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Anclaje y sobrevivencia
Las células de organismos multicelulares forman anclajes con la matriz extracelular y con otras células
Alberts et al MBC 2002
citoplasma
ligando extracelular
citoesqueleto
Los anclajes transmiten fuerzas entre las células y su entorno.
Moléculas de trans-membrana
anclan ligandos intracelulares
y extracelulares inmobilizados.
Sin anclaje
Con anclaje
“Adhesión celular”
ligando intracelular
membranafuerza/
deformación
Wassarman et al, Nature Cell Biol 2001; Prymakoff & Myles, Science 2002; Vjujina & Evans Front Biosci 2008; Satouh & Ikawa TIBS 2018
La adhesión es un fenómenoesencial durante la fertilización
células
del
cúmulo
zona pelúcida
moléculas de
adhesión
La adhesión es esencial para mantener la cohesión del embrión en desarrollo
BMoC 2008; Damsky et al Cell 1983
mórula
mórula
+ anti-E-caderinaEl bloqueo de E-caderinas (uvomorulina)
con un anticuerpo monoclonal desensambla
las adhesiones intercelulares, inhibe la
compactación y desorganiza la mórula.
compactación
La adhesiones proporcionan cohesión a los tejidos y son fundamentalespara la organización y arquitectura multicelular
Alberts et al BMoC 2008
filamentos
intermedios
La adhesión involucra el reconocimiento de ligandos extracelulares mediante diversos mecanismos moleculares
uniones homofílicas
Ej. caderina-caderina,
NCAM-NCAM
uniones a través de una molécula
extracelular puente. Ej.
integrinas-proteoglicanos-integrinasuniones heterofílicas
Ej. integrinas-ICAMs,
selectinas-glicanos
Alberts et al MBC 2002
Los dominios extracelulares de las moléculas de adhesión han evolucionado para reconocer
moléculas del mismo tipo (unión homofílica) o moléculas diferentes (unión heterofílica).
Lodish et al MBC 2004
Varias familias de proteínas están involucradas en procesos de reconocimiento y adhesión
(~115) (~700) (~26)
KNOCK OUT INTEGRINS & CADHERINS
La depleción de moléculas de adhesión provoca letalidad o severos defectos en el desarrollo, estructura y funcionamiento de los tejidos
N-cadE10, neurulation/somito
genesis defects, heart
does not form
E-cad
die at time of
implantation
N-CAM
Nervous system
defectsL1
claudin
die at birth
Lodish et al MBC 2004; Alberts et al MBC 2015
Los complejos de adhesión cumplen funciones mecánicas
Los receptores de adhesión se anclan al citoesqueleto mediante diversas proteínas
adaptadoras y de “scaffold”. Las interacciones son de naturaleza no covalentes y
dinámicas, y permiten la transmisión de fuerzas entre la célula y su entorno.
Lodish et al MCB 2016; Erickson COSB 2017
Las proteínas de adhesión responden a las fuerzas mecánicas mediante cambios en su conformación
compact
unfoldedmechanical force
fibronectin dimers
Las integrinas transmiten fuerzas mecánicas entre la matriz extracelular y el citoplasma
Roca-Cusachs et al JCS 2012; Wang et al Cell Molec Bioing 2016
extended
closed
conformation
open
conformation
compact
FN modules
La elongación de talina
promueve su interacción
con vinculina y el refuerzo
del anclaje receptor-actina.
stretching!
sitios de oligomerización
tensionado
módulo
relajado
módulo de FN III
Alberts et al MBC 2015integrinas
El proceso de conversión de
fuerzas mecánicas en señales
bioquímicas y respuestas
biológicas se denomina
mecanotransducción.
fuerza de unión
~40-90 picoNewton (pN)
stretching!
Las caderinas inducen cambios conformacionales en proteínas asociadas a su dominio citosólico
stretching!
La generación de fuerzas
intracelulares dependen
de actina y miosina
La elongación
de -catenin
promueve su
interacción
con vinculina.
Lodish et al MBC 2004; Alberts et al MBC 2015
fuerza de unión
~50 piconewton (pN)
Hynes Cell 2002
Los complejos de adhesión también generan y modulan señales bioquímicas intracelulares
Diversos procesos celulares fundamentales (ej. proliferación, apoptosis, etc) son regulados por la adhesión
a la matriz extracelular. La adhesión activa diversas enzimas y proteínas asociadas a los complejos de
adhesión. Esta función se realiza de manera sinérgica con otros tipos de receptores.
Chiquet et al, BBA 2009
Métodos para estudiar las respuestas mecánicas de las células
Empleo de substratos deformables (ej. silicona, poliacrilamida, etc)
célula en reposo célula ejerciendo tracción
substrato substrato
substrato substrato
Empleo de trampas ópticas
rayo lásermicroesfera
cubierta con
proteína adhesiva
filamentos
de actina
fuerza
desplazamiento
video disponible
Provenzano et al CPCB 2010; Schwarz & Gardel, JCS 2012; Tojkander et al JCS 2012; Paluch et al BMC Biol 2015; Alberts et al BMC2008
Métodos para estudiar las respuestas mecánicas de las células
Contracción de geles de colágeno
1 mm
Alineamiento de fibras de colágeno
Evaluación del citoesqueleto
mapa de fuerzas de tracción
Adhesiones
Microscopía de fuerzas de tracción
microesferas
gel/elastómero
Los complejos de adhesión cumplen diferentes funciones en los distintos tejidos
dendritic cell
T-cell
sinapsis inmunológica
Comunicación y señalización
neuronasepitelialesepiteliales
Anclaje
epiteliales
Barrera
Barrera (hemostasis)
malla de fibrina
colágeno
plaquetas activadas
Señalización
Diferentes estructuras y funciones de los complejos de adhesión
matriz
extracelular
(fibroblasto)
Anclaje
Doyle et al, Nature Commun 2015
Migración
fotos tomadas cada 1 hora
adhesión
fibra
Fuerzas en los
anclajes: modelo de
2 resortes en serie.
Los epitelios exhiben múltiples tipos de uniones intercelulares
Uniones estrechas: Constituyen una
barrera al pasaje de moléculas entre la
cara apical y basolateral.
Uniones adherentes: Anclan los
citoesqueletos contráctiles y son
esenciales durante la morfogénesis.
Desmosomas: Anclan los citoesqueletos
no contráctiles y son esenciales para
mantener la estructura del epitelio.
Uniones en hendidura: Permiten el pasaje
de iones, segundos mensajeros, y otras
moléculas pequeñas. Contribuyen a la
coordinación funcional del epitelio.
Hemidesmosomas: Anclan las células,
mediante un citoesqueleto no contráctil
(fil. intermedios), a la membrana basal
que limita con el tejido subyacente.
Adhesiones focales: Anclan las células,
mediante un citoesqueleto contráctil
(actina), a la membrana basal.
Las células epiteliales maduras se polarizan formando un dominio apical (= luminal) y uno basolateral.
(estrechas)
(adherentes y
desmosomas)
(hendidura)
(focales)
Alberts et al MBC 2015
lúmen
Lodish et al MBC 2016
Los epitelios exhiben múltiples tipos de uniones intercelulares
Microscopía electrónica
Las uniones estrechas impiden la libre difusión de moléculas a través del epitelio (transporte paracelular) y
actúan como barrera a la difusión de proteínas de membrana entre los dominios apical y basolateral.
Microscopía electrónica que ilustra la barrera formada
por las uniones estrechas. En este experimento se
incubó un epitelio con hidróxido de lantanio (opaco a los
electrones). El lantanio no pasa las uniones estrechas.
lantanio en uniones estrechas
lantanio
Función de barrera: Uniones estrechas (Tight/Occluding junctions)
transporte
vectorial
(transcelular)
de glucosa
En el intestino la polarización de
las células permite un flujo
vectorial de nutrientes.
Al microscopio electrónico las uniones estrechas se visualizancomo una costura en la porción apical de las células epiteliales
Alberts et al MBC 2002
Visualización de uniones estrechas por microscopía
electrónica. Técnica de congelación y fracturacara apical
cara basolateral
Las principales proteínas de transmembrana de las uniones estrechas son las Claudinas
Los dominios extracelulares de claudinas y ocludinas
median interacciones homofílicas independientes de
calcio. Los dominios intracelulares se anclan al
citoesqueleto de actina por medio de proteínas
adaptadoras denominadas ZO ("Zonula Occludens").
célula 1 célula 2
Otras proteínas de transmembrana como
ocludinas, JAMs y tricelulinas también forman
parte de las uniones estrechas .
Las proteínas de “scaffold” ZO poseen varios dominios
que les permiten interaccionar con proteínas de
transmembrana, actina y otros adaptadores.
JAMs
Algunos virus y bacterias patogénicas invaden perturbando las uniones estrechas
Krause et al Sem Cell Dev Biol 2015; Saitoh et al Science 2015; Eichner et al Eur J Physiol 2017
Estructura de claudina
ECL2: Extracellular Loop 2
sitio de unión homofílica
CPE: Clostridium perfringens enterotoxin
CPE en complejo con claudina
toxina ECL1 y 2
(celeste y
naranja)
Función de anclaje: uniones adherentes, desmosomas, hemidesmosomas y adhesiones focales
Las uniones de anclaje incluyen uniones
intercelulares y entre células y la matriz
extracelular. Se componen de proteínas de
transmembrana que anclan los ligandos
extracelulares inmobilizados con filamentos
del citoesqueleto.
Alberts et al MBC 2002
Uniones adherentes (Adherens Junctions)
En epitelios, las uniones adherentes
forman bandas adhesivas (“adhesion belt”)
por debajo de las uniones estrechas.
Alberts et al MBC 2002
Las proteínas de transmembrana de las uniones
adherentes son las caderinas. Los ectodominios de
las caderinas de células adyacentes interaccionan
entre sí en presencia de calcio. Los dominios
intracelulares se anclan a los filamentos de actina
contráctiles. Las uniones adherentes y estrechas
están vinculadas entre sí estructural y funcionalmente.
~ 38 nm
ectodominios
Las uniones adherentes son requeridas en eventos morfogenéticos que ocurren durante el desarrollo
Alberts et al MBC 2002Nakajima & Tanoue Small GTPases 2012
Banda adhesiva
Uniones estrechas
Uniones adherentes
Apical
constriction
actin-
myosin
forces
La contricción del citoesqueleto
contráctil apical anclado a las
uniones adherentes cambia la
forma de las células.
Microscopía electrónica de barrido. Formación del tubo neuraly de la copa óptica
Alberts et al MBC 2002
Gilbert Developmental Biology 2000
Invaginación de ectodermo y formación del tubo neural
Invaginación de ectodermo y formación
de la copa óptica
Desmosomas y hemidesmosomas
Los desmosomas y hemidesmosomas son uniones de
anclaje esenciales para mantener la estructura de los
epitelios. Se acoplan a los filamentos intermedios
los cuales no son contráctiles. Los desmosomas
anclan células epiteliales adyacentes, mientras que
los hemidesmosomas anclan la cara basal de las
células epiteliales a la lámina basal.
Alberts et al MBC 2002
integrin
receptors
Organización y componentes moleculares de los desmosomas
Las proteínas de transmembrana de los desmosomas son las desmogleínas y desmocolinas, integrantes de
la superfamilia de las caderinas. Los dominios extracelulares de desmogleínas y desmocolinas de células
adyacentes interaccionan entre sí en una manera dependiente de calcio. Sus dominios intracelulares se unen
a placoglobinas y placofilinas (integrantes de la familia de las cateninas), que mediante la unión a
desmoplaquinas anclan el complejo a los filamentos intermedios.
Alberts et al, MBC 2015
Organización y componentes moleculares de los hemidesmosomas
Las principales proteínas de transmembrana de los hemidesmosomas son las integrinas 6β4 y el
colágeno de transmembrana tipo XVII. Estas proteínas interaccionan entre sí y se unen a la laminina de
la membrana basal. Sus dominios intracelulares interaccionan con las proteínas adaptadoras plectina y
BP230 que a su vez se unen a los filamentos intermedios.
Alberts et al, MBC 2015
Lodish et al MBC 2004
Cohen et al., JCB 2004
La formación de las uniones de anclaje y estrechas son esenciales para lapolarización de las células epiteliales
Las células epiteliales MDCK se polarizan cuando se cultivan confluentes sobre soportes porosos cubiertos
con una lámina basal sintética. Microscopía de fluorescencia y electrónica revelan que las células adquieren
una forma columnar, y diferencian un dominio apical con microvellosidades, y un dominio basolateral.
MDCK: Madin-Darby Canine Kidney cells
gp135: marcador de dominio apical
ZO-1 marcador de uniones estrechas
β-catenina y E-caderina marcador de uniones adherentes y dominio lateral
Uniones en hendidura (Gap Junctions)
La mayoría de las células poseen uniones en hendidura. En estos complejos proteicos las membranas
se separan unos 2-4 nm (panel de la izquierda). En una vista frontal las uniones en hendidura forman
agregados de estructuras cilíndricas (panel de la derecha).
Lodish et al MBC 2004
conexones
Proteínas de transmembrana denominadas conexinasforman canales intercelulares denominados conexones
Los conexones permiten el pasaje de
iones y otras moléculas pequeñas (ej.
segundos mensajeros, aminoácidos,
Ca++), facilitando el acoplamiento
metabólico y eléctrico entre las células.
connexin
conexón (hexámero)
(Da)
Conectividad funcional
entre neuronas de la retina.
Liberación del neuro-
transmisor dopamina.
Las uniones en hendidura permiten el acople metabólico y eléctrico entre células
MBC, 2008
Inhibición de la
permeabilidad de las
uniones en hendidura y
del campo de inervación.
Inyección de un trazador
fluorescente que pasa por
las uniones en hendidura
y revela el campo de
inervación de la neurona
folículo
ovárico
La permeabilidad de los conexones puede ser regulada por varios factores como AMPc, calcio, voltaje, pH.
Moléculas de GMPc sintetizado en las células foliculares
pasan a través de uniones en hendidura al ovocito e
inhiben su maduración (arresto en profase meiótica).
células foliculares
GMPc
PDE
AMPc
mitosis AMPc
Receptor
Dopamina
Caderinas: Estructura y función
Las caderinas son proteínas de transmembrana cuyo
dominio extracelular contiene repeticiones de ~110
aminoácidos, denominadas “cadherin repeats” (CR). Las
caderinas clásicas son una familia de proteínas de
transmembrana de tipo I a la cual pertenecen las
caderinas tipo E, P y N. Se caracterizan por tener cinco
CR en su dominio extracelular y un dominio citoplasmático
conservado que interacciona con proteínas citosólicas
denominadas cateninas. La unión de Ca2+ entre los CR
favorece la forma rígida y extendida del ectodominio.
Molecule Predominant Cellular Distribution
E-cadherin Preimplantation embryos, non-neural epithelial tissue
P-cadherin Trophoblast
N-cadherin Nervous system, lens, cardiac and skeletal muscle
SOURCE: M. Takeichi, 1988, Development 102:639; M. Takeichi, 1991, Science
251:1451; H. Inuzuka et al., 1991, Neuron 7:69; and M. Donalies et al., 1991, Proc. Nat'l.
Acad. Sci. USA 88:8024.
caderinas clásicas
Molecule Predominant Cellular Distribution
E-cadherin Preimplantation embryos, non-neural epithelial tissue
P-cadherin Trophoblast
N-cadherin Nervous system, lens, cardiac and skeletal muscle
SOURCE: M. Takeichi, 1988, Development 102:639; M. Takeichi, 1991, Science
251:1451; H. Inuzuka et al., 1991, Neuron 7:69; and M. Donalies et al., 1991, Proc. Nat'l.
Acad. Sci. USA 88:8024.
Alberts et al, MBC2008; Pokutta & Weiss, ARCDB 2007
Estructura
tridimensional del
dominio extracelular
(ectodominio).
CR1
CR2
CR3
CR4
CR5
Ca2+
carbohydratos
catenins
CR1
CR1
Trp
Trp
La unión entre caderinas involucra el intercambio de regiones estructurales
del CR1 de ambas. El triptofano (Trp, W) 2 en la hoja beta N-terminal del
CR1 de cada caderina se inserta en un bolsillo hidrofóbico del CR1 de la
caderina opuesta en trans (“strand swap dimer”). La unión es además
estabilizada por interacciones electrostáticas y puentes de hidrógeno.
Bases estructurales de la adhesión mediada por caderinas
Boggon et al., Science 2002;
Brasch et al TICB 2012;
adaptado de Alberts et al MBC 2008
Strand swapped dimer
La afinidad entre dímeros en trans es relativamente baja (~ 0,7mM) y la fuerza para romper la interacción
es de ~ 50 pN. En las adhesiones interaccionan simultaneamente miles de moléculas, incrementando por
un efecto de avidez la fuerza de la unión.
En los anclajes intercelulares, la agregación de caderinas incrementa la fuerza de la unión
MP
MP
interacción de múltiples
ectodominios de caderinas
en transcélula1
célula1
MP MP
AJ: Adherens Junction
Cell1 Cell2
Drolia & Bhunia, TIM 2018Pizarro-Cerdá et al, CSHPM 2012
El ectodominio de la E-caderina es un blanco de adhesinas bacterianas
Internalina A (InlA) es una adhesina de Listeria monocytogenes que promueve la internalización de la bacteria en células epiteliales.
Schubert et al, Cell 2002, Wollert et al, Cell 2007
El tropismo de huésped está relacionado a cambios puntuales en aminoácidos del CR1 que son críticos para el reconocimiento de InlA
InlA interacciona a través de su dominio rico en leucinas (LRR) con el dominio de la E-caderina humana (hCR1). La prolina en
posición 16 (P16) en el hCR1 es reemplazada por ácido glutámico (E16) en la E-caderina de ratón. Este único cambio reduce
la afinidad de la unión y disminuye notablemente la probabilidad de la infección de ratones por Listeria.
extremo de inserción en la
pared bacteriana
dominio LRR de InlA
hCR1
LRR
Superposición de la P16 y E16 en el
bolsillo hidrofóbico del LRR de InlA
El reconocimiento homofílico de las caderinas es un mecanismoque facilita la segregación de grupos o poblaciones celulares
células sin caderinas
incubadas con y sin Ca2+
células transfectadas con
caderinas e incubadas en
presencia y en ausencia de Ca2+
conclusión: la adhesión
requiere de caderinas
y calcio.
resultado: células
que expresan las mismas
caderinas se segregan
espacialmente.
conclusión: la adhesión
es homotípica y
homofílica.
resultado: células que
expresan diferentes
niveles del mismo tipo
de caderina se segregan.
conclusión: diferencias
cuantitativas en la
expresión de caderinas
también contribuye a la
organización espacial de
las poblaciones celulares.
estado
inicial
estado
final
incubación
con agitación +Ca2+
células transfectadas
con E-caderinas (azul)
y N-caderinas (naranja)
resultado:
adhesión
resultado:
no adhesión
mezcla de células que
expresan diferentes niveles
del mismo tipo de caderina
resultado:
no adhesión
+Ca2+ +Ca2+
Hibridización in situ revela la expresión de diferentes
caderinas en áreas específicas del cerebro de un
embrión de ratón.
El neuroectodermo expresa E-caderinas. Durante
la formación del tubo neural el neuroepitelio cambia
la expresión de E-caderinas por N-caderinas.
E-cad
N-cad
tubo
neural
ectodermo
La interacción homofílica mediada por caderinas facilita la segregación celular durante el desarrollo
Hirano & Takeichi, Physiol Rev 2012
Las cateninas anclan las caderinas al citoesqueleto y la estabilizan en la superficie
La b-catenina interacciona directamente con
las caderinas y con -catenina. Alfa catenina
interacciona con otras proteínas (vinculina, -
actinina) que unen actina. Las interacciones
son dinámicas y reguladas por fosforilación.
Alberts et al, MBC2008; Hirano & Takeichi, Physiol Rev 2012
sin anclaje al citoesqueleto
adhesión débil
con anclaje al citoesqueleto
adhesión fuerte
(-catenin,
vinculin,
-actinin)
~~extracelular
domain
En desmosomas la proteína adaptadora equivalente
a la β-catenina es placoglobina.
anclaje
La unión de la catenina p120 bloquea las señales de endocitosis (en amarillo) presentes en el dominio
citoplasmático de las caderinas e impide su internalización mediada por clatrina. La fosforilación (P)
de la caderina inhibe la unión de p120 y facilita la endocitosis de las caderinas.
La catenina p120 es requerida para estabilizar la caderina en la superficie celular
endocytic
signal
DEE
Reynolds, Cell 2010
La β-catenina no unida a las adhesiones puede actuar como un co-activador transcripcional
Las caderinas reclutan β-catenina a las adhesiones intercelulares. La β-catenina disociada de las
adhesiones puede tener dos destinos: a) degradación en proteasomas; b) estabilización y translocación al
núcleo donde forma complejos con los factores de transcripción TCF y LEF, los cuales promueven la
transcripción de genes pro-invasivos y mitogénicos (ciclina D, metaloproteasas, fibronectina, myc, etc).
La adhesión mediada por caderinas es regulada a nivel transcripcional
Kang & Masagué, Cell 2004
Transición Epitelio-Mesénquima o TEM
receptores
TGFβFGF
Wnt
extracelular
intracelular
TEM
La estimulación de receptores de crecimiento y
citoquinas activan y promueven la expresión de
factores de transcripción, como Twist, Snail,
SIP1 y Slug, que reprimen la expresión de E-
caderina y cateninas y estimulan la expresión
de proteínas involucradas en motilidad.
epitelio
tejido
conectivo
(estroma)
membrana
basal
normal carcinoma
La flecha en (F) indica células invasivas que han atravesado la membrana basal y se diseminan por el estroma.
Durante el proceso de TEM las células tumorales epiteliales degradan la membrana basal e invaden el estroma
TEM ocurre de manera regulada durante el desarrollo embrionario y permite la formación de estructuras nuevas
↓ N-caderina
↑ integrinas
↑ N-caderina
↑ N-caderina
Las células de la cresta neural se originan
por TEM. Después de migrar a lo largo del
embrión se agregan y diferencian para
formar distinas estructuras corporales.
La adhesión mediada por caderinas también puede ser regulada rápidamente por mecanismos post-traducción
Balzac et al., JCS 2005
A B
Regulación de la afinidad. La unión entre caderinas
requiere de calcio. La eliminación de Ca2+ con un
quelante (EGTA) inhibe reversiblemente la adhesión.
células unidas separadas unidas unidas separadas
Regulación del anclaje. El anclaje de las caderinas al
citoesqueleto es inhibido por fosforilación. Inhibidores de
fosfatasas (PAO) provocan la pérdida de la adhesión.
Regulación de la expresión en la superficie
celular. La endocitosis de las caderinas es
estimulada por diferentes factores extracelulares.
La endocitosis es facilitada
por la disociación de la
catenina p120 del tallo
citoplasmático de la caderina.
EGF, HGF, VEGF
La diapédesis requiere de una inactivación temporaria y rápida de la función adhesiva de las caderinas vasculares
Shaw et al, J. Immunol. 2001; Vestweber Nature Rev Immunol 2015
Visualización de la migración trans-epitelial de leucocitos. Células endoteliales fueron transfectadas con VE
caderina-GFP y activadas con TNF. Leucocitos polimorfonucleares marcados con Cell Tracker orange (rojo)
se sembraron sobre la monocapa y se filmó el pasaje entre dos células endoteliales adyacentes (flecha).
0 0:45 3:00 3:15 3:30
3:45 4:00 4:15 4:30 9:15
La inactivación rápida y transitoria de la
VE-caderina ocurre por cambios en su
estado de fosforilación que induce su
endocitosis y disociación del citoesqueleto.
Las caderinas junto a otras moléculas de adhesión son esenciales para la formación de las sinapsis neuronales
sinapsis
madura
sinaptogénesiscadherin
Hynes. Cell 2002,
Anthis & Campbell, TIBS 2011
Las integrinas son receptores de moléculas de la matriz extracelular
12
10
11
collagen receptors
Fibronectin,
Vitronectin,
Fibrinogen
El receptor es un heterodímero formado por la unión no covalente entre una subunidad y una b
de una familia de subunidades y b. Ambas subunidades son proteínas de transmembrana tipo I.
El sitio de unión al ligando está compuesto por el extremo N-terminal de las dos subunidades.
β-propeller
ligando
Mg2+, Mn2+
La afinidad de las integrinas es regulada por la unión a ligandos extra e intracelulares
Las integrinas existen en dos conformaciones alostéricas que determinan la afinidad por el ligando:
inactiva (= baja afinidad por el ligando) y activa (= alta afinidad por el ligando). Interacciones específicas
con ligandos extracelulares o intracelulares inducen cambios conformacionales que activan el receptor.
Shattill et al NRMBC2010
El tripéptido RGD está presente en
proteínas de la matriz extracelular,
como fibronectina, y es reconocido
por ciertas integrinas celulares
interacciones
entre α y β
promueven la
conformación
inactiva.
inactiva
activa activa
regulación del
citoesqueleto,
supervivencia,
transcripción
ligando
intracelular
microscopía electrónica de los
ectodominios en la conformación
inactiva (A) y activa (B).
unión a la ECMligando extracelular
La agregación de integrinas incrementa la fuerza del anclaje
Las agregación de integrinas incrementa la avidez (múltiples pares de interacción receptor/ligando). La
agregación es facilitada por la naturaleza polimérica de las proteínas de la matriz extracelular y por el
efecto de fuerzas ejercidas por el citoesqueleto de actina y miosina. Varias proteínas “scaffold” tales
como talina, vinculina y -actinina participan en el anclaje de las integrinas a los filamentos de actina.
Marcación fluorescente de b1-integrina
y actina: complejos de adhesiónLa microscopía de super-resolución revela diferentes capas de
proteínas en los complejos de adhesión formados por integrinas.
Kanchanawong et al, Nature 2010
A través de los complejos de adhesión las células ejercen fuerzas de tracción sobre el substrato
tracción mediada por miosina II inhibición de miosina y la tracción
(A y C) muestran la deformación de un substrato de silicona cuando se estimula la GTPasa
RhoA. La inhibición de la actividad de miosina elimina las fuerzas de tracción (B).
A BC
La estimulación de integrinas
activa RhoA, que a su vez
activa a miosina y promueve la
contractilidad actina-miosina.
Ballestrem et al 2001;
Morimatsu et al 2013
Determinación de fuerzas
mediadas por las integrinas
empleando un sensor de
fuerzas compuesto por pares
de FRET en los extremos de
una secuencia peptídica
elástica, y de un motivo RGD
para la unión de integrinas. El
rango de fuerzas de una
integrina es de 2-40 pN.
high force
Las fuerzas generadas por el citoesqueleto y los complejos de adhesión promueven el ensamble y organización de la matriz extracelular
Las fuerzas ejercidas por fibroblastos
sobre moléculas de fibronectina
extracelular inducen la exposición de
sitios de oligomerización ocultos que
promueven el ensamble de las fibras.
Alineamiento de las fibras de
colágeno entre dos colonias de
fibroblastos inmersos en un gel
de colágeno.
1 mm
coloniacolonia
gel de colágeno
fibras alineadas
secuencias de oligomerización
tensionado
módulo
relajado
módulo de FN III
Modelo de ensamble de las fibras de fibronectina
Singh et al Annu Rev Cell Dev Biol 2010
Dímero de FN unido
a la integrina.
Fuerzas celulares alteran la
conformación de moléculas de FN.
La agregación de integrinas expone
nuevos sitios de unión entre
moléculas de FN y cambios
adicionales en la conformación.
polimerización y formación de
una matriz de FN insoluble.
La agregación de las integrinas en los complejos de adhesiónactiva tirosina quinasas y promueve fosforilación
Fibroblastos adheridos sobre fibronectina activan la fosforilación de numerosas proteínas en los
complejos de adhesión. Esto puede apreciarse por inmunofluorescencia con un anticuerpo
anti-fosfotirosina. Las flechas señalan los focos de adhesión marcados con el anticuerpo.
FAK y Src son las principales quinasas activadas en los complejos de integrinas
integrinas FAK Cas Crk JNK
integrinas FAK Grb2 Sos Ras Erk
(MAP kinasa)
(MAP kinasa)
expresión de ciclinas D;
proliferación
PTK adaptor adaptor MAP
PTK adaptor GEF GTPase MAP
Las quinasas Src y FAK activadas en las adhesiones cumplen diferentes roles reguladores del citoesqueleto y motilidad
Las células normales producen
focos de adhesión alargados
(flechas en (A). Las células
deficientes en FAK (B) producen
múltiples focos pequeños.
Src-FAK
E-cadherin
Rac
polimerización de
actina y extensión
de lamelas y
filopodios
crecimiento y
recambio de
los contactos
adhesivos
+
+
-
+
A
B
(Schlaepfer, PBMB 1999)
Rho
+
++
generación
de fuerza,
contractilidad
miosinaArp2/3, forminas
Las células normales se polarizan formando una lamela de avance en la dirección de la migración. Las células deficientes
en FAK no se polarizan eficientemente, cambian de dirección frecuentemente y exhiben alteraciones quimiotácticas.
Tilghman et al JCS2005; Owen et al JCB 2007
Tavora et al EMBO Mol Med 2010
FAK es requerido para la polarización y migración direccional
células que expresan FAK
células que no expresan FAK
cambios de forma de macrófagostiempo
FAK wt
FAK KO
Inhibición de la respuesta
quimiotáctica de células
endoteliales al VEGF
Las adhesiones regulan el dinamismo del citoesqueleto y la migración celular
Durante la migración, nuevas adhesiones se ensamblan en el margen de avance (a) y se
desensamblan en el polo posterior (p), facilitando la translocación de la célula.
Burdiso et al JCS 2013; Pankov et al JCB 2005
0 min 5 min 10 min 15 minp
a aaa
p
Mutaciones en integrinas que afectan la activación
de GTPasas alteran los patrones de migración.WT mut
trayectorias al azar direccionadas
Rho, Rac, Cdc42
citoesqueleto
Un nivel de adhesión intermedio es óptimo para la migración
Holly et al., Exp. Cell Res. 2000
La fuerza de la adhesión de las células al substrato depende del tipo celular y del tipo
de substrato. En general la respuesta migratoria de las células a la adhesión es
bifásica, mostrando un óptimo a niveles de adhesión intermedios.
Nivel de adhesión
La interacción de las integrinas epiteliales con la membrana basal es requerida para la polarización y diferenciación de los epitelios
Estructura de un acino de glándula mamaria
polarización normal
O’Brien et al, NCB 2001; Bissell et al, COCB 2003
La inhibición del ensamble de
la lamina basal produce una
polarización invertida (rojo)
En rojo se muestra un marcador del dominio apical
lámina
basal
lamina
basal
lumen
actina
La estimulación de las integrinas promueve la supervivencia celular mediante la inhibición de la apoptosis
APAF 1: Apoptotic Protease Activating Factor 1
integrina
ECM
FAK
Ausencia de estimulación apoptosis estimulación apoptosis
integrina activa
La mayoría de las células dependen del anclaje a la matriz extracelular para su crecimiento, proliferación y supervivencia
El incremento del área celular generado
por contactos entre la célula y el substrato
es un factor crítico que promueve el
crecimiento, supervivencia y la proliferación.
= área total
de fibronectina
Growth
fibronectina
Chen et al., Science 1997
integrinas
caderinas
sobrevivencia,
crecimiento y
proliferación
diferenciación apoptosis
. ..... . ..... . ..... . .....
La estimulación de integrinas activan vías de
señalización que promueven el crecimiento,
la proliferación y la supervivencia de las células.
extendidaextendida
sobrevivencia
y crecimiento
Las células epiteliales requieren del contacto con la
matriz para su diferenciación. Durante la involución
de la glándula mamaria y de la próstata, la lámina
basal se degrada y las células mueren por apoptosis.
matriz extracelular
Erk
Ras
caveolina
ciclo celular
Rho
cki
Raf/MEK
ciclina D
PI-3k
Akt
caspasa 9
Bad
apoptosis
Rac
JNK
p53
Red de vías de señalización activadas por adhesión
CDK
motility
p130Cas/
paxilina
ShcGrb2
FAK/Src
integrinasmembrana
- adaptadores
- Tyr quinasas
- GTPasas
- Ser/Thr quinasas
CAMs (Cell Adhesion Molecules)
Alberts et al MBC 2002
Se caracterizan por poseer repeticiones de motivos homólogos a los encontrados en inmunoglobulinas (Ig-
like) en la porción extracelular. Otros módulos frecuentes en los dominios extracelulares son los FN-III,
homólogos a los encontrados en fibronectina. Median interacciones homofílicas (ej. NCAM) o heterofílicas
(ej. ICAM y VCAM) independiente de calcio.
Ig-like domain
N-terminus
C-terminus
N-terminus
C-terminus
FN-III domain
PECAM-1 media interacciones
homofílicas en células
endoteliales y leucocitos
La N-CAM y otras CAMs relacionadas cumplen funciones importantes en las interacciones intercelulares durante el desarrollo
Durante la formación del sistema nervioso los axones neuronales se adhieren mediante
NCAM y L1 y forman fascículos que recorren distancias considerables juntos.
Las N-CAMs fueron las
primeras CAMs caracterizadas.
Existen ~ 20 isoformas de N-
CAM generadas por corte y
empalme de un mRNA comun.
Fascículos de axones de neuronas
ganglionares de la retina. Los fascículos
axonales convergen en el sitio de salida
del nervio óptico (asterisco rojo).
*
Villegas-Perez et al., J. Neurosci 1988PSA: Poly Sialic Acid
El agregado de ácido polisiálico (PSA)
en NCAM inhibe su función adhesiva y
produce defasciculación de los axones.
N-CAM con
repeticiones de
ácido siálico (PSA)
n repeticiones
(A) Las ICAMs y VCAMs se expresan en el endotelio e interaccionan con integrinas (Lβ2) de linfocitos T activados durante
procesos inflamatorios. La interacción entre integrinas y CAMs acercan las membranas adheridas favoreciendo la transmisión
de señales intercelulares (ej. quimioquinas) y eventualmente la diapédesis. (B) Las ICAMs expresadas en células dendríticas
se unen a integrinas en las membranas de linfocitos T y promueven la sinapsis inmunológica.
A
ICAM y VCAM cumplen funciones importantes en la interacción de células del sistema inmune y el endotelio
B
LFA-1: Leukocyte Function Antigen = integrin L/β2
Sinapsis inmunológica
Mecanismos dependientes e independientes de citoquinas secretadas
por las células endoteliales, activan integrinas de los linfocitos y
establecen una unión fuerte entre las células y el endotelio.
Constantin et al Nature Immunol 2012
signaling &
activation
of talin
signaling &
activation
of talin
Lβ2
Las selectinas poseen un dominio de lectina en el extremo distal de la región
extracelular, que reconoce de manera específica y dependiente de calcio a
oligo/polisacáridos en glicolípidos y glicoproteínas (ej. PSGL-1). El dominio
intracelular se asocia al citoesqueleto de actina. Las selectinas median
adhesiones de baja afinidad entre leucocitos y las células endoteliales.
PSGL-1 (P-Selectin Glycoprotein Ligand-1)
Marth & Grewal, Nature Rev Immunol 2008; MBC Alberts et al 2015; Tinoco et al Trends Immunol 2017
Alineamiento de
ectodominios de
selectinas E y P
Ca2+
extracelular
intracelular
Las E- y P-selectinas expresadas en la
superficie de las células endoteliales
activadas detienen el flujo de los leucocitos.
PSGL-1
sLex: tetrasacárido
reconocido por las
selectinas
Las Selectinas interaccionan con carbohidratos presentes en proteínas y lípidos
Función coordinada de selectinas, integrinas, CAMs y caderinas durante la extravasación de leucocitos
Estímulos inflamatorios (ej. TNFα) inducen la expresión de selectinas en la superficie endotelial que se unen a glicanos
(PSGL1) en la membrana de leucocitos y detienen el flujo (“rolling”). La adhesión leucocito-endotelio permite la señalización
mediada por quimioquinas liberadas por las células endoteliales. Los receptores de quimioquinas en los leucocitos activan
las integrinas (“activation”). Las integrinas y CAMs (ICAM, VCAM) promueven una adhesión fuerte y la protrusión de los
leucocitos. La inactivación de VE-caderinas y PECAM (Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule) facilitan el pasaje trans-
endotelial de los leucocitos.
Ley et al Nature Rev Immunol2007
VE-cadherin, JAMs
ICAM, PECAMintegrins, ICAMselectins,
PSGL1
integrin activation,
VCAM
La señalización de diferentes complejos de adhesión es integrada en el citoplasma
integrinasRTKs
factores de
crecimientomatriz
extracelular
E-caderinas
b-catenina
Frizzled
Wnt
Erk
ciclo celular
proliferación
cki
ciclina D
núcleo
uniones estrechas
Zona B
ZO-1
Las uniones estrechas
secuestran activadores
transcripcionales y CDKs.
Las caderinas inhiben
activadores transcripcionales
y la actividad de CDKs.
Cdk4
estabilización
en citoplasma
retención
en
adhesiones
retención en adhesiones
activación
síntesis
fosforilación,
inactivación
Las integrinas y receptores de
factores de crecimiento
promueven la actividad de CDKs.
FAK
CDKs
degradación
en proteosomas
Lef/Tcf
YAP/TAZ
vías inhibitorias
vías activadoras
