Angioarquitetura de Carcinoma de Células Escamosas

5/26/2018 Angioarquitetura de Carcinoma de C lulas Escamosas

LAURA BEATRIZ OLIVEIRA DE OLIVEIRA

ANGIOARQUITETURA DE CARCINOMA DE CLULAS ESCAMOSAS,

QUIMICAMENTE INDUZIDO EM BOLSA JUGAL DE HAMSTER: ANLISE

EM MICROSCOPIA DE LUZ E MICROSCOPIA ELETRNICA DE

VARREDURA DE RPLICAS VASCULARES

Tese apresentada como requisito parcial

obteno do ttulo de Doutor emBiologia Celular e Molecular, daPontifcia Universidade Catlica do RioGrande do Sul.

Data de aprovao em 20 de janeiro de 2009

BANCA EXAMINADORA:

Prof. Dr.Jos Antnio Poli de Figueiredo..................................................................

Prof. Dr. Leo Kraether Neto..............................................................................

Prof. Dr. Manoel SantAna Filho..............................................................................

Prof. Dr. Mnica Ryff M. Roca Vianna

..............................................................................

Porto Alegre2009


SUMRIO

CAPTULO 1 .......................................................................................................... 18

1 INTRODUO ................................................................................................... 19

1.1 VASCULOGNESE VERSUS ANGIOGNESE ............................................. 20

1.2 REGULAO DA ANGIOGNESE ................................................................ 21

1.3PROMOTORES ENDGENOS DA ANGIOGNESE ..................................... 21

1.4 INIBIDORES ENDGENOS DA ANGIOGNESE .......................................... 24

1.5 ANGIOGNESE NO TUMOR ......................................................................... 25

1.6 MODELO ANIMAL .......................................................................................... 27

1.7 AGENTES CARCINOGNICOS ................................................................................................ 29

1.7.1 DMBA, 9,10 dimetil benzatraceno (9, 10 dimethyl-1, 2-benzathracene) .......................... 29

1.7.2 Perxido de Carbamida ............................................................................. 30

1.8 TCNICA DE MODELO DE CORROSO VASCULAR .................................. 32

1.9 HIPTESE ...................................................................................................... 34

2 OBJETIVOS ....................................................................................................... 34

2.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 34

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ........................................................................... 34

CAPTULO 2 - HAMSTER SRIO DOURADO (MESOCRICETUS AURATUS) UM

MODELO PARA ESTUDO DE CARCINOMA DE CLULAS ESCAMOSAS ........ 35

1 INTRODUO ................................................................................................... 38

1.1 CNCER BUCAL ............................................................................................ 38

1.2 MODELO ANIMAL .......................................................................................... 38

2 OBJETIVO .................................................................................................................................... 43

3 MATERIAIS E MTODO .................................................................................... 43

3.1 ANIMAIS .......................................................................................................... 43

3.2 ENRIQUECIMENTO AMBIENTAL ................................................................... 44

3.3 PREPARO DOS AGENTES QUMICOS .......................................................... 44

3.4 APLICAO .................................................................................................... 45

3.5 EUTANSIA E ANLISE DOS ESPCIMES ................................................... 45

4 RESULTADOS ................................................................................................... 465 DISCUSSO ...................................................................................................... 47


REFERNCIAS ...................................................................................................... 53


CAPTULO 3 - BOLSA JUGAL DE HAMSTER SRIO DOURADO

(MESOCRICETUS AURATUS): ESTUDO COM MODELO DE CORROSO E

MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA ASSOCIADA MICROSCOPIA

DE LUZ .................................................................................................................. 58

1 INTRODUO ................................................................................................... 60

1.1 ANATOMIA E ARRANJO VASCULAR DA BOLSA JUGAL E DO MSCULO

RETRATOR ........................................................................................................... 61

2 OBJETIVOS DO TRABALHO ........................................................................... 65

3 MATERIAIS E MTODO .................................................................................... 65

3.1 PERFUSO COM RESINA ACRLICA ............................................................ 653.2 CORROSO VASCULAR ............................................................................... 66

3.3 ANLISE DAS RPLICAS MICROVASCULARES ......................................... 67

3.4 MICROSCOPIA DE LUZ ................................................................................. 68

4 RESULTADOS ................................................................................................... 68

4.1 MICROSCOPIA DE LUZ ................................................................................. 68

4.2 TNICA MUCOSA .......................................................................................... 69

4.3 TNICA MUSCULAR ...................................................................................... 704.4 TNICA ADVENTCIA ..................................................................................... 71

4.5 TECIDO CONJUNTIVO / VASOS SANGNEOS .......................................... 71

4.6 MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA .......................................... 72

4.6.1 Vasos arteriais ............................................................................................ 72

4.6.2 Vasos venosos ........................................................................................... 72

4.6.3 Capilares ..................................................................................................... 73

5 DISCUSSO ...................................................................................................... 75REFERNCIAS ...................................................................................................... 79

CAPTULO 4 - ARTIGO (submetido ao peridicoOral Oncology) ................... 83

REFERNCIAS ................................................................................................................................. 98

5 CONSIDERAES FINAIS ............................................................................... 101

5.1 HISTOLOGIA ................................................................................................... 101

5.2 INDUO QUMICA DE CARCINOMA DE CLULAS ESCAMOSAS MODELO

ANIMAL .................................................................................................................. 1035.3 ENRIQUECIMENTO AMBIENTAL ................................................................... 103

5.4 CARCINOMA DE CLULAS ESCAMOSAS BEM DIFERENCIADO ................ 103


5.5 TCNICA DE CORROSO VASCULAR ASSOCIADA MICROSCOPIA

ELETRNICA DE VARREDURA ........................................................................... 104

5.6 MICROSCOPIA DE LUZ E MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA

............................................................................................................................... 105

REFERNCIAS ..................................................................................................... 106

ANEXOS ............................................................................................................... 117

Anexo A - A oncologia de cabea e pescoo da Grcia Antiga ao Sculo XX quando

a avaliao histolgica de tumores se tornou um padro prtico ........................... 118

REFERNCIAS ...................................................................................................... 121Anexo B - O animal experimental - hamster srio dourado com bolsa jugal

evidenciada ............................................................................................................ 123Anexo C - 2ndInternational Workshop on advances in vascular casting ................ 127

Anexo D Ofcio 055/08-CEUA ............................................................................. 134


RESUMO

O cncer da cavidade bucal e o cncer orofarngeo representam o 6 tipomais comum de cncer no mundo, sendo que 90% desses tumores bucais so dotipo carcinoma de clulas escamosas. Para que ocorra o estabelecimento, aexpanso e a metastatizao de neoplasias fundamental que tumores estimulem aproduo de sua prpria rede vascular, processo conhecido como angiognesetumoral. Assim, o resultado uma nova rede de vasos adequada ao crescimento e aviabilizao de metstases. Os vasos do tumor so considerados como imaturos ediferem dos vasos normais, apresentando formas tortuosas, irregulares, revestidospor clulas endoteliais amplamente fenestradas e muitas vezes com ausncia demembrana basal. Os objetivos deste trabalho foram: definir um protocolo paraestudo da angioarquitetura em rplicas vasculares de tumores quimicamenteinduzidos na bolsa jugal de hamster srio dourado Mesocricetus auratus, descrever ahistologia do rgo normal por microscopia de luz (ML) e a angioarquitetura por

microscopia eletrnica de varredura (MEV), analisar qualitativamente a rede vascularneoformada em bolsas jugais de hamster srios aps induo qumica de tumor emtrs tempos diferentes. 24 hamsters srios machos e com cinco semanas de vida,divididos em trs grupos de oito animais cada, tiveram suas bolsas jugais direitastratadas trs vezes por semana com dimetilbenzantraceno (DMBA) e duas vezes porsemana com perxido de carbamida por 55, 70 e 90 dias, respectivamente cadagrupo. A bolsa esquerda foi isenta de tratamento e considerada como controle.Posteriormente induo do tumor, cinco animais de cada grupo tiveram suas redesvasculares moldadas pela resina Mercoxe analisadas em microscopia eletrnicade varredura (MEV). Os trs animais restantes de cada grupo tiveram suas bolsaspreparadas para anlise em microscopia de luz (ML). Aps 55 dias de induo

tumoral, todos os espcimes analisados por ML j apresentavam carcinoma declulas escamosas na bolsa jugal tratada e este resultado se consolidou aos 70 e 90dias de tratamento. O menor tempo necessrio para a induo tumoral comparado aestudos anteriores e o sucesso na produo do tumor em todos os animaissubmetidos ao tratamento foi correlacionado a ao do perxido de carbamida e aoenriquecimento ambiental empregado durante o experimento. Foi possvel concluirque o protocolo desenvolvido pode ser til anlise da angioarquitetura dos tumoresem bolsas jugais de hamster srio. A tcnica de MEV possibilitou diferenciar vasosarteriais de venosos, como tambm replicar estruturas como esfncteres,bifurcaes, anastomoses e sugestionar a presena de sproutings. No estudo dabolsa jugal normal com ML foram evidenciadas trs tnicas: a tnica mucosa, atnica muscular e a tnica adventcia. Quando analisadas por MEV, as replicasvasculares das bolsas controle apresentavam sua rede vascular composta por vasosparalelos ao seu maior eixo, conforme a fisiologia do rgo. Nas bolsas submetidas induo tumoral observou-se a formao de uma nova rede vascular, com apresena de vasos tortuosos e paralelos. Durante a progresso do tumor houveperda do paralelismo vascular e um aumento do calibre dos vasos. Estururas deangiognese tambm foram observadas.

Palavras-chave:hamster srio, bolsa jugal, DMBA, perxido de carbamida,angioarquitetura, microscopia de luz, microscopia eletrnica de varredura, carcinoma

de clulas escamosas.


1 INTRODUO

Todas as clulas dependem de oxignio e nutrientes para a sua

sobrevivncia. Essa necessidade implica em que as clulas se encontrem prximas

a capilares sangneos, a uma distncia que permita a difuso de oxignio (DANIEL;

ABRAHAMON, 2000).

A rede vascular basal insuficiente em situaes de aumento de

consumo de oxignio e nutrientes, como por exemplo, no crescimento e na

regenerao tecidual. Para ultrapassar o dficit nestas situaes, a vasodilatao,

muitas vezes, no suficiente, sendo necessria a formao de novos vasos

sangneos. O processo de formao de novos vasos a partir dos pr-existentes

denomina-se, genericamente, angiognese (BECK JR.; DAMORE, 1997; DANIEL;

ABRAHAMON, 2000).

Sob circunstncias fisiolgicas controladas, a angiognese um processo

normal e essencial. Entretanto, durante o processo de estabelecimento e

propagao do cncer, a angiognese permite que o tumor produza sua prpria

fonte de provimento sangneo para obter os nutrientes e o oxignio. Assim, o

resultado uma rede de vasos adequada ao crescimento e a viabilizao demetstases (FOLKMAN, 1998).

Fisiologicamente, este processo est presente no desenvolvimento

embrionrio e no crescimento ao longo dos primeiros anos. Na idade adulta,

observa-se no aparelho reprodutor feminino a cada ciclo menstrual, na gravidez, na

cicatrizao de feridas e na seqncia de processos inflamatrios (POLVERINI,

2002; JAFFE, 2000).

Clulas endoteliais, que normalmente permanecem quiescentes, comturnover entre os 1000 e 5000 dias, em determinadas circunstncias, emergem para

estados de rpida proliferao, viabilizando a formao de novos vasos (DANIEL;

ABRAHAMON, 2000; BECK JR.; DAMORE, 1997).

Portanto, nas situaes em que h aumento das necessidades de

oxignio e nutrientes, existe uma resposta fisiolgica do organismo que aumenta a

densidade da rede capilar. Essa resposta minuciosamente regulada e tem uma

durao limitada (POLVERINI, 2002; ZAKRZEWICZ; SECOMB; PRIES, 2002).H, porm, inmeras situaes patolgicas em que o processo persiste

descontroladamente durante meses ou anos. O exemplo mais conhecido o do


tumor, em que a angiognese fundamental, para sustentar o crescimento tumoral e

assim permitir a metastatizao (POLVERINI, 2002).

Outros exemplos de desregulao da angiognese so citados, tais como

as doenas inflamatrias intestinais, as doenas de neovascularizao ocular, a

destruio de cartilagens na artrite reumatide, o desenvolvimento de placa

aterosclertica, os hemangiomas infantis, a endometriose, a obesidade, entre outras

(POLVERINI, 2002; GIBALDI, 1998; CARMELIET, 2005).

Ocorrem tambm mltiplas situaes de processos isqumicos, onde

til a formao de novos vasos que possam suprir o dficit de oxignio. Porm,

muitas vezes, a proliferao vascular no suficiente perante as necessidades,

como no caso da doena arterial perifrica, na coronariopatia, em patologiasneurodegenerativas e em fraturas sseas (POLVERINI, 2002; GIBALDI, 1998;

CARMELIET, 2003).

1.1 VASCULOGNESE VERSUS ANGIOGNESE

A vasculognese o processo iniciado precocemente na vida

embrionria, que origina os vasos de grande calibre, a partir de precursores

mesodrmicos, os angioblastos (RISAU; FLAMME, 1995). A vasculognese pode

desempenhar um papel fundamental na organognese (MATSUMOTO et al., 2001).

O termo angiognese muitas vezes empregado no seu sentido mais

lato, como o mecanismo de proliferao de clulas endoteliais e musculares lisas

para formar novos vasos sangneos. Em 1787, Hunter foi o pioneiro a usar o termo

angiognese (crescimento de novos vasos sangneos) para descrever o

crescimento de vasos sangneos semelhantes a galhos de rvore.Aps a formao dos grandes troncos vasculares, os vasos ramificam-se

e distribuem-se numa rede vascular complexa (CARMELIET, 2000). Os vasos

neoformados surgem a partir de vasos preexistentes e este processo mantm-se

durante toda a vida do indivduo, respondendo sempre que necessrio a alteraes

na demanda de oxigenao tecidual (SCOTT, 2000).

Podem ser descritos dois mecanismos distintos de angiognese: a

angiognsese por brotamento (RISAU, 1997) e a angiognse por intussuscepo(CADUFF et al., 1986).


A angiognese por brotamento consiste na proliferao das clulas

endoteliais e o subseqente aumento do calibre do vaso, a que se segue a migrao

de clulas para o lmen, subdividindo-se o vaso inicial em vrios vasos de menor

calibre (RISAU, 1997).

Outro mecanismo de angiognese a intussuscepo, e refere-se ao

processo pelo qual um nico capilar se divide longitudinalmente em dois pela

formao de um septo. Neste caso, as clulas endoteliais de lados opostos do vaso

se estendem intraluminalmente at entrarem em contato formando um septo,

levando ao surgimento de dois vasos (CADUFF et al., 1986). Ela ocorre quando o

sistema capilar se expande dentro dele mesmo como, por exemplo, no crescimento

do tipo intersticial no tecido cartilaginoso (CADUFF et. al., 1986).

1.2 REGULAO DA ANGIOGNESE

To importante quanto a proliferao vascular quando h aumento das

necessidades de oxignio e nutrientes, a involuo deste processo, que ocorre

aps a resoluo dessa demanda adicional, com a regresso dos vasos

neoformados (SEMENZA, 2002). Desta forma, evitado que haja um aporte

excessivo de oxignio que, alm de desnecessrio, poderia conduzir a estresse

oxidativo e formao de radicais livres de oxignio, nefastos para os tecidos

(SEMENZA, 2002).

Nesse contexto inconstante, o mecanismo angiognico parece atuar como

uma balana, em que, de um lado esto os ativadores, e do outro, os inibidores.

do resultado deste balano que sobrevm um maior ou menor estmulo para a

proliferao vascular. Em muitas patologias h desregulao desse balano, o quejustifica a identificao de uma resposta em cascata visando ao restabelecimento da

homeostasia (BERGERS; BENJAMIN, 2003).

1.3 PROMOTORES ENDGENOS DA ANGIOGNESE

Citam-se como promotores endgenos da angiognese o fator de

crescimento fibroblstico (Fibroblastic growth factors -FGF); o fator de crescimento

vascular endotelial (Vascular endothelial growth factors -VEGF); o fator de


crescimento da clula endotelial derivado de plaqueta (Platelet-derived endothelial

cell growth factor- PD-ECGF), os fatores de crescimento derivados de plaquetas,

como as prostraglandinas, angiotensina e a heparina, e o fator de necrose tumoral

alfa (Tumor necrosis factor - TNF ) (BRAT; VAN MEIR, 2001).

Devido ao harmoniosa, complementar e coordenada destas

molculas que se formam vasos funcionais (DANIEL; ABRAHAMON, 2000).

Dentre as inmeras molculas indutoras da angiognese, se destaca o

VEGF (CARMELIET, 2003). Embora tendo ao predominante na estimulao da

angiognese, o VEGF forma apenas vasos imaturos, no funcionais e instveis

(McMAHON, 2000).

O VEGF foi primeiramente descrito como fator de permeabilidade vasculare se constitui em uma famlia de molculas mitognicas endoteliais, indutoras da

angiognese in vivo (FRELIN et.al., 2000).

O VEGF tem participao central na regulao da proliferao vascular,

podendo ter sua expresso induzida ou reprimida conforme a oxigenao tecidual.

Por exemplo, caso exista uma leso na pele, o organismo promove uma resposta

imunitria local e inicia o processo de cicatrizao. Esses fenmenos aumentam as

necessidades de oxignio e induzem a sntese do fator indutor de hipxia (HypoxiaInducible Factor) em resposta hipxia, que aumenta a expresso do VEGF e

estabiliza o seu RNA mensageiro (RNAm). Quando a ferida cicatrizada e existe um

excesso de aporte de oxignio, estimula a sntese do fator indutor de hiperxia

(Hyperoxia Inducible Factor), que inibe a expresso do VEGF e instabiliza seu

respectivo RNAm (SEMENZA, 2002).

Existem quatro isoformas principais do VEGF (VEGF-A), cada uma

codificada por uma poro diferente do gene VEGF. So estas suas isoformas:VEGF121, VEGF165, VEGF189, e VEGF206. Embora estas isoformas se

comportem identicamente em soluo, elas diferem na sua capacidade de ligao

heparina e matriz extracelular (RINI; SMALL, 2005).

As Angiopoietinas (Ang) so uma famlia de duas molculas (Ang1, Ang2)

que se ligam ao mesmo receptor, o TK. A Ang1 induz as clulas endoteliais a

liberarem fatores de crescimento que promovem a associao aos pericitos e s

clulas musculares lisas, incorporando-se aos vasos (JONES et al., 2001).

A Ang2, ao ligar-se ao TK, inibe a ao da Ang1, resultando uma

instabilizao vascular que leva ao afastamento dos pericitos e clulas musculares


lisas. Por ao da Ang2, obtido um tubo endotelial (estrutura tubular revestida por

clulas endoteliais que ainda no formam um vaso maduro) que, na presena de

VEGF, aumenta a angiognese e, na sua ausncia, conduz apoptose das clulas

endoteliais e regresso vascular (JONES et al., 2001).

A Efirina-B2 e a Ang1 so essenciais na maturao vascular, sabendo-se

hoje que a Efirina- B2 particularmente importante na diferenciao arterial ou

venosa dos vasos imaturos (YANCOPOULOS; KLAGSBRUN; FOLKMAN, 1998). A

Ang1 essencial para a estabilidade vascular. A interrupo desse sinal

estabilizador coincide com o reincio da angiognese, mediada por um antagonista

da Ang1, a Ang2, que uma secreo autcrina do endotlio. Esse processo ocorre

primariamente no desenvolvimento estrutural, sendo reativado na angiognese doadulto (aparelho reprodutor feminino, na cicatrizao de feridas, em tumores, entre

outros) (ELLIS et.al., 2002).

J os fatores de crescimento fibroblstico (Fibroblast Growth Factors- aFGF e

bFGF), potentes moduladores da proliferao celular, motilidade e diferenciao

no so especficos quanto a sua atuao sobre as clulas endoteliais pois atuam

tambm em fibroblastos, clulas musculares lisas e neurnios (GERWINS;

SKOLDENBERG; CLAESSON-WELSH, 2000). Desempenham um papel central nainiciao do processo angiognico (CHEN, J.; FOROUGH, R., 2006).

Os fatores aFGF1 e bFGF2, devido sua potente ao mitognica e atividade

pr-migratria, tm a capacidade de induzir alteraes metablicas e fenotpicas na

clula endotelial que so necessrias para estimular a angiognese (CHEN, J.;

FOROUGH, R., 2006).

So fatores que merecem destaque, j que so protenas angiognicas

mais potentes in vivo. Em conjunto com a Ang2, tornam-se mais especficos: a Ang2,

ao repelir as clulas musculares, potencializa a sua ao nas clulas endoteliais.

Estes fatores tem duas origens principais: a matriz extracelular, onde est

armazenado, sendo mobilizado por proteinases e heparinases e os macrfagos

ativados (GERWINS; SKOLDENBERG; CLAESSON-WELSH, 2000).

Existem nveis anormalmente elevados de bFGF no soro e urina de

indivduos com diversos tipos de tumor, e no lquido cfalo-raquidiano de doentes

com vrios tipos de tumores cerebrais (REYNOLDS; REDMER, 1998).


H ainda um fator que pela sua sntese muito especfica por parte da

placenta ao longo da gravidez, adquiriu o nome de fator de crescimento da placenta

(placental inducible growth factor- PIGF). Suas aes so semelhantes s do VEGF,

porm mais potentes, sendo importante na gravidez (SMITH et al., 2000).

Os principais receptores que parecem envolvidos nas cascatas de

transduo de sinal em resposta ao VEGF so uma famlia de receptores tirosina-

quinase com trs membros: VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3. Paralelamente, esto

identificados alguns receptores acessrios, as neurofilinas, que modulam a ligao

aos receptores principais. O VEGFR-2 o principal mediador nos efeitos do VEGF

no crescimento e permeabilidade dos vasos. J o VEGFR-1 pode ter um papel

negativo, suprimindo a sinalizao pelo VEGFR-2 (BERNATCHEZ et al, 1999).O VEGFR-3, que est presente essencialmente nos vasos linfticos e

parece levar proliferao destes, tem grande afinidade pelo VEGF-C (SHIBUYA et.

al., 2001).

Receptores Funo

VEGF (VEGF-A) VEGFR-1, VEGFR-2,

neuropilina-1.

Angiognese,

manuteno vascular

VEGFR-1 A estabelecer

VEGF-C VEGFR-2, VEGFR-3 LinfangiognseVEGF-D VEGFR-2, VEGFR-3 LinfangiognseVEGF-E (fator viral) VEGFR-2 Angiognese*PIGF VEGFR-1, neuropilina-1 Angiognese e

inflamaoQuadro 1 - Promotores angiognicos VEGF e seus receptores

*PIGF: fator de crescimento da placentaFonte: GENENTECH, BIONCOLOGY Disponvel em:

1.4 INIBIDORES ENDGENOS DA ANGIOGNESE

Inibidores endgenos da angiognese so molculas cuja sntese

laboratorial est em franca expanso, estando identificadas inmeras aplicaes

teraputicas (FERRARA; KERBEL, 2005).

A angiostatina, endostatina, fator plaquetrio 4, prolactina,trombospondina, os inibidores teciduais de metaloproteinase 1, 2, 3 (tissue inhibitor

of metalloprotenase 1-TIMP-1, tissue inhibitor of metalloprotenase 2-TIMP-2, tissue


inhibitor of metalloprotenase 3-TIMP-3) so protenas inibidoras da angiognese

(BRAT; VAN MEIR, 2001).

Entre as molculas mais importantes salientam-se a angiostatina, a

endostatina e a antitrombina III (REYNOLDS; REDMER, 1998).

Vrios ensaios clnicos demonstraram que certos tumores poderiam

produzir inibidores angiognicos (CARMELIET, 2003). Esse fenmeno explicaria

porque, em certas cirurgias, aps a remoo do tumor principal (carcinomas do

clon e da mama e sarcomas osteognicos), havia rpido desenvolvimento de

metstases distncia (FOLKMAN, 2006).

Soff (2000) relatou que os fatores inibidores provinham da ao

enzimtica de metaloproteinases em protenas comuns. Assim, a angiostatinaresulta da degradao do plasminognio e a endostatina, do colgeno XVIII. De

acordo com o autor, ambas as molculas, reconhecidamente importantes na inibio

do processo angiognico, esto sendo usadas em mltiplos ensaios clnicos na rea

da oncologia.

1.5 ANGIOGNESE NO TUMOR

Para se analisar o crescimento tumoral deve-se supor que no tumor

coexistam dois compartimentos celulares que se estimulam mutuamente: o

compartimento das clulas endoteliais e o compartimento das clulas tumorais

(BERGERS; BENJAMIN, 2003).

A existncia de hiperemia tumoral tornou-se conhecida h cerca de dois

sculos, durante as intervenes cirrgicas (FOLKMAN, 2006). Contudo, at 1970 o

fato era explicado pela dilatao dos vasos sanguneos preexistentes, comoresultado do processo inflamatrio que acompanhava o tumor. No incio da dcada

de 70, surgiu a hiptese de que os tumores poderiam recrutar o seu prprio aporte

sanguneo atravs da produo e liberao de molculas estimuladoras da formao

de novos vasos sanguneos. Essa hiptese foi aceita com ressalvas. Somente aps

a introduo da cultura de clulas endoteliais, da purificao de protenas

angiognicas, e do advento da biologia molecular, foi possvel a sua confirmao

(McDONNELL et al., 2000).


Sabe-se atualmente que a maioria dos tumores humanos surge sem

atividade angiognica, mantendo-se, microscopicamente, como neoplasias in situ

durante meses e anos (CARMELIET, 2005). Ao longo deste tempo, somente uma

pequena porcentagem adquire fentipo angiognico, que lhe permite crescimento e

metastizao (McDONNELL et al., 2000; KIRSCH et al, 2000).

Na maioria dos tumores humanos, o fentipo maligno histologicamente

reconhecvel precede o fentipo angiognico (BERTRAM, 2001). Clinicamente, a

migrao para a condio angiognica reconhecida pela rpida expanso da

massa tumoral para dimenses detectveis, hemorragias locais e metastizao. No

caso da metastizao, a angiognese necessria no incio e ao final (KIRSCH et

al., 2000; ZETTER, 1998).Em animais experimentais, foi observado que antes da neovascularizao

raramente eram encontradas clulas tumorais em circulao, sendo as metstases

virtualmente inexistentes (ZETTER, 1998). Quando ocorre a neovascularizao, a

metastizao surge de imediato e de maneira proporcional vascularizao

(KIRSCH et al., 2000; ZETTER, 1998). Por outro lado, as metstases que subsistem

distncia, tornam-se detectveis aps desenvolverem vascularizao prpria, pois

de outra forma, mantm-se indefinidamente quiescentes (KIRSCH et al., 2000;ZETTER, 1998).

Comprovada a importncia da angiognese no desenvolvimento tumoral,

particularmente no processo de metastizao, os frmacos inibidores da

angiognese apresentam-se como uma arma teraputica no tratamento de vrias

neoplasias, quando combinados com a quimioterapia, resultando em um aumento de

sobrevida nos pacientes com tumores malignos avanados (CARMELIET, 2003)

Mesmo que no seja obtida a cura, estes frmacos podem viabilizar o controle dadoena (ZETTER, 1998; FERRARA; KERBEL, 2005; BALUK et al., 2005).

O uso de frmacos inibidores da angiognese tem inmeras vantagens

em comparao quimioterapia convencional. Os agentes citostticos, sustncias

citotxicas utilizadas especificamente para causar um dano celular, no so

seletivos para as clulas tumorais, sendo inespecficos, acabam por destruir tambm

clulas no neoplsicas, constituindo um entrave ao aumento das doses e so

responsveis pelos seus inmeros efeitos adversos (GOODMAN; GILMAN, 2006).

Acrescenta-se ainda, que as clulas tumorais so geneticamente instveis, com

elevado ndice de mutaes, o que conduz muitas vezes resistncia a drogas


inicialmente eficazes (CARMELIET, 2005). provvel que mantenham sensibilidade

terapia antiangiognica, sendo as clulas endoteliais geneticamente estveis e

com baixo ndice de mutao, comparadas s clulas tumorais e outras clulas

somticas (FERRARA; KERBEL, 2005).

Os citostticos clssicos podem comear a ser usados de maneira

diferente como na aplicao de doses menores, ao longo de um tempo maior,

embora exera menos efeito no tecido tumoral, consegue inibir a diviso das clulas

endoteliais, reprimindo a angiognese (KERBEL; KAMEN, 2004). Dessa forma,

evita-se o crescimento e a metastizao do tumor. Esse tambm o princpio da

radioterapia fracionada, que utiliza o aumento da freqncia das exposies com

doses menores (PUDUVALLI; SAWAYA, 2000). Tem-se estudado esquemascombinados dos vrios frmacos disponveis, com o objetivo de inibir as vrias

etapas do desenvolvimento tumoral e aproveitar o efeito sinrgico das drogas

(PUDUVALLI; SAWAYA, 2000).

A utilizao da densidade microvascular como indicador prognstico tem

sido alvo de inmeros estudos (BERGERS; BENJAMIN, 2003). Porm, h ainda

relativo desconhecimento quanto integrao das mltiplas cascatas angiognicas

e anti-angiognicas, sendo difcil especular sobre o prognstico da evoluotumoral em funo da maior ou menor vascularizao (MAcDONALD et al., 2002).

1.6 MODELO ANIMAL

O hamster dourado ou srio Mesocricetus arautus, um roedor da famlia

Cricetidae. Os hamsters dourados silvestres ocorrem em uma faixa de rea limitada

do Oriente Mdio, na Sria, onde so chamados pelo equivalente arbico depossuidores de bolsas para carregar, em virtude de suas bolsas faciais

(HARKNESS; WAGNER, 1993).

Estes animais vivem em profundas galerias, onde estocam grandes

quantidades de gros, apresentam cauda curta quando comparada com a de ratos

Wistar e so pequenos (cerca de 100g de peso). So conhecidos pelo curto perodo

de gestao, fcil domesticao, presena de bolsas faciais, tolerncia imunolgica

e pela grande habilidade em escapar do confinamento (HARKNESS; WAGNER,1993). Em laboratrio alimentam-se com rao peletilizada ou dieta para roedores


com alto teor de protenas e geralmente permanecem saudveis e ativos durante

sua vida. Os hamsters possuem tempo de vida que varia entre 18 e 24 meses,

entretanto, animais mais idosos tambm podem ser observados (HARKNESS;

WAGNER, 1993).

Os hamsters apresentam alto grau de tolerncia imunolgica a

transplantes homlogos e heterlogos de tecidos normais ou neoplsicos

(BILLINGHAM, et al., 1960). So animais com sistema imune ntegro, possuindo um

local de privilgio imunolgico natural nas suas bolsas jugais (LEMON et.al., 1952).

As bolsas servem ao hamster como meio de estocagem de alimentos e ao homem

como um stio de privilgio imunolgico para uso em pesquisa, j que so facilmente

acessveis para induo de tumor.As bolsas jugais ou faciais so divertculos bilaterais das mucosas jugais,

altamente distensveis que se estendem, sob a pele, da extremidade posterior da

comissura labial at aproximadamente ao nvel das escpulas do animal. O epitlio

da parede da bolsa similar pele humana, sendo denominado pele sem folculos

e glndulas (DULING, 1973). A bolsa, ao ser evertida, assume um aspecto sacular.

Apresenta camadas basal, espinhosa, granular e crnea com queratincitos, similar

epiderme e epitlio da gengiva ou palato duro humano (WHITE et. al., 1982).As camadas de clulas epiteliais apiam-se em tecido conjuntivo frouxo,

naturalmente imunodeficiente e aparentemente com ausncia de vasos linfticos,

exceto na regio proximal, onde se inserem as fibras do msculo retrator da bolsa

(GOLDENBERG; STEINBORN, 1970).

A bolsa jugal do hamster um excelente stio para o estudo de carcinoma

da mucosa oral porque susceptvel a modificaes por uma variedade de

influncias locais e sistmicas (GIJARE et al., 1990), sendo um dos modelosusados nas pesquisas de cncer oral (SALLEY, 1954; EVESON, 1980; MOGNETTI

et al., 2005).


1.7 AGENTES CARCINOGNICOS

1.7.1 9,10 dimetil benzatraceno (DMBA)O composto 9,10 dimetil benzatraceno (DMBA), agente

carcinognico iniciador, induz uma transverso no par de bases adenina-timina

(A-T) na segunda posio do cdon 61 do gen ras, sendo esta mutao

freqentemente identificada em carcinomas de clulas escamosas (SAM;

WATT, 2006).

Em 1954, Salley relatou que aplicaes de um ou vrios

hidrocarbonetos policclicos podem induzir a carcinoma de clulas escamosas

na mucosa de hamster. O autor aplicou DMBA dissolvido em ter e este se

apresentou como um carcinognico efetivo na induo de tumores aps 16

semanas. O autor descreveu 4 estgios histologicamente reconhecveis na

mucosa, que vo desde hiperplasia, papiloma, carcinoma in situ, at carcinoma

de clulas escamosas.

Morris (1961) relatou que o epitlio da bolsa jugal de hamsters

idosos apresentaram maior resistncia ao do DMBA do que animais

jovens. O autor relatou que: cinco semanas, o tempo necessrio para iniciar

as anlises de carcinogsese experimental. A carcinognese na bolsa jugal dehamster provavelmente o sistema animal mais comparvel com o

desenvolvimento de pr-malignidade e malignidade do cncer bucal humano.

Alm disso, o autor definiu que 0,5% de DMBA em soluo de acetona, produz

o efeito mximo de neoplasia, com o mnimo de perodo de latncia e sem

morbidade. Morris (1961) padronizou o procedimento, de tal modo que a leso

experimental pde ser reproduzida posteriormente.

O DMBA 0,5% induz uma resposta hiperplsica no epitlio da bolsaaps poucas aplicaes, constatando-se pela aparncia de variedades de

leses displsicas parecidas com leses pr-malignas humanas, aps seis a

oito semanas de tratamento (SANTIS et al., 1964). Tumores benignos e

malignos, leses papilomatosas e carcinomas, especificamente de clulas

escamosas comeam a ser evidenciados aps algumas semanas de

tratamento (SANTIS et al., 1964). Contudo, estgios de carcinognese

(iniciao, promoo, progresso) no tm sido bem definidos (GIMENEZ-CONTI; SLAGA, 1993).


Lin et al. (1996) obtiveram 100% de incidncia de tumor na bolsa

jugal de hamster aps aplicao de DMBA trs vezes por semana por oito

semanas consecutivas.

A maior vantagem da aplicao do DMBA neste modelo animal a

similaridade entre a mucosa da bolsa jugal do hamster e a mucosa oral

mastigatria humana. Alm disso a ausncia de induo de carcinomas

espontneos, desenvolvimento de leso displsica comparvel com a

leucoplasia humana oral e a suceptibilidade do sistema de tumor a influncias

sistmicas como vitaminas, hormnios e vrias drogas (SHKLAR et al., 1979).

Outra caracterstica desse modelo est na possibilidade de

acompanhamento macroscpico da evoluo do tumor, em tempos diferentes

aps o tratamento, pela simples everso da bolsa, e o mesmo tambm permite

delimitao dos stios onde est sendo induzida a leso (KREIMANN et al.,

2001).

A maior desvantagem do modelo experimental em bolsa jugal de

hamster o procedimento intensivo laboratorial, em adio ao extensivo

manuseio do animal com o carcingeno. No modelo clssico de Salley (1954) e

no modelo modificado de Lin et al. (1996), o animal manuseado, no mnimo,

48 vezes durante a induo do tumor.

1.7.2 Perxido de CarbamidaO perxido de carbamida, um agente promotor da carcinognese,

pode ser encontrado comercialmente nas concentraes de 10%, 11%, 15%,

16% e 35% em anidro glicerol ou glicerina (CH4N2O-H2O2) (DISHMAN;

BAUGHAN, 1992; FASANARO, 1992; KWONG et al., 1993; McGUCKIN;

MEYER, 1992). tambm conhecido como perxido de uria, perxido dehidrognio-uria, perxido de hidrognio-carbamida ou peridrol-uria; sendo

muito utilizado na tcnica caseira de clareamento de dentes vitais (DARNELLA;

MOORE, 1990; FASANARO, 1992; HAYWOOD; HEYMANN, 1989). O perxido

de carbamida nas concentraes mais usadas uma substncia instvel e

quando em contato com a saliva se dissocia em 3,6% a 5% de perxido de

hidrognio e 6,4% a 7% de uria (FASANARO, 1992; HAYWOOD, 1992;

HUMMERT et al., 1993). O perxido de hidrognio presente no perxido decarbamida, por sua vez, se dissocia em oxignio e gua, quebrando-se


posteriormente e liberando radicais livres; a uria dissocia-se em amnia e

dixido de carbono (HAYWOOD; HEYMANN, 1989; HAYWOOD et al., 1990;

FASANARO, 1992; HAYS et al., 1995).

O perxido de hidrognio o princpio ativo do perxido de

carbamida (NAIK, et al., 2006). A presena de radicais livres originrios da

quebra do perxido de hidrognio pode ser nociva pelo fato de que, os nions

superxidos e os ons hidroxila liberados so radicais oxidantes altamente

reativos e txicos, um vez que agem diretamente nos componentes vitais das

clulas, onde podem danificar membranas celulares, alterar o DNA e as

protenas, podendo causar mutaes (CHERRY et al., 1993; IMLAY; LINN,

1988; POWELL; BALES, 1991). Sabe-se, porm, que o organismo possui

mecanismos de defesa bioqumicos e mecanismos de reparo intracelulares que

reagem com os radicais livres inativando-os, como o caso de sistemas

enzimticos que controlam o ciclo celular (FRIDOVICH, 1978).

Ito et al. (1981) avaliaram a induo de tumores duodenais em ratos

pela administrao de perxido de hidrognio. A soluo de perxido de

hidrognio foi adicionada na gua destilada para beber, nas concentraes de

0,1% e 0,4%. Os autores verificaram que os grupos de 0,1% e 0,4% de diluio

apresentaram alta incidncia de hiperplasia duodenal com ndices de 40% e

62% respectivamente. Adenoma duodenal foi encontrado em 5% dos ratos, no

grupo em que foi administrada a concentrao de 0,4%, e em 1% dos animais,

no grupo em que foi administrada a concentrao de 0,1%. Eroses gstricas

surgiram aps 40 semanas; hiperplasia duodenal, aps 10 semanas e

carcinomas duodenais em 65 semanas. Os autores concluram que o perxido

de hidrognio pode ter dupla funo na formao de ndulos duodenais,

ampliando a ocorrncia espontnea de hiperplasia duodenal e transformando

ndulos hiperplsicos em neoplsicos.

Weitzman et al. (1984), discutiram a possibilidade dos metablitos

do perxido de hidrognio danificarem o DNA das clulas e causarem

mutaes. Os autores alertaram para os perigos da administrao crnica do

perxido de hidrognio no tratamento de doenas gengivais, pois a exposio

constante pode levar a alteraes indesejveis nos tecidos. As clulas so

danificadas quando expostas a altas concentraes de oxidantes. A


preocupao que os perxidos possam aumentar a expresso de tumores

por outros carcingenos do meio ambiente (WEITZMAN et al.,1984). O tumor,

para se manifestar, pode demorar anos ou dcadas em humanos (WEITZMAN

et al.,1984).

Weitzman et al. (1986), avaliaram o efeito carcinognico do perxido

de hidrognio no modelo de carcinognese qumica bucal induzida em

hamster. Os animais foram divididos em 4 grupos, sendo que o grupo I recebeu

DMBA; o grupo II recebeu DMBA e perxido de hidrognio 3%; o grupo III

recebeu DMBA e perxido de hidrognio 30%; e o grupo IV recebeu perxido

de hidrognio 30%. A concentrao de DMBA foi de 0,25% em leo mineral. As

bolsas jugais do hamster foram pinceladas duas vezes por semana com os

carcingenos, e o sacrifcio foi realizado aps 19 e aps 22 semanas. Foi

observada a presena de queratose e hiperplasia em mais de 85% dos animais

em todos os grupos aps 19 semanas. Aps 22 semanas, os animais do grupo

I apresentaram carcinomas epidermides em trs de sete animais; no grupo II,

seis de 11 animais desenvolveram carcinomas em 22 semanas e todos os

animais do grupo III desenvolveram carcinomas invasivos. No grupo IV, os

animais no desenvolveram carcinomas, porm, apresentaram mudanas

associadas a leses pr-neoplsicas, incluindo hipercromatismo de clulas e

displasia mdia. Os resultados sugeriram uma ao co-carcinognica do

perxido de hidrognio no modelo analisado e este, isolado ou associado,

provocou mudanas pr-neoplsicas e aumentou a atividade mittica e

hiperplsica.

1.8 TCNICA DE MODELO DE CORROSO VASCULAR

A tcnica de modelo de corroso vascular associada MEV tem

sido aplicada no estudo do padro vascular de rgos e tecidos normais, de

processos patolgicos e de estruturas em desenvolvimento

(LAMETSCHWANDTNER; LAMETSCHWANDTNER; WEIGER, 1990;

DERUITER et al., 1991). Os modelos vasculares desses rgos e tecidos so

obtidos pela modelagem do lmen dos vasos com resina de baixa viscosidade,

seguida pela corroso com soluo alcalina, do tecido circunjacente resina


polimerizada (WEEKES; SIMS, 1986; HODDE; STEEBER; ALBRECHT, 1990;

OHTA et al., 1992; SUGIOKA; IKE, 1993; PIETTE; LAMETSCHWANDTNER,

1994; SELLISETH; SELVIG, 1995b; KRONKA; WATANABE; SILVA, 2001;

VERLI, F.D. et al, 2007).

O modelo de corroso vascular fornece a angioarquitetura da

estrutura anatmica (AHARINEJAD; BCK, 1994), sendo que alguns dos

aspectos morfolgicos observados so: o arranjo tridimensional da

vascularizao, o dimetro vascular, a impresso dos ncleos das clulas

endoteliais na superfcie do modelo vascular, bem como o trajeto das arterolas

e vnulas que compem a estrutura avaliada (HOSSLER; DOUGLAS, 2001).

A moldagem realizada com resina Mercox (MercoxCL 2RB,

Ladd Research Industries, Burlington, VT), material de moldagem vascular

base de metilmetacrilato, bastante utilizado nas pesquisas de modelo de

corroso vascular (KOGUSHI et al., 1988; OHSHIMA; YOSHIMA; KOBAYASHI,

1990; AHARINEJAD; BCK, 1994; NINOMIYA, 2000; VERLI, F.D. et al, 2007) .

Aps a moldagem, realizada a corroso, que a dissoluo dos

tecidos circunjacentes moldagem, utilizando solues de hidrxido de sdio

(NaOH) e hidrxido de potssio (KOH), associadas ou no a detergentes em

diferentes concentraes (HODDE; STEEBER; ALBRECHT, 1990;

LAMETSCHWANDTNER; LAMETSCHWANDTNER ; WEIGER, 1990).

Aps corroso dos espcimes, estes sofrem tratamento condutivo,

que consiste no revestimento dos espcimes com uma camada metlica

(metalizao). Com a adio desta camada, h conduo de eltrons sobre as

superfcies dos espcimes e a produo de eltrons capazes de gerar sinal

suficiente para a formao da imagem em MEV (LAMETSCHWANDTNER;

LAMETSCHWANDTNER; WEIGER, 1990; BELZ; AUCHTERLONIE, 1995).

As eletromicrografias de varredura de arterolas, vnulas, artrias,

veias e alas capilares obtidas pela tcnica de corroso vascular fornecem

imagens tridimensionais individualizadas dessas estruturas. Essas imagens

proporcionam informaes especficas dos modelos vasculares como dimetro

vascular e a impresso das clulas na superfcie dos modelos (HODDE;

STEEBER; ALBRECHT, 1990; KONERDING, 1991). A anlise dos modelos de

corroso vascular principalmente descritiva (KONERDING, 1991).


5.6 CONCLUSO

O entendimento da morfologia da microcirculao tem um papel

importante na compreenso dos fenmenos fisiolgicos e fisiopatolgicos de

todos os sistemas orgnicos.

Documents

Angioarquitetura de Carcinoma de Células Escamosas