NACIONES UNIDAS OFICINA CONTRA LA DROGA Y EL DELITO MTODOS RECOMENDADOS PARA LA IDENTIFICACIN Y EL ANLISIS DE

ANFETAMINA, METANFETAMINA Y SUS ANLOGOS CON ANILLO SUSTITUIDO EN MATERIALES DECOMISADOS (Revisados y actualizados) MANUAL PARA USO DE LABORATORIOS NACIONALES DE ENSAYO DE ESTUPEFACIENTES V.05-86469

Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos OFICINA DE LAS NACIONES UNIDAS CONTRA LA DROGA Y EL DELITO Viena MTODOS RECOMENDADOS PARA LA IDENTIFICACIN Y EL ANLISIS DE

ANFETAMINA, METANFETAMINA Y SUS ANLOGOS CON ANILLO SUSTITUIDO EN MATERIALES DECOMISADOS (Revisados y actualizados) MANUAL PARA USO DE LABORATORIOS NACIONALES DE ENSAYO DE ESTUPEFACIENTES

NACIONES UNIDAS Nueva York, 2005

La mencin de nombres de empresas y productos comerciales no implica opinin alguna de parte de las Naciones Unidas. La presente publicacin no ha pasado por los servicios de edicin.

ST/NAR/34

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AGRADECIMIENTOS La Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos de la ONUDD desea expresar su agradecimiento a los expertos que participaron en la Reunin de Consulta sobre El examen de los mtodos para la identificacin y el anlisis de estimulantes de tipo anfetamnico y sus anlogos con anillo sustituido en material decomisado por su contribucin al contenido del presente manual. Sra. Rosa Alis Rodrguez, Laboratorio de Drogas y Sanidad de Baleares, Palma de Mallorca (Espaa) Dr. Hans Bergkvist, SKL Laboratorio Nacional de Ciencias Forenses, Linkping (Suecia) Sra. Warank Boonchuay, Divisin de Anlisis de Estupefacientes, Departamento de Ciencias Mdicas, Ministerio de Salud Pblica, Nonthaburi (Tailandia) Dr. Rainer Dahlenburg, Bundeskriminalamt / KT34, Wiesbaden (Alemania) Sr. Adrian V. Kemmenoe, The Forensic Science Service, Birmingham Laboratory, Birmingham (Reino Unido) Dr. Tohru Kishi, Instituto Nacional de Investigacin de Ciencia Policial, Chiba, Japn Dr. Waldemar Krawczyk, Laboratorio Forense Central de Polica, Ministerio del Interior y Administracin, Varsovia, Polonia Sr. Ira Lurie, Special Testing and Research Laboratory, Drug Enforcement Administration, McLean, Virginia (Estados Unidos de Amrica) Dr. Yukiko Makino, Departamento de Fiscalizacin de Estupefacientes, Kanto-Shinetsu Oficina de Salud y Bienestar, Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Tokio (Japn) Sr. Tim McKibben, Special Testing and Research Laboratory, Drug Enforcement Administration, McLean, Virginia (USA) Sra. Anneke Poortman, Laboratorio de Ciencias Forenses, Ministerio de Justicia, Rijswijk (Pases Bajos) Sra. Jana Skopec, Australian Government Analytical Laboratories, Pymble, NSW (Australia) Sr. Takahiro Terasaki, Kanto-Shinetsu Oficina Regional de Fiscalizacin de Estupefacientes, Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Tokio (Japn) La Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos de la ONUDD desea tambin expresar su agradecimiento a la Sra. Jana Skopec por la revisin, actualizacin y finalizacin del manuscrito, tambin con contribuciones adicionales de los participantes en la reunin1.

1 Tambin se agradece mucho la revisin del proyecto del manual que hizo el Dr. Ken Tanaka, de la Agencia Nacional de Polica del Japn.

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ndice

I. INTRODUCCIN.......................................................................................................... 1II. EMPLEO DEL MANUAL............................................................................................... 2III. CLASIFICACIN / DEFINICIONES.............................................................................. 3IV. DESCRIPCIN DE LOS COMPUESTOS PUROS ...................................................... 4 A. Estereoqumica .................................................................................................... 4 B. Caractersticas fsicas .......................................................................................... 5V. FABRICACIN ILCITA DE ETA .................................................................................. 6 A. Sntesis de la anfetamina..................................................................................... 7 B. Sntesis de la metanfetamina............................................................................... 8 C. Sntesis de ETA con anillo sustituido................................................................... 10VI. ANLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO DE ETA................................................ 13 A. Ensayos presuntivos ............................................................................................ 13 1. Ensayos cromticos..................................................................................... 13 2. Ensayo de aniones ...................................................................................... 17 3. Ensayos de microcristales ........................................................................... 19 B. Cromatografa de capa delgada (CCD) .............................................................. 19 C. Cromatografa en fase gaseosa (CG) detector de ionizacin por llama (FID) 25 1. Anlisis cualitativo ....................................................................................... 26 2. Anlisis cuantitativo ..................................................................................... 27 i. Mtodo A: mtodo estndar nico........................................................ 27 ii. Mtodo B: mtodo estndar mltiple sin derivatizacin ...................... 29 iii. Mtodo B: mtodo estndar mltiple con derivatizacin ..................... 31 D. Cromatografa en fase gaseosa espectrometra de masas (CG-EM) ............ 31 E. Cromatografa lquida de gran rendimiento (CLGR) ........................................... 33 F. Espectrometra infrarroja transformada de Fourier (FTIR) ................................. 35 G. Anlisis de ismeros pticos................................................................................ 37 1. Punto de fusin............................................................................................ 38 2. Ensayos de microcristales ........................................................................... 38 3. Tcnicas instrumentales .............................................................................. 40 i. Tcnicas de CG .................................................................................... 40 ii. Tcnicas de CLGR................................................................................ 42 iii. Tcnicas de EC..................................................................................... 42 iv. Tcnicas IR ........................................................................................... 43VII. OTRAS TCNICAS ANALTICAS PARA EL ANLISIS DE ETA................................. 45 A. Tcnicas de resonancia magntica nuclear 1H (RMN) ....................................... 45 B. Electroforesis capilar (EC) .................................................................................. 46 C. Cromatografa en fase slida microextraccin en fase slida (CG-SPME) 46

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1. Mtodo de anlisis de cabeza .................................................................... 47 2. Anlisis (de trazas) de muestras acuosas.................................................. 47 D. Cromatografa en fase gaseosa espectroscopa infrarroja transformada de

Fourier (CG-FTIR) ............................................................................................... 47

ANEXOS................................................................................................................................ 49

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I. INTRODUCCIN En el plano internacional la atencin se centra cada vez ms en una cuestin de importancia creciente: los estimulantes de tipo anfetamnico (ETA). En particular durante los ltimos 10 a 15 aos, el uso indebido de ETA relacionado con las anfetaminas (anfetamina y metanfetamina) y sustancias del grupo xtasis (MDMA, MDA, MDEA, etc.), ha pasado a ser un problema mundial. Aunque hay diferencias regionales, en la actualidad ningn pas est a salvo de una de las mltiples facetas de la fabricacin, el trfico o el uso indebido de ETA. Esta nueva situacin, que con frecuencia abarca ETA nuevos y desconocidos, o combinaciones, y las tendencias del trfico plantean un desafo tanto a las autoridades nacionales encargadas de hacer cumplir la ley como al personal cientfico de los laboratorios forenses. Hoy en da, los analistas deben estar en condiciones de analizar una amplia gama de sustancias y preparados, y deben utilizar mtodos ms precisos y cientficos de identificacin y anlisis a fin de hacer frente al mayor nmero de anlisis necesarios y a los requerimientos de las leyes nacionales ms estrictas contra las drogas. Adems, el carcter internacional del trfico de drogas requiere el intercambio oportuno de datos analticos entre laboratorios y los servicios de represin en los planos nacional, regional e internacional. Por estas razones, la Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos de la ONUDD comenz a principios de los aos 80 a ejecutar un programa de armonizacin y establecimiento de mtodos de ensayo recomendados para laboratorios nacionales de ensayo de drogas. En septiembre de 1998, la Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos de la ONUDD, en cooperacin con el Servicio de Ciencias Forenses del Reino Unido, organiz una reunin consultiva con la participacin de 13 expertos para examinar mtodos para la identificacin y el anlisis de estimulantes de tipo anfetamnico (ETA) y sus anlogos con anillo sustituido en material decomisado. El presente manual refleja las conclusiones de esa reunin, que fueron revisadas y actualizadas nuevamente en 2004/2005. Ofrece asistencia prctica a las autoridades nacionales describiendo mtodos recomendados para su empleo en laboratorios de ensayo de drogas con miras a identificar y analizar estimulantes de tipo anfetamnico (ETA) y sus anlogos con anillo sustituido. El presente manual forma parte de una serie de publicaciones similares que tratan de la identificacin y el anlisis de diversos grupos de drogas sometidas a fiscalizacin internacional. Combina y reemplaza manuales publicados anteriormente sobre Mtodos recomendados para el ensayo de anfetamina y metanfetamina (ST/NAR/9, 1987) y Mtodos recomendados para el ensayo de los derivados anfetamnicos ilcitos con anillo sustituido (ST/NAR/12, 1988). El presente manual y los anteriores proponen enfoques que pueden ayudar a los analistas de drogas a seleccionar mtodos apropiados a la muestra que se examina, con la posibilidad tambin de adaptarlos al nivel de adelanto de los diferentes laboratorios. Por primera vez en esta serie de publicaciones, el presente manual tiene tambin anexos con mtodos validados seleccionados. La mayora de los mtodos que se describen han sido publicados en la bibliografa cientfica, y han sido utilizados durante un cierto nmero de aos por laboratorios de reputacin conocida. Al identificar esos mtodos, la Reunin Consultiva tuvo presente que haba varios otros mtodos publicados en la literatura de las ciencias forenses que tambin producan resultados aceptables. El presente manual se limita a los mtodos analticos para los ETA. Un manual separado sobre tcnicas analticas ms generales, y sus caractersticas y empleos prcticos para el anlisis de drogas, complementa esta serie de manuales sobre mtodos recomendados.

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II. EMPLEO DEL MANUAL No todos los mtodos descritos en el presente manual deben aplicarse a todas las muestras sospechosas de ser o contener anfetamina, metanfetamina u otros ETA. La eleccin del mtodo y el enfoque de su anlisis quedan a la discrecin de los analistas y dependen del tipo de droga de que se trate, la disponibilidad de los instrumentos y los materiales de referencia apropiados, as como del nivel de prueba jurdicamente aceptable en la jurisdiccin en que trabajan los analistas. Por consiguiente, si bien se reconoce que los requisitos exclusivos de diferentes jurisdicciones pueden determinar las prcticas que aplican los diferentes laboratorios, las Buenas Prcticas de Laboratorio exigen que un enfoque analtico para determinar la identidad de una sustancia sometida a fiscalizacin en material sospechoso comprenda, como mnimo, la determinacin de por lo menos dos parmetros no relacionados entre s. La seleccin de esos parmetros en cualquier caso particular deber tener en cuenta la droga de que se trate y los recursos de laboratorio de que dispone el analista. Cuando sea posible, se deben utilizar tres tcnicas analticas totalmente diferentes: ensayos cromticos, cromatografa (por ejemplo, CCD, CG o CLGR) y espectroscopa (por ejemplo, IR o UV). Las tcnicas compuestas, como CG-EM, cuentan como dos parmetros, siempre que se utilice la informacin de ambas tcnicas (por ejemplo, el tiempo de retencin y las caractersticas del espectro de masa). Se hace hincapi tambin en la importancia fundamental de que los analistas de drogas dispongan de libros de referencia sobre drogas de uso indebido y tcnicas analticas. Adems, el analista debe necesariamente estar al corriente de las tendencias del momento en el anlisis de drogas, ajustndose coherentemente a la literatura sobre ciencias forenses y anlisis de actualidad. La ONUDD ayuda a los laboratorios a este respecto proporcionando, previa solicitud, artculos seleccionados de la literatura cientfica. La Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos de la ONUDD agradecer todas las observaciones que se le hagan llegar sobre el contenido y la utilidad del presente manual. Los comentarios y las sugerencias se pueden dirigir a:

Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos Oficina de las Naciones Unidas Contra la Droga y el Delito Centro Internacional de Viena P. O. Box 500 A-1400 Viena (Austria) Fax: +43-1-26060-5967 Correo-e: lab@unodc.org

Todos los manuales, as como las directrices y otras publicaciones cientficas y tcnicas se pueden solicitar a la direccin mencionada ms arriba.

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III. CLASIFICACIN / DEFINICIONES Los estimulantes de tipo anfetamnico (ETA) son un grupo de sustancias, en su mayora de origen sinttico, estructuralmente derivadas de la -fenetilamina (-PEA, grfico 1). Los ETA por lo general estimulan el sistema nervioso central. Por lo tanto son considerados, en diverso grado, como prototipos de estimulantes del sistema nervioso central con un potencial de toxicidad

sictica cuando se usan en dosis excesivas o por largos perodos. Los ETA pueden producir uno o ms sntomas relacionados con la dosis, incluido un estado de mayor alerta y euforia, pulsaciones aceleradas, mayor presin arterial, respiracin y temperatura corporal. El uso indebido crnico puede producir agitacin, temblores, hipertensin, prdida de memoria, alucinaciones, episodios sicticos, ilusiones paranoicas y comportamientos violentos. La abstinencia despus de haber tomado dosis altas de ETA puede provocar depresin grave. Los

ETA se producen ilcitamente en una variedad de preparados (polvo, tabletas o cpsulas), y se pueden inyectar, ingerir oralmente, esnifar o fumar. La modificacin qumica en los puntos R1 a R9 (grfico 2)2 produce un nmero prcticamente ilimitado de compuestos farmacolgicamente activos, algunos de los cuales son estimulantes ms potentes que otros. Aunque hay varias posibilidades para la modificacin de la cadena lateral, la sustitucin en el anillo aromtico aporta la mayor contribucin a diferencias cualitativas sustanciales en los efectos farmacolgicos. En cuanto a las caractersticas estructurales, los ETA se pueden dividir en tres grandes subgrupos, que corresponden en gran parte a las siguientes pautas de sustitucin en el anillo aromtico:

i. Ninguna sustitucin en el anillo aromtico (por ejemplo, anfetamina, metanfetamina, fenetilina);

ii. Grupo metilendioxi: sustitucin en el anillo aromtico (por ejemplo, MDA, MDMA, MBDB);

iii. Otras pautas de sustitucin, por lo general incluyendo uno o ms de los grupos alkiloxi (por ejemplo, 2C-B, STP/DOM).

Por razones de orden prctico, el presente manual contiene datos especficos slo para una seleccin de los ETA ms comunes. En particular, incluye ETA sometidos a fiscalizacin internacional y ETA seleccionados sometidos a fiscalizacin nacional. Los analistas deben tener presente que se pueden encontrar otros anlogos estrechamente relacionados. En la mayora de los casos, la metodologa presentada se podr aplicar tambin a esos anlogos. Las estructuras qumicas de los ETA seleccionados, junto con los nombres comunes y de la nomenclatura de la Unin Internacional de Qumica Pura y Aplicada (Nomenclatura IUPAC) figuran en el anexo I.

2 No se muestran todos los otros sustituyentes para saturar las valencias, ya que por lo general se utiliza hidrgeno (H).

NH2

Grfico 1

R3R5

R9

R8

R7

R6

NR2

R1R4

Grfico 2

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IV. DESCRIPCIN DE LOS COMPUESTOS PUROS Los ETA se decomisan normalmente en forma de sales, en particular como clorhidratos, sulfatos, fosfatos o sales de bromuro. No obstante, no es difcil que en las investigaciones de laboratorios clandestinos se encuentren esos compuestos tambin en forma de bases (por lo general, un lquido aceitoso de color pardo). Las sales son sustancias cristalinas o en polvo, que varan en coloracin desde el blanco (similar a los productos de calidad farmacutica) hasta el rosado, el amarillo o el pardo. Con frecuencia se encuentran hmedos y despiden un olor desagradable caracterstico, debido a la presencia de residuos de disolventes y/o precursores. Los ETA tambin se pueden encontrar en forma de tabletas. Adems de los ETA activos, las tabletas suelen contener diferentes adulterantes, agentes reductores, colores de alimentos comunes y/o diferentes excipientes y agentes aglutinantes.

Anfetamina La anfetamina ilcita se suele encontrar en forma de polvo como sal sulfatada, y rara vez como tableta. En los laboratorios clandestinos se suele decomisar anfetamina base, normalmente como lquido aceitoso pardo con un olor desagradable caracterstico de 1-fenil-2-propanona (P-2-P) y/o residuos de disolvente.

Metanfetamina La metanfetamina fabricada en forma ilcita est disponible en diferentes formas, segn la regin geogrfica. Estas formas incluyen el polvo, los cristales (comnmente conocidos como Cristal, Ice o Shabu) y las tabletas (comnmente conocidas como Yaba). La forma de sal ms comn es el clorhidrato.

ETA con anillo sustituido con un grupo metilendioxi MDMA, MDA y MDEA se encuentran comnmente como tabletas que pueden estar marcadas con un emblema. Rara vez se encuentran en forma de polvos, pero stos contienen concentraciones elevadas de sustancias activas. Las tabletas suelen tener colores brillantes y con frecuencia varan en tamao. El contenido de droga suele oscilar entre 40 y 140 mg. Se sabe de diferencias regionales en el contenido de droga y cambios que se producen con el tiempo. En Europa, por ejemplo, el contenido medio de MDMA en las tabletas de xtasis ha bajado a unos 60-70 mg (en comparacin con unos 100 mg a mediados de los aos 90). La forma de sal de ETA de tipo metilendioxi que se encuentra con ms frecuencia es el clorhidrato, pero tambin se han visto sales de bromuro y fosfatos.

A. ESTEREOQUMICA La mayora de los ETA tienen por lo menos un centro quiral y, por lo tanto, pueden encontrarse como mezcla racmica o como enantimeros individuales3. En los mercados ilcitos, la mayora de los ETA se encuentran en un compuesto estereoqumico tpico. La anfetamina, por ejemplo, y la mayora de los ETA con anillo sustituido, se encuentran normalmente como racematos, mientras que la metanfetamina se suele encontrar como enantimero S- o dextro (tambin

3 Los trminos (d) o (+), (l) o () y (d, l) o () se utilizan normalmente para designar la rotacin ptica de sustancias quirales. (R) y (S) describen la configuracin estrica absoluta de sustituyentes en centros quirales individuales, y se prefieren sobre todo en el caso de los diasteremeros.

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conocido como Ice o Shabu), adems del racemato. En el captulo VI.G., infra, se describe el anlisis de ismeros pticos.

B. CARACTERSTICAS FSICAS Puntos de fusin y de ebullicin Se conocen los puntos de fusin y/o ebullicin de los ETA que se encuentran con ms frecuencia. Los analistas deben tener presente, sin embargo, que esos datos se refieren a sustancias puras4. Con excepcin de los ETA de alta pureza, como la metanfetamina cristalina (Ice), los puntos de fusin se deben utilizar, por lo tanto, slo como ensayo presuntivo (respecto del uso de los puntos de fusin para la diferenciacin de ismeros, vase el captulo VI.G.1, infra).

Solubilidades Las solubilidades de ETA seleccionados y sus sales se proporcionan en la seccin sobre ensayo de aniones (pgina 17, infra). La recristalizacin selectiva basada en las diferencias de solubilidad se puede utilizar para la separacin de algunas sales de ETA (vase el captulo VI.F. sobre FTIR).

Datos espectroscpicos Los datos del anlisis de espectro de masa (EM), infrarrojo (IR) y de resonancia magntica nuclear (RMN) de los ETA ms comunes aparecen en ediciones anteriores de los dos manuales de las Naciones Unidas relacionados con el anlisis de ETA, es decir, Mtodos recomendados para el ensayo de anfetamina y metanfetamina (ST/NAR/9) y Mtodos recomendados para el ensayo de los derivados anfetamnicos ilcitos con anillo sustituido (ST/NAR/12). Los datos tambin se pueden encontrar en la pgina web de la Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos.

4 Los analistas tambin deben tener presente que los puntos de fusin de algunos ETA pueden variar en funcin del disolvente que se utilice para la cristalizacin.

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V. FABRICACIN ILCITA DE ETA El conocimiento del mtodo utilizado en la fabricacin ilcita de drogas de uso indebido puede cumplir una funcin importante en la interpretacin de los resultados de anlisis, especialmente en casos en que se han realizado anlisis ms a fondo de impurezas y subproductos de la fabricacin, denominados estudios de perfil de impurezas. El uso de mtodos de sntesis obtenidos o publicados ilcitamente (literatura subterrnea o Internet), los qumicos clandestinos sin experiencia, el equipo de laboratorio inapropiado y la falta de control de calidad en los laboratorios suelen dar por resultado productos impuros y de calidad inferior, y variaciones en la calidad y la potencia. En consecuencia, las drogas fabricadas ilcitamente suelen contener subproductos e intermedios derivados de materias primas con impurezas, reacciones incompletas y purificacin inadecuada de los intermedios y el producto sinttico final. Los tipos y las cantidades de impurezas que se encuentran en muestras de ETA ilcitos (el perfil de impurezas) dependen en gran parte de los mtodos de sntesis, las proporciones, la fuente y la pureza de las materias primas, las condiciones de la reaccin y los procesos de purificacin, si los hubiere. La presencia o ausencia de impurezas especficas (marcadores) puede ser til para determinar el mtodo de sntesis empleado y las materias primas (precursores) utilizadas. El anlisis de disolventes puede aumentar el cuerpo de informacin y, de esa forma, puede constituir un instrumento til para la comparacin y caracterizacin de muestras de ETA. Si bien los estudios de perfil de impurezas no son el tema del presente manual, algunos de los mtodos descritos se pueden adaptar para ese propsito5. En la literatura se encuentran descripciones de varios mtodos de sntesis de ETA que utilizan los fabricantes ilcitos o clandestinos. Los mtodos de sntesis de uso ms comn para la fabricacin ilcita de anfetamina se pueden modificar tambin para producir metanfetamina o anfetaminas con anillo sustituido. Esto se logra frecuentemente sustituyendo la fuente amina o la fuente del anillo aromtico, respectivamente, durante el proceso de reaccin. En general, la disponibilidad de precursores determina en gran medida la eleccin del mtodo de sntesis utilizado en las operaciones ilcitas. A continuacin se presentan descripciones breves de los mtodos de sntesis ms comnmente utilizados para la anfetamina, la metanfetamina y la MDMA6. Los mtodos de sntesis se clasifican sobre la base de los tipos de reduccin utilizados en la reaccin y del mecanismo de reduccin. En la prctica, muchas de esas reacciones se conocen por nombres populares como mtodo Leuckart, o mtodos del cido hidridico/fsforo rojo, oxima, nitrostireno, Birch o Emde. Esos nombres populares se basan en el qumico que descubri el mtodo, o en los reactivos caractersticos o los intermedios importantes. Siempre que es posible se incluyen los nombres populares.

5 Para una introduccin general a este tema, se remite al lector al manual de las Naciones Unidas Caracterizacin de drogas y elaboracin de perfiles de impurezas (ST/NAR/32/Rev.1, 2001); para mtodos y enfoques ms especficos para la elaboracin de perfiles de impurezas de la metanfetamina, vase tambin ONUDD, publicacin cientfica y tcnica No. 17 (SCITEC/17), 2000. 6 Para ms detalles, se remite al lector al manual de las Naciones Unidas Clandestine manufacture of substances under internacional control (ST/NAR/10/Rev. 2, 1998).

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A. SNTESIS DE LA ANFETAMINA

La reaccin central de todos los mtodos utilizados para la sntesis de la anfetamina se basa en la reduccin cataltica del 1-fenil-2-propanona (P-2-P, bencil metil ketona, BMK, fenilacetona), en presencia de amonaco o metilamina. Los mtodos de reduccin ms populares de la actualidad son el mtodo Leuckart (reduccin no metlica) y el mtodo de reduccin metlica cataltica (aminacin reductiva, hidrogenacin cataltica o hidrogenlisis).

Reaccin Leuckart (reduccin no metlica) En razn de su sencillez, la reaccin Leuckart sigue siendo uno de los mtodos de sntesis ms populares para la fabricacin ilcita de anfetaminas. La sntesis Leuckart es una reduccin no metlica que normalmente se realiza en tres etapas. Para la sntesis de la anfetamina, se calienta una mezcla de P-2-P y formamida (algunas veces en presencia de cido frmico), o formiato de amonio hasta que se obtiene una reaccin de condensacin en el producto intermedio N-formilanfetamina. En la segunda etapa, la N-formilanfetamina se hidroliza, normalmente utilizando cido clorhdrico (vase el grfico 3). La mezcla de la reaccin se hace bsica, se asla y se destila (vapor). En la etapa final, el producto se precipita de la solucin, normalmente como sal sulfatada. La anfetamina base es un lquido aceitoso con un olor a pescado y amina caracterstico.

Grfico 3. Reaccin Leuckart utilizada en la fabricacin ilcita de anfetamina

El mtodo Leuckart es uno de los ms estudiados. En la literatura se identifican y describen varias impurezas especficas del mtodo. Las impurezas ms prominentes son el intermedio N-formilanfetamina (por lo general, arrastrado al producto final) y 4-metil-5-fenil pirimidina. Otros mtodos sintticos no dan tantas impurezas especficas como el mtodo Leuckart.

Aminacin reductiva (reduccin metlica cataltica) La aminacin reductiva es un proceso de reduccin qumica o cataltica de aldehdos y cetonas en presencia de amonaco, o una amina primaria o secundaria, que resulta en la amina relacionada de orden superior. El mecanismo de reaccin pasa por la formacin de una imina o producto intermedio de iminio por la reaccin de un compuesto de carbonilo con un compuesto amino apropiado, seguida de la reduccin. En la sntesis de la anfetamina que utiliza mtodos de aminacin reductiva se emplea P-2-P y un catalizador preferido. Los mtodos utilizados con

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ms frecuencia se pueden dividir en tres tipos diferentes basados en las especies de reduccin:

a) Reduccin cataltica heterognea utilizando xido de platino, paladio o nquel Raney; b) Reduccin metlica por disolucin utilizando aluminio, zinc o amalgamas de

magnesio; c) Reduccin metlica utilizando hidruro de aluminio-litio (LiAlH4), borohidruro de sodio

(NaBH4) o, con menos frecuencia, cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3). La reduccin cataltica heterognea se logra normalmente utilizando una mezcla de P-2-P y gas de amonaco cargado con hidrgeno en presencia de un catalizador seleccionado. El paladio en carbn (Pd/C) o el xido de platino son los catalizadores de uso ms comn, seguidos por el nquel Raney. Las reducciones se logran normalmente a baja presin y baja temperatura. En raras ocasiones, tambin se han encontrado aminaciones a alta presin en un reactor a presin Parr (presin o bomba de tubo). La reduccin metlica por disolucin utilizando aluminio, zinc o amalgamas de magnesio es uno de los mtodos de aminacin reductiva de uso ms comn. El procedimiento ms popular emplea amalgama de aluminio y mercurio (Al-Hg). El mecanismo de reduccin de la amalgama se produce mediante la reduccin de un aducto de base Schiff de P-2-P y la amina apropiada. En condiciones de clandestinidad difciles, este mtodo utiliza un recolector de aluminio o arenisca, y cloruro de mercurio (HgCl2). Las impurezas ms caractersticas de las aminaciones reductivas son las bases Schiff, que se supone son formadas por la condensacin de P-2-P y anfetamina, pero no son impurezas especficas del mtodo y pueden estar presentes en cualquier procedimiento de sntesis que incluya P-2-P. Los compuestos de tipo P-2-P e imina tambin pueden aparecer como impurezas. Las impurezas inorgnicas resultantes del empleo de un catalizador determinado pueden servir de marcadores. Otros mtodos de aminacin reductiva de uso menos frecuente son las reducciones de hidruro metlico, como el mtodo del nitropropano y el mtodo de la oxima, denominados en funcin de los intermedios caractersticos (fenil-nitropropeno y oxima, respectivamente), que se forman durante la reaccin. El mtodo de la oxima es una reaccin de P-2-P con hidroxilamina. El intermedio de oxima es posteriormente hidrogenado para obtener anfetamina. Un intermedio de oxima suele ser hidrolizado por reduccin metlica utilizando Pd/H2, o por reduccin de hidruro metlico utilizando LiAlH4. El mtodo del nitropropeno comprende la condensacin de benzaldehdo con nitroetano, que produce 1-fenil-2-nitropropeno. La hidrogenacin subsiguiente del doble enlace y la reduccin del grupo nitro produce anfetamina. La fase de reduccin se completa por lo general utilizando Pd/H2 o LiAlH4.

B. SNTESIS DE LA METANFETAMINA

La metanfetamina tambin se puede sintetizar utilizando los mtodos mencionados ms arriba pero sustituyendo el amonaco con metilamina. Ahora bien, los mtodos de sntesis de la metanfetamina ms populares emplean efedrina o seudoefedrina como precursor, en lugar de P-2-P. Las reacciones se logran por lo general mediante una de las reacciones siguientes (vase el grfico 4):

a) Reducciones no metlicas, como el mtodo 'cido hidridico/fsforo rojo; b) La reduccin metlica por disolucin, como la reduccin Birch; o

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c) La reduccin cataltica heterognea utilizando tionilcloruro y paladio u xido de platino como catalizador (mtodo Emde).

Es raro encontrar otras reacciones, como el mtodo del nitropropeno o el de la oxima.

Grfico 4. Mtodos comunes para la fabricacin ilcita de metanfetamina La efedrina y la seudoefedrina estn presentes en muchos preparados farmacuticos contra la tos, muchos de los cuales se pueden obtener sin receta. La hierba china Ma-huang, que se encuentra en varios suplementos alimenticios y productos de estilo de vida, es otra fuente de esos precursores. A diferencia del P-2-P, la efedrina y la seudoefedrina son sustancias quirales. Son diasteremeros y existen en una dos formas enantiomricas cada una, (d- y l-efedrina, y d- y l-seudoefedrina), adems de dos racematos. El anlisis quiral de los ismeros de efedrina o seudoefedrina tambin puede ayudar a determinar el proceso de fabricacin de la metanfetamina ilcita. Todos los mtodos de fabricacin que comienzan con la produccin de I-efedrina o d-seudoefedrina producen (+)-(S)-metanfetamina como nico ismero ptico, que es por lo menos

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dos veces ms potente que la mezcla racmica producida por reacciones a partir de P-2-P. El mtodo del cido hidridico-fsforo rojo se realiza normalmente calentando efedrina o seudoefedrina con fsforo rojo y cido hidridico. La mezcla de la reaccin se filtra, se hace bsica y se extrae en un disolvente. La metanfetamina base resultante es un lquido aceitoso, comnmente denominado meth oil. De este lquido se cristalizan sales de clorhidratos utilizando ter/acetona y cido clorhdrico. Alternativamente, un gas de cloruro de hidrgeno (de un cilindro, una solucin acuosa o generado utilizando cido sulfrico y cloruro sdico) se bulle en el meth oil para que la sal clorhdrica precipite fuera de la solucin. El Hl y el fsforo rojo se pueden sustituir por yodo y cido hipofosfrico (hipofosfato sdico), o por agua y yodo. Raras veces, la mezcla de la reaccin, a veces denominada ox-blood, se utiliza sin ms purificacin, principalmente por inyeccin. La mezcla de color rojo, causada por un exceso de yodo, contiene meth oil y diferentes impurezas provenientes del mtodo Hl/fsforo rojo. Las impurezas tpicas encontradas en muestras producidas por reducciones con Hl/fsforo rojo o yodo/cido hipofosfrico son efedrina o seudoefedrina, aziridinas y dimetilnaftalinas. Las aziridinas no se pueden considerar como impurezas especficas del mtodo, dado que tambin se producen a partir de la clorefedrina por eliminacin algena y cierre de los anillos (mtodo Emde), o de un intermedio de oxima y N-hidroximetanfetamina. El proceso de la reduccin Birch se realiza mediante una reduccin metlica por disolucin de efedrina o seudoefedrina en presencia de amonaco. La reaccin comprende mezclar efedrina o seudoefedrina con gases de amonaco anhidro y metal de sodio o de litio. La mezcla se deja reposar hasta que se evapora el amonaco. La separacin del meth oil se realiza mediante extraccin directa por disolvente y filtracin. El producto de la reaccin se purifica luego mediante la formacin de la sal de clorhidrato y la recristalizacin. En la prctica ilcita, la reduccin Birch se realiza normalmente en una reaccin de un paso utilizando amonaco, que est disponible en grandes cantidades, y cintas de litio de bateras. Pese a esto, la reduccin Birch produce normalmente un producto final muy limpio. En la literatura se informa de varias impurezas especficas del mtodo, como el N-metil-1-(1,4-ciclohexadienil))-2-propanamina. La reaccin que incluye amonaco anhidro es peligrosa y las explosiones en los laboratorios clandestinos no son raras. En el mtodo Emde, la efedrina o la seudoefedrina se hacen reaccionar normalmente con tionilcloruro para obtener el intermedio clorefedrina, que luego es hidrogenado sobre un catalizador de platino o paladio para obtener metanfetamina. En los procedimientos analticos basados en la CG, el intermedio clorefedrina se encuentra raras veces como impureza, porque se descompone durante el anlisis para formar aziridinas. La clorefedrina tambin se descompone rpidamente durante la extraccin bsica de metanfetamina.

C. SNTESIS DE ETA CON ANILLO SUSTITUIDO

El estimulante anfetamnico de tipo metilendioxi que se encuentra ms comnmente es MDMA, y ocasionalmente MDEA y MDA. En general, los mtodos de sntesis utilizados para la MDMA se aplican, con ligeras modificaciones, a otros anlogos metilendioxi con anillo sustituido. El principal precursor utilizado para esa sntesis es 3,4-metilendioxifenil-2-propanona (tambin conocido como 3,4-MDP-2-P, 3,4-metilendioxi-fenilacetona, piperonil metil cetona, o PMK). El 3,4-MDP-2P est disponible en el comercio como precursor sometido a fiscalizacin internacional. La MDMA se puede sintetizar tambin a partir del safrol (3,4-metilendioxialilbenceno), ya sea directamente o utilizando isosafrol obtenido por isomerizacin del safrol. El safrol est disponible

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en el comercio, o se puede extraer del aceite de sasafrs u otras partes de plantas o aceites esenciales con alto contenido de safrol. El piperonal (heliotropin, 3,4-metilendioxibenzaldehdo), un producto qumico industrial de gran uso, es otro precursor alternativo para la sntesis de 3,4-MDP-2-P. El mtodo ms directo para la sntesis de la MDMA es la aminacin reductiva de 3,4-MDP-2-P con metilamina y gas de hidrgeno sobre un catalizador de platino (reduccin metlica cataltica). La reduccin se puede lograr tambin mediante una reduccin metlica disolvente utilizando amalgama de aluminio (hoja de aluminio y mercuriocloro), o por reduccin de hidruro metlico utilizando cianoborohidruro sdico (vase el grfico 5). Sustituyendo la metilamina por etilamina se obtiene MDE; el gas de amonaco produce MDA, y la dimetilamina produce MDDMA. Un mtodo anlogo para la fabricacin ilcita de anfetamina comnmente utilizado para la fabricacin ilcita de MDMA es el mtodo Leuckart. Se reducen 3,4-MDP-2-P y N-metilformamida utilizando cido frmico. El intermedio resultante, N-formil-MDMA se hidroliza por reflujo con un cido o una base fuerte para producir MDMA.

Grfico 5. Aminacin reductiva utilizada en la fabricacin ilcita de MDMA

El mtodo del nitropropeno adquiri popularidad a principios del decenio de 1990. Comprende la reaccin de piperonal con nitroetano en presencia de un catalizador bsico, normalmente n-butilamina. En la literatura se informa de diversos procedimientos para la produccin del intermedio fenil-nitropropeno, pero normalmente se deja reposar una mezcla de piperonal y nitroetano durante unos pocos das en la oscuridad. Alternativamente, se produce un reflujo de piperonal y nitroetano en cido actico y acetato amnico. Los intermedios formados en estas reacciones son muy caractersticos en cuanto a apariencia, y por lo general precipitan de la solucin de la reaccin como cristales amarillos brillantes. Para producir MDA, el intermedio se suele reducir con hidruro de aluminio-litio. Para la sntesis de MDMA, MDEA u otros ETA, el nitropropeno intermedio se convierte en 3,4-MDP-2-P, que luego se reduce mediante uno de los mtodos de aminacin reductiva descritos ms arriba. Los intermedios nitropropeno y nitroestireno son sustancias cristalinas de color amarillo o naranja brillante.

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La MDMA tambin se fabrica normalmente utilizando el denominado mtodo del bromosafrol. La reaccin se produce mediante la brominacin del safrol con cido hidrobrmico a baja temperatura, seguida de un tratamiento con metilamina para formar el producto final. El rendimiento depender del contenido de agua de la mezcla de la reaccin. La sustitucin de la metilamina con otras aminas produce diferentes productos de tipo MDMA (por ejemplo, MDA, MDEA, o MDDMA). Las drogas de tipo metoxianfetamina se sintetizan normalmente utilizando aldehdo y nitroetano con anillos sustituidos apropiados, mientras que para la mescalina, el 2C-B y otras fenetilaminas con anillo sustituido se utiliza nitrometano. El 2C-B se fabrica haciendo reaccionar 2,5 dimetoxibenzaldehdo y nitroetano, seguida de una reduccin LiALH4 para formar 2,5-dimetoxifenetilamina, que es luego brominada para obtener el producto final.

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VI. ANLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO DE ETA

Por lo general, cuando se intenta determinar la identidad de una sustancia sometida a fiscalizacin en el material sospechoso, el enfoque analtico debe comprender la determinacin de por lo menos dos parmetros no correlacionados. Se reconoce que la seleccin de estos parmetros en cualquier caso particular tendr en cuenta la droga de que se trate y los recursos de laboratorio de que dispone el analista. Tambin se acepta que los requisitos especiales establecidos en diferentes jurisdicciones pueden determinar las prcticas que se sigan en un laboratorio particular.

A. ENSAYOS PRESUNTIVOS Los ensayos presuntivos son procedimientos de clasificacin rpidos que por lo general consisten en dos o tres ensayos independientes. Estn diseados para dar una indicacin de la presencia o ausencia de tipos de drogas en la muestra ensayada y eliminar rpidamente las muestras negativas. Las buenas tcnicas de ensayos presuntivos, como todas las tcnicas analticas, maximizan la probabilidad de un resultado verdadero y reducen al mnimo la probabilidad de un positivo falso. Ahora bien, los ensayos presuntivos no se consideran suficientes para identificar drogas y los resultados deben ser confirmados mediante otros ensayos de laboratorio. En los ltimos tiempos, los ensayos presuntivos se utilizan con ms frecuencia en pruebas de campo, aunque tambin se realizan en laboratorios como primer procedimiento de clasificacin. Para la clasificacin de los ETA, se usan normalmente ensayos cromticos, o pruebas rpidas, aunque tambin se dispone de ensayos de inmunoanlisis y varias tcnicas rpidas y con instrumentos porttiles. Los mtodos de clasificacin con instrumentos, como el espectrmetro de movilidad de iones (escaneo de iones), el espectrmetro de masas porttil y los espectrmetros FTIR o Raman, han obtenido popularidad en los ltimos aos. Se dispone tambin de muchos estuches de ensayos comerciales para la clasificacin de ETA, aunque deben ser evaluados internamente en funcin de su especificidad y sensibilidad.

1. Ensayos cromticos Los ensayos cromticos suelen ser los ensayos clnicos ms sencillos y ms rpidos que un analista puede aplicar a una muestra. Los ensayos cromticos son muy sensibles; por lo tanto, slo se necesitan cantidades muy pequeas de la muestra para completar con xito el ensayo, y con frecuencia los mejores resultados se obtienen con las cantidades de muestras ms pequeas, generalmente menos de un miligramo. Dado que las muestras pueden variar en pureza (concentracin de ETA) y pueden contener sustancias ajenas, los colores que aparecen en estos ensayos deben interpretarse con cuidado. Adems, hay que tener presente el aspecto subjetivo de la evaluacin del color.

Tcnicas de ensayos cromticos Normalmente se utilizan varios reactivos diferentes en los ensayos cromticos de sustancias de tipo anfetamnico y sus anlogos con anillo sustituido. Los ms importantes para estas sustancias son los ensayos de Marquis, de Simon y de Chen. El ensayo de Marquis permite distinguir entre la anfetamina y sus anlogos con anillo sustituido. El ensayo de Simon se utiliza generalmente para aminas secundarias, por ejemplo, la metanfetamina y las anfetaminas secundarias con anillo sustituido, incluidas la MDMA y la MDE. Ahora bien, otras aminas secundarias, por ejemplo la dietilamina y la piperidina, pueden dar colores similares. En general,

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los colores son intensos pero pueden desaparecer rpidamente en presencia de algunas impurezas. Por estas razones, es esencial que el analista confirme los resultados del ensayo de Simon realizando un ensayo suplementario, por ejemplo, un ensayo de Marquis. El ensayo de Chen se utiliza para distinguir la efedrina, la seudoefedrina, la norefedrina, la fenilpropanolamina y la metcatinona de la anfetamina y la metanfetamina, que no reaccionan con el reactivo del ensayo de Chen. Un cuarto ensayo, el ensayo del cido glico, proporciona un medio simple de distinguir MDMA, MDA y MDEA de la anfetamina o la metanfetamina, porque reacciona especficamente con los compuestos aromticos de metilendioxi sustituido. Tambin reaccionan los precursores que contienen la subestructura metilendioxi, como el safrol y el isosafrol. MTODOS En el anexo II se describe la preparacin de reactivos. Los reactivos se deben preparar en el momento.

Ensayo de Marquis 1) Colocar una pequea cantidad (1-2 mg de polvo, o 1-2 gotas de lquido) del material

sospechoso en una ranura de una placa de ensayos. 2) Agregar una gota de reactivo de Marquis 1, luego una gota de reactivo 2, y mezclar. 3) Observar el color de la mezcla.

Ensayo de Simon 1) Colocar una pequea cantidad (1-2 mg de polvo, o 1-2 gotas de lquido) del material

sospechoso en una ranura de una placa de ensayos. 2) Agregar una gota de reactivo de Simon 1, y mezclar. 3) Agregar una gota de reactivo de Simon 2, luego una gota de reactivo 3. 4) Observar el color de la mezcla.

Ensayo de Chen 1) Colocar una pequea cantidad (1-2 mg de polvo, o 1-2 gotas de lquido) del material

sospechoso en una ranura de una placa de ensayos. 2) Agregar 2 gotas de reactivo de Chen 1. 3) Agregar 2 gotas de reactivo de Chen 2, y luego 2 gotas de reactivo 3 y mezclar. 4) Observar el color de la mezcla.

Ensayo del cido glico 1) Colocar una pequea cantidad (1-2 mg de polvo, o 1-2 gotas de lquido) del material

sospechoso en una ranura de una placa de ensayos. 2) Agregar una gota de reactivo de cido glico. 3) Observar el color de la mezcla.

RESULTADOS En el cuadro 1 se proporcionan resultados de los tres principales ensayos cromticos para la mayora de los estimulantes de tipo anfetamnico y sus anlogos con anillo sustituido que se encuentran ms comnmente. Dado que el ensayo de cido glico se utiliza principalmente para identificar, por lo general, el sustitutivo metilendioxi del anillo y no un ETA individual con esa subestructura, en este cuadro los resultados no se incluyen separadamente para sustancias individuales. Un color verde oscuro

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brillante indica la presencia de MDA, MDMA, MDE, N-hidroxi-MDA o MMDA. En algunos casos, por ejemplo MDE y N-hidroxi-MDA, el color verde puede cambiar a pardo durante el ensayo. Cuadro 1. RESULTADOS DE LOS ENSAYOS CROMTICOS

Compuesto Reactivo de Marquis

Reactivo de Simon

Reactivo de Chen

Anfetamina Naranja, lentamente pasando a pardo

SR * SR *

Catinona SR SR * Pasa gradualmente del amarillo al naranja

Dimetilanfetamina Naranja SR * SR * Efedrina Seudoefedrina SR SR * Prpura N-Etilanfetamina Naranja, pasando a

pardo

Metanfetamina Naranja, lentamente pasando a pardo

Azul intenso SR *

Metcatinona SR Azul plido, precipitado como mancha o anillo

Pasa gradualmente del amarillo al naranja

Norefedrina SR SR Prpura 2C-B Amarillo--> verde SR * SR * 2C-T-2 Rosa plido, naranja SR * 2C-T-7 SR SR *

DMA Verde-->verde oscuro

SR *

DOB Amarillo--> verde SR * SR *

DOET Pardo amarillento SR * FLEA Azul oscuro/negro MBDB Azul oscuro/negro Azul intenso SR * MDA Azul oscuro/negro SR * SR * MDDM Azul oscuro/negro

MDEA Azul oscuro/negro Azul (intenso)--> pardo

SR *

MDMA Azul oscuro/negro Azul intenso SR * MDOH Azul oscuro/negro MMDA Prpura SR * SR * 4-MTA SR SR *

PMA SR--> verde plido SR *

STP / DOM Amarillo SR * SR * TMA Naranja SR * SR = sin reaccin. * El color del reactivo se debe considerar negativo.

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Notas analticas a) ETA especficos Dado que los ETA, en especial la metanfetamina y los anlogos con anillo sustituido en Asia sudoriental, se encuentran con frecuencia en forma de tabletas de colores brillantes, el resultado de los ensayos cromticos puede quedar oculto, o se puede producir un cambio en el resultado de esos ensayos.

Aunque se utiliza una gran variedad de colores para producir tabletas de ETA, la mayora de los colores son solubles en agua, y su solubilidad se puede manipular cambiando el pH de la solucin. En esos casos, por lo tanto, el anlisis se debe ajustar al procedimiento de extraccin y se debe eliminar el color totalmente antes de proceder al ensayo cromtico propiamente dicho.

En algunos casos, cuando el ensayo cromtico no se puede interpretar claramente debido a la presencia de un colorante en la tableta, el procedimiento siguiente suele producir resultados aceptables:

Colocar una pequea cantidad (aproximadamente 10 mg) de la muestra en un tubo de ensayo pequeo. Agregar aproximadamente 1 ml de metanol (o una mezcla de 4:1 metanol:cloruro de metileno). Despus de filtrar la mezcla por lana de vidrio, se la evapora hasta que quede seca. La muestra se reconstituye en una pequea cantidad de agua y luego se procede a realizar el ensayo cromtico depositando cuidadosamente la solucin de la muestra acuosa en una placa de ensayos y agregando el reactivo de color. Dado que la muestra ya est diluida, bastarn 3 gotas de reactivo por una gota de muestra.

La presencia de disolventes y adulterantes tambin puede perturbar las reacciones de coloracin y dar resultados negativos falsos. El ensayo de Simon puede dar resultados negativos falsos en muestras de ETA con adulterantes o disolventes; el ensayo de Marquis es menos sensible a las muestras adulteradas y, por lo tanto, es preferible cuando la concentracin de ETA en la muestra es muy baja.

b) General Los colores descritos son juicios subjetivos debido a que la percepcin de los colores es individual. Por esta razn, es decir, el aspecto subjetivo de la evaluacin del color, es necesario que cada analista ensaye estndares de referencia apropiados para asegurar que puede reconocer cada resultado del ensayo cromtico. Asimismo, es conveniente realizar un ensayo con una muestra en blanco sin la sustancia de que se trata para asegurar la familiaridad con el color del reactivo.

Si se realiza adecuadamente, un ensayo de coloracin negativo es por lo general bastante fidedigno para establecer la ausencia de un compuesto determinado; no obstante, los resultados positivos son slo indicaciones presuntivas de la posible presencia de un compuesto. Muchos otros compuestos, con frecuencia benignos y no sometidos a fiscalizacin por las leyes nacionales o los tratados internacionales, pueden dar colores similares con un reactivo de ensayo cromtico determinado.

Por lo tanto, es obligatorio que el analista confirme un ensayo cromtico positivo de cualquier compuesto sometido a fiscalizacin por ley utilizando otros ensayos de laboratorio.

Para eliminar la posibilidad de que una placa de ensayo contaminada d un resultado positivo falso, conviene colocar el reactivo en la placa y luego agregar una cantidad pequea de la muestra al reactivo.

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Lecturas recomendadas Naciones Unidas (1995), Mtodos para el ensayo inmediato de drogas de uso indebido: Manual para uso del personal de laboratorios nacionales de estupefacientes y de los organismos de represin (ST/NAR/13/Rev.1)

S. A. Johns, A. A. Wist y A. R.Najam (1979), Spot tests: a colour chart reference for forensic chemists, J. Forensic Sci., vol. 24, pgs.631 a 649.

E. Jungreis (1985), Spot test analysis, Clinical, environmental, forensic and geochemical applications, John Wiley & Sons, Nueva York-Chichester-Brisbane-Toronto-Singapur.

A. C. Moffat, M. D. Osselton y B. Widdop (eds.) (2004), Clarkes Analysis of Drugs and Poisons, 3ra. ed., Pharmaceutical Press, Londres-Chicago.

C. L. ONeil y otros (2000), Validation of twelve chemical spot tests for the detection of drugs of abuse, Forensic Sci. Int., vol.109, pgs.189 a 201.

R. A. Velapoldi y S. A. Wicks (1974), The use of chemical spot test kits for the presumptive identification of narcotics and drugs of abuse, J. Forensic Sci., vol. 19, pgs. 636 a 654.

2. Ensayo de aniones El ensayo de aniones con fines forenses utiliza normalmente las solubilidades combinadas con reacciones selectivas en que los resultados estn determinados por la presencia o ausencia, y la solubilidad, de un precipitado. A continuacin se describe la solubilidad de diferentes ETA y sus sales en agua y en varios sistemas de disolventes comunes.

Anfetamina y sus sales Base Clorhidrato Fosfato Sulfato Agua Ligeramente

soluble Soluble Soluble Soluble

Metanol o etanol Soluble Soluble Ligeramente soluble

Ligeramente soluble

ter dietlico Soluble Insoluble Insoluble Insoluble Cloroformo Soluble Soluble Insoluble Insoluble

Metanfetamina y sus sales Base Clorhidrato Agua Ligeramente

soluble Soluble

Metanol o etanol Soluble Soluble

ter dietlico Soluble Insoluble Cloroformo Soluble Soluble

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ETA con anillo sustituido y sus sales Las bases libres de ETA con anillo sustituido son por lo general insolubles en agua y solubles en etanol, ter dietlico, cloroformo y otros disolventes orgnicos. Sus sales clorhdricas son solubles en agua y etanol, ligeramente solubles en cloroformo, e insolubles en ter dietlico. Las solubilidades de las diferentes sustancias de este grupo dependen del ETA con anillo sustituido especfico de que se trate.

MTODOS

Todos los reactivos se deben preparar con arreglo a un procedimiento establecido. En el anexo II se describe detalladamente la preparacin de los reactivos.

Ensayo del nitrato de plata La muestra del ETA desconocido se disuelve en varias gotas de agua desionizada y se trata con 1-2 gotas de solucin de AgNO3. A continuacin se dan los resultados para los aniones comunes. Dado que otros aniones pueden dar resultados similares, se deben realizar ensayos adicionales o trabajos de familiarizacin con las limitaciones del ensayo. Cloruro Forma un precipitado cremoso que es insoluble en cido ntrico concentrado. Despus de lavarlo con agua, el precipitado es soluble en una solucin de amonaco diluida, a partir de la cual se lo puede volver a precipitar aadiendo cido ntrico. Bromuro Forma un precipitado de color amarillo plido a crema que es insoluble en cido ntrico. Despus de lavarlo con agua, el precipitado se disuelve muy lentamente en soluciones de amonaco diluidas y es soluble en soluciones de amonaco concentradas. Se lo puede volver a precipitar a partir de ambas soluciones agregando cido ntrico. Yoduro Forma un precipitado amarillo brillante que es ligeramente soluble en una solucin de amonaco concentrada pero soluble en una solucin de tiosulfato. Sulfato Forma un precipitado cristalino ligeramente coloreado que se puede identificar fcilmente colocando la solucin de ensayo en una placa de microscopio y buscando los caractersticos cristales de sulfato de plata en forma de diamantes. Fosfato Forma un precipitado amarillo plido, que ese soluble en una solucin de amonaco diluida, o en cido ntrico fro. Para las sales sulfatadas y fosfatadas se pueden realizar otros ensayos especficos:

Ensayo de sal sulfatada La muestra del ETA desconocido (unos 100 mg) se disuelve en agua y se trata con una solucin de cloruro de bario. Un precipitado blanco, que es insoluble en cido clorhdrico, indica la presencia de una sal sulfatada.

Ensayo de sal fosfatada La muestra del ETA desconocido (unos 100 mg) se disuelve en una solucin compuesta de volmenes iguales (por ejemplo, 1 ml cada uno) de solucin de cido ntrico (10% v/v) y solucin de molibdato de amonio (10% p/v). Al calentarla lentamente, la formacin de un precipitado de color amarillo canario brillante, que es soluble en una solucin de amonaco, indica la presencia de una sal fosfatada.

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Notas analticas Dado que todos los ensayos de aniones se realizan en soluciones acuosas, la solubilidad en agua de las sales de ETA es una condicin para obtener resultados significativos.

Es esencial lavar el precipitado con agua antes de realizar el ensayo de disolucin del precipitado, a fin de remover cualquier anin soluble (no precipitado).

Lecturas recomendadas McKibben, T., Chappell, J. S., Evans, H., Mausolf, N., Analyses of Inorganic Components Found in Clandestine Drug Laboratory Evidence, J. Cland. Lab. Invest. Chem. Ass., 5(4), 1995, 19 a 33.

3. Ensayos de microcristales Los ensayos de microcristales son rpidos, sencillos y extremadamente sensibles para identificar sustancias y sus ismeros pticos. Comprenden la formacin de cristales a partir de la reaccin del compuesto objetivo con un reactivo qumico, seguida del anlisis de los cristales resultantes utilizando un microscopio de polarizacin y comparndolos con los materiales de referencia, por lo general fotografas de cristales conocidos. MTODOS La forma ms simple del ensayo consiste en agregar una gota de un reactivo adecuado a la sustancia que se ensaya, y observar y analizar luego los cristales formados en el microscopio de polarizacin. A fin de mantener un registro preciso, se deben describir las caractersticas principales de los cristales. El registro ms preciso de los resultados del ensayo son las fotografas. Si no se dispone de fotografas, un esbozo de las formas de los cristales puede resultar til. En el captulo Anlisis de ismeros pticos (pgina 37) se describen mtodos y procedimientos detallados para el ensayo de microcristales de ETA. En el anexo III se dan trminos descriptivos para las formas de los cristales y fotografas de cristales de los principales ETA, as como los requisitos en materia de equipo e instrumentos bsicos.

Lecturas recomendadas Cunningham, M. D. (1973), Rapid and sensitive technique for the differentiation of the optical isomeric forms of methamphetamine and amphetamine, Microgram, vol. 6, No.6, pgs.87 a 95.

Fulton, C. C. (1969), Modern Microcrystal Tests for Drugs, Wiley-Interscience, A Division of John Wiley & Sons, Nueva York-Londres-Sydney-Toronto.

no, M., Microcrystal Test, Japn, 1996 Proporciona una introduccin amplia a la tcnica de los ensayos de microcristales, con fotografas de resultados de ensayos de microcristales de 39 ETA y sus precursores.

B. CROMATOGRAFA DE CAPA DELGADA (CCD) La cromatografa de capa delgada (CCD) es una de las tcnicas usadas con ms frecuencia para separar e identificar drogas fabricadas ilcitamente. Es rpida (un anlisis rara vez toma

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ms de 30 minutos), sensible (se requieren cantidades inferiores a 1 mg del analito), extremadamente flexible en las fases estacionaria y mvil y, por lo tanto, adecuada para una amplia variedad de sustancias en forma de bases o de sales, que van desde los materiales ms polares hasta los ms no polares. Tambin se presta a una variedad de tcnicas de visualizacin, y es poco costosa. Pese a las ventajas obvias de la CCD, en muchos pases no se la acepta como tcnica nica de identificacin de drogas. Placas de CCD (fases estacionarias) Recubrimiento: Gel de slica G con un espesor de capa de 0,25 mm, y con un

indicador inerte, que fluorece bajo luz UV de longitud de onda de 254 nm

Nota: Las placas preparadas por el analista debe ser activadas antes de utilizarlas, colocndolas en un horno por lo menos durante 10 a 30 minutos a 120 C. Las placas se almacenan luego en un desecador libre de grasas sobre gel de slica azul. La activacin por calor normalmente no se requiere para capas enlazadas qumicamente (placas comerciales).

Tamaos de placa tpicos: 20x20 cm, 20x10 cm, 10x5 cm (la placa de 10x5 cm se debe utilizar nicamente con el lado de 10 cm en posicin vertical en el tanque de CCD.

Sistemas de disolventes (fases mviles) Sistema A: Metanol 100 Amonaco concentrado 1,5 Sistema B: Acetato etlico 85 Metanol 10 Amonaco concentrado 5 Sistema C: Cicloexano 75 Tolueno 15 Dietilamina 10

En relacin con sistemas de CCD ms normalizados, vase:

Thin-layer chromatographic Rf values of toxicologically relevant substances on standardized systems, second, revised and enlarged edition, Report XVII of the DFG Commission for clinical-toxicological analysis, volumen especial del boletn TIAFT, VCH Verlagsgesellschaft mbH, 1992.

MTODOS

A continuacin se proporcionan mtodos recomendados y resultados seleccionados, pero el analista deber familiarizarse con los resultados especficos para ETA individuales.

Sistemas de disolventes Preparar sistemas de disolventes de desarrollo en la forma ms precisa posible utilizando pipetas y cilindros de medicin. Dejar el sistema de disolvente en el tanque de CCD durante un tiempo suficiente para permitir la saturacin de la fase de vapor antes del anlisis (con tanques revestidos con papel absorbente, esto toma aproximadamente 5 minutos).

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Preparacin de muestras y soluciones estndar de ETA La forma de los estndares y las muestras (en sales o bases), no tiene importancia. Cualquiera de las dos es satisfactoria. Debido a la naturaleza bsica de los disolventes de desarrollo, los compuestos emigran como bases libres.

Soluciones estndar de ETA Las soluciones estndar de ETA se deben preparar a una concentracin de aproximadamente 2 mg/ml en metanol. Deben almacenarse a oscuras y en un lugar fro.

Soluciones de muestras de ETA (muestra de ETA desconocido) Las soluciones estndar de ETA se deben preparar a una concentracin de aproximadamente 5 mg/ml en metanol. En algunos casos, cuando se sospecha que la pureza del ETA es demasiado baja debido a que ha sido adulterado, quiz sea necesario preparar soluciones de muestras ms concentradas (se recomiendan soluciones 10 veces ms concentradas como punto de partida). Para las muestras de ETA en otras formas distinta del polvo, las soluciones de muestra se deben preparar de la siguiente manera:

Tabletas: Triturar un nmero representativo de tabletas (siguiendo planes generales de muestreo) hasta obtener un polvo fino y preparar una solucin con ese polvo.

Cpsulas: Extraer el contenido de una muestra representativa de las cpsulas (siguiendo planes generales de muestreo) y preparar una solucin con ese polvo.

Soluciones acuosas: Aplicar directamente sobre la placa, o el equivalente de 5 mg/ml, si se conoce la concentracin del ETA.

Aplicacin y desarrollo Aplicar sobre la placa de CCD 1 l y 5 l de una solucin de la muestra, junto con 2 l de la solucin o soluciones estndar (de preferencia, aplicar tambin a la placa un disolvente como control negativo). La aplicacin se debe hacer con cuidado para no daar la superficie de la placa. El punto de partida del anlisis, es decir, la lnea de aplicacin, debe ser 2 cm desde el fondo de la placa. El espacio entre aplicaciones de la muestra (puntos de aplicacin) debe ser de por lo menos 1 cm, y las aplicaciones no se deben colocar a menos de 1,5 cm del borde lateral de la placa. Para evitar aplicaciones difusas durante el desarrollo, el tamao de la aplicacin de la muestra debe ser lo ms pequeo posible (>2 mm). Dejar que la aplicacin se seque, y colocar la placa en el tanque de CCD saturado de disolvente (la saturacin de la fase de vapor se logra utilizando almohadillas o papel de filtro saturados con disolvente como revestimiento del tanque). Extraer la placa del tanque de revelado tan pronto como el disolvente alcance la lnea de revelado marcada de antemano; de otra forma, se producirn puntos difusos.

Visualizacin/deteccin Las placas se deben secar antes de la visualizacin: el disolvente se puede dejar secar a temperatura ambiente, o extraer con un secador de aire caliente. Si se utiliza aire caliente, hay que tener cuidado en razn de la volatilidad de las bases libres de ETA. Para el desarrollo del color apropiado, es importante que se eliminen de la placa todas las trazas de amonaco.

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La siguiente es una seleccin de mtodos de visualizacin. Sobre la base de los resultados de los ensayos presuntivos, los ETA previstos se deben seleccionar utilizando uno de los siguientes mtodos y reactivos, o una combinacin de ellos: Mtodo/ reactivo de visualizacin Analitos objetivo y resultados A. Luz UV a 254 nm Mtodo universal. Muchas sustancias, incluidos los ETA,

producen manchas prpura en una placa normalmente de color verde fluorescente.

B. Reactivo de ninhidrina Muchas aminas primarias y secundarias, adheridas a un tomo de carbono aliftico, como la anfetamina y la metanfetamina, dan manchas violeta o rosa.

C. Reactivo de yodoplatinato de potasio acidificado

Reactivo general sensible. Muchas aminas primarias y secundarias dan manchas de color azul plido.

D. Reactivo negro slido de potasio

Las aminas primarias y secundarias dan manchas de diversos colores, desde el violeta (aminas primarias) hasta el naranja o el rojo-naranja (aminas secundarias).

E. Reactivo de Marquis Distincin entre ETA con y sin anillo sustituido. F. Reactivo de

fluorescamina (Fluram) Reactivo sensible para aminas primarias. Recomendado para la deteccin de concentraciones de aminas primarias.

G. Reactivo de Simon Reactivo general para aminas secundarias (la efedrina y la seudoefedrina no reaccionan).

H. Reactivo de Dragendorff Reactivo general para alcaloides y bases nitrogenadas. A. Luz UV

Observar la placa seca bajo luz UV a 254 nm y 366 nm.

B. Reactivo de ninhidrina Preparar una solucin en etanol al 10%.

Rociar la placa con el reactivo de ninhidrina y calentar en un horno a 120 C por lo menos durante 15 minutos. Las aminas primarias, como la anfetamina, y las aminas secundarias, como la metanfetamina, producen manchas violetas o rosas. La efedrina tambin produce una mancha violeta.

C. Reactivo de yodoplatinato de potasio acidificado Disolver 0,25 g de cloruro platnico y 5 g de cloruro potsico en agua y preparar hasta 100 ml. Agregar 2 ml de cido clorhdrico concentrado.

Rociar la placa con la solucin de yodoplatinato de potasio acidificado y observar las manchas de colores. La anfetamina y la metanfetamina producen manchas difusas de color gris-violeta-pardo sobre un fondo rosa.

La solucin tambin se puede utilizar para rociar las superficies de las placas que anteriormente haban sido rociadas con ninhidrina.

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D. Reactivo negro slido de potasio Solucin A: Preparar una solucin de sal de reactivo negro slido de potasio en agua al 1% [2,5-dimetoxi-4-((4-nitrofenil)azo)benceno diazonio tetraclorozincato (2:1)]

Solucin B: 1N NaOH

Rociar la placa con la solucin A y observar las manchas de colores. Las aminas secundarias como la metanfetamina y la MDMA producen manchas inmediatamente. El nuevo rociado con solucin B produce manchas de colores para la anfetamina y otros ETA con anillo sustituido. Secar las placas con aire y rociar una vez ms con la solucin A. Esto produce manchas de colores ms intensos. Los colores varan del violeta para las aminas primarias al naranja o el naranja-rojo para las aminas secundarias como la metanfetamina y el MDMA.

E. Reactivo de Marquis Agregar de 8 a 10 gotas de solucin de formaldehdo al 40% a 10 ml de cido sulfrico concentrado. Preparar fresco antes de cada uso.

No se recomienda rociar con el reactivo de Marquis debido a la presencia de cido sulfrico concentrado. No obstante, proporciona informacin adicional til para diferenciar entre los ETA, por ejemplo, despus de la deteccin con ninhidrina. A tal fin, verter el reactivo de Marquis con una pipeta Pasteur sobre las manchas ya detectadas.

F. Reactivo de fluorescamina (Fluram) Disolver 10 mg de fluorescamina en 50 ml de acetona. Preparar diariamente.

Rociar la placa con el reactivo de fluorescamina. Secar utilizando aire caliente. Observar la placa con una luz UV a 366 nm. La anfetamina da una mancha fluorescente amarilla brillante. La metanfetamina no se detecta. (Para la estabilizacin en 366 nm, rociar con una solucin de trietilamina al 10% v/v en diclorometano).

G. Reactivo de Simon7 Disolver 100 mg de nitroprusiato de sodio y 2 g de carbonato de sodio en 10 ml de agua (es decir, una solucin acuosa que contiene nitroprusiato de sodio a una concentracin del 1% y carbonato de sodio al 20%). Preparar el reactivo fresco antes de usarlo.

Rociar la placa con el reactivo de Simon. Colocar la placa en un tanque de desarrollo vaco junto con un vaso de precipitacin con acetaldehdo. Cubrir el tanque. El vapor de acetaldehdo har que una mancha de metanfetamina se vuelva de color azul intenso.

H. Reactivo de Dragendorff Solucin madre: disolver 0,85 g de subnitrato de bismuto (bsico) en 10 ml de cido actico. Disolver 50 ml con agua y agregar 8 g de yoduro de potasio en 20 ml de agua.

Rociar la placa con una solucin preparada de 1 ml de solucin madre de Dragendorff, 2 ml de cido actico y 10 ml de agua. Los colores varan del naranja al violeta.

7 Este mtodo modificado mejora la sensibilidad para la metanfetamina a 0,1 (LOD). Las aminas primarias no se pueden detectar en razn de la baja sensibilidad del sistema a este grupo de sustancias, y a la interferencia con el color de fondo cuando se utiliza amonaco en el disolvente de desarrollo.

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Interpretacin Despus de la visualizacin, marcar las manchas (por ejemplo, con lpiz), y calcular los valores del factor de retardacin (Rf):

Distancia de migracin: del origen al centro de la zona del analito (mancha) Rf = Distancia de desarrollo: del origen al frente del disolvente Es muy comn expresar factores de retencin como Rf x 100, denominado hRf. RESULTADOS Comparar los colores y los valores Rf de la muestra del ETA desconocido con los de normas de referencia de ETA autnticos que se analizaron simultneamente en la misma placa. En el cuadro 2 se dan los valores Rf de algunos de los ETA ms comunes.

Cuadro 2. Valores Rf de los ETA y adulterantes que se encuentran con mayor frecuencia

Sistema de CCD* Nombre del ETA A B C Anfetamina 0,48 (0,43)** 0,37 (0,43) (0,20) Catinona 0,66 0,56 DOB 0,37 0,32 (0,13)

DOET 0,36 0,32 (0,24) DMA 0,37 0,33 (0,19) N-Etilanfetamina 0,47 0,37 (0,47)

Metanfetamina 0,35 (0,31) 0,22 (0,42) (0,28) MDA 0,36 (0,39) 0,33 (0,42) (0,18)

MDMA 0,31 (0,33) 0,21 (0,39) (0,24) MMDA 0,40 0,31 PMA 0,41 (0,73) 0,33 (0,43) (0,23) STP/DOM 0,35 (0,51) 0,31 (0,41) (0,15) TMA 0,35 0,20

Efedrina (0,30) (0,25) (0,05)

Cafena (0,52) (0,52) (0,03) *Sistemas de disolventes: A, B o C; placa de CCD: Gel de slica G con espesor de capa de 0,25mm Sistema A: metanol : amonaco concentrado (100:1,5) Sistema B: acetato etlico: metanol : amonaco concentrado (85:10:5) Sistema C: ciclohexano : tolueno : dietilamina (75:15:10) ** Los valores Rf entre parntesis se obtuvieron utilizando placas de slica impregnadas con KOH metanlico (0,1mol/l).

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Notas analticas Debido a que pequeos cambios en la composicin y activacin de la placa de CCD, los sistemas de disolventes, la saturacin del tanque o la distancia de desarrollo pueden resultar en cambios significativos en los valores Rf, los valores proporcionados deben considerarse slo como una indicacin del comportamiento cromatogrfico de los ETA y adulterantes enumerados. Es esencial que los patrones de referencia de los ETA se analicen simultneamente en la misma placa. Alternativamente, se puede aumentar significativamente la posibilidad de reproduccin utilizando compuestos de referencia y valores Rf corregidos (Rfc).

A los fines de la identificacin, siempre se deben considerar tanto los valores Rf como los colores de las manchas despus del rociado con reactivos de visualizacin

Lecturas recomendadas Fried y J. Sherma (Eds.), Practical Thin-Layer Chromatography, A Multidisciplinary Approach, Boca Raton Press, 1995.

Jork y otros, Thin-Layer Chromatography, Reagents and Detection Methods, Weinheim, VCH, vol.1 (1990), Vol.2 (1992).

Neumann, H. (1987), Nachweis und Identifizierung von Feniletilaminen (Stimulantien und Halluzinogene), Sci. Pharm., 55, 1 a 11.

Ojanper, I., Whl, K., y Hase, T. A. (1990): Fast black K salt: a versatile thin-layer chromatographic visualization reagent for the differentiation of aliphatic amines, Analyst, vol. 115, pgs. 263 a 267.

Stead, A. H., Gill, R., Wright, T., Gibbs, J. P., Moffat, A. C. (1982), Standardized thin-layer chromatographic systems for the identification of drugs and poisons, Analyst, vol. 107, pgs. 1106-1168.

C. CROMATOGRAFA EN FASE GASEOSA (CG) DETECTOR DE IONIZACIN POR LLAMA (FID)

Para el anlisis de ETA por CG, los principios generales de las tcnicas son vlidos. En la actualidad el instrumento preferido de CG para trabajos analticos de rutina es el cromatgrafo de columna capilar de calibre menor, utilizando columnas capilares con dimetros internos entre 0,2 y 0,32 mm. Se reconoce que, por diversas razones, hay laboratorios que quiz deseen mantener un sistema de columna rellena. Para esos laboratorios, en una edicin anterior del presente manual se describe un mtodo que utiliza columnas rellenas. Los procedimientos de CG que utilizan una columna capilar de calibre mayor (0,53 mm de dimetro interno) representan un medio de mejorar el poder de resolucin en comparacin con las columnas rellenas, y son ms robustos que los sistemas de columna capilar de menor calibre. Los sistemas de CG ms antiguos, que fueron diseados para columnas rellenas, se pueden adaptar para utilizarlos con columnas de mayor calibre.

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MTODOS

1. Anlisis cualitativo Preparacin de muestras y soluciones estndar de ETA

a) Soluciones estndar de ETA Poner unos 25 mg de sales estndar de ETA8 (debidamente pesados), en una probeta graduada de 25 ml y aadir agua hasta la marca. Colocar con una pipeta una alcuota de 1 a 5 ml de esta solucin en un tubo de ensayo de vidrio con tapn de rosca de 10 ml. Aadir por goteo una solucin de hidrxido de sodio al 5% hasta obtener un pH 10. Luego aadir 5 ml de disolvente de extraccin9. Tapar e invertir el tubo de ensayo por lo menos 10 veces o mezclar en un mezclador Vortex durante 1 minuto y dejar reposar hasta que se separen las capas10. Utilizando una pipeta Pasteur, transferir la capa de disolvente (por ejemplo, el cloroformo) a travs de la capa de sulfato de sodio anhidro a un vial de CG. Inyectar 1-2 l de la capa de disolvente en el CG.

b) Soluciones de muestras de ETA (muestra de ETA desconocido) Pesar de 25 a 150 mg de la muestra, segn la pureza anticipada, para obtener una concentracin final de aproximadamente 1 mg/ml de sal del analito, y colocarla en una probeta graduada y aadir agua hasta la marca. La pureza prevista de la muestra se determina empricamente11. Colocar con una pipeta una alcuota de 1 a 5 ml de esta solucin en un tubo de ensayo de vidrio con tapn de rosca de 10 ml. Aadir por goteo una solucin de hidrxido de sodio al 5% hasta obtener un pH 10. Aadir luego 5 ml de disolvente de extraccin (por ejemplo, cloroformo). Tapar e invertir el tubo de ensayo por lo menos 10 veces o mezclar en un mezclador Vortex durante 1 minuto y dejar reposar hasta que se separen las capas. Utilizando una pipeta Pasteur, transferir la capa de disolvente a travs de la capa de sulfato de sodio anhidro a un vial de CG. Inyectar 1-2 l de la capa de disolvente en el CG. Si se requiere una muestra rpida del producto, se pueden tomar muestras directamente en etanol/amonaco acuoso (99:1), e inyectarlas en el cromatgrafo de fase gaseosa. Con el empleo de este mtodo, la condicin del inyector y la columna pueden deteriorarse ms rpidamente que

8 Ocasionalmente, los estndares de ETA se pueden obtener en forma de base. En esos casos, no se requiere extraccin. En general, sin embargo, es importante que la forma de los estndares y las muestras sea siempre la misma. 9 Todos los analitos deben ser completamente solubles en el disolvente de extraccin, y ste ltimo debe ser inmiscible con una capa acuosa. Los disolventes adecuados son, entre otros, n-hexano, cloroformo, cloruro de metileno y acetato de butilo. 10 Cuando se emplea cloroformo como disolvente de extraccin, se pueden formar emulsiones. En esos casos, la adicin de NaCI mejora la taza de extraccin al romper la emulsin. Si se utilizan agitadores modernos y luego se centrifuga la muestra para la separacin de las dos capas, normalmente no se forman emulsiones. 11 La pureza de la muestra se puede determinar en base a la experiencia del qumico, o utilizando el siguiente mtodo aproximativo: disolver 100 mg de la muestra en 2-3 ml de cloroformo; filtrar la solucin, recoger los insolubles, secar y pesar. La cantidad soluble (es decir, el peso original menos los insolubles secos) es la pureza prevista de la muestra. Hay que tener presente, sin embargo, que ste mtodo puede resultar en una pureza anticipada de la muestra inferior a la real para las sales que no son solubles en cloroformo (vase el captulo VI.A.2, sobre el ensayo de aniones, supra)

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con las muestras extradas. (Nota: Este mtodo no es adecuado para anlisis cuantitativos dado que es difcil producir una buena cromatografa en presencia de amonaco.) Condiciones de trabajo con un CG Detector: FID (o NPD, si est disponible o es conveniente) Columna: DB-5 (5% fenil, 95% dimetilpolisiloxano), DB-1 (100% dimetil-

polisiloxano), o equivalente Longitud: 10-30 m, ID 0,20-0,53 mm Espesor de la pelcula: 0,10-0,50 m Gas portador12: Nitrgeno, helio o hidrgeno, a aprox. 0,8ml/min (N2) o 1-1,2 ml/min

(He o H2) Tasa de desdoblamiento:

20:1 a 50:1

Temperatura de la columna:

La temperatura inicial debe ser suficientemente baja (por ejemplo, 60-90C) en razn de la alta volatilidad de los ETA bases, por ejemplo, 60C, mantener por 0,5 min, a 280C, a una tasa de 12C/min, mantener la temperatura final durante 30 min.

Temperatura de inyeccin:

210-250C

Temperatura del detector:

310C

RESULTADOS La identificacin se realiza comparando el tiempo de retencin del analito con el de una norma de referencia. El orden de elucin es como sigue: anfetamina < metanfetamina < seudoefedrina < efedrina < PMA < PMMA < MDA < MDMA < 4-MTA < MDEA < MBDB < 2C-B. En las condiciones descritas, la cafena y la ketamina, que se encuentran con frecuencia en las muestras de ETA en algunas regiones, elucidan despus de 2C-B.

2. Anlisis cuantitativo A continuacin se presentan tres mtodos para el anlisis cuantitativo de ETA por CG-FID: Un mtodo estndar nico (A) y dos mtodos estndar mltiples (B y C). Los mtodos A y B no requieren derivatizacin, mientras que el mtodo C requiere sililacin. Los tres mtodos se describen para uso general. En el anexo IV hay ejemplos de mtodos de CG validados para la cuantificacin de ETA seleccionados.

i. Mtodo A: mtodo estndar nico El mtodo A es adecuado para la cuantificacin de la mayora de los ETA. Comprende la preparacin de slo una solucin estndar de ETA en una concentracin similar a la concentracin prevista del analito.

Preparacin de la solucin estndar interna (SI) Pesar con precisin unos 25 mg de la solucin estndar interna seleccionada (por ejemplo, n-tetradecano u otros n-alcanos con un nmero par de tomos de carbono, o difenilamina) y disolver en 25 ml de disolvente de extraccin (por ejemplo, cloroformo). Si la solucin estndar

12 El flujo de gas depende de la columna ID; se puede utilizar la programacin del gradiente de presin, si est disponible.

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interna se utiliza para la extraccin, la concentracin objetivo se debe preparar dentro del intervalo lineal del instrumento (no ms de 0,5 mg/ml).

Preparacin de muestras y soluciones estndar de ETA13 Las muestras y soluciones estndar de ETA se deben preparar siguiendo los procedimientos esbozados ms arriba para el anlisis cualitativo, utilizando la solucin estndar interna para la extraccin de muestras y estndares de ETA, de la siguiente manera:

a) Soluciones estndar de ETA

Pesar con precisin unos 25 mg de sales estndar14 del ETA de inters en una probeta graduada y aadir agua hasta la marca. Transferir con precisin una alcuota de 1 a 5 ml de esta solucin a un tubo de ensayo de vidrio con tapn de rosca de 10 ml. Aadir por goteo una solucin de hidrxido de sodio al 5% hasta obtener un pH 10. Aadir luego con precisin 5 ml de solucin estndar interna. Tapar e invertir el tubo de ensayo por lo menos 10 veces o mezclar en un mezclador Vortex durante 1 minuto y dejar reposar hasta que se separen las capas. Utilizando una pipeta Pasteur, transferir la capa de disolvente a travs de la capa de sulfato de sodio anhidro a un vial de CG. Inyectar 1-2 l de la capa de disolvente en el CG. Analizar la solucin estndar tres veces o ms.

b) Soluciones de muestras de ETA (muestra de ETA desconocido)

Pesar con precisin de 25 a 150 mg de la muestra, segn la pureza anticipada, para obtener una concentracin final de aproximadamente 1 mg/ml de sal del analito, ponerla en una probeta graduada y aadir agua hasta la marca. La pureza prevista de la muestra se determina empricamente. Con una pipeta, poner una alcuota de 1 a 5 ml de esta solucin en un tubo de ensayo de vidrio con tapa de rosca de 10 ml. Aadir por goteo una solucin de hidrxido de sodio al 5% hasta obtener un pH 10. Aadir luego con precisin 5 ml de la solucin estndar interna. Tapar e invertir el tubo de ensayo por lo menos 10 veces o mezclar en un mezclador Vortex durante 1 minuto y dejar reposar hasta que se separen las capas. Utilizando una pipeta Pasteur, transferir la capa de disolvente a travs de la capa de sulfato de sodio anhidro a un vial de CG. Inyectar 1-2 l de la capa de disolvente en el CG. Analizar la solucin de la muestra del ETA desconocido de preferencia dos veces o ms. Condiciones de trabajo con CG Las mismas que para el anlisis cualitativo por CG (pg. 26).

13 Las muestras y soluciones estndar de ETA y sus concentraciones estn diseadas para usar con columnas capilares y los procedimientos que se describen ms abajo. El empleo de columnas y sistemas de CG alternativos puede requerir cambios en trminos tanto de la composicin relativa como de las concentraciones de los diferentes componentes. 14 Si se utilizan estndares de ETA en forma de base, no se requiere extraccin. En esos casos, pesar no menos de unos 10 mg del estndar de ETA y disolver directamente en 10 ml de solucin estndar interna dispensada con precisin. Para una cuantitacin precisa, es importante que la forma del analito (sal o base) sea igual a la del estndar de ETA.

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Clculos De las inyecciones mltiples, calcular las tasas medias de las reas del pico: 1) del estndar de ETA pertinente en relacin con el estndar interno (ASt/IS), y 2) del ETA desconocido en relacin con el estndar interno (AATS/IS). El porcentaje de contenido de droga de la muestra se puede calcular utilizando la siguiente frmula:

CSt AATS/IS ATS (%) = CATS * ASt/IS *

100

donde ATS (%) = Contenido del ETA desconocido (como base o sal; vase la nota 14) en

el material de muestra original (= pureza de la muestra) CSt = Concentracin de la solucin estndar de ETA (mg/ml), preparada de

conformidad con a) supra (= peso del ETA estndar puro por mililitro de disolvente)

CATS = Concentracin de la solucin de la muestra del ETA desconocido (mg/ml), preparada de conformidad con b) supra (= peso de la muestra del ETA desconocido por mililitro de disolvente)

AATS/IS = Recuentos del rea del pico del ETA desconocido dividido por el recuento del rea del pico del estndar interno (de preferencia, una media de dos determinaciones)

ASt/IS = Recuentos del rea del pico del ETA estndar dividido por el recuento del rea del pico del estndar interno (de preferencia, una media de dos determinaciones)

El mtodo A se puede modificar de nico a mltiple diluyendo secuencialmente alcuotas de la solucin estndar de ETA con la solucin estndar interna utilizando probetas graduadas de 10 ml. De esta forma, se pueden preparar concentraciones estndar de ETA, en funcin de la concentracin apropiada dentro del intervalo lineal del instrumento, y lograr una calibracin de puntos mltiples.

ii. Mtodo B: mtodo estndar mltiple sin derivatizacin El que sigue es un mtodo de calibracin de puntos mltiples recomendado; en el anexo IV figuran mtodos de CG validados para el anlisis cuantitativo de ETA, con y sin derivatizacin.

Preparacin de la solucin estndar interna (SI) Pesar cuidadosamente de 0,3 a 0,4 g de la solucin estndar interna seleccionada (n-tetradecano, otros n-alcanos, difenilamina o ETA estructuralmente relacionado en forma de base)15 en una probeta graduada de 500 ml y diluir al volumen con cloroformo para obtener una solucin estndar interna de 0,6 a 0,8 mg/ml.

15 Si se utiliza un estndar interno en forma de sal (por ejemplo, la sal de un ETA estructuralmente relacionado), se requiere una extraccin. En esos casos, pesar no menos de unos 10 mg de estndar de ETA y disolver directamente en 10 ml de solucin estndar interna dispensada con precisin.

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Preparacin de soluciones estndar de ETA (soluciones de calibracin de CG) Las soluciones madre estndar deben contener todos los compuestos de inters en concentraciones de aproximadamente 1000 mg/l. Se pueden mantener en una probeta cerrada en un refrigerador por un perodo de hasta un ao. Para la preparacin de soluciones madre:

a) Pesar con precisin unos 1000 mg de la sal o sales del ETA de inters y ponerlos en una probeta graduada de 1000 ml; aadir agua hasta la marca;

b) Transferir con precisin mediante una pipeta, 5 ml de esta solucin a un tubo de ensayo de vidrio con tapa de rosca de 20 ml. Hacer bsica al tornasol aadiendo unas pocas gotas de solucin de amonaco concentrada. Aadir con precisin 5 ml de cloroformo;

c) Cerrar y agitar bien, y dejar reposar hasta que se separen las capas. Utilizando una pipeta Pasteur, transferir aproximadamente 1 ml de la capa de cloroformo a travs de sulfato de sodio anhidro a un pequeo vaso de precipitacin. Esta solucin estndar no debe permanecer en reposo ms de media hora antes de utilizarla para la calibracin;

d) Para la preparacin de los estndares de calibracin en una calibracin de 5 puntos, preparar los diferentes niveles de la siguiente manera:

Preparacin de estndares de calibracin de puntos mltiples

Nivel de calibracin

Solucin estndar

de ETA (l) Solucin

SI (l) CHCl3

(l)

Concentracin aproximada de sal

de ETA (mg/l) Nivel 1 20 100 880 20 Nivel 2 40 100 860 40 Nivel 3 60 100 840 60

Nivel 4 80 100 820 80

Nivel 5 100 100 800 100 Inyectar, por lo menos tres veces, 1-2 l de cada nivel en el CG y utilizar los valores medios para establecer la curva de calibracin.

Preparacin de soluciones de muestras de ETA (muestra de ETA desconocido) En general, pero especficamente para los anlisis cuantitativos, homogeneizar las muestras antes de iniciar cualquier ensayo o submuestreo.

a) Pesar con precisin una cantidad de muestra suficiente en una probeta graduada de 25 ml para obtener una concentracin final de aproximadamente 0,2-1 mg/ml del analito. Agregar agua hasta la marca.

Nota: La cantidad de la muestra que se pese depender de la pureza anticipada, como se indica en el mtodo de clasificacin preliminar. Por ejemplo, si la pureza anticipada es de un 40%, la cantidad de muestra utilizada deber ser aproximadamente 60 mg;

b) Transferir con precisin mediante una pipeta 5 ml de esta solucin a un tubo de ensayo de vidrio con tapa de rosca de 20 ml. Hacer bsica al tornasol aadiendo unas pocas gotas de solucin de amonaco concentrada. Aadir con precisin 5 ml de cloroformo;

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c) Cerrar y agitar bien, y dejar reposar hasta que se separen las capas. Utilizando una pipeta Pasteur, transferir aproximadamente 1 ml de esta muestra a travs de sulfato de sodio anhidro a un pequeo vaso de precipitacin. Medir 100 l de la solucin de la muestra, 100 l de la solucin estndar interna y 800 l de cloroformo y ponerlos en el vial de CG;

d) Inyectar 1-2 l en el cromatgrafo de fase gaseosa. Analizar la solucin de la muestra del ETA desconocido, de preferencia dos veces o ms.

Condiciones de trabajo con un CG Para los anlisis cuantitativos, es preferible utilizar un CG equipado con un instrumento de muestreo automtico. Las condiciones de trabajo pueden ser las mismas que para el anlisis cualitativo (pg. 26).

Clculos El porcentaje de droga contenido en la muestra se calcula a partir de la concentracin de la solucin de la muestra del ETA desconocido y los correspondientes valores de la curva de calibracin. Con instrumentos y programas informticos de CG modernos, y despus de conocer a travs del operador las concentraciones de los diferentes estndares de calibracin y la solucin de la muestra desconocida, se establece la curva de calibracin y se realizan los clculos automticamente para un punto nico de la curva a la terminacin del anlisis. Normalmente, el resultado se expresar como contenido porcentual de la droga desconocida en el material de muestra original, es decir, como la pureza de la muestra (peso del analito en relacin con el peso de la muestra).

iii. Mtodo C: mtodo estndar mltiple con derivatizacin Preparar muestras y soluciones estndar de ETA derivatizadas midiendo una alcuota (por ejemplo, 100 l de base seca liberada (es decir, despus de haber transferido las muestras y soluciones estndar a travs de sulfato de sodio anhidro a un p