Analytické metody

Vladimíra Kvasnicová

1. SPEKTROFOTOMETRIE

2. CHROMATOGRAFIE

3. POTENCIOMETRIE

4. VOLUMETRIE

Spektrofotometrie

spektrofotometr

Materiál používaný pro analýzu:

ROZTOK

PRINCIP

• interakce mezi stanovovaným analytem a

monochromatickým zářením

• část záření je absorbována

stanovovanou látkou, zbývající

záření je detekováno detektorem

• množství absorbovaného záření je přímo

úměrné množství analyzované látky

Spektrofotometrie je kvantitativní metoda:

stanovujeme

KONCENTRACI

koncentrace tmavší roztok absorpce

Důležité termíny

vzorek = analyzovaný roztok

neznámý vzorek = vzorek o neznámé koncentraci

standard = vzorek o známé koncentraci

blank = roztok neobsahující analyzovanou látku

chromofor = část struktury chemické látky,

která je schopna absorbovat

záření určité vlnové délky

fialová 380 – 450 nm

modrá 450 – 495 nm

zelená 495 – 570 nm

žlutá 570 – 590 nm

oranžová 590 – 620 nm

červená 620 – 750 nm

viz. http://en.wikipedia.org/wiki/Electromagnetic_spectrum

Obrázek převzat z http://en.wikipedia.org/wiki/Electromagnetic_spectrum (2006)

Používané elektromagnetické záření

• barevné vzorky: viditelné (VIS)

• bezbarvé vzorky: UV záření

A /

„absorpční spektrum“

Komplementární barvy

SCHÉMA spektrofotometru

Které veličiny jsou měřeny?

TRANSMITANCE

= poměr intenzity záření vystupujícího z kyvety (I)

k intenzitě záření do kyvety vstupující (Io)

(tj. záření dopadající na detektor / původní záření)

T = I / Io

T = 0 – 1 nebo v procentech % (0 – 100 %)

Jak se vyjadřuje množství pohlceného záření?

veličina odvozená od transmitance: ABSORBANCE

A = - log10 T

= - log10 (I/I0) = log10 (I0/I) = log10 (1/T)

A = 0 – 1.0 (1.5 nebo více)

horní limit závisí na citlivosti detektoru

T prošlo (%) pohlceno (%) A

1 100 0 0

0.99 99 1 0.004

0.90 90 10 0.05

0.50 50 50 0.3

0.10 10 90 1.0

0.01 1 99 2.0

0.001 0.1 99.9 3.0

0.0001 0.01 99.99 4.0

T prošlo (%) pohlceno (%) A

1 100 0 0

0.99 99 1 0.004

0.90 90 10 0.05

0.50 50 50 0.3

0.10 10 90 1.0

0.01 1 99 2.0

0.001 0.1 99.9 3.0

0.0001 0.01 99.99 4.0

citlivosti detektoru

Zjištění koncentrace:

1. Lambert-Beerův zákon

2. Kalibrační křivka

3. Výpočet pomocí hodnot (A, c) standardních vzorků

Zjištění koncentrace:

Lambert-Beerův zákon

A = x l x cnebo

T = 10- ( x l x c)

A = absorbance (A = -log T)

T = transmitance (T = 10-A)

= molární absorpční („extinkční“) koeficient

l = tloušťka kyvety (v cm), c = molární koncentrace

Kalibrační křivka

3 a více standardů

zpracovaných

stejnou metodou

lineární kalibrační

křivka

A = x l x c y = kx + q

Výpočet pomocí standardů

Ast = cst x l x Avz = cvz x l x

Ast / cst = l x Avz / cvz = l x

l x = l x

Ast / cst = Avz / cvz

cvz = Avz x (cst / Ast)

cvz = Avz x f

f = průměr všech (cst / Ast) použitých při experimentu

Cvičení1) Avz = 0,25 Cvz = ?

Ast = 0,40 Cst = 4mg / L

2) standard glukózy: Cs = 1000mg/L, T = 0,49.

neznámý vzorek: T = 0,55, Cvz = ? (v mg/L i mmol/L)

MW = 180g

3) standard proteinů: T = 0,33; vzorek pacienta: T = 0,44

Porovnejte koncentraci proteinů ve vzorku pacienta se

standardem.

Přesnost stanovení

absorpce ostatními látkami přítomnými

ve vzorku musí být eliminována:

BLANK (slepý pokus)

→ jeho absorbance se odečte od absorbance

vzorku výsledná absorbance odpovídá pouze

koncentraci analyzované látky

Spektrofotometrie v praktickém cvičení

„Stanovení koncentrace kreatininu v moči“

analyzovaný vzorek: vlastní moč

1. bezbarvý kreatinin je převeden na barevný

produkt chemickou reakcí

2. koncentrace kreatininu ve vzorku se

zjišťuje z naměřené absorbance pomocí

kalibrační křivky

Chromatografie

chromatograf

Všechny

chromatografické

techniky nejsou

instrumentální...

TLC chromatografie = úkol v praktiku

PRINCIP

Separace směsi různých látek je založena na

rozdílné distribuci látek mezi dvě

nemísitelné fáze:

• stacionární fáze (pevná nebo kapalná)

• mobilní fáze (kapalná nebo plynná)

Mobilní fáze unáší jednotlivé vzorky skrz stacionární fázi

rozdílnou rychlostí v závislosti na jejich afinitě k fázím.

• pokud je „afinita“ látky k mobilní fázi vysoká,

látka putuje systémem rychleji než látka

s nižší afinitou

• pokud je „afinita“ látky ke stacionární fázi

vysoká, látka je ve stacionární fázi déle

zadržována a pohybuje se sytémem pomaleji

než látka mající nižší afinitu

Obrázek převzat z http://www.chemistry.vt.edu/chem-ed/sep/lc/lc.html (listopad 2006)

Co je cílem analýzy?

1. rozdělit (separovat) od sebe jednotlivé látky

2. identifikovat látky (= kvalitativní analýza)

3. stanovit koncentraci přítomných látek

(= kvantitativní

analýza)

Klasifikace chromatografických technik

1) podle mobilní fáze

kapalinová chromatografie (LC)

plynová chromatografie (GC)

2) podle uspořádání

planární (rovinná) chromatografie

chromatografie v koloně

kapalinová

v koloně

„manuální“

chromatografie

kapalinová

v koloně

„instrumentální“

chromatografie

kapalinová planární

chromatografie

příklad:

Plynová chromatografie (GC)

Obrázek převzat z http://www.cofc.edu/~kinard/221LCHEM/ (listopad 2006)

3) podle fyzikálně-chemických interakcí

adsorpční chromatografie

rozdělovací chromatografie

gelová permeační chromatografie (GPC)

chromatografie na iontoměničních (IONEX)

afinitní chromatografie

Fyzikálně-chemické mechanismy separace

adsorpce rozpouštěnísítový efekt –

gelová chromatografie

iontová výměnaspecifická interakce-

afinitní chromatografieSnímek převzat z prezentace analyticke_metody / Petr Tůma

Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)

Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)

Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)

Vyhodnocení chromatogramu

Porovnání skvrn se

standardy:

Rf = a /b

Rf = retardační faktor

(„rate of flow“)

a = vzdálenost start-střed skvrny

b = vzdálenost start-čelo mobilní f.

1) planární chromatografie (př. TLC)

„b“

„a“

Obrázek převzat z http://sms.kaist.ac.kr/~jhkwak/gc/catofp/chromato/tlc/tlc.htm (listopad 2006)

2) chromatografie v koloně (HPLC, GC)

Porovnání „píků“ se

standardy:

tR = retenční čas

identifikace látek

h = výška píku

koncentrace látek

„píky“

Chromatografie v praktickém cvičení

„ TLC lipofilních barviv“

= adsorpční planární kapalinová chromatografie

• mobilní fáze: toluen (nepolární)

• stacionární fáze: destička se silikagelem (polární)

• stadardy barviv → porovnání Rf

• neznámý vzorek: obsahuje 2 různá barviva

„Demonstrace HPLC a GC“

HPLC

= High Performance Liquid Chromatography (vysokoúčinná kapalinová chromatografie)

• normální nebo reverzní fáze• princip (vysokoúčinná, vysokotlaká chromatogr.)

GC

= Gas Chromatography(plynová chromatografie)

Potenciometrie

potenciometr

PRINCIP

Potenciometrie je elektrochemická metoda

založená na měření napětí elektrochemického

článku za bezproudého stavu.

dvě elektrody:

• indikační (měřící) elektroda

• referentní (srovnávací) elektroda

Schéma:

Elektrody

indikační elektrodajejí potenciál závisí na složení roztoku

referentní elektrodajejí potenciál je stabilní (konstantní, známý)

Měřit přímo potenciál jako takový nelze měříme rozdíl potenciálů (=napětí)

indikační elektrodyObrázek převzat z http://food.oregonstate.edu/images/ph/beck8.jpg (2006)

Nernstova rovnice

E = E0 + (RT/nF) ln aM

E = elektrodový potenciál

E0 = standardní elektrodový potenciál

R = molární plynová konstanta (8.314 J K-1 mol-1)

F = Faradayova konstanta (96 458 C mol-1)

T = absolutní teplota (25 0C = 298 K)

n = náboj stanovovaného iontu (M)

a = aktivita stanovovaného iontu

E = E0 + (RT/nF) ln aM

ln a = 2.303 log a; dosazeno za R, T a F

E = E0 + (0.059/n) log aM

! DŮLEŽITÉ !• elektrodový potenciál závisí na teplotě roztoku,

aktivitě („koncentraci“) a náboji stanovovaného iontu

• elektrodový potenciál nepotřebujeme počítat: ke kalibraci potenciometru používáme standardy

Obecná klasifikace elektrod

1) elektrody I. druhu (kovové nebo plynové)

2) elektrody II. druhu (kov + jeho nerozpustná sůl)

→ REFERENTNÍ ELEKTRODY

3) redoxní elektrody (Pt, Au)

4) membránové elektrody

→ ISE = iontově selektivní

elektr.

(stanovení iontů v medicíně: H+, Na+, K+, Cl-,...)

„Standardní vodíková elektroda“ (SHE)

• plynová elektroda

• její potenciál byl definován: ESHE = 0

za všech podmínek

REFERENTNÍ ELEKTRODA, ale v praxi se běžně nepoužívá

Referentní elektrody

kalomelová argent-chloridová

SHE

„Skleněná elektroda“

= ISE (H+)

stanovenípH

membránová electroda

Membránové elektrody na stanovení plynů

skleněnáelektroda

referentníe lektroda

tě losensoru

vnitřníe lektro lyt

perm eabilním em brána

analyzovanéprostředí

skleněnáelektroda

CO (g)2

perm eabilním em brána

analyzovanéprostředí

film e lytu

pH-m etr

CO +H O HCO +H+2 2 3-

elektroda používaná na stanovení CO2 v krvi

Potenciometrie v praktickém cvičení

„ Měření pH fosfátového pufru“

• roztoky fosfátového pufru o různém složení

• stanovení pH pomocí pH-metru

(= upravený potenciometr)

• kalibrace přístroje pomocí standardů

• skleněná kombinovaná elektroda („dvojče“)

Skleněná kombinovaná

elektroda

vnějšírefeferentníelektroda

stínění – přívodk vnější ref.elektrodě

vnitřní vodič – přívodk vnitřní ref.elektrodě

plnicíotvor

vnitřní referentníelektroda

solný můstek ( keramická frita)

skleněnámembrána

Skleněná kombinovaná

elektroda v praktiku

Volumetrie (= titrace, odměrná analýza)

Metoda založená na chemické reakci mezi analyzovanou látkou a tzv. odměrným roztokem

byretas odměrným

roztokem

titrační baňka s naředěnýmanalyzovaným vzorkem

titrace= zjištění přesné

koncentrace vzorku

PRINCIP

K analyzované látce se pomocí byrety postupně přidává

roztok o známé koncentraci, a to tak dlouho, dokud není dosaženo stechiometrického

poměru reagujících látek (= bod ekvivalence)

bod ekvivalence= reagující látky jsou ve stechiometrickém poměru daném chemickou rovnicí popisující probíhající reakci

Odměrný roztok (OR)

• známé, přesně definované složení

• jeho koncentraci lze přesně stanovit pomocí

stadardu o známé a neměnné koncentraci

• reaguje se stanovovanou látkou rychle, bez

vedlejších reakcí

• reakci lze popsat chemickou rovnicí

• v bodě ekvivalence dochází „skokem“

k fyzikálně-chemické změně, kterou je možno

snadno indikovat

Zjištění přesné koncentrace OR

• titrací standardu o přesně známé koncentraci• porovnání teoretické (předpokládané, vypočítané)

spotřeby se skutečnou (aktuální, titrací zjištěnou):

Vt / Va = f

• f = faktor odměrného roztoku (0,900 – 1,100)

• aktuální konc. OR (= titr): ca = f x ct

• faktorem při výpočtu koncentrace vzorku násobíme teoretickou hodnotu koncentrace OR

Výpočet koncentrace vzorku

• založen na znalosti stechiometrie chemické reakce

a A + b B → c C + d D

a, b, c, d = stechiometrické koeficienty = látkové množství (n)

A = „odměrný roztok“, B = analyzovaná látka

a / b = n(A) / n(B)

a / b = n(A) / n(B)

c = n / V → n = c x V

c = molární koncentrace (mol/l)

n = látkové množství (mol)

V = objem roztoku

a, b = stechiometrické koeficienty

a x n(B) = b x n(A)

a x cB x VB = b x cA x VA

a x cB x VB = b x cA x VA

• známe stechiometrii chemické reakce • známe koncentraci odměrného roztoku a jeho

objem spotřebovaný při dosažení bodu ekvivalence

• známe objem vzorku použitého pro analýzu

jediná neznámá je koncentrace vzorku

cB

Cvičení

1) spotřeba odměrného roztoku: 23,8 ml NaOH,(f = 0,9685; C = 0,1M), vzorek = 10ml H2SO4; C = ?

2) spotřeba odměrného roztoku: 10ml KMnO4 (0,1M), vzorek: 20ml FeSO4 ; C = ? (mol/ L, % ),

MW = 152g

3) H3PO4 → Na2HPO4

vzorek: 20ml H3PO4 (C = 0,3M ), odměrný roztok: 0,2M NaOH V = ?

Titraci provádí jedna osoba:po kapkách přidává OR z byrety

za stálého promíchávání obsahu titrační baňky

Indikace bodu ekvivalence

1) pomocí indikátoru jednoduché, ale subjektivní hodnocení bod ekvivalence objemu OR po jehož přidání

změní titrovaný roztok trvale své zbarvení indikuje „první nadbytečnou kapku“ přidaného OR

ve skutečnosti je při změně zbarvení roztok „přetitrován“

2) pomocí přístroje (např. potenciometru) objektivní vyhodnocuje se TITRAČNÍ KŘIVKA

Titrační křivkatitrace kyseliny hydroxidem

odměrný roztok

indikátoryměřená veličina

titrace hydroxidu kyselinou

odměrný roztok

Klasifikace titrací

1) neutralizační (acidobazické) kyselina /báze• H+ + OH- → H2O

2) oxidačně-redukční (redox) ox./red. činidlo• oxidace: red → ox + e-

• redukce: ox → red + e-

3) srážecí př. AgNO3

• vznik nerozpustné sraženiny

4) komplexometrické př. EDTA• vznik koordinačně-kovalentní sloučeniny

Titrace v praktickém cvičení

„Stanovení acidity žaludeční šťávy“

• reaguje HCl ze žaludeční šťávy

• odměrný roztok: NaOH

→ neutralizační titrace (= alkalimetrie)

• indikátor: fenolftalein (bezbarvý → fialový)

• z konc. HCl se vypočítá pH žaludeční šťávy

• zjišťuje se pH před a po stimulaci

(= na lačno a „po jídle“)

Návody na praktika+ teorie metod:

http://www.lf3.cuni.cz/chemie/

viz. Studium / praktika