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MINISRTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR
UNIVERSITE DE LA MANOUBA
INSTITUT SUPERIEUR DE BIOTECHNOLOGIE DE SIDI THABET (ISBST)
SUPPORT DE COURS
ANALYSES GENETIQUES
UE : Analyses Génétiques / Technologies Immunologiques et Cellulaires
Licence Appliquée en Biologie Analytique et Expérimentale
Bioanalyses et Contrôle qualité
Niveau L2
Elaboré par :
Dr. KHOUAJA Fattouma
Année Universitaire 2018/2019
2
Annexe 21
UEF3 : analyses génétiques / technologies immunologiques et cellulaires
ECUE n°1 : analyses génétiques
Plan du cours (21H)
Introduction (1h30)
- Stabilité et variabilité de l’hérédité
- Polymorphisme de l’ADN
Chapitre I : les différents types de mutations (6H)
- Mutations chromosomiques (polyploïdie, aneuploïdie, inversion, translocation)
- Mutations de répétition (microsatellites et minisatellites)
- Mutations ponctuelles (substitution, frameshift)
Chapitre II : méthodes d’analyse génétique (7H30)
- Techniques cytologiques et caryologiques
- Techniques biochimiques et cellulaires
- Techniques des acides nucléiques (PCR, RFLP, RAPD, ISSR, séquençage)
- Approches d’analyse des populations
Chapitre IV : génotypage et empreinte génétique (6H)
- Applications en agriculture (identification variétale, certification des séquences
et des races animales, détection des OGM)
- Applications légales (empreinte génétiques, test de paternité)
- Applications médicales (diagnostic anténatal, conseils génétiques)
TD/TP (18H)
Les TD/TP sont des applications sur le contenu du cours
3
derivative
Figure 1 : Les mutations chromosomiques I
Délétion terminale 46,XY,del (4p)
L’isochromosome du bras long du chromosome X : 46,X,i(Xq) est une anomalie fréquente dans le syndrome de Turner
Figure 2 : Délétions par une seule cassure chromosomique
46,XY,4p- : délétion
intersticielle
chromosome 13 en anneau : 46,XY,4p-
derivative
Figure 3 : Délétions par deux cassures chromosomiques
4
Figure 4 : inversion
Figure 5 : Translocation
robertsonienne non réciproque
Figure 6 : Descendance d’un parent porteur de translocation robertsonienne
Phénotype
normal : (46, XY) Phénotype
45,XY,rob (14 ;21)
46, XY
Figure 7 : Translocation réciproque
5
Figure 9 : Caryotypes partiels montrant des cas d’instabilités chromosomiques
Figure 8 : Les différents types de gamètes produits par translocation réciproque
Figure 12 : Mécanismes de triploïdie
Dygénie I ou II Diandrie
Dispermie Diplospermie I ou II
2n 2n n
n n n
n
Figure 13 : Endoréduplication
6
Figure 10 : Formation de gamètes aneuploïdes à la suite d’une non-disjonction lors
de la première ou de la deuxième division méiotique
Lors d’une non-disjonction méiotique, les chromosomes peuvent ne pas se séparer lors
de la 1ère ou la 2ème division. Des gamètes n+1 et n-1 sont produits dans les 2 cas. Si un
gamète n-1 est fécondé par un gamète n, il se forme un zygote monosomique 2n-1 ; par
contre, la fusion d’un gamète n+1 et d’un gamète n conduit à un trisomique 2n+1.
Figure 11 : Descendance obtenue après une non-disjonction mitotique
Production de fœtus trisomiques
Production de fœtus monosomiques
monosomiqiques
Production de fœtus trisomiques
et monosomiques
Production de fœtus disomiques
Mit
ose
réd
uct
ion
nel
le
Mit
ose
éq
uat
ion
nel
le
Mit
ose
éq
uat
ion
nel
le
Mit
ose
réd
uct
ion
nel
le
7
Figure 14 : Détail d’un microsatellite
15/20 44/20
44/15 60/17 57/18
42/20 17/18
Figure 15: Exemple de famille de chorée de Huntington (maladie de Huntington).
Les personnes ayant hérité d’un allèle muté du gène de la huntigtine sont représentés en gris. Le
nombre de CAG est représenté sous chaque individu. Les allèles normaux (15 à 20 CAG dans cette
famille) sont transmis sans changement alors que les allèles mutés (en gras, 40 à 60 CAG dans
cette famille) peuvent être amplifiés à chaque génération lorsqu’ils sont transmis par le père.
8
Tableau I : description des pathologies humaines causées par l’expansion de
triplets (Timchenko, 1999)
9
Figure 16 : Séquence correspondant à un allèle du minisatellite CEB 310 avec les
séquences flanquantes dont la connaissance est indispensable pour le choix des
amorces PCR.
Le minisatellite est ici constitué par la répétition (25 fois) du motif de base de séquence
consensus de 24 nucléotides : GTATACACACATATACATATATAT avec un très faible % de
variation interne (les substitutions sont en bleu foncé). Les séquences (30 nucléotides chacune)
utilisées pour le choix des amorces sont en rouge. Il est facile de prévoir quelle sera la taille du
fragment amplifié par PCR qui révèlera la présence de cet allèle du marqueur CEB 310. On le
retrouvera sur le gel, après électrophorèse au niveau du marqueur de taille 1000 pb
Figure 17 : Recherche des mutations du codon 694 par séquençage de l’exon 10 du gène MEFV (Fièvre Méditerranéenne Familiale) A : Homozygote normal (ATG) B : Homozygote pour la mutation M694V (p.Met694Val) (GTG) C : Homozygote pour la mutation M694I (p.Met694Ile) (ATA) D : Hétérozygote composite M694V/ M694I (p.Met694Val/ p.Met694Ile) (GTG/ATA)
10
Tableau II : Les principaux types de mutations ponctuelles dans l’ADN et leurs conséquences fonctionnelles au
niveau protéique
11
Le code génétique
Pre
miè
re l
ett
re
Deuxième lettre
Tro
isièm
e le
ttre
U C A G
U UUU
UUC
UUA
UUG
UCU
UCC
UCA
UCG
UAU
UAC
UAA OCRE
UAG AMBRE
UGU
UGC
UGA OMBRE
UGG Trp
U
C
A
G
C CUU
CUC
CUA
CUG
CCU
CCC
CCA
CCG
CAU
CAC
CAA
CAG
CGU
CGC
CGA
CGG
U
C
A
G
A AUU
AUC
AUA
AUG Met
ACU
ACC
ACA
ACG
AAU
AAC
AAA
AAG
AGU
AGC
AGA
AGG
U
C
A
G
G GUU
GUC
GUA
GUG
GCU
GCC
GCA
GCG
GAU
GAC
GAA
GAG
GGU
GGC
GGA
GGG
U
C
A
G
Phe
Leu
Ser
Tyr Cys
Leu Pro
His
Gln
Arg
Ile
Val
Thr
Ala
Asn
Lys
Asp
Glu
Ser
Arg
Gly
Tableau III : La nature chimique des acides aminés
12
13
Q-Binding (Q : Quinacrine) : Apparition de bandes fluorescentes sur les chromosomes.
obtenues en utilisant des fluorochromes tels la quinacrine, permettant l'obtention d'une
coloration intense de l'hétérochromatine centrométrique, du chromosome Y et génèrent des
bandes fluorescentes de même topographie que les bandes G. inconvénients : télomères peu
colorés et préparations peu stables.
G-Banding ou technique de marquage des bandes G utilise un colorant chimique, le Giemsa
(après traitement des chromosomes) qui engendre des bandes sombres sur les chromosomes
métaphasiques. Ce colorant a la particularité de se fixer sur les T et A, les bandes ainsi révélées
indiquent les régions riches en AT
R-Binging : (Reverse-Bands) par dénaturation thermique. télomères bien colorés. Les bandes R
sont riches en liaisons C-G, en gènes actifs à réplication précoce
T-Binding (télomérique) : Une dénaturation thermique poussée ne laisse persister le marquage
qu’au niveau des télomères
C-Binding (centromérique) : mise en évidence des centromères, des constrictions secondaires et
de la partie distale du chromosome Y. Ces régions chromosomiques ont de l’ADN répétitif ou
ADN satellite, à réplication tardive. 10 à 15% du génome. polymorphisme marqué +++
Figure 20: G-bands caryotype d’un
homme normal montrant
approximativement 400 bandes par
jeu haploïde de chromosomes
Figure 21: R-bands
Reverse band
Figure 22: Q-bands
Figure 24 : Différents types de chromosomes : a. acrocentrique, b. submétacentrique, c. métacentrique, d. constriction secondaires et satellites.
14
Centromère Région variable
15
Figure 27 : La technique FISH A : Principe B : Visualisation des anomalies au niveau des chromosomes
A
B
Figure 28 : PAGE
16
Figure 29 : Electrophorèse bidimensionnelle de protéines (2D-PAGE).
Cette technique apporte une information pour de nombreux gènes simultanément (plusieurs centaines de polypeptides sont révélés et analysés sur un même gel), mais le nombre d’individus analysés par unité de temps est faible. Ce sont des séquences codantes et exprimées à un moment donné dont le polymorphisme peut être analysé de cette façon. Cette technique a été appliquée sur plusieurs espèces d’arbres forestiers et à partir de divers tissus : aiguilles de Picea abies (pollen, bourgeons, graines, racines ...)
17
Figure 30 : test colorimétrique du SOS chromotest
Figure 31 : Principe de l’amplification enzymatique de l’ADN par PCR
18
19
Complément de cours
1- Les sondes
Il existe 2 types de sondes :
Les sondes qui reconnaissent les protéines = anticorps marqués On a recours à cette technique lorsqu’on n’a aucune connaissance sur la séquence
des AA de la protéine. Dans ce cas, on purifie la protéine à partir de l’organe pour obtenir
des anticorps dirigés contre le produit protéique du gène recherché. Les clones positifs
seront révélés grâce au marquage (radioactif ou non radioactif) des anticorps. Donc en
identifiant la protéine, l’anticorps identifie le clone contenant le gène qui a dû synthétiser
cette protéine.
Les sondes qui reconnaissent les acides nucléiques (ADN et ARN) = sondes nucléotidiques
Définition : C’est tout fragment d’acide nucléique simple brin (ADNc, fragment PCR,
oligonucléotide, ARN) de taille très variable et qui possède une homologie de séquences
avec l’ADNc ou le gène recherché.
Obtention : il existe plusieurs façons pour obtenir une sonde nucléotidique :
- par synthèse chimique si on connaît la séquence de l’ADN à étudier. Si cette séquence est
inconnue, on peut étudier la protéine correspondante et retrouver la séquence d’ADN grâce
au code génétique (dans ce cas le travail est laborieux vu le nombre de codons élevé pour
un même AA, Cf. exemple plus loin).
- une sonde peut être un ADNc dont seulement une partie sera utilisée (après digestion et
clonage des fragments obtenus)
- une sonde peut être de l’ARNm
2- Hybridation moléculaire de la sonde
La sonde permet donc de rechercher de manière spécifique un fragment d’acide nucléique
que l’on désire étudier. Cette réaction sonde – fragment correspond à une réaction
« d’hybridation moléculaire ». Celle-ci nécessite des conditions physico-chimiques
parfaites (tampon, pH, t°…) appelées strigence et dépend de la longueur de la sonde et de
la complémentarité sonde – fragment avec possibilité de mésappariement. Elle doit être
complémentaire et anti// au fragment recherché, qui lui aussi doit être dénaturé (simple brin).
Pour repérer cette réaction d’hybridation sonde-ADN recherché, il faut réaliser un marquage
de la sonde.
3- Marquage
Dans un mélange complexe où s’effectue l’hybridation moléculaire, la sonde doit être
facilement repérable grâce à un marquage.
20
Complément de cours (suite 1)
Le marquage d’une sonde est réalisé soit avec un atome radioactif = radio-isotope (=
isotope radioactif) : c’est le « marquage radioactif à chaud» (par une sonde radiomarquée)
et le clone positif (contenant le gène recherché) est révélé par une tache noire par
autoradiographie ; soit avec un « colorant fluorescent » : c’est le « marquage
enzymatique ou fluorescent à froid » non radioactif. Dans ce cas, le clone positif est révélé
par une tâche fluorescente brillante.
Globalement, le marquage se fait soit à l’extrémité soit à l’intérieur du fragment d’ADN :
- marquage aux extrémités : voir exemple plus loin
- marquage interne :
- Technique « nick translation » = coupure-réparation : Clivage au hasard de
l’ADNdb par la Dnase I, puis réparation des coupures par l’ADN pol I en présence de
« dNTP 32P » (c’est-à-dire dNTP radiomarquée en position par l’isotope 32P)
- Technique « random priming » (amorçage au hasard) : les 2 brins d’ADN de la
sonde sont préalablement séparés par chauffage/refroidissement brutal. Puis on ajoute un
mélange d’hexanucléotides de synthèse correspondant à toutes les combinaisons possibles
(46 = 4096). Ces oligo vont s’hybrider avec la sonde par une partie d’entre eux.
Donc on ne peut synthétiser une sonde nucléotidique que lorsqu’on connaît le produit
protéique du gène recherché et sa séquence d’acides aminés.
Marquage par transfert de coupure
(Nick translation) Marquage par amorçage aléatoire
(random priming)
21
Complément de cours (suite 2)
Principe de la technique d’hybridation moléculaire avec une sonde ADN radiomarquée
aux extrémités 5’P
Elle consiste à identifier dans une banque d’ADN, les clones bactériens comportant une
séquence d’ADN par hybridation avec une sonde radiomarquée. Pour cela, il est nécessaire
de connaître une partie de la séquence recherchée qu’on peut déduire à partir des acides
aminés de la protéine correspondante.
choix d’un segment d’acides aminée (de la protéine correspondante au gène recherché)
avec le minimum de dégénérescence possible :
Exemple d’une courte séquence de protéine utilisée pour fabriquer un ensemble
d’oligonucléotides dégénérés utilisables comme une sonde pour retrouver le gène codant la
protéine.
6 2 2 1 2 1 4
NH2 ……….. Ser – Tyr – His – Met – Glu – Trp – Pro ……….. COOH
synthèse chimique (synthétiseur d’oligo) des oligonucléotides de toutes les combinaisons
possibles correspondant à cette région (encadrée).
Les séquences possibles de la sonde de 17 bases : 5’ TAT CAT ATG GAA TGG CC ……3’ C C G
2x 2x 2x
le coefficient de dégénérescence = nombre de combinaisons des séquences de la
sonde = 23 = 8.
L’un des oligonucléotides de la sonde correspondra exactement au gène recherché.
marquage des 8 séquences. Le plus simple est le marquage de l’extrémité 5’ par la T4 PK
(=T4 polynucléotide kinase qui est une kinase qui ajoute des groupements phosphates).
Dans notre cas, la T4 PK transfère le groupement phosphate (en position gamma = la
position la plus externe) à partir d’une molécule d’ « ATP 32P » (ATP radiomarquée en
position par l’isotope 32P) sur l’hydroxyle 5’ de l’ADN de la sonde préalablement
déphosphorylé.
Au lieu de ce marquage radioactif, on peut réaliser le marquage fluorescent à froid à l’aide
du dUTP marqué à froid à l’isotope 35S. Ce marquage est moins sensible mais moins
dangereux que le marquage radioactif.
UCN AGU AGC
UAU UAC
CAU CAC
AUG
GAA GAG
UGG
CCN
Des sondes ADN synthétiques sont fabriquées
à partir des données du code génétique. Cette
séquence d’AA est traduite en sens inverse
pour obtenir la séquence d’ADN qui l’a codée.
Cependant, en raison de la dégénérescence du
code génétique, plusieurs séquences d’ADN
pourraient avoir codé la protéine en question.
22
Complément de cours (suite 3)
Criblage d’une banque ADN par hybridation moléculaire avec une sonde ADN radiomarquée
* * * * * * * * *
Banque d’ADN
* * * * * * * * *
* * * * * * * * *
Réplique de la banque :
repiquage des clones qui
constituent la banque sur
plusieurs boites de pétri
Empreinte de chaque boite sur
une membrane (ou filtre) de
nitrocellulose ou nylon pour fixer
quelques bactéries de chaque clone
Empreinte
Filtre
Boite de
pétri
traitement du filtre par
la soude (NaOH) : lyse des
bactéries, fixation de l’ADN
plasmidique et sa
dénaturation
ADN sb
Filtre
hybridation moléculaire
ADN / sonde
Solution
d’hybridation
contenant les 8
séquences
radiomarquées
Filtre
élimination de tous les
fragments d’ADN non
hybridés par plusieurs
lavages
révélation de la
radioactivité par
autoradiographie
Film révélé au RX
retour à la boite
initiale : le clone
recherché est repéré
par l’emplacement de
la tache radioactive
extraction d’ADN
plasmidique
recombinant, couper
l’insert et vérifier la
partie du gène par PCR
ou par séquençage
Le clone bactérien
transformé par un
vecteur recombinant
ayant inséré le gène
recherché
23
Complément de cours (suite 4)
4- Southern blot
C’est une technique d’hybridation moléculaire permettant la détection spécifique des acides
nucléiques par fixation d’une sonde ADN marquée.
Exemple : soit un gène P cloné et provenant d’une espèce de plante. Si on recherche la
présence de ce même gène dans une autre espèce de plante.
Les différentes étapes de détection d’un gène à partir de l’ADN génomique d’une
plante en utilisant la technique d’hybridation moléculaire par Southern blot.
Extraction de l’ADN génomique d’une plante
Digestion par différentes enzymes de restriction
Séparation des fragments d’ADN totaux par électrophorèse sur gel d’agarose (l’électrophorèse
sépare une population de fragments d’acides nucléiques en fonction de leur taille. On observe donc
une traînée continue de bandes d’ADN dont l’une d’elles correspond au gène recherché et qui sera
identifiée par la sonde marquée après Southern blot)
Dénaturation des fragments d’ADN digérés par traitement alcalin (acide) du gel d’électrophorèse
(ADNdb ADNsb)
Transfert par Southern ou « Southern blot »
Transfert par capillarité des fragments d’ADNsb séparés sur une membrane poreuse souple (feuille de nylon).
24
Complément de cours (suite 5)
Principe du transfert selon Southern (1975)
Cette technique consiste à détecter spécifiquement des fragments d’ADN transférés sur filtre par
leur hybridation à des séquences complémentaires marquées par un radio-isdotope.
Fixation de l’ADNsb sur la membrane (par cuisson de la membrane ou par exposition sous UV)
Hybridation moléculaire de l’ADN fixé à la membrane avec une sonde radio-marquée dénaturée.
Placer la membrane dans une solution contenant la sonde radiomarquée dénaturée qui trouvera sa
séquence complémentaire de l’ADN recherché et s’hybridera avec elle
Lavages
Autoradiographie (La membrane est mise en contact avec un film photographique)
Révélation du film pour révéler les bandes d’ADNsb hybridées dont la séquence est homologue à
celle de la sonde (ces bandes sont visibles sous forme de bandes noires sur un fond blanc). La
position de ces bandes par rapport à des témoins de poids moléculaire permet de déterminer la taille
de ces fragments)
Film photographique révélé
25
Complément de cours (suite 6)
26
Figure 36 : Analyse du polymorphisme par RFLP Couple enzyme/sonde
Figure 37 : Analyse du polymorphisme par RAPD
Figure 38 : Révélation du polymorphisme par le marqueur AFLP Marqueur AFLP = couple enzyme/amorce
27
Figure 39: Principe de la technique de séquençage enzymatique de Sanger utilisant le ddNTP. (a) structure d’un ddNTP. (b) les étapes de séquençage selon Sanger.
(b)
(a)
28
Tableau IV : Les principaux marqueurs moléculaires
Figure 40 : Lecture du séquençage par la technique Sanger. (a) sur gel : Autoradiogramme (b) sur Enregistrement obtenu à partir d’un séquenceur automatique qui utilise des colorants fluorescents
(b) (a)
29
Unions possibles AA Aa aa
AA p4 2p3q p2q2
Aa 2p3q 4p2q2 2pq3
aa p2q2 2pq3 q4
Fréquence des mariages aa x Aa = 2pq3 + 2pq3 = 4 pq3
Génotype des enfants
Type d’union Fréquence AA Aa aa
AA x AA p4 p4
AA x Aa 4p3q 2p3q 2p3q
Aa x Aa 4p2q2 p2q2 2p2q2 p2q2
aa x aa q4 q4
aa x Aa 4 pq3 2pq3 2pq3
AA x aa 2p2q2 2p2q2
Total :
AA : p2 (p4 + 2p3q + p2q2) = p2 (p2 + 2pq + q2) = p2
Aa : 2pq (p4 + 2p3q + p2q2) = 2pq(p2 + 2pq + q2) = 2pq
aa : q2 (p4 + 2p3q + p2q2) = q2 (p2 + 2pq + q2) = q2
La proportion des génotypes reste donc inchangée à la deuxième génération,
c’est l’équilibre de Hardy-Weinberg.
Tableau V : Evolution d’une génération à l’autre des fréquences des gènes dans une population panmictique
Figure 41 : Principe de l’identification variétale par empreinte génétique d’une plante via les marqueurs RFLP Chaque individu est caractérisé par deux bandes, c'est-à-dire par deux fragments d'ADN. Elles sont bien séparées, ce qui permet une analyse visuelle facile et fiable. Sur la base de ces marqueurs, il est possible de prouver que deux individus sont génétiquement distincts car ils diffèrent au moins par une bande. C'est ce que l'on observe sur la photographie. Les six individus sont tous génétiquement différents.
30
Figure 42 : Usage de routine des
marqueurs microsatellites pour
l’identification variétale de la
pomme de terre
Figure 43 : Principe de l’identification variétale du fraisier par empreinte génétique moyennant les marqueurs
AFLP il existe actuellement plus de 500 variétés de
fraisier cultivées dans le monde et distingués
avec exactitude grâce aux marqueurs
moléculaires
A
B
Figure 44 : Certificat officiel du Service Officiel de Contrôle (SOC) de la production au champ des semences d’ail (A) plant d’ail certifié (B)
31
Figure 46: Les contrôles en culture Causes de refus d'une parcelle de multiplication:
- isolement insuffisant (< 200 m pour une parcelle > 10 Ha, et < 300 m pour une parcelle < 10 Ha).
- mauvais état cultural
- concordance de floraison des parents est mal assurée
- peuplement du parent mâle insuffisant
- présence d'impuretés (>0,2 %) ayant émis du pollen, chez le parent ♂ ou ♀
- proportion d'épis aberrants > 0,1 % lors de la récolte.
Figure 45: Légende des mentions du certificat officiel Chaque certificat est unique de par sa numérotation. Il indique le nom de la variété, le numéro du lot, le nombre de grains et la date d'analyse de certification. Grâce à l'enregistrement par le SOC des mentions imprimées sur chaque certificat, il est possible de retracer l'historique des semences contenues dans l'emballage. C'est la traçabilité
Figure 47: Contrôles et normes de certification
32
Tableau VI : Exemple de test de filiation par analyse des marqueurs microsatellites
ADN d'Aurore
Chromosome analysé Nb de répétitions
chromosome 1 8 et 15
chromosome 8 13 et 14
chromosome 13 4 et 15
chromosome 14 3 et 4
ADN de Christine
Chromosome analysé Nb de répétitions
chromosome 1 2 et 8
chromosome 8 17 et 20
chromosome 13 4 et 4
chromosome 14 2 et 14
ADN de Bastien
Chromosome analysé Nb de répétitions
chromosome 1 8 et 18
chromosome 8 5 et 7
chromosome 13 3 et 9
chromosome 14 2 et 8
ADN de Denis
Chromosome analysé Nb de répétitions
chromosome 1 5 et 13
chromosome 8 5 et 5
chromosome 13 4 et 18
chromosome 14 3 et 8
ADN d'Émilie
Chromosome analysé Nb de répétitions
chromosome 1 8 et 13
chromosome 8 5 et 17
chromosome 13 4 et 4
chromosome 14 2 et 3
Voici les cartes génétiques de 4 personnes (Aurore, Bastien, Christine et Denis) et de l'enfant de 2 d'entre eux, Émilie. Dans chaque tableau est indiquée pour chaque chromosome, la taille du minisatellite ACGCC. Ainsi, Aurore possède sur son premier chromosome 14 la séquence ACGCC ACGCC ACGCC (n=3) et sur son autre chromosome 14, la séquence ACGCC ACGCC ACGCC ACGCC (n=4). La comparaison des tableaux permet de conclure que Christine et Denis sont les parents d'Émilie car :
- d'après le chromosome 8, Aurore ne peut être la mère de l'enfant, car elle lui aurait transmis soit 13 soit 14 répétitions, or Émilie en possède 5 et 17.
- D’après le chromosome 13, Bastien ne peut pas être le père de l’enfant car il aurait nécessairement transmis une de ses répétitions 3 et 9.
- Les patrimoines de Christine et Denis expliquent complètement les caractéristiques des chromosomes d'Émilie.
Afin d'augmenter encore les probabilités de filiation, il faudrait comparer ces minisatellites sur davantage de chromosomes. Les laboratoires d'analyse parviennent à assurer des tests à l'issue desquels ils peuvent annoncer une probabilité de filiation excédant les 99 %.
33
Figure 48: Exemple de document d’identification des bovins
34