Análisis microbiológico en combustible turbo kerosinas …repositorios.unimet.edu.ve/docs/31/ATTP155G6A7.pdf · facultad de ingenierÍa escuela de ingenierÍa quÍmica anÁlisis

FACULTAD DE INGENIERÍA

ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO EN COMBUSTIBLES TURBO

KEROSINAS Y EN FLUIDOS DE CORTE

Cristina Goncalves Araujo

Erika Isabel Sirit López

Tutor: Beatriz Leal de Rivas

Caracas, febrero 2005

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TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN………………….…………………………………………………………1

CAPÍTULO I

I.1PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA…………...…………………………….5

I.2 DELIMITACIÓN DEL TEMA……………………………………………………6

I.3 OBJETIVOS……………………………………………………………………...7

I.3.1 Objetivo General……………………………………………..……….7

I.3.2 Objetivos Específicos……………………………………………...…7

I.4 JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………...…8

CAPITULO II. MARCO TEÓRICO

II.1. ANTECEDENTES DE CONTAMINACIÓN EN TURBO KEROSINAS Y

FLUIDOS DE CORTE…………………………………………………………….11

II.2. BIODETERIORO……………………………………………………………..12

II.3. FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGÍA…………………………………..13

II.3.1. Definición de Microbiología……………………………………….13

II.3.2. Bacterias……………………………………………………………14

II.3.3. Hongos……………………………………………………………...17

II.3.3.a. Levaduras………………………………………………..18

II.3.3.b. Mohos …………………………………………………...18

II.4 ACTIVIDAD MICROBIANA…………………………………………………..19

II.4.1. Metabolismo de Nutrición…………………………………………19

II.4.2. Metabolitos…………………………………………………………21

II.5. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD MICROBIANA……………………………………………………………………...22

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II.6. FACTORES OPERACIONALES……………………………………………25

II.6.1. Configuración del sistema…………………………..……………25

II.6.2. Mantenimientos básicos…………………………………..……...26

II.7. ECOLOGÍA MICROBIOLÓGICA DE SISTEMAS DE COMBUSTIBLES………………………………………………………………….27 II.8. BIOMASA Y BIOPELÍCULA ……………………………………….............28

II.8.1. Biopelículas………………………………………………………...29

II.9. MÉTODOS DE TOMA DE MUESTRA Y DETECCIÓN DE CONTAMINACIÓN MICROBIANA EN TANQUES Y EN SISTEMAS………………………………………...............................................35 II.10. FACTORES QUE AFECTAN LA DISTRIBUCIÓN DE MICROORGANISMOS EN TANQUES Y EN SISTEMAS DE COMBUSTIBLES………………………………………………………………….36 II.11. INVESTIGACIÓN EN TANQUES Y SISTEMAS COMBUSTIBLES………………………………………………………..………...41 II.12. INVESTIGACIÓN EN LA CALIDAD DEL COMBUSTIBLE…………….41 II.13. PROCEDIMIENTO DE TOMA DE MUESTRAS……………..………….42

II.13.1. Preparación para el Transporte y Análisis de Muestras…………………………………………………………………...43 II.13.2. Etiquetado………………………………………………………...45

II.13.3. Botellas y Contenedores de Muestras……………..…............45

II.14. ORGANISMOS PRESENTES EN FLUIDOS HIDROCARBONADOS DERIVADOS DEL PETRÓLEO...………………………………………………..46 II.15. GÉNERO PSEUDOMONAS…………..………………………….............48

II.15.1. Pseudomonas aeroginosas....................................................48

II.15.1.a. Morfología……………………………………………...49

II.15.1.b. Aspectos microbiológicos…………………………….49

II.15.1.c Propiedades Bioquímicas…………………………….50

II.15.1.d. Propiedades metabólicas……………………...........51

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II.16. BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS………………………………...51

II.17. ESTERILIZACIÓN…………………………………………………………..53

II.17.1. Métodos de esterilización………………………………............54

II.17.2. Agentes Físicos…………………………………………………..55

II.17.2.a. Calor……………………………………………...........55

II.17.2.a.1. Calor húmedo……………………………….56

II.17.2.a.2. Calor seco…………………………………...58

II.18. MEDIOS DE CULTIVO……………………………………………………..58

II.18.1. Medios naturales o complejos…………………………............59

II.18.2. Medios definidos o sintéticos…………………………………...60 II.18.3. Medios de cultivos de enriquecimiento y selectivos…………………………………………………………………..60

II.18.3.a. Medios de enriquecimiento…………………………..60

II.18.3.b. Los medios selectivos………………………………...61

II.19. FLUIDOS DE CORTE………………………………………………………61

II.19.1. Microorganismos asociados con el deterioro de los fluidos de corte………………………………………………………………………...64

II.20. TURBO KEROSINAS............................................................................67

II.20.1. Contaminación y deterioro de Turbo Combustibles…............68

II.21. CAUSAS DEL DETERIORO………………………………………………70

II.22. EFECTOS DEL DETERIORO MICROBIANO…………………………...71

CAPÍTULO III. MARCO METODOLÓGICO

III.1. CARACTERÍSTICAS METODOLÓGICAS.............................................74

III.2. BÚSQUEDA DE INFORMACIÓN O EXPLORACIÓN............................75

III.3. INVENTARIO DE MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS DISPONIBLES...............................................................................................76

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III.4. ESTANDARIZACIÓN DE METODOLOGÍAS.........................................77

III.5.IMPLEMENTACIÓN DE LAS METODOLOGÍAS ESTANDARIZADAS……………………………………………...……………….78 III.5.1. Preparación y esterilización del material de vidrio..............................78

III.5.2. Equipos y su funcionamiento..............................................................80

III.5.3. Preparación y Esterilización de Medios de Cultivo.............................84

III.5.3.1. Preparación de Medios de Cultivo Líquidos (m-TGE, Medio Tioglicolato y Caldo TSB).............................................84 III.5.3.2. Preparación de Medios de Cultivo Sólidos (Sabouraud Dextrosa Agar y Cetrimide Agar)........................86 III.5.3.3. Procedimiento para el Plaqueo y Almacenamiento de los Medios de Cultivo Sólido...................................................87

III.5.4. Procedimiento para la Toma de Muestra de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte.................................................................................89 III.5.5. Procedimiento para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos y Hongos utilizando el método de filtración de membrana..................................................................93

III.5.5.1. Determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte......................................................................93 III.5.5.2. Determinación de Pseudomonas aeroginosa y Hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte, presentes en los Caldos contaminados (turbios) por medio de repiques...................................................................98 III.5.5.3. Procedimiento para realizar la Coloración Simple de Gram.....................................................................................102

III.5.6. Procedimiento para la determinación de la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaerobias en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte............................................................103

III.6. ELABORACIÓN DE LOS KITS MICROBIOLÓGICOS (PROTOTIPO)..............................................................................................108

III.6.1. Kit Microbiológico para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Fluidos de Corte y Turbo Combustibles de Aviación.........................................108

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III.6.1.1. Objetivo..................................................................108

III.6.1.2. Instructivo de Operación para el manejo del Kit microbiológico.......................................................................108 III.6.1.6. Procedimiento de Prueba y Puesta en marcha del Kit Microbiológico (prototipo)......................................................111

III.6.2. Kit Microbiológico para la determinación de la presencia de bacterias sulfato-reductoras en las muestras de Fluidos de Corte y Turbo Kerosinas...............................................................................111 III.6.2.1. Objetivo..................................................................111

III.6.2.3. Instructivo de Operación para el Manejo del Kit Microbiológico.......................................................................112 III.6.2.4. Procedimiento de Prueba y Puesta en Marcha del Kit Microbiológico (prototipo)......................................................114

CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

IV.1. RESULTADOS....................................................................................116

IV.1.1 Determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte.................................................................................................116 IV.1.2. Determinación de Pseudomonas aeroginosas y hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte, presentes en los caldos contaminados (turbios) por medio de repiques.....................119 IV.1.3 Resultados obtenidos de la tinción de Gram para verificar la presencia o ausencia de Pseudomonas aeroginosa las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte en placas con Cetrimida agar contaminadas...................................................................................123 IV.1.4 Determinación de la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaerobias en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte.................................................................................................125 IV.1.5. Resultados obtenidos de la puesta en marcha del Kit Microbiológico (Prototipo) para la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte.............................................................................130 IV.1.6. Costos Primarios asociados a la determinación de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte (Año 2005)……………………............133

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IV.1.7. Costos Primarios asociados a la determinación de Pseudomonas aeroginosas y Hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte (Año 2005)……………………............135 IV.1.8. Costos Primarios asociados a la determinación de Bacterias sulfato-reductoras en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte a nivel de Laboratorio (Año 2005)……………………………...137 IV.1.9. Costos Primarios asociados al Kit Microbiológico (Prototipo) para la determinación de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte (Año 2005)……..139 IV.1.10. Costos Primarios asociados al Kit Microbiológico (Prototipo) para la determinación de Bacterias sulfato-reductoras en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte (Año 2005)…………………141

IV.2 ANÁLISIS DE RESULTADOS

IV.2.1. Análisis de los Resultados obtenidos en la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte.................................................143 IV.2.2. Análisis de los Resultados obtenidos en la determinación de Pseudomonas aeroginosa y Hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y en Fluidos de Corte, presentes en los caldos contaminados (turbios) por medio de repiques…….........................146 IV.2.3 Análisis de los Resultados obtenidos de la Tinción de Gram para verificar la presencia o ausencia de Pseudomonas aeroginosas en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte en placas con Cetrimida Agar contaminadas..........................................................149 IV.2.4 Análisis de los Resultados obtenidos en la determinación de la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaerobias en las muestras de Turbo Kerosinas y en Fluidos de Corte.......................................150 IV.2.5. Análisis de los Resultados obtenidos de la puesta en marcha del Kit Microbiológico (Prototipo) para la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte.................................................153 IV.2.6. Análisis de los Resultados obtenidos de los de costos asociados a los estudios realizados.................................................154

CAPÍTULO V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

V.1 Conclusiones.........................................................................................158

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V.2. Recomendaciones................................................................................159

BIBLIOGRAFÍA.......................................................................................................162

ANEXOS..................................................................................................................165

Anexo A. Turbo Kerosina Jet A1..................................................................165

Anexo B. Aceite de Corte Vanosoluble AW (Aceite emulsionalble para mecanizado).................................................................................................166 Anexo C. Medios de Cultivo Sólidos............................................................166

C.1. Sabouraud Dextrosa Agar....................................................................166

C.2. Agar Cetrimide......................................................................................166

Anexo D. Medios de Cultivo Líquidos..........................................................168

D.1. Medio Tioglicolato.................................................................................168

D.2. “Tryptone Soy Broth” (TSB)……………………………………………….169

D.3. “m-Tryptone Glucose Extract Broth” (m-TGE)…………………………..170

Anexo E. Reactivos utilizados......................................................................171

Anexo F. Identificación de algunos microorganismos en los Fluidos analizados....................................................................................................178 Anexo G. Imagen de tanque de aeronave con contaminación microbiana....................................................................................................179

GLOSARIO………………………………………………………………………………..180

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LISTA DE TABLAS Y FIGURAS

ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Bacterias comúnmente recuperadas de muestras de combustibles contaminadas……………………………………….………………………………………17 Tabla 2. Propiedades Básicas de las biopelículas………….………………………….28 Tabla 3. Microorganismos responsables de la degradación de compuestos derivados del petróleo………………………………………………….………………….46 Tabla 4. Algunos agentes físicos utilizados para la esterilización………….………...54 Tabla 5. Algunos agentes mecánicos utilizados para la esterilización………………54 Tabla 6. Algunos agentes químicos utilizados para la esterilización………………...54 Tabla 7. Microorganismos detectados por volumen y placa; acciones correctoras aplicadas en sistemas o tanques…………………………………………………………62 Tabla 8. Descripción de los fluidos utilizados en la fase experimental durante la Toma de Muestra.......................................................................................................91 Tabla 9. Muestras analizadas para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos…………………………………………………………………………95 Tabla 10. Muestras analizadas para determinar la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas………………………………………………………………….105 Tabla 11. Muestras analizadas para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos (Kit Prototipo)………………………………………………………111 Tabla 12. Observaciones de los resultados obtenidos a través de la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte……………….............................................................116 Tabla 13. Observaciones de los resultados obtenidos a través de la determinación de hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte presentes en los Caldos por medio de repiques en Sabouraud Dextrosa Agar……………………….119 Tabla 14. Observaciones de los resultados obtenidos a través de la determinación de Pseudomonas aeroginosa en las muestras de Turbo Kerosinas y en Fluidos de Corte presentes en los Caldos por medio de repiques en Cetrimida Agar…………...........................................................................................................121

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Tabla 15. Observaciones de los resultados de la Tinción de Gram en placas con Cetrimida Agar contaminadas…………………………………………………………..123 Tabla 16. Observaciones de los resultados obtenidos en la determinación de la presencia de bacterias sulfato reductoras anaerobias en las muestras de Turbo kerosinas y Fluidos de corte…………………………………………………………….125 Tabla 17. Observaciones de los resultados obtenidos de la puesta en marcha del kit microbiológico (prototipo) para la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte…………………………130 Tabla 18. Costos por análisis de Reactivos, Materiales y mano de obra en la determinación de microorganismos aerobios mesófilos en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte……………………………………………………………………………………133 Tabla 19. Costos por análisis de Reactivos, Materiales y mano de obra en la determinación de Pseudomonas Aeroginosas y hongos en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte…………………………………………………………….…………….135 Tabla 20. Costos por análisis de Reactivos, Materiales y mano de obra en la determinación de Bacterias sulfato-reductoras en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte……………………………………………………………………………………….137 Tabla 21. Costos por análisis de Reactivos, Materiales y mano de obra del Kit Microbiológico para la determinación de microorganismos aerobios mesófilos en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte……………………………………………………139 Tabla 22. Costos de Reactivos, Materiales y mano de obra, para 5 análisis, del Kit Microbiológico (Prototipo) para la determinación de bacterias sulfato-reductoras en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte……………………………………………………141 Tabla 23. Tabla comparativa que incluye los precios ofrecidos por Laboratorios BIOSAN y los costos asociados a la metodología desarrollada en el presente trabajo (en $) para los diferentes estudios realizados………………………………………..155

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ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Diversas formas bacterianas encontradas en combustibles y sistemas de combustibles……………………………………………...………………………………...14 Figura 2. Diagrama del proceso de formación de una biopelícula…………….……..29

Figura 3. Polímeros extracelulares (polisacáridos) visualizados a través de un microscopio electrónico……………………………………………………………………31

Figura 4. Dinámica de la formación de biopelículas…………………………………...33

Figura 5. Distribución típica de microorganismos en un tanque de almacenamiento de combustible contaminado en reposo…………………………………………………37

Figura 6. Tinción de Gram de la Pseudomonas aeroginosa………………………….49 Figura 7. Presencia de Pseudomonas aeroginosa en Cetrimide Agar……..............50 Figura 8. Bacterias Sulfato-reductoras en una tubería………………………………..51 Figura 9. Representación del funcionamiento de un Fluido de Corte en una maquinaria…………………………………………………………………………………..63 Figura 10. Cephalosporium acremonium (hongos encontrados en Fluidos de Corte)………………………………………………………………………………………..65 Figura 11. Fusarium (hongo encontrado en Fluidos de Corte)……………………….66 Figura 12. Representación esquemática del procedimiento realizado para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte..........................................................................97 Figura 13. Representación esquemática del procedimiento realizado para determinar la presencia de Pseudomonas aeroginosa y hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte, presente en los caldos contaminados...........................................................................................................101 Figura 14. Representación esquemática del procedimiento realizado para determinar la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte...................................................................107 Figura 15. Representación esquemática del instructivo de operación del Kit microbiológico (prototipo) para la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos……………………………..…………………………………………110 Figura 16. Representación esquemática del instructivo de operación del Kit microbiológico (prototipo) para la determinación de la presencia de bacterias sulfato-

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reductoras anaeróbicas en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte…………………………………………………………………………...................113 Figura 17. (a) Observación inicial de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 2, repetición 1) y antes de someterlos al período de incubación. (b) Observación de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 2, repetición 1) y después de 7 días de incubación a 35 ± 2° C…………..……………………………………………………….117 Figura 18. (a) Observación inicial de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 4, repetición 1) y antes de someterlos al período de incubación. (b) Observación de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 4, repetición 1) y después de 2 días de incubación a 35 ± 2° C…………………………………………………………………...117 Figura 19. (a) Observación inicial de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Fluido de Corte y antes de someterlos al período de incubación. (b) Observación de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Fluido de Corte y después de 2 días de incubación a 35 ± 2° C…………………...118 Figura 20. Observaciones de las cápsulas de Petri con Sabouraud Dextrosa Agar luego del repique del Combustible Jet A1 (muestra 2) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 5 días de incubación a 25 ± 2° C……………………….……………...............................................................120 Figura 21. Observaciones de las cápsulas de Petri con Sabouraud Dextrosa Agar luego del repique del Combustible Jet A1 (muestra 4) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 5 días de incubación a 25 ± 2° C…………………………….………...............................................................120 Figura 22. Observaciones de las cápsulas de Petri con Sabouraud Dextrosa Agar luego del repique del Fluido de Corte (muestra Corte) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 5 días de incubación a 25 ± 2° C…………………………………………………………………………………..120 Figura 23. Observaciones de las cápsulas de Petri con Cetrimida Agar luego del repique del Combustible Jet A1 (muestra 2) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 4 días de incubación a 35 ± 2° C……………………………………………………………………………………………122 Figura 24. Observaciones de las cápsulas de Petri con Cetrimida Agar luego del repique del Combustible Jet A1 (muestra 4) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 4 días de incubación a 35 ± 2° C……………………………………………………………………………………………122

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Figura 25. Observaciones de las cápsulas de Petri con Cetrimida Agar luego del repique del Fluido de Corte (muestra Corte) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 4 días de incubación a 35 ± 2° C……………………………………………………………………………………………122 Figura 26. Tinción de Gram de la muestra 4 (Jet A1) en Medio m-TGE 1 (repetición 1)……………………………………………………………………………………………124 Figura 27. Tinción de Gram de la muestra Corte (Fluido de Corte) en Medio Tioglicolato 1 (repetición 1)……………...……………………………………..............124 Figura 28. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 2) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 2) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente……………………………………………………………………126 Figura 29. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 4) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 4) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente……………………………………………………………………126 Figura 30. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 7) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 7) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente……………………………………………………………………127 Figura 31. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 8) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 8) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente……………………………………………………………………127 Figura 32. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 9) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 9) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente……………………………………………………………………128 Figura 33. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 10) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 10) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente……………………………………………………….………...128 Figura 34. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra Corte) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al

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período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra Corte) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente…………………………………………..129 Figura 35. (a) Observación inicial del tubo de ensayo al vacío con Medio Starkey (Blanco) antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación del tubo de ensayo al vacío con Medio Starkey (Blanco) después de 21 días de incubación a temperatura ambiente……………………………………………………………………129 Figura 36. (a) Observación inicial de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, TSB y Tioglicolato) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 2, repetición 1) y antes de someterlos al período de incubación, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo). (b) Observación de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 2, repetición 1) y después de 7 días de incubación a 35 ± 2° C, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo)…………………………………………………..131 Figura 37. (a) Observación inicial de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, TSB y Tioglicolato) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 4, repetición 1) y antes de someterlos al período de incubación, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo). (b) Observación de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 4, repetición 1) y después de 2 días de incubación a 35 ± 2° C, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo)…………………………………………………..131 Figura 38. (a) Observación inicial de los frascos con los tres medios de cultivo (TSB, m-TGE y Tioglicolato) luego de la filtración del Fluido de Corte (muestra Corte, repetición 2) y antes de someterlos al período de incubación, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo). (b) Observación de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Fluido de Corte (muestra Corte, repetición 2) y después de 2 días de incubación a 35 ± 2° C, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo)……………………………………….131 Figura 39. Observación de los blancos con los tres medios de cultivo (m-TGE, TSB y Tioglicolato) después de 7 días de incubación a 35 ± 2° C, haciendo uso del Kitgmicrobiológicog(prototipo)…………………………………………………………..131

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RESUMEN

“ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO EN COMBUSTIBLES TURBO KEROSINAS Y EN FLUIDOS DE CORTE”

Autores: Cristina Goncalves Araujo

Erika Isabel Sirit López Tutor: Lic. Beatriz Leal de Rivas Caracas, Febrero 2005

El presente Trabajo de Grado se realizó con la finalidad de desarrollar un

protocolo para analizar microbiologicamente Turbo Kerosinas y Fluidos de

Corte con la posibilidad de implementar un laboratorio con características

comerciales en la Universidad Metropolitana. Para ello se recolectaron

muestras de JetFuel proporcionadas por los Aeropuertos de La Carlota y

Maiquetía y muestras de Fluidos de Corte, específicamente AW-Venosoluble,

suministrados por Industrias Venoco en Guacara. Para el análisis de las

muestras se desarrollaron metodologías que permitieron llevar a cabo la

determinación de la presencia (en general) de bacterias y hongos aerobios

mesófilos, Pseudomonas aeroginosas y bacterias anaerobias sulfato-

reductoras. Las metodologías desarrolladas resultaron adecuadas para la

realización de análisis microbiológico, ya que, fueron ideadas en base a una

matriz de selección, la cual contempla: la complejidad del análisis, el acceso

y la disponibilidad de los reactivos, materiales y equipos.

DERECHO DE AUTOR

Quienes suscriben, en condición de autores del trabajo titulado “Análisis

Microbiológico en Combustibles Turbo Kerosinas y en Fluidos de Corte”,

declaramos que: “Cedemos a título gratuito, y en forma pura y simple,

ilimitada e irrevocable a la Universidad Metropolitana, los derechos de autor

de contenido patrimonial que nos corresponden sobre el presente trabajo.

Conforme a lo anterior, esta cesión patrimonial sólo comprenderá el derecho

para la Universidad de comunicar públicamente la obra, divulgarla, publicarla

o reproducirla en la oportunidad que ella así lo estime conveniente, así como

autores de la obra antes señalada. La Universidad en todo momento deberá

indicar que la autoría o creación del trabajo corresponde a nuestra persona,

salvo los créditos que se deban hacer al tutor o a cualquier tercero que haya

colaborado o fuere hecho posible la realización de la presente obra.

__________________________ _________________________ Autor: Cristina Goncalves Araujo Autor: Erika Isabel Sirit López

C.I. V-15761948 C.I. V-14897049

En la ciudad de Caracas, a los 15 día del mes de febrero del año 2005.

APROBACIÓN

Considero que el Trabajo Final titulado

“ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO EN COMBUSTIBLES TURBO

KEROSINAS Y EN FLUIDOS DE CORTE”

elaborado por las ciudadanas

ERIKA ISABEL SIRIT LÓPEZ

CRISTINA GONCALVES ARAUJO

para optar al título de

INGENIERO QUÍMICO

reúne los requisitos exigidos por la Escuela de Ingeniería Química de la Universidad Metropolitana, tiene méritos suficientes como para ser sometido a la presentación y evaluación exhaustiva por parte del jurado examinador que se designe. En la ciudad de Caracas, a los 15 día del mes de febrero del año 2005.

_________________________

Tutor: Lic. Betriz Leal de Rivas

ACTA DE VEREDICTO

Nosotros, los abajo firmantes, constituidos como jurado examinador y reunidos en Caracas, el día 28 de febrero de 2005, con el propósito de evaluar el Trabajo Final titulado

“ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO EN COMBUSTIBLES TURBO

KEROSINAS Y EN FLUIDOS DE CORTE”

presentado por las ciudadanas

ERIKA ISABEL SIRIT LÓPEZ


Para optar al título de

INGENIERO QUÍMICO

Emitimos el siguiente veredicto: Reprobado __ Aprobado __ Notable __ Sobresaliente __

Sobresaliente mención publicación __

Observaciones:_________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________ _____________ _____________ Prof. Beatriz Leal Prof. Alicia Dienes Prof. Nancy de Pérez

DEDICATORIA

A mi mamá (Graciette), a mi papá (Antonio)

y a mis hermanos (Antonio y Karina) por

ser más que un centenar de profesores y

mis grandes fuentes de inspiración.

CRISTINA GONCALVES

A mis padres por ser luz que iluminan cada

día mi camino, mis hermanos por ser mi

apoyo y mis ganas de levantarme cuando

sin querer caigo. A MIS DOS HERMOSAS

SOBRINAS…

Los quiero mucho…

ERIKA SIRIT

AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer en primer lugar a Dios y a la Virgen María por estar siempre

conmigo (especialmente los más difíciles), quienes me han guiado hasta este

momento tan especial en mi vida.

A mis padres Graciette Araujo de Goncalves y Antonio Goncalves Simoes, y a mis

hermanos Antonio y Karina, por ser mis mejores amigos, mis aliados, mis ejemplos

de vida, de lucha, de responsabilidad y sobretodo de perseverancia, gracias por el

apoyo que me han brindado durante toda mi vida y por supuesto durante el

transcurso de esta tesis. Discúlpenme los dolores de cabeza que les hice pasar por

mis preocupaciones, gracias por estar siempre allí. Los quiero muchísimo

A mi amiga Getty Barrios que desde que entré a la Universidad siempre ha estado

conmigo, gracias por regalarme momentos simpáticos y agradables. Tú me has

ayudado sin pedir nada a cambio.

A mi compañera de tesis Erika Sirit, que con sus conocimientos brindó aportes útiles

y valiosos para el desarrollo de esta investigación. Gracias por el apoyo, la

paciencia y la tolerancia durante esta aventura que juntas hicimos realidad. Espero

que esto tan sólo sea el comienzo de una bonita y sincera amistad.

A la profesora y tutora Beatriz Leal quien con sus conocimientos y experiencias nos

guió y acompañó durante el proceso investigativo. Agradezco que me hubiese dado

la oportunidad de realizar esta investigación.

A Magaly de Villegas que desde que te conocí me has enseñado muchísimo, y

aunque no lo creas eso vale mucho para mi. Gracias por ayudarme y apoyarme

desinteresadamente para que logremos culminar este trabajo de grado.

A la Profesora Beatriz Soledad y la Licenciada Carmen Molina por sus valiosas

colaboraciones, apoyo y paciencia para que llevemos a buen termino este proyecto.

Mil Gracias.

A la Lic. Rosa Vidal por su valiosa colaboración y enseñanza. Muchas gracias.

Al Histólogo Víctor Salazar en el Centro de Biofísica y Bioquímica del IVIC por su

ayuda desinteresada en el logro de este proyecto.

A todos mis profesores quienes me orientaron, porque cada uno, con sus valiosas

aportaciones, me ayudaron a crecer como persona.

Finalmente, agradezco a mis compañeros de grupo, que han contribuido en gran

medida en mis estudios a lo largo de mi carrera, especialmente a aquellos que me

brindaron momentos muy agradables.


AGRADECIMIENTOS

A Dios, por ser mi fuente de inspiración y mi guía, mi fuente de protección y refugio.

A mi Mamá, por enseñarme el bien y cuidar siempre de mí en las buenas y malas.

Por enseñarme a aborrecer lo malo, por enseñarme valores. Por llevarme de la

mano a emprender y superar etapas de mi vida. Gracias por tus, siempre oportunas,

palabras de aliento en mis momentos más tristes y tus silencios que me calman tan

dulcemente. Por tu mirada sabia y tu expresión serena, por tu paciencia,

sencillamente…Gracias!

A mi Papá, gracias por ser un padre bondadoso, tan lleno de sabiduría, mi modelo a

seguir. Por enseñarme a luchar y a conseguir lo que quiero de la vida de una

manera justa y honrada. Por enseñarme a mirar alto, a aspirar siempre a lo mejor, y

a no renunciar a mis sueños. Gracias por instruirme en la vida, ser el mejor de mis

profesores; por hacer mi vida mucho más alegre y más dulce.

A mis hermanos, Ulises, Daniel, Lorena Y Gilberto, gracias por apoyarme en los

momentos cuando más los necesitaba. Gracias por hacerme sentir que puedo

contar con ustedes y ustedes conmigo.

A Douglas Sirit, yo sé que desde allá arriba en el cielo y junto a Dios estás

compartiendo este gran momento conmigo. Como te dije un día: “Quiero seguir tu

ejemplo”. Mírame ahora…Ingeniero

A Cristina, gracias por tu paciencia y por brindarme tu amistad. Gracias por

compartir este sueño conmigo y por alcanzar esta meta juntas. Espero que nuestra

amistad se fortalezca mucho más de aquí en adelante.

A Magaly, gracias por tu valiosa ayuda en el laboratorio, gracias por ayudarnos en

nuestras incontables carreras para conseguir lo que necesitábamos. Sin ti, hubiese

sido demasiado difícil. Eres un claro ejemplo de gente eficiente, competente,

amable y trabajadora. Gracias!

A la Profesora Beatriz Soledad, nuestro ángel, infinitamente agradecida por su

invaluable ayuda. Gracias por permitirnos realizar experimentaciones en

Laboratorios International Health y brindarnos sus sabios consejos a lo largo de

nuestra investigación.

A la Lic. Carmen Molina, gracias por instruirnos en este nuevo mundo de la

microbiología. Gracias por su paciencia, su dedicación y ayuda desinteresada.

A la Prof. Beatriz Leal, por ser la pionera de este trabajo. Gracias por el tiempo que

invirtió en nuestra tesis, creo que al final va a valer la pena. Gracias por sus

consejos y opiniones, por darnos siempre mucho ánimo y mostrarse siempre

optimista ante cualquier tropiezo.

A la Lic. Rosa Vidal, en la Clínica Santa Sofía, por su valiosa colaboración en este

proyecto y por instruirnos en esta área tan nueva para nosotras.

Al Histólogo Víctor Salazar por su amable y valiosa colaboración en pro del

desarrollo de nuestra Tesis.

A mis chinas, Elizabeth e Iliana, definitivamente, sin ustedes jamás hubiese sido lo

mismo. Gracias por compartir risas y lágrimas conmigo, por compartir un mismo

sueño, por enseñarme que la amistad sí vale la pena, las quiero mucho

A Valentina, Hanen, Huei por brindarme su amistad y su apoyo en los momentos

más críticos.

A ti, porque me permitiste conocerme más y saber que era más fuerte de lo que

creía y gracias porque contigo me di cuenta lo que verdaderamente quiero de la

vida.

A todos los que de una forma u otra contribuyeron a hacer de este gran proyecto

una hermosa realidad. Le doy Gracias a Dios porque los tuve y los tengo en mi vida,

que Dios los bendiga a todos. Gracias! Los quiero mucho!!

ERIKA SIRIT LÓPEZ

Introducción

1

INTRODUCCIÓN

“No se conoce una Ciencia

si no se conoce su historia”

Anónimo

Una gran variedad de bacterias y hongos pueden proliferar en los fluidos

hidrocarbonados derivados del petróleo, si predominan las condiciones adecuadas

de temperatura, agua, y ciertos nutrientes esenciales. Con técnicas apropiadas, se

podrían detectar de forma temprana la presencia de contaminación microbiana, y

evitar los problemas operacionales derivados.

El presente trabajo contempla el análisis microbiológico en Turbo Kerosinas y

Fluidos de Corte, con el objeto de realizar un protocolo de análisis que permita

efectuar dicho estudio, además de elaborar kits microbiológicos prototipos para

determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos, así como también

de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas. Las metodologías elaboradas se

sometieron a prueba, cuyos resultados son expuestos a lo largo del mismo.

Introducción

2

Este trabajo pretende ser el punto de partida de estudios posteriores relacionados

con la elaboración de análisis microbiológicos en Turbo Kerosinas y Fluidos de

Corte, para una futura búsqueda de biocidas que permitan remediar y controlar la

presencia de microorganismos que puedan afectar seriamente los fluidos y los

sistemas donde están contenidos, ya que en Venezuela son muy pocas las

investigaciones y los laboratorios que realizan análisis microbiológicos en fluidos

de corte y ninguno en turbo combustibles de aviación.

La estructura del trabajo está comprendida en cinco capítulos cuyo contenido se

resume a continuación:

En el CAPÍTULO I, se especifica el tema de la investigación, el planteamiento del

problema, la delimitación del tema, los objetivos de la investigación y la

justificación, lo cual permite inferir sobre el problema planteado y su alcance.

En el CAPÍTULO II, se presenta el soporte teórico, donde se exponen puntos

importantes relacionados con el biodeterioro, una breve explicación sobre la

microbiología, los microorganismos que afectan tanto a los fluidos de corte como

a los turbo combustibles de aviación y los efectos que ocasionan los mismos.

En el CAPÍTULO III, el marco metodológico, se presenta la parte experimental

describiéndose los pasos empleados para resolver el problema planteado y cuya

organización estuvo orientada a los ensayos realizados a nivel de laboratorio de la

Introducción

3

metodología elaborada. De la misma forma se expone la implementación y la

puesta en marcha de los kits microbiológicos.

En el CAPÍTULO IV, se analizan y discuten los resultados obtenidos en el mismo

orden en que se realizaron las pruebas. Asimismo se presentan los costos

primarios asociados con los análisis realizados.

Por último en el CAPÍTULO V, se enumeran las conclusiones que surgieron del

desarrollo del trabajo y las recomendaciones para trabajos futuros que puedan

apoyarse en esta investigación.

CAPÍTULO I

“ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO EN COMBUSTIBLES

TURBO KEROSINAS Y EN FLUIDOS DE CORTE”

“El sabio no dice todo lo que piensa, pero

siempre piensa todo lo que dice”.

Anónimo

Capítulo I

5

I.1 PANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las bacterias y/u hongos son microorganismos que crecen y pueden crear un

ambiente propicio para la corrosión en los depósitos donde se encuentran

contenidos, ya que, los subproductos metabólicos de los microbios son ácidos

orgánicos y ácido sulfhídrico, los cuales ejercen un efecto negativo en piezas

metálicas. Los microbios requieren para su desarrollo la presencia de agua que les

permita llevar a cabo el intercambio metabólico con el ambiente que lo rodea.

En la actualidad, la presencia de estos microorganismos ha sido motivo de

preocupación tanto en el área aeronáutica como en el área automotriz e industrial.

El crecimiento fungicida y bacteriológico en depósitos donde están contenidos el

combustible y el aceite pueden comprometer la seguridad de las aeronaves,

maquinarias y motores de combustión interna, ya que se produce un limo que

puede bloquear los filtros del combustible y causar la corrosión del metal de las

paredes del tanque. El atasco de los filtros del combustible es quizás el síntoma

más común y fácil de reconocer como indicador de la presencia de contaminación

microbiana en los depósitos de combustible.

Con frecuencia la presencia de las bacterias y/u hongos no se detectan hasta que

es demasiado tarde. En Venezuela son muy pocos los laboratorios o empresas

que realizan análisis microbiológicos en Fluidos de Corte y ninguno en Turbo

Combustibles de aviación. Por tal motivo, en este proyecto se desarrollarán

procedimientos para los análisis microbiológicos de los Fluidos de Corte,

combustibles Turbo Kerosinas que podrían estar contaminados. Los resultados

Capítulo I

6

que se obtengan de estos estudios permitirán estandarizar la metodología del

análisis microbiológico para una posterior comercialización de los servicios que se

puedan generar.

I.2 DELIMITACIÓN DEL TEMA

En el transcurso de este proyecto se contemplará realizar el análisis

microbiológico de algunos combustibles y lubricantes (Turbo kerosinas, Fluidos de

Corte) a través del desarrollo de nuevas metodologías orientadas a la detección

de la presencia o no de microorganismos aerobios mesófilos y de bacterias

sulfato-reductoras anaerobias, adaptándolas a las condiciones de trabajo que se

podrían realizar y aplicar en las instalaciones de la Universidad Metropolitana.

Asimismo, una vez llevada a cabo el desarrollo de la metodología del análisis

microbiológico se efectuará un estudio de costos básico para determinar la

factibilidad de cada servicio de análisis, para una posterior comercialización hacia

los sectores aéreos, marítimos, terrestres e industriales.

Capítulo I

7

I.3 OBJETIVOS

I.3.1 Objetivo General:

Desarrollar un protocolo para realizar análisis microbiológico en Turbo Kerosinas y

en Fluidos de Corte.

I.3.2 Objetivos Específicos:

Desarrollar los métodos y técnicas necesarias para el análisis

microbiológico de bacterias y/u hongos en Fluidos de Corte y Turbo

Combustibles.

Determinar la presencia de bacterias y/u hongos en combustibles Turbo

Kerosinas (JET A1) y Fluidos de Corte (Venosolubles Aw) que podrían estar

contaminados.

Determinar la presencia de Pseudomonas aeroginosas, bacterias y hongos

mesófilos aerobios y la presencia de bacterias anaerobias sulfato-reductoras

en Turbo Kerosinas (JET-A1) y Fluidos de Corte (Venosoluble Aw).

Aplicar las técnicas para el análisis microbiológico de combustibles Turbo

kerosinas y Fluidos de Corte en la Universidad Metropolitana.

Estandarizar metodologías, para realizar análisis microbiológico de los

combustibles Turbo kerosinas y los Fluidos de Corte que podrían estar

contaminados.

Elaborar Kits microbiológicos (Prototipo) que permitan determinar la

presencia de microorganismos aerobios mesófilos y bacterias sulfato

reductoras en Turbo kerosinas y en Fluidos de Corte

Capítulo I

8

Analizar las posibles causas que provocaron la contaminación microbiana

de los combustibles y fluidos de corte analizados.

Evaluar los costos primarios asociados a los análisis realizados en el

laboratorio para la aplicación de las técnicas microbiológicas que se

desarrollarán en la Universidad Metropolitana.

I.4 JUSTIFICACIÓN

Las bacterias y hongos en un sistema de manejo de combustibles están

relacionados con el grado de contaminación presente en un aceite o combustible.

El funcionamiento seguro de los equipos, aeronaves y vehículos exige un

combustible esencialmente limpio, seco y sin contaminantes.

Hoy en día existe una preocupación motivada a la contaminación microbiana de

muchos combustibles y aceites lubricantes, causantes del deterioro químico y

físico de fluidos, piezas aeronáuticas, automotrices e industriales. Muchas

empresas se ven en la necesidad de evaluar la calidad de sus fluidos, siendo un

parámetro de calidad la ausencia de bacterias y/u hongos; por ello se pretende

desarrollar técnicas de análisis que permitan detectar la presencia de bacterias y

hongos a nivel de trazas, sentando las bases para su posterior caracterización. De

esta forma satisfacer las necesidades percibidas en las empresas que laboran con

diferentes tipos de aceites y combustibles. (23)

Actualmente en el mercado existen kits que permiten realizar análisis que detectan

la contaminación, cuando ya ha ocurrido corrosión interna de los diferentes

Capítulo I

9

componentes de las maquinarias. Cabe destacar que en algunas industrias o

empresas, el alto costo de dichos kits ha significado un obstáculo para determinar

la contaminación microbiana de sus fluidos. (12)

CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

" La teoría es cuando uno ya sabe todo, y nada funciona.

La práctica es cuando las cosas funcionan,

y nadie sabe porqué. "

Albert Einstein

Capítulo II. Marco Teórico

11

MARCO TEÓRICO

II.1. ANTECEDENTES DE CONTAMINACIÓN EN TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE La incontrolable contaminación microbiana en el combustible, sistemas de

combustibles y fluidos de corte pueden causar problemas de biodeterioro que

se traducen en grandes pérdidas económicas. Los problemas de

contaminación microbiológica son, algunas veces, difíciles de diagnosticar y

requieren de la experticia de un microbiólogo especializado en biodeterioro.

Sin embargo, una persona capacitada puede reconocer a menudo la

contaminación microbiológica y tomar la mejor acción para controlarla. Por lo

tanto, si todo el personal implicado en la manipulación del combustible, del

sistema del combustible y fluidos de corte tiene una comprensión general de

la microbiología del combustible, estarán mejor preparados para reducir los

costos causados por el biodeterioro. (4)

Se han conocido problemas relacionados con la contaminación

microbiológica tanto de los fluidos de corte como de Turbo kerosinas. (23)

De hecho, Industrias Venoco ha mostrado una gran preocupación debido a

que sus clientes, a quienes ellos surten de sus fluidos de cortes, se quejan

porque éstos, al cabo de cierto tiempo, presentan malos olores, además de

ello algunos de sus trabajadores muestran erupciones en la piel debido al

contacto directo con fluido contaminado.


12

El profesor Harold Rossmoore, fundador de laboratorios Biosan en Estados

Unidos, dedicó prácticamente toda su vida en estudiar la contaminación

microbiológica que presentaban los fluidos de corte. (12)

El crecimiento de microorganismos en productos derivados del petróleo ha

sido reportado desde 1895. Problemas en gasolinas de aviación se

reportaron a comienzos de 1950 y en Turbo Kerosinas a finales de 1950. El

ataque microbiano se evidenció a causa de la corrosión de un ala de la

aeronave Lockheed Electra en Australia en 1961. ♣

En Venezuela se han reportado casos de Turbo Kerosinas contaminadas

microbiológicamente; tal es el caso reciente (en el año 2004) de un accidente

aéreo en el cual un SKY TRUCK precipitó a tierra, alegándose como posible

hipótesis de la causa del accidente, la corrosión inducida por

microorganismos en el tanque de combustible. ♥

II.2. BIODETERIORO

El biodeterioro se refiere a todo proceso por el cual los microorganismos

afectan los materiales de forma desfavorable, ya sea de forma directa o

indirecta. El biodeterioro de forma directa o biodeterioro en primer orden,

♣ Fuente: HILL, Edwadr y Graham C. Hill. 2000. ECHA Microbiology Ltd, UK. ♥ Fuente: S/A. (2004, 11 de Diciembre). Autoridades esperan concluir hoy rescate de víctimas de accidente aéreo. EL UNIVERSAL, pp. 4-10


13

ocurre cuando los microorganismos consumen el material directamente,

usándolo como fuente alimenticia. El biodeterioro de forma indirecta incluye

detrimento, deterioro y efectos incidentes de la actividad de los organismos.

(4)

Los microorganismos formadores de biopelículas sobre superficies metálicas

excretan productos de desecho, o metabolitos. Los metabolitos poliméricos

forman la matriz de la biopelícula. Debido a que las superficies no son

uniformes, se diferenciarán condiciones fisicoquímicas en la interfase fluido-

metal cuyas áreas estén libres de biopelículas, de aquellas en la interfase

fluido-metal de las áreas cubiertas por la biopelícula. Estas diferencias

hacen que surjan varios gradientes, de los cuales el más comúnmente

medido es el gradiente electropotencial o Celda Galvánica (medida

potenciométrica en mV). Muchos metabolitos son ácidos orgánicos débiles.

Las sales inorgánicas, como sales de cloruro de sodio, pueden reaccionar

con estos ácidos débiles, formando ácidos inorgánicos fuertes (por ejemplo,

ácido clorhídrico). (4)

II.3. FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGÍA

II.3.1. Definición de Microbiología

La microbiología es la parte de la ciencia dedicada al estudio de organismos

que son muy pequeños para ser vistos a simple vista. (4)


14

II.3.2. Bacterias

Las Bacterias son los organismos unicelulares que, a diferencia de las

células de los animales, contienen paredes celulares. Su tamaño varía entre

0.2 y 3 micras de diámetro. Hay tres formas básicas de las bacterias: las

bacterias espirales, algunas de las cuales se llaman espiroquetas, incluyen el

Treponema pallidium, el organismo causante de la sífilis (ver Figura 1).

También se pueden encontrar bacterias redondeadas, denominadas cocos.

Los organismos médicamente significativos tales como Staphylococcus y

Streptococcus se incluyen en este grupo. El tercer tipo es el que tiene forma

de barra y se llaman bacilos. En este último grupo están incluidas las

Pseudomonas, un organismo importante en la degradación de combustibles

y fluidos de corte.

Figura 1. Diversas formas bacterianas encontradas en combustibles y sistemas de combustibles. Fuente:S/A. S/F. “Temas atuais relacionados á Biología”. (2005). Disponible en: http://www.estradadosol.fot.br/vestibular/temas/anthrax1.htm


15

Las bacterias son microorganismos procariotas de organización muy sencilla.

Históricamente, los microbiólogos han caracterizado a las bacterias

basándose en su forma y características fisiológicas. Los principales rasgos

fisiológicos usados para categorizar las bacterias son:

Química de la pared celular-reacción de coloración

Habilidad para transformarse en endosporas

Fuente de energía para su metabolismo (luz solar, moléculas

orgánicas, oxígeno, u otros iones inorgánicos)

Requerimientos de tolerancia de oxígeno

Requerimientos de moléculas específicas para su alimentación

(dióxido de carbono o moléculas orgánicas)

Habilidad para producir productos finales específicos (metabolitos)

La prueba de coloración más comúnmente utilizada es la Coloración de

Gram, desarrollada por Christian Gram en 1884. La coloración divide

claramente a las bacterias en dos categorías:

Gram positivas (G+)

Gram negativas (G-)

Cuando se observa bajo la luz del microscopio, las bacterias G+ aparecen

coloreadas de azul o violeta. Las bacterias G- aparecen rosadas.

Los microbios encuentran sus requerimientos energéticos por tres vías:


16

Fotosintético. Los organismos fotosintéticos convierten directamente la

luz en energía. Todos los demás organismos obtienen su energía de

moléculas orgánicas e inorgánicas.

Oxidativo. El metabolismo oxidativo usa moléculas inorgánicas como

oxígeno, sulfato o nitrato.

Fermentativo. El metabolismo fermentativo usa moléculas orgánicas.

Los microbios que dependen del oxígeno para su metabolismo oxidativo son

conocidos como Aerobios. Los aerobios no pueden crecer en ausencia de

oxígeno. Los Anaerobios Obligados no pueden tolerar el oxígeno. Algunos

anaerobios obligados dependen de sulfatos o nitratos para su metabolismo

oxidativo. Anaerobios fermentativos usan moléculas orgánicas. Algunos tipos

de bacterias pueden operar como aerobios cuando existe oxígeno disponible,

y pueden cambiar su metabolismo energético a fermentativo una vez que se

alcance una atmósfera libre de oxígeno. Estos microbios son llamados

Anaerobios facultativos.

La biodegradación incluye todos los procesos por los cuales los organismos

rompen las moléculas o, de una forma u otra, las transforman. Aunque

algunas moléculas que son productos de biodegradación pueden ser

nutrientes, no siempre ocurre así. Ciertamente, algunas, pueden ser más

tóxicas que la molécula original de la cual fue derivada. Las moléculas

nutritivas incluyen aquellas que suministran energía.


17

Es difícil determinar una correcta designación taxonómica de una bacteria.

Aunque más de un millón de especies diferentes de bacterias han sido

identificadas, los microbiólogos estiman que sólo se han descubierto 1/10000

especies de bacterias sobre la Tierra. Afortunadamente, para el personal

responsable del control de la contaminación microbiológica en sistemas de

combustibles, la información no-taxonómica es más fácil de obtener y es,

generalmente, más útil para las decisiones sobre el control de la

contaminación. La Tabla 1 enumera las bacterias más comúnmente

recuperadas de los sistemas de combustibles. (4)

Tabla 1. Bacterias comúnmente recuperadas de muestras de combustibles contaminadas

Taxa Taxa Acinetobacter spp. Desulfovibrio desulfuricans

Aerobacter spp. Flavobacter spp. Aeromonas spp. Micrococcus spp. Alcaligenes spp. Pseudomonas spp.

Bacillus spp. Fuente: S/A. S/F. “Jet Fuel Biodeterioration. Kerosene prevention against microorganisms”. S/L. (2005)

II.3.3. Hongos

Los hongos comprenden el segundo mayor grupo de microbios comúnmente

recuperados del sistema de combustible. Los hongos incluyen diversos tipos

de organismos que van desde levaduras unicelulares hasta largos hongos.

Los mohos forman filamentos-largos, hilos enredados de células. El

crecimiento de filamentos ocurre cuando la célula se divide. En líquidos, las


18

colonias de mohos, generalmente aparecen en formas esféricas y

gelatinosas. En la interfase combustible-agua los hongos pueden formar una

densa película que puede ser, estructuralmente, bastante fuerte.

Más de un millón de diferentes especies de hongos han sido descritas,

aunque sólo algunas son recuperadas de combustibles y sistemas de

combustibles habitualmente. (4)

II.3.3.a Levaduras

Las levaduras, como las bacterias, son organismos unicelulares que son

algo más grandes que las bacterias y que tienen menos variación en su

forma; son redondeadas u ovaladas. Las levaduras pueden también formar

colonias en medios de cultivo sólidos. Estas colonias son muchas veces

indistinguibles y requieren a menudo un análisis adicional para confirmar su

identidad. (12)

II.3.3.b Mohos

A diferencia de las bacterias y de las levaduras, los mohos pueden estar

compuestos por más de una célula. Los mohos son organismos que pueden

ser observados a simple vista sin la ayuda de cualquier instrumento que

magnifique. Sin embargo, los mohos pueden también, formar colonias en

medios de cultivos sólidos y éstos son fácilmente distinguibles de las

bacterias y de las levaduras por su aspecto borroso y filamentoso. (12)


19

II.4. ACTIVIDAD MICROBIANA

II.4.1. Metabolismo de Nutrición

Carbono. Todos los microorganismos necesitan una fuente de carbón, para

alimentarse y una fuente de energía para llevar a cabo su metabolismo. Al

igual que los demás organismos, los microbios excretan productos de

desecho. Los productos de desechos carbonados van desde dióxido de

carbono hasta polímeros de alto peso molecular constituidos por cadenas de

aminoácidos (péptidos) y azúcar. Llevando a cabo una serie de pruebas que

verifiquen los diferentes cambios químicos que se dan en los sistemas de

combustibles, es posible reconocer el proceso de biodeterioro.

Los microbios reducen los combustibles de menor peso molecular,

hidrocarburos alifáticos, selectivamente, enriqueciendo al combustible con

más cadenas complejas. El biodeterioro se verá reflejado en cambios en la

distribución de los puntos de ebullición. (4)

Nitrógeno y Azufre. Además del Carbono, todos los organismos requieren

Nitrógeno, Fósforo y Azufre. Los microbios atacan compuestos nitrogenados

(aminas, amidas, cicloamidinas, amidinas y nitrilos) que pudieran encontrarse

en el combustible. Parte del Nitrógeno se incorpora

a la biomasa como aminoácidos. El balance se excreta como Amoníaco

(generalmente, como el ion amonio –NH4+). Las bacterias nitrificadas oxidan

los iones amonio a nitritos (-NO2-) y nitratos (NO-

3).


20

Similarmente, los compuestos azufrados son metabolizados para

suministrarle el azufre necesario para el crecimiento de los microorganismos.

Algunos microbios almacenan gránulos de azufre elemental (S0) como

reserva de energía. Otros, oxidan compuestos azufrados, produciendo iones

sulfatos (SO4=). Las bacterias que oxidan el azufre se desarrollan en

ambientes bastante ventilados y fuertemente acidificados (pH<2; acidez

comparable al ácido sulfúrico 2.0N). Las bacterias sulfato-reductoras utilizan

SO4= como un aceptor de electrones terminal, produciendo sulfuro de

hidrógeno (H2S) en el proceso.

Las bacterias sulfato-reductoras (BSR) y otros géneros de anaerobios

obligados producen la enzima hidrogenasa. La hidrogenasa juega un papel

importante en la Corrosión Inducida por Microorganismos (CIM). Cuando se

desarrolla una celda galvánica sobre la superficie de un metal, se forma una

región anódica y una región catódica. En la celda, los electrones (e-) fluyen

del ánodo al cátodo, dándole al cátodo una carga negativa. Los protones (H+)

son atraídos hacia la superficie catódica. Cuando la concentración de H+ y e-

se igualen, cesará el flujo de electrones y la superficie estará pasiva o

equilibrada. La enzima hidrogenasa remueve los iones H+, acelerando el flujo

de electrones. Esto se traduce en una aceleración del proceso de corrosión.

Carbono, Hidrógeno, Oxígeno, Nitrógeno, Azufre y Fósforo son todos

macronutrientes. Un déficit significante en la concentración absoluta o


21

relativa de cualquiera de estos elementos podría restringir el crecimiento y

proliferación de los microbios. Igualmente, los microbios necesitan otros

elementos en menores cantidades, conocidas como micronutrientes. Algunos

de los micronutrientes más comunes son: sodio, potasio, calcio, hierro,

manganeso y magnesio. (4)

II.4.2. Metabolitos

Algunos microbios también excretan surfactantes, los cuales facilitan la

biodegradación del combustible. Los biosurfactantes permiten, a los

microbios degradadores de hidrocarburos, ponerse en contacto con

moléculas no polares, esto constituye el primer paso en el metabolismo de

hidrocarburos. Algunas consecuencias de la producción de biosurfactantes

incluyen la emulsión del agua de depósito del combustible (formación de

emulsión invertida). Las gotas de emulsión invertida traen consigo moléculas

de contaminantes polares a la fase del combustible. Estas moléculas polares

pueden polimerizarse, reduciendo la estabilidad del combustible y acelerando

la sedimentación. (4)


22

II.5. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD MICROBIANA

Los principales factores que afectan el crecimiento microbiano son:

Aire (disponibilidad de Oxígeno)

Agua

Temperatura

pH

Disponibilidad de nutrientes

Aire. Los aerobios requieren oxígeno para poder ser activos (generalmente

>5 mg/L). Los anaerobios sólo pueden ser activos en atmósferas libres de

oxígeno (generalmente < 2 mg/L). (4)

Agua. Los microbios no requieren la total ausencia de agua. Debido a que la

habilidad del combustible para retener agua disminuye con la temperatura,

las condiciones de ausencia de agua, generalmente, se alcanzan a medida

que el combustible se enfría. El agua que no se mantiene suspendida en el

combustible, precipita y se acumula como agua de depósito. Una gota de

agua de 1.0mm de diámetro (~0.5mm3) puede acomodar varios millones de

bacterias. (4)

Temperatura. Cada tipo de microbio tiene una temperatura característica en

la cual se da su crecimiento óptimo. Según esto, existen tres patrones

generales:


23

Sicrófilos obligados: cuyo crecimiento óptimo es a temperaturas

menores de 20° C.

Mesófilos: requieren temperaturas moderadas (20-40° C)

Termófilos obligados: son aquellos microbios que requieren

temperaturas >45° C. (4)

pH. El agua precipitada presente en el combustible, mejor conocida como

agua de depósito, generalmente, tiene un pH de 6.8-8.5. Sin embargo,

algunos procesos biológicos y químicos pueden afectar considerablemente el

pH del agua. Es importante destacar que el pH es una propiedad de

sustancias acuosas, por lo tanto, los combustibles podrían tener mediciones

de acidez o basicidad. Aunque estas propiedades están relacionadas al pH,

no tienen el mismo significado. Estas propiedades de combustibles son

análogas a la alcalinidad y la acidez, las cuales se describen a continuación.

El pH, definido como el logaritmo negativo de la concentración de iones

hidrógeno en una solución acuosa (-log [H+]), es la medición de las

propiedades ácido-base de un líquido. Los fluidos con pH > 7.0 son

considerados alcalinos. Aquéllos con pH < 7.0 son ácidos y las soluciones

neutras tienen un pH~7.0. La capacidad buffer de un fluido es su resistencia

al cambio de pH. Esta resistencia, generalmente reportada en mg CaCO3/l,

se conoce como alcalinidad o acidez dependiendo de la dirección del cambio

que está ofreciendo resistencia.


24

Los microbios alcalinofílicos crecen solo en atmósferas cuyo pH sea mayor

que 8. Los microbios acidófilos requieren atmósferas de pH menores que 4.

La mayoría de los microbios prefieren atmósferas cuyos pH estén en el rango

de 6-8.5.

Cuando el pH del agua de depósito de los combustibles sea mayor que 8 y

su alcalinidad sea mayor que 1.000 mg CaCO3/L, es muy probable que los

constituyentes alcalinos del combustible hayan pasado a la fase acuosa. Un

pH<6 con una acidez >150 mg CaCO3/l indica biodeterioro del combustible.

Cuando una bacteria es cultivada en el laboratorio, por lo general, produce

ácidos que interfieren en su crecimiento; para neutralizar estos ácidos y

mantener el pH adecuado, se adicionan soluciones amortiguadoras en el

medio de cultivo. (4)

Disponibilidad de nutrientes. En sistemas de combustibles, los microbios que

no son capaces de usar los componentes hidrocarburos del petróleo todavía

son capaces de sobrevivir. Primero, los constituyentes no-hidrocarburos del

combustible pueden ser lo suficientemente nutritivos para los organismos

degradadores de este tipo de componentes. Segundo, los metabolitos

producidos por los degradadores de hidrocarburos pueden sostener una gran

variedad de microbios degradadores de componentes no-hidrocarburos. De

hecho, sin una cadena alimenticia dinámica, en la que los desechos de los


25

microbios sean el alimento de otros, la acumulación de metabolitos podría

convertirse en agentes tóxicos para los organismos.

La biopelícula formada por bacterias que producen biosurfactantes aumenta

la disponibilidad de moléculas no-polares en el combustible para su propio

consumo y para el consumo de los organismos vecinos que no producen

biosurfactantes. (4)

II.6. FACTORES OPERACIONALES

Muchos factores operacionales importantes afectan la contaminación

microbiana en sistemas de combustibles. Estos incluyen la configuración del

sistema y buenas prácticas de operación.

II.6.1. Configuración del sistema. La dinámica del flujo de líquidos en la

mayoría de los tanques se puede describir en tres zonas. Generalmente, hay

una zona en el fondo del tanque que es prácticamente inmóvil. Es en esta

zona donde se acumulan agua, lodos y sedimentos y hay muy poca

circulación, exceptuando los momentos en que se drenan los tanques. Bajo

condiciones normales de operación, la interfase combustible-agua reposa en

esta zona. De igual forma, es aquí donde se dan las condiciones más

óptimas para el crecimiento y desarrollo de los microbios. La biopelícula

crece acumulándose sobre las paredes del tanque que está en contacto con


26

esta zona, y aunque esta biopelícula constituye sólo el 5% del volumen total

del tanque, es la primera zona de biodeterioro.

En contraste, más del 90% del fluido constituye la zona altamente cambiante

o la zona de gran flujo o circulación. Aunque los microbios pueden ser

introducidos durante el tránsito a través de tuberías y tanques, es muy poco

probable que ellos empiecen a degradar el combustible sin antes asentarse o

depositarse en el fondo del tanque.

La tercera zona está muy poco caracterizada. Es la zona de transición entre

la región donde el flujo es prácticamente cero y la región de mayor flujo en el

combustible. En su límite inferior, la zona de transición es prácticamente

indistinguible de la zona inmóvil del fondo. Los metabolitos producidos en la

zona inmóvil del fondo del tanque se difunden a la zona de transición. En

esta zona también se pueden encontrar micelas, producto de la emulsión

invertida y estalagmitas de biopelícula. Si se agita el tanque, mezclando el

fluido, se va acercando más a la zona cambiante o de mayor flujo en el

combustible. Los microbios y metabolitos pueden ser transportados a la zona

de mayor flujo y, consecuentemente, llevarlos a otros componentes de

sistemas de combustibles. (4)

II.6.2. Mantenimientos básicos. Aunque puede no ser posible prevenir

totalmente la actividad microbiana, es importante reducir el volumen total y el


27

área superficial que conduce a la actividad microbiana. En la mayoría de los

casos, mientras más seco se encuentre un sistema, menor será el riesgo de

problemas de biodeterioro. Un sistema capaz de remover todo excepto 10-20

ppm de agua (0.2-0.4 m3 agua en un tanque de 20000 m3 de capacidad) va a

tener menos problemas de contaminación microbiana que un sistema que

deje ≥ 1% de agua en él (200 m3 en un tanque de 20000 m3 de capacidad).

(4)

II.7. ECOLOGÍA MICROBIOLÓGICA DE SISTEMAS DE COMBUSTIBLES

Comunidades y Consorcios

En sistemas de combustibles, las comunidades forman biopelículas. Estas

biopelículas se desarrollan en las interfases del sistema, las cuales incluyen

las interfases de: combustible-aire, combustible-tanque, tanque-aire,

combustible-agua y agua-tanque. Por ejemplo, las bacterias sulfato-

reductoras requieren una atmósfera libre de oxígeno (anóxica) de manera

que puedan desarrollarse y reducir el sulfato a sulfito. Las bacterias

aeróbicas y facultativas consumen el oxígeno que pudo permear la región

superficial de la biopelícula. Consecuentemente, ellas crean un ambiente

adecuado para el desarrollo de las bacterias sulfato-reductoras en la base o

en el fondo de la biopelícula. Además, las bacterias sulfato-reductoras

prefieren los ácidos dicarboxílicos C1 a C3 como su fuente de alimentación

primaria, los mismos ácidos orgánicos débiles que fueron mencionados

anteriormente a propósito de la corrosión inducida por microorganismos. Los


28

microorganismos capaces de atacar combustibles de alto peso molecular y

moléculas de aditivos de combustibles, excretan metabolitos que las

bacterias sulfato-reductoras y otros microorganismos pueden digerir. Los

microorganismos que usan estos metabolitos como alimento los previenen de

convertirse tóxicos para los microorganismos que generaron estos

metabolitos. La suma de las actividades de los consorcios de

microorganismos es dramáticamente mayor que la de sus miembros

individuales. (4)

II.8. BIOMASA Y BIOPELÍCULA

Los microorganismos en la biopelícula se comportan de modo diferente que

las bacterias en un medio de cultivo. La Tabla 2 enumera las diferentes

propiedades que caracterizan a las biopelículas.

Tabla 2. Propiedades Básicas de las biopelículas

PROPIEDADES BÁSICAS DE LAS BIOPELÍCULAS Comunidad de varios tipos de microorganismos que cooperan entre sí Los microorganismos están dispuestos en microcolonias Las microcolonias están rodeadas por una matriz que las protegen Entre las microcolonias hay diferentes ambientes Los microorganismos en la biopelícula son resistentes a los

antibióticos y a los antimicrobianos

Fuente: LEVIT, Bernando. (2001). “Bio-films, una nueva manera de ver la placa” (2005). Disponible en: http://www.alientoassist.com/biofilm.htm


29

Vistos a través del microscopio, las bacterias en la biopelícula no están

distribuidas caprichosamente, están agrupadas en microcolonias rodeadas

por una matriz intermicrobiana. La matriz es penetrada por fluidos y canales

que conducen una corriente de nutrientes, productos de desechos, enzimas,

productos de secreción del metabolismo y oxígeno. Estas colonias tienen un

micro ambiente con diferentes pH, disposición de nutrientes, y

concentraciones de oxígeno (Ver Figura 2). (10)

Figura 2. Diagrama del proceso de formación de una biopelícula. Fuente: LEVIT, Bernando. (2001). “Bio-films, una nueva manera de ver la placa” (2005). Disponible en: http://www.alientoassist.com/biofilm.htm

II.8.1.Biopelículas

Las biopelículas son comunidades microscópicas que consisten,

principalmente, en una comunidad de células microbianas, algas, hongos,

bacterias y de un biopolímero extracelular que estas células producen.

Forman capas finas en todas las superficies incluyendo sistemas


30

combustibles. En las biopelículas pueden adherirse ciertas bacterias a la

superficie y diferenciarse en una estructura compleja multicelular. Las

bacterias se adhieren a la superficie por apéndices proteicos caracterizados

por una estructura que se engancha en la superficie donde va a permanecer.

Una vez que una cierta cantidad de estos "brazos" pegan la célula a la

superficie es muy difícil desplazar a este organismo. Una vez fijado,

empiezan a producir material polimérico, consistente básicamente de

polisacáridos y agua. La cantidad producida puede exceder la masa de las

células bacterianas por un factor de 100 veces o más. La estructura de la

biopelícula provee una protección muy favorable para la supervivencia del

organismo.

Los microorganismos comúnmente se adhieren a superficies tanto vivas

como inertes y forman biopelículas hechas de polímeros extracelulares que

facilitan la adhesión y proveen una matriz estructural. En este estado, los

microorganismos son altamente resistentes al tratamiento antimicrobiano y

están tenazmente aferrados a la superficie.


31

Figura 3. Polímeros extracelulares (polisacáridos) visualizados a través de un microscopio electrónico. Fuente: LEVIT, Bernando. (2001). “Bio-films, una nueva manera de ver la placa” (2005). Disponible en: http://www.alientoassist.com/biofilm.htm

Las biopelículas se desarrollan cuando los microorganismos se adhieren

irreversiblemente a una superficie sumergida y producen polímeros

extracelulares que facilitan la adhesión. Estos polímeros son ante todo,

polisacáridos, que pueden ser visualizados con un microscopio electrónico

(ver Figura 3). De hecho, la mayor parte de las biopelículas, están

compuestos de esta sustancia extracelular polimérica, más que de células, y

esto ha sido confirmado por el microscopio. Esta superficie puede ser inerte,

material sin vida o tejido vivo. (10)

El taponamiento prematuro de filtros es el síntoma más comúnmente

observado de acumulación de biomasa. Para comprender mejor como los

microbios obstruyen los filtros, resulta bastante útil entender los procesos

básicos del desarrollo de la biopelícula. (4)


32

Colonización Inicial. Cuando un sistema combustible es puesto en servicio,

éste podría estar ya contaminado con microbios latentes adsorbidos a través

de partículas de polvo y otros residuos. Los tanques son, generalmente,

probados con agua antes de ser puestos en servicio. El agua usada para

estas pruebas contiene, generalmente, 102 a 106 microorganismos/ml. Como

consecuencia, los microorganismos se asientan en el sistema de combustible

antes que el sistema sea puesto en servicio. Una vez en servicio, los tanques

respiran a medida que se añade o se remueve combustible. Durante los

ciclos de succión, las partículas de polvo y agua entran al tanque a través de

orificios o escapes. También, el combustible puede tomar los

microorganismos de cada etapa de los canales de distribución desde la

refinería hasta el consumidor último.


33

Figura 4. Dinámica de la formación de biopelículas: a) Inoculación y asentamiento inicial-las bacterias se asientan sobre la superficie y comienzan a producir limo o sedimentos; b) Formación de microcolonias a partir de la reproducción del asentamiento inicial. Se empiezan a desarrollar gradientes electroquímicos entre las zonas expuestas y las zonas sumergidas; c) Biopelícula madura. Las microcolonias se han desarrollado a través de la biopelícula. Los canales facilitan el transporte de nutrientes y desechos. Las condiciones fisicoquímicas en la biopelícula madura son sustancialmente distintas de aquellas condiciones del resto del fluido. Fuente: PASSMAN, F. Fuel and Fuel System Microbiology-Fundametals, Diagnosis and Contamination Control. USA.

Una vez los microbios estén en el sistema combustible, ellos tienden a

asentarse y a difundirse (Ver Figura 4). Muchas especies de bacterias

producen biopolímeros mucilaginosos, viscosos, conocidos como sustancias

poliméricas extracelulares (SPE). Cuando una bacteria hace contacto con la

superficie, la SPE permite al microorganismo adherirse a ella. Bajo

condiciones apropiadas, los microbios pioneros (aquellos en adherirse

primero) empiezan a multiplicarse. El tiempo de generación para las


34

bacterias encontradas en sistemas de combustibles es, generalmente, 0.5-6

horas. Como consecuencia, en unas cuantas horas después de la adhesión,

los pioneros forman pequeñas colonias. (4)

Maduración de la biopelícula. Una biopelícula madura comparte muchas

características similares con los organismos multicelulares, alimentándose de

los nutrientes disponibles y excretando sus desechos en el fluido donde

están inmersos. Debido a la viscosidad y a la polaridad natural del material

de la biopelícula, las partículas inorgánicas quedan inmersas en la sustancia

polimérica extracelular (SPE). Por lo tanto, se tendrán microorganismos y sus

metabolitos enredados en una matriz viscosa y acuosa, que también estarán

combinados con moléculas orgánicas, organometálicas e inorgánicas. (4)

Equilibrio Dinámico. Las biopelículas maduras son dinámicas. Al igual que la

piel, cuyas células externan mueren y se desprenden, pequeños pedazos de

biopelículas se desprenden y son transportadas a través de un medio en

suspensión. Aunque las dimensiones aparentes de las comunidades de las

biopelículas pueden parecer estables, ellas están renovándose

constantemente.

La apariencia general de la biopelícula refleja las condiciones bajo las cuales

se desarrolló. En sistemas de elevado flujo (por ejemplo, en tuberías) las

biopelículas tienden a ser uniformes y compactas. Las biopelículas suaves se


35

tienden a formar en ambientes en reposo (por ejemplo, las paredes de

tanques de almacenamiento). Virtualmente toda (> 99%) la biomasa en un

sistema de combustibles se encuentra en biopelículas. (4)

II.9. MÉTODOS DE TOMA DE MUESTRA Y DETECCIÓN DE CONTAMINACIÓN MICROBIANA EN TANQUES Y EN SISTEMAS Probablemente más que cualquier otro tipo de contaminación en

combustibles, la contaminación microbiana tiende a tener una alta dispersión

heterogénea la cual será, posiblemente, un continuo estado de cambio. Se

pueden dar cambios en el número total de microorganismos presentes, en su

viabilidad, en el número relativo a los tipos de microorganismos

predominantes (género y especie) y en la cantidad de biomasa microbiana

presente. Estos cambios pueden ser ocasionados por la actividad microbiana

por sí misma o puede ser una consecuencia de las actividades o condiciones

en las que opera el tanque o el sistema; es por esto, que, aparentemente, el

tiempo en el que se realiza la toma de muestras y los puntos adecuados

donde debe ser tomada la misma, requieren especial consideración y una

cuidadosa planificación. (4)


36

II.10. FACTORES QUE AFECTAN LA DISTRIBUCIÓN DE MICROORGANISMOS EN TANQUES Y EN SISTEMAS DE COMBUSTIBLES Los microorganismos proliferarán activamente solo si existe la presencia de

una fase acuosa. En un tanque/sistema de poco flujo o en reposo, la fase

acuosa se localizará, generalmente, en el punto más bajo o en el fondo de

éste. Los cambios de temperatura pueden desencadenar la condensación de

agua del combustible y del aire en el tanque; dicha agua condensada puede

acumularse en forma de gotas en las paredes del tanque.

La fase acuosa no debe, necesariamente, ser de gran volumen para que

exista crecimiento microbiano. Probablemente, el área superficial de la

interfase combustible-agua, sea lo más importante en la determinación de la

extensión de la proliferación microbiana. El nivel de nutrientes hidrocarburos

será, particularmente, alto en la vecindad inmediata de esta interfase. La

concentración de oxígeno también será relativamente alta, ya que, el

combustible por sí mismo contiene una cierta cantidad de oxígeno disuelto.

Como consecuencia de esto, se promoverá el crecimiento microbiológico

aeróbico extendiéndose sobre la interfase hongos filamentosos. Estos

filamentos pueden producir esporas hidrofóbicas, que permanecerán

suspendidas en la fase combustible. Las bacterias y hongos (levaduras y

mohos) pueden producir surfactantes que ocasionan la formación de una

capa emulsionada y la pérdida de una distinción clara entre las fases

acuosas y combustibles.


37

La materia polimérica producida por microorganismos también mostrará

afinidad tanto por la fase acuosa como la fase combustible. Un gran número

de microorganismos se desarrollan formando biopelículas (viscosas) sobre

las superficies internas del tanque, especialmente aquellas superficies que se

encuentran en contacto directo con el agua depositada en el fondo de éste.

Las bacterias sulfato-reductoras (anaeróbicas), un importante grupo de

microorganismos relacionadas al proceso de corrosión y a la generación de

azufre, tienden a encontrarse en lo más profundo de las biopelículas, donde

los niveles de oxígenos son escasos, el potencial óxido-reducción es bajo y

donde se mantienen por la producción de ácidos orgánicos a cargo de los

degradadores aeróbicos primarios del combustible. La Figura 5 muestra una

distribución típica de microorganismo en un tanque de almacenamiento en

reposo.


38

Figura 5. Distribución típica de microorganismos en un tanque de almacenamiento de combustible contaminado en reposo. La fase combustible, generalmente, solo contendrá microorganismos aeróbicos, los cuales lentamente se asentarán en la interfase combustible-agua. Los niveles de nutrientes hidrocarburos y de oxígeno será relativamente alto en la interfase, por lo que, se promueve el crecimiento de microorganismos aeróbicos en el agua que se encuentra inmediatamente bajo el combustible. En el fondo del tanque, el oxígeno es escaso, el potencial óxido-reducción se vuelve negativo y es cuando se promueve el crecimiento anaeróbico de bacterias sulfato-reductoras con la consecuente generación de azufre (S-). Fuente: PASSMAN, F. Fuel and Fuel System Microbiology-Fundametals, Diagnosis and Contamination Control. USA

Aparentemente, aunque el crecimiento microbiano está restringido a las

áreas en la vecindad inmediata del agua, puede haber penetración de

microbios hacia la fase combustible. En un sistema en reposo, esta

penetración generalmente será de no más de unos pocos centímetros. Sin

embargo, si hay perturbaciones físicas del tanque o sistema, particularmente

si las interfases se rompen, ocurrirá una gran dispersión de microbios hacia

el combustible. Por ejemplo, las operaciones de llenado de tanques y

movimiento de productos ocasionarán una turbulencia significativa y una


39

dispersión de microorganismos en el combustible, esto traerá problemas de

ensuciamiento y taponamiento de filtros a los usuarios.

Debido a que la densidad de los microorganismos es, considerablemente,

mayor que la del combustible, después de un tiempo, los microbios

suspendidos en la fase combustible se asentarán en el fondo del tanque. De

acuerdo a la Ley de Stoke, la velocidad a la cual se asientan es una función

de la viscosidad del combustible y de la densidad y diámetro de las partículas

microbianas. Esto determina que una célula microbiana típica de, por

ejemplo, 2μm de diámetro, se asentará en, aproximadamente, 0,2cm/h en un

gas oil típico; y es por ello que puede tomar varias semanas, incluso meses,

para que se asienten del todo.

La fase combustible presenta un ambiente hostil para la mayoría de los

microorganismos. Sólo las esporas (microbios en estados viables pero

inactivos) tienen la capacidad de desarrollar una viabilidad a largo plazo en la

fase combustible. La mayoría de las bacterias presentes en los combustibles

no producen esporas y, por tanto, mueren rápidamente, a menudo en días o

en horas, a menos que estén contenidas en gotas de agua. Las levaduras

tienden a sobrevivir un poco más, mientras que los mohos, los cuales tienden

a producir esporas proliferándose en la interfase agua-combustible, pueden

sobrevivir indefinidamente. Es importante destacar que la contaminación de

combustibles causada por microorganismos muertos puede, todavía, causar


40

problemas operacionales tal como la obstrucción de filtros. La poca

capacidad de sobrevivencia de algunos microorganismos en la fase

combustible tiene algunas implicaciones en la validez de los resultados de las

pruebas realizadas cuando hay un gran retardo entre la toma de muestras

del combustible y el hecho de llevar a cabo los análisis para los

microorganismos viables (por ejemplo, conteo de unidades formadoras de

colonias). Los análisis para microorganismos viables que son llevados a cabo

unos cuantos días después de la toma de muestras del combustible podrían

subestimar significativamente la contaminación de éste.

Es importante tener en cuenta el riesgo para la salud debido a los

contaminantes microbiológicos en los combustibles, aunque la presencia de

organismos patógenos es muy poco probable. Debido a que, generalmente,

no se requiere, entrar al tanque para tomar las muestras, no hay una

exposición directa de la persona que toma la muestra a grandes cantidades

de contaminantes microbianos. Como consecuencia de esto, en la mayoría

de los casos no habrá un riesgo microbiológico significativo para la salud de

aquellos que toman las muestras. La toma de muestras de combustibles

como parte de una investigación microbiológica no representa, generalmente,

ningún peligro para la salud, al igual que la toma de muestras para cualquier

otro propósito. Un riesgo significativo para la salud se presentará cuando el

personal necesite entrar a un tanque que contenga una gran cantidad de

residuos de crecimiento microbiológico. Por ejemplo, la inspección del tanque


41

de combustible de un avión, donde las superficies internas estén cubiertas de

mohos que exhiban un crecimiento de esporas. En este caso se deberían

tomar las precauciones pertinentes. (4)

II.11. INVESTIGACIÓN EN TANQUES Y SISTEMAS COMBUSTIBLES

Cuando la tarea es determinar la presencia de contaminación en un

tanque/sistema, un análisis microbiológico de una muestra de la fase acuosa

resulta lo más apropiado. Una muestra de la fase acuosa será una muestra

en “el peor de los estados”. Los microbios en esta agua tienen el potencial de

contaminar el combustible pasando del tanque hacia el sistema deseado por

el usuario, con las implicaciones adversas pertinentes a la calidad del

combustible y a la diseminación de la contaminación en la posterior cadena

de distribución del combustible. (4)

II.12. INVESTIGACIÓN DE LA CALIDAD DEL COMBUSTIBLE

Es necesario incorporar como parte del programa de las refinerías y de los

centros de distribución de combustible, una rutina de revisión o chequeo de

la calidad microbiológica de éste. Pero, es frecuente el caso en que la esta

calidad sólo se chequea cuando la rutina de monitoreo de la fase acuosa del

combustible indica que podría estar presente una contaminación significativa.

Los chequeos también se hacen cuando un usuario final tiene una buena

razón para sospechar que un combustible tiene una calidad dudosa. Las

muestras de combustibles seleccionadas deben ser representativas del


42

tanque o sistema completo de combustible. Debido a la alta distribución

heterogénea de la contaminación microbiológica en el combustible, una sola

muestra muy pocas veces proporcionará los resultados adecuados que

refleje la verdadera contaminación del fluido.

Muchos operadores en la aviación llevan a cabo una rutina o un monitoreo

microbiológico ocasional en los tanques de combustibles como una medida

de precaución. Algunos factores resultan importantes, particularmente,

aquellos factores relacionados al amplio rango de fluctuaciones de

temperatura que sufre el tanque de combustible (menos de -40° C en vuelo a

+40° C en tierra). Estas variaciones de temperatura afectan directamente la

tasa de crecimiento microbiológico, así como también, la condensación de

agua en el tanque. (4)

II.13. PROCEDIMIENTO DE TOMA DE MUESTRAS

Cuando las muestras van a ser usadas en pruebas de cultivo para

microorganismos viables, se deben tomar las precauciones pertinentes para

asegurar que otros microorganismos, aparte de los que están presentes en la

muestra, no contaminen la muestra, debido a que la contaminación de ésta

puede perjudicar los resultados. La mayoría de las pruebas microbiológicas

que involucran un período de incubación de varios días son pruebas de

cultivo. Las partículas microbianas individuales en la muestra son cultivadas

en un medio nutritivo, en el cual se reproducen, alcanzando poblaciones de


43

varios millones de microorganismos y empiezan a ser visibles como colonias

contables (unidades formadoras de colonias o ufc) o se comienza a apreciar

un cambio de color o turbidez en el medio de crecimiento. Si se introducen

microorganismos que no pertenecen a la muestra durante el proceso de toma

de muestras, éstos también se reproducirán durante el período de incubación

y producirán un resultado artificial alto o hasta podrán enmascarar una

genuina contaminación de combustible.

Los microbios son ubicuos y aquellos que pueden contaminar las muestras

pueden venir del aire, del personal que toma la muestra y del recipiente,

equipo, tubería o accesorio donde se toma la muestra. Se deben tomar

medidas razonables para minimizar las ocasiones en que la muestra pueda

contaminarse y producir impactos adversos en los resultados de las pruebas

o análisis. (4)

II.13.1. Preparación para el Transporte y Análisis de Muestras

Para minimizar retrasos entre la toma de muestra y el análisis, deben

tomarse ciertas medidas antes de realizar el análisis, tales como: prepararse

para las pruebas que se llevarán a cabo y realizar los arreglos necesarios en

el transporte de la muestra hacia el laboratorio. Es muy probable que ocurran

cambios en la población microbiana de la muestra durante el transporte de

ésta. Se debe asegurar que, una vez tomada la muestra, mantener, en la

medida de lo posible, las mismas características de la población microbiana


44

hasta el momento en que se llevará a cabo el análisis. Las muestras tomadas

de sistemas a temperatura ambiente, idealmente, deben mantenerse frías

(4°C) durante el transporte, pero nunca deben ser congeladas. El retraso

entre la toma de muestras y el análisis debe ser minimizado, realizando las

pruebas microbiológicas lo más pronto posible después de la que la muestra

es tomada, esto es en un período no mayor de 48 horas. El uso de análisis

in-situ tiene una gran ventaja, ya que, se reducen los retrasos entre la toma

de muestra y el análisis.

Si se está trabajando en un laboratorio analítico, es necesario avisar con

antelación la entrega de la muestras, de modo que, el personal esté

preparado para desarrollar los análisis y, así, minimizar retrasos. De igual

forma, se debe facilitar al personal del laboratorio toda la información posible

acerca del sistema del cual se tomó la muestra y las razones y objetivos de la

investigación, de esta forma, se hará una mejor selección de los

procedimientos que se desarrollarán en el laboratorio y conducirán a una

mejor interpretación de los resultados obtenidos. Esta información puede

incluir una descripción de la apariencia de la muestra al momento en el que

se que tomó, temperatura del tanque/sistema, el método usado para

descontaminar equipos o recipientes de toma de muestras, el volumen de la

muestra de combustible y la ubicación y tipo de tanque. Si se han usado

biocidas, las técnicas de análisis deben adaptarse para neutralizar este

compuesto. (4)


45

II.13.2. Etiquetado

Siempre se debe etiquetar los contenedores de muestras inmediatamente

antes de llevar a cabo los análisis. Se debe preparar una etiqueta lo

suficientemente detallada incluyendo las siguientes especificaciones:

Lugar en el cual se tomó la muestra

Descripción del material de la muestra

Número de referencia o nombre del tanque, sistema, avión o barco

Tipo de muestra (del tope, medio o fondo)

Fecha y hora en la que se tomó la muestra

Identificación del operador que tomó la muestra

Cuando el laboratorio reciba la muestra, también debe reportar la fecha y la

hora en la que fue recibida y la fecha y la hora en la que la muestra fue

analizada. (4)

II.13.3. Botellas y Contenedores de Muestras

Las botellas en las que se tomará la muestra deben ser de un tamaño

adecuado (las botellas de 500 mL son generalmente apropiadas) y tanto la

botella como su tapa o rosca deben estar hechos de un material que sea

compatible con el combustible (por ejemplo, no puede estar hecho de

poliestireno). Las botellas de vidrio limpias son ideales, ya que éstas

permiten un contacto visual preliminar, lo cual es una parte importante en

cualquier investigación microbiológica. Idealmente, se deben usar botellas

estériles. Las botellas de vidrio pueden esterilizarse calentándose en un


46

horno a 160° C por, al menos, 2 horas. También se pueden esterilizar en un

autoclave (tratamiento con vapor a 103-138 KPa por 20 min). Pequeñas

cantidades de agua residual en el contenedor de la muestra podría ocasionar

resultados erróneos para los análisis de la fase combustible, porque

cualquier microbio en la muestra siempre tenderá a concentrarse en el agua.

(4)

II.14. ORGANISMOS PRESENTES EN FLUIDOS HIDROCARBONADOS DERIVADOS DEL PETRÓLEO Existe una gran variedad de microorganismos identificados en la degradación

de compuestos derivados del petróleo. La Tabla 3 muestra algunos de los

microorganismos responsables de la degradación de combustibles, así como

su género, su especie y el compuesto que éstos degradan.

Tabla 3. Microorganismos responsables de la degradación de compuestos derivados del petróleo

Género Especie Compuesto degradado Acinetobacter sp. n-Alcanos baumanii Hidrocarburos saturados y aromáticos calcoaceticus Bifenilos policlorados calcoaceticus Petróleo Crudo Achromobacter sp. Bifenilos policlorados Arthrobacter sp. Hidrocarburos saturados y aromáticos Alcaligenes sp. Petróleo crudo faecalis Fenol Bacilus lentus Bifenilos policlorados mascerans Bifenilos policlorados Beauveria alba Hidrocarburos saturados y aromáticos Candida tropicales Petróleo crudo Cellulomonas flavigena Petróleo crudo Comamonas acidovorans Bifenilos policlorados Deslfotobacterium deshalogenans o-Clorofenol Desulfococcus sp. Alquilobencenos Flavobacterium devorans Bifenilos policlorados Gordona sp. Dibenzotiofeno


47

Marinobacter aquaelolei Petróleo crudo Micrococcus spp. Pireno Mycobacterium chthonoplastes n-Alcanos sp. Pireno sp. n-Alcanos Nocardia sp. Dibenzotiofeno Nocardipsis sp. Petróleo crudo Paenbacillum spp. Dibenzotiofeno Phormidium corium n-Alcanos Penicillum simplicis simum Hidrocarburos saturados y aromáticos Pleorotus ostreatus Polinúcleo aromáticos Pseudomonas sp. Tolueno sp. Bifenilos policlorados sp. Fenantreno sp. Petróleo crudo spp. Petróleo crudo aeruginosa Fenol fluorescens Petróleo crudo putida Petroleo crudo stutaeri Tetracloroetileno Rhizobium meliloti Dibenzotiofeno Rhodococcus sp. Dibenzotiofeno sp. Alcanos erythropolis Petróleo crudo Saccharomyces sp. Petróleo crudo Serratia sp. Fenol marcescens Petróleo crudo paucimobilis HPAs

Fuente: VALDERRAMA BLANCO, Brenda. S/F. México. “Microbiología del petróleo y sus derivados”. (2005). Disponible en:kjnjknkjnjnkjnjnknkjnkjnkjnknkjnkjnjknkjnkjnjnjnjnjknkjnjknjknjknjnjnjhbbjhb http://biblioweb.dgsca.unam.mx/libros/microbios/Cap2/imagenes/c2im3.html

Aunque no han sido caracterizados en su totalidad, muchos de estos

microorganismos poseen actividades de peroxidasas y oxigenasas, que

permiten la oxidación más ó menos específica de algunas fracciones del

petróleo. Esta oxidación cambia las propiedades de los compuestos,

haciéndolos susceptibles de ataques secundarios y facilitando su conversión

a dióxido de carbono y agua. (22)


48

II.15. GÉNERO PSEUDOMONAS

De las numerosas especies de Pseudomonas (familia Pseudomonadaceae),

solamente Pseudomonas aeroginosas, Pseudomonas pseudomallei,

Pseudomonas mallei, son consideradas patógenos importantes para el

hombre.

Los miembros del género Pseudomonas son bacilos gramnegativos móviles,

aeróbicos, algunos pueden producir pigmentos y están ampliamente

distribuidos en suelos, agua, plantas, animales, combustibles y fluidos

lubricantes.

Todos son bacilos gramnegativos, rectos o ligeramente curvados, catalasa

positiva, usualmente oxidasa positiva y capaces de crecer a temperaturas de

4-43° C. (3)

II.15.1. Pseudomonas aeroginosas

La Pseudomonas aeroginosas está ampliamente distribuida en la naturaleza.

Sus necesidades nutritivas son simples y pueden metabolizar una gran

variedad de fuentes de carbono. De ahí su capacidad para multiplicarse en

cualquier medio húmedo que contenga incluso cantidades mínimas de

compuestos orgánicos. (3)


49

II.15.1a. Morfología

En la Figura 6 se presentan bacilos gramnegativos aeróbicos de 0,5 a 1,0 por

1,5 a 3,0 μm. Se presenta aislado, en pares o cadenas cortas. Es inmóvil, no

tiene esporas, ni posee cápsula. Cuando crece en ausencia de sucrosa, se

produce una capa polisacárida extracelular, similar a una cápsula. (3)

Figura 6. Tinción de Gram de la Pseudomonas aeroginosas Fuente: TODAR, K. (2004). Pseudomonas aeroginosas. (2005). Disponible en: http://textbookofbacteriology.net/pseudomonas.html

II.15.1.b. Aspectos microbiológicos

Las Pseudomonas aeroginosa crecen rápidamente en diferentes medios de

cultivos. Forman colonias lisas, redondas, de color verdoso fluorescente (ver

Figura 7), algunas veces produciendo un olor dulzón o parecido a la uva,

debido a la aminoacetofenona. A menudo producen un pigmento azulado,

soluble en agua y cloroformo, no fluorescente, el cual difunde dentro del

agar, llamado piocianina. La piocianina es un pigmento de fenazina, capaz de


50

inhibir el crecimiento a su alrededor de otras bacterias, especialmente

grampositivas. La Pseudomonas aeroginosas es la única especie de

Pseudomonas y de gramnegativo que producen piocianina. Muchas cepas

de Pseudomonas aeroginosas producen también un pigmento fluorescente

que le da un color verdoso al medio, la pioverdina. Otras cepas producen

pigmentos de color rojo oscuro, la piorrubina, y otras un pigmento negro, la

piomelanina. (3)

Figura 7. Presencia de Pseudomonas aeroginosas en Cetrimide Agar Fuente: (S/A).(2003).All microbiology news. (2005). Disponible en: http://www.rapidmicrobiology.com/news/Show_News_List.php?sector=AllHist&m=MAY%202003.

II.15.1.c. Propiedades Bioquímicas

Las Pseudomonas aeroginosas es un bacilo aeróbico obligado (crece en

presencia de O2 solamente), no fermenta los hidratos de carbono, pero

puede oxidar los azúcares, tales como glucosa y xilosa, pero no la maltosa.

Producen gas a partir de nitratos y no producen ácido sulfhídrico o la


51

presencia de un precipitado negro en el fondo tubo de ensayo en medio

Starkey. (3)

II.15.1.d. Propiedades metabólicas

La Pseudomona aeroginosa es un microorganismo extremadamente

adaptable que puede utilizar más de 80 compuestos orgánicos diferentes

para su crecimiento, y el amoníaco puede servir como fuente de nitrógeno.

La temperatura óptima para el crecimiento es de 37° C pero puede crecer a

42° C, no así a 4° C. (3)

II.16. BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS

Desulfovibrio desulfuricans ha sido catalogado como el agente causante del

deterioro de muchas áreas de interés industrial. Ellas ocasionan la corrosión

del acero y de tuberías de hierro (Ver Figura 8).

Figura 8. Bacterias Sulfato-reductoras en una tubería Fuente: CALGARY,Alberta.2003. Canadá. “Iron, Manganese, Hydrogen Sulfide”. Disponible en: http://www.davnor.com/articles/publications/bio_residential/ironfact.pdf


52

Las bacterias sulfato reductoras más ampliamente conocidas son las

Desulfovibrio desulfuricans, referidas también como BSR. Estas bacterias

son no patógenas (que no causan ninguna enfermedad) y anaeróbicas

(requieren de un ambiente libre de oxígeno), pero son capaces de causar

corrosiones severas en materiales ferrosos en sistemas acuosos, debido a

que ellas producen enzimas que tienen la propiedad de acelerar la reducción

de sulfatos a ácido sulfhídrico (bastante corrosivo), por lo tanto, BSR actúan

como un catalizador en la reacción de reducción. Sin embargo, para que esta

reducción se lleve a cabo, deben estar presentes cuatro componentes, estos

son: BSR, sulfatos, una fuente de energía en forma de electrones libres y la

temperatura del agua debe ser aproximadamente menor a 65° C. (7)

La presencia de bacterias sulfato reductoras en sistemas acuosos puede ser

determinada mediante tres métodos: percepción sensorial, determinación del

pH y análisis biológico.

- Percepción Sensorial: como el ácido sulfhídrico es un sub-producto

de su metabolismo, el olor característico a “huevo descompuesto”

asociado al azufre es un indicador de la posible presencia de

bacterias sulfato reductoras en sistemas acuosos.

- Determinación de pH: como el ácido sulfhídrico es un sub-producto

de su metabolismo, las BSR también causan una disminución en el


53

nivel del pH del agua (pH ~ 5). Por lo tanto, si son necesarias

varias adiciones de sustancias básicas para mantener el nivel de

pH cercano del sistema acuoso dentro de los límites establecidos,

entonces es muy probable que exista la presencia de bacterias

sulfato-reductoras.

- Análisis biológico: se toman muestras del agua o del depósito del

sistema y se analizan en un laboratorio. El procedimiento básico de

esta técnica involucra elaborar un caldo nutritivo con las muestras

tomadas para un posterior período de incubación. (7)

II.17. ESTERILIZACIÓN

El término esterilización denota la destrucción o eliminación de todos los

organismos vivientes y sus esporas, de un determinado material o producto.

El método para alcanzar la esterilidad está determinado por las

características del producto. La elección del proceso de esterilización más

adecuado requiere un conocimiento íntimo del equipo usado y de la

estabilidad del material a esterilizar.

El proceso de esterilización requiere, no sólo una estricta supervisión del

equipo y procedimiento por parte de un personal bien entrenado en la


54

aplicación de los métodos de esterilización, sino también una prueba

adecuada de la efectividad del procedimiento usado. (1)

II.17.1. Métodos de esterilización

Variados son los métodos utilizados para la esterilización de los cuales se

pueden considerar: agentes físicos, químicos y mecánicos, tal como

muestran las Tabla 4, 5 y 6.

Tabla 4. Algunos agentes físicos utilizados para la esterilización

Agentes físicos Vapor a presión♣

Tindalización Agua hirviendo

Calor húmedo

Pasteurización Aire caliente

Calor

Calor seco♣

Incineración Ultravioleta No ionizantes

Luz visible (inactivación fotodinámica) Radiaciones Ionizante Rayos X, Gamma, etc

Fuente: CLAVELL, L., y PEDRIQUE, M.; 1983; Microbiología manual de métodos generales; Universidad Central de Venezuela; Caracas. P. 11-12

Tabla 5. Algunos agentes mecánicos utilizados para la esterilización

Agentes mecánicos Filtros de profundidad Filtración Filtros de superficie (membranas filtrantes)

Ondas sónicas y ultrasónicas Fuente: CLAVELL, L., y PEDRIQUE, M.; 1983; Microbiología manual de métodos generales; Universidad Central de Venezuela; Caracas. P. 11-12

♣ Método utilizado en el fase experimental del trabajo de grado ♣ Método utilizado en el fase experimental del trabajo de grado


55

Tabla 6. Algunos agentes químicos utilizados para la esterilización

Agentes químicos

Gaseosos Oxido de etileno, betapropiolactona, formaldehído

Inorgánicos (cloruro de mercurio y óxido de mercurio) Derivados del mercurio

Orgánicos (Mercuriocromo y Merthiolate) Cuartenarios de Amonio (cloruro de benzalconio y cloruro de benzetonio)

Compuestos fenólicos (fenol y cresol)

No gaseosos

Aldehídos (glutaraldehído) Fuente: CLAVELL, L., y PEDRIQUE, M.; 1983; Microbiología manual de métodos generales; Universidad Central de Venezuela; Caracas. P. 11-12

II.17.2. Agentes Físicos

II.17.2.a. Calor

Las actividades metabólicas de un organismo, son el resultado de reacciones

químicas y como tales son influenciadas por la temperatura. Las diferentes

especies de microorganismos son capaces de crecer a temperaturas que

varían ampliamente y cada tipo en particular tendrá una temperatura óptima,

una mínima, y una máxima a la cual crecerá. Temperaturas por encima de la

máxima ejercen un efecto letal sobre los microorganismos y temperaturas por

debajo de la mínima, detienen su multiplicación y causan la muerte de alguna

de las células de la población microbiana.

La acción letal del calor depende de la relación tiempo-temperatura, relación

que es afectada por numerosos factores, los cuales se deben tomar en

consideración cuando se selecciona el tiempo y la temperatura requerida


56

para reducir la población microbiana a los límites deseados. (1)

II.17.2.a.1. Calor húmedo

El calor húmedo destruye los microorganismos por coagulación de las

proteínas. La presencia del agua facilita el proceso de destrucción de los

microorganismos, lo cual se explica de la siguiente manera: La configuración

natural de una proteína es estabilizada en parte por puentes de hidrógeno,

especialmente entre los grupos carbonilo y amino de diferentes péptidos, el

calor altera la configuración proteica y estos puentes en presencia de agua

se pueden romper fácilmente y ser reemplazados por puentes de hidrógeno

unidos a moléculas de agua. (1)

Esterilización por vapor a presión

Este proceso se lleva a cabo por autoclave y emplea vapor saturado bajo

presión. A menos que se indique otra cosa, la esterilización en autoclave

emplea vapor saturado a presión, a un mínimo de 121° C por 15 minutos

contados a partir del momento que el material alcance 15 lbs de presión

(121° C). La presión a la que el autoclave trabaja es medida por un

dispositivo medidor de presión localizado en la salida de vapor del autoclave.

Como el proceso depende tanto de la presencia de humedad como de la

temperatura elevada, deben tomarse las medidas adecuadas para asegurar

que todo el aire ha sido removido de la cámara del autoclave, previo al


57

comienzo del ciclo de esterilización, ya que de no ser así, la atmósfera no

estará saturada de vapor de agua y no se logrará el efecto esterilizante

deseado. El tiempo de exposición varía con la naturaleza del producto y el

tamaño de los recipientes. Por ejemplo una solución en ampollas de vidrio

delgado de 50 ml, puede llegar a los 121° C en 6-8 minutos o más en el caso

que la solución sea envasada en botellas de vidrio grueso, de 1000 ml. Es

importante recordar que no es la presión lo que mata a los gérmenes, sino la

temperatura que alcanza el vapor bajo presión y el efecto hidrolítico del

mismo. La presión es sólo un medio de lograr vapor de agua a temperaturas

superiores a los 100° C, temperatura de ebullición del agua a presión normal.

(1)

Usos de la esterilización de vapor a presión

El autoclave es esencial en cualquier laboratorio de microbiología, la mayoría

de los medios de cultivo y materiales contaminados son rutinariamente

esterilizados en él. Existen algunos materiales que no pueden ser

esterilizados por autoclaves, entre ellos: sustancias no miscibles con el agua,

como grasas y aceites, que como no son penetrados por el vapor, los

gérmenes en su interior no son destruidos. Tampoco sustancias que se

alteren con la humedad. (1)


58

II.17.2.a.2. Calor seco

Deshidrata las células y destruye los microorganismos por oxidación de sus

constituyentes.

Este proceso se lleva a cabo usualmente en un horno esterilizante diseñado

específicamente para ese propósito. Éste es calentado normalmente por gas

o electricidad, que en algunos casos están provistos de un ventilador para

hacer circular el aire con el fin de obtener una temperatura uniforme en todo

su interior.

La esterilización por calor seco se realiza usualmente a 160-170° C por un

período de 2 a 4 horas. Se pueden emplear temperaturas más bajas y

tiempos más largos para los materiales más sensibles, y temperaturas más

altas y tiempos más cortos para los más resistentes al calor.

El uso de la esterilización con calor seco se recomienda para esterilizar

materiales termoestables que no se pueden esterilizar en autoclave, como

por ejemplo aceites y polvos, y es el procedimiento de elección para

esterilizar material de vidrio. (1)

II.18. MEDIOS DE CULTIVO

Los microorganismos para crecer deben obtener del medio ambiente todas

las sustancias que ellos requieren para la síntesis de sus materiales celulares


59

y para la producción de energía. Estas sustancias son llamadas nutrientes.

Por lo tanto un medio debe contener cantidades apropiadas de los

requerimientos específicos de los microorganismos para los cuales ha sido

diseñado.

Sin embargo los microorganismos son extraordinariamente diversos en sus

propiedades fisiológicas específicas y, como consecuencia, en sus

requerimientos nutricionales específicos. Existe, por la razón antes expuesta,

una gran variedad de medios de cultivos, los cuales pueden clasificarse de la

siguiente manera: (1)

II.18.1. Medios naturales o complejos

Están constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las

cuales usualmente son completadas por la adición de minerales y otras

sustancias, es decir, que no se conocen todos los componentes del medio de

cultivo ni las cantidades exactas que están presentes. Muchos de los

componentes de los medios complejos son digeridos ácidos o enzimáticos de

diversos tejidos vegetales, carne, caseína, células de levadura, etc.; según la

sustancia que se trate, proporcionan fuentes ricas en polipéptidos,

aminoácidos, vitaminas o sales minerales. (1)


60

II.18.2. Medios definidos o sintéticos

Son aquellos que ofrecen lo que se requiere para el crecimiento, en forma de

productos químicos relativamente puros y a una concentración conocida.

Los medios de cultivo pueden ser preparados en forma líquida o sólida.

Cuando se requiere cultivar los gérmenes sobre medios sólidos se prepara

un medio de cultivo líquido que se convierte en sólido añadiendo agente

gelificante, el más usado es el agar aunque la gelatina y la sílica-gel también

se usan en ciertas ocasiones. (1)

II.18.3. Medios de cultivos de enriquecimiento y selectivos

Los microorganismos varían ampliamente en sus requerimientos

nutricionales y ambientales, es posible, eligiendo las condiciones apropiadas,

seleccionar de una mezcla un tipo de microorganismo en particular, esto es

lo que se llama un medio de cultivo de enriquecimiento o selectivo. (1)

II.18.3.a. Medios de enriquecimiento

Son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de bacteria u

hongos en particular, permitiendo de esta manera aumentar el número de

microorganismos de esa especie. (1)


61

II.18.3.b. Los medios selectivos

Son semejantes a los de enriquecimiento, se diferencian por ser sólidos y

son diseñados para el aislamiento de organismos específicos. Estos medios

contienen usualmente una o más sustancias inhibidoras de los gérmenes

excepto de aquellos que se quieren seleccionar. (1)

II.19. FLUIDOS DE CORTE

Los fluidos de corte son productos líquidos de composición más o menos

compleja, que se adicionan en el sistema de piezas metálicas, a fin de

lubricar y eliminar el calor producido.

Generalmente, estos productos reciben el nombre genérico de "aceites de

corte". Sin embargo, esta denominación no es del todo apropiada, si se tiene

en cuenta que algunos de estos productos no contienen la más mínima

cantidad de aceite mineral en su composición. Por tanto, la designación

"fluidos de corte" resulta más correcta.

Atendiendo a su contenido en aceite mineral, los fluidos de corte pueden

clasificarse del siguiente modo:

• Fluidos aceitosos o aceites de corte.

• Fluidos acuosos o taladrinas, que a su vez pueden ser:

o Emulsiones

o Sintéticas


62

o Semisintéticas

Con frecuencia, los fluidos de corte contienen aditivos, con el fin de

proporcionarles cualidades determinadas, acordes con el propósito al que se

les destina. Entre los aceites de corte, los aditivos más usuales son los de

extrema presión. Por lo que respecta a las taladrinas, además de éstos

pueden contener emulsionantes, antioxidantes e inhibidores de corrosión,

bactericidas y bacteriostáticos, perfumes, colorantes, quelantes, etc.

En determinadas circunstancias y especialmente en taladrinas semisintéticas

y emulsiones, una disminución significativa de la concentración suele

favorecer el crecimiento de la población microbiana, lo que facilita la

reducción del pH y la degradación del producto. En los sistemas y depósitos

de taladrinas que poseen buena aireación existe un predominio de

microorganismos aerobios del género Pseudomonas, principales

responsables de su degradación, así como coliformes. Por el contrario, en los

sistemas mal aireados suelen aparecer organismos anaerobios estrictos del

género Desulfovibrio, que reducen los sulfatos a sulfuro de hidrógeno,

originando olores desagradables. También aparecen, con cierta frecuencia,

hongos y levaduras de los géneros Fusarium, Cefalosporium y Cándida. En

la Tabla 7 se muestra la cantidad de microorganismos detectados por

volumen y por placa, así como también, las posibles acciones correctivas

aplicadas a fin de solventar el problema de contaminación en el combustible.


63

Tabla 7. Microorganismos detectados por volumen y placa; acciones correctoras aplicadas en sistemas o tanques

Microorganismos Detectados Bacterias/ml Mohos/placa

Acción Correctora Aplicada

<105 < 3 No se adopta acción alguna 105-107 3-10 Adicionar biocidas. Controlar semanalmente

>107 >10 Cambiar el producto. Limpiar y desinfectar el sistema o tanque

Fuente: LABORDA GRIMA, Roberto. S/F. España. “NTP 317: Fluidos de corte: criterios de control de riesgos higiénicos”. (2005). Disponible en: http://www.mtas.es/insht/ntp/ntp_317.htm

Con independencia de las acciones indicadas, una forma sencilla y eficaz de

paliar el problema de los malos olores es airear las taladrinas, a fin de

suministrar al fluido, el oxígeno necesario para impedir el desarrollo de los

microorganismos anaerobios responsables del problema en cuestión.

Los Fluidos de Corte tienen las siguientes cualidades:

Propiedades lubricantes que permitan construir películas aunque no

sean más que de tipo molecular para disminuir las fricciones y

tendencias a soldaduras locales

Gran calor específico y propiedades refrigerantes

Débil tensión superficial que sitúen el fluido de corte lo más cerca

posible del filo o arista de la herramienta

Propiedades anticorrosivas protectoras

Carencia de efectos fisiológicos sobre el personal

La mayor transparencia posible para no impedir la visibilidad del

trabajo que se realiza


64

Una viscosidad apropiada si se requiere que ejerzan una acción de

arrastre y evacuación de residuos metálicos.

La Figura 9. muestra una representación de la labor de un Aceite de Corte en

una maquinaria.

Figura 9. Representación del funcionamiento de un Fluido de Corte en una maquinaria

Fuente: CRESPO, M.; 1972; “Los lubricantes y sus aplicaciones”; INTERCIENCIA; España.

II.19.1. Microorganismos asociados con el deterioro de los fluidos de corte

Un número algo extenso de especies de microorganismos, que han sido

aislado de algunos fluidos de corte, han demostrado su capacidad de crecer

en el laboratorio. Dichos organismos vienen de una gran variedad de fuentes

donde se crea un ambiente propicio para el desarrollo microbiano. Los

principales microorganismos responsables del deterioro químico real de los

fluidos debido a su propensión y números son aquellos que pertenecen al

género Pseudomonas aeruginosas y Pseudomonas oleovorans. Este grupo


65

tiene una reputación de ser muy difícil de eliminar y de tener una menor

necesidad alimenticia para sobrevivir en comparación con otros grupos. De

esta forma es extremadamente difícil encontrar una formulación que no se

convierta tarde o temprano en un alimento para estas criaturas voraces.

Entre las actividades que realizan dichos organismos esta la oxidación de

los hidrocarburos saturados y no saturados; y por tanto de los fluidos de

corte.

Estos organismos son altamente oxidativos, lo cual significa que crecen en

condiciones máximas de aireación, se reproducen aproximadamente cada

45 minutos en condiciones ambientales en el fluido. Existen también

microorganismos que no requieren de oxigeno para su supervivencia y que

afectan de manera significativa a los fluidos de corte como lo son los

anaeróbicos sulfato reductores. Estos no pueden comenzar, al parecer, su

crecimiento en el fluido fresco sino requieren de los materiales previamente

formados del crecimiento bacteriano aerobio. Su importante contribución al

deterioro es considerado desagradable por la presencia y exposición del

sulfuro de hidrógeno al ambiente, adicionalmente puede ser un factor que

contribuye a la corrosión puesto que lo puede causar en ausencia del

oxígeno.

Un tercer factor microbiano que se ha considerado y que ha ganado más

interés recientemente son los hongos. En los fluidos de corte tienden a


66

desarrollarse los hongos que pertenecen sobre todo a los géneros: Fusarium

y Cephalosporium y Cladosporium. La presencia de hongos obstruye los

filtros y los inyectores de las maquinarias donde puedan estar presentes. En

la Figura 10 y Figura 11 se observan los hongos del género Cephalosporium

y Fusarium, respectivamente, que pudieran estar presentes en los Fluidos de

Corte. (11)

Figura 10. Cephalosporium acremonium (hongos encontrados en Fluidos de Corte) Fuente: : HAMLYN, P. (1982). Protoplast fusion and genetic analysis in Cephalosporium acremonium. (2005). Disponible en: http://fungus.org.uk/cv/thesis_fig5.9.htm

Figura 11. Fusarium (hongo encontrado en Fluidos de Corte) Fuente: S/A. (S/F). Fungi Fusarium. (2005). Disponible en: http://byebyemold.com/mold_images/images/fusarium/fusarium_c.html

II.20. Turbo Kerosinas


67

Es un destilado incoloro, menos volátil que la gasolina. El mayor volumen de

Kerosene (Turbo Kerosina) se logra mediante destilación atmosférica del

petróleo, a temperaturas que oscilan entre 240° C y 300° C.

Las propiedades más importantes que debe exhibir el turbokerosene, son en

especial, las siguientes:

Estabilidad térmica: determina la resistencia a la oxidación y a la

polimerización del producto para las condiciones de operación, se

mide en función de la cantidad de depósitos formados en el sistema

de combustibles.

Composición: la composición de los hidrocarburos del producto

determina la calidad de su combustión. Específicamente hay

limitaciones respecto al contenido de aromáticos y nafténicos, porque

éstos están asociados a la producción de humo y carbón durante la

combustión del producto.

Contenido de Azufre: los óxidos de azufre, formados durante la

combustión, son corrosivos y afectan las partes metálicas de las

turbinas, razón por la cual su presencia en el combustible debe ser

reducida a su mínima expresión.

Destilación: el punto inicial y el punto final del rango de destilación del

producto determinan las temperaturas de inflamación y congelamiento.


68

La primera temperatura es importante por aspectos de seguridad en

tierra y la segunda por aspecto de operación de los equipos.

Los combustibles de aviación pueden clasificarse en dos grupos básicos:

gasolinas de aviación, para usar en aeronaves de motor alternativo o de

pistón y combustibles para turbinas de aviación (combustible Jet), para

usar en aeronaves de turbohélice o turborreactor. (6)

II.20.1. Contaminación y deterioro de Turbocombustibles

Los combustibles de aviación pueden resultar contaminados por diversas

sustancias (suciedad, agua, materia microbiológica, agentes tensoactivos o

residuos de otros compuestos químicos) así como por productos de petróleo

que se encuentren en los sistemas de distribución.

En el caso de la gasolina de aviación, el número de octano (índice de

detonación) es de primordial importancia. Cualquier contaminación que

cause una reducción, aunque sea pequeña, en el índice de la mezcla pobre o

rica puede tener efecto rápido y catastrófico sobre el funcionamiento de los

motores de pistón de un avión, con grave pérdida de potencia,

recalentamiento y avería mecánica de los componentes. La diferencias

serias de otras propiedades especificadas, tales como el rango de

destilación, la volatilidad y el contenido de tetraetilo de plomo, también

pueden originar graves defectos de funcionamiento dentro de un tiempo


69

relativamente corto. Los motores de turbohélice y los turborreactores no son

tan sensibles de inmediato a las deficiencias de cualquiera de las

propiedades de los combustibles de turbina; pero, si tienen que marchar

durante un tiempo prolongado con combustible que estén fuera de los límites

de las especificaciones, se puede perturbar el funcionamiento de elementos

críticos del sistema del combustible (como son las bombas y los dispositivos

de control) y reducir la duración o producir averías de las partes calientes del

motor, por ejemplo, las cámaras de combustión y los álabes de las turbinas.

En el caso de los combustibles de turbina, son la suciedad y el agua las que

producen el efecto más rápido y dañino, ya que obstruyen los filtros de las

aeronaves y restringen el paso del combustible a los motores.

Todos los combustibles pueden contener agua en solución hasta un límite de

saturación que depende de su composición química y de la temperatura. El

contenido real de agua disuelta en un momento determinado (es decir, el

grado de saturación) dependerá de varios factores, incluso la humedad

relativa del espacio lleno de aire que queda por encima del combustible y la

cantidad de agua no disuelta (libre) que está en contacto con el combustible

(por ejemplo, agua asentada en el fondo del tanque).

Mientras el agua disuelta permanece en solución, no tiene efecto adverso en

el funcionamiento del motor y el abastecedor de combustible no necesita

tenerla en cuenta. Sin embargo, el agua disuelta puede precipitarse ante un

descenso de la temperatura y entonces se convierte en agua libre o, si la


70

temperatura es muy baja, en hielo. Estas condiciones pueden presentarse

durante el vuelo, especialmente en las aeronaves de turbina y los cristales de

hielo son capaces de obstruir los filtros del motor, impidiendo el flujo de

combustible con la consiguiente falla parcial o total del motor. El agua

separada que se asienta en los tanques de la aeronave también favorece el

crecimiento microbiológico.

El agua en el combustible puede presentarse en dos formas:

Agua libre: agua en forma de una capa separada en el fondo del

recipiente que lo contenga.

Agua en suspensión: agua como su nombre lo indica, suspendida en

el combustible, en forma de pequeñas gotas. (6)

II.21. CAUSAS DEL BIODETERIORO

Existen varios factores que pueden afectar de forma negativa a los fluidos.

Entre los cuales se pueden mencionar:

Largos períodos de uso de los fluidos, cuya rata de reemplazo es muy

baja. Esto ocasiona que el fluido sea propenso a un ataque microbial

La acumulación de iones metálicos que son solubles durante la

operación de la maquinaria que pueden contribuir al estímulo del

crecimiento microbiano


71

La inhibición de la acción germicida, el deterioro catalítico del fluido y

los productos de la descomposición subsiguiente llegan a ser mejores

medios alimenticios para los microbios residentes

La adición de fluidos nuevos en sistemas poco saneados donde

posiblemente había la presencia de fluidos contaminados con

microorganismos

Los altos niveles de humedad en el ambiente es una condición

perfecta para la iniciación y continuación del crecimiento

microbiológico en las diferentes partes de las maquinarias (11)

II.22. EFECTOS DEL DETERIORO MICROBIANO

Los efectos de la contaminación microbiana, en resumen, pueden ser

clasificados como: físicos, químicos, y biológicos

Efectos físicos del deterioro

Estos efectos están relacionados sobre todo con la acción de los hongos ya

que por su misma naturaleza y agregación, interfieren con: la operación física

del flujo, la función de la máquina, y la filtración de los fluidos. Los hongos,

pueden formar depósitos fangosos en el fluido de corte. Si este crecimiento

no se trata correctamente pueden llegar a obstruir masivamente tanto las

líneas de entrega como los equipos de la filtración. Y las industrias afectadas

por este problema tendrían que parar su producción de vez en cuando, para

quitar físicamente este material.


72

Efectos químicos del biodeterioro

Corrosión

Hay una ley de la física que indica que para cada acción hay una reacción

igual y opuesta. Este axioma se puede ampliar a los sistemas de fluidos de

corte contaminados, es decir, los microbios son afectados por su ambiente, y

ellos alternadamente tienen un efecto sobre su ambiente. Un} área donde los

microorganismos pueden afectar es en la corrosión de ciertas piezas

metálicas. Ciertas bacterias son capaces de establecer una pila electrolítica o

de estimular reacciones anódicas o catódicas en el metal u otras superficies.

Estas reacciones electroquímicas en sistemas de corte pueden causar la

corrosión de la herramienta y del objeto. La contaminación bacteriana en los

fluidos de corte puede causar indirectamente la corrosión. Esto es realizado

de dos maneras, o consumiendo los inhibidores de la corrosión y/o

produciendo subproductos corrosivos tales como ácidos orgánicos.

Otros cambios químicos

La pérdida de los componentes anticorrosivos no es el único cambio químico

que los microbios pueden ejercer en un fluido. Varios estudios controlados

muestran que otros componentes de los fluidos son parcialmente perdidos y

algunas veces completamente agotados en presencia poblaciones

microbianas. Este cambio químico en los fluidos puede estar directamente

correlacionados con las pérdidas de las funciones que debería cumplir el

fluido, particularmente en el caso de aceites solubles donde se degrada el


73

hidrocarburo. Una pérdida concurrente de lubricidad puede ocurrir con este

tipo de actividad microbiana.

La instrumentación sofisticada tal como cromatografía líquida de alta presión

(HPLC) y la espectroscopia infrarroja (IR) pueden detectar incluso los

cambios más sutiles en la química del fluido, causada por la actividad

metabólica microbiana. Existen otros cambios menos sutiles en el fluido lo

cual también es causado por los microbios, por ejemplo, algunos

microorganismos son responsables de la variedad de olores desagradables

como huevos putrefactos. En algunos casos a causa de dichos olores,

muchos trabajadores se ven en la obligación de parar la producción hasta

que tales olores se encuentren bajo control.

Efectos biológicos del deterioro

Este se relaciona sobre todo con las interacciones organolépticas de los

trabajadores con su ambiente. Los olores a huevo putrefacto, los olores

fecales, o los olores a añejos, pueden afectar la vida de los trabajadores

sometidos a esa clase de olores, por los que si estos problemas no son

tratados a tiempo traerían consigo consecuencias muy serias. (11)

CAPÍTULO III

MARCO METODOLÓGICO

“Una experiencia nunca es un fracaso,

pues siempre viene a demostrar algo”.

Thomas Alva Edison

"La teoría es asesinada tarde o

temprano por la experiencia."

Albert Einstein

Capítulo III: Marco Metodológico

74

III. MARCO METODOLÓGICO

III.1 CARACTERÍSTICAS METODOLÓGICAS

Con el fin de realizar una correcta definición de las actividades a llevar a

cabo durante el desarrollo experimental se decidió orientar el estudio en

cinco fases, las cuales se explican a continuación:

1. Búsqueda de información o exploración: En esta fase se reúnen todos

los requisitos del proyecto a fin de tener una visión más global del

proceso a desarrollar. Se identificaron las fuentes de información y se

inició con la recolección de los datos para la realización del proyecto.

2. Inventario de materiales, reactivos y equipos disponibles: En esta

etapa se realiza un inventario informal de los materiales, reactivos y

equipos de los cuales se disponen y necesitan para realizar los

análisis microbiológicos.

3. Estandarización de Metodologías: Conociéndose los materiales,

reactivos y equipos disponibles se estandarizan las metodologías

asociadas al análisis microbiológico en Turbo Kerosinas y Fluidos de

Corte.

4. Implementación de las metodologías estandarizadas: En esta fase se

aplican, a nivel de laboratorio, las metodologías estandarizadas ASTM

“Fuel and Fuel Systems Microbiology-Fundamentals, Diagnosis, and

Contamination Control” para la determinación de bacterias sulfato-


75

reductoras anaerobias. De igual forma, se aplican las metodologías

estandarizadas propuestas en el Manual de Control de Calidad de

Laboratorios International Health, L.I.H. C.A. y del Manual de Métodos

Generales de Microbiología de la Universidad Central de Venezuela

para la determinación de la presencia de microorganismos aerobios

mesófilos, así como también, de Pseudomonas aeroginosa

(específicamente), y de hongos en general.

5. Elaboración de Kits (prototipos) Microbiológicos: Con la aplicación de

las metodologías estandarizadas se logran elaborar “Kits (prototipos)

microbiológicos” para determinar la presencia de bacterias sulfato-

reductoras anaerobias y microorganismos aerobios mesófilos (en

general), de fácil manipulación y correlacionados linealmente con la

metodología aplicada a nivel de laboratorio. Los Kits se preparan y

ponen a prueba de manera paralela al análisis realizado a nivel de

laboratorio, para que de esta forma se verifique la aplicabilidad de los

mismos.

III.2 BÚSQUEDA DE INFORMACIÓN O EXPLORACIÓN

A lo largo de esta actividad se llevó a cabo un levantamiento de la

información disponible sobre Microorganismos asociados a los Combustibles

de Aviación y Fluidos de Corte, asimismo, se investigó acerca de

metodologías aplicables para realizar análisis microbiológico en dichos

fluidos. La información recolectada sirvió para obtener los conocimientos


76

necesarios que fueron la herramienta fundamental en la realización del

presente trabajo.

En esta fase se encontraron metodologías que se adaptaban a los

materiales, equipos y reactivos que la Universidad Metropolitana disponía

para realizar los análisis microbiológicos necesarios, fundamentalmente: en

la metodología ASTM “Fuel and Fuel Systems Microbiology-Fundamentals,

Diagnosis, and Contamination Control”, “Manual de Control de Calidad de

Laboratorios International Health, L.I.H. C.A. “ y “Manual de Métodos

Generales de Microbiología de la Universidad Central de Venezuela”.

Como resultado de esta investigación se tiene el desarrollo del Marco Teórico

(Capítulo II), el cual es una síntesis de la información recopilada y además

permitió elaborar parte del Marco Metodológico (Capítulo III).

III.3 INVENTARIO DE MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS DISPONIBLES

En esta fase se realiza un inventario, de forma preliminar, de materiales,

reactivos, equipos y lugar de experimentación, tanto los disponibles como

los necesarios, para probar las metodologías ASTM “Fuel and Fuel Systems

Microbiology-Fundamentals, Diagnosis, and Contamination Control”, “Manual

de Control de Calidad de Laboratorios International Health, L.I.H. C.A.” y

“Manual de Métodos Generales de Microbiología de la Universidad Central


77

de Venezuela”. Se determinó la necesidad de adquisición de los reactivos y

materiales, teniendo en cuenta su valor económico para un posterior estudio

de costos.

El inventario se efectuó, realizando las consultas pertinentes a los técnicos

encargados de los laboratorios, dado sus conocimientos de empresas y/o

laboratorios que pudiesen surtir los reactivos, materiales y equipos que

hacían falta para llevar a cabo el trabajo experimental.

III.4 ESTANDARIZACIÓN DE METODOLOGÍAS

En esta fase se ajustaron los métodos experimentales, de forma tal de

introducir estándares metodológicos a la hora de realizar los estudios

microbiológicos. Se establecieron procedimientos experimentales para

realizar análisis microbiológico en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte,

basándose principalmente en la verificación y presencia de equipos,

reactivos y/u otros elementos de los cuales se disponían a la hora de realizar

la experimentación.

En esta etapa se estandarizaron las metodologías de análisis para

determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en general y

la presencia de Pseudomonas aeroginosas y hongos, así mismo para

determinar la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas. Los


78

procedimientos llevados a cabo se detallan en el apartado III.5

(implementación de las metodologías estandarizadas).

III.5 IMPLEMENTACIÓN DE LAS METODOLOGÍAS ESTANDARIZADAS

III.5.1 PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL DE VIDRIO

III.5.1.1 Objetivo

- Preparar de una manera conveniente, previa a la esterilización, el material

de laboratorio limpio, para que una vez esterilizado conserve esta condición

Pipetas:

Con un alambre de grosor adecuado, se colocó en la boquilla un trocito de

algodón que actúa como filtro, impidiendo la contaminación del material

absorbido de la propipeta, y a la vez como protector de la propipeta. Para su

esterilización, se les introducía dentro de cajas o estuches metálicos, o

envueltas en papel Kraft, ya sea individualmente o en grupos, y se

esterilizaban con calor seco a 160° C durante 2 horas y/o en autoclave a 15

psi (121° C) durante 15 min.

Tubos de ensayo:

Se taponaban uno a uno con algodón, se envolvían en grupos o se

colocaban en cestas para ser esterilizados. El tapón quedaba introducido en

el tubo no más de 3 cm., siendo de un tamaño que permitiera su fácil

manipulación y se trataba que no quedara ni muy flojo ni muy apretado.


79

Placas de Petri:

Se envolvían en grupos de 1 a 10 placas de Petri en papel Kraft.

Otros materiales:

Los matraces, fiolas, probetas, equipo de filtración, kitazatos y frascos se

taponaban como los tubos de ensayo y se cubrían el algodón con papel kraft

antes de esterilizarlos.

Todos los materiales antes nombrados se esterilizaban en autoclave a 15 psi

(121° C) durante 15 minutos.

III.5.1.2 Limpieza del Material de Vidrio

III.5.1.2.1 Reactivos

Detergente líquido

Agua destilada

Solución sulfocrómica: Dicromato de potasio................... 65g

Agua destilada..............................900 ml

Ácido sulfúrico concentrado........completar 1 litro

III.5.1.2.2 Equipos y materiales

Autoclave, estufa, papel kraft, algodón, pabilo


80

III.5.1.2.3 Procedimiento experimental

El material de vidrio sucio se remojaba en solución sulfocrómica, luego se

lavaba y enjuagaba.

Si el material de vidrio poseía material biológico o microorganismos, la

limpieza del mismo se efectuada de la siguiente manera:

a) Se esterilizaba el material de vidrio junto con el medio inoculado en

autoclave

b) Posteriormente se remojaba en una solución jabonosa, se eliminaba el

contenido y se lavaba

c) Una vez limpio, se enjuagaba no menos de 10 veces con agua

corriente y 3 o 4 veces con agua destilada

d) Una vez seco se cubría con papel Kraft y se esterilizaba en autoclave

a 15 psi durante 15 minutos.

Nota:

El material de vidrio utilizado soporta temperaturas de 121° C

III.5.2 EQUIPOS Y SU FUNCIONAMIENTO

Objetivo

- Conocer el funcionamiento de los equipos utilizados para realizar análisis

microbiológico.


81

Los equipos que se requirieron son los siguientes:

Autoclave

Características

- Debe alcanzar temperatura de 121° C y una presión de 15 libras

- Debe mantenerse limpio y seco

- Debe contener un controlador de temperatura apropiada y un medidor

de presión

- Debe contener una llave o válvula de aliviadero del vapor

Funcionamiento

- Se agrega agua destilada hasta cubrir el nivel indicado

- Se coloca el material a esterilizar en las cestas

- Se cierra, para lo cual las llaves deben quedar en forma paralela.

- Se abre la llave de vapor

- Se enciende al máximo

- Cuando se comienza a incrementar la presión (aproximadamente a 5

libras) se espera unos 5 minutos de escape de vapor con el fin de

purgar el autoclave.

- Se cierra la llave de vapor

- Al llegar a 15 libras y 121° C se disminuye un poco la temperatura

para mantener estas condiciones y se cuentan 15 minutos

- Se apaga y se abre la llave de vapor

- Al bajar la presión (se puede apreciar en el manómetro), se abre el

autoclave


82

Estufa

Características

- Debe alcanzar temperaturas de 250° C

- La temperatura debe controlarse

- Debe mantenerse limpia

Funcionamiento

- Se coloca el material a esterilizar

- Se gradúa la temperatura a 170° C

- Se esteriliza por 1 hora

- Al finalizar, se disminuye la temperatura a 60° C (como mínimo)

Incubadora

Características

- Debe alcanzar temperatura de 70° C

- Mantenerse limpia y libre de gérmenes

- La temperatura debe controlarse

Funcionamiento

- Se coloca el material a incubar

- Se gradúa la temperatura adecuada para el análisis

Plancha de calentamiento

Características

- Debe ser de acero inoxidable


83

- Debe alcanzar temperaturas de por lo menos 60° C

- Mantenerse limpia y seca

Funcionamiento

- Se enciende y se gradúa a la temperatura deseada

- Se coloca el material sobre la plancha

Nevera

Características

- Debe tener un compartimiento de refrigeración (2-5° C)

- Debe controlar la temperatura

- Mantener limpia y libre de gérmenes

Funcionamiento

- Se coloca en forma ordenada y sellada soluciones o material

microbiológico

Otros equipos

Microscopio, balanza semi-analítica, equipo de filtración Millipore, campana

de flujo laminar, pHmetro.


84

III.5.3 PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

III.5.3.1 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS (M-TGE, MEDIO TIOGLICOLATO Y CALDO TSB)

III.5.3.1.1 Objetivo

- Instruir en la preparación correcta de los medios de cultivos líquidos (m-

TGE, medio Tioglicolato y caldo TSB).


Alcohol etílico o isopropílico al 70 % v/v

Agua destilada

Caldo m-TGE

Medio Tioglicolato

Caldo TSB

III.5.3.1.3 Materiales y equipos

Balanza analítica, plancha de agitación, autoclave, pHmetro, espátula,

algodón, fiolas (2000 ml), frascos de dilución (mayor a 100 ml), papel Kraft,

papel aluminio, tijera, marcador, pabilo.


- Se limpió el área de trabajo con alcohol al 70 % v/v mediante un

algodón


85

- Se pesaron los medios de cultivo según las especificaciones que se

indicaban en la etiqueta

- Se transvasaron cuantitativamente los medios a las fiolas

- Se diluyeron los medios con el agua destilada requerida, según la

etiqueta

- Se llevaron a homogenización total por agitación y calentamiento

- Se verificó que el pH (a 25° C) de los medios correspondían con las

especificaciones de la etiqueta

- Se transvasaron cuantitativamente 100 ml de los medios a cada uno

de los frascos de dilución.

- Se cerraron los frascos colocando papel aluminio debajo de cada tapa

- Se colocó papel Kraft por encima de la tapa y se ató con pabilo

- Se identificó cada frasco con el nombre del cultivo y fecha de

preparación

- Se esterilizaron los frascos preparados con los medios de cultivos en

autoclave durante 15 minutos a 121° C y 15 lb de presión

- Se almacenaron en un lugar fresco, oscuro y limpio

Notas:

- Todos los medios de cultivos preparados en el laboratorio tienen un período

de vida útil de tres meses luego de su preparación, si se mantienen las

condiciones de almacenamiento, pues de no cumplir esto se arrojarían falsos

positivos en los medios

- No se esterilizaban los caldos más de dos veces


86

III.5.3.2 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS (SABOURAUD DEXTROSE AGAR Y CETRIMIDE AGAR)


- Instruir en la preparación correcta de los medios de cultivo sólidos

(Sabouraud Dextrosa Agar y Cetrimida Agar).


Alcohol etílico o isopropílico al 70 % v/v

Agua destilada

Sabouraud Dextrose Agar

Cetrimida Agar


Balanza analítica, plancha de agitación, autoclave, pHmetro, espátula,

algodón, fiolas (2000 ml), papel Kraft, papel aluminio, tijera, marcador, pabilo.


- Se limpió el área de trabajo con alcohol al 70 % v/v

- Se pesaron los medios sólidos según las especificaciones que se

indican en las etiquetas

- Se transvasaron cuantitativamente los medios a unas fiolas

- Se diluyeron con la cantidad de agua destilada requerida, según la

etiqueta


87

- Se llevaron a homogenización total por agitación y calentamiento

- Se verificó que el pH (25° C) de los medios correspondían con las

especificaciones

- Se taparon las fiolas donde se encontraban las soluciones

homogéneas, con algodón envuelto en gasa, cubriendo con papel

aluminio y luego con papel Kraft

- Se identificaron las fiolas (nombre del agar y fecha de preparación)

- Se esterilizaron en autoclave durante 15 min a 121° C y 15 lb de

presión

- Se dejaron enfriar, luego se almacenaron en la nevera entre 2 y 5° C

Notas:

- Todos los agares preparados en el laboratorio tienen un período de vida útil

de tres meses luego de su preparación, pues de no cumplir esto se arrojarían

falsos positivos en los medios

- No se esterilizaban los agares más de dos veces

III.5.3.3 PROCEDIMIENTO PARA EL PLAQUEO Y ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS


- Instruir en el procedimiento correcto para el plaqueo y almacenamiento de

los medios de cultivo sólido


88


Alcohol isopropílico o etílico al 70 % v/v

Agares preparados de Sabouraud Dextrose y Cetrimida♣


Mechero, algodón, cápsulas de Petri


- Se limpió el área de trabajo usando alcohol al 70 % v/v

- Se identificaron las cápsulas de Petri con el nombre del Agar

- Se quitó el tapón de la fiola e inmediatamente se trasvasaron

cualitativamente 25 ml de agar por placa y se cerró la misma

- Se dejó enfriar hasta que el agar se solidificara

- Se almacenaron las cápsulas de Petri de forma invertida a

temperaturas entre 2 y 5° C

Notas

- Todos los agares preparados en el laboratorio tienen un período de vida útil

de tres meses luego de su preparación, pues de no cumplir esto se arrojarían

falsos positivos en los medios

- No se esterilizaban los agares más de dos veces

♣ Véase apartado III.5.3.2


89

- Todo el material de vidrio que se utiliza dentro de la campana de flujo

laminar debe estar estéril

- Se trabajó en todo momento bajo el mechero

- Se calentaron los medios sólidos hasta fundir, en los casos de solidificación,

y se enfriaron hasta 45° C aproximadamente

III.5.4 PROCEDIMIENTO PARA LA TOMA DE MUESTRA DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE III.5.4.1 Objetivo

- Aplicar un procedimiento correcto para la recolección de muestras de Turbo

Kerosinas y Fluidos de Corte con el fin de evitar contaminación

III.5.4.2 Reactivos

Alcohol etílico o isopropílico al 70 % v/v.

III.5.4.3 Materiales

5 Frascos con rosca para la toma de muestras de capacidad de 500 - 1000

ml (vidrio, polipropileno o poliestireno), guantes quirúrgicos, algodón,

mascarilla, marcador.

III.5.4.4 Procedimiento experimental

- Se procedió al lavado de las manos antes de manipular el material y

los equipos de toma de muestra


90

- Se identificaron los frascos estériles para la toma de muestra

indicando número de muestra, tipo de fluido, procedencia y fecha de

muestreo, tal como lo resume la Tabla 9

- Durante la toma de muestras se limpió al alrededor del área donde

estaba localizado el punto de muestreo del contenedor del fluido a

analizar con alcohol al 70 % v/v usando un algodón o un paño limpio

- En el momento de la toma de la muestra se utilizaron guantes estériles

- Se abrió la válvula completamente y se dejó correr el fluido de dos a

tres minutos

- Al momento de realizar el muestreo se cerró un poco la válvula para

evitar salpicaduras durante la toma de muestra del fluido

- En los tanques abiertos, se tomó el frasco de muestreo, se le amarró

alambres limpios (con alcohol al 70 %) de forma tal que se pudiese

sumergir el envase en el tanque; se sumergió el envase y se tomó la

muestra correspondiente

- Para evitar falsos positivos, se abrieron los frascos al momento de la

recolección de la muestra del Fluido de Corte o el Combustible de

Aviación y se cerraron rápidamente

- Se transportaron las muestras hacia el sitio de análisis evitando en

todo momento agitar el frasco. Las muestras se mantuvieron

aproximadamente a 4° C hasta llegado el momento del análisis


91

Tabla 9. Descripción de los fluidos utilizados en la fase experimental durante la toma de muestra

Muestra/ Tipo de Fluido

Procedencia Volumen

de muestra

(ml)

Fecha de muestreo Observaciones

Imágenes de las muestras

recolectadas

2/Jet A1

Aeropuerto Maiquetía/ Tanque de

avión

1000 17/11/04

Color amarillo con presencia,

ausencia de fase acuosa (visible)

4/Jet A1

Aeropuerto La Carlota/

Tanque del ala derecha de un avión inoperativo

500 18/11/04

Color grisáceo, distinción de

interfase (combustible-

agua) turbidez en la fase acuosa, presencia de

partículas sólidas. Picaduras en el

tanque con notable presencia

de limo

7/Jet A1 Aeropuerto La

Carlota/ Cisterna

500 17/12/04

Color amarillo claro, buen aspecto, sin

partículas suspendidas ni

distinción de interfase

8/Jet A1

Aeropuerto La Carlota/

Tanque de helicóptero

500 17/12/04

Color amarillo

claro, buen aspecto, sin partículas

suspendidas ni distinción de

interfase

9/Jet A1 en caldo

nutritivo

Kit para determinar

presencia de bacterias sulfato-

reductoras anaerobias

--- Desconocida

Fluido turbio, con interfase

fácilmente distinguible, con



(utilizado para control)


92

10/Jet A1 en caldo nutritivo

Kit para determinar



---- Desconocida

Fluido turbio, con interfase

fácilmente distinguible, con



(utilizado para control)

Corte/Fluido de Corte

Venosoluble AW

Venoco-Guacara Edo.

Carabobo/ Envase de 1

galón

500 17/11/04 Emulsión blanca,

sin partículas sólidas

Notas:

- El lapso de tiempo entre la toma de muestra y el análisis no debería

exceder las 24-48 horas

- El volumen de las muestras recolectadas estuvo comprendido entre 500 –

1000 ml

- El frasco para la toma de muestra (estéril) se mantuvo abierto solamente

lo necesario

- Se evitó en todo momento tocar los interiores de los envases de muestreo

y casquillos de éstos

- Si se quiere tomar varias muestras de un mismo tanque pero en puntos

distintos, se recomienda comenzar a muestrear desde la parte superficial

del tanque hasta llegar al punto más bajo del tanque de esta forma se

evita mayores turbulencias del fluido ha analizar


93

- Si se quiere determinar únicamente organismos anaerobios dentro de un

contenedor del fluido es recomendable llenar el frasco de muestreo hasta

el borde dejando suficiente espacio vacío únicamente para las

expansiones que puedan ocurrir del fluido con los cambios de

temperatura durante el tránsito o el transporte. En este caso es

recomendable tomar la muestra del fondo del tanque

- Si se quiere determinar únicamente la presencia de microorganismos

aerobios se recomienda llenar el frasco de muestreo entre un 50 %

(ASTM 6469) a 80 % (IP Guidelines) ya esto promueve las condiciones

aerobias dentro del envase

III.5.5 PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS Y HONGOS UTILIZANDO EL MÉTODO DE FILTRACIÓN DE MEMBRANA

III.5.5.1 DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE


- Determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las

muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte


Medio Tioglicolato

Caldo TSB


94

Caldo MTGE

Alcohol 70 % v/v (etanol o alcohol isopropílico)

Solución 30 ml de solución salina al 0.85 % p/v

Solución 100 ml de Triton X-100 al 0.1 % v/v

III.5.5.1.3 Materiales y Equipos 21 frascos de dilución de capacidad de 100 ml con rosca, papel aluminio,

papel Kraft, 6 membranas para filtrar de 0.45 μm y diámetro de 47 mm,

equipo de filtración millipore, kitazato, pinza metálica, bomba de vacío,

campana de flujo laminar, mechero, algodón, marcador, autoclave,

incubadora, guantes y tapaboca.

III.5.5.1.4 Procedimiento experimental♣

- Se prepararon y esterilizaron los medios líquidos (Caldo m-TGE,

Caldo TSB y medio tioglicolato) (Ver apartado III.5.3.1)

- Se limpió y desinfectó el sitio de trabajo con alcohol al 70 %

- Se encendió el mechero lo más cercano al lugar de trabajo

- Se identificaron todos los medios de cultivo (fecha, nombre de la

muestra y el nombre del cultivo)

- Se tomaron cuantitativamente 100 ml de las muestras a analizar

(Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte) y se filtraron en el equipo de

♣ Véase Figura 12 (representación esquemática)


95

Filtración Millipore (esterilizado) utilizando una membrana de 0.45 μ de

poro. Las muestras que se analizaron se resumen en la Tabla 10.

Tabla 10. Muestras analizadas para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos.

N° de muestra Tipo de fluido Fecha de análisis 2 Jet A1 19/11/04 4 Jet A1 19/11/04

Corte Fluido de corte Venosoluble-Aw 19/11/04

Blanco (control) Soluciones de lavado 19/11/04

- Se enjuagó el vaso de filtración y el filtro sucesivamente con las

soluciones:

100 ml de Triton X-100 al 0.1 % v/v

30 ml de solución salina de NaCl al 0.85 % p/v

- Una vez finalizado el proceso de filtración, se desmontó el equipo y se

cortó el filtro en tres pedazos aproximadamente iguales

- Se tomaron los trozos de filtro con una pinza estéril

- Se colocó cada trozo de filtro en tres frascos de dilución distintos.

Cada frasco de dilución contenía 100 ml de MTGE, 100 ml de medio

Tioglicolato y 100 ml de caldo TSB

- Una vez que se colocaron los pedazos del filtro dentro de los frascos

de dilución, se cerraron e incubaron de 2 a 7 días a 35 ± 2° C

- Durantes los días de incubación se observaron los frascos de dilución

comparándolos con el blanco. Cuando los teteros exhibían

enturbiamiento entonces tenían contaminación microbiana aerobia


96

mesófila. Y aquellos que no estaban turbios no presentaban

contaminación microbiana aerobia mesófila en las muestras

analizadas♣.

Notas:

- En todo momento se realizó un blanco para mantener un control del

procedimiento experimental y de los medios utilizados, y de esta forma evitar

falsos positivos.

- La experimentación se realizó por duplicado

♣ Véase resultados experimentales


97

Figura 12. Representación esquemática del procedimiento realizado para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras deTurbo Kerosinas y Fluidos de Corte


98

III.5.5.2 Determinación de Pseudomonas aeroginosas y Hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte, presentes en los caldos contaminados (turbios) por medio de repiques

III.5.5.2.1 Objetivos

- Determinar la presencia de Pseudomonas aeroginosas en las muestras de

Fluidos de Corte y Turbo Kerosinas

- Determinar la presencia de hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y

Fluidos de Corte


Cetrimida Agar

Sabouraud Dextrose Agar

Alcohol 70 % v/v (etanol o alcohol isopropílico)

III.5.5.2.3 Materiales y Equipos

21 frascos de dilución con los caldos contaminados (véase apartado

III.5.5.1), 84 cápsulas de Petri, papel aluminio, campana de flujo laminar,

mechero, algodón, marcador, asa de platino, autoclave, incubadora, nevera,

guantes y tapaboca


99

III.5.5.2.4 Procedimiento experimental♣

- Se emplearon las cápsulas de Petri que poseían aproximadamente 25 ml

de los agares (42 cápsulas con Cetrimide agar y 42 cápsulas con

Sabouraud Dextrose agar) ya preparados y esterilizados (ver apartado

III.5.3.2)

- Se identificaron las cápsulas de Petri (nombre de la muestra, fecha de

análisis y el agar utilizado)

- Se limpió el área de trabajo con alcohol al 70 % v/v

- Se encendió el mechero lo más cercano posible al lugar de trabajo

- Se cogieron los caldos que presentaron contaminación microbiana

(turbios)♦ y se realizaron repiques con un asa de platino estéril de cada

una de los teteros (turbios) en los agares, realizándoles estrías en el

mismo

- Una vez que se realizó el repique se incubaron los caldos contaminados

en el medio Cetrimide Agar a 35 ± 2 ° C por 2-4 días, y los caldos

contaminados en el medio Sabouraud Dextrose Agar a 25 ± 2 ° C por 3-5

días

- Una vez transcurridos los tiempos de incubación se observaron las

cápsulas de Petri

♣ Véase figura 13 (representación esquemática) ♦ Véase apartado III.5.5.1 y capítulo IV (relacionado con los resultados obtenidos de la turbidez de los caldos)


100

En el agar Cetrimide, si se observaba la presencia de una coloración verde

fluorescente confirmando la presencia de Pseudomonas aeroginosas en las

muestras analizadas. Y si no se observaba dicha coloración no había

presencia de Pseudomonas aeroginosas. En los casos de placas con

crecimiento microbiano se analizaba dicho crecimiento en el microscopio

realizándose la tinción de Gram para confirmar la presencia o no de

Pseudomonas aeroginosas (véase apartado III.5.5.3).

En cuanto al Sabouraud Dextrose Agar, se observaba si había presencia o

no de hongos.

Notas:

- Se debe tomar en consideración que el Cetrimide agar es selectivo para

Pseudomonas aeroginosas, y el agar Sabouraud Dextrose Agar es un

medio selectivo para hongos

- En todo momento se realizó un blanco para mantener un control del

procedimiento experimental y de los medios utilizados, y de esta forma se

evitaba falsos positivos

- La experimentación se realizó por duplicado


101

Figura 13. Representación esquemática del procedimiento realizado para determinar la presencia de Pseudomonas aeroginosas y hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte, presentes en los caldos contaminados (turbios)


102

III.5.5.3 PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR LA COLORACIÓN SIMPLE DE GRAM


- Realizar la tinción simple de Gram de alguna de las placas

contaminadas para efectuar la observación a través del microscopio y

verificar la presencia o ausencia de Pseudomonas aeroginosas.


Safranina

Violeta cristal

Azul de metileno

Agua corriente

Fluido de cedro

Solución salina al 0.85 %


Microscopio, asa de platino, lamina para microscopio, mechero.


- Sobre las láminas limpias y secas se colocó una gota de solución

salina

- Con el asa de platino estéril se tocó el crecimiento de uno de los

cultivos y se suspendió el material recogido en la gota de solución


103

salina, procediendo luego a extender esta gota en la lámina. Se

esterilizó el asa de platino en el mechero

- Se dejó secar y luego se fijó a la llama

- Se tiño de la siguiente manera:

a) Se cubrió con la solución colorante: azul de metileno, safranina

y violeta cristal y se dejó actuar por un minuto

b) Se lavó con agua corriente, se secó cuidadosamente y se

observó en el microscopio con el objetivo de inmersión

Nota:

- Es importante resaltar que los organismos Gram positivos aparecen

teñidos de violeta y los Gram negativos de rosado

- La Pseudomona aeroginosa es un microorganismo Gram negativo.

III.5.6. PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS ANAEROBIAS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE

III.5.6.1 Objetivo

- Determinar la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaerobias en

las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte

III.5.6.2 Reactivos

- Medio Starkey

- 500 ml de hidróxido de sodio (NaOH) 1 M


104

- Potasio fosfato monobásico (KH2PO4)

- Cloruro de magnesio (MgCl2)

- Alcohol al 70 % (etílico o propílico)

III.5.6.3 Materiales y equipos

Balanza semianalítica, 14 inyectadotas desechables estériles graduadas de 5

ml, 1 inyectadora desechable estéril graduada de 10 ml, 15 tubos de ensayo

al vacío, gradilla, autoclave, pHmetro, 2 fiolas graduadas de 1 L y 1 fiola

graduada de 250 ml , 1 balón aforado de 50 ml, papel de aluminio y plancha

de calentamiento

III.5.6.4 Procedimiento para la preparación de las soluciones

III.5.6.4.1 Procedimiento para la preparación del medio Starkey.

- En una fiola de 1 L se agregaron los necesarios para preparara el

medio Starkey

- Se mezclaron todos los reactivos en aproximadamente 500 ml de

agua destilada calentándose suavemente hasta que se disolvieran

- El pH de la solución se ajustó a 7.2 ± 0.2 con la solución “Buffered

Dilution Water, Working Solution” ♠(el Agua de Dilución Buffer,

Solución de Trabajo)

- Se esterilizó el Medio Starkey en autoclave a 15 psi (121° C) por 20

min ♠ Según normas ASTM


105

- Para un análisis por duplicado de cada una de las muestras

analizadas (véase tabla 11) se llenaron 2 (duplicado) x 7 (N° de

muestras analizadas) + 1 (blanco) = 15 tubos de ensayo al vacío con 9

ml del Medio Starkey estéril, medidos con una jeringa graduada de 10

ml de capacidad

Tabla 11. Muestras analizadas para determinar la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas

N° de muestra Tipo de fluido Fecha de análisis 2 Jet A1 19/12/04 4 Jet A1 19/12/04 7 Jet A1 19/12/04 8 Jet A1 19/12/04

9 Jet A1 con caldo nutritivo y presencia de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas 19/12/04

10 Jet A1 con caldo nutritivo y presencia de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas 19/12/04

Corte Fluido de corte Venosoluble-Aw 19/12/04

III.5.6.5 Procedimiento experimental♣

- Para cada una de las muestras se necesitaron 2 tubos de ensayo al

vacío que contenían 9 ml del medio Starkey. Luego usando una

jeringa graduada de 5 ml, se añadió 1 ml de la muestra en cada uno

de los tubos correspondientes. Entre muestra y muestra las jeringas y

las agujas se desechaban y los tubos de ensayo se agitaban

vigorosamente

♣ Véase Figura 14 (esquema experimental)


106

- Se obtuvo las condiciones anaerobias succionando el aire que podría

estar presente en cada uno de los tubos de ensayo utilizando para ello

las mismas jeringas con las cuales se añadieron las muestras a los

respectivos tubos de ensayo

- Se incubaron los tubos de ensayos a temperatura ambiente por 21

días

- Los tubos de ensayo que exhibían un contenido de color negro, o un

precipitado negro en el período de 21 días se tomó como resultado

positivo

Notas:

- Se incluyó en todo momento un blanco para mantener un control del

análisis

- En el análisis se incluyeron muestras que poseían bacterias sulfato-

reductoras (muestras 9 y 10), como patrón del análisis realizado


107

Figura 14. Representación esquemática del procedimiento realizado para determinar la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte


108

III.6 ELABORACIÓN DE LOS KITS MICROBIOLÓGICOS (PROTOTIPO)

III.6.1 KIT MICROBIOLÓGICO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS EN LAS MUESTRAS DE FLUIDOS DE CORTE Y TURBO COMBUSTIBLES DE AVIACIÓN

III.6.1.1 Objetivo

- Elaborar kit microbiológico que permita determinar la presencia de

microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Fluidos de Corte y

Turbo kerosinas.

III.6.1.2 Instructivo de operación para el manejo del kit microbiológico♣

- Tomar la muestra a analizar con el envase identificado con “toma de

muestra” , utilizando guantes estériles y mascarilla

- Realizar los análisis en un lugar cerrado, limpio y con toma corriente

de 110 – 120 V

- Al comenzar el análisis, limpiar el sitio de trabajo con alcohol

isopropílico al 70 % v/v utilizando para ello algodón

- Enchufar la incubadora portátil y regular la temperatura del mismo a

35 ± 2° C

- Encender el mechero portátil de alcohol

- Colocarse un par de guantes estériles nuevos y la mascarilla

♣ Véase figura 15 (representación del esquema experimental)


109

- Preparar el equipo de filtración, incorporando con la pinza metálica

previamente esterilizada con el mechero, una membrana de filtración

de 25 mm de diámetro y 0,45 μm por poro

- Con una jeringa estéril de 20 ml, tomar 10 ml de la muestra a analizar

y añadirlo al equipo de filtración, recogiendo el líquido filtrado en el

frasco recolector

- Seguidamente verter el contenido del envase con 10 ml de la solución

Triton X-100 al 0.1 % v/v (estéril) y 3 ml de la solución salina al 0.85

% p/v (estéril)

- Una vez finalizado el proceso de filtración, remover la membrana con

la pinza metálica esterilizada en el mechero

- Sin tocar el filtro con las manos, recortar la membrana en 3 pedazos

con la tijera metálica esterilizada en el mechero

- Posteriormente se añade cada uno de los pedazos en los envases con

los caldos nutritivos estériles de TSB, m-TGE y Tioglicolato

- Cerrar los recipientes rápidamente y colocarlos en la incubadora

portátil

- Mantener los caldos en incubación de 2 a 7 días a 35 ± 2° C

- Una vez transcurrido el tiempo de incubación observar los medios. Si

alguno de ellos presentan enturbiamiento entonces la muestra se

encuentra contaminada con microorganismos aeróbios mesófilos. Si

por el contrario ninguno de los caldos presenta enturbiamiento

entonces la muestra no estará contaminada


110

Notas:

- Realizar el análisis en condiciones totalmente asépticas

- Trabajar con precaución en el mechero

- Antes de desechar los envases con los medios, someter los mismos

con calor seco a 160° C durante 2 horas o en autoclave a 15 psi (121°

C) durante 15 min

Figura 15. Representación esquemática del instructivo de operación del kit microbiológico para la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos


111

III.6.1.3 Procedimiento de prueba y puesta en marcha del kit microbiológico (prototipo)

Se puso a prueba el kit microbiológico para determinar la presencia de

microorganismos aerobios mesófilos utilizando las mismas muestras

empleadas en el apartado III.5.5.1 (véase tabla 12). Este ensayo se realizó

con el fin de establecer una correlación lineal entre la experimentación

aplicada a nivel de laboratorio (III.5.5.1) y la del kit.

Tabla 12. Muestras analizadas para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos (kit prototipo)

N° de muestra Tipo de fluido Fecha de análisis

2 Jet A1 19/11/04 4 Jet A1 19/11/04

Corte Fluido de corte Venosoluble-Aw 19/11/04 Blanco (control) Soluciones de lavado 19/11/04

Notas:

- Según el procedimiento del apartado anterior (instructivo de operación

para el manejo del kit microbiológico)

III.6.2 KIT MICROBIOLÓGICO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN LAS MUESTRAS DE FLUIDOS DE CORTE Y TURBO KEROSINAS

III.6.2.1 Objetivo

- Elaborar kit microbiológico que permita determinar la presencia de bacterias

sulfato-reductoras anaeróbicas en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos

de Corte


112

III.6.2.2 Instructivo de operación para el manejo del kit microbiológico♣

- Tomar la muestra a analizar con el envase identificado con “toma de

muestra” , utilizando guantes estériles y mascarilla

- Al comenzar el análisis, limpiar el sitio de trabajo con alcohol

isopropílico al 70 % v/v utilizando para ello algodón

- Colocarse un par de guantes estériles nuevos y la mascarilla

- Con una jeringa estéril de 5 ml, tomar 1 ml de la muestra a analizar

eliminando el aire que pudiese estar presente en la jeringa

- Añadir 1 ml de la muestra en los tubos de ensayo (al vacío) que

poseen 9 ml del medio Starkey estéril. Sin retirar aún la jeringa del

tubo de ensayo, eliminar la posible presencia de aire, realizando

succión con la jeringa

- Incubar los tubos por 21 días a temperatura ambiente en un sitio

oscuro

- Mantener una observación diaria de los tubos.

- Una vez transcurrido el tiempo de incubación observar los tubos de

ensayo. Si alguno de ellos presentan precipitado de color negro

entonces la muestra se encuentra contaminada con microorganismos

sulfato-reductores anaeróbicos. Si por el contrario ninguno de los

tubos no presenta precipitado negro entonces la muestra no estará

contaminada

♣ Véase figura 16 (representación esquemática)


113

Nota:

- Antes de desechar los envases con los medios, someter los mismos

con calor seco a 160° C durante 2 horas o en autoclave a 15 psi (121°

C) durante 15 min

Figura 16. Representación esquemática del instructivo de operación del kit microbiológico para la determinación de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas en las muestras deTurbo Kerosinas y Fluidos de Corte


114

III.6.2.3 Procedimiento de prueba y puesta en marcha del kit microbiológico (prototipo)

Se puso a prueba el kit microbiológico para determinar la presencia de

bacterias sulfato-reductoras. Se utilizaron las muestras que se exponen en el

apartado III.5.6 (véase tabla 11). El kit elaborado que se aplicó es el mismo al

expresado en el apartado III.5.6

CAPÍTULO IV

RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

“ Cualquiera podría haberlo hecho,

pero nadie lo hizo “

Anónimo

“ Si buscas resultados distintos,

no hagas siempre lo mismo “

Albert Einstein

Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados 116

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

IV.1. RESULTADOS IV.1.1. DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE Tabla 12. Observaciones en la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte

Medios de Cultivo Tipo de fluido Muestra Repetición

Tiempo de incubación

(horas) m-TGE Tioglicolato TSB

1 168 No turbio No turbio No turbio Jet A1 2 2 168 No turbio No turbio No turbio

1

48 Turbio con precipitado blanco (mal olor)

Turbio con precipitado blanco (mal olor)

Turbio con precipitado blanco (mal olor) Jet A1 4

2




1

48 Turbio Turbio con precipitado blanco (mal olor)


Turbio con precipitado blanco (mal olor) Fluido

de Corte

Corte

2




Blanco 48-168 Cristalino-no turbio

Cristalino-no turbio



(a) (b)

Figura 17. (a) Observación inicial de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 2, repetición 1) y antes de someterlos al período de incubación. (b) Observación de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 2, repetición 1) y después de 7 días de incubación a 35 ± 2° C

(a) (b) Figura 18. (a) Observación inicial de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 4, repetición 1) y antes de someterlos al período de incubación. (b) Observación de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 4, repetición 1) y después de 2 días de incubación a 35 ± 2° C


(a) (b)

Figura 19. (a) Observación inicial de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Fluido de Corte y antes de someterlos al período de incubación. (b) Observación de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Fluido de Corte y después de 2 días de incubación a 35 ± 2° C


IV.1.2. DETERMINACIÓN DE PSEUDOMONAS AEROGINOSAS Y HONGOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE, PRESENTES EN LOS CALDOS CONTAMINADOS (TURBIOS) POR MEDIO DE REPIQUES Tabla 13. Observaciones en la determinación de hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte presentes en los Caldos por medio de repiques en Sabouraud Dextrosa Agar

Sabouraud Dextrosa Agar Tipo de fluido Muestra Repetición


(horas)

m-TGE (1-2) Tioglicolato (1-2) TSB (1-2) 1 120 Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento

Jet A1 2 2 120 Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento

1

120 Crecimiento-coloración blanca-presencia de levaduras

Crecimiento-coloración blanca-presencia de levaduras


Jet A1 4

2

120 Crecimiento-coloración blanca-presencia de levaduras



1

120 Crecimiento-presencia de levaduras

Crecimiento-presencia de levaduras

Crecimiento-presencia de hongo filamentoso Fluido de

Corte Corte

2

120 Crecimiento-presencia de levaduras

Crecimiento-presencia de levaduras

Crecimiento-presencia de hongo filamentoso

Blanco Blanco ------------ 120 Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento


(a) (b) (c) Figura 20. Observaciones de las cápsulas de Petri con Sabouraud Dextrosa Agar luego del repique del Combustible Jet A1 (muestra 2) en (a) Medio Tioglicolato, (b) Medio TSB y (c) Medio m-TGE, una vez transcurrido los 5 días de incubación a 25 ± 2° C

(a) (b) (c) Figura 21. Observaciones de las cápsulas de Petri con Sabouraud Dextrosa Agar luego del repique del Combustible Jet A1 (muestra 4) en (a) Medio Tioglicolato, (b) Medio TSB y (c) Medio m-TGE, una vez transcurrido los 5 días de incubación a 25 ± 2° C

(a) (b) (c)

Figura 22. Observaciones de las cápsulas de Petri con Sabouraud Dextrosa Agar luego del repique del Fluido de Corte (muestra Corte) en (a) Medio Tioglicolato (b), Medio TSB y (c) Medio m-TGE, una vez transcurrido los 5 días de incubación a 25 ± 2° C


Tabla 14. Observaciones en la determinación de Pseudomonas aeroginosas en las muestras deTurbo Kerosinas y Fluidos de Corte presentes en los Caldos por medio de repiques en Cetrimida Agar

Cetrimida Agar Tipo de fluido Muestra Repetición

Tiempo deincubación

(horas)

m-TGE (1-2) Tioglicolato (1-2) TSB (1-2)

1 96 Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento Jet A1 2

2 96 Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento

1

96 Escaso crecimiento-coloración blanca-sin presencia de Pseudomonas aeroginosas

Escaso crecimiento-coloración blanca-sin presencia de Pseudomonas aeroginosas

Escaso crecimiento-coloración blanca-sin presencia de Pseudomonas aeroginosas Jet A1 4

2

96 Crecimiento-coloración blanca-sin presencia de Pseudomonas aeroginosas

Crecimiento-coloración blanca-sin presencia de Pseudomonas aeroginosas

Crecimiento-coloración blanca-sin presencia de Pseudomonas aeroginosas

1

96 Crecimiento-ausencia de Pseudomonas aeroginosas

Crecimiento- ausencia de Pseudomonas aeroginosas

Crecimiento- ausencia de Pseudomonas aeroginosas Fluido de

Corte Corte

2

96 Crecimiento- ausencia de Pseudomonas aeroginosas



Blanco Blanco ------------ 96 Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento


(a) (b) (c) Figura 23. Observaciones de las cápsulas de Petri con Cetrimida Agar luego del repique del Combustible Jet A1 (muestra 2) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 4 días de incubación a 35 ± 2° C

(a) (b) (c) Figura 24. Observaciones de las cápsulas de Petri con Cetrimida Agar luego del repique del Combustible Jet A1 (muestra 4) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 4 días de incubación a 35 ± 2° C

(a) (b) (c) Figura 25. Observaciones de las cápsulas de Petri con Cetrimida Agar luego del repique del Fluido de Corte (muestra Corte) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 4 días de incubación a 35 ± 2° C


IV.1.3 RESULTADOS OBTENIDOS DE LA TINCIÓN DE GRAM PARA VERIFICAR LA PRESENCIA O AUSENCIA DE PSEUDOMONAS AEROGINOSAS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE EN PLACAS CON CETRIMIDA AGAR CONTAMINADAS Tabla 15. Observaciones de la Tinción de Gram en placas con Cetrimida Agar contaminadas

Tinción de Gram en placas con Cetrimida Agar contaminadas Tipo de

fluido Muestra RepeticiónTiempo de incubación

(horas)

m-TGE (1-2) Tioglicolato (1-2) TSB (1-2)

1

120 Presencia de cocos-Gram positivos (coloración violeta)

Presencia de cocos-Gram positivos (coloración violeta)


Jet A1 4

2




1



Presencia de cocos-Gram positivos (coloración violeta) Fluido de

Corte Corte

2





Figura 26. Tinción de Gram de la muestra 4 (Jet A1) en medio m-TGE 1 (repetición 1)

Figura 27. Tinción de Gram de la muestra Corte (Fluido de Corte) en Medio Tioglicolato 1 (repetición 1)


IV.1.4 DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS ANAEROBIAS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y EN FLUIDOS DE CORTE♣ Tabla 16. Observaciones en la determinación de la presencia de bacterias sulfato reductoras anaerobias en turbo kerosinas y en fluidos de corte

Tipo de Fluido Muestra Tiempo de incubación

(horas) Repetición Observaciones

2 504 1 Ausencia de precipitado negro

Jet A1 504 2

Ausencia de precipitado negro

4 504 1 Presencia de precipitado negro

Jet A1 504 2

Presencia de precipitado negro


Jet A1 504 2



Jet A1 504 2



Jet A1 en caldo nutritivo

504 2 Presencia de precipitado negro


Jet A1 en caldo nutritivo

504 2 Presencia de precipitado negro

Corte 504 1


Fluido de Corte Venosoluble

AW 504 2


Blanco Blanco 504 Ausencia de precipitado negro

♣ Esta metodología, por ser de fácil experimentación y manipulación, fue directamente la puesta en marcha del Kit microbiológico


(a) (b) Figura 28. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 2) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 2) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente









(a) (b) Figura 34. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra Corte) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra Corte) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente

(a) (b) Figura 35. (a) Observación inicial del tubo de ensayo al vacío con Medio Starkey (Blanco) antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación del tubo de ensayo al vacío con Medio Starkey (Blanco) después de 21 días de incubación a temperatura ambiente


IV.1.5. RESULTADOS OBTENIDOS DE LA PUESTA EN MARCHA DEL KIT MICROBIOLÓGICO (PROTOTIPO) PARA LA DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE Tabla 17. Observaciones de la puesta en marcha del kit microbiológico (prototipo) para la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte

Medios de Cultivo Tipo de fluido Muestra Repetición


(horas) m-TGE Tioglicolato TSB

1 168 No turbio No turbio No turbio Jet A1 2 2 168 No turbio No turbio No turbio

1



Turbio con precipitado blanco (mal olor) Jet A1 4

2




1

48 Turbio Turbio con precipitado blanco (mal olor)


Turbio con precipitado blanco (mal olor) Fluido

de Corte

Corte

2




Blanco 48-168 Cristalino-no turbio




(a) (b) Figura 36. (a) Observación inicial de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, TSB y Tioglicolato) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 2, repetición 1) y antes de someterlos al período de incubación, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo). (b) Observación inicial de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 2, repetición 1) y después de 7 días de incubación a 35 ± 2° C, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo)

(a) (b) Figura 37. (a) Observación inicial de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, TSB y Tioglicolato) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 4, repetición 1) y antes de someterlos al período de incubación, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo). (b) Observación inicial de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 4, repetición 1) y después de 2 días de incubación a 35 ± 2° C, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo)


(a) (b) Figura 38. (a) Observación inicial de los frascos con los tres medios de cultivo (TSB, m-TGE y Tioglicolato) luego de la filtración del Fluido de Corte (muestra Corte, repetición 2) y antes de someterlos al período de incubación, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo). (b) Observación de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Fluido de Corte (muestra Corte, repetición 2) y después de 2 días de incubación a 35 ± 2° C, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo)

Figura 39. Observación de los blanco con los tres medios de cultivo (m-TGE, TSB y Tioglicolato) después de 7 días de incubación a 35 ± 2° C, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo)


IV.1.6. COSTOS PRIMARIOS ASOCIADOS A LA DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE (AÑO 2005) COSTOS POR ANÁLISIS (DUPLICADO + BLANCO) Tabla 18. Costos por análisis de Reactivos, Materiales y mano de obra en la determinación de microorganismos aerobios mesófilos en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte

Reactivos Cantidad por envase

Costo del reactivo por envase ( Bs)

Cantidad del reactivo utilizado

Costo del reactivo

utilizado (Bs)

M-Tryptone Glucose Extract Broth (MTGE) 500 g 140360,00 7,20 g 2021,18 Fluid Thioglucollate Medium 500 g 82800,00 11,90 g 1970,64 Tryptone Soya Broth 500 g 78430,00 12,00 g 2622,00 Triton X-100 3785 ml 251100,00 0,40ml 26,50 Cloruro de Sodio 500 g 250,00 1,28g 0,64 Alcohol Isopropílico 70% 120 ml 767,05 120,00 ml 767,05 Hidróxido de Amonio al 25 % 2500 ml 50600,00 4,00 ml 80,96

Subtotal 7408,05


Materiales Cantidad del

material comprado

Costo del material (Bs)

Cantidad del material utilizado

Costo del material utilizado (Bs)

Membranas de filtración Millipore (blanca) 47 mm de díametro y 0,45 Mm por poro

100 unidades 139151,15 3 membranas 4174,53

Papel Aluminio 1 unidad (7 m) 1950,00 20 cm = 0,2000 m 55,71

Pabilo 1 unidad (500m) 650,00 2.0000 m 2,60

Papel Kraft 1 unidad (2 m*10 m) 1500,00 0,2000 m*2 m 30,00

Motas de algodón 1 Unidad (100 motas) 1928,55 30 motas 578,57

Gasa estéril 1 Unidad (2 retazos) 454,00 5 retazos 1135,00

Detergente 1 Unidad (850 ml) 3105,00 10 ml 36,53

Cloro 1 Unidad (2000 ml) 1639,90 10 ml 8,20

Fósforos 1 Unidad (50 cerillos) 200,00 2 cerillos 8,00

Guantes estériles 1 Unidad (1 par de guantes) 1852,65 2 pares 3705,30

Mascarilla 1 Unidad (5 máscaras) 3188,95 2 máscarillas 1275,58

Toallas de papel absorbente

1 Unidad (100 toallas) 1500,00 10 toallas 150,00

Subtotal 11160,02

Miembros Tiempo

consumido (horas)

Sueldo por hora (Bs)

Sueldo por análisis (Bs)

Analista de laboratorio 3129,86 15649,31 Analista de laboratorio

5 horas – hombre (2 analistas) 3129,86 15649,31

Mano de Obra Directa

Supervisor del laboratorio 5 horas - hombre 3129,86 15649,31 Subtotal 46947,92

TOTAL 65515,99 Bs34,12$(

♠ Tasa de cambio actual: 1$ = 1920 Bs (Febrero-2005)


IV.1.7 COSTOS PRIMARIOS ASOCIADOS A LA DETERMINACIÓN PSEUDOMONAS AEROGINOSAS Y HONGOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE (año 2005) COSTOS POR ANÁLISIS (DUPLICADO + BLANCO) Tabla 19. Costos por análisis de Reactivos, Materiales y mano de obra en la determinación de Pseudomonas Aeroginosas y hongos en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte

Reactivos

Cantidad por envase



Costo del reactivo utilizado

(Bs) M-Tryptone Glucose Extract Broth (MTGE) 500 g 140360,0000 7,20 2021,18 Fluid Thioglucollate Medium 500 g 82800,0000 11,90 g 1970,64 Tryptone Soya Broth 500 g 78430,0000 12,00 g 2622,00 Triton X-100 3785 ml 251100,0000 0,40 ml 26,54 Cloruro de Sodio 500 g 250,0000 1,28 0,64 Alcohol Isopropílico 70% 120 ml 767,0500 120,00ml 767,05 Hidróxido de Amonio al 25 % 2500 ml 50600,0000 4,00 ml 80,96 Cetrimida Agar 500 g 149500,0000 9,06 g 2708,94 Sabouraud Dextrosa Agar 500 g 156492,0000 13,00 g 4068,79 Violeta Cristal 25 g 86250,0000 0,05 g 172,50 Safranina 25 g 118650,1000 0,025 g 118,65 Azul de metileno 25 g 55200,0000 0,10 g 220,80 Glicerol o glicerina 99,5 % pureza 1000 ml 20815,0000 2,00 ml 41,63

Subtotal 14820,32


Materiales Cantidad del material comprado




Membranas de filtración Millipore (blanca) 25 mm de díametro y 0,47 Mm por poro

100 unidades 139151,15 3 membranas 4174,53

Papel Aluminio 1 unidad (7 m) 1950,00 100 cm = 1 m 278,57 Pabilo 1 unidad (500m) 650,00 4 m 5,20 Papel Kraft 1 unidad (2 m*10 m) 1500,00 1 m 150,00 Motas de algodón 1 Unidad (100 motas) 1928,55 40 motas 771,42 Gasa estéril 1 Unidad (2 retazos) 454,00 7 retazos 1589,00 Detergente 1 Unidad (850 ml) 3105,00 20 ml 73,06 Cloro 1 Unidad (2000 ml) 1639,90 20 ml 16,40 Fósforos 1 Unidad (50 cerillos) 200,00 2 cerillos 8,00


Mascarilla 1 Unidad (5 máscaras) 3188,95 2 mascarillas 1275,58 Toallas de papel absorbente 1 Unidad (100 toallas) 1500,00 10 toallas 150,00

Subtotal 12197,06

Miembros Tiempo consumido

(horas) Sueldo por hora (Bs)



8 horas - 2 hombre (2 analistas)

3129,86 25038,89


Supervisor del laboratorio 8 horas - 1 hombre 3129,86 25038,89

Subtotal 75116,67

TOTAL 102134,50Bs53,20$(



IV.1.8. COSTOS PRIMARIOS ASOCIADOS A LA DETERMINACIÓN DE BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE A NIVEL DE LABORATORIO (año 2005) COSTOS POR CADA ANÁLISIS (DUPLICADO + BLANCO) Tabla 20. Costos por análisis de Reactivos, Materiales y mano de obra en la determinación de Bacterias sulfato-reductoras en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte




Costo del reactivo utilizado (Bs)

Lactato de sodio al 50 % 1000 ml 120750,00 5,55 ml 670,16 Cloruro de amonio p.a 500 g 48300,00 1,00 g 96,60

Potasio fosfato dibásico p.a 1000 g 66700,00 0,50 g 33,35

Sulfato de magnesio extra puro 1000 g 76475,00 2,03 g 155,12

Sulfato de sodio extra puro 1000 g 37375,00 0,50 g 18,69

Alcohol Isopropílico 70% 120 ml 767,05 120,00 ml 767,05 Cloruro de calcio

dihidratado al 95 % 1000 g 89700,00 0,10 g 8,97

Ácido tioglicólico al 80 % 500 ml 152490,00 0,10 ml 30,50 Amonio (II) sulfato

hexahidratado (sal de MOHR) p.a

500 g 56350,00 0,0010 g 0,11

Cloruro de magnesio p.a 1000 g 80500,00 1,90 g 152,95 Potasio fosfato monobásico p.a 1000 g 82800,00 6,80 g 563,04

Hidróxido de sódio p.a 1000 g 36800,00 20,00 g 736,00 Subtotal 3232,54


Materiales Cantidad del

material comprado




Jeringas estériles de 10 ml

1 unidad (1 jeringa) 893,75 3 jeringas 2681,25

Jeringas estériles de 5 ml

1 unidad (1 jeringa) 390,00 2 jeringas 780,00

Papel Aluminio 1 unidad (7 m) 1950,00 50 cm = 0,5 m 139,29

Pabilo 1 unidad (500m) 650,00 0,5 m 0,65

Motas de algodón 1 Unidad (100 motas) 1928,55 10 motas 192,86

Gasa estéril 1 Unidad (2 retazos) 454,00 1 retazos 227,00

Detergente 1 Unidad (850 ml) 3105,00 10 ml 36,53


Guantes estériles 1 Unidad (1 par de guantes)

1852,65 2 pares 3705,30




Tubos de ensayo estéril al vacío

descartables (11 ml)

1 Unidad (100 tubos) 32154,00 3 tubos 964,62

Subtotal 8416,65

Miembros Tiempo consumido (horas)



Analista de laboratorio 3129,86 12519,44

Analista de laboratorio

4 horas - hombre (2 analistas)

3129,86 12519,44


Supervisor del laboratorio 4 horas-1 hombre 3129,86 12519,44

Subtotal 37558,32

TOTAL 49207,51 Bs 25,63 $(



IV.1.9. COSTOS PRIMARIOS ASOCIADOS AL KIT MICROBIOLÓGICO (PROTOTIPO) PARA LA DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE (año 2005)

Tabla 21. Costos por análisis de Reactivos, Materiales y mano de obra del Kit Microbiológico para la determinación de microorganismos aerobios mesófilos en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte




Costo del reactivo utilizado

(Bs) M-Tryptone Glucose Extract Broth (MTGE) 500 g 140360,00 0,90 g 252,65 Fluid Thioglucollate Medium 500 g 82800,00 1,49 g 246,33 Tryptone Soya Broth (TSB) 500 g 78430,00 1,50 g 235,29 Triton X-100 3785 ml 251100,00 0,05 ml 3,32 Cloruro de Sodio 500 g 250,00 0,085 g 0,04 Hidróxido de Amonio al 25 % 2500 ml 50600,00 0,30 m 6,07

Subtotal 743,70

Materiales Costos de los materiales (Bs)

9 envases de plástico transparente con capacidad de 20 cc (con rosca esterilizables) 5175,00 3 tubos de ensayo de 9 cc 5126,70 3 envases de plástico con capacidad de 11 cc (con rosca esterilizables) 931,50 3 cm = 0,03 m de papel de aluminio 8,36 3 Membranas Millipore de 25 mm de diámetro y 0,45 micrones por poro 4364,28 1 Jeringa modificada estéril de 100 cc (equipo de filtración) (resistente al autoclave) 25000,00 Tijera metálica 3563,85 Pinza metálica 3500,00 3 Jeringas estériles desechables de 20 cc 557,75 6 Guantes estériles 11115,90 1 Mechero portátil de alcohol 17710,00 1 Botella con 120 cc de alcohol isopropílico al 70 % v/v 767,05 1 Paquete de algodón (25 g) 669,30 1 Mascarilla 637,79 1 Frasco de plástico recolector del fluido filtrado 235,75


3 Envases de 500 cc de vidrio (cara interna estéril) utilizados para las tomas de muestras 3000,00 Caja de fósforos 200,00 Detergente líquido 18,26

Subtotal 82581,50

Miembros Tiempo

consumido (horas)




2 horas - hombre (2 analistas) 3129,8600 6259,72


Supervisor del laboratorio 2 horas - hombre 3129,8600 6259,72 Subtotal 18779,17

TOTAL 157504,37 Bs82,03$


IV.1.10 COSTOS PRIMARIOS ASOCIADOS AL KIT (PROTOTIPO) PARA LA DETERMINACIÓN DE BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN LAS MUESTRAS DE TURBOKEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE (año 2005) COSTOS PARA 5 ANÁLISIS Tabla 22. Costos de Reactivos, Materiales y mano de obra, para 5 análisis, del Kit Microbiológico (Prototipo) para la determinación de bacterias sulfato-reductoras en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte




Costo del reactivo utilizado (Bs)

Lactato de sodio al 50 % 1000 ml 120750,00 5,55 ml 670,16

Cloruro de amonio p.a 500 g 48300,00 1,00 g 96,60

Potasio fosfato dibásico p.a 1000 g 66700,00 0,50 g 33,35

Sulfato de magnesio extra

puro 1000 g 76475,00 2,029 g 155,12

Sulfato de sodio extra puro 1000 g 37375,00 0,50 g 18,69

Alcohol Isopropílico 70% 120 ml 767,05 120,00 ml 767,05

Cloruro de calcio dihidratado al 95 % 1000 g 89700,00 0,10 g 8,97

Ácido tioglicólico al 80 % 500 ml 152490,00 0,10 ml 30,50

Amonio (II) sulfato hexahidratado (sal

de MOHR) p.a 500 g 56350,00 0,0010 g 0,11

Cloruro de magnesio p.a 1000 g 80500,00 1,90 g 152,95

Potasio fosfato monobásico p.a 1000 g 82800,00 6,80g 563,04

Hidróxido de sódio p.a 1000 g 36800,00 20,00 g 736,00

Subtotal 3232,54


Materiales Cantidad del material comprado



Costo del material

utilizado (Bs)Jeringas estériles de 10

ml 1 unidad (1 jeringa) 893,75 5 jeringas 4468,75

Jeringas estériles de 5 ml 1 unidad (1 jeringa) 390,00 5 jeringas 1950,00

Papel Aluminio 1 unidad (7 m) 1950,00 50 cm = 0,50 m 139,29 Pabilo 1 unidad (500m) 650,00 0,5 m 0,65

Motas de algodón 1 Unidad (100 motas) 1928,55 10 motas 192,86 Gasa estéril 1 Unidad (2 retazos) 454,00 1 retazos 227,00 Detergente 1 Unidad (850 ml) 3105,00 10 ml 36,53






Tubos de ensayo estéril al vacío descartables (11 ml)

1 Unidad (100 tubos) 32154,00 5 tubos 1607,70

Subtotal 16976,96

Miembros Tiempo consumido (horas)




4 horas - 2 hombre (2 analistas) 3129,86 12519,44


Supervisor del laboratorio 4 horas-1 hombre 3129,86 12519,44

Subtotal 37558,33

TOTAL 57767,83 Bs30,09$


IV.2 ANÁLISIS DE RESULTADOS IV.2.1. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LA DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE En la realización de este análisis se pudo observar que dos de las tres

muestras estudiadas estaban contaminadas con microorganismos aerobios

mesófilos (Ver Tabla 12), específicamente el Turbo Combustible Jet A1

(muestra 4) resultó contaminado debido a que los tres caldos empleados

presentaron enturbiamiento, mostrándose el mismo hecho en la muestra de

Fluido de Corte. Por el contrario, el Turbo Combustible Jet A1 (muestra 2) no

resultó contaminado, puesto que no se observó enturbiamiento de los caldos

utilizados.

En cuanto al Jet A1 (muestra 2), la observación de los caldos se realizó

diariamente, notándose que, al cabo de los 7 días (período máximo de

incubación) no había ningún cambio de color en los caldos que indicara

contaminación microbiana (Ver Figura 20). Esta presumible ausencia de

contaminación microbiológica se puede atribuir a un mantenimiento

adecuado por parte del personal encargado de ello, especialmente por el

drenado del tanque regularmente; este hecho se pudo evidenciar durante la

fase de toma de muestra en la cual no se observó la presencia de agua al ser

drenado el combustible, medio donde se suelen alojar y desarrollar los

microorganismos.


En los caldos de cultivo de la muestra 4 (Jet A1) se percibió enturbiamiento al

segundo día del período de incubación, hecho que sugirió la contaminación

microbiana de dicha muestra. (Ver Figura 21). Esto se evidenció por la

presencia de una película y de un precipitado blanco en los tres medios de

cultivo utilizados, percibiéndose, además, un olor desagradable. En cierta

forma, estos eran los resultados esperados debido a que la muestra

presentaba una interfase (agua/combustible), fácilmente apreciable, con

presencia de limo y partículas sólidas, siendo éstas condiciones muy

favorables para el crecimiento y desarrollo de microorganismos. Resulta

importante tomar en consideración que la muestra fue tomada de una

aeronave inoperativa, en el Aeropuerto La Carlota, facilitando, con esto, el

desarrollo microbiano. Ésta podría ser una de las posibles causas de las

picaduras observadas en las paredes del tanque, ya que, algunos sub-

productos del metabolismo (metabolitos) de los microorganismos aerobios

están constituidos por ácidos, compuestos de azufre y dióxido de carbono los

cuales atacan de forma directa los materiales que componen el tanque. Este

resultó ser un claro ejemplo de corrosión inducida por microorganismos.

Es importante destacar que el tanque de almacenamiento, del cual se surtió y

se surte de combustible esta aeronave, es del tipo subterráneo, lo cual

dificulta el mantenimiento y limpieza del mismo, dándose las condiciones

necesarias para la aparición de actividad microbiana.


Del mismo modo, al analizar el Fluido de Corte, se observó un cambio de

coloración en los tres medios de cultivo, con la presencia de un precipitado

blanco, olor desagradable y enturbiamiento que fue detectado al segundo día

del período de incubación (Ver Figura 22). Es importante acotar que el fluido

en evaluación es del tipo emulsión de 5% Aceite Venosoluble y el resto de

agua, de acuerdo a la formulación del fabricante.

Como ya es sabido, el agua es uno de los factores principales que propician

el crecimiento de microorganismos en fluidos de corte, los cuales degradan el

fluido ocasionando un déficit en el rendimiento de sus funciones de

lubricación o refrigeración, según sea el caso; esto trae como consecuencia

directa el desgaste de las piezas metálicas, unido a la formación de biomasa

y biopelículas que se adhieren a las paredes de la tubería causando

disminución del diámetro, afectando el caudal del fluido y en los peor de los

casos obstrucción.

En esta prueba se utilizaron tres medios de cultivo diferentes con la finalidad

de abarcar un mayor rango de microorganismos aerobios que pudiesen estar

presentes en los fluidos estudiados. Esto se debe a que los tres medios de

cultivo varían en su composición, dando, así, mayores opciones de nutrientes

a los microorganismos que necesiten de uno u otro compuesto para su

crecimiento y desarrollo (Ver Anexo D). Cada uno de estos medios son


productos comerciales, científicamente probados, cuyas composiciones

permiten el desarrollo de una amplia variedad de microorganismos aerobios.

IV.2.2. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LA DETERMINACIÓN DE PSEUDOMONAS AEROGINOSAS Y HONGOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE, PRESENTES EN LOS CALDOS CONTAMINADOS (TURBIOS) POR MEDIO DE REPIQUES En las placas con Cetrimide Agar (medio selectivo para Pseudomonas

aeroginosas) se observó crecimiento de microorganismos evidenciado por la

presencia de una coloración blanca en la mayoría de las ellas (Ver Tabla 14),

lo cual sugirió la ausencia de Pseudomonas aeroginosas, ya que estos

microorganismos son fácilmente distinguibles macroscópicamente,

manifestándose con una coloración verde-amarillenta cuando son expuestas

al Cetrimide Agar. Este agar estimula la producción de fluoresceina y

pioscianina, compuestos responsables de la pigmentación de estas

bacterias.

Específicamente, en las placas en las cuales se realizó el repique de la

muestra 2 (Jet Fuel), no se encontró indicio alguno de crecimiento de

microorganismos, ya que, las placas, al cabo de 4 días no mostraban un

cambio apreciable (Ver Figura 26), lo cual indica la ausencia de

Pseudomonas aeroginosas. Cabe destacar, que a pesar que los medios

líquidos no presentaban enturbiamiento (razón por la cual se debería

desechar la necesidad de realizar repiques), se decidió hacer repiques a esta


muestra sólo a manera de control de la metodología aplicada. De la misma

forma, se realizó con los blancos.

En las placas de la muestra 4 (Jet Fuel), se observó un escaso crecimiento

de microorganismos en los repiques de los tres medios de cultivo líquido

utilizados al cabo de 2 días, evidenciado por la presencia de pequeños

puntos blancos de aspecto viscoso (Ver Figura 27); estos resultados

descartaron la hipótesis de posible presencia de Pseudomonas aeroginosas

en el combustible. Una de las posibles causas por la cual no se encontraron

este tipo de bacterias en el fluido, es el uso de Biobor JF por parte del

personal encargado del mantenimiento del combustible. Éste es un biocida

especialmente formulado para inhibir el crecimiento de Pseudomonas

aeroginosas y Cladosporium resinae, por lo tanto, el crecimiento observado

debe corresponder a otro tipo de microorganismo a cuya identificación

escapa de los límites de este trabajo.

En los repiques de la muestra del Fluido de Corte se observó crecimiento de

microorganismos de coloración blanca y aspecto viscoso, descartándose, por

razones explicadas anteriormente, la existencia de Pseudomonas

aeroginosas (Ver Figura 28).


Se seleccionó el Cetrimide Agar debido a que es un medio selectivo al

microorganismo a analizar (Pseudomonas aeroginosas), además de ser un

producto comercial y científicamente probado.

En las placas con Sabouraud Dextrosa Agar (medio selectivo para hongos)

se determinó que, en el repique de la muestra 2, no hubo crecimiento de

microorganismos en los medios líquidos empleados, por lo tanto, se puede

inferir que en esta muestra no hay presencia de hongos. (Ver Figura 23).

En los repiques de la muestra 4 (Jet Fuel), se observó la presencia de

superficies lisas, de coloración blanca y aspecto seco (costras blancas) en

los tres medios líquidos utilizados (Ver Figura 24); este crecimiento responde

claramente a la forma macroscópica de las levaduras. Adicionalmente, en las

placas con los repiques de los medios líquidos m-TGE y Tioglicolato, se

observó un crecimiento de microorganismos de coloración blanca y aspecto

cremoso que podría estar asociado a un crecimiento bacteriano o a un

desarrollo de hongos. La presencia de hongos en este tipo de muestra se

debe, posiblemente, a que éstos crecen en ambientes ácidos, es decir, con

un pH<7, condición que se pudiese encontrar en el combustible debido a que

los productos de metabolismo de los microorganismos suelen ser ácidos,

además este fluido presentaba una interfase agua/combustible favorable

para su crecimiento.


En cuanto a los repiques del Fluido de Corte, se observó que en todas las

placas presentaban crecimiento de microorganismos. En el repique de los

medios Tioglicolato y m-TGE, se pudo apreciar la presencia de

microorganismos de aspecto cremoso y de coloración blanca (posiblemente

presencia de levaduras), y también se apreció en el repique del medio TSB,

aunque en menor escala y acompañada con la presencia de un hongo

filamentoso, fácilmente detectable a simple vista (Ver Figura 25).

La selección del Sabouraud Dextrosa Agar en este estudio se debió a que es

un medio selectivo a hongos, debido a que su pH ácido (5.6) inhibe

parcialmente el crecimiento de bacterias, además de ser un producto

comercial y científicamente probado.

IV.2.3 ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS DE LA TINCIÓN DE GRAM PARA VERICAR LA PRESENCIA O AUSENCIA DE PSEUDOMONAS AEROGINOSAS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE EN PLACAS CON CETRIMIDA AGAR CONTAMINADAS A pesar que ninguna de las cápsulas de Petri con Cetrimide Agar

presentaban crecimiento de Pseudomonas aeroginosas, debido a la ausencia

de una coloración verdosa, se llevó a cabo un análisis microscópico para

confirmar su ausencia, para ello se realizaron tinciones de Gram en aquellas

placas que presentaban crecimiento (placas correspondiente a las muestras

4 y Corte), observándose una coloración violeta que refleja la presencia de

cocos (Gram positivos) (Ver Figura 29 y 30). La ausencia de una coloración


rosada confirma que las muestras no contenían Pseudomonas aeroginosas

que se caracterizan por ser bacilos, Gram negativos.

IV.2.4 ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LA DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE BACTERIAS SULFATO REDUCTORAS ANAEROBIAS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE En la realización de este análisis se pudo observar que las muestras 4, 9 y

10 (Jet Fuel) resultaron contaminadas con bacterias sulfato-reductoras

anaerobias, utilizando el Medio Starkey (Ver Tabla 16), lo cual se evidenció

por la presencia de un precipitado negro; y las muestras 2, 7, 8 (Jet Fuel) y

Corte no resultaron contaminadas, ya que no se observaron cambios durante

la observación a lo largo de 21 días (período máximo de incubación) (Ver

Figura 31, 33, 34 y 37).

Es importante resaltar que las bacterias sulfato-reductoras crecen en la

interfase agua/fluido hidrocarbonado derivado del petróleo, es por ello, que

en las muestras 2, 7 y 8 no hubo crecimiento anaeróbico debido a la

ausencia de esta interfase. En cuanto al Fluido de Corte, aún y cuando se

está en presencia de un medio acuoso, no se observó crecimiento de

bacterias sulfato-reductoras (Ver Figura 37); esto pudo deberse a una posible

aireación del fluido lo cual impidió el desarrollo de éstas, puesto que, las

bacterias sulfato-reductoras necesitan un medio muy reductor y mueren en

presencia de oxígeno porque son incapaces de eliminar productos tóxicos

provenientes de su metabolismo con el oxígeno como: peróxido de


Hidrógeno (H2O2), superperóxidos (O2-) y radicales de hidroxilos (OH-). Los

aerobios contienen una enzima que descompone estos productos tóxicos, los

cuales no poseen los anaerobios, tal como se presentan en las siguientes

reacciones:

O2 + e- → 2O2-(Superperóxido)

O2- + 2H+ → H2O2 (Peróxido de Hidrógeno)

H2O2 + e- → H2O + OH- (Radical hidroxilo) ♣

En cuanto a las muestras 4, 9 y 10, se evidenció la presencia de un

precipitado negro. En la muestra 4 se apreció este precipitado al cabo de 16

días, lo que demuestra la presencia de bacterias sulfato-reductoras

anaeróbicas (Ver Figura 32). Este precipitado negro se debe a la formación

del H2S (producto de metabolismo de las bacterias sulfato-reductoras), el

cual reacciona con el Hierro (Fe+2) presente en el Medio, como Sulfato

Ferroso de Amonio ((NH4)2SO4.FeSO4.6H2O) dando lugar a la formación de

sulfuro de hierro II (FeS) cuya coloración es negra.

♣ Fuente:S/A;S/F; “Crecimiento Microbiano”. S/L. (2005). Disponible en: http://docencia.uda.edu.co/bacteriologia/MicrobiologiaAmbiental/microbiologia_2.pdf


El H2S, producto del metabolismo de las bacterias sulfato-reductoras, se

forma a partir del Lactato de Sodio y las Sales de Sulfato, tal como se

muestra en la siguiente reacción:

2 CH3HOCHCOO- + SO4= → 2CH3COO- + H2S + 2 HCO3

- ♥

Luego, el H2S metabolizado por las bacterias sulfato-reductoras, reacciona

con el Hierro presente en el medio, formando un precipitado negro

correspondiente al FeS, según lo muestra la reacción siguiente:

Fe+2 + H2S → FeS + 2H+

La presencia de este tipo de bacterias en la muestra 4, posiblemente, se

deba a que el avión, de cuyo tanque se tomó la muestra, estaba inoperativo,

lo cual debe haber favorecido el crecimiento de bacterias sulfato-reductoras

unido a la presencia de limo (producto del metabolismo de microorganismos

aerobios) que propicia un ambiente anóxico, obstaculizando el paso del

oxígeno hacia el fondo del tanque.

Como ya se mencionó anteriormente, las bacterias sulfato-reductoras crecen

en ambientes acuosos libres de oxígeno; condición que se daba en la

muestra 4, ya que ésta presentaba una interfase combustible/agua fácilmente

distinguible. ♥ Fuente: S/A; S/F; (2002). “Activity and Diversity of Sulfate-Reducing Bacteria in a Petroleum Hydrocarbon-Contaminated Aquifer”. (2005). Disponible en: http://ccee.oregonstate.edu/research/grl/push-pull/pdf/kleikemper_et_al2002.pdf


En cuanto a las muestras 9 y 10, éstas fueron incluidas en el análisis con el

objetivo de disponer de un patrón con el cual se pudiese comparar los

resultados a obtener por la presencia de bacterias sulfato-reductoras. Estas

muestras, antes de analizarlas, se conocía que contenían estas bacterias,

porque fueron suministradas por personal especializado que previamente

habían inoculado bacterias sulfato-reductoras en ellas. Al aplicar la

metodología de análisis a estas muestras, se obtuvo como resultado la

aparición de un precipitado negro, tal como era de esperarse, al cabo de 15 y

16 días para las muestras 9 y 10 respectivamente (Ver Figura 35 y 36).

IV.2.5. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS DE LA PUESTA EN MARCHA DEL KIT MICROBIOLÓGICO (PROTOTIPO) PARA LA DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE En este estudio se diseñó y elaboró un Kit microbiológico prototipo, a

pequeña escala y para que fuese de fácil manipulación, fundamentado en la

misma metodología empleada a nivel de laboratorio para determinar la

presencia de microorganismos aerobios mesófilos, es decir, que se llevó a

cabo de forma paralela y en condiciones similares a los estudios realizados

en el laboratorio. De hecho, las muestras 4 y Corte resultaron positivas a la

presencia de microorganismos aerobios mesófilos en la puesta en marcha

del kit microbiológico, así como a nivel de laboratorio (Ver Figura 40 y Figura

41). De la misma forma, la muestra 2, no resultó contaminada en la puesta


en marcha del kit microbiológico prototipo ni en la aplicación a nivel de

laboratorio. (Ver Figura 39 y Tablas 13, 18)

IV.2.6 ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS DE LOS DE COSTOS ASOCIADOS A LOS ESTUDIOS REALIZADOS Una vez conocido cuáles son los materiales, equipos y reactivos utilizados en

cada una de las metodologías, se procedió a realizar un estudio de los costos

asociados a cada análisis llevados a cabo a nivel de laboratorio, así como

también, de los “Kits (prototipo) microbiológicos” preparados.

Debido a que actualmente en Venezuela no se llevan a cabo análisis

microbiológicos en fluidos hidrocarbonados derivados del petróleo, ni se

producen ni comercializan kits que permitan detectar actividad microbiana en

dichos fluidos, se decidió realizar una comparación directa de los costos de

los análisis y kits microbiológicos (prototipos) desarrollados en el presente

trabajo, con los precios ofrecidos por Laboratorios BIOSAN (un prestigioso

Laboratorio ubicado en Michigan, Estados Unidos) con la finalidad de

conocer si los kits y análisis realizados se encuentran dentro de un rango

económicamente aceptable.

A continuación se muestra una tabla comparativa de los costos asociados a

los análisis desarrollados en el presente trabajo con los precios ofrecidos por

Laboratorios BIOSAN (Ver Tabla 23).


Tabla 23. Tabla comparativa que incluye los precios ofrecidos por Laboratorios BIOSAN y los costos asociados a la metodología desarrollada en el presente trabajo (en $) para los diferentes estudios realizados

Tipo de Análisis Precio ofrecido por

Labotatorios BIOSAN ($)

Costos asociados a la metodología

desarrollada en el presente trabajo

(Tesis) ($)

Comparación relativa

porcentual entre los precios

BIOSAN vs. Tesis (%)

Determinación de la presencia de microorganismos aerobios a nivel de Laboratorio

45,35 34,12 32,91

Determinación de la presencia de Pseudomonas y Hongos a nivel de Laboratorio

86,75 53,20 63,06

Determinación de Bacterias sulfato-reductoras a nivel de Laboratorio

38,50 25,63 50,21

Kit Microbiológico para la determinación de microorganismos aerobios (incluye incubadora portátil)

376,75 82,03 359,28

Kit Microbiológico para la determinación de bacterias sulfato-reductoras (incluye incubadora portátil)

55,75 30,09 85,28

En los datos de la tabla anterior (Tabla 24) se puede observar que los costos

primarios asociados a las metodologías llevadas a cabo en el presente

trabajo están por debajo de los precios ofrecidos por Laboratorios BIOSAN

para metodologías similares.


Es importante resaltar que los costos presentados para el desarrollo de la

metodología en cuestión consisten en costos primarios, que son la suma de

los elementos directos del costo, es decir, el conjunto formado por la materia

prima directa y por la mano de obra directa, sin tomar en consideración los

costos secundarios (servicios, depreciación de activos, alquiler, etc.) que

podrían incrementarlo. De igual forma, estos estudios son preliminares, lo

que implica que se podría optimizar tanto materiales, reactivos y todo lo

relacionado a la metodología en cuestión a fin de lograr un mayor

rendimiento de los mismos.

Se podría realizar un estudio económico más profundo, por parte de un

personal especializado en el área contable, a fin de tomar en consideración

todo aquello que implique costos secundarios, intangibles y por

comercialización de los servicios que se pudiesen ofrecer a nivel de

Laboratorio y de los Kits

CAPÍTULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

“Conclusión es el lugar donde

llegaste cansado de pensar.”

Anónimo

“Dar un buen consejo es un oficio tan

común que lo usan muchos y lo saben

hacer muy pocos.”

Fray Antonio de Guevara

Capítulo V. Conclusiones y Recomendaciones 158

V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

V.1 CONCLUSIONES

A través de la realización del presente trabajo se obtuvieron las conclusiones

siguientes:

1. Mediante las metodologías aplicadas a nivel de laboratorio se pudo

desarrollar un protocolo para realizar análisis microbiológico en Turbo

Kerosinas y en Fluidos de Corte.

2. Por medio de las técnicas llevadas a cabo en el laboratorio se pudo

determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos (en

general), Pseudomonas aeroginosas, hongos (en general) y bacterias

sulfato reductoras presentes en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte.

3. A través del desarrollo de los análisis realizados, se pudo constatar

que la Universidad Metropolitana cuenta con las instalaciones y ciertos

equipos necesarios para realizar análisis microbiológico, mas es

necesario la adquisición de nuevos equipos que garanticen un

correcto análisis microbiológico en las condiciones asépticas

pertinentes.

4. Mediante la realización de este trabajo se pudo elaborar Kits

microbiológicos (prototipos), de fácil manipulación que permiten

efectuar análisis microbiológico in situ en Fluidos de Corte y en Turbo

Combustibles de Aviación.


5. Se pudo notar que la fase más importante en el desarrollo del análisis

microbiológico es la Toma de Muestra, ya que, ésta puede afectar

significativamente los resultados experimentales obtenidos.

6. Una de las causas más importantes que provocan la contaminación

microbiana de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte, es la presencia de

una fase acuosa, además de un ambiente nutritivo que propicie el

crecimiento de microorganismos, aunado al mal manejo de dichos

fluidos por parte de los operadores (falta de drenaje de tanques e

higiene periódico de los mismos).

V.2. RECOMENDACIONES

En base a los estudios realizados:

1. Se sugiere que en próximas investigaciones se establezcan

metodologías de análisis que determinen el número de colonias

presentes en las muestras para tener una idea del grado de

contaminación microbiana o el grado de higiene con la que se han

manipulado los fluidos.

2. Se propone realizar estudios relacionados con la elaboración de análisis

microbiológicos en combustibles (en general) y en fluidos lubricantes,

para una búsqueda de biocidas que permitan remediar y controlar la

presencia de microorganismos que puedan afectar seriamente los

fluidos y los sistemas donde se encuentran contenidos.


3. Se recomienda que al finalizar la experimentación, se coloque en

autoclave o se esterilice los materiales que posiblemente contengan

material biológico (microorganismos) a fin de evitar una contaminación

microbiana en el lugar de trabajo.

4. Se propone realizar un estudio de los Combustibles y Fluidos de Corte

que contemple el efecto de la contaminación microbiana en las

propiedades físicas de éstos, comparándolos con combustibles y Fluidos

que se encuentren en óptimas condiciones.

5. Se sugiere determinar específicamente el tipo de microorganismo

hallado en los análisis, mediante pruebas bioquímicas y microscópicas

que permitan su identificación.

6. Se propone a las autoridades competentes de la Universidad

Metropolitana la adquisición de una campana de flujo laminar, así como

de todos aquellos elementos que permitan el correcto

acondicionamiento y mantenimiento (higiene y asepsia) del Laboratorio

para realizar análisis microbiológicos.

7. Se recomienda mantener siempre, dentro del grupo de muestras

analizadas, un blanco a fin de tener un control de los medios

preparados, además de utilizarse como patrón de comparación.

8. Para la búsqueda de otros tipos de microorganismos presentes en los

combustibles a analizar, se recomienda el uso de otros agares

selectivos, que permitan el crecimiento tanto de bacterias u hongos que

sean de interés en estudios posteriores.


9. Se propone la realización de un kit microbiológico con fines comerciales

que cumpla con especificaciones de diseño y presentación, de fácil

manipulación y disponibilidad, económicamente accesible a la población

interesada con la finalidad de determinar la presencia o no de

microorganismos en combustibles y fluidos de corte sin necesidad de

transportarse a un laboratorio de análisis especializado.

10. Para el cultivo de bacterias sulfato-reductoras, de un modo más

especializado y confiable, se recomienda el uso de una jarra anaeróbica

que permita alcanzar las condiciones anóxicas necesarias para el

crecimiento de este tipo de bacterias.

BIBLIOGRAFÍA

“Para la ciencia prefiero los libros

más recientes, para las letras

los más antiguos.”

Bulwer Lytton Libros:

1. CLAVELL, L., y PEDRIQUE, M.; 1983; Microbiología manual de métodos

generales; Universidad Central de Venezuela; Caracas. P. 11-15, 17-18,

35-37

2. HILL, E y Graham C. Hill. 2000. ECHA Microbiology Ltd, UK.

3. NÚÑEZ, M., GÓMEZ, M., y CARMONA, O.; 1991; Microbiología médica

(tomo I); ediciones de la biblioteca de la Universidad Central de Venezuela;

Venezuela.

4. PASSMAN, Frederick; (S/F). Fuel and Fuel System Microbiology-

Fundamentals, Diagnosis, and Contamination Control. Estados Unidos.

5. (S/A). (2003). Tribology & Lubrication Technology. Volumen 59; N° 11.

Artículo: TRIBUTO A HAROLD ROSSMOORE, pág 20. Estados Unidos.

6. S/A, 1992. Seminario Técnico de Combustibles y Lubricantes de Aviación.

Corpoven. Caraballeda

Bibliografía 163

Medios electrónicos:

7. CALGARY, Alberta; (2003). Iron, Manganeso, Hydrogene Sulphide. (2005).

Disponible en:

http://www.davnor.com/articles/publications/bio_residential/ironfact.pdf

8. HAMLYN, P. (1982). Protoplast fusion and genetic analysis in

Cephalosporium acremonium. (2005). Disponible en:

http://fungus.org.uk/cv/thesis_fig5.9.htm

9. LABORDA, Roberto; (S/F). NTP 317: Fluidos de Corte: criterios de control

de riesgos higiénicos. (2005). España. Disponible en:

http://www.mtas.es/insht/ntp/ntp_317.htm

10. LEVIT, Bernardo; (2001). “Bio-films, una nueva manera de ver la

placa”.(2005) Disponible en: http://www.alientoassist.com/biofilm.htm

11. ROSSMOORE, H.; 1994; Metal Working Fluid Microbiology (capítulo 9);

Estados Unidos. Paper disponible en:

http://www.biosan.com/publication.htm

12. ROSSMOORE, H.; 1974; TECHNICAL PAPER: Microbiological causes of

cutting fluid deterioration; Creative Manufacturing Engineering Programs;

Estados Unidos. Paper disponible en:

http://www.biosan.com/publication.htm

13. (S/A). (2003). All microbiology news. (2005). Disponible en:

http://www.rapidmicrobiology.com/news/Show_News_List.php?sector=AllHi

st&m=MAY%202003.

14. S/A. (S/F). Guerra biológica

Anthrax I. (2005). Disponible en:

Bibliografía 164

http://www.estradadosol.fot.br/vestibular/temas/anthrax1.html

15. S/A. (S/F). afbreekbare plastics . (2005). Disponible en:

http://www.openleercentrum.be/Natutech/afbreekbare_plastics.htm

16. S/A. (S/F). Fungi Fusarium. (2005). Disponible en:

http://byebyemold.com/mold_images/images/fusarium/fusarium_c.html

17. S/A. (2001). Clasificación de las bacterias. (2005). Disponible en:

http://www.estradadosol.fot.br/vestibular/temas/anthrax1.htm

18. S/A. S/F. “Temas atuais relacionados á Biología”. (2005). Disponible en:

http://www.estradadosol.fot.br/vestibular/temas/anthrax1.htm

19. (S/A).(2003).All microbiology news. (2005). Disponible en:

http://www.rapidmicrobiology.com/news/Show_News_List.php?sector=AllHi

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20. S/A;S/F; “Crecimiento Microbiano”. S/L. (2005). Disponible en:

http://docencia.uda.edu.co/bacteriologia/MicrobiologiaAmbiental/microbiolog

ia_2.pdf

21. TODAR, K. (2004). Pseudomonas aeroginosa.(2005). Disponible en:

http://textbookofbacteriology.net/pseudomonas.html

22. VALDERRAMA BLANCO, Brenda. S/A. México. “Microbiología del petróleo

y sus derivados”. (2005). Disponible en:

http://biblioweb.dgsca.unam.mx/libros/microbios/Cap2/imagenes/c2im3.html

Publicaciones periódicas:

23. S/A. (2004, 11 de Diciembre). Autoridades esperan concluir hoy rescate de

víctimas de accidente aéreo. EL UNIVERSAL, pp. 4-10

ANEXOS

“... cosas que nos

quedan en el tintero a última hora”

Anónimo

ANEXO A. TURBOKEROSINA JET A1

Descripción

El Jet A-1 es el turbocombustible de uso civil más utilizado por las líneas de

aviación en el mundo. La Tabla II.8 proporciona las características o

propiedades físico-químicas del turbocombustible Jet A-1.

Propiedades y Características

Tabla A.1. Cifras típicas de los turbocombustibles (Jet A-1)

Propiedades / Características Jet A-1 Gravedad API a 15.6° C 45 Color Visual C/B Punto de Congelación, ° C -50 Azufre, %p 0.050 Punto de Inflamación, ° C 41 Acidez Total mg KOH/g 0.010 Punto de Humo, mm 25 Aditivo Antiestático SI Aditivo Anticongelante NO Aditivo Anticorrosivo NO Índice de Separación de Agua (WSIM) 95

Fuente: S/A, 1992. “Seminario Técnico de Combustibles y Lubricantes de Aviación”. Corpoven. Caraballeda.

Anexos 166

ANEXO B. ACEITE DE CORTE VENOSOLUBLE AW (ACEITE EMULSIONABLE PARA MECANIZADO)

Descripción

Es un aceite de corte emulsionable formulado para operaciones de corte y

mecanizado de metales blandos y ferrosos. Se elabora con bases lubricantes

y aditivos especiales de alta estabilidad térmica y antidesgaste de larga vida

y para condiciones severas de operación.

Propiedades y Características

Tabla A.2. Cifras típicas del aceite de corte Venosoluble Aw

Propiedades / Características Aceite de corte Venosoluble- Aw

Punto de inflamación, °C 180 Gravedad específica 15/15 °C, g/ml 0.88

pH de la emulsión al 10% 9.0 Protección al desgaste, mm. 0.6

Concentración mínima para protección anticorrosiva, % 5.0 Viscosidad a 40 °C, cSt 36 Compuestos Clorados No Aditivos antidesgastes Si Aditivos anticorrosivos Si

Fuente: Venoco; (S/F); VENOSOLUBLE AW; (2005); Venezuela Disponible en: http://www.venoco.com/Detalle.asp?id=35&id_linea=1

Anexos 167

ANEXO C. MEDIOS DE CULTIVOS SÓLIDOS

C.1 Sabouraud Dextrose Agar

Descripción

Medio de cultivo recomendado para el cultivo y desarrollo de hongos. El bajo

pH favorece el crecimiento de hongos

Composición (en gramos por litro)

Tabla A.3. Composición del medio Sabouraud Dextrose Agar

Composición Gramos por litro Polipeptona 10.0

Glucosa 40.0 Cloramfenicol 0.05

Agar 15.0

pH final a 25 °C: 5.6 ± 0.2

Fuente: (S/A); (S/F); Sabouraud Dextrose Agar; (2005); (S/L); Disponible en: http://www.britanialab.com/espanol/k02_55.html

Instrucciones

Suspender 65 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y

mezclar hasta uniformar. Calentar agitando frecuentemente y hervir 1 minuto

hasta disolver. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 118-121°C. Mantener en

lugar fresco.

C.2 Agar Cetrimida

Descripción

Medio recomendado para el crecimiento y desarrollo selectivo de

Pseudomonas aeroginosa.

Anexos 168


Tabla A.4. Composición del Agar Cetrimida

Composición Gramos por litro Peptona pancreática gelatina 20.0

Cetrimida 0.3 Cloruro magnésico 1.4

Sulfato potásico 10.0 Agar 13.6

pH final a 25 °C: 7.2 ± 0.2

Fuente: (S/A); (S/F); Cetrimide Agar; (2005); (S/L); Disponible en: http://www.britanialab.com/espanol/k01_57.html

Instrucciones

Suspender 45.3 g del polvo y 10 ml de glicerol en 1 litro de agua destilada. .

Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar agitando

frecuentemente y hervir 1 minuto hasta disolver. Distribuir y esterilizar 15

minutos a 118-121°C. Mantener en lugar fresco.

ANEXO D. MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS

D.1 Medio Tioglicolato

Descripción

Medio recomendado para el crecimiento y desarrollo de microorganismos

aerobios y anaerobios.

Anexos 169


Tabla A.5. Composición del Medio Tioglicolato

Composición Gramos por litro Peptona caseína 15.0

Glucosa 5.5 Cloruro de sodio 2.5

Rezasurina 0.001 L-cistina 0.5

Extracto de levadura 5.0 Tioglicolato sódico 0.5

Agar 0.75 pH final a 25 °C: 7.1 ± 0.2

Fuente: (S/A); (S/F); Thioglycolate medium; (2005); (S/L); Disponible en: http://www.nybro.cz/pdf/ENGLISH%20MANUAL.pdf

Instrucciones

Suspender 29.75 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y



lugar fresco.

D.2 “Tryptone Soy Broth” (TSB)

Descripción

Medio altamente nutritivo para el cultivo de una gran variedad de

microorganismos aerobios existentes (hongos y bacterias)

Anexos 170


Tabla A.6. Composición del “Triptone Soy Broth”

Composición Gramos por litro Peptona caseína 17.0 Peptona de soya 3.0 Cloruro de sodio 5.0

Fosfato dipotásico 2.5 Glucosa 2.5

pH final a 25 °C: 7.3 ± 0.2

Fuente: (S/A); (S/F); Triptone Soy Broth; (2005); (S/L); Disponible en: http://www.nybro.cz/pdf/ENGLISH%20MANUAL.pdf

Instrucciones




lugar fresco.

D.3 “m-Tryptone Glucose Extract Broth” (m-TGE)

Descripción

Medio recomendado para el crecimiento y desarrollo de microorganismos

aerobios mesófilos.

Tabla A.7. Composición del “m-Tryptone Glucose Extract Broth” (m-TGE)

Composición Gramos por litro Peptona caseína 9.0

Hidrolysate 6.0 Extracto de carne 2.0

Glucosa 1.0 pH final a 25 °C: 7.0 ± 0.2 Fuente: (S/A); (S/F); Tryptone Glucose Extract Broth; (2005); (S/L); Disponible en: http://www.nybro.cz/pdf/ENGLISH%20MANUAL.pdf

Anexos 171

Instrucciones




lugar fresco.

ANEXO E. REACTIVOS UTILIZADOS

Cloruro de sodio (NaCl)

Características: Polvo cristalino blanco

Tabla A.8. Propiedades del Cloruro de sodio (NaCl)

Propiedades Valor Peso molecular 58.44 g/mol Punto de fusión 804 °C

Punto de ebullición 1413 °C Solubilidad en agua a 20 °C 360 g/l

Densidad a 25 °C 2.14 g/ml Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm

Triton x-100 ([C16H26O2]n)

Características: Líquido cristalino espeso, surfactante no iónico, miscible en

agua.

Tabla A.9. Propiedades del Triton x-100: Alkilauril polieter alcohol ([C16H26O2]n)

Propiedades Valor Peso molecular 250.38 g/mol

Densidad a 25 °C 1.06 g/ml pH a 5 % en solución acuosa 6.00

Tensión superficial 31.00 dina/cm Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm

Anexos 172

Glicerina (C3H8O3)

Características: Líquido transparente e incoloro, miscible en agua y viscoso.

Tabla A.9. Propiedades de la glicerina (C3H8O3)

Propiedades Valor Peso molecular 92.10 g/mol Punto de fusión 17.8 °C

Punto de ebullición 290 °C Viscosidad a 20 °C 1400 mPas Densidad a 20 °C 1.47 g/ml

Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm

Safranina solución al 1 % p/v (C20H19ClN4)

Características: Líquido de color rojo cereza, utilizado para tinciones de

microscopia.

Tabla A.10. Propiedades de la safranina: 3,7-Diamino-2,8-Dimetil-5-Fenilfenacinio Cloruro (C20H19ClN4)


Densidad de la solución al 1 % 20 /4 °C 0.998 g/ml Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm

Violeta Cristal (C25H30ClN3)

Características: En solución es un líquido de color azul – violeta, en forma

sólida es un polvo de color verdoso, miscible con el agua y alcohol, utilizado

para tinción microscópica.

Anexos 173

Tabla A.11. Propiedades del violeta cristal: Hexametilpararrosanilina Cloruro (C25H30ClN3)


Solubilidad en agua a 25 °C 4.00 g/l Solubilidad en alcohol a 25 °C 30.00 g/l

Densidad de la solución al 2 % a 20/4 0.80 g/l Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm

Azul de Metileno (C16H18ClN3S.xH2O)

Características: En solución es un líquido de color azul, en forma sólida es

un polvo de color verdoso oscuro con lustre bronceado, miscible con el agua

y alcohol, utilizado para tinción microscópica.

Tabla A.12. Propiedades del azul de metileno: Tetrametiltionina Cloruro (C16H18ClN3S.xH2O)


Solubilidad en agua a 20 °C 40.00 g/l Solubilidad en alcohol a 25 °C 15.00 g/l

Punto de fusión 180 °C Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm

Lactato de Sodio (C3H5NaO3) solución al 50 %

Características: Líquido denso transparente e incoloro. Miscible con agua

Tabla A.13. Propiedades del lactato de sodio (C3H5NaO3)

Propiedades Valor Peso molecular 112.06 g/mol Densidad a 20/4 1.27 g/ml


Anexos 174

Cloruro de Amonio (NH4Cl)

Características: Polvo cristalino blanco, soluble en agua.

Tabla A.14. Propiedades del cloruro de amonio (NH4Cl)


Solubilidad en agua a 20 °C 370 g/l Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm

Fosfato Dibásico de Potasio (K2HPO4)

Características: Pequeños cristales blancos, utilizado para preparar

soluciones tampones de fosfato.

Tabla A.15. Propiedades del fosfato dibásico de potasio (K2HPO4)



Sulfato de Magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O)

Características: Pequeños cristales blancos

Tabla A.16. Propiedades del sulfato de magnesio heptahidratado, Sal de Epson (MgSO4.7H2O)



Anexos 175

Sulfato de Sodio (Na2SO4)

Características: Polvo cristalino blanco, higroscópico.

Tabla A.17. Propiedades del sulfato de sodio (Na2SO4)


Solubilidad en agua a 20 °C 162 g/l Densidad a 20 °C 2.68 g/ml Punto de fusión 884 °C


Acido Tioglicólico (C2H4O2S) solución al 80 %

Características: Líquido transparente e incoloro, miscible con el agua,

puede causar quemaduras graves si esta en contacto con la piel y/o

mucosas. Altamente peligroso.

Tabla A.18. Propiedades del Acido Tioglicólico (C2H4O2S) solución al 80 %


Densidad a 20 °C 1.27 g/ml Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm

Sulfato de Amonio Ferroso ((NH4)2SO4.Fe(SO4)2.6H2O)

Características: Cristales verde azulado.

Tabla A.19. Propiedades del sulfato de amonio ferroso, sal de Mohr ((NH4)2SO4.Fe(SO4)2.6H2O)


Densidad a 20 °C 1.86 g/ml Solubilidad en agua a 20 °C 269 g/l


Anexos 176

Hidróxido de sodio (NaOH) (perlas)

Características: Sólido blanco en forma de perlas, higroscópico, base fuerte

de alta peligrosidad, altamente irritante de la piel y mucosas.

Tabla A.20. Propiedades del hidróxido de sodio (NaOH)

Propiedades Valor Peso molecular 40 g/mol

Densidad a 20 °C 2.13 g/ml Solubilidad en agua a 20 °C 1090 g/l

Punto de fusión 318 °C Punto de ebullición 1390 °C


Potasio fosfato monobásico (KH2PO4)

Características: Pequeños cristales blancos, utilizado para preparar

soluciones tampones de fosfato.

Tabla A.21. Propiedades del potasio fosfato monobásico (KH2PO4) Propiedades Valor

Peso molecular 136.06 g/mol Solubilidad en agua a 20 °C 222 g/l

Densidad a 25 °C 2.34 g/ml Punto de fusión 252 °C


Cloruro de magnesio (MgCl2)

Características: Polvo blanco soluble en agua

Tabla A.22. Propiedades del cloruro de magnesio (MgCl2) Propiedades Valor

Peso molecular 95.25 g/mol Solubilidad en agua a 20 °C 300 g/l


Anexos 177

Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2.2H2O)

Características: Polvo cristalino blanco. Irritante al contacto directo.

Tabla A.23. Propiedades del cloruro de calcio dihidratado (CaCl2.2H2O)


Solubilidad en agua a 1 °C 1000 g/l Punto de fusión 175 °C


Anexos 178

ANEXO F. IDENTIFICACIÓN DE ALGUNOS MICROORGANISMOS EN LOS FLUIDOS ANALIZADOS

Tabla A.24. Identificación de algunos microorganismos en los fluidos analizados.

Placa analizada en el medio Sabouraud

Dextrosa Agar

Microorganismo identificado

(género) Descripción Características

JetA1/muestra 4/ medio líquido m-TGE

2/ placa 2

Levadura Cándida

Levadura Cándida: Presencia de colonias color blanco y aspecto cremoso

Levadura Cándida: Es una levadura que en el ser humano forma parte de la flora normal de la piel y mucosas (tracto respiratorio, gastrointestinal)


Aw/muestra Corte/ medio líquido TSB 1/

placa 1

Levadura Cándida / Hongo

filamentoso Fusarium

Levadura Cándida: Presencia de colonias color blanco y aspecto cremoso. Fusarium: Hongo filamentoso de coloración marrón

Levadura Cándida: Es una levadura que en el ser humano forma parte de la flora normal de la piel y mucosas (tracto respiratorio, gastrointestinal y tracto genital femenino). Fusarium: Se considera un contaminante puede causar infección en los ojos, sinusitis, e infecciones de piel. Este hongo suele madurar a los 4 días, forma colonias blancas y algodonosas al principio que luego se van tornando de color oscuro, con los bordes de color más claros.


Aw/muestra Corte/ medio líquido m-TGE

2/ placa 1

Levadura Cándida

Levadura Cándida: Presencia de colonias color blanco y aspecto cremoso

Levadura Cándida: Es una levadura que en el ser humano forma parte de la flora normal de la piel y mucosas (tracto respiratorio, gastrointestinal)

Fuente: Laboratorio de Bacteriología de la Clínica Santa Sofía. El Cafetal – Caracas.

Anexos 179

ANEXO G. IMAGEN TANQUE DE AERONAVE CON CONTAMINACIÓN MICROBIANA

Figura A.1. Imagen de un tanque de una aeronave de la Guardia Nacional (Sky Truck) que presentaba problemas de contaminación microbiana.

GLOSARIO

"Las palabras están ahí para explicar

el significado de las cosas, de manera

que el que las escucha, entienda

dicho significado."

Aldous Huxley

• Agar: Polisacárido que, por sus propiedades gelificantes, se utiliza en

la preparación de medios nutritivos para los cultivos.

• ASTM: Sociedad Norteamericana de Exámenes y Materiales

(American Society for Testing and Materials). Es una organización con

larga tradición de estandarización.

• Autótrofo: Organismo capaz de sintetizar materia orgánica utilizando

energía inorgánica

• Biocida: Sustancia química que destruye o detiene el desarrollo de

ciertos organismos

• Biomasa: Es el peso total de la materia viva de una parte de un

organismo, población o ecosistema

Glosario

181

• Celda galvánica: Celda electroquímica en la que reacciones químicas

espontáneas producen electricidad.

• Costos primarios o directos: Es la suma de los elementos directos

del costo, es decir, el conjunto formado por la materia prima directa y

por la mano de obra directa.

• Elastómeros: Son polímeros de cadenas entrecruzadas como los

termoestables, sólo que debido a la estructura de las cadenas que lo

constituyen presentan propiedades elásticas. Son los componentes

fundamentales de los cauchos: naturales, modificados, neopreno.

• Emulsión: Una emulsión es una mezcla estable y homogénea de dos

líquidos que normalmente no pueden mezclarse, (son inmiscibles

entre ellos

• Eucariotas: Son organismos que tienen la información genética

envuelta dentro de una membrana que forman el llamado núcleo

• Flagelo: Es un orgánulo externo que poseen algunas células, tanto de

organismos unicelulares o formando parte de seres pluricelulares, con

forma de látigo, que a través de su rotación, permite el desplazamiento

de estas células por un medio acuoso.

• Glucosa: Molécula carbohidrogenada que en cadenas ordenadas

forma celulosa y en asociación amorfa almidón. Ésta (C6H12O6) es una

hexosa (monosacárido de seis átomos de carbono) y además es un

aldehído (contiene un grupo -CHO)

Glosario

182

• Heterótrofo: Son aquellos que deben alimentarse con las sustancias

orgánicas sintetizadas por otros organismos

• Hidrofílica: Sustancias que presentan afinidad por el agua

• Hidrofóbica: Sustancia no afín con el agua

• Metabolismo: Conjunto de modificaciones que sufre una sustancia

desde su entrada en el interior de un organismo hasta su

transformación final.

• Metabolito: Sustancias originadas por la transformación metabólica

de sustancias en el interior de las células o de los seres vivos.

• Péptido: Pequeñas cadenas de aminoácidos.

• Procariota: Es un organismo vivo cuyo núcleo celular no está

envuelto por una membrana, en contraposición con los organismos

eucariotas, que presentan un núcleo verdadero o rodeado de

membrana nuclear.

• Sucrosa: Disacárido compuesto por glucosa y fructosa.

• Surfactante: Son sustancias que influyen por medio de la tensión

superficial en la superficie de contacto entre dos fases (p.ej. dos

líquidos insolubles uno en otro). Se componen de una parte

hidrofóbica o hidrófuga y un resto hidrofílica, o soluble en agua.

• Taxonomía: Es la parte de la biología que estudia la clasificación de

los seres vivos, los taxa (o taxones)

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