ANIMALES TRANSGÉNICOS

Muchas generaciones de cruces selectivos son necesarias para mejorar genéticamente el ganado y otros animales domésticos de rasgos tales como la producción de leche, las características de la lana, la tasa de ganancia PESO, y la puesta de huevos de frecuencia. En cada generación, los animales con características de rendimiento superior se utilizan como reproductores. Con el tiempo, los animales alta producción se desarrollan como líneas de mejora más o menos puro. Esta combinación de apareamiento y de selección, aunque el tiempo lento y costoso, ha sido un éxito excepcional. Hoy en día, casi todos los aspectos de las bases biológicas de la producción ganadera se pueden atribuir a este proceso. Sin embargo, una vez que la línea genética eficaz se ha establecido, se hace difícil introducir nuevos rasgos genéticos por métodos de cría selectiva. Por ejemplo, una cepa con un recién descubierto, genéticos muy valiosos también pueden llevar genes deletéreos que después de cruzar, disminuiría el actual genéticamente determinado los niveles de producción. Por lo tanto, un programa completamente nuevo de cruces multigeneracionales con los procedimientos de selección riguroso tiene que ponerse en marcha para garantizar que la línea de reproducción nueva conserva tanto sus atributos originales y los nuevos rasgos.

Hasta hace poco, la cría selectiva era la única manera de mejorar las características genéticas de los animales domésticos. Sin embargo, la combinación de la transferencia exitosa de genes en células de mamíferos y la posibilidad de crear animales genéticamente idénticos mediante el trasplante de núcleos de células somáticas en Huevos enucleado (transferencia nuclear o clonación nuclear) llevó a los investigadores a considerar la posibilidad de genes individuales, o grupos de genes funcionales en el ADN cromosómico de los organismos superiores. Conceptualmente, la estrategia utilizada para lograr este fin simple. (1) A los genes clonados se inyecta en el núcleo de un óvulo fecundado. (2) Los huevos inoculados fertilizados se implantan en una hembra receptiva, porque culminación satisfactoria del desarrollo embrionario de mamíferos no está fuera Posible de una mujer. (3) Algunos de los descendientes derivados de los huevos implantados serán portadoras del gen clonado en todas sus células. (4) Los animales con el gen clonado integrado en las células de línea germinal son criados para establecer nuevas líneas genéticas.

Este enfoque tiene muchas aplicaciones prácticas. Si, por ejemplo, el producto del gen inyectado estimula el crecimiento, los animales que adquieren este gen deben crecer más rápido y requieren menos alimento. Una mejora de la eficiencia de la alimentación en un pequeño porcentaje tendría un profundo Impacto n la reducción del costo de la producción de cualquiera de res o cerdo.

Durante la década de 1980, con un esfuerzo considerable, la idea de la manipulación de los animales en general, mediante la introducción de genes en los óvulos fertilizados se convierte una realidad. Como ocurre con muchas nuevas empresas científicas, un conjunto de términos fue creado para facilitar la comunicación. Por ejemplo, un animal cuya composición genética ha sido alterada por la adición de extranjeros (exógena)) de ADN se dice que es transgénico. El ADN que se introduce se llama un transgen, y el proceso general que se llama la tecnología transgénica, o transgénesis.

El mejoramiento genético de los organismos multicelular con la introducción de transgenes relevante os sólo poco a poco se dio cuenta. En el ínterin, sin embargo, la transgénesis se ha convertido en una poderosa técnica para el estudio de los problemas fundamentales de la expresión de genes de mamíferos y el desarrollo, para el establecimiento de sistemas de modelos animales de enfermedades humanas, y para el uso de la glándula mamaria para producir proteínas farmacéuticamente importantes en la leche. Con esta última aplicación en

mente, el término "pharming" fue acuñado para expresar la idea de que la leche de granja transgénicos ("farmacias") los animales pueden ser una fuente de proteína humana auténtica medicamentos o productos farmacéuticos. Hay una serie de razones por las cuales debe ser la glándula mamaria utiliza de esta manera. La leche es un líquido renovable, segregada del cuerpo que se produce en grandes cantidades y se pueden recoger con frecuencia sin daño para el animal. Una proteína de nuevos fármacos que se limita a la glándula mamaria y secreta en la leche no debe tener efectos secundarios en los procesos fisiológicos normales del animal transgénico y deben ser sometidos a modificaciones postraduccionales que al menos se asemejan a los de los seres humanos. Por último, la purificación de una proteína de la leche. Que contiene sólo un pequeño número de proteínas diferentes (tabla 19.1), debe ser relativamente sencillo.

Tabla 19.1 proteína composición de la leche de ganado vacuno y ovino.

La concentración de proteínas en la leche de:Ganado ovino Caseína (g / L)

αs1-caseína 10,0 12,0αs2-caseína 3,4 3,8

k-caseína 3,9 4,6β-caseína 10,0 16,0

Ganado ovinoProteínas de suero de los principales

α-lactoalbúmina 0,8 1,0β-lactoalbúmina 3,0 2,8Otras proteínas

La albúmina sérica 0,4 Desconocido Lisozima traza Desconocida Lactoferrina Desconocido 0.1

Inmunoglobulinas 0.7 Desconocido

Los ratones transgénicos: Metodología

La tecnología transgénica ha sido desarrollada y perfeccionada en el ratón de laboratorio. Desde la década de 1980, cientos de genes diferentes se han introducido en diferentes cepas de ratón. Estos estudios han contribuido a la comprensión de la regulación génica, desarrollo de tumor, especificidad inmunológica, la genética molecular del desarrollo, y muchos otros procesos biológicos de interés fundamental. Los ratones transgénicos también han desempeñado un papel en el examen de la viabilidad de la producción industrial de los medicamentos terapéuticos humanos por los modelos domésticos de numerosas manifestaciones genéticas de enfermedades humanas. Para la transgénesis, el ADN puede ser introducido en ratones (1) los vectores retrovirales que infectan a las células de un embrión en fase inicial antes de la implantación en una hembra receptiva, (2) microinyección en el núcleo del espermatozoide ampliada (pronúcleo masculino) de un óvulo fecundado, o (3) introducción de la ingeniería genética en células madre embrionarias de un embrión en fase inicial de desarrollo antes de la implantación en una hembra receptiva.

Método de vectores retrovirales

De los diferentes métodos de transferencia génica, el uso de vectores retrovirales (fig. 19.1) tiene la ventaja de ser un medio eficaz para la integración de los transgenes en el genoma de una célula receptora. Sin embargo, estos vectores pueden transferir sólo pequeños trozos (-8 kilibases (kb)) de ADN, que, debido a la restricción de tamaño, pueden carecer de las secuencias adyacentes esenciales para la regulación de la expresión de la transgénica.Hay un inconveniente importante para el uso de vectores retrovirales. A pesar de estos vectores están diseñados para ser de replicación defectuosa, el genoma de la cepa retroviral (Herpes virus) que se necesita para crear grandes cantidades de ADN del vector se puede integrar en el núcleo mismo del transgén. A pesar de precauciones especiales, los retrovirus ayudante de tensión puede ser producida por el organismo transgénico. En consecuencia, para aplicaciones en las que sea un producto comercial es ser sintetizados por el organismo transgénico o el organismo transgénico se va a utilizar como alimento, es absolutamente necesario que no haya contaminación retroviral. Por lo tanto, ya que existen otros métodos, los vectores retrovirales son rara vez se utiliza para la creación de animales transgénicos que tienen un uso final comercial.

Método de Microinyección de ADN

Debido a las desventajas del método de vectores retrovirales, la microinyección de ADN es el método preferido para la producción de ratones transgénicos. Este procedimiento se realiza de la siguiente manera (fig. 19.2). (1) El número disponible de los óvulos fertilizados que han de ser inoculados por microinyección se incrementa mediante la estimulación de las hembras donantes para superovular. Los ratones hembra que se les da una inyección inicial de suero de yegua preñada y otra de inyección, unas 48 horas más tarde, de la gonadotropina coriónica humana. Un ratón superovuladas produce alrededor de 35 huevos en vez de la normal de 5 a 10. (2) Las hembras se aparean superovuladas y luego asesinados. Los huevos fertilizados son expulsados de sus oviductos. (3) La microinyección de los óvulos fertilizados por lo general se produce inmediatamente después de su recolección. La construcción del transgen microinyección es a menudo en una forma lineal y sin procariótico secuencias de vectores de ADN.

En los mamíferos, después de la entrada del espermatozoide en el óvulo, tanto en el núcleo del espermatozoide (pronúcleo masculino) y el núcleo mujeres son entidades separadas. Después de que el núcleo

femenino completa su meiosis para convertirse en un pronúcleo femenino, luego de la fusión nuclear (cariogamia) se produce. El pronúcleo masculino, que tiende a ser mayor bronceado el pronúcleo femenino, se puede encontrar mediante el uso de un microscopio de disección. El huevo entonces se puede maniobrar, orientado y sostenido por micromanipulación, mientras que el ADN es microinyección. En un buen día, varios cientos de pronúcleos masculino puede ser inoculada.Después de la inoculación, 25-40 huevos se implantan microcirugía en una madre adoptiva que se ha hecho pseudopreñadas por ser acoplado a un hombre sometido a la vasectomía. En ratones, la cópula es la única forma conocida para preparar el útero para su implantación. En este caso, porque el

varón no tiene espermatozoides, ninguno de los huevos de la madre de crianza es fertilizado. La madre adoptiva se entrega las crías de los huevos inoculados cerca de 3 semanas después de la implantación.

fig. 19.1 El establecimiento de ratones transgénicos con vectores retrovirales. El estadio de división de embriones, por lo general en la fase de ocho células, está infectado con un retrovirus defectuoso que lleva un transgén. Las mujeres implantadas (las madres de crianza) dar a luz a crías transgénicas. Los apareamientos se llevan a cabo para determinar que los cachorros tienen el transgén en las células de la línea germinal.Líneas transgénicas se pueden establecer a partir de estos animales transgénicos fundadores.

Fig. 19.2 El establecimiento de ratones transgénicos mediante microinyección de ADN. Los huevos se obtienen de las hembras donantes que han sido inducidos a superovular y se aparearon con machos. Muestras purificadas de la construcción transgénica está microinyección en el pronúcleo masculino de un óvulo fecundado. Las mujeres implantadas (las madres de crianza) dar a luz a cachorros transgénicos de la cual las líneas transgénicas se pueden establecer.

Para la identificación de los animales transgénicos, el ADN de una pequeña pieza de la cola se puede probar ya sea por hibridación Southern blot o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar la presencia del transgén. Un ratón transgénico puede ser acoplado a otro ratón para determinar si el transgén está en la línea germinal del animal fundador. Posteriormente, la progenie se puede criar entre sí para formar pura (homocigotos) las líneas transgénicas.El procedimiento, aunque aparentemente simple, requiere la coordinación de esperar, a lo sumo, sólo el 5% de los huevos inoculados a desarrollar en los animales vivos transgénicos (fig. 19.3). Ninguno de los pasos en el procedimiento es 100% eficiente, en consecuencia, un gran número de huevos fertilizados microinyección debe ser utilizado. Con el sistema de ratón, por ejemplo, alrededor del 66% de los óvulos fecundados sobrevivir el procedimiento de inyección, aproximadamente el 25% de los huevos implantados se desarrollan en los cachorros, y aproximadamente el 25% de los cachorros son transgénicos. Así, desde 1000 inoculados óvulos fecundados, 30 a 50 crías transgénicas se producen. Además, con este método, el ADN inyectado se integra en sitios al azar dentro del genoma, y, a menudo varias copias del ADN inyectado se incorporan en un solo lugar. No todos los cachorros

transgénicos tendrán la característica apropiada. En algunos individuos, los transgenes no se pueden expresar por el sitio de integración, y en otros, el número de copias puede ser excesivo y puede conducir al sobre-expresión, lo que altera la fisiología normal del animal. A pesar de la

ineficiencia general, se ha convertido en rutina para el uso de microinyección de ADN de los pronúcleos masculino para crear líneas de ratones portadores de transgenes funcionales.

Fig. 19.3 La eficiencia global del proceso de transgénesis después de la microinyección de ADN. Todos los óvulos fecundados (100%) de los

bovinos, porcinos, ovinos, y de dar a luz a los hijos es mucho menor, y sólo el 5% o menos de los huevos tratados se progenie transgénica.

Fig. 19.4 El establecimiento de ratones transgénicos con células madre embrionarias genéticamente modificadas. Un cultivo de células ES se inicia a partir de la masa celular interna de un blastocisto de ratón. Las células ES son transfectadas con un transgén. Después de un crecimiento, las células transfectadas se identifican ya sea por el procedimiento de selección positiva-negativa o el análisis de PCR. Las poblaciones de células transfectadas pueden ser cultivadas y se inserta en blastocitos, que son entonces implantados en madres adoptivas.Líneas transgénicas pueden ser establecidos por las cruces de ratones fundadores que llevan el transgen en sus líneas de germen.

Método de Diseñado celdas madre embrionarias

Las células de la etapa de blastocisto de un embrión de ratón en desarrollo pueden proliferar en cultivo celular y todavía conservan la capacidad de diferenciarse en otros tipos celulares, incluyendo células de línea germinal, después de haber sido reintroducido en otro embrión blastocisto. Estas células se llaman pluripotentes células madre embrionarias (ES) las células. Cuando en la cultura, las células ES pueden ser fácilmente manipuladas genéticamente, sin alterar su pluripotencia. Con este sistema, por ejemplo, un transgén funcional puede ser integrado en un sitio específico dentro de un gen prescindible en el genoma de células madre embrionario. Luego, las células de ingeniería genética pueden ser seleccionados, que se cultiva y utiliza para generar animales transgénicos (fig. 19.4). De esta manera, la aleatoriedad de la integración que es inherente a la microinyección de ADN y sistemas de vector retroviral se evitafirmado a integrar dentro de una localización cromosómica específica, algunas células se han integrado en el ADN no-objetivo (espurio) los sitios, mientras que en otras células, se producirá la integración en el blanco (correcto) del sitio. Por otra parte, en la mayoría de las células madre embrionarias, el ADN de entrada no debe integrarse en todos. Para enriquecer las células con el ADN integrado en el sitio de destino, un procedimiento llamado positivo-negativo de selección se lleva a cabo. Esta estrategia utiliza la selección positiva de células que han integrado, en cualquier vector de ADN en su genoma y la selección negativa en contra de la secuencia de ADN del vector que se integra en los sitios falsos.

Los lugares de destino debe estar ubicado en una sección de ADN genómico que codifica sin productos de primera necesidad, de modo que después de la integración de la entrada de ADN, no hay interferencia con las funciones de desarrollo o celular. Por otra parte, es esencial que los transgenes se integraran en una parte del genoma que no impide que se transcriba. Los investigadores están

buscando continuamente este tipo de sitios.

Un vector de ADN de selección para el procedimiento de selección positiva-negativa por lo general contiene (1) a dos cuadras de secuencias de ADN (HB1 y HB2) que son homólogas a las regiones por separado del sitio de destino, (2) del transgén, lo que le conferirá una nueva función enel receptor, (3) una secuencia de ADN que codifica para la resistencia al compuesto G-418 (Neo), y (4) dos genes diferentes para la timidina quinasa (TK1 y TK2) de virus herpes simplex tipos 1 y 2 (HSV- TK1 y el VHS-TK2) (fig. 19.5 A). La disposición de estas secuencias es clave para el proceso de selección positiva-negativa. Entre los dos bloques de ADN que son homólogas a las del sitio de destino son los genes para el transgén y G-418 de resistencia (Neo'gene). Fuera de cada uno de los bloques son los genes homólogos de HSV-TK1 y TK2 HSV-. Si la integración se produce a un sitio falso, es decir, no en HB1 y HB2, ya sea uno o ambos de los genes de HSV-tk tienen una alta probabilidad de ser integrados junto con las otras secuencias (fig.19.5 A). Alternativamente, si el evento de integración se debe a la recombinación homóloga de un cruce doble en el sitio de destino, los genes de HSV-tk serán descartados y sólo el transgén y la Neo'gene se incorpora en el genoma (fig. 19.5B).Cuando las células transferidas son cultivadas en la presencia de G-418, todas las células que carecen de la Neo'gene serán asesinados. Por lo tanto, sólo las células con el ADN integrado van a sobrevivir, es decir, estas células son seleccionadas positivamente. Si el ganciclovir compuesto se añade al mismo tiempo, como el G-418, las células que expresan la timidina kinasa será asesinado por la timidina cinasa convierte ganciclovir a los compuestos tóxicos que destruyen las células, es decir, estas células son seleccionados negativamente. Las células más probabilidades de sobrevivir a este esquema de selección de dos serán los que tienen el ADN integrado en el sitio de destino. Aunque no es infalible, el método de selección positiva-negativa enriquece una población de células ES de las células que contienen un transgén en una localización cromosómica específica.

Fig. 19.6 Las pruebas de integración y no específicos de recombinación homóloga en células transfectadas por PCR. A. Después de la integración no específica del vector de ADN, uno de los iniciadores (P2) no es capaz de hibridar con un sitio de cromosomas que es una distancia predeterminada de la página de hibrida a un segmento único (EE.UU.) del ADN de entrada que no ocurren en el ADN cromosómico de las células receptoras.

B. recombinación homóloga entre las secuencias de ADN (HB1 y HB2) de la entrada de ADN que son complementarios a los sitios de cromosomas (CS1 y CS2) crea las regiones de hibridación para P1 y P2, que son una distancia predeterminada. Amplificación por PCR genera un fragmento de ADN de un tamaño específico que puede ser visualizado por electroforesis en gel. En este caso, el transgén (TG), que se encuentra entre los bloques homóloga (HB1 y HB2), está integrado en una localización cromosómica específica.

Una forma más directa para detectar las células ES que llevan a un transgén en un sitio cromosómico objetivo es el uso de PCR. En este caso, el vector de ADN dirigido contiene dos bloques de ADN que son homólogas a las del sitio de destino, una a cada lado de ambos el transgén y un clonado bacteriana o sintético (único) de secuencias de ADN que no está presente en el genoma del ratón ( fig. 19,6). Después de la transfección de células madre embrionarias, las células se agrupan y las muestras son seleccionadas por PCR. Uno de los primers (P1) para PCR es complementario a una secuencia dentro de la secuencia de ADN clonado bacteriana o sintético (único) del vector de integración. La imprimación otros (P2) es complementaria a una secuencia de ADN que forma parte del cromosoma adyacente a la región de uno de los bloques homóloga de ADN. Si la integración se encuentra en un sitio aleatorio, la predicción de producto amplificado de ADN no se sintetiza (fig. 19.6 A. Sin embargo, si el sitio específico de la integración se produce, la PCR amplifica un fragmento de ADN de tamaño conocido (fig. 19.6 B). En este Así, las piscinas de células con células madres embrionarias que

contiene el gen deseado en el sitio de destino se pueden identificar. Por subcultivo de estas agrupaciones, líneas celulares de llevar a la integración específica de sitio puede ser establecida.

Células madre embrionarias en libros de un transgén integrado puede estar cultivadas e insertadas en embriones de fase de blastocisto, embriones y estos se pueden implantar en pseudopreñadas madres adoptivas. Líneas transgénicas se han establecido en el apareamiento de la descendencia que lleva el transgen en sus líneas de germen. Entonces, si es necesario, compañeros de camada que llevan a un transgén en sus líneas de germen se cruzan para producir ratones que son homocigotos para el transgén.

No sólo puede un transgén se inserta en un sitio determinado cromosoma por recombinación homóloga en células madre embrionarias para ofrecer una nueva función, sino también un gen de ratón específico puede ser objeto de alteración por la incorporación de una secuencia de ADN, generalmente un gen marcador de selección, en su región codificadora (fig. 19.7). Uno de los objetivos de la interrupción de genes específicos (eliminación de genes) es determinar las consecuencias del desarrollo y fisiológicos de la desactivación de un gen particular. Otro es la esperanza de que una línea transgénica con un gen específico con discapacidad puede ser utilizado como un sistema modelo para estudiar la patología molecular de una enfermedad humana.

Fig. 19.7 Gene interrupción por objetivo recombinantes homólogos. El vector de destino portador de un gen marcador de selección (SMG) con secuencias de ADN de flanqueo que son homólogas a las regiones de recombinación (líneas discontinuas) interrumpe (por ejemplo, golpea a) del gen objetivo.

Por ejemplo, la inactivación del gen de la rodopsina del ratón por la interrupción de genes específicos conduce a la

enfermedad se asemeja a la retinitis pigmentosa humana. Por lo tanto, el progreso de la degeneración de la retina y los efectos de posibles agentes terapéuticos que, o bien puede retrasar o bloquear la retinopatía inducida genéticamente pueden ser estudiados usando el ratón knock-out rodopsina. Hasta la fecha, más de 250 tipos diferentes de ratones knock-out han sido creados como modelos animales para el estudio de diversas anomalías humanos.

La modificación genética con el sistema de recombinación Cre-loxP

Los ratones transgénicos por lo general llevan un transgén o modificación de genes (gene knockout) en todas sus células. Sin embargo, es útil contar con un proceso que selectivamente regula la expresión de un gen dentro de un determinado tejido somático tipo de célula. El sistema de recombinación Cre-loxP, que se deriva de los elementos genéticos del bacteriófago P1, ha sido adaptado para este fin.

Morfológicamente, bacteriófago P1 parece bacteriófago y. Los dos tienen una cabeza, cola y fibras de la cola. El genoma P1 es de aproximadamente 100 kb de longitud. Después de la introducción en Escherichia coli, el genoma lineal P1 forma un círculo. El ADN circularizado P1 actúa como una plantilla para la replicación. Y, dependiendo de qué conjunto de génesis activa, la forma circular o es mantenido como un plásmido o se utiliza

como plantilla para la producción de genomas virales en el ciclo lítico. En raras ocasiones, un genoma circularizado P1 integra en el cromosoma de E. coli. Circularización y la integración del genoma P1 están mediadas por el producto del gen cre (recombinación circularización (recombinasa Cre) de proteínas), que específicamente se unirá y se recombina el ADN de loxP (locus de cruzar (x) en P1) sitios.

Fig. Un 19,8 loxP sitio con las repeticiones en la dirección opuesta (A) y la misma orientación (B). Las flechas indican la dirección de las secuencias repetitivas.

A cosists sitio loxP de dos de 13 pares de bases (pb) repeticiones invertidas que están separadas entre sí por una secuencia de espaciador de 8 pb (Fig. 19.8). En pocas palabras, Cre-loxP recombinación implica la unión de dos sitios loxP remoto que tienen cada uno dos moléculas obligado Cre recominase, la escisión por la recombinasa Cre en las regiones espaciadoras entre las secuencias de repetición, y el intercambio y la unión de las cadenas de ADN para formar ADN recombinado moléculas. El resultado del evento de recombinación depende de la orientación de las repeticiones de los sitios loxP. Si se repite en dirección opuesta, entonces invierte el intercambio de ADN entre los dos sitios loxP. Si se repite en la misma orientación. A continuación, la secuencia de intervención se elimina (escinde). Los elementos de repetición de bacteriófago P1 son, naturalmente, que la orientación opuesta. El sistema de recombinación Cre-loxP puede funcionar cuando los sitios loxP están muy separados. Por ejemplo, los dos sitios loxP que son esenciales para la circularización de un genoma P1 son alrededor de 100 kilobases (kb) de distancia. La especificidad del sistema Cre-loxP es absoluta debido a que la recombinasa Cre actúa exclusivamente en los sitios loxP.

Sobre la base de estas características, el sistema Cre-loxP fue desarrollado para la producción de células específicas de modificaciones de genes en células de ratón. Como primer paso en la estrategia general, el gen de la creación está aislado y puesto bajo el control de un promotor tejido-específico. Los ratones transgénicos con el gen de la construcción de creación se establecen, y la especificidad tisular de la actividad Cre está confirmada. A continuación, un sitio loxP con secuencias repetidas en la misma dirección se insertan a ambos lados de una secuencia de ADN clonado (s). Un segmento de ADN que está flanqueado por sitios loxP se dice que es "floxed". Construir Afloxed que puede incluir un gen marcador de selección está integrado en un sitio de

cromosomas de las células embryonicstem por recombinación homóloga. Estas células se seleccionan, cultas, y se utiliza para establecer una línea transgénica.Entonces, un poco con el ratón transgénico en tejidos específicos cre transgén está acoplado con un ratón transgénico con la construcción floxed. El ADN entre los dos sitios loxP se elimina después de la creación del transgén se expresa en dos organismos transgénicos (fig. 19.9). De esta manera, las consecuencias biológicas de la pérdida de actividad de un gen en un tejido específico puede ser

monitoreado. El sistema de recombinación Cre-loxP también se puede utilizar para activar un gen de entrada en un tejido específico. En este caso, la construcción floxed contiene una secuencia que impide construir transcripción. Esta se inserta entre el promotor y la secuencia codificante de un gen en particular.Cuando el transgén creación se expresa en ratones con esta construcción floxed, la secuencia de ADN que bloquea la transcripción se extirpa, permitiendo así que el gen se exprese (fig. 19.10).

Fig. 19.9 Cre-loxP recombinaciones sistema de desactivación de un gen en un tipo celular específico. (1) El gen de la creación está bajo el control de un promotor específico de células (PC) y se estableció como un transgén en una línea de ratones. (2) Un sitio loxP se clona a cada lado de un exón. La construcción de los sitios loxP se introduce en un sitio de cromosomas de las células ES mediante recombinación homóloga, y una línea de ratones transgénicos se ha establecido con estas células. Las dos líneas transgénicas se cruzan. (3) En las células, donde ambas construcciones están presentes, la recombinasa Cre (círculo rojo) se sintetiza, y dos moléculas de Cre se unen a cada sitio loxP (flecha punteada). (4) Los sitios loxP se recombinan (barra de color negro), lleva a la escisión y la circularización de un sitio loxP y el exón uno (exón 2) que finalmente se degrada y la formación de un gen inactivado que se conserva en el cromosoma. Una flecha en ángulo recto indica la transcripción.

La tecnología Cre-loxP se ha utilizado ampliamente para estudiar las consecuencias biológicas de la inactivación de genes específicos de tejido, con el objetivo de establecer modelos de enfermedades humanas.Por ejemplo, la eliminación selectiva de los genes kinesin-II, que se expresa exclusivamente en las células fotorreceptoras de la retina, lleva a una acumulación de opsina y arrestina y eventualmente a la muerte celular. Este resultado imita los aspectos de la retinitis pigmentosa hereditaria en los seres humanos y pueden ser utilizados para estudios detallados de los efectos fisiopatológicos en la retina.

Peg 606, Figura 19.10: cre-LOX sistema de recombinación P para la activación de un transgén en un tipo celular específico. (1) El gen de la creación está bajo el control de un promotor específico de células (PSA) y se estableció como un transgén en una línea de ratones. (2) Un fragmento de ADN con sitios loxP que flanquean una secuencia de terminación de la transcripción (caja rayada) se clona entre un promotor (p) y el primer exón (exón 1) de un gen. (3) La construcción de los sitios loxP se introduce en un sitio de cromosomas de las células ES mediante recombinación homóloga, y una línea de ratones transgénicos se ha establecido con estas células. Las dos líneas transgénicas se cruzan. En las células, donde ambas construcciones están presentes, la recombinasa Cre (círculo rojo) se sintetiza, y dos moléculas de creación se unen a cada sitio loxP (flecha punteada). (4) Los sitios loxP se recombinan (barra de color negro), lleva a la escisión y la circularización de un sitio loxP y una secuencia de terminación de la transcripción que finalmente se degrada y la formación de un transgén transcripcionalmente activo que se mantiene en el cromosoma. En ángulo recto flechas indican la transcripción, y barras paralelas verticales indican la terminación de la transcripción.

Aberraciones cromosómicas grandes como las eliminaciones también se pueden crear con el sistema Cre-loxP. En los seres humanos, una gran supresión en el cromosoma 22 se asocia con el síndrome de Di George (DGS), que tiene una disfunción cardiovascular como una característica importante. No se sabe si la DGS se debe a la pérdida de un gran número de genes o los más grandes. Para determinar la base de la DGS, una gran deleción del cromosoma de ratón que es comparable (syntenic) en el cromosoma humano 22 se generó con la estrategia de escisión cre-loxP. Los ratones con esta pérdida síntomas que se asemejan a los SGD.Por otra parte, cuando un transgén por un factor de transcripción cardiovasculares específicos de esta región se introdujo en estos ratones, los efectos DGS-como fueron parcialmente superadas, lo que sugiere que la pérdida de

Transgénesis con alta capacidad de Vectores

En general, los transgenes están ADN complementario (ADNc), los genes pequeños (≤ 20kb) o partes de genes. A menudo, están mal expresadas ADNc en células de mamíferos. Además, cuando el ADN genómico se utiliza para la transgénesis, importante de genes específicos de secuencias reguladoras que se encuentran aguas arriba o aguas abajo del gen rara vez se conservan como parte de la inserción. Por otra parte, genes completos y complejos de múltiples genes (≤ 100kb) son demasiado grandes para los vectores convencionales.

Por estas razones, los vectores de alta capacidad (por ejemplo, los cromosomas bacterianos, P1 artificial derivado del bacteriófago, mamíferos y levaduras [BAC, PAC, MAC, y YAC, respectivamente]) que llevan el ADN genómico que van desde 100to> 1.000 kb han ha utilizado para la transgénesis.

Una serie de ratones transgénicos que han sido producidos por la microinyección del pronúcleo del óvulo fecundado o transfección de células madre embrionarias con YAC que llevan ya sea una serie de genes relacionados o un gen muy grande. Estos organismos han sido utilizados para estudiar los procesos de desarrollo, como modelos de enfermedades humanas, y para la producción de agentes terapéuticos humanos. Por ejemplo, los ratones transgénicos con el grupo de genes humanos β-globina, que abarca alrededor de 250 kb y contiene cinco genes diferentes globina funcional, expresar estos genes en una manera específica de tejido y el tiempo dependen-que corresponde a la especificidad del sitio y el patrón temporal en los seres humanos .. Esta coincidencia se debe a que el ADN de flanqueo que contiene la región promotora y otros elementos reguladores importantes.

La producción de los ratones que sólo sintetizar anticuerpos humanos es otro ejemplo notable de la transgénesis YAC. En teoría, los anticuerpos monoclonales pueden ser agentes eficaces para la disminución de la proliferación de las células cancerosas y como un medio para el tratamiento de otras enfermedades humanas. Sin embargo, es imposible generar anticuerpos monoclonales humanos de forma rutinaria. También, por desgracia, los anticuerpos monoclonales de roedores son inmunogénicas para los seres humanos. Elaborar estrategias de ADN recombinante se han ideado para "humanizar" los anticuerpos monoclonales de roedores existentes hasta el punto en el contenido del ratón es de 5 a 10% de la molécula de anticuerpo total. En muchos casos los anticuerpos produce por este método de trabajo intensivo tienen una baja afinidad por un antígeno en particular y, en ocasiones puede causar una reacción inmunológica en los seres humanos. Además, cada anticuerpo monoclonal que tiene la promesa como agente terapéutico debe ser humanizado. Un sistema más accesible para la generación de un amplio espectro de completa (100%) los anticuerpos humanos a partir de hibridomas sería un avance tecnológico de bienvenida.

La formación de anticuerpos naturales es una maravilla biológica. Un anticuerpo es una proteína tetramérica con dos pares de cadenas diferentes. Una de las cadenas se llama pesado (H) de la cadena, y la otra es una luz (L) de la cadena. Los términos "heavy" y "luz" se refieren a la diferencia de las masas moleculares de las subunidades de anticuerpos. La información genética de una determinada cadena H es creado por reordenamientos somáticos del ADN de la variable (VH) Diversidad (DH), unión (JH) y constantes (CH) segmentos de ADN (dominios) en una célula B. Hay dos tipos diferentes de cadenas L de anticuerpo (λ, k) que se codifican después de reordenamientos de ADN de su propia variable (Vλ y Vk), unión (Jλ y JK), y la constante de dominios (Cλ y Ck). Una sola célula B sintetiza un tipo de molécula de anticuerpo que tiene un conjunto único de los segmentos combinados que codifica una novela de la cadena H y sea un λ reorganizar o reordenar la cadena de k.

El repertorio genético para la formación de la gran cantidad de diferentes cadenas de anticuerpos humanos H se compone de alrededor de 95 segmentos VH, 30DH segmentos, segmentos 6JH, y 5 principales constante (Cα, CΥ, Cδ y Cμ) de dominio ... (Ck) secuencia (fig.19.11). El H y loci k son cada gen de 1 a 1,5 megabases (Mb) de longitud. Para crear un ratón transgénico que es capaz de sintetizar una amplia gama de diferentes anticuerpos humanos, el endógeno del ratón H y L de la cadena de genes deben ser inactivados, y YAC con un gran número de elementos de H y L de la cadena de ADN de cada gen de la inmunoglobulina humana deben ser insertados en el ADN cromosómico de este ratón.Para cumplir con este fin, un grupo de investigadores de eliminar por separado los segmentos de unión de los H del ratón y la secuencia de ADN Ck, y luego, después de la cría de estos ratones knock-out, los hijos que no fueron capaces de sintetizar los anticuerpos de ratón fueron identificados. A continuación, dos YAC fueron identificados: uno lleva a una pequeña parte de la agrupación de genes humanos de la cadena H que incluye cuatro segmentos VH, DH 16 segmentos, segmentos 6JH, CΥ y Cμ, y la otra lleva a un grupo k gen humano que tenía 4 VK segmentos, 5 segmentos JK y CK. Cada YAC tenían un gen marcador que se utiliza para seleccionar células madre embrionarias después de la transfección mediante la fusión de un esferoplasto levadura con una llamada ES. La integridad de cada inserto incorporada se determinó por PCR. Los blastocistos fueron inyectados con las células que transportan ya sea la H o inserta la cadena de k, y de los organismos fundadores fueron identificados por PCR. Estos ratones transgénicos fueron criados por separado a los ratones con H inactivada, el ratón y el gen de la cadena de k, y la descendencia de estos apareamiento se aparearon entre sí para establecer doble knock-out y ratones inserción doble, es decir, animales que carecían de ratón funcional de la cadena H y k gen y llevó a los humanos que producen anticuerpos ratones con diversos antígenos, hibridomas se generaron y los anticuerpos monoclonales fueron examinados. Aunque los anticuerpos se producen contra los antígenos de los ratones no eran capaces de la generación de una completa gama de anticuerpos, debido al número limitado de segmentos H y k variable de la cadena en cada inserción. Esta restricción fue superada por la construcción de los YAC con más humano H y los segmentos de k variables.

A YAC-1000 kb que lleva 66 segmentos VH, los segmentos de 30DH, segmentos 6JH, Cμ, CΥ y Cδ fue formado por la combinación de segmentos de otros cuatro YAC humanos de la cadena H. Del mismo modo, un YAC de 800 kb con 32 segmentos Vk, 5 segmentos JH, y Ck creado a partir de tres YAC que lleva a los diferentes segmentos Vk.Estas construcciones se introdujeron en las células ES, y ratones transgénicos que sintetizan anticuerpos humanos sólo se establecieron con el tiempo.

Estos ratones transgénicos producen una amplia gama de anticuerpos humanos contra todos los antígenos. Para la validación, la "productora de anticuerpos humanos" ratones transgénicos fueron inmunizados con tres antígenos diferentes, y en cada caso, los hibridomas secreta un anticuerpo monoclonal humano que tenía una fuerte afinidad para el antígeno inmunizante. En estudios con animales, un anticuerpo monoclonal humano que se deriva de un ratón transgénico que se une al receptor del factor de crecimiento epidérmico bloquea con eficacia la proliferación de tumores humanos que sobre-expresan esta proteína. Por otra parte, en un ensayo clínico en humanos, un ratón derivado de anticuerpo monoclonal humano no era inmunogénica. Es muy probable que este sistema transgénico se usa habitualmente para desarrollar anticuerpos monoclonales humanos terapéuticos. Una versión comercializada del ratón-humano productoras de anticuerpos ha sido designado como el XenoMouse.

Figura 19.11: Representación esquemática de los genes de inmunoglobulinas K y H humanos. A. Germen versión de línea de la cadena k genes de inmunoglobulinas. La línea discontinua

representa un conjunto contiguo de dominios que no se muestran. Un gen k cadena funcional como VK8-Jk4-Ck se forma en una de las células B después de una serie de reordenamientos de ADN que combinan esta inmunoglobulina. B. Germen versión de la línea del gen de la inmunoglobulina H de la cadena. Las líneas discontinuas representan conjuntos contiguos de los dominios que no se muestran. Un funcional de genes de la cadena H como VH33-DH26-JH4-Cα se forma en una de las células B después de una serie de reordenamientos de ADN, que combinan ADN de estos dominios de inmunoglobulina. Este gen reordenado último representa una de alrededor de 85.500 posibilidades.Aunque sólo un dominio CΥ se muestra aquí, hay cuatro tipos de dominios CΥ (CΥ1, CΥ2a, CΥ2b y CΥ3)

CalizaGordon et al. fueron los primeros en demostrar la viabilidad de la transferencia de ADN por microinyección en el pronúcleo de óvulos de ratón. En su estudio, el procedimiento fue probado por la microinyección de varios cientos de huevos con una construcción de vectores de genes que consistía en llevar a pBR322 tanto el virus del herpes simple (HSV) timidina kinasa del gen y un trozo del virus de simio 40 genoma. De la 78offspring que se obtuvieron de las madres de alquiler, 2retained una muestra de ADN del plásmido. El autor concluye: "Estos datos demuestran que es posible utilizar un plásmido recombinante como vector para la transferencia de genes foráneos directamente en embriones de ratón, y que estos embriones se pueden mantener los genes foráneos en todo el desarrollo." Desafortunadamente, el plásmido de ADN no estaba intacto , y la secuencia de SHV timidina quinasa no se convirtió en un transgén.Por otro lado, Brinster et al., Que microinyección de los pronúcleos de un número de óvulos de ratón con el plásmido que lleva el gen HSV timidina quinasa bajo el control del promotor del gen de la metalotioneína-I, encontró que uno de sus ratones transgénicos que expresan HSV timidina quinasa en un nivel alto en su hígado y el riñón, en comparación con otras tres transgénicas que producen bajos niveles de esta enzima. Además, ocho animales transgénicos lleva a otro la secuencia de HSV timidina quinasa, pero no produce ningún activo HSV timidina quinasa. Southern blot mostraron que todos los ratones transgénicos que figuran varias copias del ADN microinyección.Estos dos estudios sentaron las bases para la transgénesis de ratones. A pesar de la complejidad técnica y la relativa ineficacia de la estrategia de la microinyección, que ha sido un éxito excepcional. En la actualidad, la puntuación de la cepa de ratones con genes extraños (ratones transgénicos) o genes endógenos que se han visto interrumpidas por la inserción de ADN extraño (ratones knock-out) se están utilizando el estudio de la regulación génica, desarrollo de los mamíferos, patogenia viral, cáncer, toxicología y la mutagenicidad de diversos agentes, entre otra cosa. Además, los ratones transgénicos y knock-out son de gran importancia biomédica como sistemas modelo para enfermedades humanas.

Los ratones transgénicos:

Aplicaciones: Los ratones transgénicos se pueden utilizar como sistemas modelo para la determinación de las bases biológicas de las enfermedades humanas y diseñar tratamientos para varias enfermedades. Además, la transgénesis de ratones es un sistema ejemplar para demostrar si la producción de un potencial agente terapéutico es factible. En este contexto, el ratón de laboratorio ha sido apropiadamente llamado "el tubo de ensayo difusa". En los animales intactos los modelos simular tanto la aparición y progresión de una enfermedad humana. Sin embargo, un ratón no es un ser humano, a pesar de que es un mamífero, por lo que la información obtenida de algunos modelos transgénicos no siempre puede ser médicamente relevantes. En

otros casos, sin embargo, una perspectiva crítica sobre la etiología de una enfermedad compleja que puede ser descubierto. Con esto en mente, los modelos de ratón para las enfermedades genéticas humanas como el Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, la artritis, drystrophy muscular, tumorigénesis, hipertensión, enfermedades neurodegenerativas, disfunción endocrina, enfermedad coronaria y muchos otros se han desarrollado.

Modelos transgénicos para la enfermedad de Alzheimer

La enfermedad de Alzheimer es un trastorno cerebral degenetative que se caracteriza por la pérdida progresiva de ambos el pensamiento abstracto y la memoria y se acompaña de cambios en la personalidad, trastornos del lenguaje, y una disminución de las capacidades físicas. El diagnóstico clínico de la enfermedad de Alzheimer es pobre, aunque el 1% de la población entre 60 y 65 años de edad y el 30% de la población mayor de 80 años de edad puede desarrollarla. Ovillos neurofibrilares se acumulan en el cuerpo celular de las neuronas, densos agregados extracelulares llamadas placas seniles desarrollan en los extremos de la neuritis, y las células cerebrales (neuronas) se pierden en el neocórtex y el hipocampo del cerebro en pacientes con enfermedad de Alzheimer (fig. 19.12). El núcleo de una Lague senil se compone de unas muy juntas, estructura fibrilar que tradicionalmente se ha llamado un cuerpo de amiloide. Originalmente, los cuerpos amiloides se pensaba que eran compuestos de hidratos de carbono, pero el análisis más definitivo comprobado que son agregados de la proteína. Sin embargo, a pesar de la equivocación, el término "amiloide" se ha mantenido.

La principal proteína de los cuerpos amiloides enfermedad de Alzheimer es un 4-kilodalton (kDa) proteína llamada Aß (β-amiloide, proteína β-, la proteína β-amiloide, o β/A4). La proteína Aß se extiende en longitud desde 39 hasta 42 residuos de aminoácidos, la Aβ40 y Aß42 formas son las principales variantes. Todas las proteínas Aß se derivan de una división proteolítica interna de la proteína precursora β-amiloide (APP).División defectuosa de la proteína APP causa la producción de Aβ40 y Aß42, y la limpieza ineficaz de las variantes probablemente conduce a su acumulación. Un pequeño número de familias con una alta incidencia de la enfermedad de Alzheimer tienen mutaciones en el gen APP, un hallazgo que implica este gen en la enfermedad, por desgracia, en su mayor parte, es imposible estudiar el inicio y la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer en humanos los sujetos. En consecuencia, un modelo animal que imita la enfermedad de Alzheimer podría ser una herramienta de investigación invaluable.Una serie de ratones transgénicos que han sido generados con versiones completas o parciales del gen APP normales impulsado por neuronas específicas de los promotores. En la mayoría de los casos, las placas de amiloide, ovillos neurofibrilares, la muerte de células neuronales, o trastornos de conducta ni se onserved. Sin embargo, la neurodegeneración y otras características que son similares a la enfermedad de Alzheimer se dio en algunos casos. Por ejemplo, un transgén que se compone de la región que codifica para la terminal de 100 aminoácidos de la PAA y contiene la secuencia de la proteína Aß produce las características histológicas que son representativos de la enfermedad de Alzheimer.Los modelos animales más convincente para la enfermedad de Alzheimer se han creado con transgenes que contienen mutaciones en el gen APP que se producen en algunas familias con una alta incidencia de aparición temprana (≤ 50 años de edad) de la enfermedad de Alzheimer. En un grupo de estas familias, el sitio 717 de la APP (APP-717) conHeimer la enfermedad, los sitios 670 y 671 de la APP (APP-670 / 671) contiene asparagina y la leucina en lugar de lisina y metionina.

Atransgene con la APP-717 mutación se construye a partir de una APP cDNA. Intrones modificado se añadieron entre los exones 6 y 7,7 y 8, y 8 y 9 de la APP cDNA. Los intrones fueron introducidos en el APP cDNA porque los experimentos han demostrado que los transgenes con los intrones tienen una mayor tasa de transcripción, en comparación con las construcciones sin ellos. El "APP cDNA-intrones" construir es controlado por el promotor de β derivado de las plaquetas del factor de crecimiento que se expresa en el tejido cerebral (fig. 19.13). La construcción completa se llama el minigene PDAPP. El envejecimiento de ratones transgénicos (> 6 meses de edad) con cerca de 40 copias de las placas amiloides PDAPP minigene pantalla, la muerte neuronal y la memoria detecta. Una construcción genética APP-670/671 que está impulsado por un promotor específico del cerebro también produce ratones transgénicos con la enfermedad de Alzheimer-como características, incluyendo un exceso de Aß42. Curiosamente, ni el envejecimiento de los ratones minigene PDAPP ni APP-670/671 ratones transgénicos ovillos neurofibrilares.Posiblemente, estas estructuras son una respuesta secundaria a la sobreproducción de Aß42 en los seres humanos.

Fig. 19,13 construcción de ADN para el modelado de la enfermedad de Alzheimer en ratones transgénicos. Los exones de la APP cDNA están marcados por números (1 a 18), y los intrones se introducen identificados por

letras (A a C). Las secuencias reguladoras son el β de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-β) y promotor de virus de simio 40 poli (A) secuencia. El punto marca el exón con la APP-717 mutación. La construcción se

llama el minigene PDAPP.

Otros tres genes (ApoE4, el gen de la presenilina 1 (PS1) y presenilina 2 del gen (PS2)) han sido implicados en la enfermedad de Alzheimer en los seres humanos. La presencia del locus de ApoE4, que desempeña un papel en el transporte de lípidos, aumenta la probabilidad de que las personas que tengan al menos 60 años de edad desarrollan la enfermedad de Alzheimer. Las mutaciones de los genes de las presenilinas se encuentran en familias que muestran el inicio temprano de la enfermedad de Alzheimer. Varios estudios indican que los genes de la presenilina mutada aumentar la acumulación de Aß42. Por ejemplo, los ratones doblemente transgénicos que se han generado en el apareamiento de ratones transgénicos que llevan una larga duración gen mutante APP humanos con los que tienen una mutación en la presenilina 1 sobreproducción Aß42 en las mismas partes del cerebro como lo hacen las personas que tienen enfermedad de Alzheimer. Si bien hay mucho que aprender sobre la enfermedad de Alzheimer, la disponibilidad de modo animal, ayudará a responder algunas preguntas críticas sobre las bases moleculares de una enfermedad que afecta a cerca de 4 millones de personas en los Estados Unidos a un costo anual de alrededor de $ 100 mil millones.

Usando ratones transgénicos como los sistemas de pruebas

Los ratones transgénicos se han utilizado para probar si una proteína especifica se excreta en la leche. Por ejemplo, grandes cantidades de auténtico regulador de la fibrosis quística transmenbrane (CFTR) las proteínas son necesarias para estudiar su funcionamiento y formular las posibles terapias para el tratamiento de la fibrosis quística (FQ). Esta enfermedad genética frecuente afecta a aproximadamente 1 de cada 2.500 nacidos vivos, personas de origen europeo. El principal efecto de un gen CFTR defectuoso es una alteración de la

proteína que normalmente actúa como un canal de cloruro. Como consecuencia de la interrupción del flujo apropiado de iones cloruro y fuera de las células, la acumulación de moco ..

Este moco se convierte en el sitio de una infección bacteriana que es difícil de controlar con antibióticos. Y, el ADN liberado de las bacterias muertas hace que el moco muy espeso. Este espesamiento del moco impide la función normal del órgano mediante el bloqueo de los conductos y por lo tanto exacerba los efectos de la FQ. En la actualidad, la esperanza de vida de las personas con FQ es de 25 a 30 años.

Los rendimientos de CFTR con convencionales en sistemas in vitro la expresión de células han sido bajos, posiblemente debido a las consecuencias biológicas de la acumulación de CFTR en la membrana celular de las células transfectadas. La acumulación en detrimento de CFTR en la membrana celular de una célula huésped podría evitarse si la membrana celular se cae frecuentemente. Con este sistema, no sólo una proteína transmembrana heteróloga estar asociado con los fragmentos liberados de la membrana plasmática, sino también la concentración y la purificación de la proteína recombinante sería relativamente sencillo. De hecho, durante la lactancia, las células de la glándula mamaria utiliza este procedimiento para la producción de glóbulos de grasa. En este caso, la grasa de dentro de la célula de la glándula mamaria es encapsulada por la membrana plasmática, y juntos se excreta en la leche como un glóbulo.

Para probar la viabilidad de este concepto, una secuencia de CFTR de larga duración cDNA fue clonado en el centro de una cabra defectuoso B-caseína gen que tenían una delección que se extiende desde el final del exón 2 al inicio del exón 7 (fig. 19.14). La construcción conserva el promotor y las secuencias de terminación de la cabra B-caseína gen. El CFTR cDNA fue clonado en un gen estructural para proporcionar intrones para mejorar la transcripción del transgén. El gen B-caseína se expresa activamente en las glándulas mamarias durante la lactancia, B-caseína es una proteína de la leche más importante.

Líneas de ratones transgénicos llevar la secuencia de CFTR bajo el control de las secuencias B-caseína de regulación de genes se han establecido. Como se predijo, la leche de las hembras transgénicas contenía la proteína CFTR en la membrana de los glóbulos de grasa. No se observaron efectos negativos a cualquiera de las madres lactantes CFTR-transgénicos o los cachorros que fueron alimentados con la leche que contenía CFTR. La proteína CFTR se glicosilada y se extrae fácilmente de la fracción rica en grasas de la leche. Queda por determinar si la CFTR es auténtica. Sin embargo, la posibilidad de producir otras proteínas de membrana en la leche se ha establecido. Muchas otras proteínas que son potencialmente terapéutico en humanos también han sido sintetizados por las células de la glándula mamaria de ratones lactantes transgénicos. Finalmente, para obtener grandes cantidades de CFTR, otras proteínas transmembrana de importancia médica, y varias proteínas terapéuticas humanas, las construcciones transgénicas tendrán que ser incorporado en el genoma de un mamífero más grande, como una vaca, oveja o cabra.

Figura 19.14 cabra B-CFTR construcciones de expresión de ADNc. El ADNc de longitud completa de CFTR se clonó entre el exón 2 (EX2) y de la cabra B-caseína gen. El promotor y secuencias de terminación de la transcripción y los exones 1, 8 y 9 (EX8 y EX9) del gen de B. caseína se conservan.

Los ratones transgénicos se han utilizado para probar una variedad de otras ideas. Por ejemplo, la bacteria Staphylococcus aureus es responsable del 25% de los casos de infección de las glándulas mamarias (mastitis) en vacas. Estas infecciones son contagiosas y se propaga fácilmente a través de una manada entera. La producción de leche de vacas infectadas se redujo significativamente. En la actualidad, los brotes de mastitis causada por S. aureus no se puede controlar eficazmente con un coste anual de unos US $ 1,7 mil millones en los Estados

Unidos. Posiblemente, si las vacas secretan un agente staphylolytic en la leche, las infecciones podrían evitarse por Staphylococcus simulans. Lisostafina es una enzima hidrolítica que ataca específicamente la pared celular de S. aureus. Sin embargo, sólo lisostafina inactivos es producida por células eucariotas transfectadas con un gen nativo, ya que dos residuos asparagines se glicosilada. Este problema fue superado mediante el uso de mutagénesis in vitro para sustituir a los codones de estos dos residuos asparagines con los de la glutamina. El lisostafina modificado no glucosilada después de la síntesis en las células eucariotas y en plena actividad frente a S. aureus.

El gen alterado lisostafina fue puesto fue puesto bajo el control del promotor de ovejas B-lactoglobulina, y la construcción se utilizó para producir ratones transgénicos. Los ratones que segrega la mayor cantidad de lysostaphin en la leche fueron protegidos completamente de la infección por un gran inóculo de S. aureus. En comparación con los controles, bajo lysostaphin producción de líneas transgénicas no se vieron afectados por el número de S. aureus que se espera con infecciones naturales. Si no se trata de animales transgénicos estaban sanos y fisiológicamente ni histológicamente diferentes de los animales control. Así, en principio, este sistema parece ser una forma efectiva de control de la mastitis causada por S. aureus. Sin embargo, debido a la probabilidad de selección de lisostafina S. aureus resistente a este tipo de protección puede requerir los organismos transgénicos doble o el triple que producen proteínas que tienen diferentes propiedades antiestafilocócicas.

Regulación condicional de la expresión génica

Varios protocolos se han diseñado para activar y desactivar la expresión de un transgén en un tipo específico de célula a voluntad. De estos métodos, el sistema de la tetraciclina-inducible ha sido ampliamente utilizado. Este sistema se basa en dos unidades de transcripción en la misma celda, con el producto de una de las unidades de la determinación de la expresión de un gen (s) de la otra unidad. En una forma de que el sistema inducible por tetraciclina, la adición de doxiciclina (DOX), un análogo de la tetraciclina no tóxico, se apaga la expresión de un transgén.Sin Dox, el transgén se expresa continuamente en un tipo celular específico. Este "tet-off" del sistema depende de la producción de un anticuerpo quimérico (híbrido) de proteínas compuesto por el represor tetraciclina y una secuencia de aminoácidos que se activa el proceso de transcripción. La proteína híbrida que se llama tetraciclina controlada transactivador (tetraciclina transactivador o TTA). El gen (tTA) que codifica tTA está bajo el control de un promotor específico de las células.El promotor que impulsa el transgén se compone de un conjunto de operadores tetraciclina (tet0) secuencia ascendente a partir de un promotor eucariota fuerte. La proteína tTA une a la región tet0 y unidades de la transcripción del transgén. La unión de la proteína tTA a la región tet0-promotor es absolutamente necesario para la iniciación de la transcripción. El tet0-promotor por sí sola no puede iniciar la transcripción.Por otro lado, cuando Dox está presente, se une a la proteína tTA, y el complejo de Dox-tTA no puede unirse a la secuencia tet0-promotor y la transcripción de los transgenes no se produce. Por lo tanto, la presencia o ausencia de los actos Dox como un interruptor donde el promotor específico de células del gen tTA está activo (fig.19.15A)

Un sistema de inversión llamado "tet-on", en el que Dox debe estar presente para la transcripción del transgén, también ha sido concebido.De esta forma, la secuencia de nucleótidos para el represor tetraciclina lleva a mutaciones que impiden que la proteína combinada represor y transactivador de la unión a la secuencia tet0-promotor. Este represor de tetraciclina / transactivador proteína se denomina rtTA (revertir la tetraciclina

sistema controlado por transactivador). Sin embargo, Dox se une a rtTA y cambia su configuración, que permite el complejo para unirse a la secuencia tet0-promotor e iniciar la transcripción del transgén (fig. 19.15B)

Figura 19.15 Representación esquemática de la expresión de genes regulados por la tetraciclina.

A. Tet-off del sistema. El gen tTA es impulsado por un promotor específico de células (PC) y codifica una secuencia de tetraciclina represor (rojo) y un activador de la transcripción (en azul). El producto del gen de la TTA es una proteína (TTA (círculo púrpura)) que se une a un operador de tetraciclina (tet0)-promotor eucariota (p) y la secuencia en la ausencia de doxiciclina (DOX-) activa la transcripción del transgén. Cuando está presente la doxiciclina (Dox +), que (rectángulo amarillo) se une a tTA, y el complejo de Dox-tTA no se puede unir a la región tet0-promotor y el transgen no es transcrito.

B. Tet-en el sistema. El gen rtTA es impulsado por un promotor específico de células (PC) y codifica una secuencia de tetraciclina mutada represora (amarillo oscuro) y un activador de la transcripción (en azul). El producto del gen rtTA es una proteína (rtTA (rosa círculo)) que no se une a un operador de tetraciclina (tet0)-promotor eucariota (p) secuencia, y en ausencia de doxiciclina (DOX-), el transgén no se transcriben. Cuando está presente la doxiciclina (Dox +), que (rectángulo amarillo) se une a rtTA, y el complejo de Dox-rtTA concede a la región tet0-promotor y la región e inicia la transcripción del transgén.

Tanto las unidades de transcripción de un sistema de regulación por tetraciclina se pueden incorporar en un único plásmido, reduce el número de pasos que se requieren para la producción de ratones transgénicos. Dox se administra únicamente mediante la adición al agua de beber de los ratones. La tet-off y tet-en los sistemas tienen innumerables usos. Por ejemplo, la consecuencia biológica de la producción de una proteína defectuosa o la sobreexpresión de una proteína normal puede ser examinado en detalle, las células específicas de condiciones de la enfermedad puede ser simulada, y el gen basados en tratamientos para enfermedades que afectan a un determinado tipo de células pueden ser probados.

Un fascinante ejemplo de la utilidad del sistema de regulación por tetraciclina es el desarrollo de un modelo de ratón de la enfermedad de Huntington (HD). Esta enfermedad incurable, neurológica mortal afecta a aproximadamente 1 de cada 10.000 personas en el mundo. Los síntomas en la mayoría de los casos se hacen evidentes cuando el paciente es de unos 45 años de edad. Inicialmente, la coordinación muscular se ve afectada. El trastorno es progresivo y constante. Finalmente, tanto los movimientos voluntarios e involuntarios se está perdiendo control, con sacudidas y retorciéndose ocurriendo más o menos constante, el habla se arrastra; disminuir los procesos de pensamiento, y aparecen enfermedades psiquiátricas graves, como depresión, delirios paranoides, y la rabia desenfrenada. En la última etapa de alta definición, los pacientes son mudos, cognitiva funcional, e inmovilizados en posturas dolorosas, como resultado de las articulaciones rígidas y fuertes contracciones. La enfermedad suele durar unos 15 años desde el momento de su inicio. El daño neurológico se limita a regiones específicas del cerebro. A nivel genético, la alteración es responsable de la HD es la adición de unidades de CAG a una matriz existente secuencial de estos trinucleótidos en el exón 1 del gen de la EH. A trinucleótidos CAG es el codón de residuos de glutamina (poliglutamina) en la proteína huntingtina. Los síntomas de la HD se producen cuando el segmento de poliglutaminas de codificación tiene 38 o más codones CAG.

Para crear un modelo de ratón para HD, el sistema tet-off se utilicen con la variación del gen de la EH que consiste sólo en el exón 1 con 94 repeticiones de CAG como el transgén. El gen tTA fue puesto bajo el control de un promotor que es activo en las células del cerebro anterior. La pérdida de embriones fue evitarse durante

el embarazo mediante la adición de Dox para el agua potable, que apaga la expresión de la mutación del gen HD. Al nacer, Dox no fue suministrada a los ratones transgénicos, lo que permitió la expresión continua de la mutación del gen HD y la producción de una proteína con una secuencia de poliglutamina largo. Una condición neurológica que es similar a la HD en los seres humanos desarrollaron con el tiempo en estos ratones. Curiosamente, las características de la enfermedad desapareció cuando la expresión de la mutación del gen HD fue impedido por la adición de Dox. Por lo tanto, al menos en este modelo, la expresión continua de una mutación del gen HD se requiere para el establecimiento de la enfermedad y las células del cerebro se pueden recuperar cuando se deja de esta síntesis. Sobre esta base, las estrategias terapéuticas para la alta definición será probablemente dirigido a cualquiera de bloquear la expresión de la mutación del gen HD en aquellas personas que positivo para más de 38 repeticiones de CAG o desactivar la proteína anormal de las neuronas. En cualquier caso, el tratamiento debe tener como objetivo precisamente el gen mutante o la proteína, dejando a la contraparte normal no afectada.

Control condicional de la muerte celular

La capacidad de inducir la muerte celular en diferentes momentos y bajo las condiciones definidas en un órgano específico de un organismo vivo es una forma útil para estudiar la insuficiencia orgánica destrucción de las células y determinar cómo los tejidos y órganos recuperarse de diversos grados de pérdida de células. Los ratones transgénicos han sido diseñados para este propósito. En concreto, los ratones creados con la construcción de un transgén que consiste en una célula específica del hígado promotor de la conducción de la transcripción de la secuencia de codificación de los humanos heparina vinculante del factor de crecimiento epidérmico (HB-EGFR). HB-EGFR es una proteína de la membrana celular que se une toxina de la difteria y facilita la captación celular del complejo HB-EGFR y la difteria en el sistema endosoma. El efecto tóxico está mediado por una subunidad de la toxina de la difteria que se libera en el citosol, donde se inactiva el factor de elongación del polipéptido 2 (EF-2). La síntesis de proteínas requiere funcionales EF-2 moléculas, y sobreviene la muerte celular en ausencia de la síntesis de proteínas (fig. 19.16). Las células de ratón normalmente no son susceptibles a la toxina de la difteria, ya que no tienen un receptor que reconoce esta proteína bacteriana. Cuando los ratones transgénicos con cDNA bajo el control del promotor de la albúmina HB-EGFR fueron tratados con altas dosis de toxina de la difteria, los graves daños menores se produjeron, con concentraciones más bajas de los daños fue proporcional a la cantidad de la dosis. No hubo absorción de la toxina de la difteria en los tejidos del ratón otros. Además, la presencia de HB-EGFR en la membrana celular de las células de hígado de ratón no tuvo efectos evidentes sobre las funciones celulares del hígado o de otros procesos. Estos ratones son un modelo conveniente para examinar las consecuencias de los daños de moderados a graves de hígado debido a la pérdida de células. Además, los efectos de la eliminación selectiva (ablación) de varios tipos de células pueden ser estudiados en ratones mediante la combinación de la secuencia de codificación de HB-EGFr con diferentes células específicas de los promotores.

Figura 19.16 la muerte de la ingeniería genética de la célula. A. células localizadas membrana-HB-EGFr moléculas (rectángulos marrones) se sintetizan en las células del hígado de un transgén HB-EGFR cDNA bajo el control de las células del hígado promotor específico (pliver). B. La toxina diftérica (óvalos de color amarillo y azul) se une a una HB-EGFr y se tiene en la célula. Una subunidad toxina de la difteria (óvalo amarillo) se libera de un endosoma y la inactiva EF-2. La muerte celular sigue el cese de la síntesis de proteínas.

La clonación de ganado por transferencia nuclear

En un caso muy publicitado, una oveja llamada Dolly fue clonada por la transferencia de un núcleo de unas mamarias (ubres) de células de un organismo adulto. Esta fue la primera demostración de la pluripotencia (totipotencia) de un núcleo de una célula adulta diferenciada. Desde la clonación de Dolly, los núcleos de células somáticas se han utilizado para clonar vacas, cabras y cerdos. En estos casos, los procedimientos de transferencia nuclear son similares (fig. 19.17. Brevemente, las células del donante embrionarias, fetales o adultas son aisladas, cultivadas y genéticamente modificados. Aunque no siempre es posible con células adultas, la cultura prolongadas es preferible porque los experimentadores han adicionales tiempo para llevar a cabo sucesivas alteraciones genéticas, como en la activación de los dos alelos de un locus o la creación de múltiples cambios de genes. Después de establecer una línea celular con una modificación genética específica (s), las células de los donantes individuales se funden a una ovocitos enucleados a corto duración de los impulsos eléctricos. Por ejemplo, dos de 5.2 kilovoltios-por centímetro (kV / cm) pulsos de 10 microsegundos cada uno se utilizan para fusionar células de fibroblastos de ganado adulto con ovocitos enucleados. Los pulsos al mismo tiempo inducir la fusión de células y la activación de ovocitos. Cada célula fusionada un cultivo para la etapa de blastocito antes de ser transferidos al útero de una mujer pseudopreñadas. Al nacer, el análisis del genotipo se utiliza para confirmar la presencia del transgén.

Figura 19.17 ovejas clonación por transferencia nuclear. El núcleo de un óvulo es eliminado (flecha punteada) con una pipeta. Las células del epitelio mamario de un adulto se desarrollan en cultivo, y el estado G0 es inducida por inhibir el crecimiento celular. Una célula de G0 y un óvulo enucleado se fusionan, y el óvulo renucleated se cultiva en la cultura o en los oviductos ligados hasta un estado embrionario temprano, antes de ser implantado en una madre adoptiva, donde el desarrollo procede a largo plazo. En el experimento descrito por Wilmut et al (1997), los óvulos enucleados 227 fueron fusionados con G0 células mamarias, y 1 de 29 transferidos en etapa temprana los embriones producidos un cordero vivo.

En general, los animales supervivientes producidos por transferencia nuclear son saludables. Sin embargo, hay una pérdida sustancial de los individuos antes y después del nacimiento. La base de esta supervivencia de los pobres no se conoce. A pesar de la baja eficiencia, la transferencia nuclear tiene una serie de ventajas con respecto a la micro inyección pro nuclear de ADN. Con la transferencia nuclear, site-specific cambios genéticos son posibles, todos los hijos son transgénicos, y pequeños rebaños del mismo sexo se pueden producir en un corto período de tiempo. Por el contrario, con la micro inyección de ADN, la integración del transgén ocurre en sitios al azar, la expresión es a menudo limitada debido a la localización cromosómica, arreglos en tándem inestable se forman, y el establecimiento de una línea transgénica requiere un número de generaciones. Por estas razones, mucho esfuerzo se dedica a perfeccionar la clonación de ganado con nucleícos de las células somáticas.

El ganado transgénico, ovejas, cabras y cerdos

Si la glándula mamaria es para ser utilizado como un biorreactor, ganado lechero, que cada año produce aproximadamente 10.000 litros de leche, que contiene aproximadamente 35 gramos de proteína por litro, son posibles candidatos para la transgénesis. Más específicamente, si una proteína recombinante estuvieron presentes en un gramo por litro de leche y podría ser purificado con 50% de eficiencia, el rendimiento de 20 vacas transgénicas sería de unos 100 kg al año. Coincidentemente, el requerimiento anual mundial de proteína C, que se utiliza para la prevención de coágulos de sangre, es de unos 100 kg. Por otro lado, una vaca transgénica sería más que suficiente para la producción de la producción mundial anual de factor IX

(componente de tromboplastina en plasma), que es utilizado por los hemofílicos para facilitar la coagulación de la sangre.

Un ratón modificado transgénesis ADN protocolo de micro inyección ha sido desarrollado para el ganado (fog. 19,18). En resumen, los pasos esenciales implica (1) recolección de ovocitos de matadero, mató a las vacas, (2) en la maduración in vitro de ovocitos, (3) en la fertilización in vitro con semen de toros, (4) la centrifugación de los óvulos fertilizados para concentrar la yema de huevo, que en los huevos normales evita que los pronúcleos masculino de ser visto fácilmente en un microscopio, (5) micro inyección de ADN en pronúcleos masculino de entrada, (6) en el desarrollo in vitro de embriones; (7) la implantación quirúrgica de un embrión en una madre adoptiva destinatario en celo natural, y (8) de detección de ADN de la descendencia de la presencia del transgén.

Cuando este procedimiento no quirúrgico fue puesto a prueba, dos becerros transgénicos se obtuvieron de un grupo inicial de 2.470 ovocitos. Este resultado indica que la metodología es factible, aunque ineficaz. El pobre rendimiento de los terneros transgénicos después del micro inyección de ADN es probablemente debido a la baja probabilidad de integración. Además, el tiempo y esfuerzo, un pequeño número de células pueden ser tomadas de un embrión en desarrollo antes de la implantación y ensayados para el transgén mediante PCR. La pérdida de estas células no interfiere con el desarrollo normal. La prueba se asegurará de que sólo los embriones que lleva el transgén se implantan.

Uno de los objetivos de la transgénesis de las vacas lecheras es cambiar los componentes de la leche. La cantidad de queso producido con leche es directamente proporcional al contenido de k-caseína. El aumento de la k-caseína de producción con una sobreexpresión de la k-caseína transgén es una probabilidad razonable. Para su utilización final, la expresión de un transgén de la lactasa en la glándula mamaria puede disminuir el contenido de lactosa de la leche, aunque la presencia de cierta cantidad de lactosa es necesaria para la secreción de leche. Esta modificación sería bien recibido por las muchas personas que son intolerantes a la lactosa y la indigestión severa después de la experiencia de consumo de leche o productos lácteos que contienen los alimentos. Además, las glándulas mamarias pueden ser diseñados para producir antígenos virales y otras que no son inactivados por la ingesta oral de la vacuna o los anticuerpos de la inmunidad pasiva de los seres humanos y animales de granja. A pesar de la transgénesis de ganado es una promesa, el progreso hacia la producción de un gran número de animales genéticamente modificados será lento, porque tarda unos 2 años para producir un ternero de un óvulo fecundado.

En la actualidad, las enfermedades infecciosas de los animales domésticos están controlados por la vacunación, las drogas, el aislamiento físico, y una cuidadosa monitorización. El costo de la prevención de la enfermedad puede ser de hasta el 20% del valor de la producción total. Para el ganado, en general, se tratará de crear animales con resistencia heredada a las enfermedades bacterianas, virales y parasitarias. Por ejemplo, la resistencia genética a las enfermedades bacterianas, como la mastitis (abscesos de la glándula mamaria) en el ganado lechero, la diarrea neonatal (disentería) en los cerdos, y la cólera aviar serían objetivos probables. De la base de la resistencia en cada caso se debe a un solo gen, puede ser posible en contra de una enfermedad bacteriana después de que estos genes han sido aislados y caracterizados.Otro método que puede ser utilizado para desarrollar las líneas de los animales que son resistentes a los agentes infecciosos implica la creación de la protección inmunológica heredada por transgénesis. Una serie de genes candidatos que contribuyen a que el sistema inmune (por ejemplo, los genes de histocompatibilidad, T-receptor de la célula, los genes y los genes de linfocinas) están siendo estudiados desde esta perspectiva. Sin

embargo, el resultado preliminar más favorable a la fecha han venido de la investigación en la que los genes que codifican las cadenas H y L de un anticuerpo monoclonal se han transferido a los ratones, conejos, cabras y cerdos. El fundamento de esta estrategia es proporcionar un mecanismo incorporado, heredada de protección biológica para el animal transgénico que elimina la necesidad de la inmunización por vacunación.

El concepto de la introducción en un organismo receptor, los transgenes de un anticuerpo que se une a un antígeno específico que se ha llamado inmunización in vivo. Para probar esta idea, los genes de las cadenas de inmunoglobulina de un anticuerpo monoclonal de ratón contra un anticuerpo que se une a 4-hidroxi-3-nitrophenylacetate fueron clonados en tándem y microinyección en óvulos fecundados de conejos ratones y cerdos. En cada caso, la actividad de anticuerpos monoclonales se encuentra en el suero de los animales transgénicos. Sin embargo, el nivel de anticuerpos monoclonales que contienen tanto el clonado de las cadenas H y L es bajo. Diferentes construcciones de transgenes tendrán que ser examinadas para determinar si este problema se puede resolver.

Investigación transgénesis con ovejas y cabras tiene, en su mayor parte, se dedica al desarrollo de las glándulas mamarias de estos organismos como biorreactores para la producción de proteínas farmacéuticas. A pesar de la cantidad de leche producida por cada una oveja o una cabra es menor que la producida por una vaca, la lactancia en las ovejas y cabras produce cientos de litros de leche por año (cuadro 19.2).

Cuadro 19.2 La producción de ratones transgénicos, y con las construcciones de los transgenes que han mamaria específica glándula promotores de conducción secuencias de genes humanos, los investigadores han creado ovejas transgénicas, cabras, cerdos y conejos de más de 100 proteínas diferentes humanos que son secretadas en la leche (cuadro 19.3). Las proteínas de origen transgénico se glicosilada y había otras modificaciones postraduccionales. En muchos de estos casos, las proteínas recombinantes había actividades biológicas idénticas a las de origen humano. Sin embargo, estudios más detallados que se llevarán a cabo para determinar si una proteína producida en las glándulas mamarias de los animales es estrictamente equivalente a la forma nativa.

Tabla 19.3 En general, la expresión de transgenes en las glándulas mamarias de ovejas, vacas, cerdos, conejos, cabras y no tiene efectos nocivos no tanto hembras lactantes o la progenie de enfermería. Sin embargo, esto no siempre es así. Por ejemplo, cuando el transgén de la hormona de crecimiento bovino, bajo el control del promotor de la metalotioneína se introdujo en los cerdos, los resultados adversos fueron observados.Aunque los niveles de la hormona de crecimiento variaron entre los cerdos transgénicos, el grupo en su conjunto mostró una mayor capacidad para convertir el alimento en el peso corporal. Sin embargo, esta respuesta positiva fue contrarrestada por las alteraciones patológicas que incluyen ulceración gástrica, disfunción renal, cojera, inflamación del revestimiento del corazón, la inmovilidad de las articulaciones, y la susceptibilidad a la neumonía. Las razones de estos síntomas no se conocen. Posiblemente, que fueron causados por la exposición prolongada a la hormona del crecimiento excesivo de un transgén que se transcribe más o menos continua. Estos estudios demuestran que no importa cuán atractivo puede ser un concepto, no hay sustituto para la experimentación. A pesar de instructivo, este caso puede haber sido la excepción. Ha habido muchas experiencias exitosas que se han producido cerdos transgénicos sanos.

En la actualidad, la sangre humana total de los donantes es la única fuente para reemplazar la pérdida de sangre de un trauma. Existen programas activos para reclutar a los donantes para evitar la escasez y los análisis de sangre donada para detectar el virus de la inmunodeficiencia humana y otros virus. Gran parte de este

esfuerzo podría ser aliviado de que había un suministro seguro y fiable de sangre humana o un sustituto de la sangre libre de células de una fuente no humana. Este es un problema sumamente complejo que no será fácil de resolver. Sin embargo, como un paso inicial, algunas aplicaciones médicas puede cumplirse si la forma humana de la proteína hemoglobina para transportar oxígeno estaban disponibles. En consecuencia, con una construcción que consistía en la región reguladora de la B-globina humana gen se unió a dos de globina humana A-genes humanos y un BA-globina, saludable cerdos transgénicos que expresan la hemoglobina humana en las células sanguíneas se producen. Después de lo humano B-globina promotor fue sustituido por el cerdo B-globina promotor, mayores niveles de hemoglobina humana se produjeron. Por los criterios químicos diversos, la hemoglobina humana de los cerdos transgénicos tenía las mismas propiedades como la hemoglobina natural. Además, la hemoglobina humana transgénica fue separada de la hemoglobina de cerdo mediante un procedimiento de cromatografía simple.

Aunque preliminares, estos resultados indican que la hemoglobina humana puede ser purificado de la sangre de cerdos transgénicos. Sin embargo, la hemoglobina libre no puede ser la respuesta para la sustitución de la sangre entera, ya que no lleva a cabo el intercambio de oxígeno tan eficazmente como la hemoglobina en los eritrocitos. También, la hemoglobina libre se descompone después de la administración a los animales y sus productos de degradación causan daño a los riñones. Por lo tanto, la formulación de un sustituto de la sangre humana por transgénesis puede ser un largo camino por recorrer.

La transgénesis se utiliza también para hacer frente a ciertos problemas ambientales. Por ejemplo, un gran problema ecológico con la cría masiva de cerdos y aves de corral, es decir, los organismos, monogástricos, es el exceso de fósforo en la materia fecal. Fósforo de estiércol de cerdo o aves de corral que se almacena al aire libre o se utiliza como fertilizante puede funcionar con los sistemas de agua y causar un crecimiento excesivo de las poblaciones de cianobacterias (algas) que, a su vez, reducen el suministro de oxígeno y, posteriormente, matar a los peces y otros organismos acuáticos. Además, grandes cantidades de fósforo en el medio ambiente están implicadas en la producción de gases que potencian el efecto invernadero y contribuyen al calentamiento global.

Cerdos y aves excretan grandes cantidades de fósforo, ya que, a diferencia de los rumiantes, son incapaces de digerir y utilizar el fitato (myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6-ortofosfato hexakisdihydrogen, o ácido fítico) (fig. 1.19A) , la forma predominante de almacenamiento de fósforo en la planta basado en la alimentación animal. Por ejemplo, la principal fuente de alimento para los cerdos es la harina de soja, que tiene alrededor de 50% o más de sus fosfato como fitato. La incapacidad para catabolizar fitato se debe a la ausencia de la enzima fitasa, que se encuentra en plantas y microorganismos. La mayoría de las fitasas eliminar los fosfatos sucesivas a partir de fitato para producir inositol 2-monofosfato (fig. 19.18B) o inositol (fig. 19.19C). Fitasa ha sido añadido a la alimentación animal para facilitar la absorción dietética de fósforo y reducir el contenido de fósforo de las excretas. Sin embargo, este suplemento es costoso e ineficaz ya que gran parte de la actividad de la enzima se pierde durante la preparación y almacenamiento de los alimentos.

Como una estrategia alternativa, se pensó que los cerdos transgénicos que expresan un gen de la fitasa en sus glándulas salivales puede superar las consecuencias nutricionales y la contaminación de fitato de la dieta.Con este fin, la microinyección pronuclear embrión se utiliza para introducir en los cerdos de un transgén que consiste en la construcción de la aplicación de un gen de la fitasa de E. coli bajo el control del promotor de secreción de proteínas parótida que constitutivamente unidades de la transcripción de una proteína salival específica en ratones. Establecido fitasa que producen las líneas transgénicas fueron probados para el

crecimiento y la excreción de fósforo utilizando harina de soja con el 53% de su total de fósforo como fitato. En estas condiciones, el fitato de soja estaba casi totalmente digerido y el contenido de fósforo fecal se redujo 75% en comparación con los controles no transgénicos. No se observaron efectos adversos entre los cerdos transgénicos fitasa. Se requieren más estudios para demostrar que la fitasa no es ampliamente sintetizada fuera de las glándulas salivales, que la calidad de la carne no se ve alterada, y que la fitasa no es alergénico. Con toda probabilidad, este modo se reducirán los costos de producción de cerdos y aves de corral y reducir el impacto ambiental del estiércol de estas fuentes. Muy acertadamente, los cerdos con el gen de la fitasa se han llamado "Enviro-cerdos".

Los animales son una fuente potencial de órganos para trasplante en seres humanos. De humano a humano los trasplantes de órganos (allotransplantations o aloinjertos) de corazones, hígados, riñones y los pulmones son de 70 a 80% efectivo para el primer año y efectiva 50 a 70 para 5 años. Sin embargo, todo el mundo, la demanda de órganos donados supera con creces la oferta disponible. En Canadá, por ejemplo, alrededor de 22,000 corazón, el hígado, el riñón y el trasplante de pulmón se requiere en el 1997, pero sólo 1.500 se realizaron. Con esto en mente, de animal a humano los trasplantes (xenotrasplantes o xenoinjertos) se han propuesto como una manera de aliviar esta disparidad. En este contexto, los cerdos han sido considerados la fuente más probable de órganos para xenotrasplantes, ya que son criados para la alimentación y, como consecuencia (aunque no necesariamente), que podrían ser socialmente aceptables como donantes de órganos. Por otra parte, sus órganos son similares en tamaño y las funciones fisiológicas de los seres humanos y ninguno de los agentes infecciosos conocidos porcino se cree que son patógenos humanos.

Un obstáculo importante para el trasplante de órganos entre especies es el rechazo hiperagudo del órgano del animal. El rechazo hiperagudo supone la unión de los anticuerpos preexistentes del organismo huésped a un epítopo de hidratos de carbono (Gal *-) en la superficie de las células del órgano injertado. Los anticuerpos unidos provocar una respuesta inflamatoria (cascada del complemento) que destruye las células recubiertas de anticuerpos y conduce a la pérdida del órgano trasplantado en cuestión de horas.

En condiciones naturales, las proteínas en la superficie de las células que recubren los vasos sanguíneos a proteger las células de la respuesta inflamatoria. Estas proteínas inhibidoras del complemento son específicos de especie. Por lo tanto, se razonó que si el animal donante se lleva a uno o más de los genes de un ser humano complemento de inhibición de proteínas, un órgano trasplantado podría ser protegidos de la respuesta inflamatoria inicial. Con este fin, los cerdos transgénicos con diferentes genes humanos se complementan inhibidor se han producido.

Las células de uno de estos cerdos transgénicos no se vieron afectados en gran medida por los componentes del sistema de la cascada del complemento. Además, las células olfativas ensheathing de cerdos transgénicos que expresan una proteína inhibidora humanos complementarios fueron capaces de regenerar y mielinizar problemas en la médula espinal en ratas inmunodeprimidas, que por lo menos, indica que los xenotrasplantes puede corregir el daño de las células nerviosas en ausencia de rechazo hiperagudo. En otros experimentos preliminares, el rechazo hiperagudo no se produjo después de que los riñones de cerdos transgénicos que expresan dos proteínas humanas reguladoras complementarias fueron trasplantados a una gran cantidad de primates.Sin embargo, otro gran problema surgido. Cada beneficiario falleció pocos días después del trasplante de la coagulación sanguínea excesiva (coagulopatía) a pesar del tratamiento con heparina. No está claro si otras estrategias, como la anulación de los dos alelos del gen de la enzima que produce el epítopo Gal *- y / o la

introducción de genes de enzimas que eliminan la fracción Gal *- de la superficie celular, previene el rechazo hiperagudo, grave de la sangre de coagulación, y la expulsión de xenoinjertos de retraso.

La posibilidad de que patógenos latentes de cerdo tales como retrovirus endógeno porcino (PERV), ya que podría activarse después de los xenotrasplantes y causar una infección en los seres humanos también deben ser atendidas. La información preliminar indica que el PERV se replica en algunas líneas celulares establecidas, pero no en cultivos de células recién establecidas o en células humanas in vivo. Además, no hay evidencia de que PERV produce síntomas adversos en los seres humanos. Ciertamente, todas las posibles complicaciones, así como todas las cuestiones éticas que deben resolverse antes de xenoinjertos son consideradas para ensayos clínicos.

Aves transgénicas

Varias características que son únicas para la reproducción aviar y el desarrollo que la producción de cepas transgénicas por microinyección de ADN en los óvulos fertilizados extremadamente ineficiente. Por ejemplo, durante la fecundación en las aves, el espermatozoide penetra el óvulo de varios en lugar de uno, como suele ocurrir en los mamíferos.Como resultado, es imposible identificar el pronúcleo masculino que se fusiona con el pronúcleo femenino. También ADN ingerido en el citoplasma del óvulo fecundado no se integra en el ADN genómico. Por último, aunque la microinyección de ADN nuclear era factible, la técnica podría ser difícil de implementar debido a que el óvulo aviar después de la fecundación se convierte en una sucesión rápida, envuelto en una membrana dura, rodeado de grandes cantidades de albúmina, y envuelto en membranas de la cáscara interior y exterior .

A pesar de estas desventajas, es posible inyectar un transgén en la región (disco germinal) en la yema de huevo que contiene los pronúcleos femenino y masculino. El disco germinal está presente en la cáscara de huevo se forma. Después de la administración de ADN a un disco germinal, cada huevo se cultiva in vitro, y cuando un embrión se forma, se coloca en un óvulo sustituto para producir una cría. A pesar de las dificultades técnicas, algunas de las líneas transgénicas de pollos se han establecido con este método.

En el momento en una membrana del huevo aviar capa exterior se ha endurecido, el embrión en desarrollo (fase blastodermo) tiene dos capas que consta de 30,000 a 60,000 células. En los experimentos de ensayo, la inoculación de la etapa de blastodermo con defectos en la replicación de los vectores de retrovirus con los genes marcadores de bacterias como resultado unas cuantas gallinas y codornices realizar estas secuencias de ADN en sus líneas de germen. Aunque algunos de estos organismos transgénicos no producen virus, el uso de vectores de retrovirus para introducir genes de un producto que se va a utilizar como alimento en última instancia, plantear preguntas acerca de su seguridad, ya sea real o imaginario. Además, el tamaño del transgén que se pueden introducir en el organismo receptor de vectores de retrovirus se limita a -8 kb, y, en ocasiones, la integración en el sitio inicial no es permanente. En consecuencia, otros métodos de transgénesis se han examinado. Un posible candidato como un sistema de vectores no virales para los pollos es el marinero elemento de transposición de la mosca de la fruta Drosophila Mauritania. Este elemento del ADN se incorpora en el genoma de la gallina después de la inyección en el disco germinal de los cigotos y se transmite a través de la línea germinal.

El vehículo preferido para la transgénesis se células pluripotentes que pueden mantenerse de forma constante en la cultura y modificados genéticamente con los métodos estándar. Hasta la fecha, sólo las células blastodermo y las células germinales primordiales que han limitado el crecimiento in vitro, y la etapa X (33

horas) las células de pollo madre embrionarias, las cuales sobreviven durante 21 días en cultivo, están disponibles para este propósito. En pocas palabras, el germen primordial, el estadio madre embrionarias X, o las células blastodermo (fig. 19.20) se extraen de una chica de los donantes, transfectadas con una construcción transgénica, y se implanta en el espacio subgerminal de embriones receptores de huevos frescos. Al nacimiento, algunos de los descendientes consisten en una mezcla de las células. Y el organismo con células no idénticas a partir de dos o más individuos que se llama una quimera. En algunas de las quimeras de pollo, las células que descienden de las células transferidas a formar parte de las células de línea germinal germen del tejido y la forma. Líneas transgénicas se pueden establecer a partir de estas quimeras por las rondas de los apareamientos. En general, las células del receptor superan en número a las células del donante con el transgen. Sin embargo, la proporción de células del donante se puede aumentar para mejorar la probabilidad de obtener quimeras de línea germinal. Una estrategia implica la irradiación de los embriones receptores con una dosis de 540 a 660 rads durante 1 hora antes de la introducción de las células transfectadas. El tratamiento de radiación destruye algunas pero no todas las células del blastodermo, aumentando así la relación final de los donantes de células residentes. A pesar de su ineficiencia, este procedimiento ha sido utilizado con frecuencia para producir pollos transgénicos.

Figura 19.20 El establecimiento de gallinas transgénicas mediante la transfección de células aisladas blastodermo. Las células de los donantes blastodermo se retiran, transfectadas con un transgen, y se inserta en el espacio subgerminal de un blastodermo receptores irradiados. Algunos de los pollos resultantes pueden ser quiméricos. Las quimeras que el transgén en las células de línea germinal son criados para establecer las líneas transgénicas.

Pollos transgénicos podrían ser utilizados para mejorar la composición genética de las cepas existentes con respecto a built-in (en vivo) la resistencia a enfermedades virales, bacterianas y coccidiosis, una mejor eficiencia alimenticia, reducir los niveles de grasa y colesterol en los huevos, y carne de mejor calidad. Investigadores aviar también han sugerido que los huevos con su alto contenido en proteínas se podrían utilizar como fuente de proteínas farmacéuticas. Por analogía con la glándula mamaria de los animales, la expresión de un transgén en las células del tracto reproductivo de la gallina que normalmente segrega grandes cantidades de albúmina de huevo podría conducir a la acumulación de una proteína transgénica de origen que se convierte en encerrado en la cáscara del huevo. La proteína recombinante o bien puede ser fraccionado de estos paquetes estériles o se consume como un nutracéutico con desayuno. El rendimiento anual esperado de la proteína recombinante a partir de una gallina es 0.025 kg. En la actualidad, como "prueba de principio" los experimentos, los pollos transgénicos que sintetizan anticuerpos monoclonales, la hormona del crecimiento, insulina, albúmina de suero humano, y el interferón *- se han creado.

Los peces transgénicos

Como las pesquerías naturales se agotan, la producción de esta fuente de alimento en todo el mundo va a depender mucho más de la acuicultura. En este contexto, las tasas de mayor crecimiento, tolerancia al estrés ambiental, y la resistencia a las enfermedades son algunas de las características que pueden ser creados por transgénesis. Hasta la fecha, los transgenes se han introducido por microinyección o electroporación de ADN en los óvulos fertilizados de una serie de especies de peces, como la carpa, bagre, trucha, salmón, trucha alpina, y la tilapia. Los pronúcleos de los peces no son fácilmente visibles bajo el microscopio después de la fertilización, el ADN es lineal transgén microinyección en el citoplasma de los óvulos fecundados o embriones, o que han alcanzado la fase de cuatro células de desarrollo. A diferencia de la embriogénesis de mamíferos, el

desarrollo de los peces de huevos es externa, por lo que no hay necesidad de un procedimiento de implantación. Desarrollo de peces transgénicos se produce en tanques de almacenamiento con temperatura controlada. La supervivencia de los embriones de peces después de la microinyección de ADN es alta (35 a 80%), y la producción de peces transgénicos varía de 10 a 70%. La presencia de un transgén es calificada por análisis de PCR de cualquiera de eritrocitos o ADN escala.

Fundador de pescado están acoplados a establecer puras líneas transgénicas.

Muchos de los estudios iniciales con los peces transgénicos se han centrado en examinar el efecto de un transgén la hormona del crecimiento en la tasa de crecimiento. En un estudio, un transgén que consiste en la región promotora del gen de la proteína anticongelante del pez llamado faneca, la hormona de crecimiento de cDNA de salmón, y las señales de poliadenilación de cese del extremo 3 'del gen de la proteína anticongelante forma la faneca se inyectó en los huevos de salmón del Atlántico. En general, los salmones transgénicos eran más grandes y crecieron más rápido que los controles no transgénicos. Este sistema de expresión fue elegido para mejorar la transcripción de la hormona de crecimiento en aguas frías. De "todos los peces" construcción fue montada para evitar posibles incompatibilidades biológicas que puedan surgir del uso de un gen de la hormona del crecimiento a partir de fuentes nonfish. De la especificidad aún mayor, un "todo-salmón" construir la hormona del crecimiento se formuló y microinyección en huevos de salmón rojo. Después de alrededor de 1 año, el salmón transgénico fueron aproximadamente 11 veces más pesado que el salmón no transgénico. Sin embargo, no hay diferencia de tamaño entre los adultos.En teoría, el crecimiento más rápido de los salmones jóvenes reduciría el coste de la alimentación y reducir la contaminación de las aguas costeras en las cercanías de la sede de los corrales. Existe la posibilidad, además, que la acuicultura de peces transgénicos pueden llevarse a cabo dentro de las instalaciones contenidas. Hasta ese momento, el impacto total de la liberación accidental de peces transgénicos en la población natural se debe considerar si son criados en jaulas en el mar.

Además de los rasgos de la mejora de la ayuda a la producción de pescado para la alimentación, la transgénesis se puede utilizar para generar modelos de sistemas para el monitoreo riesgos para la salud y los productos químicos de detección para determinar si causan mutaciones. Algunos de los sistemas biológicos se han diseñado para la detección de las mutaciones inducidas en los microbios y los roedores.De los principales requisitos para los ensayos de mutagénesis in vivo, las mutaciones del gen objetivo no debe afectar a la viabilidad a menos que los efectos letales del gen se anotó, las mutaciones inducidas debe producir un fenotipo fácilmente identificados, el gen de interés se pueden recuperar, y nuevas mutaciones se caracteriza por la facilidad La secuenciación del ADN.

Un método eficaz para determinar las mutaciones inducidas en los organismos pluricelulares implica la introducción de una serie en tándem del genoma del bacteriófago V en un organismo huésped. Luego, en varias ocasiones después de un animal transgénico creado ha sido expuesto a una sustancia química de prueba, se extrae el ADN, cada bacteriófago genomas V se cortan y ensamblan en partículas de bacteriófagos infecciosos, y un ensayo se lleva a cabo para determinar si las mutaciones se han producido en el bacteriófago V (fig. 19.21).

Figura 19.21 Representación esquemática del gen de bacteriófago V CII en el ensayo de mutagénesis in vivo. Las mutaciones inducidas se designan con un círculo rojo. Es muy probable que un bacteriófago V con un gen mutante CII entrara en el ciclo lítico.

La justificación para el gen de la CII mutaciones prueba depende de la función de este gen durante el ciclo de vida del bacteriófago V. En pocas palabras, una partícula bacteriófago V tiene dos opciones después de que se infecta a E. coli. Ya sea un lisogénico (temperatura) del Estado es instituido por la integración de la V bacteriófago en una ubicación específica en el cromosoma del huésped, o un ciclo lítico, que conduce a la destrucción de la máquina, comienza. Un sistema integrado de V bacteriófago se puede mantener a través de una serie de sucesivas divisiones celulares. Extirpación de todo el genoma del bacteriófago V lisógeno, que es seguido por un ciclo lítico, a menudo se produce cuando la célula huésped es fisiológicamente destacó. Durante el ciclo lítico de 20 minutos, a unos 200 descendientes se producen que son liberados al medio ambiente externo después de la destrucción (lisis) de la célula huésped. La elección entre lisogenia y el ciclo lítico es controlada por genes V bacteriófago. La fase lisogénico, que es menos probable, naturalmente, se establece por la producción de un represor (proteína CI) de los genes del ciclo lítico (fig. 19.22A). El ciclo lítico se inicia por la acción del gen de la CRO (fig. 19.22 B). En concreto, la proteína CII activa la transcripción del gen cI o, alternativamente, la proteína Cro regula a la baja de la transcripción de los genes de la CI y CII. Las mutaciones del gen de la CII disminuir la probabilidad de que lisogenia va a producir. El número de partículas de bacteriófagos que entran en el ciclo lítico se determina mediante la aplicación de una muestra diluida del bacteriófago V sobre una placa de agar que se cubre con una monocapa de E. coli, es decir, un césped bacteriano, y contando las zonas claras (placas) que se producen. Una placa representa una región donde la sucesión de los ciclos lítico destruir las bacterias que se encontraban en las proximidades de uno al otro. En estas condiciones, una muestra con un mayor número de mutaciones en el gen CII forma más placas que uno que no tiene mutaciones o CII relativamente pocos genes. En otras palabras, si el rescatado bacteriófago V de un pez transgénico que fue tratado con un agente químico produce placas significativamente mayor que el bacteriófago V de un control sin peces transgénicos, entonces el compuesto es mutagénico. Por otra parte, la determinación de la naturaleza de las mutaciones inducidas se pueden obtener fácilmente por secuenciación del ADN, ya que el gen de la CII es sólo de 300 pb de longitud. La viabilidad de este sistema en una especie pequeña, que el pescado cultivado se ha demostrado con éxito, con menos de 10 organismos transgénicos que se requiera para detectar las mutaciones genéticas inducidas por la CII.

Figura 19.22 lisogénico (A) y lítico (B) los sistemas de respuesta después de la infección de E. coli con bacteriófago VA la proteína CII (círculo rojo) activa el gen cI. La proteína cI (cuadrado verde) se apaga los genes que inician el ciclo lítico y activa los genes que son necesarios para lisogenia.B. La proteína Cro (cuadrado azul) evita la transcripción de los genes de CI y CII, lo que impide la transcripción de los genes de respuesta lisogenia y favorece la expresión de los genes que se requieren para el ciclo lítico. Una línea inclinada que termina con una línea horizontal representa la inhibición de la actividad de los genes.

Un ensayo de diferentes peces transgénicos mutación que utiliza un transgén plásmido con un gen sensible a los antibióticos como el objetivo de mutación se ha desarrollado. En este ejemplo, e: coli se transformó con el plásmido de ADN que es rescatada de los peces transgénicos tratados. Un aumento en la frecuencia de las colonias resistentes a los antibióticos de las muestras tratadas en comparación con los controles no tratados denota mutagénesis. Generalmente, los peces transgénicos proporcionan un método rentable de la determinación de los mutágenos químicos en el agua de fuentes contaminadas.

Resumen: La modificación genética de los animales por tecnología del ADN recombinante (transgénesis) supone la introducción de un gen clonado (s) en el genoma de una célula que podría, después de la proliferación y el desarrollo embrionario, estar presentes en las líneas germinales de algunos de los descendientes y de la que puede ser posible establecer una verdadera cría de linajes transgénicos. F mucho la

investigación en esta área se ha centrado en el desarrollo de ratones transgénicos. El protocolo más común involucra la introducción de un gen clonado en el pronúcleo masculino de un óvulo fecundado por micro inyección, la implantación del huevo fertilizado en el tratado una hembra receptiva, y luego probar la descendencia para determinar si alguno de ellos tiene el gen de entrada (transgén) en sus células. Un transgén puede ser entregado en un huevo fertilizado de ratón mediante el uso de vectores retrovirales. Por otra parte, las células madre embrionarias de ratón son transfectadas con un gen clonado. En este método, la construcción de ADN de entrada está formulada para integrarse en el genoma de las células receptoras. Posteriormente, las células con el gen clonado se cultivan, y las células con el transgen integrado en unos sitios cromosómicos específica son seleccionadas e introducidas en embriones tempranos de ratón para producir animales transgénicos.

Diversas estrategias se han diseñado para la regulación de la expresión del transgén, la modificación de los transgenes, y la inducción de muerte celular en momentos específicos en determinados tejidos de un organismo transgénico. El Cre-loxP activa la recombinación del sistema o transgenes inactiva, ya sea por la eliminación selectiva de elementos de ADN que la transcripción de bloque o por escisión de parte de la secuencia codificante de un transgén. Los protocolos de tet-on y off-tet utilizar el Dox análogo de tetraciclina para encender o apagar la transcripción de un transgén. Estos sistemas condicional se han utilizado ampliamente para estudiar tanto la actividad de los genes durante el desarrollo y las consecuencias de uno de ellos la pérdida de la función del gen o la sobreexpresión de genes dentro de un determinado tejido. La muerte celular inducida experimentalmente se inicia cuando la toxina de la difteria se administra a los animales transgénicos que sintetizan humanos HB-EGFr en un tipo celular específico. La toxina de la difteria se une a HB-EGFr y se tiene en la célula, donde una subunidad de la toxina diftérica inactiva polipéptido EF-2. El cese de la síntesis de proteínas conduce a la muerte celular. Este sistema es una manera eficaz de estudiar la base de la insuficiencia de órganos causada por la pérdida de células.

Alta capacidad de vectores (YAC bacteriófago P1-derivados, bacterias, mamíferos, y) permite la clonación de genes de las matrices de gran tamaño o un número de transgenes diferentes al mismo tiempo. A modo de ejemplo, un ratón transgénico que sintetiza completamente anticuerpos humanos ha sido creado por transgénesis con YAC tratar los genes de humanos y de las cadenas H k anticuerpos. Este ser de ratón genéticamente modificados debe proporcionar una fuente de los continentes de anticuerpos monoclonales humanos. As transgénicos también se han utilizado para modelar muchas enfermedades humanas, cada una como la enfermedad de Alzheimer. Este enfoque proporciona información importante acerca de las consecuencias de los productos de los genes defectuosos, son curso de la enfermedad y la eficacia de diferentes terapias.

La manipulación genética de animales puede dar lugar a variedades mejoradas mediante el aumento de la eficiencia alimentaria, la mejora de las tasas de la pena, y la protección de los animales de las enfermedades comunes. Son la frecuencia de la transgénesis en los protocolos actuales es baja. No obstante, los animales transgénicos han sido creados por microinyección de ADN o la clonación nuclear. Los anales de este último método la transferencia de los núcleos de las células que han sido manipulados genéticamente en la cultura a los ovocitos enucleados y la obtención de entre los descendientes de algunos animales que llevan el transgen altura de sus celdas. Una aplicación importante para los animales transgénicos está cumpliendo con la glándula mamaria como un biorreactor para la producción de productos farmacéuticos proteoma en la leche. En principio, los pequeños rebaños de transgénicos de vacas, ovejas y cabras podrían proporcionar una fuente continua y económica de importantes medicamentos de proteínas humanas.

El "Enviro-cerdo" es un ejemplo interesante de la transgénesis, como una manera de superar el impacto negativo de estiércol de cerdo de alta fosfato. En este caso, un transgén fitasa que se expresa en la glándula salival elimina eficazmente los fosfatos en los alimentos para cerdos. Como consecuencia, el fósforo se convierte metabólicamente en fitato reduce significativamente la cantidad de fósforo que se excreta.

La transgénesis de las aves, especialmente pollos, se utilizarán para mejorar los atributos de la tensión. Además, los huevos pueden ser un depósito de productos farmacéuticos sintetizados por los pollos transgénicos o para la entrega recombinante derivado de la medicación cuando un huevo se consume.

Aumento de genética de los peces se dirige principalmente a la mejora de las tasas de crecimiento y que confieren resistencia a las enfermedades. Además, los peces transgénicos están siendo considerados como un sistema de bioensayo económico y eficiente. En este contexto, el bacteriófago Y CII gen para determinar la presencia de contaminantes en el agua o los sistemas de pruebas de la mutagenicidad de los compuestos de reciente desarrollo.