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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE
ESCUELA DE INGENIERIA
ANÁLISIS, MODELACIÓN Y
SIMULACIÓN DEL CRECIMIENTO DE Gibberella fujikuroi Y PRODUCCIÓN
DE ÁCIDO GIBERÉLICO SOBRE SUSTRATO SÓLIDO INERTE
CLAUDIO ANDRÉS GELMI WESTON
Tesis para optar al grado de Magister en Ciencias de la Ingeniería
Profesores Supervisores: RICARDO PÉREZ C. IVÁN SOLAR M.
Santiago de Chile, 1999.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE ESCUELA DE INGENIERIA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOPROCESOS
ANÁLISIS, MODELACIÓN Y
SIMULACIÓN DEL CRECIMIENTO DE Gibberella fujikuroi Y PRODUCCIÓN
DE ÁCIDO GIBERÉLICO SOBRE SUSTRATO SÓLIDO INERTE
CLAUDIO ANDRÉS GELMI WESTON
Tesis presentada a la Comisión integrada por los profesores:
RICARDO PÉREZ C.
IVÁN SOLAR M.
EDUARDO AGOSIN T.
GONZALO ACUÑA L.
BONIFACIO FERNÁNDEZ L.
Para completar las exigencias del grado de Magister en Ciencias de la Ingeniería
Santiago de Chile, 1999.
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A Claudio, Leonor, José Manuel y María Milagro, por todo el tiempo que me regalaron.
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AGRADECIMIENTOS Me gustaría agradecer a mis amigos: Andrea B., Andrea Ch., Ariel,
Guillermo, Ingrid, José Antonio, Kathleen, Lenka, Marcial, Mario y Mauricio. Gracias por su vital e incondicional ayuda.
Me gustaría agradecer además a FONDECYT N°1960360 y a la Beca Shell Chile, por su apoyo económico para la realización de esta tesis.
ÍNDICE GENERAL Pág.
DEDICATORIA ........................................................................................................... ii AGRADECIMIENTOS .............................................................................................. iii ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................ vii ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................. viii RESUMEN .................................................................................................................. ix ABSTRACT ................................................................................................................. x I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 11
1.1 Variables críticas de operación ................................................................ 12 1.1.1 Temperatura ..................................................................................... 13 1.1.2 Contenido de agua del lecho sólido ................................................. 13 1.1.3 pH......... ........................................................................................... 14 1.1.4 Agitación .......................................................................................... 14 1.1.5 Aireación .......................................................................................... 14
1.2 Modelación ............................................................................................... 15 1.2.1 Crecimiento de biomasa................................................................... 16 1.2.2 Producción de metabolitos secundarios ........................................... 18 1.2.3 Transferencia de masa y calor .......................................................... 18 1.2.4 Producción de ácido giberélico ........................................................ 20
II. ANÁLISIS Y TRATAMIENTO DE DATOS .................................................. 23 2.1 Materiales y métodos ............................................................................... 23
2.1.1 Preparación de biomasa y medio de cultivo .................................... 23 2.1.2 Control de la aw y temperatura ......................................................... 24 2.1.3 Cultivos y toma de muestras ............................................................ 24 2.1.4 Registro de O2 y CO2 instantáneos .................................................. 24 2.1.5 Determinación de biomasa total ...................................................... 25
2.1.6 Determinación de urea en el medio ................................................. 26 2.1.7 Determinación de la fuente de carbono ........................................... 26 2.1.8 Determinación del ácido giberélico ................................................. 26 2.1.9 Determinación de la velocidad máxima de crecimiento max .......... 26 2.10 Métodos estadísticos ........................................................................ 27
2.2 Resultados y discusión ............................................................................. 29 2.2.1 Crecimiento de biomasa................................................................... 29 2.2.2 Producción de GA3 .......................................................................... 32
III. MODELACIÓN Y SIMULACIÓN .................................................................. 36 3.1 Modelo ..................................................................................................... 36
3.1.1 Biomasa viva.................................................................................... 36 3.1.2 Biomasa medida ............................................................................... 36 3.1.3 Degradación de urea ........................................................................ 37 3.1.4 Degradación de la fuente de carbono ............................................... 37 3.1.5 Producción de GA3 .......................................................................... 38 3.1.6 Producción de CO2 .......................................................................... 38 3.1.7 O2 utilizado ...................................................................................... 38 3.1.8 Ecuaciones constitutivas .................................................................. 39
3.2 Estimación de parámetros ........................................................................ 40 3.2.1 Parámetros independientes del modelo ............................................ 40 3.2.2 Determinación de parámetros mediante ajuste de EDO .................. 43
3.3 Resultados y discusión ............................................................................. 45 3.3.1 Análisis de sensibilidad ................................................................... 49
IV. CONCLUSIONES ............................................................................................ 53 V. NOMENCLATURA ......................................................................................... 54 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................ 55 Anexo A: Cálculo de max .......................................................................................... 65 Anexo B: Curvas de crecimiento de biomasa medida................................................ 70 Anexo C: Gases instantáneos y degradación de urea ................................................. 71
Anexo D: Producción de ácido giberélico.................................................................. 72 Anexo E: Gases acumulados y RQ ............................................................................ 73 Anexo F: Degradación de almidón............................................................................. 74 Anexo G: Ajuste de las ecuaciones (3.16) y (3.17) .................................................... 75 Anexo H: Simulaciones de los cultivos ..................................................................... 76 Anexo I: Análisis de sensibilidad 25ºC y aw =0.992 .................................................. 80 Anexo J: Cálculo de la constante de muerte .............................................................. 81
vii
ÍNDICE DE TABLAS Pág.
Tabla 2.1: Modelos estadísticos ajustados a datos experimentales ............................ 27 Tabla 2.2: max para distintas condiciones de cultivo................................................. 29 Tabla 2.3: Biomasa final y GA3 máximo ................................................................... 32 Tabla 3.1: Parámetros del modelo bajo distintas condiciones de Tº y aw .................. 45 Tabla 3.2: Análisis de correlación .............................................................................. 46 Tabla 3.3: Parámetros más relevantes del análisis de sensibilidad ............................ 49
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ÍNDICE DE FIGURAS Pág.
Figura 2.1: Monitoreo y adquisición de datos ............................................................ 25 Figura 2.2: Biomasa, gases instantáneos y urea (25ºC, aw = 0.992) ........................... 30 Figura 2.3: CO2 acumulado ........................................................................................ 31 Figura 2.4: Producción de GA3 y consumo de urea (36ºC, aw = 0.999) ..................... 33 Figura 3.1: Análisis cualitativo de ecuaciones (3.10) y (3.11) ................................... 39 Figura 3.2: Ajuste de ecuaciones (3.16) y (3.17) ....................................................... 41 Figura 3.3: Resumen de la calibración del modelo .................................................... 43 Figura 3.4: Ejemplo de simulación 25ºC y aw = 0.992 ............................................... 47 Figura 3.5: Parámetros más relevantes del análisis de sensibilidad ........................... 50
ix
RESUMEN En este trabajo se estudia la influencia de factores físicos, tales como
temperatura (25, 31 y 36ºC) y actividad de agua (0.985, 0.992 y 0.999), además de factores nutricionales en el crecimiento del hongo Gibberella fujikuroi y la producción de ácido giberélico (GA3) sobre sustrato sólido inerte en columnas de Raimbault. Condiciones de temperatura de 31ºC y actividad de agua (aw) de 0.985-0.999 resultaron ser las mejores condiciones para la producción del metabolito, alcanzado valores aproximados de 0.70 (mg/g.s.i.).
Mediante experiencias a 25ºC aw = 0.992, 25ºC aw = 0.999, 31ºC aw = 0.985, 31ºC aw = 0.992 se desarrolló un modelo matemático de crecimiento sobre sustrato sólido inerte y producción de metabolito secundario.
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ABSTRACT This work presents the influence of the temperature (25, 31 and 36ºC),
the water activity (0.985, 0.992, 0.999) and the nutrients concentration (starch, urea) on Gibberella fujikuroi growth and gibberellic acid (GA3) production on inert support in Raimbault columns. The highest biomass concentration is reached when cultures are performed at 31ºC and water activity 0.985 or 0.999. The gibberellic acid concentration obtained under these conditions is 0.70 (mg/g.i.s.).
Experimental data (25ºC aw = 0.992, 25ºC aw = 0.999, 31ºC aw = 0.985, 31ºC aw = 0.992) have been used to developed a mathematical model for the growth of the fungus and gibberellic acid production.
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I. INTRODUCCIÓN En la mayoría de los procesos biotecnológicos comerciales, la producción
de enzimas y compuestos orgánicos son realizadas en exceso de agua libre. Este tipo de fermentaciones son conocidas como cultivos sumergidos y generalmente son llevadas a cabo en reactores agitados. En cambio, aquellas realizadas bajo condiciones restringidas de agua, se les denomina cultivos sobre sustrato sólido (CSS).
Específicamente, los procesos CSS se refieren al crecimiento microbiano y a la formación de productos sobre y en el interior de una matriz sólida, bajo condiciones de humedad restringida. En este caso, parte del agua se encuentra fuertemente ligada a las superficies sólidas, parte está débilmente ligada, y el resto puede existir en forma libre en las regiones capilares del material, sin exceder la capacidad de retención hídrica de la matriz. De esta manera, se pueden distinguir 4 fases. La primera de ellas, corresponde a la fase gaseosa, la cual generalmente fluye en forma continua a través del lecho sólido. La segunda fase consiste en un soporte insoluble, el cual contiene a la tercera fase, una solución acuosa rica en nutrientes. Finalmente, la cuarta fase corresponde al microorganismo propiamente tal, el cual crece dentro, alrededor y/o en los espacios libres del soporte [1].
Este tipo de procesos presenta varias características favorables para su desarrollo industrial. En primer lugar, mayores rendimientos, lo cual hace que el CSS sea económicamente viable. Lo anterior lleva a que los reactores sean de menor tamaño y, por lo tanto, que los costos de producción sean menores. Por último, esta tecnología genera una menor cantidad de efluentes, reduciendo el impacto ambiental y los costos de tratamiento [2].
A pesar de sus ventajosas características, los cultivos sobre sustrato sólido han tenido escasas aplicaciones en la industria. En parte ésto se explica debido a los problemas inherentes que enfrenta esta tecnología [2]: tasas relativamente lentas de crecimiento; capacidades limitadas para la disipación del calor metabólico generado; problemas en la transferencia de masa, en particular, en la difusión de nutrientes del sustrato al microorganismo; falta de sensores apropiados para este tipo
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de procesos; escasa investigación en modelos de reactores CSS, estrategias de control y procedimientos de escalamiento.
Aunque las bacterias y levaduras pueden crecer sobre un sustrato sólido, son los hongos filamentosos los microorganismos que mejor se adaptan a este tipo de cultivo [3] y, por lo tanto, son los más utilizados en CSS [4]. El modo de crecimiento, su tolerancia a bajas actividades de agua y altas presiones osmóticas lo hacen eficiente y competitivo para este tipo de medio [3]. La forma filamentosa que poseen, les otorga ventajas sobre los organismos unicelulares en lo relativo a la colonización del sustrato sólido y a la utilización de los nutrientes disponibles. Además, su particular forma de crecimiento les permite penetrar al interior del sustrato sólido, incrementando con ello la disponibilidad de nutrientes [3].
En general, los sustratos empleados en procesos CSS son sub-productos heterogéneos provenientes de la agricultura o la agroindustria [3]. Todos los sustratos sólidos utilizados poseen una estructura macromolecular básica (e.g. celulosa, almidón, pectina, fibras, etc.), la cual les confiere la propiedad de sólido al sustrato [3]. Esta estructura proporciona una matriz inerte en donde las fuentes de carbono y energía (e.g. azúcares, lípidos, ácidos orgánicos) son adsorbidas.
La biomasa es un parámetro fundamental en la caracterización del crecimiento microbiano. Su medición es esencial para realizar estudios cinéticos en CSS. No obstante, la determinación directa es muy difícil, debido a los problemas que involucra separar la biomasa del sustrato [3]. Se han desarrollado algunos métodos para medir biomasa en CSS, siendo los más importantes: i) cuantificación directa, ii) inferencia de la biomasa a través de la actividad respiratoria o metabólica, iii) medición a través de algún componente específico de la biomasa (e.g. glucosamina). 1.1 Variables críticas de operación
Las variables de operación más críticas para el control de reactores CSS, lo constituyen la temperatura del lecho, pH y el contenido de agua del soporte sólido [2]. Lo anterior resulta del hecho que los microorganismos pueden crecer y producir en un rango relativamente estrecho de condiciones de operación. La agitación y
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aireación del lecho sólido también constituyen factores relevantes. Además, la concentración de nutrientes y gases metabólicos afectan a la biomasa y las tasas de producción de metabolitos, aunque estas variables son muy difíciles de controlar [2]. 1.1.1 Temperatura
Gradientes importantes (3 ºC/cm) pueden ser observados en prácticamente todos los reactores estáticos de CSS [2]. El calor metabólico generado, producto del crecimiento del microorganismo, debe ser retirado con el fin de no alcanzar condiciones desfavorables de cultivo. El método más comúnmente utilizado en reactores piloto o de escala industrial es el flujo forzado de aire a través del lecho del reactor. En este caso, se puede manipular la temperatura de entrada y el flujo de la corriente de aire. Sin embargo, probablemente el método más eficiente corresponde al de enfriamiento por evaporación del agua libre contenida en el lecho sólido [2]. En esta técnica se regula la humedad relativa de la corriente de aire a la entrada del reactor. De esta manera, es posible modificar la tasa de evaporación desde el lecho sólido, logrando con ello la remoción del calor metabólico generado. La principal desventaja que presenta esta técnica es la utilización de aire muy seco, lo cual obliga el empleo de un sistema de control para el contenido de agua del reactor [2]. En esta línea, se han reportado buenos resultados utilizando enfriamiento del lecho por evaporación, para un reactor piloto de 50 (kg) de capacidad [5]. Estudios recientes de simulación [6, 7] establecieron la conveniencia de regular la temperatura del lecho sólido, mediante la manipulación simultánea de la humedad relativa, temperatura y flujo del aire de entrada. 1.1.2 Contenido de agua del lecho sólido
La regulación de la actividad de agua en el lecho sólido es crucial, dado que este factor determina directamente el crecimiento y la tasa de producción de metabolitos. El control del contenido de agua del lecho sólido es difícil, dado que los sensores en línea son escasos, caros y poco fiables [2]. Sin embargo, esta limitación puede ser superada mediante mediciones secundarias en línea, tales como el peso del lecho sólido [2]. La manera más fácil para controlar la humedad del lecho es mediante la adición directa de agua fresca. El agua también puede ser proporcionada a través de la corriente de aire en forma de vapor. Sin embargo, el método empleado
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dependerá del tipo de reactor utilizado y la manera en que el control de temperatura es manejado [2]. 1.1.3 pH
El control de pH se ve dificultado debido a la gran capacidad buffer del lecho sólido y a la falta de sensores apropiados para sustrato sólido [2]. Sin embargo, la regulación del pH puede ser realizada mediante la selección de nutrientes suplementarios, los cuales pueden ser alimentados periódicamente durante la fermentación. 1.1.4 Agitación
La agitación en reactores de CSS cumple una serie de objetivos [2]: mantener condiciones de operación homogéneas permitir una distribución uniforme del agua y nutrientes remover el aire ocluido entre las partículas evitar la aglomeración de las partículas, crucial en el cultivo de hongos
filamentosos Las políticas de agitación son fundamentalmente empíricas. Parámetros
asociados con agitación son velocidad, sentido, y para reactores que emplean agitación intermitente lo son la frecuencia y la duración de ésta. 1.1.5 Aireación
Como se mencionó anteriormente, la aireación es un factor clave para la remoción del calor metabólico, CO2 y metabolitos volátiles ocluidos entre las partículas, junto con regular la humedad del lecho. Además, la aireación del reactor permite que el crecimiento del microorganismo se realice en condiciones aeróbicas.
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1.2 Modelación Tradicionalmente los modelos matemáticos utilizados en biotecnología
pueden ser divididos en categorías, basadas principalmente en dos supuestos. El primero de ellos se relaciona con la distribución de la biomasa. Si las células son indistinguibles unas de otras, el modelo es denominado no segregado. Por otro lado, los modelos segregados toman en cuenta el hecho de que la biomasa puede encontrarse en diferentes estados fisiológicos. El segundo supuesto tiene relación con los procesos que ocurren dentro y alrededor del microorganismo. Si éste es tratado como una caja negra, el modelo es denominado no estructurado. En cambio, los modelos estructurados son aquellos en donde explícitamente se consideran los procesos que ocurren al interior y alrededor del microorganismo. Los modelos más ampliamente utilizados son los modelos no segregados y no estructurados [8]. Mitchell et al. [4] clasifican a los modelos de CSS según fenómenos de transporte local o global. Es así como los modelos microscópicos combinan fenómenos de transporte y condiciones ambientales locales. Estos modelos describen el crecimiento microbiano a nivel particular, identificando los mecanismos responsables de éste. Tienden a describir a la biomasa en mayor detalle, considerando aspectos tales como variaciones en la densidad de la hifa o la existencia de distintos estados metabólicos. Por otro lado, los modelos macroscópicos describen un comportamiento global del bioreactor y el principal objetivo es describir el crecimiento de la biomasa. Para esto se requiere predecir perfiles de temperatura, concentraciones de oxígeno, nutrientes o propiedades del lecho sólido. Estos modelos deben ser desarrollados para contribuir en el diseño, operación, escalamiento, control y optimización de bioreactores [4].
Un modelo matemático puede ser una poderosa herramienta, sin embargo, su desarrollo en CSS presenta una serie de dificultades principalmente en la falta de mediciones de biomasa, concentración de nutrientes y gases, temperatura y pH. A lo anterior, se suma la dificultad en modelar la producción de metabolitos secundarios. Estas limitaciones han retardado y complicado las aplicaciones y desarrollos en control automático y optimización, dificultando con ello la aplicación industrial de esta tecnología.
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1.2.1 Crecimiento de biomasa En la literatura modelos no segregados y no estructurados, como la
ecuación logística, modelos de crecimiento lineal y exponencial son ampliamente utilizados para describir la relación entre biomasa, su tasa de crecimiento y actividad [4, 9-14]. A continuacón se presentan las cinéticas más comunes: Cinética de crecimiento lineal:
ctedtdX (1.1)
Cinética de crecimiento exponencial: Xdt
dXm (1.2)
donde m representa la máxima velocidad específica de crecimiento. Ecuación logística:
m
m XXXdt
dX 1 (1.3)
donde Xm es la cantidad máxima de biomasa. Dentro de este grupo, los modelos logísticos consideran una limitación
para el crecimiento y, por tal razón, han sido utilizados en cultivos CSS. Estos modelos representan de buena manera el crecimiento del microorganismo, hasta que éste alcanza la etapa estacionaria. Sin embargo, los modelos logísticos no consideran explícitamente limitaciones por sustrato o problemas difusionales y sus parámetros deben ser determinados para cada nuevo sistema [4].
Otra manera de modelar el crecimiento de la biomasa, es asumir que éste se relaciona con la concentración de algún sustrato limitante. La ecuación más utilizada para modelar ésto, es la ecuación de Monod, en donde el crecimiento
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decrece una vez que los sustratos limitantes comienzan a agotarse. La ecuación (1.4) corresponde a una cinética Monod de crecimiento:
sss
m CKCXdt
dX (1.4)
En la ecuación (1.4) el término Ks corresponde a una constante de saturación para el sustrato limitante (Cs). Otros modelos han sido desarrollados para el caso de un nutriente limitante, tales como la ecuación de Contois, Moser y Tessier [8]. El modelo de Contois es considerablemente mejor que el modelo de Monod, cuando las concentraciones de biomasa son altas. Modelos que dependen de varios nutrientes limitantes y modificaciones a la cinética de Monod han sido ampliamente discutidos [4, 15].
Otros modelos como el de Pirt [15], han sido ampliamente utilizados para describir el crecimiento en CSS. Este modelo relaciona a la biomasa con la actividad respiratoria del microorganismo. El principal supuesto es que la actividad respiratoria es proporcional a la tasa de crecimiento y además, una pequeña parte de la actividad respiratoria siempre se mantiene presente aun cuando el crecimiento haya cesado. Esto último se conoce como respiración por mantención.
La temperatura y el contenido de agua influyen de manera importante en el crecimiento de la biomasa. Es así como algunos modelos han considerado el efecto de la actividad de agua (aw) sobre la tasa de crecimiento [16]. El efecto de la temperatura ha sido modelada en algunos trabajos utilizando diferentes expresiones matemáticas [4, 9, 10, 13, 17, 18]. Otros aspectos tales como el efecto de pH, concentración de CO2 y O2, han recibido escasa atención.
Otros autores han desarrollado modelos de crecimiento que consideran una cinética de muerte o inactivación del hongo [4, 13, 19, 20]. En general, estas cinéticas se han asumido de primer orden [4]. Es importante considerar este aspecto cuando se desea estudiar la producción de metabolitos secundarios, ya que éstos son excretados una vez que la biomasa ha finalizado un período de crecimiento balanceado.
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Técnicas más recientes, como el análisis de imagen mediante computador han resultado prometedoras para caracterizar la morfología y diferenciación de hongos filamentosos en medios de cultivo sólido [21]. Así también, se han utilizado modelos híbridos [22] con el fin de describir el crecimiento de hongos filamentosos en CSS. Como ejemplo, Thibault et al. [22] incorporaron un set de ecuaciones diferenciales, las cuales describen en gran parte los procesos fenomenológicos involucrados y, por otro lado, utilizaron redes neuronales para obtener algunos parámetros claves del modelo para el caso del hongo Gibberella fujikuroi. 1.2.2 Producción de metabolitos secundarios
En general, el principal objetivo de los modelos matemáticos en CSS ha sido describir el crecimiento microbiano. A pesar de que muchos autores han presentado resultados experimentales de producción de metabolitos en CSS [23, 24], la modelación de este aspecto no ha sido tratada [2]. Como se mencionó anteriormente, en general, los modelos de crecimiento de biomasa describen la etapa exponencial (e.g. modelo logístico) y no consideran una inactivación o muerte del hongo y, por lo tanto, sólo son capaces de predecir la biomasa total. Sin embargo, para modelar la producción de algún metabolito secundario es necesario diferenciar entre biomasa activa e inactiva [4]. A pesar de estos problemas, modelos de formación de productos desarrollados para medios sumergidos pueden ser aplicados a CSS [25]. 1.2.3 Transferencia de masa y calor
Mucho de los sistemas experimentales utilizados para el estudio del crecimiento de biomasa en medio sólido, son lo suficientemente pequeños como para asegurar la homogeneidad del medio (e.g. columnas de Raimbault). De esta manera, las concentraciones de biomasa, O2, nutrientes, contenido de humedad, temperatura y pH son aproximadamente iguales a través del lecho sólido. Además, es relativamente fácil mantener las condiciones de operación (temperatura, contenido de agua y O2) bajo control. Para el caso de reactores piloto o de escala industrial, la situación es muy diferente. En este caso, es muy difícil regular las condiciones de operación y mantener la homogeneidad del medio de cultivo [2].
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Algunos autores han desarrollado modelos capaces de predecir o explicar la dependencia espacial y temporal de la temperatura, contenido de agua y O2 [2]. En este caso, los modelos espaciales pueden ser clasificados en modelos de parámetros concentrados o parámetros distribuidos. Los modelos de parámetros concentrados son aquellos que no consideran una distribución espacial y las variables del proceso dependen solamente del tiempo. Este tipo de modelos son descritos por ecuaciones diferenciales ordinarias. Cuando la distribución espacial es considerada, las variables del proceso son descritas por ecuaciones diferenciales parciales. Reactores estáticos a nivel industrial deben ser modelados como sistemas de parámetros distribuidos. Los modelos temporales pueden ser clasificados como pseudo-homogéneos o heterogéneos. Modelos que explícitamente no consideran distribución al interior de la partícula sólida son denominados pseudo-homogéneos, en cambio, modelos que describen gradientes al interior de la partícula sólida son denominados heterogéneos [2].
Raimbault [26] desarrolló un modelo en CSS para el hongo Aspergillus niger y cómo su crecimiento es limitado por la falta de superficie y agua libre. El modelo utiliza una ecuación logística de crecimiento para biomasa. Además, predice variables tales como la evolución de azúcares, CO2, O2, agua y calor metabólico. Determinó los coeficientes de mantención para azúcares, CO2 y O2, además de establecer una ecuación estequiométrica global de crecimiento. Las columnas utilizadas para desarrollar su modelo, hoy llevan su nombre.
Ryoo [27], contribuyó con la incorporación del calor latente de evaporación en el balance de energía. Para modelar el crecimiento del hongo filamentoso Rhizopus oligosporus utilizó un modelo logístico. Además, el modelo describe la evolución de CO2, temperatura y contenido de agua. En su modelo considera la cinética de degradación del sustrato por el hongo.
Más recientemente, Gutierrez-Rojas et al. [28] propusieron un modelo de parámetros concentrados para el hongo Aspergillus niger en medio sólido. Se estudió el comportamiento del hongo en columnas de Raimbault. El modelo describe la evolución de biomasa, azúcar, agua, CO2, O2 y la temperatura. El modelo propuesto incorpora nuevas características: i) una cinética de crecimiento limitada por efectos
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estéricos y por sustrato, ii) dependencia de max con la temperatura, iii) un balance de energía que considera convección, conducción y calor metabólico.
Saucedo-Castañeda et al. [10] aplicaron un modelo pseudo-homogéneo para describir la evolución de los gradientes radiales de temperatura en un reactor de CSS cilíndrico, con aire forzado en régimen laminar. El balance de energía incluye el calor metabólico generado y la transferencia de calor por dos mecanismos, conducción en el lecho sólido y convección a través de las paredes del reactor.
Rajagopalan & Modak [29] desarrollaron un modelo heterogéneo, en donde se considera la difusión de oxígeno al interior de una partícula sólida. Los mismos autores [30] desarrollaron un modelo de crecimiento sobre una partícula esférica de salvado de trigo. En este caso, la cinética de crecimiento incluye simultáneamente limitaciones por O2 y glucosa, utilizando la ecuación de Monod en ambos casos. Simulaciones empleando este modelo mostraron que el agotamiento de oxígeno al interior del biofilm es la primera causa del cese del crecimiento. No obstante, a medida que la fermentación continúa, el agotamiento de la glucosa marca el fin del crecimiento. Por otro lado, para un lecho sólido de partículas esféricas altamente aireado, Thibault et al. [31] concluyeron que la difusión de oxígeno a través del biofilm es la limitante más importante para la transferencia de oxígeno. En este caso, se utilizó un modelo de transferencia de oxígeno calibrado mediante datos publicados. 1.2.4 Producción de ácido giberélico
El ácido giberélico (GA3) es un ácido diterpenoico presente en plantas superiores en las cuales participa en la regulación del crecimiento y diferenciación vegetal. Se le confiere la calidad de hormona vegetal, debido a que se trata de un compuesto natural de plantas superiores que se encuentra en muy pequeña cantidad, y que afecta un variado rango de procesos, tales como elongación del tallo, germinación, floración, etc..
Algunos hongos, como Gibberella fujikuroi (sinónimo: Fusarium moniliforme), son capaces de producir GA3 en cantidades importantes. En este caso, la fase exponencial de crecimiento en medios limitados por nitrógeno, se prolonga
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hasta que este elemento se vuelve limitante, momento en el cual comienza una fase de transición y almacenamiento [32, 33]. Durante esta última, y en condiciones de suficiencia en carbono, se observa un aumento sustancial de los triglicéridos y carbohidratos micelares, concurrentes con la síntesis de GA3. Posteriormente, el cultivo entra en fase de mantención, período en que ocurre gran parte de la síntesis de ácido giberélico. De esta forma, el GA3 es una hormona vegetal endógena, biológicamente activa, y también un producto del metabolismo secundario de ciertos microorganismos. Esta última característica ha permitido desde hace varios años, la producción industrial masiva de esta hormona mediante cultivo sumergido.
Los principales usos agrícolas del GA3 incluye tanto a frutas (e.g. naranjas, uva) como hortalizas (e.g. papas, alcachofas) y cereales. Sin embargo, más del 90% del ácido giberélico empleado en el mundo, principalmente California, Chile e Israel, se destina a la obtención de uva de mesa apirénica (i.e. sin semilla).
En la actualidad, la demanda nacional por GA3 corresponde al 25% del consumo mundial y el 100% del GA3 es importado. El ácido giberélico tiene variados usos comerciales en el sector agrícola, siendo uno de los más importantes el caso de la uva de mesa de exportación. La aplicación de GA3 a la uva es la única forma de regular el crecimiento de las bayas para obtener racimos de calidad exportable.
A nivel de laboratorio, la producción de ácido giberélico por Gibberella fujikuroi ha sido estudiada ampliamente en cultivo agitado [32, 33, 34] y en medio sólido. En este último caso, se ha investigado la influencia de factores nutricionales [23, 35, 36], físicos (humedad, tiempo de autoclavado, pH) [37], perfiles de alimentación fed-batch [35, 38], además de diferentes sustratos de cultivo [23, 24]. Se han desarrollado modelos matemáticos de crecimiento de G. fujikuroi [39, 40], sin embargo, no se ha modelado la producción de GA3 en medio sólido. Probablemente, esto último se deba a la dificultad en modelar la evolución de la biomasa activa y la limitación de GA3 por nitrógeno.
Finalmente, a escala piloto se han desarrollado reactores de cultivo en medio sólido para la producción de GA3 [5, 38, 41], con resultados prometedores.
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De esta manera, el objetivo general de este trabajo es desarrollar un modelo matemático de crecimiento y producción de ácido giberélico (GA3) en un CSS, a partir de datos experimentales a nivel de laboratorio. Este modelo permitirá posteriormente optimizar las condiciones iniciales del cultivo y sentará las bases para el desarrollo de políticas de alimentación fed-batch. En ambos casos, el fin es maximizar la producción de GA3.
Los objetivos específicos de este trabajo son: Estudiar cómo condiciones de actividades de agua (0.985, 0.992 y 0.999),
temperaturas controladas (25, 31 y 36ºC) y nutrientes, afectan al crecimiento del hongo y la producción del metabolito, durante el cultivo sobre soporte inerte.
Determinar intervalos de 95% de confianza para los datos experimentales presentados, con el fin de analizar la existencia de diferencias significativas en los resultados.
Desarrollar un modelo matemático de crecimiento de Gibberella fujikuroi y producción de ácido giberélico sobre sustrato sólido inerte.
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II. ANÁLISIS Y TRATAMIENTO DE DATOS 2.1 Materiales y métodos 2.1.1 Preparación de biomasa y medio de cultivo
El inóculo se prepara a partir de la cepa Gibberella fujikuroi (ATCC 12616), cultivada sobre agar malta levadura. Una vez que el micelio es homogeneizado, se utilizan 2 (ml) para inocular 100 (ml) de medio de propagación estéril. La composición del medio es: 80 (g/l) glucosa anhidra, 0.45 (g/l) sulfato de magnesio, 5 (g/l) KH2PO4, 10 (ml/l) de sales rosadas (en g/l; 0.2 de FeSO47H2O, 0.2 de ZnSO47H2O, 0.1 de CaCl22H2O, 0.02 de CuSO45H2O, 0.02 de CoCl2, 0.02 de Na2B4O710H2O, 0.02 de Na2MoO42H2O, 0.02 de MnSO4H2O y 0.6 de EDTA), 1.85 (g/l) de NH4NO3. Cada matraz es complementado con 200 (l) de clotrimoxazol y luego es dejado en agitación a 28ºC por 48 a 60 (h). Antes de mezclar con el sustrato, se observó al microscopio óptico para comprobar la ausencia de bacterias y/o levaduras.
Como soporte sólido se utilizó la resina de intercambio iónico, Amberlita IRA 900 (SIGMA). La resina fue estabilizada a pH 4.5 con una solución de Na2HPO4 (0.25 M, pH 4.5). Posteriormente fue secada en estufa a 50ºC hasta obtener una humedad menor al 10%, luego ésta se mezcló con maltodextrina, sales y urea. De esta manera las relaciones C/N fueron: 40 (25ºC, aw = 0.992), 55 (25ºC, aw = 0.999), 87 (31ºC, aw = 0.985), 49 (31ºC, aw = 0.992), 6 (31ºC, aw = 0.999), 8 (36ºC, aw = 0.999) y la humedad en todos los casos, fue de un 60% aproximadamente. Este medio sólido se cargó en columnas de Raimbault, las cuales se mantuvieron con temperatura, aireación y actividad de agua (aw) controladas.
24
2.1.2 Control de la aw y temperatura Para proporcionar una humedad controlada en el aire de entrada a las
columnas, se dispuso de un sistema de burbujeadores con soluciones agua-glicerol (Figura 2.1). Se formularon mezclas agua-glicerol para obtener aw de 0.985, 0.992 y 0.999. Las concentraciones adecuadas de glicerol se obtuvieron usando el programa computacional UNIFAC [42]: aw = 0.985 Glicerol: 72.6 (ml/l) aw = 0.992 Glicerol: 38.5 (ml/l) aw = 0.999 Glicerol: 0.0 (ml/l)
Los burbujeadores se conectaron a las columnas por un tapón de goma, el cual fue sellado. Las mangueras se conectaron a una salida de aire estéril y todo el sistema fue colocado en baños de agua termoregulados (THERMOMIX). Durante la fermentación el nivel de agua-glicerol fue controlado, agregando agua estéril cuando fue necesario. 2.1.3 Cultivos y toma de muestras
Los cultivos se realizaron en 46 columnas de Raimbault. Adicionalmente, 4 columnas fueron utilizadas como control. Las muestras y su duplicado fueron tomadas a intervalos regulares durante 142 horas, con mayor frecuencia las primeras 20 horas. 2.1.4 Registro de O2 y CO2 instantáneos
El sistema de monitoreo mide en línea la composición del gas de salida de 4 columnas, tres con inóculo y una columna control. El sistema está compuesto por una columna de sílica gel para deshumidificar el aire de salida, un flujómetro másico de gas (Aalborg Instruments GFM17), un sensor electroquímico de oxígeno (Columbus Instruments 0135-0345) y un sensor infrarrojo de dióxido de carbono (Columbus Instruments 0135-190E). Una columna de sulfato de calcio (Drierite) fue colocada entre el flujómetro másico y los sensores de O2 y CO2 para secado adicional del gas de salida. El flujo de cada columna fue ajustado manualmente a 35 (ml/min); la válvula fue periódicamente ajustada con el fin de mantener el flujo
25
constante. La adquisición de datos fue realizada mediante un Controlador Lógico Programable (PLC) conectado a un computador personal (MITAC 386SX). El computador registró el tiempo, el flujo de aire y el porcentaje de CO2 y O2 de las columnas cada 20 minutos (Figura 2.1). La información fue procesada posteriormente en una planilla EXCEL, donde se determinaron las curvas instantáneas y acumuladas de CO2 y O2.
Figura 2.1: Monitoreo y adquisición de datos en línea de gases. (1) regulador de temperatura, (2) columnas de Raimbault, (3) regulador de presión para el aire de entrada, (4) tubo de silica gel, (5) sensor de gas, (6) computador.
2.1.5 Determinación de biomasa total
La biomasa total es medida indirectamente, a través de un ensayo colorimétrico de glucosamina, proveniente de la hidrólisis de quitina contenida en la pared fúngica [43, 44]. La hidrólisis se hace reaccionando el medio sólido cultivado con HCl (6 N) durante 16 horas a 80ºC. El hidrolizado es neutralizado con CH3COONa. La glucosamina se hace reaccionar con 3-metil-2-benzotiazolona hidrocloruro (MTBH), derivando posteriormente a un compuesto coloreado de absorbancia máxima a 653 (nm). Para obtener la equivalencia de glucosamina y
1
3
5
4
6
2
26
biomasa, se hace crecer el hongo sobre un trozo de papel celofán, puesto sobre amberlita con igual composición de nutrientes. Posteriormente la biomasa se desprende y se mide gravimétricamente, relacionando la cantidad de peso seco con la de glucosamina. Los resultados experimentales indican que el contenido de glucosamina de la biomasa es de un 8.3% (p/p) (datos no mostrados). 2.1.6 Determinación de urea en el medio
Se determinó la evolución de la urea mediante el kit UREA S (laboratorio Boehringer Mannheim), basado en el desdoblamiento con ureasa y posterior reacción de Berthelot. De esta reacción se origina un complejo coloreado detectable a 600 (nm). 2.1.7 Determinación de la fuente de carbono
Se midió el contenido de almidón en el medio a través del método Orcinol-Sulfúrico, el cual consiste en la hidrólisis con H2SO4 de las uniones glicosídicas de los azúcares. Los extremos libres son deshidratados en compuestos furfurales que se condensan al orcinol, formando un compuesto anaranjado que se detecta en espectrofotómetro a 425 (nm). 2.1.8 Determinación del ácido giberélico
El método se basa en la detección del derivado fluorescente que se produce al reaccionar el ácido giberélico con H2SO4 [45]. El GA3 se extrae desde 2 (g) de muestra con 3x6 (ml) de isopropanol (60, 30 y 15 minutos). El extracto se diluye con isopropanol y se hace reaccionar con H2SO4 al 85% durante 1 hora. 2.1.9 Determinación de la velocidad máxima de crecimiento max
La máxima velocidad específica de crecimiento, se obtiene a partir del logaritmo natural de la curva acumulada de CO2 y O2, en el intervalo de mayor pendiente [46]. El tramo comprendido entre las 0-8 (h) no es utilizado debido a la mala calidad de los datos registrados. Un ejemplo de cálculo se muestra en el Anexo A.
27
2.10 Métodos estadísticos
Debido a la gran dispersión observada en los datos experimentales (biomasa total, fuente de carbono, ácido giberélico, CO2 y O2 instantáneos), se procedió a utilizar herramientas estadísticas para el cálculo de intervalos de 95% de confianza en las estimaciones presentadas. El método requiere de modelos matemáticos capaces de reproducir las dinámicas no lineales de las variables experimentales. En la Tabla 2.1 se muestran los modelos utilizados para el ajuste de los datos.
Tabla 2.1. Modelos estadísticos ajustados a datos experimentales. Variables Modelo
Biomasa (X) tceb
aatX
11)(
Fuente de carbono (S) tgefStS 1)( 0
Ácido giberélico (GA3) 55
44
33
22103 )( tatatatataatGA
Gases instantáneos tii etiitig 4321)( Los parámetros de los distintos modelos (Tabla 2.1) fueron calibrados
mediante la función nlinfit del toolbox estadístico de MATLAB 5.0. Esta función se basa en el método iterativo de Gauss-Newton, el cual minimiza la suma de los errores cuadráticos entre los datos experimentales y las predicciones, en sistemas no lineales [47, 48].
Para la determinación de intervalos de 95% de confianza, se utilizaron las funciones nlparci y nlpredci del mismo toolbox estadístico. Estas funciones basan sus resultados en el test estadístico t de Student [49, 50]. Mediante los datos
28
experimentales y los modelos no lineales como entrada, estas funciones entregan los intervalos de confianza para la media de la variable modelada.
29
2.2 Resultados y discusión 2.2.1 Crecimiento de biomasa
En primer lugar se puede apreciar en el Anexo B, que las cantidades máximas de biomasa total fueron alcanzadas a 25ºC. En condiciones de aw = 0.992 se registraron 40 (mg/g.s.i.), seguido de 31 (mg/g.s.i.) para aw = 0.999. Los niveles más bajos de biomasa se obtuvieron para condiciones de 31ºC y aw = 0.999, alcanzando sólo 8.4 (mg/g.s.i.). Por otro lado, en los cultivos a 25ºC y 31ºC, la cantidad máxima de biomasa se logró con aw = 0.992. Para los cultivos a 31ºC, aw = 0.985 y aw = 0.999 no se percibieron diferencias significativas frente a variaciones en la actividad de agua (aw). Los intervalos de confianza en este caso, permiten afirmar que los factores físicos influyen en el crecimiento del hongo, siendo más importante su efecto a bajas temperaturas (25ºC) y actividades de agua medias (0.992).
Los valores obtenidos de biomasa se encuentran dentro del rango de valores reportados por otros autores. Estudios realizados por Kumar & Lonsane con Gibberella fujikuroi [36, 51] han reportado concentraciones de 16 (mg biomasa/g salvado de trigo seco) en 8 días de cultivo. Por otra parte, Ebner et al. [52] reportan 118 (mg biomasa/g sustrato inerte) en 160 (h) de cultivo. En este caso, los investigadores utilizaron vermiculita como soporte inerte. De manera similar, Agosin et al. [53] informan rendimientos de 94 (mg/g vermiculita). Para el caso del hongo filamentoso Aspergillus niger, Auria & Revah [54] reportaron 103 (mg biomasa/g soporte seco) en 28 (h) de cultivo, utilizando como soporte inerte la resina de intercambio iónico Amberlita IRA-900.
A escala piloto, Bandelier et al. [38] estudiaron el crecimiento de G. fujikuroi en un reactor de 50 (l) de capacidad utilizando salvado de trigo como medio de cultivo. Los rendimientos de biomasa total alcanzados fueron de 103 (mg /g masa seca) en 11 días de cultivo.
La medición de biomasa es difícil y poco confiable debido principalmente a problemas de interferencia y separación con el sustrato. Por ejemplo, algunos investigadores han realizado estimaciones indirectas de biomasa mediante mediciones de la actividad respiratoria del hongo.
30
Investigaciones realizadas por Borrow et al. [32, 33] en medio sumergido demuestran que una vez agotado el nitrógeno extracelular, el hongo G. fujikuroi acumularía grasas y carbohidratos. Debido a esto y al hecho de que el método experimental utilizado para medir biomasa supone una relación constante de glucosamina/biomasa, se podría estar subestimando los niveles reales de biomasa. Estos antecedentes indican que se podrían obtener concentraciones de biomasa aún mayores en Amberlita.
La Tabla 2.2 permite apreciar la variación de la velocidad máxima específica de crecimiento (max), en función de la temperatura y aw. En este caso, el valor de max fue calculado a partir del logaritmo natural de CO2 (Nº1) y O2 (Nº2) acumulado. En su mayoría, los intervalos de confianza para los distintos max se superponen, por lo tanto, no es posible establecer diferencias significativas entre los valores obtenidos. Sin embargo, a 31ºC aw = 0.999 y 36ºC aw = 0.999 se obtuvieron los valores más bajos para la velocidad específica de crecimiento. Esto es consecuente con los bajos valores de biomasa obtenidos en estos experimentos. En todos los casos max se obtuvo en el intervalo 10-20 (h), dado que fue el período de mayor pendiente para el logaritmo natural de los gases acumulados. Los valores presentados en la Tabla 2.2 se encuentran dentro de aquellos reportados para otros hongos en CSS [3, 4, 46, 55], los cuales varían entre 0.05 y 0.5 (h-1). Estudios de G. fujikuroi en donde se utiliza vermiculita como soporte inerte reportan un max de 0.17 (h-1) [52]. El valor máximo reportado para G. fujikuroi en medio líquido es de 0.21 (h-1) [39]. A nivel de reactor piloto Bandelier et al. [38] reportan un max de 0.018 (h-1). A pesar de los altos valores obtenidos para max, nuestros niveles de biomasa son bajos, presumiblemente por una alta tasa de muerte para el hongo y una baja velocidad específica promedio de crecimiento, debido al rápido agotamiento del nitrógeno disponible.
Tabla 2.2. max calculados en base a la actividad respiratoria del hongo.
Temperatura(ºC)
aw Xmax(mg/g.s.i.) max (h-1)(Nº1) max (h-1)
(Nº2)25 0.992 39.71.3 0.210.02 0.210.0225 0.999 30.72.8 0.230.04 0.230.0331 0.985 11.31.0 0.200.03 0.180.0231 0.992 18.40.8 0.200.03 0.190.0231 0.999 8.40.5 0.140.01 ---36 0.999 13.70.8 0.160.02 ---
31
En el Anexo C es posible apreciar la evolución de los gases instantáneos y su relación con el consumo de urea. En todos los casos, los niveles máximos de gases instantáneos y biomasa total, no fueron alcanzados en el mismo lapso de tiempo. Como ejemplo consideremos el cultivo a 25ºC y aw = 0.992. En la Figura 2.2 se observa que la desaparición extracelular de urea coincide con los peaks de las curvas de CO2 y O2 instantáneos. Sin embargo, es posible apreciar que la biomasa total sigue aumentando, aun cuando no existe urea disponible en el medio. Esto último indicaría que el hongo Gibberella fujikuroi acumularía parte del nitrógeno proveniente de la urea, para luego, bajo condiciones de limitación externa, proceder a su consumo. Un trabajo reciente [56] ha observado este fenómeno en el hongo Arthrobotrys oligospora, el cual almacenaría una proteína y la utilizaría posteriormente con el fin de continuar su crecimiento, una vez agotado el nitrógeno del medio.
25ºC, aw=0.992
0,0E+00
6,0E-07
1,2E-06
1,8E-06
2,4E-06
0 50 100 1500,0
1,5
3,0
4,5
6,0
Tiempo (h)
Bioma
sa (m
g/g.s.i
.)
Urea (mg/g.s.i.) Gases
instan
táneos
(m
ol/g.s.i
.min)
25ºC, aw=0.992
0
10
20
30
40
50
0 50 100 150
(b)
(a)
Figura 2.2: (a) Datos experimentales de biomasa medida (); las líneas superiores e inferiores representan los intervalos de 95% de confianza; la línea intermedia representa el valor promedio de biomasa. (b) Relación entre producción de CO2 (), O2 () y evolución de urea ().
32
Siempre las curvas de gases instantáneos lograron su máximo valor alrededor de las 20 (h), antes que las curvas de biomasa total. Por otro lado, el periodo de mayor pendiente para la curva de gases instantáneos, se obtuvo en el intervalo 10-20 (h) aproximadamente, coincidiendo con aquel encontrado para la velocidad máxima de crecimiento (max). La concentración de CO2 (Figura 2.3) y O2 acumulado no mostraron una clara relación con el crecimiento de la biomasa total. Sólo para el cultivo a 25ºC y aw = 0.992, la máxima producción de CO2 y consumo de O2, coincidió con la máxima producción de biomasa.
2.2.2 Producción de GA3
La cantidad máxima de GA3 producido fue aproximadamente 0.73 (mg GA3/g.s.i.) para el cultivo a 31ºC y aw = 0.985. Sin embargo, los intervalos de confianza para los cultivos a 31ºC y actividades de agua 0.985-0.999 se superponen (Anexo D). Lo anterior implica que no es posible establecer diferencias significativas entre ambos resultados. Sin embargo, si es posible afirmar que esas fueron las condiciones que lograron la mayor producción de ácido giberélico. Cabe destacar que a partir de estos resultados para un cultivo limitado en el tiempo, maximizar la producción total de GA3 no sería equivalente a maximizar la producción de biomasa total. Esto también habría sido observado por otros investigadores [23]. La Tabla 2.3
CO2 ac
umula
do (m
ol/g.s.i
.)
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0 50 100 150
25ºC, aw=0.992
25ºC, aw=0.999
31ºC, aw=0.98531ºC, aw=0.992
31ºC, aw=0.99936ºC, aw=0.999
Figura 2.3: CO2 acumulado. Tiempo (h)
33
muestra cómo los niveles máximos de biomasa no coinciden con la producción máxima de GA3, para las distintas condiciones de cultivo.
Tabla 2.3. Biomasa final y GA3 máximo.
Para las experiencias a 25ºC (aw = 0.992 y aw = 0.999) y 31ºC (aw =
0.999) (Anexo D) es posible observar una alta tasa de producción de GA3. Esto indicaría que producciones más importantes de ácido giberélico se hubieran obtenido con tiempos de cultivo más largos. No obstante, los resultados presentados en la Tabla 2.3 son significativamente menores a los reportados previamente por otros autores. Así, Kumar & Lonsane [36, 51] han obtenido rendimientos de 1.2 (mg GA3/g salvado de trigo seco) en 7 días de cultivo. Estudios realizados por Qian et al. [37] informan rendimientos de 19.3 (mg GA3/g de sustrato seco fermentado) en 18 días de cultivo. Estos autores emplearon altas concentraciones de harina de maiz, aproximadamente un 80% del medio de cultivo total. Los investigadores afirman que los rendimientos obtenidos podrían corresponder, en parte, a la mayor utilización del sustrato, pero también a la satisfacción de una necesidad de alto consumo de carbono por el hongo. A nivel de laboratorio, Agosin et al. [53] informan rendimientos de 3.8 (mg GA3/g vermiculita) y 6.8 (mg GA3/g masa seca inicial) en 190 (h), empleando salvado de trigo como medio de cultivo. En este último caso, los investigadores atribuyen la mayor producción a una menor limitación por carbono y posiblemente a la presencia de algún compuesto desconocido que induciría fuertemente la producción de GA3.
Experiencias realizadas en reactor piloto de 50 (l) de capacidad reportan 3 (mg GA3/g materia seca final) en 11 días de cultivo [38]. El medio de cultivo
Temperatura(ºC)
aw Xmax(mg/g.s.i.)(GA3)max(mg/g.s.i.)
Producción específica(mg GA3/mg biomasa)
25 0.992 39.71.3 0.570.04 0.0140.00125 0.999 30.72.8 0.360.04 0.0120.00231 0.985 11.31.0 0.730.04 0.0650.00931 0.992 18.40.8 0.470.02 0.0260.00231 0.999 8.40.5 0.670.07 0.0800.01336 0.999 13.70.8 0.250.01 0.0180.002
34
utilizado por los autores fue salvado de trigo enriquecido con una solución nutritiva. Por otro lado, utilizando un reactor piloto de 50 (kg) de capacidad, Agosin et al. [41] informan rendimientos de 5.2 (mg GA3/g materia seca inicial) en 6 días de cultivo utilizando salvado de trigo.
Se comprobó que la producción de ácido giberélico comienza cuando la concentración del nutriente nitrogenado es baja, debido a que éste inhibe la aparición de GA3 [57, 58]. El GA3 excretado por el hongo presentó en algunos casos una clara degradación (31ºC aw = 0.985; 31ºC aw = 0.992; 36ºC aw = 0.999), posiblemente producto de una hidrólisis química al entrar en contacto con el medio acuoso y a una metabolización de éste por parte del hongo [59, 60]. La figura 2.4 ejemplifica lo expuesto:
36ºC, aw=0.999
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0 50 100 1500,0
1,5
3,0
4,5
6,0
Figura 2.4: Producción de GA3 (); las líneas superiores e inferiores representan los intervalos de 95% de confianza; la línea intermedia representa el valor promedio de GA3. Concentración de urea ().
Tiempo (h)
GA3 (m
g/g.s.i
.) Urea (mg/g.s.i.)
35
Podemos concluir que el cultivo de Gibberella fujikuroi sobre sustrato sólido inerte tiene el potencial para lograr altas concentraciones de biomasa. Esto se ve reflejado por los altos valores de max obtenidos, utilizando Amberlita como soporte inerte. Sin embargo, podría ser el temprano agotamiento de la urea la causa de los bajos niveles de biomasa máxima alcanzados. Altas concentraciones iniciales de nitrógeno pueden aumentar los niveles de biomasa final, pero a su vez pueden inhibir la producción de GA3. Por lo tanto, una adición programada de nitrógeno durante el cultivo, permitiría alcanzar valores altos de biomasa y de ácido giberélico al mismo tiempo.
Por último, se puede agregar que la gran dispersión de los datos experimentales de biomasa y almidón se podrían deber a la gran cantidad de etapas requeridas en los métodos de determinación. Además de la participación de varios operadores en la realización y medición durante los experimentos.
36
III. MODELACIÓN Y SIMULACIÓN 3.1 Modelo
El modelo está constituido por 8 ecuaciones diferenciales de parámetros concentrados, en su mayoría no lineales. Las ecuaciones son capaces de reproducir el crecimiento del hongo, la evolución del CO2 producido y el O2 utilizado, junto con la degradación de los nutrientes almidón y urea, siendo este último limitante. Además, el modelo simula los perfiles de concentración del ácido giberélico (GA3), metabolito secundario que sólo se manifiesta cuando la concentración del nutriente nitrogenado es baja [57].
Los principales supuestos del modelo son: resistencia a la transferencia de oxígeno despreciable el nutriente limitante es el nitrógeno fuente de carbono no es limitante temperatura y actividad de agua constantes durante el cultivo
3.1.1 Biomasa viva La evolución de biomasa activa queda definida por un balance de masa
dinámico, el cual considera una tasa de crecimiento específica y un término de muerte para el hongo. Se asumió una cinética de muerte de primer orden, ya que es la más ampliamente utilizada en la literatura [4].
XkXdtdX
d (3.1)
3.1.2 Biomasa medida El método indirecto empleado para la determinación de la biomasa total
(activa + inactiva) consiste en la medición de glucosamina, componente de la quitina, la cual es parte fundamental de la pared celular del hongo. Estas mediciones no son capaces de diferenciar entre ambos tipos de biomasa. De esta manera, la siguiente
37
ecuación reproduce la evolución de la biomasa total (Xm) presentes en el medio para cada instante de tiempo.
XdtdX m (3.2)
3.1.3 Degradación de urea La urea degradada se utiliza fundamentalmente para la formación de
proteínas estructurales, las cuales forman parte de las paredes del microorganismo. El modelo utilizado supone que el nutriente nitrogenado limitante, urea, se descompone a un derivado de ésta (nitrógeno intermediario, ejemplo; amonio) el cual posteriormente se incorpora a la biosíntesis de compuestos nitrogenados [61], siguiendo una cinética de orden cero.
kdtdU (3.3)
INXI
YXkdt
dN/
47.0 (3.4)
En que el factor 0,47 utilizado en la ecuación (3.4) corresponde al porcentaje en peso de nitrógeno en la urea.
3.1.4 Degradación de la fuente de carbono El primer término de la cinética de degradación de carbono está destinado
al crecimiento del hongo, aportando los elementos necesarios para la síntesis de biomasa y la energía necesaria para este proceso. El segundo término corresponde al de mantención, el cual considera el aporte de energía para mantener vivo al microorganismo y además, aporta los materiales necesarios para la formación de productos extracelulares. En nuestro caso, esto último es prácticamente despreciable debido a las pequeñas cantidades de metabolito producido.
38
XmYX
dtdS
sSX
/
(3.5)
3.1.5 Producción de GA3 La tasa neta de producción de ácido giberélico está representada por un
término de producción específica, el cual sigue una forma típica de inhibición por sustrato [34] y un término de degradación en medio acuoso. Este último término supone que el GA3 al entrar en contacto con el medio líquido sufre una hidrólisis química [59, 60].
33 GAkXdtdGA
P (3.6)
3.1.6 Producción de CO2 Producto de la respiración del microorganismo, el dióxido de carbono es
eliminado al medio durante la fermentación. El primer término de la ecuación (3.7) representa la producción de CO2 debido al crecimiento del microorganismo y el segundo, producto de la respiración del hongo [4].
XmYX
dtdCO
COCOX
22/
2 (3.7)
3.1.7 O2 utilizado La ecuación (3.8) corresponde a la cantidad de oxígeno empleado por el
hongo. El primer término de la ecuación representa al O2 utilizado para el crecimiento del hongo y el segundo representa al oxígeno empleado para su respiración [4]. Como se mencionó anteriormente, éste no es considerado como limitante.
XmYX
dtdO
OOX
22/
2 (3.8)
39
La integración de las ecuaciones diferenciales fue realizada mediante un algoritmo corrector/predictor Runge-Kutta de 4º/5º orden (función ODE45 de MATLAB). El horizonte de tiempo simulado fue de 145 (h) de cultivo. 3.1.8 Ecuaciones constitutivas Velocidad específica de crecimiento
En general en fermentación sólida se modela el crecimiento de biomasa con una curva logística. Ésta es más apropiada para describir su evolución en la etapa de crecimiento. Sin embargo, la producción de ácido giberélico comienza en la fase estacionaria. Luego, es necesario modelar la evolución de la biomasa en condiciones de limitación de nutrientes en el medio. De esta manera la dependencia de por nitrógeno, se ajusta con una relación de Monod [15].
nIImax
kNN
(3.9)
Velocidad específica de producción de GA3 En este caso se modificó el término de velocidad específica propuesto
por Pastrana et al. [32]. Según la ecuación (3.10) planteada por los autores, una vez que los niveles de nitrógeno son iguales a cero, la producción de GA3 se detiene. Sin embargo, esto no habría sido observado en experiencias de laboratorio. Por tal razón, en la ecuación (3.10) el término se tomó igual a cero, resultando así la ecuación (3.11). Esta última presenta una clara inhibición por nitrógeno intermediario y la producción de hormona comienza una vez que los niveles de intermediario son bajos, siendo ésta máxima una vez que las concentraciones del compuesto nitrogenado llegan a su valor mínimo.
2IiI
IetamNKN
N
(3.10)
Iietam
NK 1 (3.11)
40
La Figura 3.1 muestra cualitativamente las diferencias entre las ecuaciones (3.10) y (3.11).
Figura 3.1: Análisis cualitativo de ecuaciones (3.10) y (3.11).
3.2 Estimación de parámetros Los parámetros del modelo se obtuvieron mediante experiencias en
columnas de laboratorio bajo condiciones de temperatura y actividad de agua controladas (25ºC aw = 0.992, 25ºC aw = 0.999, 31ºC aw = 0.985, 31ºC aw = 0.992, 31ºC aw = 0.999, 36ºC aw = 0.999).
La calibración de todos los parámetros mediante optimización directa no es posible, debido a la no convergencia de la solución paramétrica global. Por tal razón, se procedió a determinar de manera independiente la mayor cantidad de parámetros del modelo y posteriormente, se realizó la calibración del modelo diferencial. 3.2.1 Parámetros independientes del modelo Determinación de max
En primer lugar, como fue analizado en el Capítulo 2, el término max se obtiene a partir del logaritmo natural de la curva acumulada de CO2 y O2, en el intervalo de mayor pendiente [46] (ver Anexo F). Sin embargo, este método
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 2 4 6 8 10
Ecuación (3.10)
Ecuación (3.11)
NI
41
considera que todos los gases generados o utilizados son producto del crecimiento del microorganismo, despreciando la respiración por mantención. Determinación de coeficientes de mantención y muerte
El estudio de respirometría utilizado permitió obtener estimaciones de la constante de muerte del hongo (kd) y los términos de mantención de CO2 y O2 (mCO2 y mO2 respectivamente). En primer lugar, a partir de t0 horas de cultivo es posible despreciar el término de crecimiento de la ecuación (3.1), transformándose en:
XkdtdX
d (3.12)
La solución a la ecuación diferencial (3.12) resulta ser la ecuación (3.13), si kd se supone constante:
)(0 0ttkdeXX (3.13)
De la ecuación anterior t0 y X0 corresponden a constantes de integración. El mismo argumento empleado para la ecuación de crecimiento de
biomasa es utilizado para la ecuación de CO2. A partir de t0 horas de cultivo, el término preponderante en la ecuación (3.7), es el de mantención (mCO2). Por lo tanto, es posible despreciar el término de crecimiento, debido a que la biomasa a partir del instante t0 se encuentra en fase seudoestacionaria. De esta manera la ecuación (3.7) toma la siguiente forma:
XmdtdCO
CO 22 (3.14)
Reemplazando el término de biomasa (X) de la ecuación (3.13) en la ecuación (3.14), se obtiene:
)(0
2 02
ttkCO deXmdt
dCO (3.15)
42
La ecuación (3.15) corresponde a una ecuación diferencial de variables separadas y, por lo tanto, se puede integrar para t y CO2 en forma independiente. Hecho esto, se obtiene:
d
ttkCO
dCO
keXm
kXmCOtCO d )(
00022
022 )()(
(3.16)
Por analogía y repitiendo los mismos pasos para la ecuación de O2, es posible obtener la siguiente expresión:
d
ttkO
dO
keXm
kXmOtO d )(
00022
022 )()(
(3.17)
Los términos 02CO , 0
2O y X0 corresponden a los niveles medidos de dióxido de carbono, oxígeno utilizado y biomasa viva en el instante de tiempo t0. Utilizando la planilla de cálculo EXCEL, se realizó un ajuste por mínimos cuadrados obteniéndose los términos kd, mCO2 y mO2. La Figura 3.2 muestra el ajuste de las ecuaciones (3.16) y (3.17) para condiciones de 25ºC y aw = 0.992. Nótese que ambas curvas (experimental y ajuste) son practicamente idénticas.
Figura 3.2: Ajuste de las ecuaciones (3.16) y (3.17).
25ºC, aw=0.992
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0 50 100 150Tiempo (h)
CO2 y
O2 ac
umula
dos
(gr/gr
.s.i.)
CO2
O2
43
En el Anexo G se muestra el ajuste de las ecuaciones (3.16) y (3.17) para el resto de las experiencias. 3.2.2 Determinación de parámetros mediante ajuste de EDO
Una vez determinados los parámetros max, mCO2, mO2 y kd se procedió a minimizar el error cuadrático entre los valores experimentales (biomasa total, urea, S, GA3, CO2 y O2) y los entregados por el modelo matemático. Aquí se utilizó la función constr del software MATLAB, la cual corresponde a una rutina de optimización restringida, que utiliza un algoritmo de programación cuadrática secuencial [62-65]. Posteriormente se ajustó la constante de degradación de urea (ecuación 3.3), ya que es independiente del resto del modelo. Posteriormente, se ajustaron los parámetros kn e YX/NI, debido a que ellos son los que determinan la forma de las curvas de biomasa viva y medida, y por ende, afectan a las demás ecuaciones del modelo (S, GA3, CO2, O2). Una vez calibradas las curvas de biomasa viva y medida, es posible encontrar los parámetros (YX/S, ms, etam, Ki, kp, YX/CO2, YX/O2) de las ecuaciones (3.5), (3.6), (3.7) y (3.8), las cuales poseen la propiedad de ser independientes entre sí, facilitando con ello enormemente la labor de optimización. Finalmente, los términos de mantención de las ecuaciones de CO2 y O2 son recalibrados. La Figura 3.3 resume cuál fue la secuencia utilizada para ajustar el modelo matemático.
44
Figura 3.3: Resumen de la secuencia para determinar los parámetros del modelo.
Estimación de max, mCO2, mO2 y kd (EXCEL)
mediante EXCEL
Estimación de la constante de degradación de urea (k)
mediante MATLAB (función constr)
Ajuste de kn e YX/NI simultáneamente
mediante MATLAB (función constr)
Ajuste de YX/S y ms Ajuste de etam, Ki y kp
Ajuste de YX/CO2 y recalibración mCO2
Ajuste de YX/O2 y recalibracíón mO2
X0, CO2, O2
GA3
U
S
X
CO2 O2
45
3.3 Resultados y discusión La Tabla 3.1 muestra los parámetros obtenidos mediante respirometría y
calibración, bajo las distintas condiciones de cultivo. Es posible comparar algunos parámetros del modelo con lo reportado en la literatura: max (máxima velocidad específica de crecimiento): como se mencionó
anteriormente, los valores calculados se encuentran dentro de aquellos reportados para otros hongos en CSS [3, 4, 9, 46, 55], los cuales varían entre 0.05 y 0.3 (h-1). Estudios de G. fujikuroi en donde se utiliza vermiculita como soporte inerte [40], reportan un max de 0.17. El valor máximo reportado [39] para G. fujikuroi en medio líquido es de 0.21 (h-1).
kd (constante de muerte de biomasa): los valores obtenidos se encuentran en el rango de valores publicados para otros hongos en medio sólido [13, 66], los cuales varían entre 0.005-0.086 (h-1).
YX/S (coeficiente de rendimiento biomasa/almidón): valores de rendimiento se han reportado [67, 68] en el rango 0.20-0.68 (g X/g S) para hongos en cultivo sobre sustrato sólido. Estudios de G. fujikuroi en donde se utiliza vermiculita como soporte inerte [40] reportan un valor de 0.54 (g X/g azúcar).
ms (coeficiente de mantención): valores para hongos [67] se encuentran en el rango 0.04-0.17 (g fuente energía/g Xh).
YX/CO2 (coeficiente de rendimiento biomasa/CO2): estudios de G. fujikuroi en donde se utiliza vermiculita como soporte inerte [40] reportan un valor de 1.67 (g X/g CO2). Para el hongo Aspergillus oryzae en medio sólido se han reportado [3] valores de 0.8-1.1 (g X/g CO2). Estudios en donde se modela [12] el crecimiento del hongo Rhizopus oligosporus en medio sólido, reportan un valor de 1.31 (g X/g CO2).
YX/O2 (coeficiente de rendimiento biomasa/O2): estudios de hongos en medio líquido [25] reportan valores entre 0.17-1.50 (g X/g O2). En general, los valores obtenidos por simulación superan estos valores.
46
Tabla 3.1: Parámetros del modelo.
A los parámetros se les aplicó un análisis de correlación multivariable [48, 50], tomando como variables independientes a la temperatura y actividad de agua (aw). Mediante este procedimiento, fue posible establecer el grado de dependencia lineal (R2) entre las variables físicas y los parámetros ajustados. Además, el análisis permitió establecer de manera cualitativa el tipo de influencia ejercida por la temperatura y aw sobre los parámetros. Sin embargo, la interpretación de este análisis debe tener en cuenta que existen problemas en la identificación de los parámetros. Esto último significa que en algunos casos pueden existir varias combinaciones de parámetros para una misma ecuación de estado.
Parámetros 25ºCaw=0.992
25ºCaw=0.999
31ºCaw=0.985
31ºCaw=0.992
max (1/h) 0.21 0.24 0.21 0.19kn (g NI/g.s.i.) 7.810-4 4.610-4 3.010-4 2.410-4
kd (1/h) 0.027 0.039 0.027 0.025k (1/h) 1.310-4 510-4 1.510-4 1.310-4
YX/NI (g X/g NI) 21.0 17.0 5.0 9.6YX/S (g X/g S) 0.89 0.18 0.12 0.18ms (g S/g Xh) 0.09 0.08 0.85 0.21YX/CO2 (g X/g CO2) 1.15 1.96 0.75 1.73mCO2 (g CO2/ g Xh) 0.13 0.17 0.43 0.24YX/O2 (g X/g O2) 2.60 3.80 1.22 2.56mO2 (g O2/ g Xh) 0.05 0.07 0.24 0.12etam (g GA3/g Xh) 6.1110-4 5.5810-4 3.110-3 8.810-4
Ki (1/ g NIg.s.i.) 2.95105 2.95105 9.53106 1.33105
kp (1/h) 0.0016 0 0 0
47
La Tabla 3.2 muestra los resultados más relevantes del análisis de correlación.
Tabla 3.2: Análisis de correlación.
Destacan por su alto grado de correlación (R2) los parámetros YX/CO2, YX/O2, kn e YX/NI. En el primer caso, el parámetro de rendimiento YX/CO2 se vio afectado positivamente (+) a medida que la temperatura y actividad de agua aumentan. Para los términos de rendimiento YX/O2 e YX/NI, éstos mostraron disminuir (-) a medida que la temperatura asciende, y por otro lado, mostraron un aumento (+) a medida que la actividad de agua crece. Esta relación entre YX/NI y la temperatura, explicaría en parte, el hecho de que a 25ºC se alcancen las mayores concentraciones de biomasa. Finalmente, el parámetro de ajuste kn, demostró disminuir (-) a medida que la temperatura (Tº) y la actividad de agua (aw) aumentan.
Todas las simulaciones comenzaron a las 0 horas (Anexo H), a excepción de aquella a 25ºC y aw = 0.999. En este caso la simulación comenzó a las 20 (h), debido a que el modelo matemático utilizado no es capaz de reproducir la fase lag.
Se apreció en todas las simulaciones que una vez agotado el nitrógeno intermediario, finaliza el crecimiento neto de biomasa y se inicia la producción de ácido giberélico. Esto último sería consecuente con la ecuación de velocidad específica planteada (ecuación 3.11). Tomemos como ejemplo el cultivo a 25ºC y aw = 0.992. En la Figura 3.4 es posible apreciar las curvas de biomasa, consumo de urea y producción de GA3 simultáneamente.
Parámetros R2 (Tº, aw) Tº awYX/CO2 0.98 + +YX/O2 0.98 - +
kn 0.91 - -YX/NI 0.88 - +
48
Figura 3.4: (a) curva de biomasa medida (línea gruesa) y biomasa viva (línea punteada), (b) consumo de urea y nitrógeno intermediario, (c) producción de GA3.
Para las experiencias a 25ºC y actividades de agua 0.992 y 0.999, se cumplió que una vez agotada la urea del medio, el nitrógeno intermediario se encontraba en altas concentraciones. Esto último permitió que la biomasa continuara su crecimiento hasta agotarse el intermediario. Por otro lado, se observó que los niveles de nitrógeno intermediario a 31ºC y aw = 0.985 y 0.992 se agotaron junto con la urea, deteniendo con ello el crecimiento de la biomasa alrededor de las 25 (h). Los
25ºC, aw=0.992
0
10
20
30
40
50
0 50 100 150
25ºC, aw=0.992
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
0 50 100 1500,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
25ºC, aw=0.992
0,00
0,15
0,30
0,45
0,60
0 50 100 150
Bioma
sa (m
g/g.s.i
.) Ur
ea (m
g/g.s.i
.) GA
3 (mg/g
.s.i.)
Nitrógeno intermediario (mg/g.s.i.)
Tiempo (h)
(c)
(a)
(b)
49
niveles máximos de intermediario parecieran estar relacionados con las concentraciones finales de GA3, ya que mientras mayores son las concentraciones de nitrógeno intermediario, menores son las concentraciones de GA3 excretados por el hongo al finalizar el cultivo.
En todos los casos estudiados, la cinética de degradación de urea mostró ser claramente de orden cero (ver Figura 3.4), desapareciendo del medio de cultivo entre las 20-25 (h). La velocidad de degradación de urea (k) pareciera no estar relacionada con las condiciones físicas de temperatura y actividad de agua.
Al examinar en conjunto las máximas concentraciones de biomasa y producción de ácido giberélico, se concluye que maximizar la producción total de GA3, no necesariamente sería equivalente a maximizar la producción de biomasa total. Esto también habría sido observado por otros investigadores [23]. Nótese que a 31ºC y aw = 0.985-0.999, se obtuvieron las mayores concentraciones de GA3 y se alcanzaron las concentraciones más bajas de biomasa medida.
El ajuste de la fuente de carbono, presentó pequeñas desviaciones con respecto a los datos experimentales. Esto podría deberse a las dificultades asociadas a la medición de dicha variable, producto de la técnica empleada. 3.3.1 Análisis de sensibilidad
Se perturbaron los parámetros nominales del modelo en 30%, con el fin de medir su influencia en las variables simuladas. Se tomó como caso de estudio el cultivo realizado a 25ºC y aw = 0.992. La siguiente ecuación corresponde al índice de sensibilidad empleado:
maxttt
ttt
iXiXi
XiXiS
*/
*/
(3.18)
El término Si representa el análisis de sensibilidad con respecto a la variable i (biomasa viva, biomasa medida, nitrógeno intermediario, fuente de carbono, GA3, CO2 y O2), Xit+/- es la variable de interés perturbada positiva o
50
negativamente, Xit* es la variable nominal y el denominador del índice representa la máxima perturbación de la variable analizada. De esta manera, el término Si queda acotado entre 0 y 1.
La Tabla 3.3 muestra los parámetros que más influyen en las variables de estado y, por lo tanto, cuáles de éstos deben conocerse con una mayor precisión. En primer lugar, la biomasa viva se ve afectada fuertemente por la constante de muerte (kd). La biomasa medida, nitrógeno intermediario y almidón, se ven fuertemente influenciados debido al parámetro YX/NI. Este parámetro afecta a la biomasa medida y a la fuente de carbono de manera indirecta, ya que el término de rendimiento no aparece explícitamente en estas ecuaciones de estado. La producción de ácido giberélico fue más sensible con respecto al parámetro kd, el cual también ejerce su influencia de manera indirecta. En este caso, la producción de hormona depende directamente de las concentraciones de biomasa viva, la cual a su vez depende de la constante de muerte. Finalmente, la producción de CO2 y consumo de O2 presentaron una gran sensibilidad con respecto a los términos de mantención mCO2, mO2 y a YX/NI.
Tabla 3.3: Parámetros más relevantes del análisis de sensibilidad. La Figura 3.5 muestra gráficamente cómo los parámetros de la Tabla 3.3,
afectan a las variables de estado. En todos los casos, se evidenciaron fuertes desviaciones producto de perturbaciones positivas (+30%) y negativas (-30%) efectuadas a los parámetros más importantes del modelo. La concentración de biomasa medida y producción de ácido giberélico fueron las variables más sensibles, producto de perturbaciones en YX/NI y kd respectivamente.
Variables de estado ParámetrosX kdXm YX/NINI YX/NIS YX/NIGA3 kdCO2 mCO2, YX/NIO2 mO2, YX/NI
51
Figura 3.5: Análisis de sensibilidad. Caso de estudio 25ºC, aw = 0.992. Las líneas gruesas representan el caso nominal. +P y –P corresponden a las perturbaciones positivas (+30%) y negativas (-30%) en los parámetros. En la curva de biomasa viva (a) y producción de GA3 (d) se perturbó a kd. En la curva de biomasa medida (a), nitrógeno intermediario (b) y almidón (c) se perturbó al parámetro YX/NI. En las curvas de gases acumuladas (e) fueron perturbados mCO2 y mO2.
25ºC, aw=0.992
0102030405060
0 50 100 150
25ºC, aw=0.992
0
0.4
0.8
1.2
0 50 100 150
25ºC, aw=0.992
0
70
140
210
280
350
0 50 100 150
25ºC, aw=0.992
0.00
0.15
0.30
0.45
0.60
0 50 100 150
25ºC, aw=0.992
0.000.050.100.150.200.250.30
0 50 100 150
CO2
O2
Tiempo (h)
Tiempo (h)
(a)
(c)
(b)
(d)
(e)
Bioma
sa (mg
/g.s.i.)
Almidó
n (mg
/g.s.i.)
Gases
acum
ulados
(g/g.s.
i.)GA3 (mg/g.s.i.)
Nitrógeno intermediario (mg/g.s.i.)
+P
+P
+P
+P
+P
+P
+P
-P
-P
-P
-P
-P-P
-P
52
El parámetro de rendimiento YX/NI aparece en el análisis de sensibilidad como uno de los más importantes, siendo su influencia directa e indirecta. En este caso, no es posible determinar su valor de manera experimental, dado que no se posee información acerca del real intermediario utilizado por el hongo G. fujikuroi.
En el Anexo I se muestra el análisis de sensibilidad realizado in extenso.
53
IV. CONCLUSIONES Bajas temperaturas (25ºC) y altas actividades de agua (aw = 0.992)
favorecen el crecimiento del hongo Gibberella fujikuroi. Sin embargo, a 31ºC y actividades de agua 0.985-0.999 se obtuvieron las mayores concentraciones y productividades de ácido giberélico.
El cultivo de Gibberella fujikuroi sobre sustrato sólido inerte tiene el potencial para lograr altas concentraciones de biomasa. Esto se ve reflejado por los altos valores de max obtenidos, utilizando amberlita como soporte inerte. Sin embargo, podría ser el temprano agotamiento de la urea la causa de los bajos niveles de biomasa máxima alcanzados. Altas concentraciones iniciales de nitrógeno pueden aumentar los niveles de biomasa final, pero a su vez pueden inhibir la producción de GA3. Por lo tanto, una adición programada de nitrógeno durante el cultivo, permitiría alcanzar valores altos de biomasa y de ácido giberélico al mismo tiempo.
La modelación del metabolito secundario no presentó mayores dificultades al momento de emplear expresiones desarrolladas para medios sumergidos. Esto se debería principalmente a que se diferenció entre biomasa activa e inactiva. Los datos experimentales se ajustaron satisfactoriamente en la mayoría de los casos. Sin embargo, el análisis de sensibilidad demostró que las variables de estado presentan importantes desviaciones al perturbar los parámetros del modelo en 30%. Con respecto a la estimación de parámetros, urge la necesidad de determinar métodos adecuados para encontrar valores confiables y precisos. Esto es vital, sobre todo cuando conclusiones son formuladas a partir de ellos.
El modelo desarrollado sienta las bases a la optimización del cultivo de Gibberella fujikuroi, mediante políticas adecuadas de alimentación fed-batch y concentraciones iniciales óptimas del nutriente nitrogenado.
Por otro lado, el modelo aquí expuesto permitirá el desarrollo de estimadores en línea de biomasa, sustrato, GA3 y la optimización de la adición de nutrientes durante el cultivo del hongo Gibberella fujikuroi.
54
V. NOMENCLATURA ai Parámetros de ajuste (i = 0...5) b Parámetro de ajuste ii Parámetros de ajuste (i = 1...4) k Constante de degradación de urea [1/h] kd Constante de muerte [1/h] Ki Constante de inhibición [1/ g NIg.s.i.] kN Parámetro de ajuste [g NI/g.s.i.] kp Constante de degradación de GA3 [1/h] mCO2 Coeficiente de mantención de CO2 [g CO2/g Xh] mO2 Coeficiente de mantención de O2 [g O2/g Xh] ms Coeficiente de mantención de almidón [g S/g Xh] NI Nitrógeno intermediario [g/g.s.i.] S Fuente de carbono [g/g.s.i] S0 Almidón inicial [mg/g.s.i.] Si Análisis de sensibilidad con respecto a la variable i s.i. Soporte inerte t Tiempo [h] U Nutriente urea [g/g.s.i.] X Biomasa viva [g/g.s.i.] Xit+/- Variable de interés perturbada positiva o negativamente Xit* Variable nominal Xm Biomasa medida [g/g.s.i.] YX/CO2 Coeficiente de rendimiento biomasa/CO2 [g X/g CO2] YX/NI Coeficiente de rendimiento biomasa/nitrógeno intermediario [g X/g NI] YX/O2 Coeficiente de rendimiento biomasa/O2 [g X/g O2] YX/S Coeficiente de rendimiento biomasa/almidón [g X/g S] Tasa específica de aparición de GA3 [1/h] etam Valor de ajuste [g GA3/g Xh] Tasa específica crecimiento de biomasa [1/h] max Máxima velocidad específica de crecimiento [1/h]
55
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64
A N E X O S
65
ANEXO A: CÁLCULO DE MAX Como ejemplo utilicemos el cultivo a 25ºC y aw = 0.992. En primer
lugar, se aplicó un polinomio de tercer orden a los gases instantáneos en el intervalo 10-30 (h). La Figura A (a) muestra el polinomio ajustado con intervalos de 95% de confianza para las curvas de CO2 y O2 instantáneas. Estas curvas son integradas en EXCEL, obteniéndose la curva acumulada para ambos gases (Figura A (b)). A los gases acumulados se les aplica logaritmo natural y luego se calcula la pendiente en el intervalo de mayor crecimiento (A (c)). Nótese que en ambos casos, los rangos de valores son prácticamente idénticos.
25ºC, aw=0.992
0
0.0002
0.0004
0.0006
0.0008
0 5 10 15 20 25
25ºC, aw=0.992
0
0.0002
0.0004
0.0006
0.0008
0 5 10 15 20 25
25ºC, aw=0.992
y = 0.21x - 11.79y = 0.24x - 12.52
y = 0.19x - 11.30
-11
-10
-9
-8
-7
-60 5 10 15 20 25
25ºC, aw=0.992
y = 0.21x - 12.21y = 0.23x - 12.79
y = 0.19x - 11.74
-11
-10
-9
-8
-7
-60 5 10 15 20 25
O2 Instantáneo
(mol/g.s.i.min) ln(O
2 ) CO
2 Acum
ulado
(mol/g
.s.i.)
CO2 In
stantá
neo
(mol/g
.s.i.m
in)
O2 Acumulado (mol/g.s.i.)
ln(CO
2)
Tiempo (h) Tiempo (h)
(a) (a)
(b) (b)
(c) (c)
25ºC, aw=0.992
0.0E+00
4.0E-07
8.0E-07
1.2E-06
1.6E-06
0 5 10 15 20 25
25ºC, aw=0.992
0.0E+00
4.0E-07
8.0E-07
1.2E-06
1.6E-06
0 5 10 15 20 25
Anexo A: 25ºC, aw = 0.992. (a) gases instantáneos con intervalos de 95% de confianza, (b) gases acumulados con intervalos de 95% de confianza, (c) pendientes del logaritmo natural de los gases acumulados.
66
Tiempo (h) Tiempo (h)
CO2 In
stantá
neo(m
ol/g.s.i
. min)
0.0E+00
4.0E-07
8.0E-07
1.2E-06
1.6E-06
0 5 10 15 20 25 30
25ºC, aw=0.999
0.0E+00
4.0E-07
8.0E-07
1.2E-06
1.6E-06
0 5 10 15 20 25 30
25ºC, aw=0.999
0.0E+00
1.5E-04
3.0E-04
4.5E-04
6.0E-04
0 5 10 15 20 25 30
25ºC, aw=0.999
0.0E+00
1.5E-04
3.0E-04
4.5E-04
6.0E-04
0 5 10 15 20 25 30
25ºC, aw=0.999
(a) (a)
(b) (b)
(c)(c)
O2 Instantáneo
(mol/g.s.i. min)ln(O
2 )CO
2 Acum
ulado
(mol/g
.s.i.)
O2 Acumulado(mol/g.s.i.)
ln(CO
2)
y = 0.20x - 13.26
y = 0.26x - 14.54y = 0.23x - 13.80-12
-11
-10
-9
-80 5 10 15 20 25 30
25ºC, aw=0.999
y = 0.27x - 14.35
y = 0.19x - 12.39y = 0.23x - 13.22
-12
-11
-10
-9
-8
-7
-60 5 10 15 20 25 30
25ºC, aw=0.999
Anexo A: 25ºC, aw = 0.999. (a) gases instantáneos con intervalos de 95% de confianza, (b) gases acumulados con intervalos de 95% de confianza, (c) pendientes del logaritmo natural de los gases acumulados.
67
CO
2 Acum
ulado
(mol/g
.s.i.)
0.0E+00
4.0E-04
8.0E-04
1.2E-03
1.6E-03
0 5 10 15 20 25 30
31ºC, aw=0.985
0.0E+00
4.0E-04
8.0E-04
1.2E-03
1.6E-03
0 5 10 15 20 25 30
31ºC, aw=0.985
Tiempo (h)
(b)
O2 Instantáneo
(mol/g.s.i. min)ln(O
2 )
CO2 In
stantá
neo(m
ol/g.s.i
. min)
O2 Acumulado(mol/g.s.i.)
Tiempo (h)
(a)
(b)
(c)
ln(CO
2)
(a)
(c)y = 0.22x - 11.66
y = 0.17x - 10.42
y = 0.19x - 10.93
-10
-9
-8
-7
-60 5 10 15 20 25 30
31ºC, aw=0.985
y = 0.20x - 11.42y = 0.17x - 10.92
y = 0.16x - 10.54
-10
-9
-8
-7
-60 5 10 15 20 25 30
31ºC, aw=0.985
0.0E+00
4.0E-07
8.0E-07
1.2E-06
1.6E-06
0 5 10 15 20 25 30
31ºC, aw=0.985
0.0E+00
4.0E-07
8.0E-07
1.2E-06
1.6E-06
0 5 10 15 20 25 30
31ºC, aw=0.985
Anexo A: 31ºC, aw = 0.985. (a) gases instantáneos con intervalos de 95% de confianza, (b) gases acumulados con intervalos de 95% de confianza, (c) pendientes del logaritmo natural de los gases acumulados.
68
0.0E+00
4.0E-07
8.0E-07
1.2E-06
1.6E-06
0 5 10 15 20 25 30
31ºC, aw=0.992
0.0E+00
4.0E-07
8.0E-07
1.2E-06
1.6E-06
0 5 10 15 20 25 30
31ºC, aw=0.992
0.0E+00
2.0E-04
4.0E-04
6.0E-04
8.0E-04
0 5 10 15 20 25 30
31ºC, aw=0.992
0
0.0002
0.0004
0.0006
0.0008
0 5 10 15 20 25 30
31ºC, aw=0.992
y = 0.23x - 12.353
y = 0.20x - 11.61y = 0.18x - 11.09
-11
-10
-9
-8
-7
-60 5 10 15 20 25 30
31ºC, aw=0.992
y = 0.21x - 12.41y = 0.19x - 11.94
y = 0.18x - 11.57
-11
-10
-9
-8
-7
-60 5 10 15 20 25 30
31ºC, aw=0.992
CO2 A
cumula
do(m
ol/g.s.i
.)
Tiempo (h)
(b)
O2 Instantáneo
(mol/g.s.i. min)ln(O
2 )
CO2 In
stantá
neo(m
ol/g.s.i
. min)
O2 Acumulado(mol/g.s.i.)
Tiempo (h)
(a)
(b)
ln(CO
2)
(a)
(c) (c)
Anexo A: 31ºC, aw = 0.992. (a) gases instantáneos con intervalos de 95% de confianza, (b) gases acumulados con intervalos de 95% de confianza, (c) pendientes del logaritmo natural de los gases acumulados.
69
0.0E+00
4.0E-07
8.0E-07
1.2E-06
1.6E-06
0 5 10 15 20 25 30
31ºC, aw=0.999
0.0E+00
4.0E-07
8.0E-07
1.2E-06
1.6E-06
0 5 10 15 20 25 30
36ºC, aw=0.999
0
0.0004
0.0008
0.0012
0.0016
0 5 10 15 20 25 30
31ºC, aw=0.999
0
0.0004
0.0008
0.0012
0.0016
0 5 10 15 20 25 30
36ºC, aw=0.999
y = 0.15x - 10.05y = 0.14x - 9.82
y = 0.14x - 9.93
-10
-9
-8
-7
-60 5 10 15 20 25 30
31ºC, aw=0.999
y = 0.17x - 11.07y = 0.15x - 10.57
y = 0.14x - 10.19
-10
-9
-8
-7
-60 5 10 15 20 25 30
36ºC, aw=0.999
CO2 A
cumula
do(m
ol/g.s.i
.)
Tiempo (h)
(b)
CO2 In
stantá
neo(m
ol/g.s.i
.min)
Tiempo (h)
(a)
(b)
ln(CO
2)
(a)
(c) (c)
ln(CO2 )
CO2 Acumulado
(mol/g.s.i.)CO
2 Instantáneo(mol/g.s.i.min)
Anexo A: 31 y 36ºC, aw = 0.999. (a) gases instantáneos con intervalos de 95% de confianza, (b) gases acumulados con intervalos de 95% de confianza, (c) pendientes del logaritmo natural de los gases acumulados.
70
ANEXO B: CURVAS DE CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIDA
Anexo B: Biomasa medida. () datos experimentales; las líneas superiores e inferiores representan los intervalos de 95% de confianza; la línea intermedia representa el valor promedio de biomasa.
25ºC, aw=0.992
01020304050
0 50 100 150
25ºC, aw=0.999
01020304050
0 50 100 150
31ºC, aw=0.985
01020304050
0 50 100 150
31ºC, aw=0.992
01020304050
0 50 100 150
31ºC, aw=0.999
01020304050
0 50 100 150
36ºC, aw=0.999
01020304050
0 50 100 150Tiempo (h) Tiempo (h)
Bioma
sa (m
g/g.s.i
.)
71
ANEXO C: GASES INSTANTÁNEOS Y DEGRADACIÓN DE UREA
Anexo C: Relación entre producción de CO2 (), O2 () y evolución de urea ().
25ºC, aw=0.992
0.0E+00
6.0E-07
1.2E-06
1.8E-06
2.4E-06
0 50 100 1500.0
1.5
3.0
4.5
6.0 25ºC, aw=0.999
0.0E+00
6.0E-07
1.2E-06
1.8E-06
2.4E-06
0 50 100 1500.0
1.5
3.0
4.5
6.0
31ºC, aw=0.985
0.0E+00
6.0E-07
1.2E-06
1.8E-06
2.4E-06
0 50 100 1500.0
1.5
3.0
4.5
6.0
31ºC, aw=0.999
0.0E+00
6.0E-07
1.2E-06
1.8E-06
2.4E-06
0 50 100 1500.0
1.5
3.0
4.5
6.0 36ºC y aw=0.999
0.0E+00
6.0E-07
1.2E-06
1.8E-06
2.4E-06
0 50 100 1500.0
1.5
3.0
4.5
6.0
Tiempo (h) Tiempo (h)
31ºC y aw=0.992
0.0E+00
6.0E-07
1.2E-06
1.8E-06
2.4E-06
0 50 100 1500.0
1.5
3.0
4.5
6.0 Urea (mg/g.s.i.)Gases
instan
táneos
(mol/g
.s.i. m
in)
72
ANEXO D: PRODUCCIÓN DE ÁCIDO GIBERÉLICO
Anexo D: Producción de ácido giberélico (), las líneas superiores e inferiores representan los intervalos de 95% de confianza; la línea intermedia representa el valor promedio de GA3.
25ºC, aw=0.992
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 50 100 150 200
25ºC, aw=0.999
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 50 100 150 200
31ºC, aw=0.985
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 50 100 150 200
31ºC, aw=0.992
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 50 100 150 200
Tiempo (h)
36ºC, aw=0.999
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 50 100 150 200Tiempo (h)
Ácido
giberé
lico (m
g/g.s.i
.)
31ºC, aw=0.999
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 50 100 150 200
C/N = 40 C/N = 55
C/N = 87 C/N = 49
C/N = 6 C/N = 8
73
ANEXO E: GASES ACUMULADOS Y RQ
Anexo E: CO2 y O2 acumulado por gramo de soporte inerte (g.s.i.). RQ de las experiencias a 25ºC aw = 0.992, 0.999, 31ºC aw = 0.985 y 0.992.
Tiempo (h)
O 2 acu
mulad
o (mol/g
.s.i.)
CO2 ac
umula
do (m
ol/g.s.i
.)
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0 50 100 150
25ºC, aw=0.992
25ºC, aw=0.999
31ºC, aw=0.98531ºC, aw=0.992
31ºC, aw=0.99936ºC, aw=0.999
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0 50 100 150
25ºC, aw=0.999
31ºC, aw=0.992
31ºC, aw=0.985 25ºC, aw=0.992
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0 50 100 150
25ºC, aw=0.992
31ºC, aw=0.985
31ºC, aw=0.992
25ºC, aw=0.999
Tiempo (h)
R.Q.
74
ANEXO F: DEGRADACIÓN DE ALMIDÓN
Anexo F: Consumo de almidón (); las líneas superiores e inferiores representan los intervalos de 95% de confianza; la línea intermedia representa el valor promedio de almidón.
25ºC, aw=0.992
0
100
200
300
400
0 50 100 150
25ºC, aw=0.999
0
100
200
300
400
0 50 100 150
31ºC, aw=0.992
0
100
200
300
400
0 50 100 150
Tiempo (h) Tiempo (h)
Almidó
n (mg
/g.s.i.)
31ºC, aw=0.985
0
100
200
300
400
0 50 100 150
31ºC, aw=0.999
0
100
200
300
400
0 50 100 150
36ºC, aw=0.999
0
100
200
300
400
0 50 100 150
75
ANEXO G: AJUSTE DE LAS ECUACIONES (3.16) Y (3.17)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0 50 100 150
25ºC, aw=0.999
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0 50 100 150
31ºC, aw=0.985
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0 50 100 150
31ºC, aw=0.985
Tiempo [h]
CO2 y
O2 ac
umula
dos[gr
/gr.s.i
.]CO2
O2
CO2
O2
CO2
O2
76
ANEXO H: SIMULACIONES DE LOS CULTIVOS
25ºC, aw=0.992
0
10
20
30
40
50
0 50 100 150
25ºC, aw=0.992
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
0 50 100 150
25ºC, aw=0.992
0.0
0.4
0.8
1.2
0 50 100 150
25ºC, aw=0.992
0
70
140
210
280
350
0 50 100 150
25ºC, aw=0.992
0.00
0.15
0.30
0.45
0.60
0 50 100 150
25ºC, aw=0.992
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0 50 100 150
(a)
(c)
(b)
(d)
(e) (f)
Tiempo (h) Tiempo (h)
Bioma
sa (m
g/g.s.i
.) Urea (mg/g.s.i.)Almidón (mg/g.s.i.)
Gases acumulados (g/g.s.i.)
GA3 (m
g/g.s.i
.)Nit
rógeno
interm
ediari
o (m
g/g.s.i
.)
CO2
O2
Anexo H: 25ºC, aw = 0.992. () datos experimentales. (a) línea punteada representa a la biomasa viva, (f) línea delgada representa a los datos experimentales.
77
25ºC, aw=0.999
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
0 50 100 150
25ºC, aw=0.999
0
10
20
30
40
50
0 50 100 150
25ºC, aw=0.999
0.0
0.4
0.8
1.2
0 50 100 150
25ºC, aw=0.999
0
70
140
210
280
350
0 50 100 150
25ºC, aw=0.999
0.00
0.15
0.30
0.45
0.60
0 50 100 150
25ºC, aw=0.999
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0 50 100 150
(a)
(c)
(b)
(d)
(e) (f)
Bioma
sa (m
g/g..s.
i.) Urea (mg/g.s.i.)Almidón (mg/g.s.i.)
Gases acumulados (g/g.s.i.)
GA3 (m
g/g.s.i
.)Nit
rógeno
interm
ediari
o (m
g/g..s.i
.)
Tiempo (h) Tiempo (h)
CO2
O2
Anexo H: 25ºC, aw = 0.999. () datos experimentales. (a) línea punteada representa a la biomasa viva, (f) línea delgada representa a los datos experimentales.
78
31ºC, aw=0.985
0
10
20
30
40
50
0 50 100 150
31ºC, aw=0.985
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
0 50 100 150
31ºC, aw=0.985
0.0
0.4
0.8
1.2
0 50 100 150
31ºC, aw=0.985
0
70
140
210
280
350
0 50 100 150
31ºC, aw=0.985
0.00
0.15
0.30
0.45
0.60
0 50 100 150
31ºC, aw=0.985
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0 50 100 150
(a)
(c)
(b)
(d)
(e) (f)
Bioma
sa (m
g/g.s.i
.) Urea (mg/g.s.i.)Almidón (mg/g.s.i.)
Gases acumulados (g/g.s.i.)GA
3 (mg/g
.s.i.)
Nitróg
eno int
ermedi
ario
(mg/g
.s.i.)
Tiempo (h) Tiempo (h)
CO2
O2
Anexo H: 31ºC, aw = 0.985. () datos experimentales. (a) línea punteada representa a la biomasa viva, (f) línea delgada representa a los datos experimentales.
79
31ºC, aw=0.992
0
10
20
30
40
50
0 50 100 150
31ºC, aw=0.992
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
0 50 100 150
31ºC, aw=0.992
0
0.4
0.8
1.2
0 50 100 150
31ºC, aw=0.992
0
70
140
210
280
350
0 50 100 150
31ºC, aw=0.992
0.00
0.15
0.30
0.45
0.60
0 50 100 150
31ºC, aw=0.992
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0 50 100 150
(a)
(c)
(b)
(d)
(e) (f)
Bioma
sa (mg
/g.s.i.) Urea (mg/g.s.i.)
Almidón (mg/g.s.i.)Gases acumulados (g/g.s.i.)
GA3 (m
g/g.s.i
.)Nit
rógeno
interm
ediari
o (m
g/g.s.i
.)
Tiempo (h) Tiempo (h)
CO2
O2
Anexo H: 31ºC, aw = 0.992. () datos experimentales. (a) línea punteada representa a la biomasa viva, (f) línea delgada representa a los datos experimentales.
80
ANEXO I: ANÁLISIS DE SENSIBILIDAD 25ºC Y AW =0.992
X Xm NI S+30% -30% S+ S- <S> S+ S- <S> S+ S- <S> S+ S- <S>
0.27 0.147 0.58 0.73 0.66 0.15 0.27 0.21 0.60 0.66 0.63 0.15 0.29 0.2210.110-4 5.4610-4 0.40 0.36 0.38 0.11 0.13 0.12 0.66 0.46 0.56 0.12 0.12 0.120.0346 0.0186 0.86 1.00 0.93 0.04 0.04 0.04 0.27 0.15 0.21 0.51 0.70 0.61
- 1.7310-4 0.9310-4 0.45 0.56 0.51 0.12 0.19 0.16 1.00 0.70 0.85 0.11 0.20 0.16
27.29 14.70 1.00 0.77 0.89 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.001.1618 0.6256 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.27 0.49 0.380.1186 0.0638 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.88 0.85 0.87
GA3 CO2 O2
Xi* +30% -30% S+ S- <S> S+ S- <S> S+ S- <S>max 0.21 0.27 0.147 0.76 0.88 0.82 0.15 0.29 0.22 0.15 0.29 022
kn 7.810-4 10.110-4 5.4610 -4 0.69 0.53 0.61 0.11 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12
kd 0.0266 0.0345 0.0186 1.00 1.00 1.00 0.58 0.81 0.70 0.58 0.80 0.69
k 1.3310-4 1.7310-4 0.9310 -4 0.18 0.29 0.24 0.11 0.21 0.16 0.11 0.21 0.16
YX/NI 20.99 27.29 14.70 0.55 0.39 0.47 0.97 1.00 0.99 0.99 1.00 1.00
mCO2 0.1322 0.1719 0.0925 0 0 0 1.00 1.00 1.00 0 0 0
YX/CO2 1.154 1.50 0.808 0 0 0 0.17 0.32 0.25 0 0 0
mO2 0.0544 0.0707 0.0381 0 0 0 0 0 0 1.00 1.00 1.00
YX/O2 2.604 3.385 1.823 0 0 0 0 0 0 0.18 0.33 0.26
m 6.1110-4 7.9410-4 4.2810 -4 0.74 0.50 0.62 0 0 0 0 0 0
K i 2.95105 3.84105 2.07105 0.10 0.10 0.10 0 0 0 0 0 0
kp 0.0016 0.0021 0.0011 0.05 0.03 0.04 0 0 0 0 0 0
81
ANEXO J: CÁLCULO DE LA CONSTANTE DE MUERTE Otra manera de calcular la constante de muerte (kd) del microorganismo
es la que a continuación se detalla.. A partir de t0 horas de cultivo es posible despreciar el término de crecimiento de la ecuación (3.1), transformándose en:
XkdtdX
d (1)
El mismo argumento empleado para la ecuación de crecimiento es utilizado para la ecuación de CO2 (ecuación 3.7). A partir de t1 horas de cultivo, el término preponderante en la ecuación (3.7), es el de mantención (mCO2). Por lo tanto, es posible despreciar el término de crecimiento, debido a que la biomasa a partir del instante t1 se encuentra en fase seudoestacionaria. De esta manera la ecuación (3.7) toma la siguiente forma:
XmdtdCO
CO 22 (2)
Derivando la ecuación (2) y reemplazando la ecuación (1) se obtiene:
XkmdtdXmdt
COddCOCO 222
22 (3)
Despejando de la ecuación (2) el término X y reemplanzando en la ecuación (3) se obtiene:
dtdCOkdt
COdd 2
22
2 (4)
82
La ecuación (4) corresponde a una ecuación diferencial de 2º orden cuya solución es:
tktktktktk
tktkd
dddd
dd eeeCOCO
eeCOeCOetCO
2121
21 22
12
12
222 )( (5)
Donde 12CO y 2
2CO son las cantidades de CO2 acumulado para los tiempos t1 y t2 respectivamente.
