ANALISI  CAMPIONI  CRIOPRESERVATI  PRELEVATI  DALL’AZIENDA  OSPEDALIERA    “SPEDALI  CIVILI  DI  BRESCIA”    NELL’AMBITO  DELL’INDAGINE    

RIGUARDANTE  LA  “STAMINA  FOUNDATION”    

Laboratorio  di  Biologia  Cellulare  e  Terapie  Oncologiche  Avanzate  Dipar:mento  di  Scienze  Mediche  e  Chirurgiche  Materno  Infan:li  e  dell’Adulto      Università  di  Modena  e  Reggio  Emilia  Azienda  Ospedaliera  Universitaria  di  Modena      Prof.  Massimo  Dominici  massimo.dominici@unimore.it     Azienda Ospedaliera – Universitaria di Modena

Roma,  Senato  della  Repubblica,  Commissione  Sanità,  30  Luglio  2014  

Le  Potenzialità  delle  Staminali  

Lung  injury  

Bone  injury  

Graaf  T,  Blood  2003;  Dominici  M  JBR  2001,  PNAS  2004,  Blood  2008,  Blood    2009,  TransplantaLon  2008  

Come  Agiscono  le  Staminali?  

•  Staminali  maMone    à Differenziamento  

•  Staminali  di  supporto  à Rilascio  di  Molecole  

•  Entrambe  

Horwitz  EM  &  Dominici  M  Cytotherapy  2008    

DANNO  !    

Midollo  Osseo  

Midollo  

OSSO  ESC  

MSC  

Lichtman  MA.  Exp  Hematol  1981      

IL  MIDOLLO  OSSEO            Cellule  Staminali  EmatopoieLche:  ESC          Cellule  Staminali  Mesenchimali:  MSC            CELLULE  IMMUNITA’+  SANGUE  

R2

0,01%  

ANALISI  CITOMETRICHE  SUBITO  DOPO  ESTRAZIONE  

 Le  Staminali  MSC  sono  Rare  

ESC  

MSC  

Il  CD73,  CD105,  CD90    Sono  marcatori  di    Staminali  MSC  

         CELLULE  IMMUNITA’  +  SANGUE  

Immagine  Microscopica  (100X)  

Ecco  Cosa  Accade  in  Vitro  

Dominici M et al. JBR 2001 & Transplantation 2008

Amplificazione  in  vitro  

ANALISI  CITOMETRICHE  DOPO  AMPLIFICAZIONE  

 Un’Appropriata  Amplificazione  in  Vitro    “Purifica”  le  Staminali  Riducendo  ed  Eliminando    

Le  Cellule  dell’Immunità  

CD73,  CD105,  CD90:    Sono  marcatori  di  MSC  

ESC  

MSC  

         CELLULE  IMMUNITA’  +  SANGUE  

L’Esperienza  Americana-­‐USA  2007-­‐2011  (su  ~115  casi  sperimentali  per  la  medicina  rigeneraLva  )  

Bailey  AM  Sci  Transl  Med  2012  

TIPO  DI  CELLULE   FONTE  TESSUTO  

MSC  

Infusioni  singole  o  mulLple  di  1-­‐5  milioni  di  cellule/kg  se  e.v.  

Donatori  ed  Indicazioni  Cliniche    Nella  Medicina  Rigenera:va  

Ratcliffe  E  et  al  Br  Medical  Bullein  2013      

Paziente  

Isolamento  ex-­‐vivo  

Espansione  Purificazione  CaraMerizzazione  IdenLficazione    Congelamento  

Trapianto  Autologo  ed  Allogenico  di  MSC  

Trapianto  

Cellule  dell’immunità  

Staminali  MSC  

Autologo  

Donatore    Sano  

Isolamento  ex-­‐vivo  

Espansione  Purificazione  CaraMerizzazione  IdenLficazione      Congelamento  

Trapianto  

Paziente  

Allogenico  

1.  Non  servono  2.  Sono  dannose  perchè  provocano  reazioni  avverse  legate  alla  

capacità  delle  cellule  del  donatore  di  aggredire  i  tessu:  del  ricevente    

3.  Possono  innescare  una  risposta  del  ricevente  verso  le  cellule  immunitarie  trapiantate  con  una  reazione  „allergica“  anche  mortale  oltre  che  invalidare  il  trapianto    

4.  QuesL  aspei  non  sono  significaLvi  per  il  trapianto  Autologo  

 Perchè  è  Necessario  Eliminare    L’Immunità  nel  Trapianto  Allogenico  di  MSC?  

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 Aspirato  Midollare    Isolamento    Amplificazione  In    

Laboratorio      

 Analisi    Laboratorio  

 Congelamento  N2  Scongelamento  TraMamento  Con    

Acido  ReLnoico  

Infusioni  mulLple  di  

200.000  cellule  

 IN  VENA  Nel  Midollo  Spinale  -­‐  Rachide  

Quello  che  è  stato  compreso  del  “Protocollo  STAMINA”  

VALUTAZIONI  INIZIALI    CAMPIONI  “STAMINA”  

•  I  campioni  sono  staL  consegnaL  il  giorno  01/08/2012  presso  il  ns.  Laboratorio  da  Ufficiali  autorizzaL  dei  NAS.    

•  La  valutazione  ispeiva  al  momento  della  consegna  dimostrava  la  presenza  di  due  campioni  in  apparente  buono  stato  di  criopreservazione.    

•  In  sostanza  poco/non  leggibili  i  caraMeri  siglaL  sulle  fiale  da  congelamento      

ANALISI  IMMUNOFENOTIPICA  E  MORFOLOGICA  DEI  CAMPIONI  POST-­‐SCONGELAMENTO  

•  I  campioni  venivano  quindi  analizzaL  immediatamente  dopo  scongelamento  mediante  parametri  definiL  da  Dominici  et  al.  (Cytotherapy  2006)  

 •  Le  cellule  venivano  quindi  poste  in  coltura  al  fine  di:      à monitorarne  il  comportamento  in  vitro  à amplificarle  per  i  test  necessari  a  definirne  le  caraMerisLche  

biologiche  e  la  staminalità  (immunologia  e  differenziamento)  à valutarne  le  capacità  di  divenire  cellule  della  linea  

neuroectodermica  (definito  qui  “neuronale”  in  senso  lato)  

QUALI  SONO  LE  MINIME    DEFINIZIONI  DI  “NORMALITA’”  PER  CELLULE  STAMINALI  MSC?  

 

BM-­‐MSC  

Criteri  Dominici  &  ISCT    per  Minima  Definizione  di  Staminalità  in  Cellule  Stromali/Staminali  Mesenchimali:  il  Normale  Aspe[o  in  Coltura  

Criteri  Dominici  &  ISCT    per  Minima  Definizione  di  Staminalità  in  Cellule  Stromali/Staminali  Mesenchimali:  IL  FENOTIPO  IMMUNOLOGICO  ATTESO  

Cellule  dell’immunità  

Staminali  MSC  

Criteri  Dominici  &  ISCT    per  Minima  Definizione  di  Staminalità  in  Cellule  Stromali/Staminali  Mesenchimali:    LA  CAPACITA‘  DI  DIFFERENZIARE  

GRASSO   Osso   Car:lagine  

INDO

TTI  

NON  IN

DOTTI  

Staminali  

Adulte    

In  Vitro  

Oil R

ed A

lizarin Red

Alcian B

lue

Feno:po  Immunologico    

Appropriato  senza  Contaminan:  

Capacità  di  

Differenziamento  

GRASSO  

Criteri  Dominici  &  ISCT    per  Minima  Definizione  di  Staminalità:  SINTESI  

Osso  

Car:lagine  

I  Criteri  Applica:  alle  cellule  “Stamina”  •  L’analisi  immunofenoLpica  mostrava  una  contaminazione  fino  al  18.8%  di  

cellule  CD45+  (in  accordo  con  quanto  visto  nell’analisi  citofluorimetrica  effeMuata  dall’IsLtuto  Superiore  di  Sanità)  di  esse  il  61.7%  sono  CD14+/HLADR+    

à  contaminazione  di  cellule  in  grado  di  generare  reazioni  mortali  

•  Il  CD105  appariva  inferiore  al  15,8%.  à Mancanza  di  marker  di  staminalità  

 LIMITI    RICONOSCIUTI:    

Anomalie  in  Coltura:  Contaminan:  Immunitari    

Campione  cresciuto  con  “protocollo  stamina”  o[enuto    “breve[o”  (con  siero  bovino)  

Campione  cresciuto  con  terreno  standard  privo  di  siero  bovino    

I  Protocolli  di  Infusione  Stamina:    il  Punto  di  Vista  Immunologico  

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Autologo  Allogenico  

Da  Donatore  a  Paziente  

Allogenico    da  Paziente  a  Paziente  

à Contaminazione  di  cellule  immunità  in  grado  di  generare  reazioni  avverse    à Mancanza  di  marcatori  di  staminalità  

UN  BIZZARRO  ESEMPIO  AGLI  ATTI:  Paziente  XY  “I  TRAPIANTI  ETEROLOGHI  MULTIPLI”  

Autologo  1°  infusione  

Allogenico  Da  Donatore  Sano  a  

Paziente  XY  2°  Infusione  !!  

Allogenico    da  Paziente  ZZ  a    Paziente  XY  

3°  Infusione  !!!!  

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à Contaminazione  di  cellule  immunità  in  grado  di  generare  reazioni  avverse    à Mancanza  di  marcatori  di  staminalità  

LE  “CELLULE  STAMINA”  DA  NOI  ANALIZZATE  MOSTRANO  ELEVATI  LIVELLI  DI  CELLULE  DELL’IMMUNITA’  IN  GRADO  DI  GENERARE  

PERICOLOSE  REAZIONI  AVVERSE    

Anomalie  del  Differenziamento  O

il Red

Alizarin R

ed A

lcian Blue

GRASSO  

Osso  

Car:lagine  INDO

TTO  

NON  IN

DOTTO  

GRASSO  CELLULE  STAMINA   COME  DOVREBBE  ESSERE  

Anomalie  del  Differenziamento  O

il Red

Alizarin R

ed A

lcian Blue

GRASSO  

Osso  

Car:lagine  INDO

TTO  

NON  IN

DOTTO  

OSSO  CELLULE  STAMINA   COME  DOVREBBE  ESSERE  

Oil R

ed A

lizarin Red

Alcian B

lue GRASSO

 Osso  

Car:lagine  INDO

TTO  

NON  IN

DOTTO  

CARTILAGINE  CELLULE  STAMINA   COME  DOVREBBE  ESSERE  

Anomalie  del  Differenziamento  

LE  CELLULE  STAMINA  NON  RISPETTANO  LE  MINIME  DEFINIZIONI  DI  NORMALITA’  PER  CELLULE  STAMINALI  ADULTE    

QUALI  LE  CELLULE  STROMALI/STAMINALI  MESENCHIMALI:  NON  SONO  STAMINALI  

 

TENTATIVO  DI  DIFFERENZIAMENTO  “NEURONALE”  

•  Al  fine  di  monitorare  le  capacità  differenziaLve  delle  cellule  in  oggeMo  in  senso  “neuronale”,  dopo  2  passaggi  in  coltura  le  cellule  sono  state  indoMe  secondo  il  protocollo  descriMo  nel  BreveMo  US  0149099  del  2012  in  capo  ai  Sig.  Vannoni  e  Molino.    

•  Secondo  il  protocollo  descriMo  nel  BreveMo  US  0149099  del  2012,  6  ul/ml  di  una  soluzione  madre  di  Acido  ReLnoico  in  etanolo  98%  (1mg/ml  corrispondente  a  3x10-­‐3  M)  sono  staL  aggiunL  al  mezzo  di  coltura  (SIERO)  per  2  ore    

•  Al  termine  delle  2  ore  di  differenziamento  sono  state  effeMuate  analisi  morfologiche  

Acido  re:noico  INDOTTO  NON  INDOTTO  2H  

ARTEFATTI  nel  Differenziamento  “NEURONALE”  

NON  INDOTTO  2  H   Acido  re:noico  INDOTTO  

•  Dopo  2  ore  di  induzione  non  si  sono  osserva:  cambiamen:  significa:vi  nella  stru[ura  cellulare.    

•  Abbiamo  osservato  struMure  simil-­‐dendriLche  ed  assonali  sia  nei  campioni  indoi  che  nei  controlli  che  apparentemente  non  appaiono  indicaLve  di  un  divenuto  differenziamento.  Medesimi  risultaL  sono  staL  oMenuL  alle  24  ore.    

•  TuMavia,  anche  la  presenza  di  un’alterazione  morfologica  simil-­‐neuronale  non  pare  indicaLva  di  una  reale  potenzialità  rigeneraLva  Lssutale  come  documentato  nei  seguenL  lavori  pubblicaL:    

 •  ReevaluaLon  of  in  vitro  differenLaLon  protocols  for  bone  marrow  stromal  cells:  disrupLon  of  acLn  cytoskeleton  induces  

rapid  morphological  changes  and  mimics  neuronal  phenotype.  Neuhuber  B,  Gallo  G,  Howard  L,  Kostura  L,  Mackay  A,  Fischer  I.  J  Neurosci  Res.  2004  Jul  15;  77(2):192-­‐204  

•  InducLon  of  bone  marrow  stromal  cells  to  neurons:  differenLaLon,  transdifferenLaLon,  or  arLfact?  Lu  P,  Blesch  A,  Tuszynski  MH.  J  Neurosci  Res.  2004  Jul  15;  77(2):174-­‐91.  

•  Chemically-­‐Induced  RAT  Mesenchymal  Stem  Cells  Adopt  Molecular  ProperLes  of  Neuronal-­‐Like  Cells  but  Do  Not  Have  Basic  Neuronal  FuncLonal  ProperLes.  Gabriela  F.  Barnabé,  Telma  T.  Schwindt,  Maria  E.  CalcagnoZo,  Fabiana  L.  MoZa,  Gilberto  Mar[nez,  Jr.,  Allan  C.  de  Oliveira,  Leda  M.  N.  Keim,  Vânia  D'Almeida,  Rosália  Mendez-­‐Otero,  Luiz  E.  Mello.  PLoS  ONE.  2009;  4(4):  e5222  

ARTEFATTI  nel  Differenziamento  “NEURONALE”  

LE  CELLULE  STAMINA  NON  RISPETTANO  LE  MINIME  DEFINIZIONI  DI  NORMALITA’  PER  CELLULE  STAMINALI  ADULTE    

QUALI  LE  CELLULE  STROMALI/STAMINALI  MESENCHIMALI  E  NON  SONO  IN  GRADO  DI  

GENERARE  CELLULE  “NEURONALI”