Animales modificados genéticamente como donantes de órganos en xenotrasplante

3

REVISIONES

Animales modificados genéticamente como donantes de órganos en xenotrasplante

José Yélamos, Pablo Ramírez y Pascual Parrilla

Unidad de Trasplante. Servicio de Cirugía. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. Murcia.

Animales; Xenotrasplante; Donantes de órganos; Rechazo de trasplante

La elevada supervivencia conseguida en la mayoría de losenfermos alotrasplantados gracias al mejor control del re-chazo, al perfeccionamiento de la técnica quirúrgica y a untratamiento postoperatorio más completo ha hecho que dis-minuyan las contraindicaciones absolutas y relativas parapoder recibir un órgano. Por este motivo el número de en-fermos que requieren o podrían requerir un trasplante o,más grave aún, el número de fallecimientos de pacientes enlista de espera para trasplante va en aumento progresivo.Sin embargo, la tasa de donaciones por muerte cerebral seincrementa muy despacio o incluso disminuye. Esto ocurreen todos los países del mundo, incluido España, donde con-tamos con la tasa más elevada del mundo de donantes por1.000.000 de habitantes. Precisamente es esta escasez deórganos disponibles la que hace resurgir, a mediados de losaños ochenta1, el interés por el xenotrasplante, definidocomo el trasplante de órganos o tejidos entre miembros deespecies diferentes, tras un período de latencia investigado-ra en el tema de más de 20 años2-5.Dentro del xenotrasplante, los problemas son ligeramentediferentes en función de la proximidad filogenética entre es-pecie donante y especie receptora del órgano. Así, en 1970Calne6 introdujo los términos de xenotrasplante concordantepara referirse a aquel que tiene lugar entre especies relati-vamente próximas como serían el hombre y el chimpancé, yxenotrasplante discordante, que sería el que se efectúa en-tre especies más alejadas filogenéticamente, como el hom-bre y el cerdo. Esta división clásica consideraba que en losmodelos discordantes existen anticuerpos preformados enel receptor dirigidos contra determinados antígenos de laespecie donante, lo que origina un rechazo hiperagudo delórgano en minutos y, por supuesto, su pérdida inmediata.Las barreras a las que nos enfrentamos en el xenotrasplanteson complejas y se pueden clasificar en tres grandes gru-pos: inmunológicas, fisiológicas e infecciosas. Desde el pun-to de vista inmunológico y fisiológico, el donante ideal seríanlos primates no humanos, filogenéticamente próximos alhombre. Este modelo se encuadraría dentro del grupo dexenotrasplante concordante. Sin embargo, los problemaséticos, la dificultad de su reproducción en cautividad y, so-bre todo, el peligro de transmisión de agentes infecciosos,especialmente retrovirus, han descartado su uso. En estemomento, existe bastante consenso entre la comunidadcientífica interesada en el xenotrasplante sobre la utilizacióndel cerdo como potencial donante de órganos a humanos.Aunque se trata de una combinación de xenotrasplante dis-cordante y, por tanto, con mayores barreras inmunológicas,

Correspondencia: Dr. J. Yélamos.Unidad de Trasplante. Servicio de Cirugía.Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca.Ctra. de Cartagena, s/n. El Palmar. 30120 Murcia.Correo electrónico: [email protected]

Recibido el 30-8-1999; aceptado para su publicación el 30-12-1999

Med Clin (Barc) 2000; 114: 342-348

42

el cerdo presenta una serie de ventajas, entre las que se po-drían destacar las siguientes: es una especie que se repro-duce con facilidad; por su lejanía filogenética, es más difícilla transmisión de agentes infecciosos al hombre, y compar-te muchas propiedades anatómicas y fisiológicas con loshumanos7.De alguna forma, como casi siempre ocurre en ciencia, elresurgimiento del interés por el xenotrasplante muestra unparalelismo muy estrecho con la aparición de la tecnologíatransgénica en los años ochenta8. Así, hoy día parece claroque la única vía que puede hacer del xenotrasplante una realidad clínica es la utilización de animales modificados ge-néticamente como donantes de órganos. En esta revisiónplantearemos algunas de las numerosas dianas «potencia-les» sobre las que dirigir la manipulación genética del ani-mal donante (cerdo), encaminadas todas ellas a superar lasbarreras inmunológicas y fisiológicas inherentes al xenotras-plante de modelos discordantes, utilizando la tecnologíatransgénica clásica mediante inyección de ADN en zigotos.Otras metodologías de modificación genética de animales,como la transferencia génica ex vivo, son muy poco eficacesen este momento por la ausencia de vectores adecuadosque permitan un grado de expresión estable y aceptable.Asimismo, la tecnología de células embrionarias y la tecno-logía de transferencia nuclear no están aún desarrolladas enel cerdo.

Metodología transgénica

El objetivo de esta revisión es la aplicación de la tecnologíatransgénica al xenotrasplante. Los conceptos básicos de di-cha tecnología, sus limitaciones y su desarrollo protocoliza-do están muy bien documentados en otras revisiones y li-bros específicos del tema9,10.Básicamente, el animal transgénico se define como aquelque contiene un fragmento exógeno de ADN en su genoma.Este fragmento es lo que denominamos, en un sentido am-plio, construcción genética, que debe contener la secuenciade ADN codificante de la proteína que se quiere expresar,junto con los elementos reguladores requeridos (promotor,intrón, señal de poli-A) para su transcripción específica endeterminados tipos celulares a pre-ARN y posterior procesa-miento de dicho ARN inmaduro a ARN maduro, que migra-rá posteriormente desde el núcleo celular al citoplasma,donde será leído por los ribosomas para dar lugar a la pro-teína correspondiente. Este fragmento de ADN se inyecta enel pronúcleo de un óvulo fecundado (zigoto) bajo microsco-pio utilizando un micromanipulador. Los zigotos se dejandesarrollar in vitro hasta la etapa de embrión de dos célulasy luego se implantan en una hembra seudopreñada para sudesarrollo. Tras el nacimiento, los hijos se someten a un cri-bado mediante técnicas de reacción en cadena de la poli-merasa (PCR) y/o Southern blot para determinar si algunode ellos contiene el gen exógeno integrado en su genoma.En los casos en los que el ADN se integre en el genoma, to-

J. YÉLAMOS ET AL.– ANIMALES MODIFICADOS GENÉTICAMENTE COMO DONANTES DE ÓRGANOS EN XENOTRASPLANTE

Fig. 1. Esquema general del proceso de generación de cerdos transgénicos. A) La microinyección de la construcción genética de interés (color verde) se realizaen el pronúcleo de un óvulo fecundado (zigoto). El material genético endógeno se representa en rojo. Después de permitir el desarrollo del embrión in vitro has-ta el estadio de dos células, se implanta en una hembra receptora. Al nacimiento, los diferentes hijos se analizan para conocer si contienen o no el ADN exóge-no integrado en su genoma. Aquel que contenga dicho ADN exógeno se analiza para conocer el grado de expresión del transgén en las proteínas y formaría loque se denomina el fundador de dicha línea transgénica. B) Representación esquemática de la transferencia del ADN exógeno, integrado en el genoma endó-geno, a la descendencia durante el proceso de meiosis.

Microinyecciónen pronúcleo

Mitosis

Cerdo transgénico Screening

Meiosis

Célula germinaldel cerdo

transgénico

Óvulos o esperma haploide(50% contiene ADN exógeno)

A B

das las células somáticas de ese animal van a contener di-cho gen exógeno (fig. 1A). Este animal se denomina funda-dor de la línea transgénica y transferirá esta información ge-nética a la descendencia, gracias a que durante el procesode meiosis el 50% de las células germinales serán portado-ras de dicha información genética exógena (fig. 1B). Sinembargo, la integración del ADN exógeno en el genoma nogarantiza su expresión en las proteínas, debido a que dichaintegración se produce al azar y puede tener lugar en regio-nes silentes del mismo. Por ello, es necesario realizar unanálisis de expresión proteica mediante técnicas de inmu-nohistoquímica o Western blot a todos los animales trans-génicos para seleccionar a aquellos con un alto grado deexpresión proteica como fundadores de las líneas transgéni-cas que se usarán posteriormente.

Barreras inmunológicas del xenotrasplante

La capa de células endoteliales que revisten la superficie lu-minal de los vasos sanguíneos lleva a cabo numerosas fun-ciones, entre las que se incluyen el control de la coagula-

ción y de la permeabilidad vascular, el mantenimiento deltono vascular y la regulación de la extravasación leucocita-ria. Durante el trasplante de órganos vascularizados, tantoen alotrasplante como en xenotrasplante, se va a produciruna exposición inmediata del endotelio vascular del injertoal sistema inmune del receptor. Por ello, desde el punto devista inmunológico, y en algunos casos también desde elpunto de vista fisiológico (los problemas de agregación pla-quetaria y coagulación fundamentalmente), es muy impor-tante que la modificación genética del órgano vaya dirigidasobre todo a la célula endotelial (figs. 2-4).

Rechazo hiperagudo

El primer problema inmunológico en xenotrasplante discor-dante, y quizás por ello también el mejor conocido, es unrechazo hiperagudo del órgano injertado iniciado por los xe-noanticuerpos del huésped que reaccionan con xenoantíge-nos que se expresan en la superficie de las células endote-liales del órgano donante (fig. 2). La presencia de loscomplejos antígeno-anticuerpo en la célula endotelial da lu-

Fig. 2. Representación esquemática de la cascada de activación del complemento en la célula endotelial. La cascada es iniciada por la formación de los comple-jos antígeno-anticuerpo y conduce a la formación de las convertasas de C3 y C5, lo que da como resultado final la formación del complejo de ataque a la mem-brana (MAC). La presencia de las proteínas humanas reguladoras de la activación del complemento, DAF, MCP (CD46) y CD59, en la superficie de la célula en-dotelial de cerdo impedirá la formación de la convertasa de C3, producirá la inactivación de la convertasa de C5 y evitará la formación del MAC, respectivamente.La expresión de la enzima fucosil-transferasa (HT) reduce las cifras de xenoantígenos α-gal en la superficie de la célula endotelial.

STOPHT

Xenoanticuerpos

Xenoantígenos

C1

C1C4

C14b

DAF

C3

C5, C6, C7, C8, C9C2

MCP

C14b(2b)2a3b

MACCD59

Célula endotelial

STOP STOP

STOPC14b(2b)2b

343

MEDICINA CLÍNICA. VOL. 114. NÚM. 9. 2000

3

Citocinas

Trombina

STOP

STOPbcl-2bcl-xlA20A1

NF-kB-IkB

ARNm

STOP

Móleculas de adhesión

ROS

HO

CD39ATPDasa

Plaquetas

P65RH

STOP

STOP

STOP

TFPI

Actividadprocoagulante

TM

Citocinas

aPC

MocitosCélulas NKCélulas THLA

Células NK

NF-kB

STOP

Fig. 3. Representación esquemática de algu-nas, de las muchas, manipulaciones genéti-cas en la célula endotelial del órgano del do-nante, que podrían eliminar las barreras alxenotrasplante que aparecen después de su-perado el rechazo hiperagudo. La expresiónde hemoxigenasa-1 (HO) tiene un fuerteefecto antioxidante. La sobreexpresión de ge-nes con actividad antiapoptósica (bcl-2, bcl-xl, A20, A1) inhibe la migración del factor detranscripción NF-κB al núcleo celular. La ex-presión de inhibidores de I-κB (p65RH) va aproducir también una inhibición de NF-κB.Esta inhibición bloqueará la transcripción degenes que codifican moléculas implicadas enprocesos inflamatorios (moléculas de adhe-sión y citocinas). La agregación plaquetariase puede bloquear mediante la expresión deCD39/ATPDasa. La expresión de trombo-modulina puede generar proteína C activa,involucrada en el proceso de coagulación. Laexpresión de TFPI humano puede eliminarlas incompatibilidades entre el TFPI porcinoy el factor X humano. La expresión de molé-culas HLA de clase I puede inhibir la xenorre-actividad de células natural killer.

gar a la activación del complemento, que mediará a su vezen la activación de la célula, la generación de un ambienteprocoagulante y la pérdida de la integridad vascular. Estetipo de activación del endotelio, conocida como activaciónde tipo I, no requiere la síntesis de novo de proteínas11. Enlos últimos años, algunos de los progresos más espectacula-res en xenotrasplante se han producido en la prevención deeste tipo de rechazo. Los puntos de actuación encaminadosa controlar el rechazo hiperagudo deben, por tanto, ir enca-minados a eliminar o reducir las cifras de xenoanticuerpos,reducir la expresión de los antígenos diana de la superficieendotelial y controlar la activación del complemento.

Los xenoanticuerpos. Son anticuerpos policlonales, general-mente de baja afinidad, la mayoría de isotipo IgM y en me-nor medida de isotipo IgG, preexistentes en el receptor yque forman parte de lo que se conoce como anticuerposnaturales, posiblemente producidos por una pequeña po-blación de linfocitos B CD5+. Las estrategias utilizadas parasu eliminación o reducción son muy variadas, pero todas

44

ellas se basan en su adsorción mediante diferentes procedi-mientos12-14. Sin embargo, esta reducción siempre es transi-toria. Recientemente, se está trabajando en la posibilidadde eliminar del individuo receptor la población de linfocitosB CD5+, en apariencia la responsable de su existencia11. Alser éste un factor preexistente en el receptor, no son válidaslas estrategias de manipulación del órgano donante.

Los antígenos diana. En los últimos años, se ha demostradoque la mayoría de los xenoanticuerpos naturales van dirigi-dos frente a un único epítopo denominado α-gal15 presenteen numerosas glucoproteínas y glucolípidos de la superficieendotelial del cerdo, entre ellas algunas moléculas de adhe-sión16-18. Este determinante antigénico se forma por la ac-ción de la enzima α-galactosil-transferasa, que utiliza comosustrato y glucosila la N-acetil-lactosamina. Los humanos, aligual que otros primates del viejo mundo, tienen inactivo elgen que codifica para esta transferasa y en su lugar utilizanla α-fucosil-transferasa, que emplea el mismo sustrato quela α-galactosil-transferasa, dando lugar en este caso a la

Fig. 4. Representación esquemática del papel que desempeña la interacción de loslinfocitos del receptor con el endotelio del injerto a través del sistema Fas-FasL. Encondiciones normales, el endotelio expresaen su superficie FasL, que interacciona conel Fas expresado en la superficie de los linfo-citos, lo que conduce a la muerte de los mis-mos y por tanto se evita su infiltración. Encondiciones de activación del endotelio, seproduce una reducción en la expresión deFasL por parte del endotelio, junto con la ex-presión de moléculas de adhesión, lo quepermite la infiltración de las células efectorasde la respuesta inmune celular al injerto.

Endotelio

Linfocito Moléculasde adhesión Activación endotelial

Adhesión

Transmigración

Moléculas de adhesión

Apoptosis

FasL

Endotelio

Fas


sustancia H. Dependiendo del grupo sanguíneo de un indi-viduo, se añaden otros azúcares a este esqueleto de hidra-tos de carbono para formar los grupos A o B. Así, en esen-cia, podríamos decir que los cerdos expresan «un nuevoantígeno de grupo sanguíneo» en comparación con los hu-manos.Esta identificación bastante precisa del principal epítopo re-conocido por los xenoanticuerpos ha facilitado enormemen-te la posibilidad de diseñar estrategias de manipulación ge-nética del animal donante para eliminar o reducir dichoepítopo. De esta forma, Sandrin et al19, en 1995, sugirieroncomo estrategia para reducir la expresión de α-gal la gene-ración de un animal transgénico que exprese la enzima fu-cosil-transferasa, que va a competir por el mismo sustratocon la α-galactosil-transferasa (fig. 2). Esta estrategia ha de-mostrado su validez tanto en ratones20 como en cerdostransgénicos21.

Regulación de la activación del complemento. El papel cla-ve que la activación del complemento desempeña en el re-chazo hiperagudo se ha demostrado tanto en modelos in vi-tro como in vivo22,23. La cascada de activación delcomplemento se regula por la expresión de una serie deproteínas reguladoras que actúan en diferentes puntos de la cascada de activación, tales como DAF, CD46 y CD59(fig. 2). Todas estas proteínas reguladoras son específicasde especie. Así, por ejemplo, las proteínas reguladoras de laactivación del complemento de cerdo serían incapaces decontrolar la activación del complemento humano. Sin em-bargo, la expresión de una proteína reguladora humana sísería capaz de controlar la activación del propio comple-mento humano (fig. 2). Experimentos realizados in vitro me-diante la expresión de proteínas reguladoras de la activacióndel complemento humano en células no humanas demos-traron la validez de esta hipótesis de trabajo24.Sin duda alguna, la eficacia de la metodología transgénicaaplicada al xenotrasplante ha quedado plenamente demos-trada mediante la generación de cerdos transgénicos parala proteína reguladora de la activación del complemento hu-mano, denominada CD55 o DAF (decay-acceleratingfactor)25. Usando este animal modificado como donante deórganos, se han establecido modelos experimentales de xe-notrasplante de corazón26, riñón27 y, recientemente, de hí-gado28 de cerdo transgénico para hDAF a mono. En todoslos casos, los resultados han sido espectaculares y esperan-zadores, puesto que se ha eliminado el rechazo hiperagudo.Esta capacidad de controlar la activación del complementohumano en modelos in vivo se ha demostrado también paraCD46 y CD59. Para ambas proteínas se han generado ani-males transgénicos y se ha demostrado, así mismo, su ca-pacidad de controlar la activación del complemento huma-no29,30. En este momento, la estratega genética que se estásiguiendo en la investigación para abolir el rechazo hiper-agudo persigue conseguir animales politransgénicos paradiferentes combinaciones de proteínas reguladoras de la ac-tivación del complemento31.

Rechazo vascular agudo

Como se ha indicado anteriormente, la tecnología transgéni-ca permite controlar el rechazo hiperagudo al xenoinjerto.Este logro ha permitido conocer qué ocurría después y,como parecía obvio, se ha puesto de manifiesto la gran ca-pacidad del sistema inmune para reaccionar frente a lo nopropio mediante otros mecanismos independientes delcomplemento. Unos días después de realizado el trasplante,el xenoinjerto se ve sometido a un fuerte rechazo, conocidocomo rechazo vascular agudo. La histología de este tipo de

rechazo es diferente de la del rechazo hiperagudo, con me-nos hemorragia, pero con una significativa trombosis intra-vascular. El infiltrado celular, al igual que en el rechazo hi-peragudo, es escaso. A diferencia de lo que ocurre en elrechazo hiperagudo, cuyo mecanismo se conoce y, por tan-to, se han podido desarrollar estrategias para prevenirlo, elmecanismo del rechazo vascular agudo se conoce muchomenos y, por consiguiente, no está claro cuál o cuáles se-rían las modificaciones genéticas en el animal donante ca-paces de controlarlo. Esto hace que las investigaciones eneste campo se encuentren en un punto de máximo interés.Al igual que sucede con el rechazo hiperagudo, el elementocentral de la fisiopatología del rechazo vascular agudo es laactivación de la célula endotelial. Sin embargo, esta activa-ción no requiere complemento y se produce más lentamen-te, con lo que permite la transcripción y expresión de nue-vas moléculas por parte del endotelio (activación de tipoII)32. Algunos experimentos parecen indicar que la unión deanticuerpos al endotelio puede ser uno de los principalesfactores responsables de esta activación tipo II de la célulaendotelial33,34.En gran parte, los efectos de este tipo de activación del en-dotelio están mediados por la activación del factor de trans-cripción NF-κB, que es capaz de activar la transcripción deun gran número de genes, muchos de ellos involucrados enla respuesta inflamatoria. El factor NF-κB está presente enel citoplasma celular en forma inactiva unido al factor I-κB.La activación de la célula por diferentes vías produce la fos-forilación y degradación proteolítica de I-κB, lo que permiti-rá la liberación y migración de NF-κB al núcleo donde va ainducir la transcripción, en cuestión de minutos, de molécu-las proinflamatorias35. La transferencia de genes a la célulaendotelial, capaces de inhibir la activación de NF-κB, pue-de ser una vía adecuada para bloquear dicha activación ycontrolar de esta forma la respuesta inflamatoria. En estesentido son varios los procedimientos utilizados, como la ex-presión de un factor I-κB modificado35.Recientemente se ha sugerido que la sobreexpresión de ge-nes con actividad antiapoptósica en la célula endotelial pue-de ser capaz de producir una inhibición de la activación dedichas células, actuando, en algunos casos, posiblementetambién en NF-κB32. Entre los genes sugeridos por Bach etal32 que presentan esta actividad antiapoptósica se encuen-tran bcl-2, bcl-x1, A1, A20. En algunos casos, esta sugeren-cia se ha demostrado experimentalmente. Así, la expresiónde A20 en la célula endotelial de cerdo inhibe la transcrip-ción de genes dependientes de NF-κB36. De igual forma, re-cientemente se ha demostrado que la sobreexpresión delgen A1 inhibe la activación de la célula endotelial mediantela inhibición de NF-κB37. Por otra parte, la sobreexpresiónde bcl-2 en el endotelio de un órgano es capaz de proteger-lo durante su período de almacenamiento previo al trasplan-te, observación de extremo valor tanto en alotrasplantecomo en xenotrasplante38. Todos estos resultados parecenindicar que la sobreexpresión de los genes antiapoptósicosen la célula endotelial podría inhibir la activación de dichacélula y, al mismo tiempo, protegerla del proceso de apop-tosis, una vez bloqueado el factor NF-κB (fig. 3).

Rechazo celular

Hasta el momento, ha sido muy difícil mantener los xenoin-jertos en el receptor el tiempo suficiente para estudiar losmecanismos de la respuesta inmune celular, aunque la ideageneral es que puede ser más difícil de controlar que la res-puesta celular a aloinjertos. Por este motivo, las estrategiasde manipulación genética que vamos a sugerir en esta sec-

345


34

ción están sometidas a intensa investigación y representansólo algunas de las muchas dianas potenciales en las quese podría actuar. A medida que los resultados experimenta-les comiencen a dar sus frutos, se podrá diseñar la mejorestrategia de manipulación genética que podría utilizarse enel potencial donante.

Células T. Los linfocitos T reconocen los antígenos MHC delinjerto a través de dos vías: a) un reconocimiento directo delos antígenos sobre las células del donante, y b) un recono-cimiento indirecto de los antígenos del donante procesadosy presentados en forma de péptidos antigénicos en el con-texto de moléculas MHC por las células presentadoras deantígeno del receptor. Esta vía indirecta de reconocimientoparece desempeñar un papel especial en el rechazo celulara los xenoinjertos.Estudios in vitro han demostrado que los linfocitos humanosT CD4+ pueden proliferar y generar citotoxicidad en res-puesta a una estimulación de moléculas MHC de clase II decerdo, mientras que los linfocitos T CD8+ pueden generarcitotoxicidad después de su estimulación con antígenosMHC clase I de cerdo39,40. Esta respuesta de los linfocitos Thumanos frente a las células de cerdo implica que la mayo-ría de las interacciones moleculares involucradas en la fun-ción de los linfocitos T están intactas en esta combinaciónde especies (CD4/clase II, CD8/clase I, CD2/LFA-3,CD28/B7, LFA-1/ICAM, VLA-4/VCAM y Fas/FasL). Por tanto,las manipulaciones genéticas deben ir dirigidas a bloquearestas interacciones.

Interacción Fas-FasL. Un avance fundamental en inmunolo-gía ha sido el descubrimiento de la interacción de la molé-cula Fas (CD95) con su ligando (FasL) y el papel clave queesta interacción desempeña en el proceso de apoptosis enel sistema inmune. Fas es una proteína de membrana ex-presada por una gran variedad de células, mientras que laexpresión de FasL es más restringida. FasL induce apopto-sis en aquellas células que expresan su receptor, Fas41. Es-tudios recientes han demostrado el gran potencial de la in-teracción Fas-FasL en la biología del trasplante, aunque losresultados han sido polémicos42-45. Los datos obtenidos deestos estudios parecen indicar la importancia del tipo de cé-lulas en las que se exprese FasL para conferir el efecto pro-tector al órgano injertado. Recientemente, se ha demostra-do la expresión funcional de FasL en la superficie de lacélula endotelial46 y se ha planteado la posibilidad de un pa-pel fundamental de la interacción Fas-FasL en el control delproceso de transmigración leucocitaria47. El modelo pro-puesto por Walsh y Sata supone que en presencia de estí-mulos inflamatorios y liberación de factor de necrosis tumo-ral α (TNF-α), se produciría una inhibición de la expresiónde FasL, un incremento en la expresión de moléculas deadhesión y la consiguiente migración leucocitaria (fig. 4).Dado que las células endoteliales parecen ser resistentes alproceso de apoptosis mediado por la interacción Fas-FasL48, la expresión controlada de FasL en la superficie en-dotelial podría inducir apoptosis de linfocitos activados queinteraccionen con el endotelio, de una forma selectiva49.

Células natural killer (NK). Existen datos experimentales queponen de manifiesto la capacidad de las células NK huma-nas de lisar células xenogénicas de cerdo40. Los estudios invivo han demostrado infiltrados de células NK en el xenoin-jerto, y también se ha probado una prolongación de la su-pervivencia del xenoinjerto en aquellos casos en los que sehan eliminado o reducido las células NK del receptor50. To-dos estos datos apuntan a un papel muy importante de las

6

células NK en la respuesta inmune a los xenoinjertos y, portanto, es importante diseñar alguna estrategia de modifica-ción genética del órgano donante encaminada a reducir oeliminar esta acción.Las células NK expresan en su superficie unas moléculasconocidas como receptores inhibidores de la actividad cito-tóxica de NK (KIR), que reconocen moléculas MHC de cla-se I en la superficie de las propias células del organismo einhibirían la lisis de dichas células por NK. Sin embargo, pa-rece ser que los KIR serían incapaces de reconocer las mo-léculas MHC de clase I xenogénicas, lo que permitiría la ac-tivación de las células NK y la consiguiente lisis de la céluladel injerto. Para evitar este proceso se ha sugerido la expre-sión de diferentes moléculas MHC de clase I humanas en lasuperficie de la célula xenogénica de cerdo, las cuales se-rían reconocidas por los KIR humanos, expresados en la su-perficie de las células NK, y de esta forma se inhibiría la ac-tuación de dichas células sobre el xenoinjerto. Hasta estemomento se han expresado HLA-Cw351, HLA-G52 (fig. 3) ylos resultados obtenidos parecen confirmar la hipótesis detrabajo en todos los casos.

Otros mecanismos efectores del rechazo

Citocinas. El endotelio vascular del órgano injertado va a es-tar expuesto a la acción de una serie de moléculas solublescon una acción proinflamatoria inespecífica, como es elcaso de las citocinas, que ejercerán su acción mediante re-ceptores específicos presentes en la célula endotelial. Se hapropuesto que la expresión en el endotelio de receptoresmodificados capaces de unir la correspondiente citocina,pero incapaces de transmitir la señal de activación a la cé-lula endotelial, podría competir con los receptores naturalesde las citocinas y, de esta forma, disminuir su acción sobreel endotelio32 (fig. 3).

Especies reactivas de oxígeno. Durante el trasplante de ór-ganos se producen muchas especies reactivas de oxígeno(ROS) que podrían activar NF-κB y, por tanto, conducir auna activación de tipo II de la célula endotelial (estrés oxi-dativo). Recientemente se ha demostrado que la expresiónde la enzima hemoxigenasa-1 (HO-1), con una potente ac-tividad antioxidante, en xenoinjerto de corazón en ratónparece ser esencial para la supervivencia a largo plazo.Los corazones de ratón que expresan en sus células endo-teliales HO-1 pueden sobrevivir indefinidamente en ratasuna vez controlada la activación del complemento median-te el tratamiento con veneno de cobra para prevenir el re-chazo hiperagudo53. Estos resultados parecen indicar quela expresión de HO-1 es necesaria para eliminar la infiltra-ción del injerto por leucocitos efectores del organismo re-ceptor (fig. 3).

Barreras fisiológicas en xenotrasplante

Para el éxito del xenotrasplante, una vez controlado el re-chazo del xenoinjerto, es de extrema importancia que el ór-gano sea capaz de responder a las necesidades fisiológicasde su nuevo portador. Mientras que en el caso del corazón,siempre y cuando el tamaño sea adecuado, es de esperarque no se produzcan problemas fisiológicos de importancia,la situación puede ser mucho más compleja en el caso deotros órganos como el riñón y especialmente el hígado, au-téntica factoría metabólica del organismo.La experiencia previa ha demostrado que los riñones dechimpancé son capaces de mantener la vida humana y quela insulina porcina puede regular las concentraciones san-guíneas de azúcar en humanos. Sin embargo, modelos ex-


perimentales de xenotrasplante de riñón de cerdo a prima-te no humano han demostrado que la eritropoyetina decerdo no funciona en primates11. En este sentido, la intro-ducción de un transgén que codifique para eritropoyetinahumana podría ser la solución a este problema. Así mismo,los receptores humanos de un hígado de mono babuinopresentaron unas concentraciones más bajas de colesterolen suero (consistentes con las cifras propias de los babui-nos) y valores muy reducidos de ácido úrico en suero, yaque el hígado de babuino no produce ácido úrico54.Especial mención requieren los factores que pueden estarinvolucrados en el proceso de coagulación sanguínea. Laagregación plaquetaria puede representar un problema fun-damental. Se han propuesto dos estrategias de manipula-ción genética para tratar de evitar este problema: la sobre-expresión de trombomodulina y de ATPDasa en lasuperficie de la célula endotelial32. La expresión de trombo-modulina podría conducir a la producción de un buen nivelde proteína C activa. Se ha demostrado que la expresión detrombomodulina humana en la célula endotelial de cerdo invitro es activa en la transformación de la proteína C inactivaa su forma activa55, que desempeña una acción anticoagu-lante muy importante. Por otra parte, la agregación plaque-taria necesita ADP. La sobreexpresión de ATPDasa puedeayudar a eliminar el ADP mediante su transformación enAMP y adenosina, la que posee actividad antiagregante32.A medida que se mejore el control del rechazo inmunológi-co del xenoinjerto, será posible estudiar mucho mejor las in-compatibilidades fisiológicas y, por tanto, diseñar las mejo-res estrategias de manipulación genética encaminadas acorregir dichas deficiencias.

Conclusión

Dada la gran variedad de barreras a las que se enfrenta enel xenotrasplante, parece obvio que la vía que puede con-vertirlo en una realidad clínica ha de pasar, posiblemente,por la generación de animales politransgénicos que expre-sen simultáneamente el número de proteínas necesariaspara «humanizar» el órgano donante y permita tanto suaceptación inmunológica como su correcto funcionamientodesde el punto de vista fisiológico.La metodología existente en este momento permite la microin-yección de una mezcla equimolar de diferentes construccio-nes genéticas que codifican para diferentes proteínas56. Deesta forma se puede generar una línea politransgénica paradichas proteínas que podría cruzarse con otras líneas poli-transgénicas para incrementar así el número de transgenespresentes en el animal.Así mismo, se ha demostrado la posibilidad de cambiar todoel repertorio de los genes que codifican para las inmunoglo-bulinas de ratón por el repertorio de genes de inmunoglobu-lina humana, produciendo así una humanización del siste-ma inmune humoral del ratón, gracias al desarrollo detécnicas que permiten donar fragmentos de ADN humanosde tamaño de megabases en cromosomas artificiales de le-vadura (YAC) e introducirlos en la línea germinal del ratón.Es decir, este ratón es una fábrica de anticuerpos humanoscon potencial uso en terapia57. No podemos descartar queesta metodología, aplicada al cerdo, facilite la obtención deórganos humanizados para su posible uso clínico.

AgradecimientoEste trabajo ha sido financiado por la Comisión Interministerial deCiencia y Tecnología (CICYT; proyecto 1FD97-0366) y la Consejeríade Sanidad de la Comunidad Autónoma de la Región de Murcia.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Bailey LL, Nehlsen-Cannarella SL, Concepcion W, Jolley WB. Baboon-to-human cardiac xenotransplantation in a neonate. JAMA 1985; 254:3321-3329.

2. Reemtsma K, McCracken BH, Schiegel JV, Pearl M. Heterotransplanta-tion of the kidney: two clinical experiences. Science 1964; 143: 700-702.

3. Reemtsma K, McCracken BH, Schiegel JV, Pearl MA, Dewitt CW, CreechOJ. Reversal of early graft rejection after renal heterotransplantation inman. JAMA 1964; 187: 691-696.

4. Hitchcock CR, Kiser JC, Telander RL, Seijeskob EL. Baboon renal grafts.JAMA 1964; 189: 934-937.

5. Starzl TE, Marchioro TL, Peters GN, Kikpatrick CH, Wilson WEC, PorterKE et al. Renal heterotransplantation from baboon to man: experiencewith six cases. Transplantation 1964; 2: 752-776.

6. Calne RY. Organ transplantation between widely disparate species.Trans Proc 1970; 2: 550-554.

7. Cooper DKC, Ye Y, Rolf JLL, Zuhdi N. En: Cooper DKC, Kemp E, Reemtsma K, White DJG, editores. The pig as potential organ donor forman in xenotransplantation. The transplantation of organs and tissuesbetween species. Berlín: Springer, 1991; 481-500.

8. Gordon J, Scangos G, Plotkin D, Barbosa J, Ruddle F. Genetic transfor-mation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc NatlAcad Sci USA 1980; 77: 7380-7384.

9. Hogan B, Beddington R, Costantini F, Lacy E. Manipulating the mouseembryo. A laboratory manual (2.a ed.). Cold Spring Harbor LaboratoryPres, 1994.

10. Pintado B, Gutiérrez-Adán A. Obtención, aplicaciones y prospectiva delos cerdos transgénicos. Porci 1998; 45: 15-33.

11. Auchincloss H, Sachs DH. Xenogeneic transplantation. Annu Rev Immu-nol 1998; 16: 433-470.

12. Rydberg L, Hallberg E, Bjorck S, Magnusson S, Strokan V, Samuelsson BEet al. Studies on the removal of anti-pig xenoantibodies in the human byplasmapheresis/immunoadsortion. Xenotransplantation 1995; 2: 253-263.

13. Kooyman DL, McClellan SB, Parker W, Avissar PL, Velardo MA, Platt JLet al. Identification and characterization of a galactosyl peptide mimetic.Implications for use in removing xenoreactive anti-A Gal antibodies.Transplantation 1996; 61: 851-855.

14. Taniguchi S, Neethling FA, Korchagina EY, Bovin N, Ye Y, Kobayashi Tet al. In vivo immunoadsorption of antipig antibodies in baboons using aspecific Gal α 1-3 Gal column. Transplantation 1996; 62: 1379-1384.

15. Oriol R, Ye Y, Koren E, Cooper DKC. Carbohydrate antigens of pig tissuesreacting with human natural antibodies as potential targets for hyperacu-te vascular rejection in pig-to-man organ xenotransplantation. Transplan-tation 1993; 56: 1433-1442.

16. Lin SS, Parker W, Holzknecht ZE, Platt JL. Quantitative evaluation of por-cine endothelial cell antigens recognized by human natural antibodies:an analysis by Western blotting. Xenotransplantation 1996; 3: 129-137.

17. Aspeslet LJ, Chackowsky P, Sekhon H, Malcolm AJ, Mosleh Z, Koshal Aet al. Identification of porcine membrane antigens involved in the cytoto-xic response mediated by human xenoreactive antibodies. Xenotrans-plantation 1996; 3: 1-10.

18. Keams-Jonker MK, Cramer DV, Dane LA, Swesson JM, Makowka L. Hu-man serum reactivity to porcine endothelial cells after antisensee-media-ted down-regulation of GpIIIa expression. Transplantation 1997; 63:588-593.

19. Sandrin MS, Fodor WL, Mouhtouris E, Osman N, Cohney S, Rollins SA etal. Enzymatic remodelling of the carbohydrate surface of a xenogeniccell substantially reduces human antibody binding and complement-me-diated cytolisis. Nat Med 1995; 1: 1261-1267.

20. Chen C-G, Fisicaro N, Shinkel TA, Aitken V, Katerelos M, Van DenderenBJW et al. Reduction in Gal-α 1,3-Gal epitope expression in transgenicmice expressing human H-transferase. Xenotransplantation 1996; 3: 69-75.

21. Koike C, Kannagi R, Takuma Y, Akursu F, Hayashi S, Hiraiwa N et al. In-troduction of α(1,2)-fucosyltransferase and its effect on α-Gal epitopesin transgenic pig. Xenotransplantation 1996; 3: 81-86.

22. Kemp E, Kemp G, Starklint H, Larsen S. Immunosuppression with cobravenom factor, anti-platelet aggregator, and cyclosporin A in renal xeno-transplantation. Transpl Proc 1982; 14: 116.

23. Braidley PC, Dunning JJ, Wallwork J, White DJG. Prolongation of survivalof rat heart xenograft in C3-deficient guinea pigs. Transpl Proc 1994; 26:1259-1269.

24. Dalmasso AP, Vercelloti GM, Platt JL, Bach FH. Inhibition of comple-ment mediated cytotoxicity by decay accelerating factor. Potential forprevention of xenograft hyperacute rejection. Transplantation 1991; 52:530-533.

25. Langford GA, Yannoutsos N, Cozzi E, Lancaster K, Elsome K, Chen P etal. Production of pigs transgenic for human decay accelerating factor.Transpl Proc 1994; 26: 1400-1401.

26. Schmoeckel M, Bhatti FN, Zaidi A, Cozzi E, Waterworth PD, Tolan MJ etal. Orthotopic heart transplantation in a transgenic pig-to-primate model.Transplantation 1998; 65: 1570-1577.

27. Zaidi A, Schmoeckel M, Bhatti F, Waterworth P, Tolan M, Cozzi E et al.Life-supporting pig-to-primate renal xenotransplantation using geneticallymodified donors. Transplantation 1998; 65: 1584-1590.

347


3

28. Ramírez P, Chávez R, Majado M, Munitiz Y, Muñoz A, Hernández Q etal. Porcine liver supports metabolic homeostasis and prolong survival ofa baboon recipient of an orthotopic hDAF transgenic pig liver. TransProc. En prensa.

29. Diamond LE, McCurry KR, Martin MJ, McClellan SB, Oldham ER, PlattJL et al. Characterization of transgenic pigs expressing functionally activeCD59 on cardiac endothelium. Transplantation 1996; 61: 1241-1249.

30. Thorley BR, Milland J, Christiansen D, Lanteri MB, McInnes B, Moeller Iet al. Transgenic expression of CD46 (membrane cofactor protein) mini-gene: studies of xenotransplantation an measles virus infection. Eur JImmunol 1997; 27: 726-734.

31. Cowan PJ, Shinkel TA, Aminian A, Romanella M, Wigley PL, Lonie AJ etal. High level co-expression of complement regulators on vascular endo-thelium in transgenic mice: CD55 and CD59 provide greater protectionfrom human complement-mediated injury than CD59 alone. Xenotrans-plantation 1998; 5: 184-190.

32. Bach FH, Ferran C, Soares M, Wrighton CJ, Anrather J, Winkler H et al.Modification of vascular responses in xenotransplantation: inflammationand apoptosis. Nat Med 1997; 3: 944-948.

33. Hasan R, Van den Bogaerde JB, Wallwork J, White DJG. Evidence thatlong-term survival of concordant xenografts is achieved by inhibition ofantispecies antibody production. Transplantation 1992; 54: 408-413.

34. Dorling A, Stocker C, Tsao T, Haskard DO, Lechler RI. In vitro accommo-dations of immortalized porcine endothelial cells: resistance to comple-ment mediated lysis and down-regulation of VCAM expression inducedby low concentrations of polyclonal human IgG antipig antibodies. Trans-plantation 1996; 62: 1127-1136.

35. Ghosh S, May MJ, Kopp EB. NF-κB and REL proteins: evolutionarilyconserved mediators of immune responses. Annu Rev Immunol 1998;16: 225-260.

36. Ferran C, Stroka D. Adenovirus-mediated gene transfer of A20 rendersendothelial cells resistant to activation: a means of evaluating the role ofEC activation in xenograft rejection. Transpl Proc 1997; 29: 879-880.

37. Stroka DM, Badrichani AZ, Bach FH, Ferran C. Overexpression of A1, anNF-kappaB-inducible anti-apoptotic bcl gene, inhibits endothelial cellactivation. Blood 1999; 93: 3803-3810.

38. Bilbao G, Contreras JL, Gómez-Navarro J, Eckhoff DE, Mikheeva G,Krasnykh VA et al. Genetic modification of liver grafts with an adenoviralvector encoding the bcl-2 gene improves organ preservation. Transplan-tation 1999; 67: 775-783.

39. Yamada K, Sachs DH, DerSimonian H. Human anti-porcine xenogeneicT cell response: evidence for allelic specificity of mixed leukocyte reac-tion and for both direct and indirect pathways of recognition. J Immunol1995; 155: 5249-5256.

40. Chan DV, Auchincloss HJ. Human anti-pig cell-mediated cytotoxicity invitro involves non-T as well as T cell components. Xenotransplantation1996; 3: 158-165.

41. Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science 1995; 267: 1449-1456.

48

42. Bellgrau D, Gold D, Selawry H, Moore J, Franzusoff A, Duke RC. A roleof CD95 ligand in preventing graft rejection. Nature 1995; 377: 630-632.

43. Lau HT, Yu M, Fontana A, Stoeckerrt CJ. Prevention of islet allograft re-jection with engineered myoblasts expressing FasL in mice. Science1996; 273: 109-112.

44. Kang SM, Shneider DB, Lin Z, Hanahan D, Dichek DA, Stock PG et al.Fas ligand expression in islets of Langerhans does not confer immuneprivilege and instead targets them for rapid destruction. Nat Med 1997;3: 748-743.

45. Swenson KM, Ke B, Wang T, Markowitz JS, Maggard MA, Spear GS etal. Fas ligand gene transfer to renal allografts in rats: effect on allograftsurvival. Transplantation 1998; 65: 15.

46. Sata M, Walsh K. TNFα regulation of Fas ligand expression on the vas-cular endothelium modulates leukocyte extravasation. Nat Med 1998; 4:415-420.

47. Walsh K, Sata M. Is extravasation a Fas-regulated process? MolecularMedicine Today 1999; 5: 61-67.

48. Sata M, Walsh K. Endothelial cell apoptosis induced by oxidized LDL isassociated with the down-regulation of the cellular caspase inhibitorFLIP. J Biol Chem 1998; 273: 33103-33106.

49. Inverardi L, Samaja M, Motterlini R, Mangili F, Bender JR, Pardi R. Earlyrecognition of a discordant xenogeneic organ by human circulatinglymphocytes. J Immunol 1992; 149: 1416-1423.

50. Umesue M, Mayumi H, Nishimura Y, Kong Y-Y, Omoto K, Murakami Y etal. Donor-specific prolongation of rat skin graft survival induced by rat-donor cells and cyclophosphamide under coadministration of monoclo-nal antibodies against T cell receptor αβ and natural killer cells in mice.Transplantation 1996; 61: 116-124.

51. Seebach JD, Comrack C, Germana S, LeGuern C, Sachs DH, DerSimo-nian H. HLA-Cw3 expression on porcine endothelial cells protectsagainst xenogeneic cytotoxicity mediated by a subset of human NK cells.J Immunol 1997; 159: 3655-3661.

52. Sasaki H, Xu XC, Smith DM, Howard T, Mohanakumar T. HLA-G expres-sion protects porcine endothelial cells against natural killer cell-mediatedxenogeneic cytotoxicity. Transplantation 1999; 67: 31-37.

53. Soares MP, Lin Y, Anrather J, Csizmadia E, Takigami K, Sato K et al. Ex-pression of heme oxygenase-1 can determine cardiac xenograft survival.Nat Med 1998; 4: 1073-1077.

54. Starzl TE, Fung J, Tzakis A, Todo S, Demetris AJ, Marino IR et al. Ba-boon-to-human liver transplantation. Lancet 1993; 341: 65-71.

55. Wrighton C, Kopp CW, McShea A, Veir H, Bach FH. High level of func-tional human thrombomodulin in cultered porcine aortic endothelialcells. Transpl Proc 1995; 27: 288-289.

56. Yélamos J, Klix N, Goyenechea B, Lozano F, Chui YL, González-Fernán-dez A et al. Targeting of non-Ig sequences in place of the V segment bysomatic hypermutation. Nature 1995; 376: 225-229.

57. Neuberger M, Brüggeman M. Mice perform a human repertoire. Nature1997; 386: 25-26.

Documents

Animales modificados genéticamente como donantes de órganos en xenotrasplante