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Modelado, análisis y control de un sistema biológico biestable
Análisis de los Resultados Experimentales 125
Análisis de los resultados experimentales en
laboratorio
En esta sección se presentarán los resultados de los experimentos que llevaron a cabo el grupo iGEM sobre los sistemas biestables simple y mejorado.
Tras la presentación se hará un análisis donde intentaremos sacar las máximas conclusiones posibles al respecto del comportamiento real mostrado en laboratorio.
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Modelado, análisis y control de un sistema biológico biestable
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1. Experimentos en laboratorio
Para la presentación del proyecto Flashbacter del grupo de estudiantes de la universidad Pablo de Olavide, se llevaron a cabo una serie de experimentos en laboratorio de las construcciones de los biestables.
En este apartado presentaremos una breve descripción de las construcciones y del procedimiento de los experimentos con la idea de comprender los resultados que de estas pruebas se extrajeron.
Sobre las medidas de los experimentos
A diferencia del modelado llevado a cabo durante este documento, el sistema real difiere en varios puntos:
- Hemos analizado el comportamiento de los sistemas en una única bacteria a la que se le ha supuesto una vida eterna.
- No se considera que esta bacteria se replica y subdivide cada cierto tiempo. Esto implicaría en los modelos, que las poblaciones se dividirían por la mitad, pasando a tener que considerar el doble de sistemas ambientes.
- La bacteria mantiene un volumen a lo largo del tiempo. Esto, de nuevo es falso, ya que este sistema viviente aumenta su tamaño hasta un nivel en el que se subdivide.
- La adición de IPTG al sistema se ha considerado directa e instantánea. Cuando se añade este químico a la colonia de bacterias, tiene que difundirse a través de las paredes de ser vivo hasta alcanzar el mismo ambiente en el que se encuentra nuestros plásmidos.
- …
Frente a estas diferencias de consideraciones, tenemos en cuenta lo siguiente:
- La utilización de una bacteria escherichia coli donde incluir nuestro sistema se debe a que ofrece un espacio cerrado y aislado. Además necesitamos este ambiente ya que es necesario disponer de otros entres biológicos como ARNp o ribosomas para que el plásmido cumpla su cometido.
- La presencia de reporters de cada uno de los represores se debe a la necesidad de tener por un lado, un indicador visual del estado de la bacteria, mientras que por otro lado, no ayuda a tener una referencia para conocer las poblaciones de represores de la colonia de bacterias.
- Para la demostración del comportamiento biestable no es preciso estudiar la bacteria donde se desarrolla mientras ésta no le afecte sensiblemente.
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Además, antes de presentar los resultados, vamos a hacer algunos comentarios acerca de la toma de datos.
Dada la imposibilidad de poder medir tanto el tamaño de la población de bacterias y dentro de cada una la población, no sólo de los represores, sino del resto de especies importantes para nuestros análisis, las medidas se hacen sobre la fluorescencia de la colonia.
Se utiliza un lector de placas (por fluorescencia) para realizar las medidas. Este aparato excita el sistema con una longitud de onda específica (GFP 501nm, RFP 584nm), para que la muestra emita una luz de diferente longitud (GFP 511nm, RFP 607nm) que se recogen gracias a un detector. Además, este aparato puede medir la densidad óptica, que nos sirve como orientación para determinar la cantidad de bacterias que hay en el cultivo.
Modelado, análisis y control de un sistema biológico biestable
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2. Resultados experimentales del biestable básico
Estos experimentos se realizaron para el siguiente plásmido (el del sistema simple)
El plásmido y sus genes detallados se pueden consultar en el siguiente enlace del registro de partes de iGEM:
Biobrick: BBa_K177038
Enlace: http://partsregistry.org/Part:BBa_K177038
Y recordamos el data page del biestable simple:
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Respecto a las gráficas mostradas, tenemos que señalar que los valores para la fluorescencia del indicador verde están escalados (7 veces) para poder ajustarlos a los valores del indicador rojo. Este hecho, se explicó cuando se hizo la selección de parámetros.
Experimentos realizados dejando al sistema evolucionar sin aplicación de ninguna de las acciones de control.
En la primera gráfica, cuando el GFP deja de crecer y comienza a bajar su población, el RFP tiende a crecer. Sucede algo parecido en la segunda, donde podemos observar un cambio del sistema aleatorio, donde el GFP tiende a caer su población mientras el RFP crece.
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Tras dejar el sistema durante una noche inducido por IPTG, en el instante 0 de las gráficas se aumenta la temperatura del sistema hasta 42ºC
Las tres gráficas muestran el mismo comportamiento cualitativo. Al aumentar la temperatura, la población de GFP y por tanto de cI(ts) disminuye, desreprimiendo la expresión de LacI y provocando un aumento de la población de RFP.
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Tras dejar el sistema durante una noche a temperatura de 42ªC, en el instante 0 de las gráficas se induce el sistema añadiendo IPTG
Este caso es especial, ya que el único experimento que parece confirmar lo que esperamos obtener es el primero de ellos, mientras que el resto, sorprendentemente muestran todo lo contrario.
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Conclusiones de los experimentos realizados sobre el biestable simple
A la vista de todos los resultados, no podemos llegar a asegurar la biestabilidad del sistema ni siquiera cuando aplicamos las acciones de control para los que se diseñó.
Al aumentar la temperatura, la población de represor termosensible cae casi a 0, por eso funciona bastante bien este cambio de estado. Sin embargo, a través de la inducción por IPTG no observamos el cambio esperado.
Este resultado se puede explicar probablemente por el bajo efecto inductor que tiene este químico en nuestro sistema. También es posible que la inducción por IPTG no se realizara durante el tiempo necesario o con la cantidad suficiente como para inestabilizar el estado actual.
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3. Resultados experimentales del biestable mejorado
A continuación mostramos la construcción, basada en el plásmido anterior, del biestable mejorado.
En este caso, tenemos dos plásmidos:
Plásmido: BBa_K510019
Enlace: http://parts.igem.org/Part:BBa_K510019?title=Part:BBa_K510019
Plásmido: BBa_K510036
Enlace: http://parts.igem.org/Part:BBa_K510036?title=Part:BBa_K510036
Modelado, análisis y control de un sistema biológico biestable
Análisis de los Resultados Experimentales 135
Y recordamos el data page del sistema mejorado
Presentamos a continuación los resultados de los experimentos realizados con esta construcción:
CAMBIO POR TEMPERATURA
Esta imagen muestra el cambio de estados cuando aplicamos el aumento de temperatura. En este caso, el cambio es mucho más claro que en el sistema simple.
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INDUCCIÓN POR IPTG
Para los experimentos de la inducción de IPTG, caso que fallaba en la construcción primaria, no sólo se ha comprobó que la adición de este químico indefinidamente, provocaba y mantenía el cambio de estado, sino que se hicieron varios experimentos para comprobar que el sistema es capaz de mantener éste estado sin una aplicación continua de la acción de control.
Conclusiones de los experimentos
A la vista de los datos mostrados y a pesar de no disponer de más experimentos que mostrar, se llegó a la conclusión de que efectivamente, el sistema mejorado funcionaba de forma más robusta. Incluso, en los experimentos realizados (aunque no muestren este documento) se observó que el sistema funciona mucho mejor cuando el número de copias del plásmido que contiene únicamente al promotor y el ARN mensajero antisentido del cI, es mucho mejor ya que parece mostrar que pierda la condición de biestabilidad.
Por otra parte, se hace patente que la inducción por IPTG aplica un efecto mucho más estable que en el biestable simple, ya que podemos encontrar algunos valores para los que no es necesario continuar con la inducción mientras queramos mantener el estado.
La inducción por temperatura también nos enseña que tras una inducción determinada en el tiempo, se mantiene tras ella el estado deseado. En los experimentos con el simple no sucede esto cuando dejamos de mantener la temperatura elevada y tras volver a los 37ºC, el sistema volvía a mostrar estado aleatorios.
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4. Conclusiones generales de los experimentos en
laboratorio
A la vista de todos los resultados, podemos afirmar que, en el laboratorio, el biestable creado a partir del primero funciona mucho mejor que simple, y las acciones de control, temperatura y adición de IPTG, mejoran el comportamiento estable de los estados.
Tal y cómo se comentaba en el objeto del proyecto, los experimentos buscaban un interpretación cualitativa de las construcciones. La caracterización realizada es suficiente como para afirmar el objetivo final del proyecto Flashbacter: crear un sistema biestable con mayor estabilidad que el propuesto por diversos grupos de investigación anteriores.
Efectivamente, se corroboró lo esperado: La construcción mejorada a partir del biestable propuesto por Timothy S. Gardner, muestra un comportamiento más robusto y más estable, eliminando la necesidad de aplicar inducciones de los estados mientras queramos su mantenimiento.
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