ANALIZA SADRŽAJA DNA I PROLIFERACIJSKE …klinkemija.kbcsm.hr/HDMB/BiochMedARHIVA/Vol06_4_1996/02_Zulle_… · Protočna citometrija Analiza sadržaja DNA i faza staničnog ciklusa

Izvorni znanstveni članakUDK 615-074:534.076 Original Scientific Paper

ANALIZA SADRŽAJA DNA I PROLIFERACIJSKEAKTIVNOSTI TUMORSKIH STANICA PROTOČNOM

CITOMETRIJOM I RAČUNALSKIM PROGRAMOMModFIT LT™ U BOLESNICA SA SEROZNIM

KARCINOMOM JAJNIKALidija Bilić-Zulle', Branka Užarević2, Maja Kraševič', Mladen Petrovećki2, Drago

Batinić2, Malko Marušić2

1 Zavod za laboratorijsku dijagnostiku KBC Rijeka,2 Zavod za imunologiju, Klinički zavod zalaboratorijsku dijagnostiku Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu i KBC Zagreb,' Zavod

za patologiju Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Rijeci

SAŽETAK - Analiza sadržaja DNA (ploidija) i staničnog ciklusa protoč-nom, citometrijom učinjena je iz parafinskih blokova tumorskog tkiva 30bolesnica sa. seroznim karcinomom jajnika. Dobiveni rezultati uspoređenisu s kliničko-patološkim pokazateljima, bolesti, uključujući dob,patohistološki nalaz, klinički, stadij bolesti, i preživljenje bolesnica. Slabijediferencirani tumori pokazali su veću ukupnu proliferacijskii, aktivnosttumorskih stanica, a slična sveza nađena je i u odnosu na. veći stupanjkliničkog stadija bolesti. Sveza između ploidije tumorskih stanica ikliničko-patoloških pokazatelja nije nađena. Analizom međusobneovisnosti ispitivanih pokazatelja nađeno je da dob bolesnica, i kliničkistadij bolesti imaju prognostičku vrijednost za ukupno preživljenjebolesnica, dok pokazatelji plodije i proliferacijske aktivnosti tumorskihstanica nemaju prognostički značaj.

ZAHVALA— Toplo se zahvaljujemo gdici Žaklini Ćavar bez čije bi izvrsne tehničke pripremeuzoraka ovaj rad bio bitno otežan.

BIOCHEMIA MEDICA god. 6, br. 4, 1996. 255

Sadržaj DNA u seroznim tumorima jajnika L. Bilić-Zulle i sur.

UVOD

Karcinom jajnika zloćudna je novotvorina ženskog spolnog sustava. Zbognespecifičnih simptoma bolesti, u većine bolesnica dijagnoza se postavlja tek uuznapredovalom stadiju bolesti (1). Tumori jajnika heterogeni su s obzirom namorfološke i antigenske značajke, sadržaj receptora i osjetljivost nakemoterapiju (2). Novi pristupi istraživanju karcinoma jajnika idu u smjeruotkrivanja laboratorijskih pokazatelja biološkog poznavanja tumora kako bise unaprijedila dijagnostika, liječenje i prognoza bolesti. Pokazateljimastaničnog ciklusa pripisuje se potencijalni prognostički značaj i stoga je ciljovog rada bio analiza sadržaja DNA i proliferacijske aktivnosti tumorskihstanica bolesnica sa seroznim karcinomom jajnika, uporabom metode protočnecitometrije i novog računalskog programa za analizu histograma DNA - ModFITLT™ .

MATERIJAL I METODE

Bolesnice

Analizirano je tumorsko tkivo 30 bolesnica sa seroznim karcinomom jajnikaprimljenih i liječenih u KBC-u Rijeka u razdoblju od 1988. do 1995. godine.Sve bolesnice imale su sljedeće kliničko-patološke nalaze: patohistološki stupanjtumora, klinički stadij bolesti i preživljenje. Vrst tumora i pripadajućipatohistološki stupanj određen je prema WH0 klasifikaciji (World HealthOrganisation: Histological Tvping of Ovarian Tumor) (3). Tumori se dijele premastupnju diferenciranosti u tri skupine: histološkog stupnja I (dobro diferenciranitumori), II (srednje diferencirani tumori) i III (slabo diferencirani tumori).Klinički stadij određenje prema FIGO klasifikaciji (Federation InternationalGynecology & Obstetrics) (4), prema kojoj se razlikuju četiri klinička stadija:stadij I = tumorski rast ograničen na jajnike, stadij II = tumorski rast najednom ili oba jajnika s proširenjem na zdjelicu, stadij III - tumorski rast najednom ili oba jajnika s intraperitonealnim metastazama izvan zdjelice i/ilipozitivnim retroperitonealnim čvorovima; stadij IV = tumorski rast najednomili oba jajnika s udaljenim metastazama.

Materijal

Tumorsko tkivo seroznog karcinoma jajnika je nakon biopsije uklopljeno uparafin i naknadno obrađeno prema standardnoj metodi po Hedleyj-u (5) iVindelov-u (6). Svaki uzorak tumora pregledao je patolog, a za analizu jeupotrijebljen najreprezentativniji dio tumora.

Protočna citometrija

Analiza sadržaja DNA i faza staničnog ciklusa učinjena je u Kliničkomzavodu za laboratorijsku dijagnostiku KBC Zagreb na protočnom citometruFACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, SAD) uz uporabu računalskihprograma - Cellquest™ (Becton Dickinson Immunochemistry Systems, San

256 BIOCHEMIA MEDICA god. 6, br. 4, 1996.

L. Bilić-Zulle i sur. Sadržaj DNA u seroznim tumorima jajnika

Jose, CA, SAD) i ModFit LT™ (Verity Software House, Inc., SAD, 1995) naosobnom računalu Macintosh Quadra 650. Program CellQuest™ služi zamjerenje uzoraka i pohranjivanje izmjerenih podataka, a program ModFit LT™za analizu pohranjenih podataka. Za svaki uzorak tumorskog tkiva kroz mjernisustav protočnog citometra propušteno je 10,000 jezgara. Jednoparametrijskihistogrami (intenzitet fluorescencije x broj stanica/jezgara) analizirani suModFit LT™ programom.

Tumačenje histograma DNA

Na temelju jednoparametrijskog histograma fluorescencije i njegovihbrojčanih izvedenica dobiven je sadržaj DNA i raspodjela tumorskih stanicaprema fazama staničnog ciklusa: faza G0-G1 (stanice u mirovanju), S-faza(stanice u fazi podvostručenja DNA, označava stanice u proliferaciji) i fazaG2-M (stanice u diobi) (7). Histogram se tumači kao diploidan ako postoji jedansimetričan G0-G1 vršak (si. 1), dok nazočnost više od jednog vrška pokazuje

100 150DNA Content

200 250

1 - G0-G1 faza staničnog ciklusa

2 - S-faza staničnog ciklusa

3 - G2-M faza staničnog ciklusa

Dale acquired: 9-May-96File: BILIC LIDIJA 09.05.96..0O5Sample: SAMPLE IDSample lag: SAMPLE TAGAnalysis type: Aulomatic analysisPrep: ParafJtn

DIPLOID: 100.00%DipGO-GI: 77.51 % al 64.06DipG2-M:9.7! % at 128.12Dp S: 12.78 % G2/G1:2.00Dip % CV:7.27

Total S-Piiase: 12.78 %

Extra Pop: %Debris:9.17%Aggiegales: 0.00 %

Modeled Evenls: 13222.54 RCS: 4.765

Diploid B.A.D.: 5.94 % No aggs modeieđ

S-PhaseAssessment:Tissue Type: OvariaPloidy Status: DiploidDiploid S: High

S l i k a 1. - Jednoparametrijski histogram DNA diploidnog tumora jajnika spripadajućim statističkim podacima.



da se radi o aneuplodiji (si. 2) (8). Proliferacijska aktivnost tumorskih stanicaizražena je kao ukupna S-faza (USF), tj. kao udio svih izmjerenih stanica u S-fazi (u postocima). USF diploidnih tumora istovjetna je izmjerenoj vrijednostiudjela stanica u S-fazi staničnog ciklusa. Kod aneuploidnih tumora je mogućeustanoviti posebno udio diploidnih i udio aneuploidnih stanica u S-fazi staničnogciklusa.

i 00 150DNA Content

200 250

1 - DIP G0-G1 faza staničnog ciklusa

2 - DIP S-faza staničnog ciklusa

3 - A N G0-G1 faza staničnog ciklusa

4 - AN S-faza staničnog ciklusa

5 - AN G2-M faza staničnog ciklusa

Date acquired: 9-May-96File: BILIC LIDIJA 09.05.96. 011S m r t : SAMPLE IDSample lag: SAMPLE TAGAnalysis type: Aulomalic ana!ysisPrep: ParaHin

DIPLOID: 33-Tt %Dip GO-Gl: 88.08% at 66.15Dlp G2-M: 0.00 % at 132.31Dip S: 11.92% G2/G 1:2.00Dip % CV:7.82

ANEUPLOID 1-66.86%Ani G0-G1: 66.11 % at 91.32Ani G2-M: 6.89% at 173.45Ani S: 27.00% G2/G1: 1.90An1 %CV:7.18D!: 1.38

Tolal S-Phase: 22.00 %

Exlra Pop: %Debns- 15.91 %Aggregates: 0.00 %Modeled Evenls: 13923.67 RCS: 3 113

Diploiđ&AD..-11.95% No aggsmodeled

Aneuploid B.A.D.: 8.74 % NoAggs modeled

Tolal B.AD.: 11.67 % No aggs rr.ođelsd

S-PhaseAssessment:TissueType: OvariaPloidy Status: AneuploidAneuploid S: HighTotal S: High

S l i k a 2. - Jednoparametrijski histogram DNA aneuploidnog tumora jajnika spripadajućim statističkim, podacima

Brojčani pokazatelj stupnja ploidnosti je DNA-indeks. To je omjer relativnogsadržaja DNA G0-G1 faze staničnog ciklusa ispitivanog uzorka i relativnogsadržaja DNA stanica standarda (8). Međutim, preporuka je SAC XIV društva(Societv of Analvtical Cytology Subcommitee, 1990) da se aneuploidija DNAne izražava putem DNA indeksa (9).

Statistička obrada podatakaBrojčani podaci prikazani su srednjim vrijednostima i mjerama odstupanja,

a vrijednosti između skupina bolesnica uspoređene su Mann-Whitneyevim



neparametrijskim testom. Kaplan-Meirova statistika korištena je za izraču-navanje krivulja preživljenja, a utjecaj pokazatelja na preživljenje određen jeCoxovim regresijskim testom.

REZULTATI

Tablica 1 prikazuje kliničko-patološke značajke 30 bolesnica sa seroznimkarcinomom jajnika i rezultate analize tumorskih stanica na sadržaj DNA istanični ciklus rasta. Medijan dobi bolesnica iznosio je 50 godina, u rasponuod 17 do 76 godina. U 15 bolesnica (50,0%) otkrivenje serozni karcinom jajnikahistološkog stupnja II, 7 bolesnica (23,3%) bilo je s tumorima histološkog stupnjaI, a 8 bolesnica (26,7%) s tumorima histološkog stupja III. Prema kliničkoj

T a b l i c a 1. — Kliničko-patološke značajke 30 bolesnica sa seroznim karcinomomjajnika

Parametar

Dob, godine(medijan)(raspon)

Histološki stupanj tumora(WH0)»

Klinički stadij bolesti(FIGO-klasifikacija)1'

Sadržaj DNA u tumorima(ploidija)

USFC(%) (x±s.d.)(raspon)

5017-76

IIIIII

IIIIIIIV

diploidnianeuploidni

10.04 + 8.09(1.0-33.7)

Broj bolesnica (%)

7(23.3)15(50.0)8(26.7)

7(23.3)6(20.0)

14(46.7)3(10.0)

22(73.3)8(26.7)

" I ( dobro diferencirani tumori; II ( srednje diferencirani tumori; III ( slabo diferenciranitumori.

b stadij I = tumorski rast ograničen na jajnike, stadij II = tumorski rast na jednom ili obajajnika s proširenjem na zdjelicu, stadij III = tumorski rast na jednom ili oba jajnika sintraperitonealnim metastazama izvan zdjelice i/ili pozitivnim retroperitonealnim čvorovima; stadijIV = tumorski rast najednom ili oba jajnika s udaljenim metastazama

' ukupna proliferacijska aktivnost tumorskih stanica



slici, 14 bolesnica bilo je u kliničkom stadiju III (46,7%), dok je podjednak udiobolesnica bio u kliničkom stadiju I (23.3%) i II ( 20.0%). Svega tri bolesnice(10%) bile su u kliničkom stadiju IV. Diploidni tumori nađeni su u 22 (73.3%)bolesnice, a aneuploidni tumori u 8 (26.7%) bolesnica. U ispitivanoj skupinibolesnica nisu nađeni tzv. granični (engl. border-line) tumori, niti bolesnice stetraploidnim ili multiploidnim tumorom. Srednja vrijednost koeficijentavarijacije (CV) za sve uzorke iznosila je 7.71 (raspon 4.2-12.1). U tri uzorka CVje bio >10, a u jednom uzorku CV iznosio je 12,1.

Tablica 2 prikazuje utjecaj ukupne proliferacijske aktivnosti tumorskihstanica (izražena kao ukupna S-faza ili USF) i udjela aneuploidnih tumorskihstanica s kliničko-patološkim pokazateljima. U tumorima histološkog stupnjaI USF je bila statistički značajno niža (p<0.05) od USF tumora histološkogstupnja II i III. Slično tome, USF u tumorima kliničkog stadija bila je statističkiznačajno niža od USF tumora kliničkog stadija III (p<0,05). Udio aneuploidnih

T a b l i c a 2. - Usporedba ukupne proliferacijske aktivnosti (USF) i udjelaaneuploidnih tumorskih stanica s kliničko-patološkim pokazateljima (N=30)

Parametri

Histološki stupanj (WH0)I

II

III

Klinički stadij bolesti (FIGO)I

IIIIIrv

USF (%)(medijan,

2,3

7,4

13,2

2,2

12,710,6

7,4

raspon)

1-12,7-'

1,7-33,7

6-18,7

1-21,7C

1,1-33,7

2,3-22

7,1-21,3

Udio aneuploidnihstanica (%)

(medijan, i-aspon)

43,3

79,0

-

71,0

63,9

-

6,7-71b

74,5-86,7

-

18,9-74,5

6,7-S6,7

-

;l USF tumora histološkog stupnja I statistički se vjerodostojno razlikuje (p<0,05) od USF tumorahistološkog stupnja II i III,

b vidio tumorskih aneuploidnih stanica u bolesnica kliničkog stadija II statistički se vjerodostojnorazlikuje (p<0.05) od udjela tumorskih aneuploidnih stanica u bolesnica kliničkog stadija III,

c USF tumora u bolesnica kliničkog stadija I statistički se vjerodostojno razlikuje (p<0.05) odUSF tumora u bolesnica kliničkog stadija III.

stanica u tumorima histološkog stupnja II bio je značajno manji od udjelaaneuploidnih stanica u tumorima histološkog stupnja III (p<0,05). Ploidija(sadržaj DNA) nije bila značajno različita u odnosu na parametre histološkog



stupnja i kliničkog statusa (nije prikazano u tablici). Tablica 3 prikazujerezultate univarijatne i multivarijatne analize utjecaja kliničko-patološkihpokazatelja na ukupno preživljenje bolesnica, a slika 3 krivulju ukupnogpreživljenja bolesnica. Petogodišnje preživljenje iznosi 15,7 ± 7,2 mjeseca, aukupno praćenje svih bolesnica obuhvatilo je 61 mjesec. Tijekom praćenja 7bolesnica (23,3%) je preživjelo, a 23 bolesnice (76,7%) su umrle. Dob, histološki

T a b l i c a 3. —Utjecaj kliničko-patoloških pokazatelja na ukupno preživljenjebolesnica sa seroznim karcinomom jajnika (univarijatna i multivarijatna analiza)

Parametar

Dob

Histološki stupanj (WHO)Klinički stadij bolesti (FIGO)Ukupna proliferacijska aktivnoststanica (USF)Ploidija tumorskih stanica

Univarijatna

P

0,0070,001

<0,001

0,2500,071

Multivarijatnaanaliza

P

<0,0010,1550,007

0,2000,642

1.0 T

0.9

g 0.8

§0.7-

£ °-6"EU

H 0 - 5 t<-n i| °-4 f< 0.3 io :w 0-2 }i

0.1 +0.0 -1-

0

•l

12 24 36 48VRIJEME (mjeseci)

60

S l i k a 3. - Krivulja vjerojatnosti ukupnog preživljenja 30 bolesnica sa seroznimkarcinomom jajnika



stupanj i klinički stadij bolesti statistički su vjerodostojni pojedinačniprognostički pokazatelji ukupnog preživljenja bolesnica (za sve p<0.01), dokrezultati multivarijatne analize ukazuju da su jedino dob bolesnica i kliničkistadij bolesti nezavisni prognostički pokazatelji ukupnog preživljenja bolesnica.

RASPRAVA

Odluka o izboru terapijskog protokola u bolesnica sa karcinomom jajnikaosniva se na posrednim pokazateljima biološkog potencijala tumora,prvenstveno na kliničkom stadiju bolesti i procjeni ostatne bolesti nakonkirurškog zahvata (10). Stoga pokušaji iznalaženja neposrednih pokazateljabiološkog ponašanja tumora imaju za cilj razvoj novih strategija liječenja. Međutim pokazateljima su, između ostalih, sadržaj DNA (ploidija) i proliferativnaaktivnost tumorskih stanica (2,10). S ciljem boljeg upoznavanja biološkihosobitosti tumora jajnika, istražili smo pokazatelje staničnog ciklusa u 30bolesnica sa seroznim karcinomom jajnika i usporedili ih s poznatim kliničko-patološkim pokazateljima tumora jajnika.

Matematička analiza parametara staničnog ciklusa učinjena je posve novimračunalskim programom ModFit LT™ koji omogućuje ručnu i automatskuanalizu histograma DNA. Pri ručnoj analizi histograma DNA postavljaju segranice (kanali) prema vizualnoj procjeni za pojedine faze staničnog ciklusa ilise unošenjem potrebnih podataka za analizu staničnog ciklusa (npr. vrstaanaliziranog materijala, vrst tumora, ploidni status, vidljiva/nevidljiva G2-Mfaza, raspadnute stanice i agregirane stanice) bira model analize histograma.Kod ranijih programa za analizu histograma DNA bila je moguća ručna iliautomatska analiza na osnovi vizualno postavljenih kanala za pojedine fazestaničnog ciklusa.

Pri automatskoj analizi, ModFit LT™ program sam odabire jedan od 82ponuđena modela analize koji najbolje odgovara ispitivanom uzorku. Ranijiprogrami nisu imali definirane modele. Odabir modela analize ovisi o vrstiupotrijebljenog materijala (tkiva), sadržaju DNA u tumorskim stanicama,nazočnosti raspadnutih stanica i staničnih agregata. Uz osnovne pokazateljestaničnog ciklusa program ModFit LT™ daje podatke o broju analiziranihstanica, pokazatelju RCS (engl. reduced chi-square test), udjelu raspadnutih iagregiranih elemenata - BAD (engl. background aggregates and debris),koeficijentu varijacije (CV) i do sada najtočniju analizu proliferacijske aktivnostistanica uzorka, tj. udio stanica u S-fazi staničnog ciklusa (11). Pokazatelj RCSukazuje u kolikoj mjeri izabrani model analize odgovara ispitivanom uzorku.CV je pokazatelj kvalitete pripreme uzorka, ali ovisi i o značajkama tumorskogtkiva koje se ispituje. Preporuka je da CV za parafinske blokove bude manji od10% (12). U četiri slučaja našeg mjerenja CV je bio veći od 10% (11% i 12%).Ove uzorke smo ponovili i dobili iste vrijednosti CVi to vjerojatno zbog osobitostisamog tumorskog tkiva, a ne kvalitete pripreme uzoraka.

Kvalitetna procjena udjela stanica u S-fazi staničnog ciklusa moguća jeako histogrami DNA imaju zadovoljavajuću vrijednost CV i mali udioraspadnutih i agregiranih stanica. Veća nazočnost raspadnutih stanica ima



značajan utjecaj na točnost mjerenja udjela stanica u S-fazi staničnog ciklusa(povećanje udjela stanica) (13). Ranijim se programima za analizu staničnogciklusa nije mogao točno odrediti udio stanica u S-fazi kod aneuploidnih tumorazbog preklapanja površina koje su označavale S-fazu. Udio stanica u G2-Mfazi nije se uvijek mogao izraziti iz istog razloga ili zbog toga što površina kojaodgovara G2-M fazi nije bila vidljiva.

ModFit LT™ daje vrlo točnu analizu udjela tumorskih stanica u S i u G2-M fazi staničnog ciklusa i to odvojeno udjela stanica u S-fazi diploidnih ianeuplodnih tumorskih stanica, kao i ukupnu proliferacijsku aktivnosttumorskih stanica,

Aneuploidni serozni karcinomi jajnika otkriveni su u 26,7% bolesnicaobuhvaćenih ovim istraživanjem. Literaturni podaci o učestalosti aneuplodijeu karcinomu jajnika su raznoliki, a kreću se od 19% do 70% (1,2,10). Mogućirazlozi različite zastupljenosti aneuplodnih tumora u navedenim istraživanjimajesu heterogenost ispitivanih skupina tumora, vrst materijala (tumorsko tkivoili tumorsko tkivo s primjesama nekrotičnog ili okolnog normalnog tkiva), tekvaliteta pripreme i analize uzoraka.

U ovom radu ukupna proliferacijska aktivnost tumorskih stanica (izraženakao ukupna S-faza ili USF) dobro diferenciranih karcinoma jajnika statističkije značajno niža od USF srednje i slabo diferenciranih tumora. Slično tome,USF je značajno niža u bolesnica kliničkog stadija I nego u bolesnica kliničkogstadija III.

Pored pokazatelja proliferacijske aktivnosti tumorskih stanica, udioaneuploidnih tumorskih stanica (što u novije vrijeme neki autori rabe u prikazuznačajnosti parametara staničnog ciklusa) (10), također je bio u svezi spatohistološkom slikom tumora. U tumorima histološkog stupnja I aneuplodinestanice nisu nađene. Udio aneuploidnih tumorskih stanica statistički jeznačajno veći u tumorima histološkog stupnja II nego u tumorima histološkogstupnja III. Međutim, ova sveza s obzirom na klinički stadij bolesti nijeutvrđena, što drugim riječima znači da nije nađena povezanost između ploidijetumorskih stanica i kliničko-patoloških pokazatelja bolesti.

U našim ispitivanjima ukupno preživljenje bolesnica iznosilo je 23%, štoodgovara podacima iz literature (4). Univarijatna analiza utjecaja ispitivanihpokazatelja na ukupno preživljenje bolesnica pokazala je da histološki stupanjtumora, dob bolesnice i klinički stadij bolesti (FIGO) imaju prognostički značaj,dok pokazatelji proliferacijske aktivnosti tumorskih stanica (USF) i aneuploidijatumora nisu pokazali to svojstvo. Multiparametrijska analiza izdvojila je dobbolesnica i klinički stadij bolesti kao vjerodostojne pokazatelje preživljenjabolesnica sa seroznim karcinomom jajnika.

Kako bi vjerodostojnost dobivenih pokazatelja staničnog ciklusa za prognozubolesnica sa seroznim karcinomom jajnika bila veća, istraživanje bi trebalonapraviti na uzorku većeg broja bolesnica svrstanih u podjednako brojnehistopatološke i kliničke skupine.



FLOW CYTOMETRIC DNA PLOIDY IN PATIENTS WITH SEROUSOVARIAN CARCINOMA: ANALYSIS WITH ModFIT LT™ PROGRAM

SUMMARY - Flow-cytometric DNA analysis was performed retrospec-tively from paraffin-embedded blocks in 30 patients with ovarian serouscarcinoma. Tumor proliferative actwity and ploidy status ivere related topatients' age, histological stage of the tumor, FIGO classification andsuruival. There was a significant correlation betuieen total proliferativeactivity and histological stage of the tumor, since higher proliferative ac-tivity ivas found in less differentiated tumors. However, both univariateand multivariate analysis of clinical, path.ohistological and flow-cytometric da ta shoived no prognostic significance of DNA-parametersfor the overall survival of patients. More studies with larger number ofpatients in each clinical arm are needed bcfore the value of DNA-analy-sis of serous ovarian cancer can be unequivocally deterniined.

LITERATURA

1. Pfisterrer J, Kommoss F, Suuerbrei W, et al.Cellular DNA content and survival in ad-vanced ovarian carcinoma. Cancer1994;74:2509-15.

2. Kaern J, Trope CG, Krinstensen GB,Pettersen EO. Flow cvtometric DNA ploidyand S-phase heterogeneitv in advanced ova-rian carcinoma. Cancer 1994:73:1870-7.

3. Serou SF, Scully RE, Sobin LH. Histologi-cal typing of ovarian tumors. Geneva: WorldHealth Organization, 1973.

4. Gompel C, Silverberg G. Pathology in gyne-cologv and obstetrics. 3rd ed. Philadelphia:J.B.Lippincott, 1985, 326-44.

5. Hcdley DW, Friedlander ML, Tayl,or IW,Rugg CA, Musgrovc EA. Method for analy-sis of cellular DNA content of paraffin-em-bedded pathological material using flowcytometry. J Histochem Cytochem1983;31:1333-5.

6. Vindelov LL, Chriatensen. U, Nissen NI. Adetergent-trypsin method for the prepara-tion of nuclei for flow cytometric DNA analy-sis . Cytometry 1983; 3:323-7.

7. Wersto RP, Liblit RL, Koss LG. Flovvcytometric DNA analvsis of human solid tu-mors:A review of the interpreta tion of DNAhistograms. Hum Pathol 1991;22:1085-98.

8. Hiddemann W, Schumann J, Andreeff M,et al. Convention on nomenclature for DNAcytometry. Cytometry 1984;5:445-6.

9. Hiddemann W, Schumann J, Andreeff Metal. Convention on nomenclature for DNAcytometry. Cancer Gcnet Cytogenet1984;13:181-3.

10. Khoo SK, Battistutta D, Hurst T, SandersonB, Ward BG, Free K. The prognostic valueof clinical, pathological and biological pa-rameters in ovarian cancer. Cancer1993;72:531-7.

11. ModFIT LT™ User Guide, Verity Softwai-eHouse, Inc., SAD, 1995

12. Hedley DW, Shankey TV, Wheeless LL. DNAcytometry consensus conference. Cytometry1993;14:471-500.

13. Bagivell CB, Mayo SW, Whetstone SD, et al.DNA histogram debris theory and compen-sation. Cytometry 1991;12:107-118.


Documents

ANALIZA SADRŽAJA DNA I PROLIFERACIJSKE …klinkemija.kbcsm.hr/HDMB/BiochMedARHIVA/Vol06_4_1996/02_Zulle_… · Protočna citometrija Analiza sadržaja DNA i faza staničnog ciklusa