ANEXO: Fundamentos Biológicos I

ANEXO: Fundamentos Biológicos

Se desarrollará en este apartado unas nociones de biológica molecular básica necesarias para la comprensión del funcionamiento de las construcciones que se detallarán más adelante.

Comenzaré por incluir unas definiciones de los entes partícipes y las relaciones que se crean entre ellos. Tras esto, haremos un estudio de las cinéticas de las reacciones intervinientes.

Este anexo pretende servir de base para aquellos cuyas nociones de la biología molecular no son suficientes, y están extraídos del libro Biología, de Curtis [12].

II ANEXO: Fundamentos Biológicos

ANEXO: Fundamentos Biológicos III

Contenido del Anexo:

1. Definiciones de Entes Biológicos ............................................................................... V

2. La expresión genética ............................................................................................. VIII

Dogma Central de la Biología Molecular ................................................................ VIII

3. La regulación de la expresión genética ..................................................................... X

Operón ....................................................................................................................... X

Fago Lambda.............................................................................................................. X

4. Otras reacciones biológicas ...................................................................................... XI

Proteólisis ................................................................................................................. XI

ARN Antisentido ....................................................................................................... XI

5. Cinéticas Enzimáticas ............................................................................................. XIII

Michaelis-Menten .................................................................................................. XIII

Inhibición enzimática ............................................................................................... XV

Cinéticas no Michaelianas ..................................................................................... XVII

IV ANEXO: Fundamentos Biológicos

ANEXO: Fundamentos Biológicos V

1. Definiciones de Entes Biológicos

Proteína

Compuesto orgánico complejo constituido por una o más cadenas polipeptídicas, cada una formada por muchos (100 o más) aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.

Enzima

Molécula de proteína globular que acelera una reacción química específica. Son proteínas con la capacidad de manipular a otras moléculas.

Proteasa

Son enzimas que pueden romper los enlaces de las cadenas de polipéptidos. Sirven para controlar el nivel de proteínas no deseadas. El proceso por el que estas enzimas realizan la digestión de las proteínas, se conoce como Proteolisis.

ADN (Ácido Desoxirribonucleico)

El portador de la información genética en las células, compuesto por dos cadenas complementarias de nucleótidos enrolladas en una doble hélice, capaz de autorreplicarse y de dirigir la síntesis de RNA.

ARN (Ácido Ribonucleico)

Clase de ácidos nucleicos caracterizada por la presencia del azúcar ribosa y la pirimidina uracilo; incluye ARNm, ARNt y ARNr. El ARN es el material genético de muchos virus.

ARN Mensajero (ARNm)

Un tipo de moléculas de ARN, cada una de las cuales es complementaria de una hebra de ARN. Lleva la información genética del cromosoma a los ribosomas, donde se traduce a proteína.

ARN de Transferencia (ARNt)

Clase de ARN pequeños con dos sitios funcionales; uno reconoce un aminoácido específico activado; el otro lleva el triplete de nucleótidos (anticodón) para ese aminoácido. Cada tipo de ARNt acepta un aminoácido activado específico y lo transfiere a una cadena polipeptídica naciente, según lo especifica la secuencia de nucleótidos del ARNm que está siendo traducido.

VI ANEXO: Fundamentos Biológicos

ARN Ribosómico (ARNr)

Tipo de molécula de ARN que se encuentra junto con proteínas características en los ribosomas; se transcribe a partir del ADN de los bucles de cromatina que forman el nucléolo.

ARN Antisentido (ARNas)

Un ARNm antisentido es complementario a un ARNm endógeno. Su función es la de bloquear la expresión de un gen, ya que se adhiere al ARNm y no permite que este pueda ser traducido.

Ribosoma

Organela pequeña compuesta por proteína y ácido ribonucleico; sitio de traducción en la síntesis de proteínas; en las células eucarióticas, unido frecuentemente al retículo endoplásmico.

Gen

Molécula de DNA que desempeña una función específica, tal como codificar una molécula de RNA o un polipéptido.

Cromosoma

La estructura que lleva los genes. Los cromosomas eucarióticos son filamentos o bastones de cromatina que aparecen contraídos durante la mitosis y la meiosis y que en otros momentos están contenidos en un núcleo. Los cromosomas procarióticos consisten en un círculo de ADN con el que se asocian varias proteínas.

Operón

Unidad de expresión y regulación de genes bacterianos. En el cromosoma bacteriano, un segmento de ADN que consiste en un promotor, un operador y un grupo de genes estructurales adyacentes que codifican para proteínas involucradas en una vía metabólica. Los genes estructurales se transcriben en una sola molécula de ARNm y su transcripción es regulada por una proteína represora.

ANEXO: Fundamentos Biológicos VII

Promotor

Segmento específico de ADN al cual se une la ARN polimerasa para iniciar la transcripción del ARNm desde un operón.

Represor

En genética, una proteína que se une al operador impidiendo que la ARN polimerasa se una al promotor y transcriba los genes estructurales del operón; lo codifica un gen conocido como regulador.

Plásmido

En los procariotas, una molécula de ADN circular, pequeña, extracromosómica, de replicación independiente.

Procariota

Célula que carece de núcleo y orgánelas limitadas por membrana.

Bacteria Escherichia Coli (E. Coli)

Organismo procariota, sin núcleo celular definido, perteneciente al género de las enterobacterias. Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore von Escherich, y es probablemente el organismo más estudiado.

VIII ANEXO: Fundamentos Biológicos

2. La expresión genética

La expresión genética y su regulación es la idea en la que se basa nuestro dispositivo y por tanto será preciso definirla y profundizar en los agentes que intervienen además de los mecanismos que nos hará posible controlarla y modificarla.

Dogma Central de la Biología Molecular

Se describe mediante un proceso de dos etapas, transcripción y traducción. De esta manera es como se transforma el código genético en la proteína que recoge.

La información que almacena una cadena de ADN se divide en genes. Un gen codificador de proteínas consiste en un promotor (secuencia de pares de bases

que especifica donde debe comenzar la transcripción), seguido de la secuencia de codificación de la proteína (secuencia codificante de la proteína) y de un terminador (secuencia que especifica el final de la transcripción).

Fig. Esquema de la estructura de un gen

La Transcripción es la síntesis de una copia de ARN a partir de un segmento de ADN. El ARN se sintetiza mediante la enzima ARN polimerasa. Cuando la enzima encuentra un promotor, recorre la cadena del gen, a medida que crea una cola tras de si con el código ya transcrito. A la molécula de ARN que se crea tras esta etapa se llama ARN mensajero (ARNm). Finalmente, la molécula formada se separa del ADN al encontrarse un una secuencia terminadora

La Traducción es la síntesis de la cadena de polipéptidos (proteína) especificado en el ARNm. Cuando el ARN mensajero encuentra un ribosoma, éste lo recorre y sitúa los polipéptidos necesarios de acuerdo a la secuencia que lee. Finalmente, se separan el ARNm y el ribosoma tras crearse la proteína correspondiente.

ANEXO: Fundamentos Biológicos IX

Hay que destacar que, aunque cada molécula nombrada tiene una vida, tras la traducción, la molécula de ARNm está de nuevo disponible para realizar una nueva copia si, eventualmente, se encontrase con un ribosoma. Al igual ocurre con el ribosoma.

X ANEXO: Fundamentos Biológicos

3. La regulación de la expresión genética

Los mecanismos naturales de los que hacemos uso para poder controlar la expresión de proteínas se basan en la represión o inhibición, e inducción.

La represión genética es el mecanismo por el que se inhibe la transcripción de un promotor y de su secuencia génica. Esto ocurre de varias maneras en la naturaleza, sin embargo, en nuestro caso, la forma de conseguir tal objetivo es obstaculizando físicamente la unión primera entre el promotor y la enzima transcriptora.

La inducción por tanto, se refiere al mecanismo contrario. Un agente, normalmente una enzima, elimina la barrera posible entre el promotor y la ARN polimerasa. Mientras la represión inhibe la transcripción, es la inducción a través de un inductor, la que la reactiva.

El tipo de regulación natural que dará lugar a nuestro esquema es el de Operón.

Operón

Los genes estructurales del operón codifican un grupo de proteínas funcionalmente relacionadas. La transcripción es controlada por secuencias en el promotor y en el operador, adyacentes a los genes estructurales y capaces de unir proteínas específicas. El promotor contiene una posición de unión para la ARN polimerasa. El operador es el sitio de unión para un represor, proteína codificada por otro gen, el regulador. Cuando el represor se une a la molécula de ADN en el sitio operador, la ARN polimerasa no puede iniciar la transcripción del ARNm. Cuando el represor no está presente, la ARN polimerasa puede unirse y comenzar su movimiento a lo largo del cromosoma, permitiendo que ocurra la transcripción y la síntesis de proteínas.

El Operón Lac Será el operón específico con el que trabajamos. Fue el primer operón en ser estudiado y comprendido. En la bacteria Escherichia Coli es requerido para el transporte y metabolismo de la lactosa.

Fago Lambda

Los fagos son virus que afectan únicamente a las bacterias. En nuestro caso, usamos un mecanismo del fago lambda, ya que éste virus afecta la bacteria Escherichia Coli, y produce una proteína represora llamada cI. Se conoce como proteína lambda dado su origen. el represor actúa como inhibidor de la transcripción insertándose en un sitio específico del genoma.

ANEXO: Fundamentos Biológicos XI

4. Otras reacciones biológicas

Durante el desarrollo del documento, aparecen otros procesos biológicos que no pertenecen propiamente a la regulación genética. Estas son las siguientes.

Proteólisis

Los procesos por proteólisis contemplan las degradaciones de proteínas mediante enzimas específicas llamadas proteasas. La digestión intracelular, se produce cuando una proteasa se encuentra con la proteína.

ARN Antisentido

Una hebra complementaria de un ARNm permite la inhibición de la molécula de ARNm a la que es análoga. El ARN antisentido se “aparea” con su ARNm complementario formando una molécula de doble hebra que puede no traducirse y termina degradándose enzimáticamente.

Para comprender mejor el efecto de un ARN antisentido, incluyo una breve explicación:

El ADN está compuesto de una serie de módulos, llamadas bases. Hay 4 tipos de bases nitrogenadas: adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T), que se colocarán una tras otras en una determinada disposición. Una cadena de ADN se asocia con otra cadena de ADN complementaria formando uniones entre parejas de bases. Las uniones posibles son: Citosina-Guanina y Adenina-Timina y viceversa, Guanina-Citosina y Timina-Adenina. De esta manera se forman las cadenas de doble hélice (una por cada cadena de ADN) de pares de bases (uniones C↔G, A↔T).

Cuando ocurre la transcripción, la doble hélice se “abre” habilitando la lectura de una de las cadenas de ADN. A medida que la ARN polimerasa comienza a leer la cadena, va creando una cola con la misma cadena transcrita. Al terminar, el segmento formado se llama ARN mensajero. La terminología usada (transcripción, ARN mensajero) hace referencia lo siguiente. Una cadena de ARN no tiene las mismas bases o nucleótidos que el ADN, sino que usa en vez de la Timina (T) el Uracilo (U). Cuando la ARNp crea su cola, las ribonucleótidos son los complementarios uno a uno, es decir, C↔G, A↔U

XII ANEXO: Fundamentos Biológicos

Si una cadena de ADN fuese algo así

La cadena de ARN mensajero será

Entendido esto, un ARN antisentido es precisamente el complementario de la cadena de ARN. Fíjese que es igual que la cadena de ADN primera excepto porque aparece el U de uracilo en vez de la T de timina.

Así, se consigue que la cadena de ARN mensajera no pueda ser leída ni traducida.

A-C-G-T-C-A-A-C-C-T-T

U-G-C-A-G-U-U-G-G-A-A

U-G-C-A-G-U-U-G-G-A-A

A-C-G-U-C-A-A-C-C-U-U

ANEXO: Fundamentos Biológicos XIII

5. Cinéticas Enzimáticas

Michaelis-Menten

Estas cinéticas fueron estudiadas por Leonor Michaelis y Maude Menten, que crearon modelos que ajustaban la velocidad de acción de estos procesos.

Lejos de querer hacer un estudio de la cinética enzimática, expondré brevemente el mecanismo que reproducen las reacciones inherentes en nuestro sistema.

Las enzimas catalizan las reacciones para las que se existen específicamente. Para que pueda operar necesita de un sustrato, con el que se una, para generar productos. Una vez se completa, la enzima queda liberada para servir de catalizador a otros sustratos.

Haciendo un símil con un proceso ingenieril, las enzimas actúan como agentes nucleantes al igual que lo hacen las impurezas o paredes del recipiente durante la solidificación de materiales fundidos. Ofrecen un sitio donde la energía necesaria para continuar esa etapa es menor.

La cinética de Michaelis-Menten proporciona el siguiente planteamiento.

𝐸 + 𝑆𝑘1⇌𝑘−1

𝐸𝑆𝑘2→ 𝐸 + 𝑃

Esta ecuación no contempla la reversión del paso del complejo a producto. Esta suposición no es crítica y simplifica mucho la formulación del producto:

𝑑[𝐸𝑆]𝑑𝑡

= 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝐸𝑆 − 𝑟𝑜𝑡𝑢𝑟𝑎 − 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜

𝑑[𝐸𝑆]𝑑𝑡

= (𝑘1 · ([𝐸𝑡] − [𝐸𝑆]) · [𝑆]) − 𝑘−1[𝐸𝑆] − 𝑘2[𝐸𝑆]

Asumiendo régimen permanente,

𝑑[𝐸𝑆]𝑑𝑡

= 0 → 𝑘1 · ([𝐸𝑡] − [𝐸𝑆]) · [𝑆] = 𝑘−1[𝐸𝑆] + 𝑘2[𝐸𝑆]

[𝐸𝑆] =𝑘1[𝐸𝑡][𝑆]

𝑘1[𝑆] + 𝑘−1 + 𝑘2 [𝐸𝑆] =

[𝐸𝑡][𝑆][𝑆] + 𝐾𝑚

XIV ANEXO: Fundamentos Biológicos

Así podemos calcular la producción de producto como:

𝑣 =𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆]𝐾𝑚 + [𝑆] 𝐾𝑚 =

𝑘2 + 𝑘−1𝑘1

Ecuación de Michaelis-Menten, una ecuación de velocidad para reacciones enzimáticas de sustrato único. La constante de Michaelis Km se define como la concentración a la que la velocidad de reacción es la mitad de la Vmax.

𝐾𝑚= 𝑇𝑖𝑒𝑛𝑒 𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜. 𝑆𝑒 𝑒𝑣𝑎𝑙ú𝑎 𝑎 𝑙𝑎 𝑚𝑖𝑡𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥

= 𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 �𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛

𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜� .𝑉𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑎 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

0.2

0.4

0.6

0.8

1

[S]

V

Cinética de Michaelis-Menten

Km

Vmax

V

Vmax/2

ANEXO: Fundamentos Biológicos XV

Inhibición enzimática

Explicado anteriormente en los apartados de Regulación génica y Operón, es el mecanismo por el que controlamos la expresión génica o más concretamente la acción enzimática, se produce ha través de la inhibición.

Los inhibidores pueden clasificarse en 2 grupos funcionales:

- Irreversibles

- Reversibles: competitivos y no competitivos

Atendiendo a las características de la regulación génica del operón Lac, nuestro estudio debe situarse dentro de los reversibles y competitivos ya que el inhibidor se une con la enzima. Esto tiene un significado en las cinéticas de Michaelis-Menten vistas anteriormente.

Comencemos estudiando las reacciones que se producen:

En la imagen se aprecia como la unión entre enzima e inhibidor no permite al sustrato adherirse, cortando así la transformación del sustrato en producto.

Esto provoca una variación en la constante llamada de Michaelis Km.

𝑣 =𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆]

[𝑆] + 𝐾𝑚 �1 + [𝐼]𝐾𝑖�

Vemos como el término que lleva ahora adosada la constante 𝐾𝑚 es la unidad en el caso de que no haya inhibidor, y como su presencia provoca un aumento aparente del valor de la contante de Michaelis.

XVI ANEXO: Fundamentos Biológicos

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

0.2

0.4

0.6

0.8

1

[S]

V

Cinética de Michaelis-Menten con Inhibición

Vmax

Michaelis-Menten con Inhibición

Michaelis-Menten sin Inhibición

ANEXO: Fundamentos Biológicos XVII

Cinéticas no Michaelianas

Se le da este nombre a un tipo de reacciones enzimáticas que dan lugar a unas curvas con trazado sigmoideo, provocado por el concepto de cooperatividad y alosterismo. Los primeros estudios que se realizaron de las proteínas cooperativas los realizo Hill en 1910. La idea que subyace tras la cooperatividad es la unión de varias enzimas para realizar la inhibición e implica una ralentización del proceso.

De nuevo sucede lo mismo que en el apartado anterior, se modifica la constante de Michaelis. Sin embargo, Hill plantea un nuevo modelo muy parecido al de las cinéticas enzimáticas comunes.

La reacción de unión:

𝐸 + 𝑆1 → 𝐶1 + 𝑆2 → ⋯ → 𝐸 + 𝑃 𝐸 + 𝑛𝑆 → 𝐸𝑆𝑛 → 𝐸 + 𝑃

Sea la reacción de cooperatividad, donde la cinética por ella expresada es:

𝑣 =𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆]𝑛

𝐾𝐻 + [𝑆]𝑛

El trazado de esta curva es la siguiente:

En la imagen se puede observar la variación respecto a la cinética de Michaelis-Menten. Además podemos identificar dos estados diferentes:

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

0.2

0.4

0.6

0.8

1

[S]

V

Cinética enzimática cooperativa

Michaelis-Menten

Cooperatividad Negativa

Cooperatividad Positiva

XVIII ANEXO: Fundamentos Biológicos

Cooperatividad positiva: la unión al sustrato es más fácil medida que se acerca la enzima a la saturación. La evolución de este comportamiento es sigmoidal

Cooperatividad negativa: la unión al sustrato es más difícil a medida que la enzima satura. La evolución es hiperbólica.