Volumen 64, Broj 11 VOJNOSANITETSKI PREGLED Strana 739

Correspondence to: Snežana Đorđević, Vojnomedicinska akademija, Centar za kontrolu trovanja, Crnotravska 17, 11040 Beograd, Srbija.Tel.: +381 11 36 09 481

O R I G I N A L N I Č L A N A K UDC: 615.212.7:615.9.07]:543.544.5

Analitička potvrda letalnog predoziranja heroinom primenom metodatečne hromatografije

Analytical confirmation of lethal heroin overdose by the use of liquidchromatography methods

Snežana Đorđević, Vesna Kilibarda

Vojnomedicinska akademija, Centar za kontrolu trovanja, Beograd

Apstrakt

Uvod/Cilj. Heroin je diacetilovani morfin. Svojstvo da izazi-va euforiju dovodi do njegove česte zloupotrebe i posledičnodo fizičke i psihičke zavisnosti. Heroin ima kratak poluživotkoji iznosi 2−6 min. U mozgu podleže deacetilaciji do 6-monoacetilmorfina (6−MAM) i morfina. Detekcija 6−MAM uurinu ukazuje na korišćenje heroina. Cilj ovog rada bio je dase uporede pouzdanost i osetljivost dve analitičke metode, vi-šekolonske tečne hromatografije sa UV skenirajućim detekto-rom (HPLC-UV) i tečne hromatografije sa masenom spek-trometrijom (LC-MS) u određivanju opijata u post mortemmaterijalu. Metode. Post mortem uzorci krvi, urina i očne vodi-ce analizirani su primenom tečne hromatografije sa UV i MSdetektorom. Uzorci su pripremani alkalnom (pH 9) tečno-tečnom ekstrakcijom sa smešom hloroform-izopropanol(9:1). Razdvajanje morfina, kodeina i 6-MAM LC-MS meto-dom vršeno je na C8 koloni uz primenu mobilne faze sastav-ljene od 55% acetonitrila sa koncentrovanom sirćetnom kise-linom (99:1) i 45% 20 mM amonijumacetata. Rezultati. Ana-lizom uzoraka krvi, urina i očne vodice primenom višekolon-ske HPLC-UV metode morfin je dokazan u uzorcima krvi iurina, kodein samo u urinu, a 6-MAM u uzorcima urina i oč-ne vodice. Primenom LC-MS metode morfin je dokazan usvim uzorcima, a kodein je dokazan u urinu i u uzorku očnevodice. U uzorcima očne vodice i urina dokazan je 6-MAM.Zaključak. Tehnika LC-MS znatno je osetljivija i pouzdanijau odnosu na višekolonsku tečnu hromatografiju u određiva-nju opijata u post mortem materijalu.

Ključne reči:heroin; predoziranost; hromatografija, tečna;toksikologija, forenzička.

Abstract

Background/Aim. Heroin is diacetylated morphine. Its abilityto induce euphoria has led to its frequent abuse, giving rise topsychological and physical dependence. It has a short half-life,of approximately 2−6 min. In the brain, heroin undergoesdeacetylation to 6-monoacetylmorphine (6−MAM) and mor-phine. Detection of 6-acetylmorphine in the urine is indicativeof heroin use. The aim of this study was to compare sensitivityand reliability of two analytical methods, a multicolumn liquidchromatography system with UV scanning detector (HPLC-UV) and liquid chromatography-mass spectrometry detection(LC-MS) in opiate determining in post mortem material. Meth-ods. Post mortem samples (blood, urine and vitreous humor)were analyzed by liquid chromatography with UV and MS de-tection. The samples were prepared by liquid-liquid extractionwith mixture chloroform-isopropanol (9:1). Separation wasperformed on C8 column with mobile phase composed of55% acetonitrile-glacial acetic acid (99:1) and 45% 20 mM am-monium acetate. Results. The analysis of blood samples, urine,and eye liquid by the use of multicolumn HPLC-UV methodconfirmed the presence of morphine in the samples of bloodand urine, codeine only in urine, and 6-MAM in the samples ofurine and eye liquid. Using LC-MS method morphine was con-firmed in all of the samples, while codeine was confirmed inurine and in the sample of eye liquid. In the samples of eye liq-uid and urine 6-MAM was confirmed. Conclusion. For de-termination of opiates in post mortem material LC-MS techniqueis more sensitive and reliable as compared to multicolumn liq-uid chromatography.

Key words:heroin; overdose; chromatography, liquid; forensictoxicology.

Uvod

Heroin je diacetil morfin. Dobija se iz morfina ace-tilovanjem položaja tri i šest. Ima izuzetno kratak poluži-vot, svega 2−6 min. Metaboliše se do 6-monoacetil-

morfina (6-MAM) i morfina. Poluživot 6-MAM je 6−25min. Morfin se u drugoj fazi metabolizma konjuguje saglukuronskom kiselinom i izlučuje urinom. Heroin i 6-MAM su liposolubilniji od morfina i zato brže prolaze umozak 1−2.

Strana 740 VOJNOSANITETSKI PREGLED Volumen 64, Broj 11

Đorđević S, Kilibarda V. Vojnosanit Pregl 2007; 64(11): 739–743.

Ukoliko se morfin dokaže u uzorku urina, to potvrđujenjegovo uzimanje u poslednja 2−3 dana ili duže kod hroničneupotrebe. Pozitivan 6-MAM ukazuje na korišćenje heroina 1−2.

Najčešće primenjivana tehnika za detekciju opijata jeimunoenzimska tehnika 3−5. Međutim, zbog male osetljivostii nespecifičnosti često se primenjuju druge tehnike kao što suvišekolonska tečna hromatografija sa UV skenirajućom dete-kcijom (high performamce liquid chromatography with UVscanning detection − HPLC-UV) 5, 6, gasna 7−9 i tečna hro-matografija sa masenom spektrometrijskom detekcijom(liquid chromatography with mass spectrometry detection −LC−MS) 10−12.

Cilj rada bio je upoređivanje rezultata dobijenih anali-zom uzoraka post mortem materijala na sadržaj opijata mor-finske strukture višekolonskom HPLC-UV metodom sa re-zultatima analize LC-MS metode.

Metode

Uzorci krvi, urina i očne vodice uzeti su prilikom obdu-kcije. Svi uzorci su čuvani na -20 °C do analize. Hloroform,izopropanol, amonijak, koncentrovana sirćetna kiselina imetanol (HPLC čistoće) nabavljeni su od firme Merck,Darmstadt, Nemačka.

Reagensi (mobilne faze i smeša internih standarda) kojisu korišćeni za analizu na višekolonskom sistemu za tečnuhromatografiju dobijeni su od proizvođača Bio-Rad Diagnos-

tics Group, Hercules, SAD. Aparati: Višekolonski HPLC-UVsistem Bio-Rad Diagnostics Group, Hercules, SAD; masenispektrometar sa elektrosprej jonizacijom (Finnigan MATSSQ7000 LC/MS – ESI System), tečni hroma-tograf Thermo Separation Products SpectraSystem (Autosampler AS3000, HPLC binarnapumpa P2000, Degaser SCM1000), kolona (Li-chrospher 100 RP-8 E 250-4, 5 μm, Merck),pretkolona (Lichrochart 4 - 4 RP-8, Merck,Darmstadt, Nemačka; mobilna faza 55% aceto-nitrila sa koncentrovanom sirćetnom kiselinom(99:1) i 45% 20 mM amonijumacetata, protok 1ml/min).

Uzorci urina i očne vodice za analizu navišekolonskom HPLC sistemu sa UV skenira-jućim detektorom analizirani su bez prethodneekstrakcije uz dodatak smeše internih standar-da. Uzorci krvi, urina i očne vodice ekstraho-

vani su alkalnom ekstrakcijom (pH 9) sa smešom hloroform-izopropanol (9:1 v/v) 13. Posle ekstrakcije, dobijeni suvi os-taci rekonstituisani su u mobilnoj fazi i analizirani LC-MSmetodom.

Na isti način urađena je i ekstrakcija seruma i urina op-terećenih standardnim rastvorima morfina, 6-MAM i kodeinakoncentracija 0,1, 0,5 i 1 mg/l.

Za izračunavanje koncentracija morfina, 6-MAM i ko-deina posle analize na višekolonskom HPLC-UV sistemu ko-rišćeni su podaci za faktor odgovora (response factor − RF)vrednosti iz biblioteke za ova tri jedinjenja. Određivanjekoncentracija LC-MS tehnikom vršeno je poređenjem povr-šine pikova analiziranih jedinjenja sa odgovarajućim piko-vima seruma i urina opterećenih standardnim rastvorima po-znatih koncentracija.

Rezultati

Analizom uzoraka krvi, urina i očne vodice primenomvišekolonske HPLC-UV metode morfin je dokazan u uzor-cima krvi i urina, kodein samo u urinu, a 6-MAM u uzorcimaurina i očne vodice. Primenom LC-MS metode morfin je do-kazan u svim uzorcima, a kodein u urinu i u uzorku očne vo-dice. U uzorcima očne vodice i urina dokazan je 6-MAM.

Rezultati dobijeni poređenjem sa serumima i urinimaopterećenim standardnim rastvorima morfina, kodeina i 6-MAM prikazani su u tabeli 1.

Na slikama 1−4 prikazani su hromatogrami uzorka uri-na i UV spektri morfina, kodeina i 6-monoacetil morfina po-sle analize na višekolonskom HPLC sistemu.

Sl. 1 − HPLC-UV − hromatogram dobijen primenom višekolonsketečne hromatografije sa ultravioletnom skenirajućom detekcijom

Tabela 1Koncentracije detektovanih opijata u biološkom materijalu

dobijene HPLC-UV i LC-MS metodom

Analitičke metode Biološki materijal Morfin(mg/l)

Kodein(mg/l)

6-monoacetil morfin(mg/l)

Krv 0,0391 – –HPLC-UV Urin 2,5661 0,3077 0,9002

Očna vodica – – 0,1063Krv 0,1677 – –

LC-MS Urin 3,6865 0,2195 1,3281Očna vodica 0,0325 0,0062 1,4684

Volumen 64, Broj 11 VOJNOSANITETSKI PREGLED Strana 741

Đorđević S, Kilibarda V. Vojnosanit Pregl 2007; 64(11): 739–743.

Sl. 2 − UV spektri morfina iz biblioteke i uzorka

Sl.3 − UV spektri kodeina iz biblioteke i uzorka

Sl. 4 − UV spektri 6-monoacetil morfina iz biblioteke iuzorka

Na slikama 5−8 prikazani su hromatogram uzorka urinaposle analize LC-MS metodom i maseni spektri morfina, ko-deina i 6-monoacetilmorfina.

Sl. 5 − LC-MS − hromatogrami dobijeni tečnom hromatografijom samasenom spektrometrijskom detekcijom

Strana 742 VOJNOSANITETSKI PREGLED Volumen 64, Broj 11

Đorđević S, Kilibarda V. Vojnosanit Pregl 2007; 64(11): 739–743.

Sl. 6 − Maseni spektar kodeina

Sl. 7 − Maseni spektar morfina

Sl. 8 − Maseni spektar 6-monoacetil morfina

Diskusija

Višekolonski HPLC sistem sa UV detektorom proizvo-đača Bio-Rad je analitički instrument razvijen za screening to-ksikološki značajnih jedinjenja u biološkom materijalu. Za-hvaljujući biblioteci spektara koju poseduje, primenjuje se kaoscreening tehnika za istovremenu identifikaciju velikog brojatoksikološki značajnih jedinjenja. Može se iskoristiti i kao se-mikvantitativni test za određivanje koncentracija supstancija ubiološkom materijalu. Biblioteka instrumenta raspolaže RFvrednostima za većinu lekova i aktivnih metabolita. Množe-njem vrednosti površine pika sa izveštaja sa vrednošću RF zadato jedinjenje dobija se koncentracija analiziranog jedinjenjau ng/ml. Ovaj višekolonski HPLC sistem preporučuje se u ci-lju preliminarnih analiza, a dobijene rezultate neophodno jepotvrditi nekom drugom tehnikom od kojih se najčešće prepo-ručuje masena spektrometrija. Takođe, negativan rezultat neisključuje odsustvo supstancije iz uzorka, pa je neophodna iprimena drugih tehnika u cilju pravilne analize uzorka.

Tečna hromatografija sa maseno-spektrometrijskimdetektorom je veoma pouzdana i osetljiva tehnika. Prednostove tehnike u odnosu na gasnu hromatografiju sa MS detek-torom je u tome što se mogu određivati i jedinjenja koja suneisparljiva i termolabilna. Primena ove tehnike je od veli-kog značaja naročito u sudsko-medicinskim analizama. Zbogtoga su uzorci krvi, očne vodice i urina analizirani osimHPLC-UV i LC-MS tehnikom.

Rezultati dobijeni primenom ove dve tehnike veoma serazlikuju. Ove razlike se javljaju jer je LC-MS tehnika znat-

Volumen 64, Broj 11 VOJNOSANITETSKI PREGLED Strana 743

Đorđević S, Kilibarda V. Vojnosanit Pregl 2007; 64(11): 739–743.

no osetljivija od višekolonske tečne hromatografije sa UVspektralnom potvrdom. Limit detekcije za morfin, 6-MAM ikodein na opisanom višekolonskom HPLC-UV sistemu je0,1 mg/l. Limiti detekcije LC-MS metode za morfin i 6-MAM bili su 0,01 mg/l, a za kodein 0,05 mg/l.

U skladu sa tim je i činjenica da su morfin (0,0325mg/l) i kodein (0,0062 mg/l) u uzorku očne vodice detekto-vani samo primenom LC-MS tehnike, što je postignutoukoncentrisavanjem uzorka.

U ispitivanju, kojim je bilo obuhvaćeno 63 ispitanikakoji su primili heroin u dozi od 0,635 g, koncentracija morfi-na bila je 17,8 mg/l 8,5 sati posle ingestije, a morfin je dete-ktovan i sedam dana od uzimanja 3.

Rop i sar. 7 opisali su slučaj letalnog trovanja heroinom.Koncentracija morfina u krvi bila je 1,14 mg/l, u želudačnomsadržaju 0,425 mg/g i u urinu 3,65 mg/l. Koncentracija 6-MAM u krvi bila je 0,168 mg/l, a u želudačnom sadržaju 12ng/mg. U uzorku urina nije dokazan 6-MAM.

U post mortem uzorcima telesnih tečnosti nakon predo-ziranja heroinom, koncentracija morfina u krvi bila je 0,68mg/l, a u urinu 0,49 mg/l 14.

Koncentracija morfina u urinu dobijena primenom opi-sane LC-MS metode bila je 3,68 mg/l. Osim morfina doka-zan je i 6-MAM (1,33 mg/l) i kodein (0,22 mg/l).

Koncentracije morfina i 6-MAM prikazane u ovom ra-du slične su podacima iz literature.

Zaključak

Višekolonski HPLC-UV sistem može se primeniti ukvalitativnoj analizi uzoraka, naročito kada je u pitanjunepoznati uzročnik trovanja. Međutim, da bi se pouzdanoodredile koncentracije analita u uzorcima i pouzdano do-kazalo njihovo prisustvo, potrebno je primeniti masenuspektrometriju kao drugu spektralnu potvrdnu tehniku.Primenjena LC-MS metoda za određivanje opijata u postmortem materijalu je brza, specifična, osetljiva i jednos-tavna za izvođenje. S obzirom na to da je u uzorcima uri-na i očne vodice osim morfina dokazan i 6-MAM može sezaključiti da je u ovom slučaju do trovanja došlo usled in-gestije heroina.

L I T E R A T U R A

1. Baselt RC. Drug effects on psychomotor performance. FosterCity: Biomedical Publications; 2001.

2. Cone EJ, Holicky BA, Grant TM, Darwin WD, Goldberger BA.Pharmacokinetics and pharmacodynamics of intranasal"snorted" heroin. J Anal Toxicol 1993; 17(6): 327–37.

3. Narongchai P, Sribanditmonkol P, Thampithug S, Narongchai S, Chi-tivuthikarn C. The duration time of urine morphine detection inheroin addicts by radioimmunoassay. J Med Assoc Thai 2002;85(1): 82–6.

4. Lemos NP, Anderson RA, Valentini R, Tagliaro F, Scott RT.Analysis of morphine by RIA and HPLC in fingernail clip-pings obtained from heroin users. J Forensic Sci 2000; 45(2):407–12.

5. Abadie JM, Allison KH, Black DA, Garbin J, Saxon AJ, BanksonDD. Can an immunoassay become a standard technique indetecting oxycodone and its metabolites? J Anal Toxicol 2005;29(8): 825–9.

6. Drummer OH, Gerostamoulos J. Postmortem drug analysis: ana-lytical and toxicological aspects. Ther Drug Monit 2002; 24(2):199–209.

7. Rop PP, Fornaris M, Salmon T, Burle J, Bresson M. Concentrationsof heroin, 06-monoacetylmorphine, and morphine in a lethalcase following an oral heroin overdose. J Anal Toxicol 1997;21(3): 232–5.

8. Tagliaro F, Valentini R, Manetto G, Crivellente F, Carli G, MarigoM. Hair analysis by using radioimmunoassay, high-performance liquid chromatography and capillary electropho-

resis to investigate chronic exposure to heroin, cocaine and/orecstasy in applicants for driving licences. Forensic Sci Int 2000;107(1–3): 121–8.

9. Moeller MR, Steinmeyer S, Kraemer T. Determination of drugs ofabuse in blood. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1998;713(1): 91–109.

10. Katagi M, Nishikawa M, Tatsuno M, Miki A, Tsuchihashi H. Col-umn-switching high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry for identification ofheroin metabolites in human urine. J Chromatogr B BiomedSci Appl 2001; 751(1): 177–85.

11. Dams R, Murphy CM, Lambert WE, Huestis MA. Urine drugtesting for opioids, cocaine, and metabolites by direct injectionliquid chromatography/tandem mass spectrometry. RapidCommun Mass Spectrom 2003; 17(14): 1665–70.

12. Musshoff F, Trafkowski J, Madea B. Validated assay for the de-termination of markers of illicit heroin in urine samples for thecontrol of patients in a heroin prescription program. J Chro-matogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2004; 811(1): 47–52.

13. Trajković S. Opioids in biological materials. Beograd:Zadužbina Andrejević; 2005. (Serbian)

14. Moffat AC, Osselton MD, Widdop B. Clarke's analysis of drugsand poisons. In: Pharmaceuticals, body fluids and postmortemmaterial. 3rd ed. London: Pharmaceutical press; 2004.

Rad je primljen 28. III 2007.