

(etilenglicol) i enrasar amb aigua destil·lada. Cal verificar que els tres pics surten ben resolts i que tant el pic del etanol com el de l’etilenglicol estan ben definits.

f.- Preparar dissolucions que contenguin una concentració perfectament coneguda

d’aproximadament 10, 20, 25, 30, 40 % en volum d’EtOH i un 1 % de patró intern (250 µL en 25 mL), enrasant amb aigua destil·lada.

g.- Construïu i calculeu la corba de calibrat representant el quocient de l’àrea del pic

d’EtOH amb l’àrea del pic del patró intern (àrea d’EtOH / àrea del patró intern), en front del quocient de concentracions d’EtOH i de patró intern (% EtOH / %patró intern).

28

(NOTA: també es pot representar enfront el % d’EtOH, doncs el % de patró intern és el mateix en tots els patrons de la recta de calibrat).

h.- Preparar una dissolució de mostra d’aiguardent igual a la preparada en el punt e.

S’injecta al cromatògraf i es calcula el % en volum d’EtOH en la mostra tot interpolant en la corba de calibrat (e).

Discussió Comentar raonadament els resultats obtinguts i avantatges i/o problemes dels dos mètodes de calibrat.

29

Normes de seguretat

ÉS OBLIGATORI PORTAR SEMPRE BATA (100% COTÓ) I ULLERES PROTECTORES HOMOLOGADES.

El departament no disposa de bates per aquells que se’n oblidin però sí d’un nombre limitat d’ulleres per a casos excepcionals en cada laboratori. La normativa complerta està disponible permanentment a la web del Departament de Química, entrant a la pestanya de docència de Grau http://www.uab.cat/departament/quimica

L’ALUMNE HA DE SIGNAR EL COMPROMÍS DE QUE CONEIX LES NORMES DE SEGURETAT MITJANÇANT LA

SIGNATURA EN EL FULL PERTINENT.

30

ANNEXE : FÒRMULES AJUST MÍNIMS QUADRATS