“Analiza odpowiedzi roślin na stres suszy: wyciszanie ekspresji genów kinaz kaskady MAPK”

Mitogen-Activated Protein Kinase

Cascade

Transcription factors

Stimuli

MAPKKKs

MAPKKs

MAPKs

Target genes

A1

A2

B

C

D

MAPKK subfamilies (classification according to Kazuya Ichimura et al.) with phylogenetic tree

At, Arabidopsis thaliana; Le, Lycopersicon esculentum; Ms, Medicago sativa; Nt, Nicotiana tabacum; Os, Oryza sativa; Zm, Zea mays

Hairpin RNA

P

P

Uzyskanie transgenicznych roślin A. thaliana z wyciszoną ekspresją genu kodującego kinazę AtMKK1.

promotor terminator

siRNA

LONG

Inverted repeats

Pol RNA II

SHORT

shRNA

Pol RNA III

> 1 siRNA 1 siRNA

AtMEK1

1419 bp

CDS

siRNA siRNA

5' region

3' region

Schemat sekwencji mRNA genu AtMEK1. Za pomocą skrótów oznaczono: CDS – sekwencja kodująca kinazę AtMEK1, 5’ i 3’ region – odcinki DNA wybrane do konstrukcji odwrotnych powtórzeń, siRNA – krótkie sekwencje DNA wybrane do konstrukcji shRNA

1 2 3

pHannibal5824 bp

ampintron pdk

promoter 35S CaMV

terminator OCS

Eco RI (4218)

Bam HI (5035)

Cla I (5024)

Hin dIII (5029)

Kpn I (4228)

Xba I (5041)

Xho I (4212)

Not I (2859)

Not I (5819)

Mapa wektora pHannibal. za pomocą skrótów oznaczono: amp - gen oporności na ampicylinę, promoter 35S CaMV – promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora,, pdk – intron, terminator OCS – terminator genu syntazy oktopinowej Do wprowadzenia fragmentów genu AtMEK1 wykorzystano miejsca restrykcyjne dla enzymów XhoI i KpnI oraz ClaI i XbaI

pART2711667 bp

nptII

spec

promoter NOS

LB

RB

terminator NOS

Not I (1)

Mapa plazmidu pART27 za pomocą skrótów oznaczono: LB - lewa sekwencja graniczna T-DNA, RB - prawa sekwencja graniczna T-DNA, nptII - gen fosfotransferazy neomycynowej, promoter NOS- promotor genu syntazy nopalinowej, terminator NOS - terminator genu syntazy nopalinowej, spec – gen oporności na spektinomycynę

konstrukt7193 bp

nptII

intron pdk

p35S CaMV

pNOSLBRB

MKK1-3'

MKK1-3'

tNOS

tOCS

Schemat konstruktu T-DNA zawierającego odwrócone powtórzenia regionu 3’ genu AtMEK1 (MKK1-3’). Za pomocą skrótów oznaczono: LB - lewa sekwencja graniczna T-DNA, RB - prawa sekwencja graniczna T-DNA, nptII - gen fosfotransferazy neomycynowej, pNOS- promotor genu syntazy nopalinowej, tNOS - terminator genu syntazy nopalinowej, p35S CMV – promotor 35S CaMV, tOCS – terminator genu syntazy oktopinowej, intron pdk – intron genu kinazy pdk

Źródła klonów cDNA:

Biological Resource Center, The Ohio State University - USA

Riken Bioresource Center –Japan

Wektory• pZL1

• pBluSKM

• pBluSK2P

• pCMV_SPORT6

• pFLC1 i pochodne

• pSHlox1

PCR (startery T7 i T3) lub (startery T7 i Sp6)

Dr Patricka Gallois - School of Biological Sciences, University of Manchester

Konstrukcja płytek mikromacierzy cDNA

Stoki główne

Izolacja plazmidów

Stoki glicerolowe

Kultury bakteryjne

50 µl PCR

Płytki 96 dołkowe

Stoki robocze

Oczyszczanie produktów PCR, Millipore

Nadruk

Płytki 384 dołkowe

Ocena poprzez rozdział elektroforetyczny

» Tracking - Rozlokowanie prób na płytce

» Duplikacja prób - reproduktywność wyników

» Próby kontrolne

> próby negatywne

• ORF_o567 [Escherichia coli] - 178C16

• aconitate hydrase 1 [Escherichia coli] - 239E4

> próby konstytutywne:

• 18S rRNA

• HMG1 (3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase)

• Plastocyanin

• EF1 (elongation factor 1-alpha)

• Phosphoglycerate kinase

• FPS1 (farnesyl pyrophosphase synthase)

• beta tubulin

• ubiquitin

• TUFA (elongation factor Tu)

• CAB (photosystem II type I chlorophyll a b binding protein) 3

• RUBISCO (ribulose bisphosphate carboxylase)

o geny uczestniczące w biosyntezie i degradacji kluczowego fitohormonu stresu suszy - ABA- kwasu abscysynowego (m.in.. geny: epoksydazy neoksantynowej – ZEP, dioksygenazy 9-cis-epoksykroteinowej – NCED, oksydazy ksantoksyny – ABA2, lipoksygenazy – LOX2)

o geny uczestniczące w transdukcji sygnałów (m.in. kinazy MAP i MAPK, fosfatazy PP2C, CDPK)

o geny czynników transkrypcyjnych (m.in. MYB/MYC, bZIP, WRYK)

o geny obronne (m.in. enzymy stresu oksydacyjnego, enzymy zaangażowane w procesy degradacji makromolekuł)

o geny biorące udział w akumulacji i degradacji osmolitów

o geny kodujące transportery błonowe (transportery jonów, metabolitów)

o inne geny A. thaliana o nieznanej funkcji, które zostały wybrane na podstawie homologii sekwencji do znanych funkcjonalnie genów innych gatunków roślin; są to geny przypuszczalnie indukowane w warunkach stresu suszy.