Analisis Microbiologico de Los Alimentos Vol II

7/25/2019 Analisis Microbiologico de Los Alimentos Vol II

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Este Manual ha sido preparado por integrantes delGrupo Tcnico de Microbiologa de la RENALOA

Reda c c i n :

- Lic. Mara del Carmen Alcaide. Servicio de Microbiologa, INAL -

ANMAT

- Bioq. Mara Josefina Cabrera. Servicio de Microbiologa, INAL

ANMAT

Rev i s i n tcn ica

- Bioq. Mariela Darr. Direccin de Bromatologa de la Provincia

de Chaco

- Bioq. Mara Susana Condor. Direccin de Bromatologa de la

Provincia de Tucumn

- Bioq. Marcela Lpez. Laboratorio Regional de Salud Ambiental

Cinco Saltos

- Lic. Vernica Trevisn. Departamento Laboratorio

Microbiolgico del Instituto Biolgico

"Dr Toms Pern" de La Plata- Med. Vet. Cecilia Peirano Departamento Laboratorio

Microbiolgico del Instituto Biolgico "Dr Toms Pern" de La

Plata

- Lic. Stella Maris Reffi. Departamento Laboratorio Microbiolgico

del Instituto Biolgico"Dr Toms Pern" de La Plata

- Diana Vernica Benegas. Laboratorio Bromatolgico Dr. G.

Montes, Mercado de Abasto de Ro Cuarto

- Lic. Nancy Passalacqua. CEPROCOR

- Med. Vet. Mara Noel Olivera. Servicio de Microbiologa, INAL -

ANMAT

- Lic. Mara Soledad Sarniguet. Servicio de Microbiologa, INAL -

ANMAT

- Lic. Fernando Trinks. Servicio de Microbiologa, INAL - ANMAT

Re v i s i n e d i t o r i a l y e d i c i n

- Lic. Martn Fernandez

- Lic. Juan Pablo Maseda

- Lic. Fernando Trinks


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INDICE

Bacillus cereus en alimentos pg. 5

Recuento de Bacillus cereusen muestras de alimentos.Tcnica de recuento en placa. Procedimiento segnInternational Standard Organization ISO 7932: 2006

pg. 11

Bacillus cereus. Deteccin y enumeracin por la tcnicade nmero ms probable (NMP) en muestras dealimentos. Procedimiento segn InternationalStandard Organization ISO 21871:2006

pg. 30

Clostridium perfringensen alimentos pg. 55

Recuento de Clostridium perfringensen muestras de

alimentos. Tcnica de recuento en placa.Procedimiento segn International StandardOrganization ISO 7937: 2004

pg. 62

Stahylococcus aureus en alimentos pg. 85

Recuento de Estafilococos coagulasa positiva enmuestras de alimentos. Tcnica de recuento en placa.Procedimiento segn International StandardOrganization ISO 6888-1: 1999

pg. 91

Recuento de Estafilococos coagulasa positiva enmuestras de alimentos. Tcnica de recuento en placa.Procedimiento segn International Commission onMicrobiological Specifications for Foods (ICMSF)

pg. 109

Estafilococos coagulasa positiva. Deteccin yenumeracin por la tcnica de nmero ms probable(NMP) en muestras de alimentos. Procedimientosegn International Standard Organization ISO 6888-3: 2003 (correccin 2004)

pg. 110

Estafilococos coagulasa positiva. Deteccin y

enumeracin por la tcnica de nmero ms probable(NMP) en muestras de alimentos. Procedimientosegn International Commission on MicrobiologicalSpecifications for Foods (ICMSF)

pg. 134


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Bacillus cereus


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B a c i l lu s c e r e u s

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Ba c i l l u s c e r e u s en alimentos

1.Generalidades

Bacillus cereus es un microorganismo Gram positivo, con forma debastn, anaerobio facultativo y esporoformador. Por tincin de Gramse observan bacilos positivos grandes de extremos rectos, aislados,en pares o cadenas, la mayora mvil por flagelos pertricos.

Las condiciones ptimas para su crecimiento son de 30C a 40C, conun rango de crecimiento entre 4C y 55C. Es mesfilo, pero existencepas psicrtrofas.

El pH ptimo para el desarrollo es entre 6.0 y 7.0, con un mnimo de

5.0 y un mximo de 8.8.La actividad acuosa (aw) mnima para su desarrollo es 0.93

(1).

La capacidad de esporular es una caracterstica importante, porqueestas estructuras confieren a la bacteria resistencia a condicionesadversas, de esta manera pueden seguir viables a pesar de que lasclulas vegetativas hayan sido destruidas. Luego, si las condicionesson las apropiadas, la espora germina y el microorganismo puedecrecer. La espora se desarrolla en forma central o subterminal sindeformacin del esporangio. Para la germinacin de las esporas,algunas cepas necesitan activacin por calor (shock trmico), una

opcin es por calentamiento a 80C durante 10 minutos. Estapropiedad es utilizada en algunas tcnicas analticas y es deimportancia a la hora de establecer el origen de algunos brotes deETA causados por este microorganismo.

Es resistente a la penicilina y ms resistente que otrosmicroorganismos esporulados al tratamiento con cido peractico, elcual se usa como alternativa al perxido de hidrgeno en eltratamiento de los envases para envasado asptico de alimentos (3).

2.Taxonoma

Debido a la gran diversidad del gnero, la clasificacin es compleja.Actualmente, la jerarqua taxonmica es: Reino: Bacteria; Divisin:Firmicutes (bajo contenido G+C); Clase: Bacilli; Orden: Bacillales;Familia: Bacillaceae; Gnero: Bacillus; Subgrupo I: Grupo Bacilluscereus sensu lato. A este subgrupo tambin pertenecen: B. anthracis,B. mycoides, B. pseudomycoides, B. thuringiensis, B.weihenstephanensis(1, 2).


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Ba c i l lu s c e r e u s

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3.Caractersticas de la enfermedad

Es considerado un patgeno de riesgo moderado directo, dediseminacin limitada, categora 8 de la clasificacin de la I.C.M.S.F.(4). La distribucin del microorganismo es universal. Es una bacteria

ubicua, encontrndose en suelo, polvo, ambiente, de fcilpropagacin a vegetales. Tambin se ha encontrado en otros tipos dealimentos debido a contaminacin cruzada. No se transmite depersona a persona, pero s puede multiplicarse en el alimento. Sesabe que gran parte de los alimentos e ingredientes estncontaminados con esta bacteria, pero no alcanzan la dosis infectiva,la cual es de aproximadamente 105UFC/g (5). Se considera que unalimento que contenga ms de 104UFC/g de B. cereuspodra no serseguro para su consumo (1).

La portacin asintomtica en el hombre tiene un rango del 13 al 43 %

segn la Organizacin Panamericana de la Salud (6), aunque algunosautores afirman que su presencia en heces refleja el consumo dealimentos contaminados, ya que la bacteria no colonizara elintestino.

Bacillus cereus causa dos tipos de intoxicaciones, segn la toxinainvolucrada: sndrome emtico y sndrome diarreico. Segn la cepa,producen una u otra toxina, pero hay algunas que tienen la capacidadde sintetizar las dos. El tipo de enfermedad predominante vara porregiones geogrficas segn la distribucin de las cepas de Bacilluscereusy la dieta tpica de cada zona.

El sndrome emtico es ocasionado por una toxina preformada en elalimento (1, 7). La toxina involucrada es llamada cereulida ovomitoxina, es un pptido altamente resistente a los extremos de pHde 2 y 11, al calor (no se destruye por tratamiento a 121C por 90minutos) y a la accin de enzimas proteolticas (tripsina y pepsina).Esta toxina es una molcula proteica pequea, no antignica, que seproduce en la fase estacionaria de crecimiento, antes de laesporulacin. Los sntomas se presentan entre una y cinco horasdespus de realizada la ingesta, predominando nuseas y vmitos. El

malestar dura de 6 a 24 horas. Este cuadro puede confundirse con elocasionado por Staphylococcus aureus. La toxina interfiere en laactividad mitocondrial y tiene accin inmunomodeladora.Esta toxinaes la ms peligrosa de las producidas por Bacillus cereus, junto con lacitotoxina K.

El sndrome diarreico se debe a la germinacin in vivo de las esporasde la bacteria en el intestino con la consecuente produccin deenterotoxinas termolbiles. Suelen aparecer en alimentos malrefrigerados. Los sntomas aparecen entre las 6 y 8 horas derealizada la ingesta y duran entre 12 y 24 horas. La sintomatologa

principal consiste en diarrea y dolor abdominal y, ocasionalmente,nuseas y vmitos. Esta intoxicacin suele confundirse con la


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ocasionada por Clostridium perfringens. Las toxinas involucradas sonmolculas proteicas que se elaboran en la fase exponencial decrecimiento de la bacteria, la toxicidad se pierde despus de estafase. Segn Granum (1), las enterotoxinas involucradas enintoxicaciones alimentarias son: citotoxina K1 y K2, enterotoxina no

hemoltica (NHE) y, probablemente, hemolisina HBL. Hay otras dosenterotoxinas (T y FM) que se desconoce si son contaminantes dealimentos. La presencia de estas toxinas puede determinarse en ellaboratorio por mtodos moleculares (PCR) o por ensayos decitotoxicidad contra lneas celulares que resultaron ser sensibles a lasenterotoxinas diarreicas, tales como Vero (clulas de rin de mono)y CHO (clulas de ovario de hamster chino).

4.Epidemiologa

Ambas intoxicaciones gastrointestinales tienen corto perodo deincubacin (menos de 12 horas), son sintomticas (principalmentediarrea, dolor abdominal, nuseas y vmito) y son autolimitadas, seresuelven en 12 a 24 horas sin necesidad de tratamiento conantimicrobianos. En la mayora de los casos para el tratamientoalcanza con la hidratacin adecuada del paciente durante el proceso.

Para confirmar un caso, es necesario identificar en el alimentosospechoso Bacillus cereus con un recuento igual o superior a 105UFC/g; no es suficiente con su identificacin en las heces debido a la

posible portacin asintomtica. Adems, hay que tener en cuenta enel caso del sndrome diarreico que la presencia de los genes de latoxina en cepas aisladas de Bacillus cereusno prueba la produccin invivo de la misma.

En general, se admite que debido a la levedad del cuadro y a que ladeteccin de esta bacteria no se realiza rutinariamente en losanlisis, la incidencia real puede ser mayor que la estimada. Ademshay que tener en cuenta que el cuadro clnico puede confundirse conel causado por Staphylococcus aureuso Clostridium perfrigens, segnla toxina implicada.

La resistencia trmica de las esporas dificulta su eliminacin delambiente, relacionando su presencia con fallas en las condicioneshiginico sanitarias. Muchos alimentos estn contaminados conBacillus cereusdebido a su amplia distribucin en el ambiente, perosu presencia en pequeas cantidades no suele constituir un problemaya que no causar enfermedad. Aquellos que son probable fuente deinfeccin o intoxicacin, son los que se conservan a temperaturaambiente luego de la coccin, lo cual puede permitir el desarrollo dela bacteria y la produccin de toxina preformada en el alimento antesde su ingestin. Por lo tanto, si la coccin no fue suficiente para

inactivar las clulas, es la falta de refrigeracin inmediata delalimento lo que permitir el desarrollo de dicha bacteria. Aunque


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luego los alimentos se recalienten previamente a su consumo, esteproceso no inactivar las esporas ni la toxina emtica que pudohaberse producido. Por lo cual, la prevencin de la enfermedadrequiere del control de la germinacin de las esporas y delcrecimiento de las clulas vegetativas en los alimentos listos para

consumir. Las condiciones que favorecen el desarrollo delmicroorganismo incluyen procedimientos que activan las esporasseguidos de un enfriamiento lento y el almacenamiento de losalimentos a temperaturas entre 10C y 50C. Para disminuir losriesgos de intoxicacin, los alimentos deben ser refrigerados oconsumidos en caliente, inmediatamente despus de la coccin. Lagerminacin de esporas tambin puede controlarse por regulacin delpH y la aw.

Alimentos amilceos como el arroz, papas, pastas y otros estnparticularmente asociados a brotes por Bacillus cereus. Tambin lasespecias son un importante vehculo de transmisin ya que lasesporas son muy resistentes a la desecacin. En productos crnicos,la incidencia suele ser mayor debido a que en muchos de ellos seincorporan aditivos, como las especias, que incrementan el nmerode Bacillus cereus. La contaminacin de leche con esta bacteria estmuy relacionada a vacas enfermas con mastitis aguda. Alimentos queposeen leche en polvo en su composicin pueden estar altamentecontaminados con esporas, esto es especialmente importante en eldesarrollo de frmulas para lactantes y nios. Otros alimentos de losque fue aislada la bacteria son t, postres, legumbres, salsas, sopas,

entre otros.

5. Determinacin

Existen ciertas diferencias entre las normas que se utilizan para ladeterminacin de Bacillus cereus en el laboratorio. Algunas normasestablecen marchas para su determinacin muy largas, con unaextensa batera de pruebas bioqumicas. Por el contrario, hay otrasque slo indican la realizacin de algunas pocas pruebas debido a la

dificultad de identificar a nivel especie las bacterias del gnero. Poreste ltimo camino se llega a una determinacin presuntiva deBacillus cereus. En estos casos, la determinacin ms importante seconsidera que es la capacidad hemoltica de la bacteria, ya que serelaciona esta propiedad con la patogenicidad de la misma (normaISO 7932:2004).

6.Legislacin

Actualmente, el C.A.A. exige su bsqueda en polvos o mezclas para

preparar postres para helar (Art. 818 bis), en polvo para prepararhelados, preparado bsico para helados y similares (Art. 1079 bis),


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en harinas de trigo (Art. 661 bis), en comidas preparadas listas parael consumo (Art. 156 tris) y en viandas a domicilio (Art. 151) (8)

Por otro lado, la legislacin de otros pases pide su bsqueda en otrosalimentos. Por ejemplo en Espaa, hay lmites establecidos para

caldos, consoms, sopas y cremas; especias y condimentos; salsa demesa; t; preparados para lactantes y alimentos dietticos paramenores de 6 meses.(9) En Per, se exige su bsqueda en muchosalimentos tales como: postres a base de helados, mezclasdeshidratadas para helados, sopas, cremas, salsas y pursdeshidratadas instantneas y que requieren coccin; en mezclas enseco de uso instantneo (refrescos, gelatinas) y que requierencoccin (flanes); en harinas, almidones y fculas, cerealesinstantneos, productos de panadera congelados listos para suconsumo y en productos deshidratados e instantneos que requierenreconstitucin o coccin.(10) En Chile, se pide su bsqueda enfrmulas lcteas, frmulas para lactantes, mezclas deshidratadas deuso instantneo o que requieran coccin, y en comidas y platos listospara el consumo que contengan arroz(11). La legislacin brasileatambin reglamenta su anlisis en una amplia variedad de alimentos.(12)


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Referencias

(1) Granum, P. E. 2002 Bacillus cereus. En : Food MicrobiologyFundamentals and Frontiers. Doyle, M.P.; Bechaut, L. R.; Montville, T.J. A&M Press. Washington D.C. USA. Pg: 327 a 336.

(2) Claus, D., Berkeley, R.C.W., 1986. Genus Bacillus. En: Bergey'sManual of Systematic Bacteriology, vol. 2. The Williams and WilkinsCo., Baltimore. Pg: 1105-1139.

(3) Blakistone, B. R. Chuyate, D. Kautter, jr., J. Charbonneau, and K.Suit. 1999. Efficacy of Oxonia Active against selected spore formers.J. Food Protect. 62: 262-7.

(4) Microorganismos de los Alimentos. Caractersticas de lospatgenos microbianos. ICMSF

(5) Adams, M. R.; Moss, M. O. 1995. Food Microbiology. The Royal

Society of Chemistry. Cambridge. USA. Pg. 160 a 164.

(6) Diagnstico e Investigacin Epidemiolgica de las EnfermedadesTransmitidas por los Alimentos. Organizacin Panamericana de laSalud. Curso virtual. http://www.ops.org.ar/publicaciones/publicaciones20virtuales/libroETAs/index.html

(7) Rajkowski, K.T., Bennett, R.W., 2003. Bacillus cereus. En:International Handbook of foodborne Pathogens. Miliotis, M.D., Bier,J.W. Marcel Dekker, inc. New York, USA.

(8) Cdigo Alimentario Argentino. http://www.anmat.gov.ar/

alimentos/normativas_alimentos_caa.asp

(9) Reglamento (CE) N 1441/2007. Diario Oficial de la UninEuropea. http://cvu.rediris.es/pub/bscw.cgi/d311175/Normicro/Recopila/normicro.htm

(10) Norma sanitaria N 071-MINSA/DIGESA-V.01, Norma Sanitariaque establece los Criterios Microbiolgicos de Calidad Sanitaria eInocuidad para los Alimentos y Bebidas de Consumo Humano.Resolucin ministerial N 591-2008/MINSA. Per.

(11) Chile. Reglamento Sanitario de los Alimentos.

(12) Resolucin 2/1/2001. Reglamento tcnico sobre patronesmicrobiolgicos para alimentos. ANVISA, Ministerio de Salud, Brasil.

(13) Rhodehamel, E.J; Harmon, S.M 1998. Bacillus cereus. En:Bacteriological Analytical Manual (BAM). Octava Edicin, Revisin A.

(14) Fundamento pruebas bioqumicas: Manual de Prcticas deMicrobiologa. Evangelina Olivas E. y Luis Roberto Alarcn.Universidad Autnoma de Ciudad Jurez.

(15) Hobbs, B.C. and Gilbert, R. J. 1974. Microbiological Counts in

relation to food poisoning, Proceedings of the IV internationalCongress of Food Science Technology 3:159.


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Recuento de Ba c i l l u s ce r e u s en

muestras de alimentos

Tcnica de recuento en placaProcedimiento segn

International Standard Organization ISO 7932:2004

1.OBJETIVO

El presente procedimiento tiene como objetivo describir lametodologa llevada a cabo por el Laboratorio de Microbiologa pararealizar la enumeracin de presunto Bacillus cereus viable por la

tcnica de recuento de colonias en placa a 30C, en muestras dealimentos y muestras ambientales de las reas de produccin ymanipulacin de alimentos.

2.ALCANCE

Este procedimiento se aplica para realizar la enumeracin depresunto Bacillus cereus por la tcnica de recuento de colonias enplaca a 30C en muestras de alimentos y muestras ambientales en elrea de produccin y manipulacin de alimentos.

Con el fin de tener un mtodo de ensayo prctico, la fase deconfirmacin ha sido restringida al aspecto tpico de las colonias enagar MYP y al test de hemlisis.El trmino presunto se utiliza con el fin de reconocer el hecho quela fase de confirmacin no permite la distincin entre B.cereusy otrasespecies de Bacillus estrechamente relacionadas pero aisladas conmenor frecuencia, tales como B. anthracis, B. thuringiensis, B.weihenstephanensis, B. mycoides.En caso que se sospeche la presencia de B. anthracis se puedeagregar un test de movilidad para ayudar a diferenciarlo de B.cereus.

NOTA: las cepas aisladas deben ser enviadas al Centro de ReferenciaInstituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S Dr. CarlosG. Malbrn, para una mayor tipificacin.

Normas de referencia: Para la aplicacin del presenteprocedimiento son indispensables las normas citadas en el punto 5.Referencias

3.DESARROLLO


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3.1. Definiciones

Para el propsito de este documento, presunto Bacillus cereuses unabacteria que forma colonias tpicas en la superficie del medio decultivo selectivo y da una reaccin positiva de confirmacin bajo las

condiciones especificadas en este procedimiento.Al parecer muchas, si no la mayora, de las cepas de Bacillus cereusgerminan rpidamente en la superficie del medio de cultivo usadopara recuento. En la mayora de los casos no parece ser necesario unshock trmico para provocar la germinacin. A veces un tratamientotrmico es deseable, por ejemplo para el recuento de esporas o parainhibir el crecimiento de clulas vegetativas. En tales casos serecomienda un calentamiento por 10 minutos a 80C.

3.2. Medios de cultivo, reactivos, materiales y equipos

3.2.1. Agua peptona bufferada (BPW)3.2.2. Solucin salina peptonada (SFP)3.2.3. Agar manitol yema de huevo polimixina (MYP) para aislamientode Bacillus cereus3.2.4. Solucin de polimixina (106 U.I. en 100 ml)3.2.5. Emulsin de yema de huevo3.2.6. Agar base sangre3.2.7. Sangre de oveja desfibrinada3.2.8. Estufa de esterilizacin

3.2.9. Autoclave3.2.10. Estufa de incubacin: 30C 1C3.2.11. Bao de agua o aparato similar capaz de mantener latemperatura a 45C 0.5C y a 50C 1C,3.2.12. Peachmetro de exactitud 0.01 a 25C 1C.3.2.13. Pipetas de 1 ml y 10 ml de capacidad, graduadas enintervalos de 0.1 y 0.5 ml respectivamente3.2.14. Ansas de platino/irdio o nquel/cromo de aproximadamente 3mm de dimetro y de puncin del mismo material, o equivalentesestriles descartables.

3.2.15. Tubos de ensayo, botellas o frascos de capacidad apropiada,en particular de 16 mm x 160 mm o bolsas de plsticos estriles decapacidad apropiada.3.2.16. Equipo para mezclado (tipo stomacher)3.2.17. Agitador mecnico (tipo vortex)3.2.18. Placas de Petri de vidrio o plstico de 90 a 100 mm dedimetro o de 140 mm en caso que fuere necesario.3.2.19. Esptula de Drigalsky3.2.20. Equipo de filtracin para esterilizacin de soluciones.

3.3. Principio (ver anexo 1)

El mtodo est basado en las siguientes etapas:


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3.3.1. Preparacin de la muestra, suspensin inicial y dilucionesdecimales sucesivas.3.3.2. Plaqueo en la superficie de un medio de cultivo selectivo deuna cantidad especfica de la muestra problema si es lquida o de lasuspensin inicial si es slida y de las diluciones decimales sucesivas.

Incubacin en aerobiosis a 30C por 18 h a 48 h.3.3.3. Clculo del nmero de presunto Bacillus cereus por gramo omililitro de muestra a partir del nmero de colonias obtenidas de lasplacas que dan resultados significativos y de la confirmacin deacuerdo al test especificado.

3.4. Muestreo

El plan de muestreo a utilizar est fuera del alcance de estametodologa.

3.5. Procedimiento

3.5.1. Preparacin de la muestra, suspensin inicial ydiluciones (ISO 6887-1:1999)

NOTA: Para este punto referir a la norma ISO 6887 1 y las normasespecficas para el alimento en cuestin. (Ver punto 5 Referencias)

3.5.1.1. Suspensin inicialEn un frasco estril o bolsa de plstico estril pesar con unaincertidumbre de medicin de 5 % una cantidad de masa x g omedir con una incertidumbre de medicin de 5 % un volumen x ml(como mnimo 10 g 10 ml a menos que se indique otra cantidad).Agregar una cantidad del diluyente igual a 9 x g 9 x ml (dilucin1/10) y homogeneizar de 1 a 3 minutos dependiendo del alimento.Para evitar daos de los microorganismos por cambios bruscos detemperatura, la temperatura del diluyente debera ser aproximada ala temperatura ambiente.En el caso de recuento de esporas realizar un tratamiento trmico ala suspensin inicial, inmediatamente despus de su preparacin, porejemplo 10 minutos a 80C seguido de un enfriamiento rpido.NOTA: En algunos casos, particularmente para los productos muyviscosos o muy espesos, podra ser necesario agregar mayor cantidadde diluyente lo cual debe tenerse en cuenta en las operacionessubsiguientes y / o en la expresin de resultados.

3.5.1.2. Diluciones decimalesTransferir con una pipeta 1ml (con una incertidumbre de medicin de

5 %) de la suspensin inicial en un tubo con 9 ml del diluyenteestril, para obtener la dilucin 10-2.


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Para una ptima precisin no introducir la pipeta ms de 1 cm en lasuspensin inicial y evitar el contacto entre la pipeta que contiene elinculo y el diluyente estril.Mezclar utilizando preferentemente un agitador mecnico entre 5 y10 segundos Si es necesario repetir esta operacin a partir de la

dilucin 10-2 ydiluciones sucesivas, utilizando en cada operacin unanueva pipeta estril para obtener las siguientes diluciones (10-3,10-4,etc.). Se realizan las diluciones que sean necesarias para obtener unnmero apropiado de microorganismos para realizar el recuento. (Ver3.5.3.)

3.5.1.3. Duracin del procedimientoEl tiempo transcurrido entre el final de la preparacin de lasuspensin inicial y el instante en que el inculo entra en contactocon el medio de cultivo no debe superar los 45 minutos, mientras que

el lapso de tiempo lmite entre la preparacin de la suspensin inicialy el comienzo de la preparacin de las diluciones decimales sucesivases de 30 minutos.NOTA: si la temperatura ambiente del laboratorio es muy alta estosdos lapsos de tiempo deben ser reducidos.

3.5.2. Inoculacin e incubacin

3.5.2.1. Transferir por medio de una pipeta estril, 0.1 ml de lamuestra si el producto es lquido 0.1 ml de la suspensin inicial

(dilucin 1/10), por duplicado, a placas de agar MYP. Si es necesariorepetir el procedimiento para las sucesivas diluciones decimales.3.5.2.2. Para algunos productos se puede aumentar el lmite dedeteccin por un factor de diez, examinando 1 ml de la muestrainicial si es lquida 1 ml de la suspensin inicial para otrosproductos. Distribuir 1 ml del inculo en la superficie de una placa dePetri de 140 mm de dimetro con agar MYP o en tres de placas 90mm de dimetro con agar MYP utilizando una esptula de Drigalsky.En ambos casos preparar duplicados usando dos placas de 140 mm oseis placas de 90 mm.

3.5.2.3. Distribuir el inculo tan pronto como sea posible sobre lasuperficie del medio sin tocar los bordes de las placas con unaesptula estril. Utilizar una esptula para cada placa. Dejar lasplacas con la tapa puesta por 15 minutos a temperatura ambientepara permitir que el inculo sea absorbido en el agar.3.5.2.4.Invertir las placas e incubarlas a 30C entre 18 y 24 horas.Si no hay colonias claramente visibles, incubar las placas por 24horas adicionales antes del conteo.

3.5.3. Recuento y seleccin de las colonias

Despus de la incubacin por el perodo especificado, seleccionar lasplacas, preferiblemente en dos diluciones sucesivas, en las que el


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recuento sea menor a 150 colonias, contar en cada placa las coloniascon caractersticas de colonias presuntas de Bacillus cereus.Las colonias presuntas son grandes, rosas (indicando que no ocurrefermentacin del manitol, ver NOTA 1) y generalmente rodeadas deuna zona de precipitacin (produccin de lecitinasa, ver NOTA 2).

Si hay menos de 15 colonias caractersticas en las placas inoculadascon el producto lquido o con la menor dilucin de los otros productos,es posible realizar un recuento estimado como se indica en el punto3.5.5.NOTA 1. Si las placas contienen numerosos organismosfermentadores de manitol que producen cido, la caracterstica decolor rosa de las colonias de Bacillus cereus puede reducirse odesaparecer por completo.NOTA 2. Algunas cepas de Bacillus cereusproducen poco o nada delecitinasa. Las colonias deberan tambin ser sometidas al test de

confirmacin.Si el inculo de 1 ml fue distribuido sobre tres placas de Petri de 90mm (ver 3.5.2.2) tratar esas placas como una en el recuento y en elprocedimiento de confirmacin.

3.5.4. Confirmacin

3.5.4.1. Seleccin y purificacin de las colonias paraconfirmacin

Elegir cinco colonias presuntas de cada placa seleccionada como en

3.5.3. Si hay menos de cinco colonias en la placa, tomar todas lascolonias presentes. Confirmar esas colonias como se especifica en3.5.4.2 y 3.5.4.3Si las placas estn con sobrecrecimiento y no es posible seleccionarcolonias bien aisladas, estriar 5 colonias presuntivas en placas con elmedio selectivo (MYP). Incubar las placas a 30C durante 18 h a 24h.Seleccionar de cada placa al menos una colonia bien aislada.Confirmar como se especifica en 3.5.4.2 y 3.5.4.3.

3.5.4.2.Confirmacin por el test de hemlisis en agar sangrede ovejaEstriar, pinchar o sembrar como mancha las colonias seleccionadasen 3.5.4.1 a partir de las placas de MYP en la superficie de agarsangre de oveja de modo de obtener colonias aisladas que permitanuna buena interpretacin de la reaccin de hemlisis.Incubar a 30C durante 24 h y leer la reaccin de hemlisis.Cada colonia rodeada de una zona clara se considera hemlisispositiva.

3.5.4.3. Interpretacin bioqumicaVer tabla 1


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Tabla 1

Test Resultado de los test

Agar MYP Formacin de colonia rosarodeada de precipitado (ver NOTA1 en 3.5.3.)

Hemlisis Reaccin positiva (a)(a) El ancho de la zona de hemlisis puede variar

3.5.5. Expresin de los resultados

3.5.5.1. Recuento de colonias de presunto Ba c i l lu s c e r e u s Informar el recuento de presunto Bacillus cereus en la porcin demuestra analizada (por gramos o mililitros para muestras lquidas).Ver Anexo 3: Clculo y expresin de resultados.

3.5.5.2. Placas sin coloniasSi las dos placas correspondientes a la muestra sembrada (productoslquidos) o a la suspensin inicial (otros productos) no contienencolonias de presunto Bacilus cereus informar el resultado comosigue:

Si se sembr 1 ml repartido en 3 placas (ver 3.5.2.2)- Menos de 1 microorganismo / ml (productos lquidos) - Menos de 1/d microorganismo / g (otros productos) donde d es

el factor de dilucin de la suspensin inicial.

Si se sembr 0.1 ml en cada placa- Menos de 10 microorganismos / ml (productos lquidos) - Menos de 10/d microorganismos / g (otros productos) donde d

es el factor de dilucin de la suspensin inicial.


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4. ANEXOS

ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento para recuentode Ba c i l l u s c e r e u s

Preparacin de la muestra: x g de muestra + 9 x ml de diluyente(dilucin 1/10)

Inoculacin e incubacin: transferir por duplicado 0.1 ml de lasdiluciones preparadas en placas de Petri con agar MYP, Incubar a

30C 0,5C, 18 h a 48 h

Recuento y seleccin de las colonias caractersticas: seleccionarlas placas con menos de 150 colonias caractersticas y contar como

presunto Bacillus cereus. Seleccionar 5 colonias caractersticas

Confirmacin

Seleccin y puri ficacin de las colonias para confi rmacin: en agar

MYP a 30C, 18 h a 24 h

Test de hemlisis en agar sangre deoveja:a 30C, 24 h 2 h

Expresin de resultados


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ANEXO 2: Medios de cultivos y reactivos

1.Agua peptona bufferada (BPW)

Peptona (enzimtica) de casena 10.0 g

Cloruro de sodio (NaCl) 5.0 g

Disodio hidrgeno fosfato dodecahidratado (Na2HPO4.12H2O) 9.0 g

Potasio dihidrgeno fosfato (KH2PO4) 1.5 g

Agua destilada 1000 ml

Disolver los componentes en agua, si es necesario calentar. Ajustar elpH a 7.0 0.2 a 25C. Distribuir en frascos o tubos de acuerdo a lasnecesidades analticas. Esterilizar a 121C durante15 minutos.

2.Solucin salina peptonada (SFP)

Digesto enzimtico de casena 1.0 g

Cloruro de sodio 8.5 g



3.Agar manitol yema de huevo polimixina (MYP)

3.1. Medio base


Extracto de carne 1.0 g

D- manitol 10.0 g


Rojo fenol 0.025 g

Agar9 g a 18g*


*dependiendo de la firmeza del agar

Disolver los componentes en agua, por calentamiento y agitacin.Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor despus de laesterilizacin de 7.2 0.2 a 25C. Fraccionar 90 ml del medio enrecipientes de capacidad adecuada. Esterilizar a 121C durante 15minutos.3.2. Solucin de sulfato de polimixina B


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Sulfato de polimixina B1.000.000 unidades (equivalente a0.1g aproximadamente)


Disolver el sulfato de polimixina B en agua destilada. Esterilizar porfiltracin.

3.3 Emulsin de yema de huevo.

Usar huevos de gallina frescos, limpios y con sus cscaras intactas.Lavar los huevos, usando un cepillo, en detergente lquido. Enjuagarbajo agua corriente, sumergir por 30 segundos en alcohol 70% envolumen y secar. Usando procedimientos aspticos, romper cadahuevo y separar la yema de la clara por repetidas transferencias de la

yema de una mitad de la cscara del huevo a la otra. Poner lasyemas en un recipiente con graduacin y agregar cuatro partes envolumen de agua estril. Transferir aspticamente a un recipienteestril y mezclar vigorosamente.Calentar la mezcla durante 2 h en bao de agua a 44C - 47C.Luego dejar durante 18 h a 24 h a 3C 2C para permitir que seforme un precipitado.Recoger el sobrenadante aspticamente.La emulsin puede ser guardada a 3C 2C durante no ms de 72h.

NOTA: Se acord incluir en este procedimiento la siguientemodificacin a la Norma ISO 7932:2006.

Con el objetivo de aumentar la practicidad de la tcnica se incluyenen este procedimiento dos opciones de Emulsin de yema de huevo

1. En caso de haber disponible se puede utilizar una preparacincomercial

2. Como opcional se puede utilizar el procedimiento delBacteriological Analytical Manual para la preparacin de laemulsin yema de huevo

Emulsin de yema de huevo al 50%: Bacteriological AnalyticalManual M51(http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064304.htm)

Lavar los huevos frescos con un cepillo duro y enjuagar bajo corrientede agua, sumergir por 1 h en etanol al 70% y escurrir. Usando

procedimientos aspticos, romper cada huevo y separar la yema de laclara por repetidas transferencias de la yema de una mitad de la


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cscara del huevo a la otra. Retirar las yemas de huevo con unajeringa estril o una pipeta de boca ancha. Colocar las yemas en unrecipiente estril y mezclar aspticamente con un volumen igual desolucin salina estril 0,85%. Almacenar a 4C hasta su uso. La yemade huevo emulsin (50%) est disponible comercialmente.

3.4 Medio completo

Medio base (3.1) 90.0 ml

Solucin de sulfato de polimixina (3.2) 1.0 ml

Emulsin yema de huevo (3.3) 10.0 ml

Fundir el agar base y enfriar en bao de agua a 44C - 47C.Agregar los otros ingredientes agitando continuamente.

Mantener en bao de agua a 44C - 47C.

Preparacin de las placas de PetriTransferir 15 a 20 ml del medio completo en placas de Petri y dejarsolidificar. Las placas pueden guardarse a 3C 2C hasta 4 das.Antes de ser usadas, secar las placas en estufa entre 25C y 50C,preferentemente sin la tapa y con la superficie del agar hacia abajohasta que la misma est seca.

4.Agar sangre de oveja

4.1 Medio base sangre N 2

Proteasa peptona o peptona equivalente 15.0 g

Hidrolizado de hgado 2.5 g

Extracto de levadura 2.5 g


Agar12g a18g*


*dependiendo de la fuerza gel del agarDisolver los componentes o el medio deshidratado en agua, porebullicin. Ajustar el pH si es necesario para obtener un valordespus de la esterilizacin de 7.3 0.2 a 25C. Fraccionar enrecipientes de capacidad adecuada. Esterilizar a 121C durante 15minutos.

4.2 Sangre de oveja desfibrinada


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4.3 Medio completo

Medio base (4.1) 100 ml

Sangre de oveja desfibrinada5 ml a 7ml

Fundir el agar base y enfriar en bao de agua a 47C. Agregar lasangre desfibrinada. Mezclar.Verter aproximadamente al menos 12 ml del medio en placas dePetri estriles y dejar solidificar.


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ANEXO 3: Clculo y expresin de los resultados (ISO7218:2007)

NOTA: Para el clculo y expresin de resultados se seguirn losrequisitos generales establecidos en la Norma ISO 7218 salvo que la

norma ISO 7932 para recuento de Bacillus cereus en placa indiqueotros requisitos especficos.

1. Mtodo de clculoPara que un resultado sea vlido, se suele considerar necesario que elrecuento de colonias se realice al menos en una placa que contengaun mnimo de 15 colonias sospechosas (de acuerdo a la normaespecfica ISO 7932 para recuento de Bacillus cereus en placa)

2. Mtodo de clculo despus de la confirmacin

2.1.En este mtodo donde se requiere de una confirmacin para elrecuento, se identifica un nmero de colonias sospechosas )(A que se

someten a confirmacin (ver 3.5.4.1). Tras la confirmacin se calculael nmero de colonias de cada placa )(a que cumplen con los criterios

de la confirmacin, utilizando la ecuacin (1):

1. =

Donde:

- b: es el nmero de colonias que cumplen con los criterios deconfirmacin dentro de las colonias sospechosas A que sesometen a confirmacin

- C: es el nmero total de colonias sospechosas contadas en cadaplaca

2.2. El resultado calculado se aproxima al nmero entero msprximo. Cuando se realiza esta operacin, si la primera cifra decimal

es inferior a 5, no se modifica la cifra anterior; si la primera cifradecimal es igual o superior a 5, la cifra anterior se incrementa en unaunidad

2.3. El nmero de microorganismos N presentes en la muestra deanlisis se calcula reemplazando C por aen la ecuacin general

=

1,1 quedando =

1,1


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Donde:

V: es el volumen de inculo utilizado en cada placa, en mililitros

- d: es la dilucin correspondiente a la primera dilucin elegida

(d = 1 cuando se utiliza el producto lquido sin diluir)

2.4. El resultado calculado se redondea a dos cifras significativas.Cuando se realiza esta operacin, si la tercera cifra es inferior a 5, nose modifica la cifra anterior; si la tercera cifra es igual o superior a 5,la cifra anterior se incrementa en una unidad.Preferiblemente el resultado se expresa como un nmero entre 1.0 y9.9 multiplicado por la potencia de 10 adecuada, o como un nmeroentero con dos cifras significativas.El resultado se expresa como nmero de microorganismos Npor

mililitro (para productos lquidos) o por gramo (para el resto deproductos)

EJEMPLO: El recuento ha proporcionado los siguientes resultados

- Para la primera dilucin escogida (10-3): 66 colonias- Para la segunda dilucin escogida (10-4): 4 colonias

Realizando el anlisis de las colonias escogidas:- de las 66 colonias, se analizaron 8, de las que 6 cumplieron los

criterios, por consiguiente 50=a - de las 4 colonias, las 4 cumplieron los criterios; por consiguiente a= 4

=

1,1 =

5 0 + 4

1 1,1 103=

54

1,1 103= 49090

Redondeando el resultado como se indic en 2.4., el nmero demicroorganismos es de 49000 o 4,9 x 104 por mililitro o por gramo deproducto.

NOTA: en caso de sembrar 0.1 ml V= 0.1 ml

3. Mtodo de clculo para recuento bajo

3.1. Si la placa contiene menos de 15 colonias (de acuerdo a lanorma especfica ISO 7932 para recuento de Bacillus cereus enplaca), pero como mnimo 4, el resultado se calcula como lo indicadoen 2.3 y se expresa como nmero estimado de microorganismos x por mililitro (productos lquidos) o por gramo (resto de productos)


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3.2. Si el resultado total oscila entre 1 y 3 colonias, la precisin delanlisis es demasiado baja y el resultado debe expresarse como:

Hay microorganismos presentes, pero a un nivel inferior a (4 x d)por gramo o ml

NOTA: para recuentos de casos especiales ver la norma ISO7218:2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs. Generalrequirements and guidance for microbiological examinations.


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ANEXO 4: FOTOS

1. Agar manitol yema de huevo polimixina (MYP)

Bacillus cereus ATCC 4778: colonias tpicas rosa rodeada deprecipitado

2. Agar sangre de oveja

Bacillus cereus: reaccin positiva para el test de hemlisis


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5. REFERENCIAS

(1) International Standard. ISO 7932: 2004 (E). Microbiology offood an animal feeding stuffs. Horizontal method for the enumerationof presumptive Bacillus cereus. Colony - count technique at 30C.Third edition, 2004-06-15.

(2) International Standard. ISO 6887 1. Microbiology of food andanimal feeding stuffs. Preparation of test samples, initial suspensionand decimal dilutions for microbiological examination - Part 1:General rules for the preparation of the initial suspension and decimaldilutions. First edition, 1999-02-15.

(3) International Standard. ISO 7218: 2007. Microbiology of foodand animal feeding stuffs. General requirements and guidance for

microbiological examinations. Third edition, 2007-08-15.

NOTA: Las siguientes normas de referencias sonindispensables para la aplicacin del presente procedimiento.Para cada norma de referencia debe aplicarse la edicincitada, en caso de no especificarse la misma, deber aplicarsela ltima edicin (incluyendo cualquier modificacin).

IS0 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs -

Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutionsfor microbiological examination - Part 1: General rules for thepreparation of the initial suspension and decimal dilutions

IS0 6887-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs -Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutionsfor microbiological examination - Part 2: Specific rules for thepreparation of meat and meat products

IS0 6887-3, Microbiology of food and animal feeding stuffs -

Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutionsfor microbiological examination - Part 3: Specific rules for thepreparation of fish and fishery products

IS0 6887-4, Microbiology of food and animal feeding stuffs -Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutionsfor microbiological examination - Part 4: Specific rules for thepreparation of products other than milk and milk products meat andmeat products, and fish and fishery products

ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Generalrequirements and guidance for microbiological examinations.


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ISO 6887-5, Microbiology of food and animal feeding stuffs --Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutionsfor microbiological examination - Part 5: Specific rules for thepreparation of milk and milk products

lSO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs -Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1 :General guidelines on quality assurance for the preparation of culturemedia in the laboratory

lSO/TS 11133-2:2003, Microbiology of food and animal feedingstuffs - Guidelines on preparation and production of culture media -Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media


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NOTAS PERSONALES


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Ba c i l l u s c e r e u s

Deteccin y enumeracin por la tcnica denmero ms probable (NMP) en muestras de

alimentos

Procedimiento segnInternational Standard Organization ISO 21871:2006

1. OBJETIVO

El presente procedimiento tiene como objetivo describir lametodologa llevada a cabo por el Laboratorio de Microbiologa pararealizar la deteccin y la enumeracin de presunto Bacillus cereusviable, en bajo nmero, por la tcnica de nmero ms probable(NMP) y mtodo de deteccin en muestras de alimentos y muestrasambientales de las reas de produccin y manipulacin de alimentos.

2. ALCANCE

Este procedimiento se aplica para realizar la deteccin y laenumeracin de presuntos Bacillus cereus en bajo nmero por latcnica de nmero ms probable (NMP) y mtodo de deteccin enalimentos y muestras ambientales en el rea de produccin ymanipulacin de alimentos.

NOTA: las cepas aisladas deben ser enviadas al Centro de ReferenciaInstituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S Dr. CarlosG. Malbrn, para una mayor tipificacin.

Normas de referencia: Para la aplicacin del presenteprocedimiento son indispensables las normas citadas en el punto 5.Referencias

3. DESARROLLO

3.1. Definiciones

Para el propsito de este documento, presunto Bacillus cereuses unabacteria que forma colonias tpicas o atpicas en la superficie del

medio de cultivo selectivo, y da reacciones positivas de confirmacinbajo las condiciones especificadas en este procedimiento.


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NOTA: La definicin de presunto Bacillus cereusobedece al hecho deque para propsitos prcticos este procedimiento no distingue entreotras especies ntimamente relacionadas. En particular el test deconfirmacin no es adecuado para distinguir entre Bacillus cereus yotras especies de Bacilluscomo Bacillus weihenstephanensis, Bacillus

anthracis, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides and Bacilluspseudomycoides

3.2. Principio (ver anexo 1)

3.2.1. Mtodo de enumeracinEl mtodo est basado en las siguientes etapas:

3.2.1.1. Inoculacin de tres tubos con medio lquido deenriquecimiento selectivo doble concentracin, con una cantidad

especfica de la primera dilucin (suspensin inicial).3.2.1.2. Inoculacin de tres tubos con medio lquido deenriquecimiento selectivo simple concentracin, con una cantidadespecfica de la primera dilucin (suspensin inicial). Luego bajo lasmismas condiciones inoculacin de tres tubos con medio lquido deenriquecimiento selectivo simple concentracin, con una cantidadespecfica de las diluciones sucesivas realizadas a partir de lasuspensin inicial.3.2.1.3. Incubacin de los tubos con medio lquido deenriquecimiento selectivo simple y doble concentracin a 30C

durante 48 h.3.2.1.4. Inoculacin en superficie del medio de cultivo slidoselectivo a partir de los tubos con medio lquido de enriquecimientoselectivo.3.2.1.5 Incubacin de las placas a 37C 30C (de acuerdo al medioslido selectivo utilizado) durante 18 h a 48 h y seleccin de coloniastpicas de presuntos Bacillus cereus.3.2.1.6. Confirmacin de las colonias tpicas por el test de hemlisis ypor observacin microscpica.3.2.7. Clculo del NMP de presunto Bacillus cereus por gramo o por

mililitro de muestra, teniendo en cuenta los tubos confirmados yutilizando la tabla de NMP.

3.2.2. Mtodo de deteccinEl mtodo est basado en las siguientes etapas:

3.2.2.1. Inoculacin de un medio de enriquecimiento selectivo conuna cantidad especfica de la muestra si el producto es lquido o conuna cantidad especfica de la dilucin inicial en caso de otrosproductos.3.2.2.2. Incubacin del tubo a 30C durante 48 h.3.2.2.3. Inoculacin por superficie del medio de cultivo slidoselectivo a partir del medio lquido de enriquecimiento selectivo.


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3.2.2.4. Incubacin de las placas a 37C 30C durante 18 h a 48 hy seleccin de colonias tpicas de presunto Bacillus cereus3.2.2.5. Confirmacin de las colonias tpicas por el test de hemlisis ypor observacin microscpica3.2.2.6. Expresin de resultados como presencia o ausencia de

presuntos Bacillus cereus en g o ml de producto.

3.3. Medios de cultivo, soluciones, reactivos para propiedadesbioqumicas y equipos (ver ANEXO 2)

3.3.1. Agua peptona bufferada (BPW).3.3.2. Solucin salina peptonada (SFP).3.3.3. Medio selectivo lquido: caldo triptona soja polimixina (TSPB).3.3.4. Medio selectivo slido: agar polimixina piruvato emulsin deyema de huevo manitol azul de bromotimol (PEMBA).

3.3.5. Solucin de sulfato de polimixina B.3.3.6. Emulsin de huevo.3.3.7. Medio selectivo slido: agar manitol yema de huevo polimixina(MYP)3.3.8. Solucin de verde de malaquita.3.3.9. Solucin de Sudan black B.3.3.10. Xileno.3.3.11. Solucin de safranina.3.3.12. Agar base sangre.3.3.13. Sangre de oveja desfibrinada.

3.3.14. Estufa de esterilizacin3.3.15. Autoclave3.3.16. Estufa de incubacin: a 30C 1C o 37C 1C3.3.17. Bao de agua o aparato similar capaz de mantener la

temperatura a 47C 2C y aproximadamente 80C3.3.18. Peachmetro de exactitud 0.01 a 25C 1C.3.3.19. Pipetas de 10 ml y 1 ml de capacidad, graduadas en

intervalos de 0.5 ml y 0.1 ml respectivamente.3.3.20. Ansas de platino-iridio o nquel-cromo de aproximadamente 3

mm de dimetro y de puncin del mismo material, o

equivalentes estriles descartables.3.3.21. Tubos de ensayo, botellas o frascos de capacidad apropiada,en particular de 16 mm x 160 mm y tubos de hemlisis.

3.3.22. Placas de Petri de vidrio o plstico de 90 mm a 100 mm dedimetro.

3.3.23. Vortex3.3.24. Mezclador tipo stomacher3.3.25. Microscopio con objetivo de inmersin3.3.26. Portaobjetos de aproximadamente 76 mm por 26 mm3.3.27.Papel de filtro de poro fino, por ejemplo Whatman N 41

3.4. Muestreo


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El plan de muestreo a utilizar est fuera del alcance de estametodologa.

3.5. Procedimiento

3.5.1. Preparacin de la muestra, suspensin inicial ydiluciones (ISO 6887-1:1999)

NOTA: Para este punto referir a la norma ISO 6887 1 y las normasespecficas para el alimento en cuestin. (Ver punto 5. Referencias)

3.5.1.1. Suspensin inicialEn un frasco estril o bolsa de plstico estril pesar con unaincertidumbre de medicin de 5 % una cantidad de masa x g o

medir con una incertidumbre de medicin de 5 % un volumen x ml(como mnimo 10 g 10 ml a menos que se indique otra cantidad).Agregar una cantidad del diluyente igual a 9 x g 9 x ml (dilucin1/10) y homogeneizar de 1 a 3 minutos dependiendo del alimento.Para evitar daos de los microorganismos por cambios bruscos detemperatura, la temperatura del diluyente debera ser aproximada ala temperatura ambiente.En el caso de recuento de esporas realizar un tratamiento trmico ala suspensin inicial, inmediatamente despus de su preparacin, porejemplo 10 minutos a 80C seguido de un enfriamiento rpido.NOTA: En algunos casos, particularmente para los productos muyviscosos o muy espesos, podra ser necesario agregar mayor cantidadde diluyente lo cual debe tenerse en cuenta en las operacionessubsiguientes y / o en la expresin de resultados.

3.5.1.2. Diluciones decimalesTransferir con una pipeta 1ml (con una incertidumbre de medicin de 5 %) de la suspensin inicial en un tubo con 9 ml del diluyenteestril.Para una ptima precisin no introducir la pipeta ms de 1 cm en lasuspensin inicial y evitar el contacto entre la pipeta que contiene el

inculo y el diluyente estril.Mezclar utilizando preferentemente un agitador mecnico de 5 a 10segundos para obtener la dilucin 10-2.Si es necesario repetir esta operacin a partir de la dilucin 10-2 y

diluciones sucesivas, utilizando en cada operacin una nueva pipetaestril para obtener las siguientes diluciones (10-3, 10-4, etc.). Serealizan las diluciones que sean necesarias para obtener un nmeroapropiado de microorganismos para realizar el recuento. (Ver 3.5.3.)

3.5.1.3. Duracin del procedimiento

El tiempo transcurrido entre el final de la preparacin de lasuspensin inicial y el instante en que el inculo entra en contacto


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con el medio de cultivo no debe superar los 45 minutos, mientras queel lapso de tiempo lmite entre la preparacin de la suspensin inicialy el comienzo de la preparacin de las diluciones decimales sucesivases de 30 minutos.NOTA: si la temperatura ambiente del laboratorio es muy alta estos

dos lapsos de tiempo deben ser reducidos.

3.5.2. Inoculacin e incubacin

3.5.2.2. Mtodo de enumeracin

3.5.2.2.1. Porcin de muestra para el ensayo y suspensininicialPreparar la suspensin inicial y las diluciones decimales de acuerdo altem 3.5.1.

3.5.2.2.2. Inoculacin e incubacinInocular 3 tubos que contengan caldo triptona soja polimixina (TSPB)doble concentracin, con 10 ml de la primera dilucin (suspensininicial) y mezclar utilizando un agitador tipo vortex. Esta inoculacinequivale a 1 g de muestra por tubo.Inocular 3 tubos que contengan caldo triptona soja polimixina (TSPB)simple concentracin, con 1 ml de la primera dilucin (suspensininicial) (equivale a 0.1 g de la muestra por tubo) y mezclar utilizandoun agitador tipo vortex.

Para cada dilucin decimal sucesiva transferir 1 ml a 3 tubos conmedio TSPB simple concentracin.Incubar los tubos inoculados a 30C durante 48 h 4 h.

3.5.2.2.3. SubcultivoDespus de la incubacin por el perodo especificado, agitar bien lostubos y estriar con ansa de 3 mm a partir de cada uno de los tubosen la superficie de placa de agar PEMBA o agar MYP.Incubar las placas invertidas a 37C (PEMBA) o a 30C (MYP) durante18 h a 24 h. Si las colonias no pueden verse bien incubar las placas

por otras 24 h adicionales. Si se usa placas de agar PEMBA, laincubacin posterior puede ser llevada a cabo a temperaturaambiente.

3.5.2.2.4. Seleccin de las placasDespus de la incubacin completa, examinar las placas paradeterminar la presencia de colonias tpicas y atpicas- Colonias tpicas: En agar PEMBA, las colonias tpicas de presuntoBacillus cereusson de alrededor de 2 mm a 5 mm, tienen un bordeirregular entre rugoso y radicular, con aspecto brilloso en lasuperficie, de color turquesa a azul, posiblemente con centro blancogrisceo contra el fondo azul, y tienen un halo de precipitacin(reaccin de la yema de huevo) de hasta 5 mm de ancho.


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En agar MYP, las colonias tpicas son de 2 mm a 5mm de tamao,rugosas. Tienen una coloracin rosa contra el fondo carmes y un halode precipitacin (reaccin de la yema de huevo) de hasta 5 mm deancho.- Colonias atpicas: Si las placas tienen un alto contenido de flora

acompaante que fermenta el manitol, la coloracin de las colonias ydel fondo puede reducirse y no servisible. Adems, algunas cepas depresunto Bacillus cereus tienen solamente una reaccin leve con layema de huevo o ninguna. En tales casos y en otros casos dudosos,esas colonias deberan ser tambin sometidas a la confirmacin.

3.5.2.2.5. ConfirmacinLas colonias tpicas y las atpicas en agar PEMBA o MYP deben serconfirmadas por medio del test de hemlisis en agar sangre de oveja.Adems, las colonias tpicas y las atpicas en agar PEMBA (pero no en

agar MYP) pueden ser confirmadas por microscopa.

3.5.2.2.5.1. Seleccin y purificacin de las colonias paraconfirmacinSeleccionar tres colonias de cada placa, de acuerdo a lo indicado en3.5.2.2.4. Si hay menos de tres colonias en la placa, tomar todas lascolonias presentes. Confirmar esas colonias como se especifica en3.5.2.2.5.2. 3.5.2.2.5.3Si las placas presentan sobrecrecimiento y no es posible seleccionarcolonias bien aisladas, tomar material de las colonias de tres puntos y

estriar en placas con el medio selectivo (PEMBA o MYP). Incubar lasplacas a 37C (agar PEMBA) o a 30C (agar MYP) por 18 h a 24 h.Seleccionar de cada placa al menos una colonia bien aislada.Confirmar como se especifica en 3.5.2.2.5.2. 3.5.2.2.5.3

3.5.2.2.5.2 Confirmacin por el test de hemlisis en agarsangre de oveja (PEMBA o MYP)Estriar las colonias seleccionadas en 3.5.2.2.1. en la superficie deplacas de agar sangre de oveja de modo de obtener colonias aisladas.Incubar a 30C durante 24 h y leer la reaccin de hemlisis.

Cada colonia rodeada de una zona clara se considera hemlisispositiva.

3.5.2.2.5.3. Confirmacin microscpica (PEMBA)

- Coloracin: transferir algo de material del centro de la colonia en elcaso de cultivos de 24 h, o de la periferia en caso de cultivos viejos,usando un ansa de inoculacin a un portaobjeto desgrasado ysuspender en una pequea gota de agua. Dejar secar al aire y fijarpor calentamiento. Luego colorear las esporas sobre agua hirvientecon la solucin de verde de malaquita. Despus de 2 minutos,enjuagar el exceso de colorante con agua, secar el portaobjeto ycubrir con una capa de la solucin Sudan black B para colorear la


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grasa intracelular. Dejar durante 15 minutos, luego lavar con xileno,secar con papel de filtro y recolorear con la solucin de safranina elesporangio. Despus de 20 segundos, volcar el exceso de colorante,enjuagar con agua y secar al aire.

- Observacin microscpica: examinar el portaobjeto al microscopiousando aceite de inmersin. Como regla, las clulas con forma deladrillos de presunto Bacillus cereus estn agrupadas en cadenas yson de 4 a 5 de largo, 1 a 1,5 de ancho y contienen grancantidad de grasa intracelular que se colorea de negro. La coloracinverde de las esporas puede ser central o subterminal, pero nuncadeforma la coloracin roja del esporangio.

3.5.2.3. Mtodo de deteccin

3.5.2.3.1. Porcin de muestra para el ensayo y suspensininicialPreparar la suspensin inicial de acuerdo al item 3.5.1.1

3.5.2.3.2. Inoculacin e incubacinAgregar 1 ml de la suspensin inicial a un tubo con 9 ml del caldotriptona soja polimixina (TSPB) simple concentracin (es decir 0.1 g 0.1 ml de la muestra) 10 ml de la suspensin inicial a un tubo con10 ml del caldo triptona soja polimixina (TSPB) doble concentracin(es decir 1 g 1 ml de la muestra). Para cantidades ms grandes de

muestra de ensayo, preparar la suspensin inicial agregandoxml oxg de la muestra a 9 xml del diluyente (ver 3.5.1.1.). Luego agregartoda la suspensin inicial a 90xml del caldo triptona soja polimixina(TSPB) simple concentracin (ejemplo agregar 5 ml 5 g de lamuestra a 45 ml del diluyente y agregar todo el volumen desuspensin inicial a 450 ml del caldo TSPB simple concentracin).Incubar el tubo o frasco inoculado a 30C durante 48 h 4 h

3.5.2.3.3. SubcultivoLuego de mezclar, si es posible usando un Vortex, estriar con ansa a

partir del tubo o frasco, en la superficie de una placa de agar PEMBAo agar MYP. Luego proceder como en 3.5.2.2.3, segundo prrafo.

3.5.2.3.4. Seleccin de las placasProceder como en 3.5.2.2.4.

3.5.2.3.5. ConfirmacinProceder como en 3.5.2.2.5.

3.5.3. Clculo y expresin de resultados

3.5.3.1. Mtodo de enumeracin para la determinacin delnmero ms probable (NMP)


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Para cada dilucin del medio lquido selectivo de enriquecimientoinoculado (3.5.2.2.2.) registrar el nmero de tubos en los que lapresencia de presunto Bacillus cereus ha sido confirmada. Designaresos tubos como positivos.

3.5.3.1.1. Seleccin de resultados positivos para el clculo deNMP de (ISO 7218)Hay combinaciones de tubos positivos con una probabilidad deaparicin mucho mayor que otras. Por ejemplo, es mucho menosprobable que aparezca una combinacin de resultados positivos de 0,0, 3 que una combinacin de 3, 2, 1. Para cuantificar estaprobabilidad, se ha asignado un ndice de 0 a 3 a todas lascombinaciones posibles de resultados positivos. La categora 1corresponde a los resultados de probabilidad ms alta, mientras quelos resultados de la categora 3 son raros y no son fciles de

reproducir. Los peores casos son los resultados de la categora 0, loscuales deberan considerarse con un alto grado de desconfianza.Asumiendo que los resultados del anlisis son correctos, deberaesperarse que el 95% de las combinaciones correspondan a lacategora 1, el 4 % a la categora 2 y el 0.9% a la categora 3 ysolamente el 0.1% a la categora 0. En la tabla 2 del Anexo 3 seexplican con ms detalles las categoras.

En el caso que se realicen ms de tres diluciones, la seleccin de lacombinacin correcta de tres diluciones consecutivas no siempre es

muy evidente. Sin embargo, se puede hacer fcilmente registrandotodas las combinaciones posibles de tubos positivos, determinando enla tabla 1 a cual categora corresponde.

Por consiguiente, se aplican las reglas siguientes: Se selecciona la combinacin de tres diluciones consecutivas

con un perfil de categora 1 para obtener el ndice de NMP. Si seobtiene ms de una combinacin con perfil de categora 1, seutiliza la que tenga un mayor nmero de tubos positivos.

Si no se encuentra ninguna combinacin de categora 1, se

utiliza la que presente un perfil de categora 2. Si se obtienems de una categora con perfil de categora 2, se utiliza la quetenga un mayor nmero de tubos positivos.

Si no se encuentra ninguna combinacin de categora 2, seutiliza la que presente un perfil de categora 3. Si se obtienems de una categora con perfil de categora 3, se utiliza la quetenga un mayor nmero de tubos positivos.

En la tabla siguiente se muestran algunos ejemplos


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Ejemplo de seleccin de resultados positivos para el clculode NMP

Fuente: ISO 7218

3.5.3.1.2. Expresin de resultados.Seleccionar tres diluciones consecutivas de acuerdo al punto3.5.3.1.1. y determinar el NMP entrando en la tabla 1 del Anexo3.Utilizando el ndice de NMP determinado en la tabla 1, se determina lacantidad ms probable de microorganismos en el volumen dereferencia.El resultado se expresa cmo el nmero ms probable de presuntosBacillus cereus por gramo o mililitro

3.5.3.2. Mtodo de deteccinDe acuerdo a la interpretacin de los resultados, reportar la presenciao ausencia de presuntos Bacillus cereus en la porcin testeada,especificando en gramos o mililitros de muestra.


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4. ANEXOS

ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento paraenumeracin de presuntos Ba c i l lu s c e r e u s por la tcnica denmero ms probable (NMP)

Incubar a 30C durante 48 h +/- 4 h.

Aislar en- Agar PEMBA a 37C, 18 h a 24 h y 24 h adicionales si es necesario

o en- Agar MYP a 30C. 18 h a 24 h y 24 h adicionales si es necesario

Seleccin de colonias sospechosas

Sembrar 10 ml de la suspensin inicialen 3 tubos con medio TSPB doble

concentracin

- Confirmacin de colonias aisladas de agar PEMBA por: test de hemlisis y observacin enmicroscopio- Confirmacin de colonias aisladas de agar MYP por: test de hemlisis

Clculo del NMP de acuerdo al nmero de tubos confirmados y expresin de resultados

Sembrar 1 ml de la suspensin inicial yde las diluciones sucesivas en 3 tuboscon medio TSPB simple concentracin


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ANEXO 2: Medios de cultivos y reactivos

1. Agua peptona bufferada (BPW)

Peptona (enzimtica) de casena 10.0 g


Disodio hidrgeno fosfato dodecahidratado (Na2HPO4.12H2O) 9.0 g

Potasio dihidrgeno fosfato (KH2PO4) 1.5 g

Agua destilada1000ml


2. Solucin salina peptonada


Cloruro de sodio 8.5 g

Agua destilada1000ml

Disolver los componentes en agua, si es necesario calentar. Ajustar elpH a 7.0 0.2 a 25C. Distribuir en frascos o tubos de acuerdo a las

necesidades analticas. Esterilizar a 121C durante15 minutos.

3. Caldo triptona soja polimixina (TSPB)

.1. Medio base


Digesto enzimtico de soja 3.0 g


Glucosa 2.5 gFosfato cido disdico (Na2HPO4) 1.0 g

Agua destilada (a)1000ml

(a) 500 ml para el caldo doble concentracin.Disolver los componentes en agua por calentamiento y agitacin.Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 7.3 0.2a 25C. Distribuir en tubos de 16 mm x 160 mm, 10 ml para el caldodoble concentracin y 9 ml para el caso simple concentracin.

Esterilizar a 121C durante 15 minutos.


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.2. Solucin de sulfato de polimixina B

Sulfato de polimixina B500.000 unidades (equivalente a0.05 g aproximadamente)


Disolver el sulfato de polimixina B en agua destilada. Esterilizar porfiltracin.

3.3.Medio completoInmediatamente antes de usar, agregar 200 l (caldo dobleconcentracin) y 100 l (caldo simple concentracin) de la solucinde sulfato de polimixina a cada uno de los tubos que contienen elmedio.

4. Agar polimixina piruvato yema de huevo manitol azul debromotimol (PEMBA)

4.1. Medio base


D-Manitol 10.0 g

Piruvato de sodio 10.0 g

Cloruro de sodio (NaCl) 2.0 gSulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O) 0.1 g

Fosfato cido disdico (Na2HPO4) 2.5 g

Fosfato dicido monopotsico (KH2PO4) 0.25 g

Azul de bromotimol 0.12 g

Agar9g a18g*


* dependiendo de la firmeza del agar

Disolver los componentes en agua destilada por calentamiento yagitacin. Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de7.2 0.2 a 25C. Dispensar en porciones de 8 ml en tubos.Esterilizar a 121C durante 15 minutos.

4.2. Solucin de sulfato de polimixina BPreparar como en 3.2.

4.3. Emulsin de yema de huevo al 20%Usar huevos de gallina frescos, limpios y con sus cscaras intactas.

Lavar los huevos, usando un cepillo, en detergente lquido. Enjuagarbajo agua corriente, sumergir por 30 segundos en alcohol 70% en


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volumen y secar. Usando procedimientos aspticos, romper cadahuevo y separar la yema de la clara por repetidas transferencias de layema de una mitad de la cscara del huevo a la otra. Poner lasyemas en un recipiente con graduacin y agregar cuatro partes envolumen de agua estril. Transferir aspticamente a un recipiente

estril y mezclar vigorosamente.Calentar la mezcla durante 2 h en bao de agua a 47C. Luego dejardurante 18 h a 24 h a 3C 2C para permitir que se forme unprecipitado.Recoger el sobrenadante aspticamente.La emulsin puede ser guardada a 3C 2C por no ms de 72 h.Los dos medios selectivos descriptos en esta norma sonoriginalmente preparados con emulsin de huevo al 20 %. Hayemulsiones disponibles comercialmente, en algunos casos condiferentes concentraciones, las que pueden usarse teniendo en

cuenta las instrucciones del fabricante, especialmente en lo referentea la vida til y asegurndose que la concentracin sea apropiada parael medio de cultivo tal como se lo describe en los puntos 4 y 5.

4.4. Medio completo


Solucin de sulfato de polimixina (3.2) 10 ml

Emulsin yema de huevo (3.3) 50 ml

Preparacin:Fundir el agar base y enfriar en bao de agua a 47C.Calentar los otros ingredientes a la misma temperatura y agregarlosagitando continuamente.- Preparacin de las placas de Petri: Transferir 12.5 ml del mediocompleto en placas de Petri y dejar solidificar. Las placas puedenguardarse a 3C 2C hasta 4 das. Antes de ser usadas, secar lasplacas en estufa a una temperatura entre 25C y 50C,preferentemente sin la tapa y con la superficie del agar hacia abajohasta que la misma est seca.

5. Agar manitol yema de huevo polimixina (MYP)

5.1. Medio base


Extracto de carne 1.0 g

D- manitol 10.0 g


Rojo fenol 0.025 g


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Agar 9g a 18g*


*dependiendo de la firmeza del agarDisolver los componentes en agua, por calentamiento y agitacin.

Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor despus de laesterilizacin de 7.2 0.2 a 25C. Fraccionar cada 90 ml del medioen recipientes de capacidad adecuada. Esterilizar a 121C durante 15minutos.

5.2. Solucin de sulfato de polimixina BPreparar como en 3.2.

5.3. Emulsin de yema de huevoPreparar como en 4.3.

5.4. Medio completo

Medio base (5.1) 90.0 ml

Solucin de sulfato de polimixina (5.2) 1.0 ml

Emulsin yema de huevo (5.3) 10.0 ml

Fundir el agar base y enfriar en bao de agua a 47C.Calentar los otros ingredientes a la misma temperatura y agregarlosagitando continuamente.

- Preparacin de las placas de Petri: transferir de 15 a 20 ml delmedio completo en placas de Petri y dejar solidificar. Las placaspueden guardarse a 3C 2C hasta 4 das. Antes de ser usadas,secar las placas en estufa a una temperatura entre 25C y 50C,preferentemente sin la tapa y con la superficie del agar hacia abajohasta que la misma est seca.

6. Soluciones de coloracin para identificacinmicroscpica

6.1.Solucin de oxalato de verde de malaquitaOxalato de verde de malaquita 5.0 g

Agua 100 ml

Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua.

6.2.Solucin de Sudan black B

Sudan Black B 0.3 g

Etanol 70% 100 ml


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Disolver el Sudan black B en alcohol.

6.3.Xileno

6.4. Solucin de safranina

Safranina 0.5 g

Agua 100 ml

Disolver la safranina en agua.


7.1. Medio base


Digesto enzimtico de soja 5.0 g


Agar9g a18g*


*dependiendo de la firmeza del agarDisolver los componentes o el medio deshidratado en agua, porebullicin. Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor

despus de la esterilizacin de 7.3 0.2 a 25C. Fraccionar enrecipientes de capacidad adecuada. Esterilizar a 121C durante 15minutos.

7.2. Sangre de oveja desfibrinada

7.3. Medio completo


Sangre de oveja desfibrinada

5ml a

7ml

Fundir el agar base y enfriar en bao de agua a 47C. Agregar lasangre desfibrinada. Mezclar.Verter aproximadamente 15 ml del medio en placas de Petri estrilesy dejar solidificar.


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ANEXO 3:

Tabla 1: ndices de NMP y lmites de intervalo de confianza(95%) cuando se utilizan tres porciones analticas de 1g (ml),tres de 0.1g (ml) y tres de 0.01 g (ml)

b: ver tabla 2

Fuente: ISO 7218


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Tabla 2:

Categora Definicin

1

Cuando el nmero de bacterias de la muestra es igual al valor deNMP hallado, este resultado es de los que tienen mayorprobabilidad de obtenerse. Como mucho, hay un 5 % deprobabilidad de obtener un resultado que es menos probable que elde menor probabilidad de esta categora

2

Cuando el nmero de bacterias de la muestra es igual al valor deNMP hallado, este resultado es de los que tienen una probabilidadde obtenerse menor que incluso el resultado menos probable de lacategora 1, pero hay en el mejor de los casos solamente un 1% deprobabilidad de obtener un resultado que es menos probable que el

de menor probabilidad de esta categora.

3

Cuando el nmero de bacterias de la muestra es igual al valor deNMP hallado, este resultado es de los que tienen una probabilidadde obtenerse menor que incluso el resultado menos probable de lacategora 2, pero hay en el mejor de los casos solamente un 0.1%de probabilidad de obtener un resultado que es menos probable queel de menor probabilidad de esta categora.

0

Cuando el nmero de bacterias de la muestra es igual al valor deNMP hallado, este resultado es de los que tienen una probabilidadde obtenerse menor que incluso el resultado menos probable de la

categora 3. Solamente hay un 0.1% de probabilidad de obtener unresultado de esta categora, incluso sin que se haya cometidoninguna incorreccin

a Antesde comenzar los anlisis, debera decidirse que categora se va a aceptar,es decir, solamente la categora 1, la 1 y la 2 o incluso la 1, la 2 y la 3. Cuando sevaya a tomar una decisin de gran importancia en base a los resultados,solamente debera aceptarse la categora 1, o en todo caso la 1 y la 2. Losresultados de la categora 0 deberan considerarse con un alto grado dedesconfianza.


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ANEXO 4: FOTOS

1. Caldo triptona soja polimixina (TSPB)

Mtodo de NMP para recuento de presuntosBacillus cereus en caldoTSPB


Bacillus cereus: reaccin positiva para el test de hemlisis


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5. REFERENCIAS

(1) International Standard. ISO 21871. Microbiology of food andanimal feeding stuffs - Horizontal method for the determination oflow numbers of presuntive Bacillus cereus. Most problable numbertechnique and detection method. First edition 2006-01-15

(2) International Standard. ISO 6887 1. Microbiology of food andanimal feeding stuffs. Preparation of test samples, initial suspensionand decimal dilutions for microbiological examination - Part 1:General rules for the preparation of the initial suspension and decimaldilutions. First edition, 1999-02-15.

(3) International Standard. ISO 7218: 2007. Microbiology of foodand animal feeding stuffs. General requirements and guidance for

microbiological examinations. Third edition, 2007-08-15.

NOTA: Las siguientes normas de referencias sonindispensables para la aplicacin del presente procedimiento.Para cada norma de referencia debe aplicarse la edicincitada, en caso de no especificarse la misma, deber aplicarsela ltima edicin (incluyendo cualquier modificacin).

IS0 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs -Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions

for microbiological examination - Part 1: General rules for thepreparation of the initial suspension and decimal dilutions

IS0 6887-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs -Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutionsfor microbiological examination - Part 2: Specific rules for thepreparation of meat and meat products

IS0 6887-3, Microbiology of food and animal feeding stuffs -Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions

for microbiological examination - Part 3: Specific rules for thepreparation of fish and fishery products

IS0 6887-4, Microbiology of food and animal feeding stuffs -Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutionsfor microbiological examination - Part 4: Specific rules for thepreparation of products other than milk and milk products meat andmeat products, and fish and fishery products

ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Generalrequirements and guidance for microbiological examinations.


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ISO 6887-5, Microbiology of food and animal feeding stuffs --Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutionsfor microbiological examination - Part 5: Specific rules for thepreparation of milk and milk products

lSO/TS 1 11 33-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs -Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1 :General guidelines on quality assurance for the preparation of culturemedia in the laboratory

lSO/TS 11 133-2:2003, Microbiology of food and animal feedingstuffs - Guidelines on preparation and production of culture media -Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media


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NOTAS PERSONALES


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Clostridium perfringens


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Cl o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s

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Cl o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s en

alimentos

1.Generalidades

El gnero Clostridium est formado por ms de cien especies conlimitada relacin gentica y propiedades bioqumicas diversas.Comprende a bacilos Gram positivos, anaerobios, esporulados. Sonubicuos pudiendo ser encontrados en el suelo y aguas residualescomo as tambin en la flora intestinal de hombres y animales.En su mayora son saprfitos, pero los patgenos pueden causar

enfermedades graves que pueden ser fatales, como gangrenagaseosa, botulismo, ttanos, infecciones de piel y partes blandas,colitis asociada a antibiticos e intoxicaciones alimentarias.La capacidad para provocar enfermedad est vinculada a laposibilidad de sobrevivir en condiciones ambientales adversasmediante la formacin de esporas, crecer rpidamente y producirtoxinas histolticas, enterotoxinas y neurotoxinas.

Clostridium perfringens es la especie del gnero Clostridium msfrecuentemente aislada en materiales clnicos. Pertenece a la familia

de las Bacillaceae.

Es un bacilo Gram-positivo grande (1 de ancho por 4 de largo, enpromedio) de bordes rectos y extremos romos, inmvil, formador deesporas que se encuentra en los intestinos de los seres humanos y devarios animales, en el suelo, en el agua, en los alimentos (sobre todoen las carnes que no estn bien cocinadas), entre otros.Anaerbico significa que es incapaz de crecer en presencia de oxgenolibre. Desarrolla rpidamente en anaerobiosis, produciendo coloniasgrandes (1 a 3 mm de dimetro) que muestran doble halo de

hemlisis en las placas de agar sangre.

Clostridium perfringensteidos con la tincin de Gram
http://www.gefor.4t.com/concurso/bacteriologia/clostridiumperfringens3.jpg


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Clostridium perfringens: colonias hemolticas en agar sangre

Sus caractersticas morfolgicas, la demostracin de presencia de

esporas, el rpido desarrollo en anaerobiosis y algunas propiedadesbioqumicas (lecitinasa) conforman un perfil que facilita su rpidadeteccin en el laboratorio.

Las clulas vegetativas de C. perfringensen la fase exponencial de lacurva de crecimiento son muy sensibles a la refrigeracin y a lacongelacin. As sucede que las pruebas en alimentos congelados orefrigerados frecuentemente slo revelan los esporos presentes de C.perfringens (que sobreviven a la refrigeracin y a la congelacin) y nolas clulas vegetativas que se habrn inactivado.

C. perfringens es el agente etiolgico de muchas enfermedades y esla tercera causa de toxinfeccin alimentaria bacteriana despus deSalmonella spp y Staphylococcus aureus.

Produce toxinas que pueden causar otras enfermedades como laenteritis necrtica o la gangrena gaseosa.

En la gangrena gaseosa, el Clostridium provoca destruccin en lostejidos infectados si persiste. Esto es provocado por la liberacin de

exoenzimas especficas que atacan a las molculas constituyentes delos tejidos animales: fosfolipasas, hemolisinas, colagenasas,proteasas, que provocan la putrefaccin del tejido acompaada deuna produccin de gas, y de ah su nombre ("gaseosa"). La solucin,llegado este nivel, es la amputacin de la zona afectada; de no seras la infeccin suele acabar con la muerte del animal (cerdos, pollos,caballos y humanos).

Es el tercer indicador de contaminacin fecal de las aguas. Sedestruye con temperaturas superiores a 121C.

2.Patogenia


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Existen dentro de la especie cinco tipos llamados A, B, C, D y E.

C. perfringens A es el responsable de la mayora de los procesosinfecciosos.Produce una enterotoxina (polipptido de 35.000 Daltons de peso

molecular) que se comporta como un superantgeno promoviendo laliberacin de mediadores de inflamacin en forma masiva.

La enterotoxina es susceptible a pronasa pero no a tripsina niquimiotripsina.

En el intestino delgado, la enterotoxina se une a un receptor demembrana del ribete en cepillo e induce una alteracin de lapermeabilidad calcio dependiente resultando en una prdida de ionesy metabolitos. Esta prdida electroltica altera la funcin metablica

intracelular provocando dao morfolgico y eventual lisis.

3.Epidemiologa

La enfermedad se produce cuando el individuo ingiere alimentocontaminado con un elevado nmero de microorganismosproductores de enterotoxinas (>106 UFC) los cuales al llegar alintestino delgado esporulan y liberan las enterotoxinas.

Los alimentos que pueden estar contaminados son carnes vacuna,

porcina, pollo, salsas cocinadas, guisos, sopas y no refrigerados.

Estos alimentos, cuando son almacenados a temperaturasinadecuadas aumentan el riesgo de infeccin y enfermedad porClostridium perfringens, ya que las esporas presentes despus de lacoccin pueden germinar y potencialmente crecer hasta un nmeroalto y peligroso. El mantenimiento del alimento en la zona detemperaturas peligrosas por ms de dos horas, es la causa principalde ETA por Clostridium perfringens.

No son comunes los brotes familiares pero si los producidos a travsde alimentos preparados comercialmente y destinados a restauranteso instituciones.

Para confirmar la existencia de una enfermedad de este tipo esnecesario recuperar el agente de la muestra de alimento y delpaciente. Se deben recuperar al menos 105 UFC de C. perfringens porgramo de alimento y 106 UFC de microorganismos por gramo deheces en las primeras 24 horas.Es posible detectar anticuerpos contra la enterotoxina pero ellos notienen valor protector.


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4.Clnica

Entre 7 y 15 horas despus de la ingesta, el paciente presentadiarrea lquida espumosa y maloliente y dolores abdominales. Laenfermedad tiende a ser autolimitada en pacientes que no presenten

otras complicaciones.

5.Diagnstico

El diagnstico es sospechado por la presencia del agente en elalimento y el paciente. Tambin puede buscarse la presencia de laenterotoxina en las heces utilizando ELISA o hemaglutinacin pasivareversa; tambin se han desarrollado tcnicas moleculares para ladeteccin de estos agentes.

6.Tratamiento y prevencin

En general, no requiere tratamiento antimicrobiano, slo medidas desostn. Como accin preventiva, debe ser mantenida unarefrigeracin adecuada de los alimentos cocidos de no ser consumidosde inmediato.El control de C. perfringens se basa casi totalmente en losprocedimientos de coccin y de enfriamiento. La mayora de losbrotes son el resultado de un enfriamiento lento de los alimentosluego de su coccin, y un mantenimiento prolongado en las

temperaturas peligrosas de crecimiento (entre 10C y 60C). Por lotanto, las medidas principales para prevenir una toxiinfeccin por C.perfringens son:

Los alimentos deben ser cocinados completamente a unatemperatura interna entre 63C a 74C y luego mantenidos enuna temperatura mayor a 60C hasta el servicio/ consumo.

Si el alimento no va a ser consumido inmediatamente, se debeenfriar rpida y adecuadamente siguiendo el Procedimiento deEnfriado Rpido de Alimentos. Debe permanecer el menortiempo posible en el rango de temperaturas de 60C a 10C, yluego ser mantenido a temperaturas inferiores a 5C.

El recalentamiento de los alimentos debe realizarse a unatemperatura mayor a 74C en su interior inmediatamente antesde su consumo.

Las Buenas Prcticas Agropecuarias contribuyen a reducir lacontaminacin de los alimentos con tierra y materia fecal animal,minimizando as la carga bacteriana general en la materia prima. Laelaboracin con Buenas Prcticas de Manufactura, evitando lacontaminacin cruzada entre alimentos cocidos y crudos o

contaminados, y las Buenas Prcticas de Higiene son esenciales parala prevencin de ste y otros microorganismos.


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Referencias

(1) Bad Bug Book: Foodborne Pathogenic Microorganisms and NaturalToxins.

(2) U.S. Food and Drug Administration, Center for Food Safety andApplied Nutrition.

(3) Handbook http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Clostridiumperfringens&oldid=52349170.

(4) Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray, 1995.

(5) Principles and Practice of Infectious Diseases, Gerald L. Mandell,1995.

(6) Diagnstico Microbiolgico, Elmer W. Koneman, 1999.

(7) Ohio State University Extension. Clostridium perfringens: Not the24-hour flu, HYG-5568-98. http://ohioline.osu.edu/hyg-fact/5000/5568.html (Last Accessed: 23 March 2010).

(8) Enfermedades Transmitidas por Alimentos: Ficha Tcnica n5:Toxiinfeccin por Clostridium perfringens: RENAPRA

(9) US Food and Drug Administration. US FDA/CFSAN - Bad Bug Book- Clostridium perfringens,April 2009.

http://www.fda.gov/Food/FoodSafety/ FoodborneIllness/FoodborneIllnessFoodbornePathogensNaturalToxins/

BadBugBook/ucm070483.htm (Last Accessed: 23 March 2010).(10) US Food and Drug Administration. FDA Food Code. July 2009.http://www.cfsan.fda.gov/~dms/foodcode.html (Last Accessed: 04September 2009).

(11) Schmidt, R.H., R.M. Goodrich, D.L. Archer, and K.R. Schneider.FSHN033/FS099: General Overview of the Causative Agents ofFoodborne Illness. http://edis.ifas.ufl.edu/FS099 (Last Accessed: 04September 2009


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NOTAS PERSONALES

7/25/2019 Analisis Microbiolog

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Analisis Microbiologico de Los Alimentos Vol II