ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/eng/browse/24090/banu sukran.pdfBradford yöntemi ile ölçülmüştür. Hücre içi lipaz aktiviteleri

ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

DETERJAN KATKI MADDESİ OLARAK MİKROBİYAL KAYNAKLI

LİPAZ ÜRETİM KOŞULLARININ ARAŞTIRILMASI Banu Şükran ŞENGEL

KİMYA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI

ANKARA 2007

Her hakkı saklıdır

i

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

DETERJAN KATKI MADDESİ OLARAK MİKROBİYAL KAYNAKLI LİPAZ ÜRETİM KOŞULLARININ ARAŞTIRILMASI

Banu Şükran ŞENGEL

Ankara Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı

Danışman: Prof. Dr. Serpil TAKAÇ

Süt mamulleri üretim tesisi yağlı atığından izole edilen ve genetik tanımlama ile türünün Debaryomyces hansenii olduğu belirlenen mikroorganizmadan, deterjanlarda kullanılmak üzere aktif ve kararlı lipaz üretimi için karbon ve azot kaynakları, metal iyonları, sıcaklık, pH gibi uygun üretim koşullarının belirlenmesi amaçlanmıştır. TBA ortamında çoğaltılan mikroorganizma, steril koşullarda öncelikle sıvı ön çoğalma ortamına, ön çoğalma ortamından da farklı üretim parametrelerinin incelendiği üretim ortamlarına 1/10 aşılama oranı ile aktarılmış ve çalkalamalı hava banyosunda N=150 rpm’de izoterm koşullarda enzim üretimi gerçekleştirilmiştir. Farklı kalma sürelerinde üretim ortamlarından alınan örneklerle hücre derişimi, protein derişimi ve lipolitik aktiviteler izlenmiştir. Mikroorganizma derişimi türbidimetrik olarak spektrofotometre ile ölçülmüş; lipaz aktivitesi ise titrimetrik ve spektrofotometrik olarak belirlenmiştir. Mikroorganizmanın ürettiği protein miktarı Bradford yöntemi ile ölçülmüştür. Hücre içi lipaz aktiviteleri belirlenirken, hücre cam boncuklu homojenizatörde parçalanmıştır. Lipaz üretimi için en uygun koşullar belirlendikten sonra, bu koşullarda üretilen lipaz saflaştırılmıştır. Bu amaçla ardışık olarak ultrafiltrasyon ve anyon değişim kromatografisi yapılmıştır. Son olarak kısmen saflaştırılmış lipazın SDS, EDTA, Triton X-100, H2O2, amilaz ve proteaz gibi deterjan katkı maddelerinin varlığında aktivitesi incelenmiş ve enzimin deterjanlarda kullanıma uygun olup olmadığı araştırılmıştır. Sonuç olarak lipolitik aktivite için en uygun koşullar, karbon kaynağı olarak %1 derişimde soya yağı, azot kaynağı olarak %1 derişimde soya unu, metal tuzları içerisinde 10 mM KCl, üretim sıcaklığı T=30oC, üretim başlangıç pH’ı 6.5 olarak belirlenmiştir. Mikroorganizmanın hücre dışına salgıladığı lipazın aktivitesi, hücre içi lipaz aktivitesinden daha yüksektir. Kısmen saflaştırılmış olan lipaz, deterjan katkıları varlığında aktivitesinin büyük çoğunluğunu koruyabildiği için üretilen enzimin deterjanlarda kullanım potansiyeline sahip olduğu düşünülmektedir.

2007, 158 sayfa

Anahtar Kelimeler : Debaryomyces hansenii, deterjan enzimleri, lipaz, lipaz aktivitesi, mikrobiyal lipaz üretimi

ii

ABSTRACT

Master Thesis

INVESTIGATION OF MICROBIAL LIPASE PRODUCTION CONDITIONS AS DETERGENT ADDITIVE


Ankara University

Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemical Engineering

Supervisor: Prof.Dr. Serpil TAKAÇ

The aim of this study is to produce active and stable extracellular lipase enzyme by yeast isolated from waste of a milk products plant; and to test its compatibility with detergent additives. The yeast was determined as Debaryomyces hansenii using molecular identification methods; and the most effective conditions for lipase production including carbon and nitrogen sources, temperature, initial pH and metal ions were investigated. The microorganism grown on TBA was first inoculated into pre-culture medium and then transferred into enzyme production medium with the volume ratio of 1/10. Enzyme production was carried out in shake flasks isothermally at 150 rpm. Samples drawn from the medium with certain time intervals were analyzed for the determination of cell concentration, protein concentration and lipolytic activity. The cell concentration was determined turbidimetrically and the protein concentration was measured by Bradford method. Lipolitic activity was determined by spectrophotometrically and titrimetric analysis. To determine intracellular lipase activity, the cells were disrupted with a homogenizator using glass beads. The enzyme produced under optimal conditions was partially purified by ultrafiltration and anion exchange chromatograpy in successive. Partially purified enzyme was tested for its recovered activity in the presence of detergent additives such as SDS, EDTA, Triton X-100, amylases and proteases. As a result, optimal parameters for lipase production from D. hanseneii were found out to be soybean oil (%1v/v) as carbon source, soybean flour (%1 w/v) as nitrogen source and 10 mM KCl as metal salt. The optimal temperature and initial pH for high lipase activity were T=30oC and pH=6.5, respectively. The extracellular lipase activity was found to be higher than intracellular lipase activity. The partially purified lipase succeeded to recover its activity in the presence of detergent additives tested; therefore, the enzyme has been considered to have a required potential for the usage in detergent industry.

2007, pages 158 Key Words : Debaryomyces hansenii, detergent enzymes, lipase, lipase activity, microbial lipase production

iii

TEŞEKKÜR

Yüksek lisans çalışmam boyunca bilgi ve deneyimleriyle bana yol gösteren, çalışmamın

her aşamasında ilgi ve desteğini gördüğüm danışman hocam Prof. Dr. Serpil TAKAÇ’a

çok teşekkür ederim.

Çalışmamda, mikroorganizmanın genetik olarak tanımlanmasındaki yardımları için

Doç. Dr. Hilal ÖZDAĞ’a; DNA izolasyonu ve mikroorganizmanın morfolojik olarak

tanımlanmasındaki yardımları için Prof. Dr. Gönül DÖNMEZ ve Prof. Dr. Sedat

DÖNMEZ’e, bitkisel yağların analizlerindeki yardımları için Prof. Dr. Aziz TEKİN’e;

enzim saflaştırma basamağındaki yardımlarından dolayı Dr. Duygu ÖZEL

DEMİRALP’e;

Tez çalışmamın mikroorganizma izolasyonu kısmında bana yardımcı olan Araş. Gör.

Sevgi ERTUĞRUL ve Araş. Gör. Nur KOÇBERBER KILIÇ’a; mikroorganizmanın tür

tayini ile ilgili kısmındaki yardımlarından dolayı Gamze ÖZSÖZ’e; zamanımın büyük

bir kısmını geçirdiğim Reaksiyon Mühendisliği Laboratuarındaki çalışma arkadaşlarım

Başak MARUL, Araş. Gör. Ayşe Ezgi ÜNLÜ BÜYÜKTOPÇU ve Banu ERDEM’e;

Maddi ve manevi destekleri ile yanımda olan, üzüntülerimi, sevinçlerimi paylaştığım,

çalışmalarım süresince birçok fedakarlıklar göstererek beni destekleyen, her şeyimi

borçlu olduğum annem Canan ŞENGEL ve babam Mustafa ŞENGEL’e; beni anlayan,

dinleyen ve hep destek olan Funda OĞUZKAYA ve Remzi KAYA’ya

çok teşekkür ederim.

Bu tez çalışmasını maddi olarak destekleyen Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji

Enstitüsü’ne (Proje No: 2005-189) ve Bilimsel Araştırma projelerine (Proje No:

20070745004HPD) teşekkür ederim.


Ankara, Temmuz 2007

iv

İÇİNDEKİLER

ÖZET…………………………………………………………………………………….i

ABSTRACT…………………………………………………………………………….ii

TEŞEKKÜR……………………………………………………………………………iii

SİMGELER DİZİNİ………………………………………………………………….vii

ŞEKİLLER DİZİNİ……………………………………………………………………ix

ÇİZELGELER DİZİNİ……………………………………………………………….xv

1. GİRİŞ………………………………………………..………………………………..1

2. KAYNAK ÖZETLERİ……………………………………………………………...3

2.1 Enzimler ve Kullanım Alanları…………………………………………………....3

2.2 Enzimlerin Deterjan Formülasyonlarındaki

Yeri ve Deterjanlarda Kullanımının Önemi……………………………………..4

2.3 Enzim Esaslı Deterjanlardaki Gelişme…………………………………………..4

2.4 Enzimlerin Deterjanlarda Bulunuş Şekilleri ve

Formülasyona Katılacak Enzimin Hazırlanması……………………………….10

2.5 İdeal Deterjan Enzimlerinin Özellikleri…………………………………………14

2.6 Deterjan Enzimleri………………………………………………………………..14

2.6.1 Proteazlar……………………………………………………………………..…15

2.6.2 Selülazlar……………………………………………………………………...…15

2.6.3 Amilazlar………………………………………………………………………...15

2.6.4 Lipazlar……………………………...…………………………………………...16

2.6.4.1 Lipaz kaynakları……………………………………………………………....20

2.6.4.2 Lipaz üretiminde önemli parametreler……………………………………...21

2.6.4.2.1 Karbon ve azot kaynakları etkisi…………………………………………..22

2.6.4.2.2 pH etkisi…………………………………………………………………...…25

2.6.4.2.3 Sıcaklık etkisi……….……………………………………………………….25

2.6.4.2.4 Metal iyonları etkisi………………………………………………………....25

2.6.4.2.5 Oksijen aktarımı etkisi……………………………………………………...26

2.6.4.3 Lipazların kullanım alanları………………………………………………...26

2.6.4.4 Lipazların deterjan enzimi olarak kullanımı ve üretimi…………………..27

2.6.4.5 Lipazın saflaştırılması………………………………………………………..31

2.6.4.5.1 Saflaştırmanın önemi……………………………………………………….31

v

2.6.4.5.2 Protein saflaştırma yöntemleri……………………………………………..31

2.6.4.5.2.1 Çöktürme…………………………………………………………………..31

2.6.4.5.2.2 Diyaliz ve ultrafiltrasyon………………………………………………….32

2.6.4.5.2.3 Kromatografik yöntemler………………………………………………...33

2.7 Debaryomyces hansenii Mayasından Lipaz üretimi…………………………….35

3. MATERYAL ve YÖNTEM ……………………………………………………….38

3.1 Materyal…………………………………………………………………………..38

3.2 Yöntem………………………………………………………………………….....38

3.2.1 Mikroorganizma izolasyonu…………………………………………………....38

3.2.2 Mikroorganizma tür tayini…….………………………………….....................39

3.2.2.1 Mikroorganizmanın morfolojik tanımlaması………………………….........39

3.2.2.2 Mikroorganizmanın genetik tanımlaması…………………………………...40

3.2.3 Mikroorganizma ve lipaz üretim ortamlarının hazırlanışı…………………...44

3.2.3.1 Agar ortamı…………………………………………………………………....44

3.2.3.2 Ön çoğalma ortamı…………………………………………………………....44

3.2.3.3 Lipaz üretim ortamı…………………………………………………........…..45

3.2.4 Hücre parçalama…………………………………………………………..........45

3.2.5 Lipaz saflaştırması…………………………………………………….........….46

3.2.6 TCA çöktürmesi………………………………………………………...............47

3.2.7 SDS-PAGE yöntemi……………………………………………………….........47

3.3 Analizler…………………………………………………………………...............50

3.3.1 Spektrofotometrik yöntemle lipaz aktivitesi………………………….......…..50

3.3.2 Titrimetrik yöntemle lipaz aktivitesi……………………………………..........51

3.3.3 Proteaz aktivitesi…………………………………………………………..........51

3.3.4 Hücre derişimi………………………………………………………….......…...52

3.3.5 Protein derişimi……………….……………………………………...................52

3.3.6 Bitkisel yağ analizleri...………………………………………………................53

3.4 Verilerin Değerlendirilmesi………………………………………………............53

3.4.1 Spesifik aktivite…………………………………………………………............53

3.4.2 Mikroorganizmanın özgül çoğalma hızları……………………………...........54

4. BULGULAR……………………………………………………………..…............55

4.1 Mikroorganizma İzolasyon ve Tanımlama………………………………...........55

vi

4.2 Lipaz Üretiminde Önemli Parametreler…………………………………...........56

4.2.1 Karbon kaynaklarının etkisi……………………………………………...........56

4.2.1.1 Bitkisel yağların etkisi…………………………………………………...........57

4.2.1.2 Yağ asidi esterlerinin etkisi…………………..………………………............72

4.2.1.3 Yağ asitlerinin etkisi………………………………………….……….............79

4.2.1.4 Gliserolün etkisi………………………………………………….……............87

4.2.1.5 Glukozun etkisi…………………………………………………. ……............89

4.2.1.6 Peyniraltı suyu etkisi……………………………………………….…............90

4.2.1.7 Triton X-100 etkisi…………………………………………………….............92

4.2.2 Azot kaynaklarının etkisi…………….…………………………………............95

4.2.3 pH etkisi……………………………………………………………….…..........103

4.2.4 Sıcaklık etkisi……………………………………………………………..........108

4.2.5 Metal iyonları etkisi………………………………………………….…...........113

4.3 En iyi koşullarda lipaz üretimi………………………………………….............119

4.4 Lipazın Üretim Ortamından Ayrılması ve Kısmi Saflaştırılması…….............122

4.5 Kısmi Saflaştırılmış Lipazın Deterjan Katkı Maddeleri ile

Kullanım Potansiyeli……………………………………………………...........126

5. TARTIŞMA ve SONUÇ…………………………………………………..............127

KAYNAKLAR……………………………………………………………….............137

EKLER……………………………………………………………………….............141

EK 1 Deneylerde Kullanılan Kimyasal ve Biyokimyasal Maddeler………...........142

EK 2 Polimeraz Zincir Reaksyonunun Bileşenleri ………………………..............145

EK 3 Spektrofotometrik Aktivite Örnek Hesabı…………………………..............146

EK 4 Titrimetrik Aktivite Örnek Hesabı……………………………………..........148

EK 5 Proteaz Kalibrasyon Grafiği………………………………………….............149

EK 6 Proteaz Aktivitesi Örnek Hesabı……………………………………..............150

EK 7 Kuru Hücre Kalibrasyon Grafiği………………………………….................151

EK 8 Protein (BSA) Kalibrasyon Grafiği………………………………….............152

EK 9 Bitkisel Yağların Yağ Asitleri Analizi……………………………….............153

EK 10 5.8S ve 26S rRNA Analizi…………………………………………...............154

EK 11 BLAST Sonuçları.............................................................................................157

ÖZGEÇMİŞ………………………………………………………………….............158

vii

SİMGELER DİZİNİ

A Absorbans

APS Amonyum Persülfat

b Işının çözelti içinde aldığı yol (cm)

BLAST Basic Local Alignment and Search Tool

BSA Bovine Serum Albumin

C Çözelti derişimi (mg/ml)

CAL Candida antarctica lipazı

CM Karboksi Metil

Cx Hücre derişimi (mg hücre/ml)

Cxo t=0. saatteki hücre derişimi (mg hücre/ml)

DEAE Di Etil Amino Etil

dNTP Deoksiribonükleozid trifosfatlar

EDTA Etilen Diamin Tetraasetik Asit

IDR Image Development Reagent

N Karıştırma hızı (rpm)

SDS Sodyum Dodesil Sülfat

SDS-PAGE Sodyum Dodesil Sülfat -Poliakrilamid Jel Elektroforez

PAGE Poliakrilamid Jel Elektroforez

PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu

pI İzoelektrik nokta

PL Fosfo Lipaz

pNF p-nitrofenol

PNFP p-nitrofenil palmitat

RDR Reduction Moderator Solution

rRNA Ribozomal RNA

rx Hücre çoğalma hızı (mg hücre/ml.st-1)

viii

SCS Silver Complex Solution

SDS Sodyum Dodesil Sülfat

SDS-PAGE Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel

Elektroforez

T Sıcaklık (oC)

TAED Tetra Asetil Etilen Diamin

TBA Tribütirin Agar

TCA Trikloroasetik asit

TEMED Tetra Etil Metilen Diamin

Tm Bağlanma – annealing sıcaklığı (oC)

U Ünite (µmol/dk)

U/mg Spesifik aktivite

U/mg hücre Hücre miktarı başına aktivite

UV Ultraviyole

V Hacim (ml)

ε Molar absorptivite katsayısı (L/mol.cm)

λ Dalga boyu (nm)

µ Özgül çoğalma hızı (st-1)

ix

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 2.1 Lipazların kristal yapısı…………………………………………………...…20

Şekil 3.1 SDS-PAGE aparatlarının şematik olarak gösterimi…………………….…...50

Şekil 4.1 Mikroorganizmanın ışık mikroskobu altındaki görüntüsü…………………..55

Şekil 4.2 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin lipolitik aktiviteye

(U/ml) etkisi……………………………………………………………….…59

Şekil 4.3 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin protein derişimine

(mg/ml) etkisi………………………………………………………………..59

Şekil 4.4 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin spesifik aktiviteye

(U/mg) etkisi………………………………………………………………....60

Şekil 4.5 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin hücre derişimine

(mg/ml) etkisi………………………………………………………………..60

Şekil 4.6 Soya yağının farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye

(U/ml) etkisi…………………………………………………………………..62

Şekil 4.7 Soya yağının farklı derişimlerinin protein derişimine

(mg/ml) etkisi………………………………………………………………..62

Şekil 4.8 Soya yağının farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye

(U/mg) etkisi…………………………………………………………………63

Şekil 4.9 Soya yağının farklı derişimlerinin hücre derişimine

(mg/ml) etkisi………………………………………………………………..63

Şekil 4.10 Susam yağı (2)’nin farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye

(U/ml) etkisi………………………………………………….......................65

Şekil 4.11 Susam yağı (2)’nin farklı derişimlerinin protein derişimine

(mg/ml) etkisi……………………………………………………….............65

Şekil 4.12 Susam yağı (2)’nin farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye

(U/mg) etkisi……………………………………………………………...…66

Şekil 4.13 Susam yağı (2) nin farklı derişimlerinin hücre derişimine

(mg/ml) etkisi……………………………………………………….............66

Şekil 4.14 Mısır yağının farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye

(U/ml) etkisi……………………………………………………………...…68

x

Şekil 4.15 Mısır yağının farklı derişimlerinin protein derişimine

(mg/ml) etkisi ……………………………………………….......................68

Şekil 4.16 Mısır yağının farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye

(U/mg) etkisi…………………………………………………......................69

Şekil 4.17 Mısır yağının farklı derişimlerinin hücre derişimine

(mg/ml) etkisi……………………………………………….……………...69

Şekil 4.18 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki

bitkisel yağlar ile elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler

(U/ml)……………………………………………………….……………...70


bitkisel yağlar ile elde edilen en yüksek spesifik aktiviteler

(U/ml)………………………………………………………………………71

Şekil 4.20 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin lipolitik aktiviteye

(U/ml) etkisi……………………………………………………...................73

Şekil 4.21 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin protein derişimine

(mg/ml) etkisi…………………………………………..…………………...74

Şekil 4.22 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin spesifik lipaz

aktivitesine (U/mg)etkisi………………………………………....................74

Şekil 4.23 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin hücre derişimine

(mg/ml) etkisi…………………………………………………….................75

Şekil 4.24 Tristearinin farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye

(U/ml) etkisi………………………………………...…………………….…76

Şekil 4.25 Tristearinin farklı derişimlerinin protein derişimine

(mg/ml) etkisi………………………………………………………………76

Şekil 4.26 Tristearinin farklı derişimlerinin spesifik lipaz aktivitesine

(U/mg) etkisi………………………………………………………………..77

Şekil 4.27 Tristearinin farklı derişimlerinin hücre derişimine

(mg/ml) etkisi………………………………………………………………77


yağ asidi esterleri ile elde edilen en yüksek lipolitik

aktiviteler (U/ml)………………………….………..……………………....78

xi


yağ asidi esterleri ile elde edilen en yüksek spesifik

lipaz aktiviteleri (U/mg)…………………………………………................79

Şekil 4.30 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin lipolitik aktiviteye

(U/ml) etkisi………………………………………….……………………...81

Şekil 4.31 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin protein derişimine

(mg/ml)etkisi………………………………………...…………..................82

Şekil 4.32 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin spesifik lipaz aktivitesine

(U/mg) etkisi………………………………………………………………..82

Şekil 4.33 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin hücre derişimine

(mg/ml) etkisi………………………………………………………………83

Şekil 4.34 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin lipaz

aktivitesine (U/ml) etkisi…………………………….……………………..84

Şekil 4.35 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin protein

derişimine (mg/ml) etkisi……………………………………….…………84

Şekil 4.36 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin spesifik

lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi……………………..……………...............85

Şekil 4.37 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin hücre

derişimine (mg/ml) etkisi………………………….……………………….85


yağ asitleri ile elde edilen en yüksek lipolitik

aktiviteler (U/ml)…………………………………..……………………….86


yağ asitleri ile elde edilen en yüksek spesifik

lipaz aktiviteleri (U/mg)…………………………………………………....87

Şekil 4.40 %1 Gliserol içeren ortamın lipaz aktivitesi (U/ml), protein

derişimi (mg/ml) ve spesifik lipaz aktivitesine

(U/mg) etkisi……..........................................................................................88

Şekil 4.41 %1 Gliserol içeren ortamın hücre derişimine (mg/ml) etkisi………………89

Şekil 4.42 Glukozun farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml)

etkisi…………………………………………………..…………………….90

xii

Şekil 4.43 Glukozun farklı derişimlerinin deney sonunda (87. saat)

hücre derişimine etkisi……………………………………………………...90

Şekil 4.44 %1 Peyniraltı suyu içeren ortamın lipaz aktivitesi(U/ml),

protein derişimi (mg/ml) ve spesifik lipaz aktivitesine

(U/mg) etkisi………………………………………………………………...91

Şekil 4.45 %1 Peyniraltı suyu içeren ortamın hücre derişimine

(mg/ml) etkisi………………………………………………………………92

Şekil 4.46 %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton X-100

içeren ortamların lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi…………………………93


içeren ortamların protein derişimine (mg/ml) etkisi………………………..94


içeren ortamların spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi…………………94


içeren ortamların hücre derişimine (mg/ml) etkisi………………………...95

Şekil 4.50 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının lipolitik

aktiviteye (U/ml) etkisi……………………………………………………..97

Şekil 4.51 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının protein

derişimine (mg/ml) etkisi……………………………..…………………….98

Şekil 4.52 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının spesifik lipaz

aktivitesine (U/mg) etkisi……………………………..……………………99

Şekil 4.53 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının hücre derişimine

(mg/ml) etkisi…………………………………………..………………….100

Şekil 4.54 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynakları ile elde edilen

en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml)……………………………………..101

Şekil 4.55 Farklı tür ve derişimdeki yağ asitleri ile elde edilen en yüksek

spesifik lipaz aktiviteleri (U/mg)………………………...……………….102

Şekil 4.56 Farklı ortam pH’larının lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi………………...105

Şekil 4.57 Farklı ortam pH’larının protein derişimine (mg/ml) etkisi……………….105

Şekil 4.58 Farklı ortam pH’larının spesifik lipaz aktivitesine

(U/mg) etkisi………………………………………………..…….............106

xiii

Şekil 4.59 Farklı ortam pH’larının hücre derişimine (mg/ml) etkisi…………...........106

Şekil 4.60 Farklı ortam pH’ları ile elde edilen en yüksek lipolitik

aktiviteler (U/ml)……………………………………………..…………..107

Şekil 4.61 Farklı ortam pH’ları ile elde edilen en yüksek spesifik

lipaz aktiviteleri (U/mg)…………………………………………………..108

Şekil 4.62 Farklı sıcaklıkların lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi………………….......110

Şekil 4.63 Farklı sıcaklıkların protein derişimine (mg/ml) etkisi…………………….110

Şekil 4.64 Farklı sıcaklıkların spesifik lipaz aktivitesine

(U/mg) etkisi……………………………………………………….............111

Şekil 4.65 Farklı sıcaklıkların hücre derişimine (mg/ml) etkisi……………...............111

Şekil 4.66 Farklı ortam sıcaklıkları ile elde edilen en yüksek

lipolitik aktiviteler (U/ml)…………………………………………...……112

Şekil 4.67 Farklı ortam sıcaklıkları ile elde edilen en yüksek

spesifik lipaz aktiviteleri (U/mg)…………………………………….........113

Şekil 4.68 Farklı metal tuzlarının 1 mM’lık derişimlerini içeren

ortamların 48. saatteki lipaz aktiviteleri (U/ml)………..………………....115

Şekil 4.69 Farklı metal tuzlarının 1 mM’lık derişimlerini içeren

ortamların 48. saatteki hücre derişimleri (mg/ml)…………..….……….....115

Şekil 4.70 KCl’nin farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye

(U/ml) etkisi…………………………………………………………….…..117

Şekil 4.71 KCl’nin farklı derişimlerinin protein derişimine

(mg/ml) etkisi……………………………………………………………...117

Şekil 4.72 KCl’nin farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye

(U/mg) etkisi……………………………………………………………….118

Şekil 4.73 KCl’nin farklı derişimlerinin hücre derişimine

(mg/ml) etkisi……………………………………………………………...118

Şekil 4.74 En iyi koşullarda hücre içi ve hücre dışı titrimetrik lipaz

aktiviteleri (U/mg)………………………………………………………....120

Şekil 4.75 En iyi koşullarda hücre içi ve hücre dışı spektrofotometrik

lipaz aktiviteleri (U/mg hücre)…………………………………..………...121

Şekil 4.76 En iyi koşullarda hücre içi ve hücre dışı proteaz

aktiviteleri (U/mg hücre)………………………………………..................121

xiv

Şekil 4.77 En iyi koşullarda hücre dışı protein ve hücre

derişimleri (mg/ml)……………………………………………………….122

Şekil 4.78 Anyon değişim kromatografisi sonucunda elde edilen

kromatogram…………………………………………………………..….124

Şekil 4.79 SDS-PAGE analizi sonuçları……………………………………………..125

xv

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 2.1 Endüstride kullanılan bazı enzimler………………………………………..3

Çizelge 2.2 Deterjan formülasyonlarında ve diğer uygulamalarda

kullanılan ticari enzimler…………………………………………...............7

Çizelge 2.3 Toz ve sıvı deterjanların bileşimi………………………………………….10

Çizelge 2.4 Bazı mikrobiyal lipazların özellikleri………………………………….......21

Çizelge 2.5 Mikrobiyal lipazların endüstriyel uygulamaları………………………...…27

Çizelge 2.6 Ticari deterjan lipazları……………………………………………………29

Çizelge 4.1 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki

bitkisel yağları içeren ortamlarda hesaplanan özgül

çoğalma hızları …………………………………………………………...71

Çizelge 4.2 Kullanılan yağ asidi esterleri ve basit formülleri………………………....72


yağ asidi esterlerini içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma

hızları………………………….………………………………………….79

Çizelge 4.4 Kullanılan yağ asitleri, içerdikleri karbon sayıları

ve molekül formülleri…………………………………………….............80


yağ asitlerini içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma

hızları…………………………………………………………………….87

Çizelge 4.6 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarını

içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma hızları…………………...103

Çizelge 4.7 Farklı ortam pH’larında hesaplanan özgül

çoğalma hızları……………………………………………………….…108

Çizelge 4.8 Farklı ortam sıcaklıklarında hesaplanan özgül

çoğalma hızları……………………………………………………….…113

Çizelge 4.9 KCl’nin farklı derişimleri için hesaplanan özgül

çoğalma hızları………………………………………………………….119

Çizelge 4.10 Lipaz enzimi saflaştırma basamakları………………………….............123

Çizelge 4.11 Saflaştırılmış lipaz enzimi aktivitesine deterjan katkıları

etkisi……………………………………………………………………126

38

1. GİRİŞ Enzimler reaksiyonların ılımlı koşullar altında gerçekleşmesini sağlayan yüksek

katalitik etkinliğe sahip biyokatalizörlerdir. Bu özellikleri ile günümüzde gıda,

kozmetik, farmasötik, tekstil, deri, kağıt ve deterjan gibi çok çeşitli endüstrilerde

kullanım alanı bulmaktadırlar. Enzimlerin en önemli uygulama alanlarından biri

deterjan endüstrisidir.

Deterjanlara, temizleme etkilerini artırabilmek amacıyla katkı maddeleri konulur.

Bunlar yüzey aktif maddeler, temizleme gücünü arttırıcı maddeler, yapıcı maddeler

(alkaliler, kompleks yapıcılar, iyon değiştiriciler), köpük düzenleyiciler, enzimler,

ağartıcılar, korozyon önleyiciler, parfüm, antiseptik maddeler, antidepozitörler ve

aşınma önleyicilerdir. Deterjan katkı maddeleri içinde önemli bir yeri olan enzimler,

deterjan formülasyonuna lekelerin çıkarılmasını kolaylaştırmak amacıyla katılırlar.

Deterjan enzimleri, başlıca proteinlere etki eden proteazlar, nişastalara etki eden

amilazlar ve yağlara etki eden lipazlardır.

Deterjanlarda kullanılan enzimler, yüksek pH ve sıcaklıkta kararlı olmalı, oksidasyona,

şelatlama ajanlarına dayanıklı olmalı, düşük derişimlerde aktif olmalı ve geniş substrat

spesifikliğine sahip olmalıdır. Deterjan formüllerinde ilk olarak kullanılan enzim 1913

yılında bir proteaz olan tripsin, sonra sırasıyla amilaz, selülaz ve lipaz olmuştur.

Enzimler etkilerini kısa sürede gösteremezler ve genellikle 50oC’ın altında aktiftirler;

daha yüksek sıcaklıklarda ise bozunabilirler. Enzimlerin, özellikle yıkama prosesinin

esas yıkamaya geçmeden önce ön hazırlık olarak soğuk suyla ıslatma içerdiği

durumlarda kullanımları daha uygundur. Yıkama koşullarının ılımlı hale getirilmesi -

çevre kirliliği etkileri düşünülerek fosfat içermeyen deterjanların kullanımı ve enerji

kullanımının azaltılması- ile düşük yıkama sıcaklıklarında çalışılması enzimlerin

deterjan formülasyonlarındaki önemini artırmaktadır.

Günümüzde Japonya, Amerika ve Avrupa ülkelerinin çoğu, deterjanlarda enzim

kullanmaktadır. Japonya’daki tüm deterjan markaları enzim içermektedir. Avrupa’da

39

çok uzun zamandan beri kaliteli deterjanların vazgeçilmez unsuru olan enzimler,

Türkiye’de 1982 yılından itibaren kullanılmaya başlanmıştır. Deterjan enzimlerinin

üretimi ve özelliklerinin geliştirilmesi, bugün pek çok bilim insanının üzerinde çalıştığı

bir konudur.

Deterjanlarda kullanılan hidrolitik enzimler içerisinde önemli bir yere sahip olan

lipazlar, proteaz içeren deterjanların yıkama kapasitesini artırır; trigliseritleri yağ asidi

ve gliserole hidrolizleme özellikleri ile yağlı yiyecek lekelerinin ve kumaşlardaki

sebumun çıkarılmasını sağlarlar. Lipazlar bitki ve hayvan dokularından ekstraksiyonla

veya mikroorganizmalardan fermantasyon yoluyla üretilirler. Ticari lipazlar genelde

mikrobiyal kaynaklıdır. Lipaz üreten mikroorganizmalar bakteriler, fungi ve

mayalardır. Mikrobiyal lipazlar çoğunlukla sıvı ortamda üretilir. Lipaz üretiminde

karbon ve azot kaynaklarının türü ve derişimi, üretim pH’ı, sıcaklık, metal iyonları ve

çözünmüş oksijen derişimi etkilidir.

Tez projesi kapsamında, süt mamulleri üretim tesisi yağlı atığından izole edilen ve

genetik tanımlama ile türünün Debaryomyces hansenii olduğu belirlenen mayadan,

deterjanlarda kullanımını araştırmak üzere aktif ve kararlı lipaz üretimi için karbon ve

azot kaynakları, metal iyonları, sıcaklık, pH gibi uygun üretim koşullarının belirlenmesi

amaçlanmıştır. Mikroorganizmadan üretilen lipaz kısmen saflaştırılarak, bazı deterjan

katkı maddelerinin varlığında aktivitesi incelenmiş ve enzimin deterjanlarda kullanıma

uygunluğu araştırılmıştır. Çalışma, lipaz üretimi için atıktan izole edilmiş bir

mikroorganizmanın kullanılması, türü sekans analizlerini kapsayan genetik bir çalışma

sonucu Debaryomyces hansenii olarak belirlenmiş mayadan lipaz üretim koşullarının

optimizasyonu ile ilgili literatürde bir çalışmanın olmaması, üretilen lipazın dünya

pazarında önemli yeri olan deterjan sektöründe kullanım potansiyelinin olması

nedeniyle önem kazanmaktadır.

40

2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Enzimler ve Kullanım Alanları Enzimler canlı sistemlerde gerçekleşen biyokimyasal reaksiyonlarda yer alarak

reaksiyonun daha ılımlı şartlar altında gerçekleşmesini sağlayan ve biyokatalizör olarak

bilinen, protein yapılı moleküllerdir. Günümüzde enzimler; gıda, tekstil, farmasötik,

deterjan, kağıt ve deri endüstrisi, kozmetik, parfümeri, biyosensör üretimi gibi çok

çeşitli alanlarda kullanılmaktadır. Enzimlerin katalitik potansiyeli anlaşıldıktan sonra,

bu çok faydalı maddelerden endüstride geniş ölçüde yararlanılmaya başlanmıştır. Bugün

çok sayıda enzim bilinmesine rağmen, büyük miktarlarda üretimi yapılan ve endüstriyel

amaçla kullanılan enzim sayısı azdır. Endüstride kullanılan bazı enzim grupları ve

uygulama alanları Çizelge 2.1’de verilmektedir.

Çizelge 2.1 Endüstride kullanılan bazı enzimler (Telefoncu 1997)

Uygulama Alanı Enzim

Yağların parçalanması ve interesterifikasyon Lipazlar

Peynir üretimi Rennin, pepsin

Sindirime yardımcı Çeşitli proteazlar

Etin gevrekleştirilmesi Papain

Dericilik Çeşitli proteazlar

Nişasta hidrolizi Amilaz (α ve β), pullulanaz

Sakkoroz inversiyonu Invertaz

Meyve suyu, sirke ve şarap berraklaştırma Pektinazlar

Lezzet kontrolü (tat verici) Nükleazlar

Besin maddesinden istenmeyen ve toksik bileşiklerin

uzaklaştırılması

Hidrolitik enzimler

Oksidasyonun önlenmesi ve besin maddelerinde renk kontrolü Oksidazlar

Amino asit üretimi Pronaz, amino peptidaz

Peynir atık suyu ve sütteki laktozun hidrolizi Laktaz (β-galaktosidaz)

Selüloz hidrolizi Selülaz

Dekstroz üretimi Amiloglikosidaz

Penisilin üretimi Penisilin amidaz

41

Çizelge 2.1 Endüstride kullanılan bazı enzimler (devam)

Organik sentezler Değişik enzimler

Sterilizasyon ve soğuk pastörizasyon Katalaz

Glukozun fruktoza dönüştürülmesi Glukoz izomeraz

2.2 Enzimlerin Deterjan Formülasyonlarındaki Yeri ve Deterjanlarda

Kullanımının Önemi

Deterjanlarda genel olarak yüzey aktif maddeler, yapıcı maddeler, köpük düzenleyiciler,

asıltı yapıcı ve yeniden çökmeyi önleyici maddeler (antidepozitörler), enzimler,

korozyon önleyiciler, ağartıcılar, yumuşatıcılar, parfüm ve antiseptik maddeler bulunur.

Enzimler lekeleri çıkarmak için ihtiyaç duyulan üstün bir temizleme performansı

göstermeleri nedeniyle deterjanlarda kullanılmaya başlanmıştır. Her bir enzim, belirli

tipte bir lekeyi çıkarma yeteneğine sahiptir. Enzimler tekrarlanan yıkamalara olan

ihtiyacı, daha ilk yıkamada zorlu kirlerin büyük çoğunluğunu çıkararak önleyebilirler.

Enzimler yıkama sıcaklığını düşürerek tüketicilerin enerji masrafını azaltırlar. Enzimler

çevre dostudur. Sentetik deterjanlar yavaş bir şekilde biyobozunmaya uğrayarak ciddi

ekolojik problemlere neden olmakla birlikte enzim kullanımıyla bu problemlerin

üstesinden gelinebilmektedir. Ayrıca toksisitelerinin az oluşu ve korozif olmamaları

enzimlerin deterjanlarda kullanımını özendirici diğer üstün özellikleridir.

2.3 Enzim Esaslı Deterjanlardaki Gelişme

Enzimler deterjan katkısı olarak ilk kez 1913 yılında Alman kimyacı Otto Rohm

tarafından kullanılmıştır. Rohm, pankreatik enzimlerin (tripsin, kimotripsin gibi

proteazlar) çamaşır temizlemede yıkama yardımcıları olarak kullanılabileceğini

gösterdikten sonra Rohm patentli ürün ‘Burnes’ adı altında ön yıkama deterjanı olarak

piyasaya sunulmuştur. Ürün, esas olarak sodyum karbonat ve hayvanların pankreatik

bezlerinden elde edilmiş az miktarda pankreatin içermektedir. Enzimin proteolitik

42

aktivitesi günümüz deterjanlarından oldukça düşüktür. Bu ürün yaklaşık 50 yıl Avrupa

marketlerinde satılmıştır (Starace 1983, Telefoncu 1997, Kumar et al. 1998).

İkinci Dünya Savaşında, yağ ve sabuna olan ihtiyaç sonucunda enzimatik yıkama

ajanları önem kazanmıştır. 1940’larda İsviçre’de enzimlerin sabun tüketimini

azaltabileceğine dair raporlar yayınlanmıştır. 1940’ların sonuna yaklaşılırken, insülin

üretimi için pankreatik bezlere olan talep tripsinin çamaşır yıkama ürünlerinde

kullanımını sınırlamıştır. Pankreatik enzimlerin çamaşır yıkama maddelerine karşı

nispeten daha az kararlılık göstermesi, bilim adamlarına bakteriyel fermantasyonla

üretilecek enzimin, pankreatik tripsine avantajlar sağlayabileceğini düşündürmüştür. Bu

şekilde bulunan nötral bakteriyel proteaz, tripsine göre büyük bir gelişme olmasına

rağmen enzim, hala pH 9-10 aralığında düşük bir kararlılık göstermekteydi (Starace

1983).

1959’da İsviçreli kimyacı Dr. Jaag, Bio 40 olarak adlandırılan tripsin yerine bakteriyal

bir proteaz içeren yeni bir ürün geliştirmiştir (http://www.mapsenzymes.com 2005).

1960’ların ortalarında, Bacillus licheniformis tarafından üretilen bir proteaz örneği,

alkali pH’larda (pH=8-10) kararlı ve aktif olup Novo Industry A/S tarafından ‘Alkalase’

ticari ismiyle piyasaya sunulmuştur (Kumar et al. 1998).

1970’lerde proteazların deterjanlarda kullanımında geçici bir duraklama olmuştur;

çünkü bazı üreticiler ve kullanıcılarda alerjik reaksiyonlar gözlenmiştir. Bu problem, toz

oluşumunu önleyen, enzimi saklarken diğer deterjan bileşenlerinin olumsuz etkilerinden

koruyan tozsuz granüllerin geliştirilmesiyle çözülmüştür (Kumar et al. 1998).

1985’te Novo, Humicola isolens’ten elde edilmiş, kiri ortadan kaldırmak, pamuklu

tekstilleri yumuşatmak ve eski renklerine kavuşturmak için üretilmiş olan, deterjan

sanayinde bir devrim yaratan selülaz deterjan enzimini, ‘Cellulase’ı sunmuştur (Kumar

et al. 1998).

43

Son yirmi yılda, rekombinant DNA teknolojilerinin başka bir ifade ile genetik ve

protein mühendisliğinin uygulamaları ile enzimolojideki yeni gelişmeler,

biyomühendislik ürünü enzimlerin çağını başlatmıştır. Novo 1988’de deterjan lipazını

ilk biyomühendislik ürünü olarak ‘Lipolase’ adıyla sunmuştur (Kumar et al. 1998).

Novo enzimin, 60oC’a kadar olan sıcaklıklarda ve pH 7-11’de kararlı olduğunu

bildirmiştir. Lipolase, aktivitesini, fosfat ve surfaktan gibi diğer deterjan bileşenlerine

karşı koruyabiliyor ve proteinleri parçalayan proteaz enzimiyle birlikte

kullanılabiliyordu (Gillis 1988).

1989’da yine rekombinant DNA teknolojisine dayanılarak başka enzimler de pazara

sunulmuştur (Kumar et al. 1998):

Savinase-Novo Nordisk, Denmark

Maxacal-Gist-brocades, Delft

Subtilisin Novo-Genencor International of California

Daha sonra enzim deterjanı imalatçıları, daha iyi yıkama performansı ve perboratlar gibi

oksidatif ağartma ajanlarına karşı daha kararlı yeni jenerasyon enzimler keşfetmiştir

(Kumar et al. 1998):

Maxapem- Solvey Enzymes, Germany

Durazym- Novo Nordisk, Denmark

Çizelge 2.2’de deterjan formülasyonlarında ve diğer uygulamalarda kullanılan

enzimlere örnekler verilmiştir.

44

Çizelge 2.2 Deterjan formülasyonlarında ve diğer uygulamalarda kullanılan ticari enzimler (Kumar et al. 1998) Ticari İsim Mikroorganizma Optimum Optimum İmalatçı Firma pH sıcaklık (oC) Alkali proteazlar/Subtilisinler Alcalase Bacillus 8-9 60 Novo Nordisk licheniformis Bagsvaerd, Denmark Savinase Alcalophilic 9-11 55 Novo Nordisk, Denmark Bacillus sp. Esperase Alcalophilic 9-11 60 Novo Nordisk, Denmark Bacillus sp. Maxacal Alcalophilic 11 60 Gist-brocades, Delft Bacillus sp. The Netherlands Maxatase Alcalophilic 9.5-10 60 Gist-brocades Bacillus sp. The Netherlands Opticlean Alcalophilic 10-11 50-60 Solvey Enzymes Gmbh Bacillus sp. Hannover, Germany Optimase Alcalophilic 9-10 60-65 Solvey, Germany Bacillus sp. Protosol Alcalophilic 10 50 Advanced Biochemical Ltd Bacillus sp. Thanc, India Alcaline Alcalophilic 10-11 40-50 Wuxi Synder Bioproduct Ltd protese ‘Wuxi’ Bacillus sp. Chine Proleather Alcalophilic 10 50 Amano Pharmaceuticals Ltd Bacillus sp. Nagoya, Japan Protease P Aspergillus sp. 8 40 Amano, Japan Durazym Protein engineered 10-10.5 50 Novo Nordisk, Denmark variant of SavinaseTM

Maxapem Bleach-resistant, 11-12 60 Solvay, Germany protein engineered variant of alkalophilic Bacillus sp. Purafect Recombinant enzyme 10 40-65 Genencor International Inc. Donor- B. lentus Rochester, USA Expressed in Bacillus sp. Amilazlar BAN Bacillus 6-7 70 Novo Nordisk, Denmark amyloliquefaciens Termamyl Donor- Humicola sp. 7-8 70-75 Novo Nordisk, Denmark Expressed in Aspergillus sp.

45

Çizelge 2.2 Deterjan formülasyonlarında ve diğer uygulamalarda kullanılan ticari enzimler (devam) Maxamyl Alkalophilic 6-8.5 100 Gist-brocades, Bacillus sp. The Netherlands Solvay Thermostable Bacillus 5-8 75-90 Solvay, Germany amylase licheniformis Lipazlar Lipolase Recombinant enzyme 10.5-11 40 Novo Nordisk, Denmark Donor- Humicola lanuginosa Expressed in Aspergillus oryzae Lumafast Recombinant enzyme 7.5-9 60 Genencor, USA Donor- Pseudomonas mendocina Expressed in Bacillus sp. Lipofast NA* 8.5 50 Advanced Biochemicals, India Cellulase Celluzyme Humicola insolens 6-7 50-55 Novo Nordisk, Denmark

*Mevcut değil Son zamanlarda Çizelge 2.2 ile verilen enzimlere yenileri katılmıştır. Örneğin

İsviçre’nin en iyi satan çamaşır deterjanı markası Total, beyaz çamaşırlar için bir selülaz

enzimi olan Endolase’ı içeren bir sıvı deterjan piyasaya sunmuştur. Deterjan proteaz

enzimi Savinase ve amilaz enzimi Termamyl’i de içermektedir. Renklilerde Carezyme

daha iyi sonuç vermektedir. Carezym giyeceklerde tüylenme sonucu oluşan

topaklaşmaları gidermede daha etkili bir enzimdir. Bunun sonucu olarak giysilerin

renklerine parlaklık verir. Endolase ise çok iyi bir antiredepozitördür

(http://www.novozymes.com, 2006).

1990-1995 arasında çok sayıda protein mühendisliği ürünü lipaz deterjan enzimi olarak

incelenmiştir. 1996’da Novo Nordisk’in Danimarka’daki pilot ölçekli fermantasyon

fabrikasında verimli bir türden elde edilen enzimler, tipik yıkama koşulları altında test

edilmiştir. Bu testler boyunca LipoPrime, proteaz ve ağartma ajanı varlığında, geniş bir

46

su sertliği aralığında kararlılık gösterebilmiştir. Enzim 10-50oC aralığında performans

göstererek maksimum aktivitesini 20-30oC’da göstermiştir. LipoPrime, Avrupa

şartlarına, Amerika ve Asya’ya oranla daha uygun bulunmuştur. Bunun, deterjan

formüllerine katılan surfaktan bileşimindeki farklılıktan olduğu düşünülmüştür.

Avrupa’daki deterjanlarda non-iyonik ve anyonik surfaktanların kullanılması,

LipoPrime’ın daha iyi bir yıkama performansı göstermesini sağlamıştır


Novo Nordisk tarafından piyasaya sunulan başka bir deterjan lipazı Lipex’dir. Lipex de

LipoPrime gibi 20oC’a kadar düşük sıcaklıklarda iyi bir performans göstermektedir.

Sadece yüzeydeki yağ asitlerini değil, liflerin içine işlemiş yağ asitlerini de çıkarır.

Liflerin içinde tutulan yağlar, Lipex ile gliserin ve yağ asitlerine parçalanır ve surfaktan

sistemiyle uzaklaştırılır (http://www.novozymes.com, 2006).

Yine Novo Nordisk’in insanlara tanıştırdığı proteaz Kannase, 10-20oC gibi çok düşük

sıcaklıklarda bile yüksek bir etki gösterebilmektedir. Bu, çamaşırların soğuk suyla

yıkandığı Japonya, diğer Asya ülkeleri, Avustralya, Afrika ve Latin Amerika için

oldukça önem taşır. Karşılaştırma amacıyla, Avrupa’da suyun yıkama makinelerinde

ısıtıldığını ve en iyi yıkama sıcaklığının 40oC olduğunu belirtmek gerekir. Şimdiye

kadar proteazlar, sıcak sularda kullanıma en uygun enzim olmasına rağmen düşük

sıcaklıklarda da kullanılabilmekteydi. Savinase’ın Japonya gibi çamaşır yıkamada

soğuk su kullanan ülkelerde geniş bir kullanım alanı bulmasının nedeni de budur.

Bununla birlikte Kannase 15oC’ta gerçekleştirilen yıkama testlerinde Savinase’dan daha

iyi bir temizleme performansı göstermiş olup düşük sıcaklık yıkamaları için daha

uygundur (http://www.novozymes.com, 2006).

Polarzyme, Novo Nordisk’in sunduğu başka bir düşük sıcaklık enzimidir. Daha az

kimyasal kullanımıyla güçlü bir temizlik sağladığı için, çevre kirliliğini önlemek

açısından düşünüldüğünde oldukça faydalı bir enzimdir. Günlük deterjanla temas göz

önünde tutulursa, daha az tehlikelidir. Ayrıca enzim, narin kumaşları korur


47

Stainzyme, bulaşık ve çamaşır deterjanlarında kullanılan ve en çok nişasta bazlı lekeleri

çıkaran bir deterjan enzimidir. Çamaşırlarda beyazlığı artırır, renkleri korur. 40-55oC

arasında en iyi performansını gösterir. Hem tablet halinde, hem de sıvı deterjanlarda

kullanılır. Ayrıca enzim, bulaşık deterjanlarında yaşanan büyük problemlerden biri olan,

cam yüzeyinde zamanla biriken nişastanın yarattığı matlığın giderilmesinde diğer

amilazlardan daha çok umut vaat etmektedir (http://www.novozymes.com, 2006).

2.4 Enzimlerin Deterjanlarda Bulunuş Şekilleri ve Formülasyona Katılacak

Enzimin Hazırlanması

Enzimler deterjanlarda önceleri toz halinde kullanılıyorken granülasyon tekniklerinin

ilerlemesi ile enzimler vakslı maddelerle kapsüllenerek kullanılmaya başlanmıştır.

Enzimler için sıvı formülasyonlar da mevcuttur (Kumar et al. 1998). Toz deterjan ve

tabletlerde enzimler granüllere bağlanmış halde kullanılmaktadır. Enzim, koruyucu

madde olarak NaCl gibi inorganik bir tuz ve şeker içeren bir karışımla birleştirilir ve

karboksimetil selüloz veya benzeri bir kolloidin fiberleri ile sağlamlaştırılır. Oluşan bu

iç, parafin yağı veya polietilen glikol ile hidrofilik bağ yapıcılardan oluştuğu için yıkama

esnasında dağılan, inert vakslı materyalle kaplanır (Chaplin and Bucke 1990). Enzim

içeren partiküllerin boyutu segregasyonu (ayrılma) önlemek için iyi ayarlanmalıdır.

Granüller genellikle 0.5 mm boyutundadır. Partiküller kolayca çözünebilmelidir.

Günümüzde vaks kaplı enzim deterjan granülleri diğer deterjan granüllerinden renkli

oluşlarıyla ayrılır. Renkli granüller deterjanlarda ekstradan eklenen aktif bir bileşenin

varlığını sembolize eder ve deterjan imalatçıları tarafından ‘işaret granülleri’ olarak

isimlendirilir (Telefoncu 1997). Çizelge 2.3’te toz ve sıvı deterjanların bileşimi

verilmektedir.

Çizelge 2.3 Toz ve sıvı deterjanların bileşimi (Telefoncu 1997)

Bileşen Toz (% ) Sıvı (%)

Anyonik sürfaktanlar 2-10 8-10

Noniyonik sürfaktanlar 0.5-6 18-20

48

Çizelge 2.3 Toz ve sıvı deterjanların bileşimi (devam)

Sabun 2-5 7-12

Sekuestranlar 30-50

Etilendiamin 1

tetraasetikasit

Ağartıcı + Aktivatör 20-30

Trietonolamin 7-13

Etanol 4-6

Propilenglikol 4-6

Enzimler 0.5 1

Parfüm 0.2 0.4

Optik beyazlatıcılar 0.4-0.8 0.2

Sodyum Sülfat %100’e tamamlanır

Su %100’e tamamlanır

Enzimler deterjan formüllerine çok az miktarda katılır. Çok düşük kullanım derişimi,

biyokatalizör oldukları gerçeğine dayanır. Temizleme prosesi boyunca enzimin kendisi

tükenmez ve tek bir enzim çok sayıda reaksiyonu başlatabilir (Kumar et al. 1998).

Sıvı deterjanlarda en büyük problem otoparçalanmadır (otoproteoliziz). Alkali pH ve

iyonik bileşiklerin varlığı proteazların otoparçalanmasına neden olur. Serbest su

derişiminin azaltılması ve enzimi tersinir olarak inhibe eden ve kararlı hale getiren borat

veya fenil boronik asit türevlerinin kullanımıyla bu problemin üstesinden gelinmeye

çalışılmaktadır (Maurer 2004). Son zamanlardaki enzim uygulamaları, enzimatik sıvı

deterjanların performansını artırmayı amaç edinmiştir (Mitidieri et al. 2006).

Toz halindeki enzimlerin otoliziz ve nem varlığında, deterjan bileşenlerinin zararlı

etkilerine bağlı olarak kararlılıklarının azalması problemi, granülasyon tekniklerinin

gelişmesiyle enzimin inert, suda çözünen vakslı maddelerle kaplanması sonucu

azalmıştır (Kumar et al. 1998).

49

Enzim esaslı otomatik bulaşık yıkama deterjanlarına, sitrat ve diğer poliakrilat yapıcılar

eklenmektedir. Bunun haricinde perboratlar ve perkarbonatlar da kullanılır. Bu peroksi

ağartıcı oluşturan sistemler, enzimler için çok zararlı değildir ve tetraasetiletilendiamin

(TAED) gibi aktivatörlerin de eklenmesiyle, düşük sıcaklıklarda kabul edilebilir bir

ağartma faaliyetini mümkün kılarlar (Kumar et al. 1998).

Tabletlerin preslenmesinde ağartma bileşenleri ile olan yoğun temastan dolayı

enzimlerin depolama kararlılığının yüksek olması gerekir (Maurer 2004). Depolama

kararlılığı, enzim üreticilerinin başlıca endişesidir. Saklama esnasında enzim, proteolitik

ve otolitik parçalanmaya uğrayabilir. Enzim aktivitesi, sert operasyon koşullarına ani

maruz kalma sonucunda hızla düşebileceği gibi, fabrikada, taşıma esnasında; örneğin

müşterilere gemi ile nakilde, müşteri hizmetlerinde, örneğin depolamada da aktivite

kaybıyla karşılaşılabilir. Enzimin inaktivasyon hızı, büyük ölçüde, sıcaklığa, pH ve

yüzey aktif ajanlara, bağlayıcılar ve ağartma ajanları gibi deterjan bileşenlerine bağlıdır.

Bunun haricinde, yüksek sıcaklık ve alkalilik, daha az kararlı enzim demektir (Kumar et

al. 1998).

Enzimin aktivite kaybı, temelde polipeptit zincirinin kısmen açılmasına bağlıdır.

İnaktivasyon ajanı, bunu, doğal konformasyonu muhafaza eden, kovalent olmayan

bağların zayıf dengesini bozarak gerçekleştirir. Enzimi kararlı kılmak için ideal

yaklaşım, inaktivasyon mekanizmasını belirlemek ve mekanizmanın gerçekleşmesini

önleyen bir prosedür tasarlamaktır (Kumar et al. 1998).

Enzimi denaturasyona karşı korumak için, Ca tuzları, Na format, borat, polihidrik

alkoller ve protein örnekleri gibi kararlaştırıcıların eklenmesi başarı sağlamıştır.

Saklama sırasında, son ticari ham örneğin kontaminasyonunu önlemek için, %18-20

derişimdeki NaCl eklenmesi iyi sonuç vermiştir. Bu prosesler, enzim aktivitesini korur

ve saklama kararlılığını iyileştirir. Saklamadaki uygun amaçlar için sıvı enzim örnekleri,

çoğunlukla liyofilizasyondan daha ucuz ve ılımlı vakum veya havada kurutma ile toz

haline getirilir (Kumar et al. 1998).

50

Deterjanlarda kullanılacak enzimler için, öncelikle uygun mikroorganizma kaynakları

seçilmelidir. Bunun için doğa, zengin bir kaynaktır. Toprak ve su örneklerinden izole

edilen mikroorganizmaların taranması ile en uygun deterjan enzimi kaynakları

belirlenir. Novozymes her hafta 1 milyondan fazla enzimin kapasitesini araştıracak bir

teknoloji platformu yaratmıştır. En çok umut veren kaynaklar daha detaylı bir analize

tabi tutulmaktadır. Belirli bir enzim tanımlandıktan sonra, klasik yöntemlerle ya da

protein mühendisliği ilkeleriyle enzim performansı artırılmaya çalışılır (Maurer 2004,

http://www.housekeepingchannel.com, 2005).

Endüstriyel ürünleri üretmek için fermantasyon, bir vialdeki kurutulmuş veya

dondurulmuş mikroorganizma ile başlar. Bu mikroorganizma, Bacillus gibi bir bakteri,

Aspergillus veya Trichoderma gibi bir fungus veya Saccharomyces cerevisiae gibi bir

maya türü olabilir. Bu mikroorganizmalar, büyük miktarlarda protein üretimi için

ihtiyaç duyulan temel mekanizmaya sahiptir ve patojenik değildir

(http://www.housekeepingchannel.com, 2005).

Enzim fermantasyonunu enzimi ayırma ve saflaştırma prosesleri izler. Bunlar, fermente

edilmiş ürünün, formülasyon için hazır, saf ve deriştirilmiş ürünlere dönüştürülmesi

için yapılan işlemleri tanımlamada kullanılmaktadır. İlk önce, enzim fermantasyon

biyokütlesinden ekstrakte edilmelidir. Bu işlem, biyokütlenin santrifüj veya filtrasyon

ile uzaklaştırılmasının ardından fermantasyon sıvısına çeşitli kimyasal maddeler

eklenerek gerçekleştirilir (http://www.housekeepingchannel.com, 2005).

Enzim ekstraksiyonundan sonra, enzim yarı geçirgen membranlar veya buharlaştırma

yardımıyla deriştirilir. Ürünler yüksek saflıkta istendiğinden proses, sıkça, istenmeyen

safsızlıkları ortadan kaldırmak için özel bir adıma ihtiyaç duyar. Bu çoğu kez seçici

çöktürme, safsızlıkların adsorpsiyonu veya son derece saf enzim ürünlerinin elde

edilebileceği ileri kristalizasyon tekniği ile yapılabilir (http://www.

housekeepingchannel.com, 2005).

Enzim üretiminin son aşaması formülasyondur. Formülasyon, ürünün son haline (sıvı

veya kuru) ve enzim aktivitesine karar vermektir. Deterjan formülasyonları artık birden

51

fazla enzimi kapsamaktadır. En başarılı markaların çoğu, iki, üç veya dört farklı enzim

tipini kapsamaktadır. Novozymes’in özellikle donatılmış ev laboratuarlarında, temel

deterjan formülasyonlarına eklenecek enzimin çeşidi ve dozunu optimize edecek titiz

yıkama denemeleri yapılmaktadır (http://www.housekeepingchannel.com, 2005).

Novozymes’in deterjan teknik servis takımından Claus Ladefoged, bir çamaşır

deterjanının çeşitli enzimleri içermesinin ilerde temizleme performansını geliştirmeye

nasıl yardımcı olduğunu şöyle açıklar: ‘‘Bir enzim deterjanında herhangi bir enzimin

derişiminin arttırılması temizleme performansını ancak belli bir maksimum performans

platosuna ulaştırır, daha fazla fayda ancak deterjan formülasyonlarına yeni enzimlerin

eklenmesiyle sağlanabilir” (http://www.housekeepingchannel.com, 2005).

2.5 İdeal Deterjan Enzimlerinin Özellikleri Deterjan enzimleri; çeşitli deterjan bileşenleriyle yüksek sıcaklıklarda bir arada

bulunabilmeli, deterjan çözeltilerinde düşük seviyelerde (%0.4-0.8) etkili olabilmeli ve

uzun bir raf ömrüne sahip olmalıdır.

Deterjan enzimlerinin, kullanım koşullarına direnç yetenekleri önemlidir. Enzim,

granüle halden serbest hale geçtiği zaman, anyonik ve noniyonik surfaktanlara, sodyum

perborat gibi H2O2 üreten oksidantlara, optik beyazlatıcılara ve diğer reaktif

materyallere pH 8-10.5 arasındaki tüm pH’larda dirençli olmalıdır. Enzimlerin deterjan

bileşimine katılmasının bir nedeni, düşük yıkama sıcaklıklarında çalışabilmeyi

sağlayarak enerji tüketiminde tasarruf sağlamak olsa da, enzimin 60oC’ın üzerinde de

aktivitesini koruyabilmesi istenir (Chaplin and Bucke 1990).

2.6 Deterjan Enzimleri

En çok kullanılan deterjan enzimleri; proteaz, amilaz, selülaz ve lipazdır. Gıda

ürünlerinde stabilizör ve koyulaştırma ajanı olarak kullanılan guar gum içeren yiyecek

lekelerini çıkarmada mannanaz enzimi de kullanılmaktadır (Kirk et al. 2002,

52

http://www.mapsenzymes.com, 2005). H2O2 üretme anlamında, glukoz oksidaz,

lipoksigenaz ve gliserol oksidaz enzimleri de deterjan formülasyonuna katılabilir.

Peroksitin ağartma etkisine, peroksidazların katılımı da yardımcı olabilir (Chaplin and

Bucke 1990).

2.6.1 Proteazlar

Proteazlar deterjan endüstrisinde en çok kullanılan enzimlerdir. Çimen, kan, süt,

yumurta ve ter gibi protein lekelerini çıkarırlar. Proteazlar proteinleri hidroliz eder ve

daha iyi çözünebilen polipeptitlere veya serbest amino asitlere parçalar

(http://www.mapsenzymes.com, 2005). Deterjan endüstrisinde kullanılan bütün

proteazları Bacillus türlerinden elde edilen subtilisinler sağlar. Subtilisinlerin başarısı,

yüksek kararlılık ve nispeten düşük substrat spesifikliğine dayanır. Subtilisinler her tip

çamaşır deterjanında ve otomatik bulaşık deterjanlarında kullanılır (Maurer 2004).

2.6.2 Selülazlar

Deterjan enzimlerinin gelişimi esas olarak lekeleri çıkarma yeteneği olan enzimler

üzerine odaklanmıştır. Bununla birlikte selülaz enzimi pamuk veya pamuk

karışımındaki selüloz lifin yapısını değiştirmeyi mümkün kılan özelliklere sahiptir

(http://www.mapsenzymes.com, 2005). Deterjanlarda selülaz kullanımı renk parlatma,

yumuşatma, kirlerin çıkarılması gibi önemli faydalar sağlar.

2.6.3 Amilazlar

Amilazlar, patates, spagetti, krema ve çikolata gibi nişasta esaslı yiyecek kalıntılarının

çıkarılmasında kullanılır. Enzimatik deterjan formülasyonlarında kullanılan ilk enzim

sınıfı proteaz olup, kullanılan ikinci enzim çeşidini amilazlar oluşturur. Amilaz sadece

çamaşır deterjanlarında değil, bulaşık deterjanlarında da kullanılmaktadır (Mitidieri et.

al. 2006, http://www.mapsenzymes.com, 2005). Deterjanlarda amilazın kullanımı, bir α-

53

amilaz olan Termamyl ile olmuştur. Termamyl B. licheniformis’ten elde edilmiş bir

enzimdir. α-Amilaz, özellikle bulaşıkta ve çamaşıra sertlik ve parlaklık veren bir çeşit

özel nişasta olan kolanın çıkarılmasında kullanışlıdır. Termamyl ve Alcalase’ı birlikte

içeren preparasyonlar üretilmiştir. Proteolizize karşı dirençli bir enzim olan Termamyl,

fonksiyonunu tamamlayabilmesi için yeteri kadar uzun bir süre aktivitesini

koruyabilmektedir (Chaplin and Bucke 1990). Çoğunlukla enzimler 20-60oC arasında

çalışırken, Termamyl aktivitesini 100oC’ın üzerinde bile sürdürür (http://www.

novozymes.com, 2006).

2.6.4 Lipazlar

Lipazlar (trigliserol açilhidrolazlar; EC 3.1.1.3), hidrolitik enzimlerden serin hidrolazlar

grubunda yer almaktadır. Hidrolitik enzimler, proteinlerde, lipidlerde ve şeker

konjugelerinde bulunan ester ve amit bağlarını hidrolizler ve serin hidrolazlar, sistein

hidrolazlar, metalloproteazlar ve aspartil proteazlar olmak üzere dört gruba ayrılırlar.

Serin hidrolazlar grubuna giren enzimler aktif bölgelerinde, serin, histidin ve genellikle

aspartik asitten oluşan bir katalitik üçlü taşır. Serin kalıntısı, başlangıç nükleofil görevi

görerek ürün oluşumunu katalizler. Serin hidrolazlara örnek olarak kimotripsin, subtilisin

ve lipaz verilebilir. Hidrolitik enzimler arasında lipazlar en geniş kullanım alanına sahip

enzimlerdir (Ünlü 2004).

Lipazlar, sulu ortamda yağların hidrolizini katalizleyerek, diaçilgliserin,

monoaçilgliserin, gliserin ve serbest yağ asitlerini oluşturur. Gerçekleşen enzimatik

reaksiyonlar çoğunlukla tersinirdir (Telefoncu 1997). Triaçilgliserollerden gliserin ve

serbest yağ asitlerinin oluşumu Eşitlik 2.1’de verilmektedir.

………….(2.1)

triaçilgliserol su gliserol (gliserin) yağ asidi

Lipazlar

54

Lipazların doğal substratları olan uzun zincirli yağ asitlerinin gliserin esterleri suda çok

az çözünürler. Lipazlar, enzimin çözündüğü sulu faz ve su ile karışmayan substrat fazı

arasındaki arayüzeyde ester bağlarının hidrolizini katalizler. Lipazların suda çözünen

esterlere karşı aktiviteleri oldukça düşüktür (Telefoncu 1997).

Lipaz katalizli reaksiyonlar iki temel kategoride incelenebilir;

(i) Hidroliz

RCOOR’ + H2O RCOOH + R’OH……………........…(2.2)

(ii) Sentez

(a) Esterifikasyon

RCOOH + R’OH RCOOR’ + H2O…………………....(2.3)

(b) İnteresterifikasyon

RCOOR’ + R’’COOR* RCOOR* + R’’COOR’…….(2.4)

(c) Alkoliziz

RCOOR’ + R’’OH RCOOR’’ + R’OH……………....(2.5)

(d) Asidoliziz

RCOOR’ + R’’COOH R’’COOR’ + RCOOH…………..(2.6)

Eşitlik (2.4) - (2.6) çoğunlukla transesterifikasyon terimi altında toplanır. Reaksiyon

ortamında suyun az olduğu durumlarda interesterifikasyon ana reaksiyondur (Gandhi 1997,

Telefoncu 1997).

Lipazların substrat spesifiklikleri, analitik ve endüstriyel uygulamalarda çok önemlidir.

Substrat spesifikliği, enzimin moleküler özellikleri ve substratın yapısına bağlı olup,

enzimin substrata bağlanmasına etki eden faktörler tarafından kontrol edilir. Lipazlar

substrata spesifikliklerine göre üç ayrı grupta incelenir (Telefoncu 1997, Saxena et al.

1999);

Spesifik Olmayan Lipazlar

Bu grupta yer alan enzimler, trigliseritlerin tüm pozisyonlarındaki açil gruplarını

koparabilme yeteneğine sahiptir. Reaksiyonda ara ürün olarak diaçil ve mono açil

55

gliserinler oluşur. Candida cylindracae, Corynebacterium acnes, Taphylococcus aureus ve

Geotrichum candidum tarafından üretilen lipazlar bu gruba girer (Telefoncu 1997, Saxena

et al. 1999).

1,3-Spesifik Lipazlar

Bu gruba giren lipazlar nötral yağları, eşdeğer konumdaki 1 ve 3 pozisyonlarından spesifik

olarak hidrolizler. Reaksiyon sonucunda, triaçilgliserollerden yağ asitleri, 1,2(2,3)-

diaçilgliserinler ve 2-monoaçilgliserinler oluşur. 1,2(2,3)-diaçilgliserinler ve özellikle 2-

monoaçilgliserinler kimyasal olarak kararsız olup sırasıyla 1,3-diaçilgliserinlere ve 1(3)-

monoaçilgliserinlere izomerleşir. Böylece oluşan izomerler, enzim tarafından tekrar

substrat olarak kullanılabilir ve sonuçta 1,3-spesifik lipazlar da spesifik olmayan lipazlar

gibi trigliseritleri gliserin ve serbest yağ asitlerine kadar parçalayabilir. Pankeas,

Aspergillus niger, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Humicola

lanuginosa, Rhizopus ve Mucor türlerinden elde edilen lipazlar 1,3- spesifiktir (Telefoncu

1997, Saxena et al. 1999).

Yağ Asidi Spesifik Lipazlar

Bu gruptaki lipazlar, açilgliserinlerdeki bazı yağ asitlerine spesifik olup bu yağ asitlerinin

oluşturduğu ester bağlarını parçalar.

Lipazların bazıları, doymamış yağ asitlerinden kısa zincirli olanlara (asetik, butirik, kaprik,

kaproik, kaprilik), bazısı ise daha uzun zincirli yağ asitlerine (oleik, linoleik, linolenik vb)

ilgi duyar (Saxena et al. 1999). Örneğin, Geotrichum candidum tarafından üretilmiş lipazın

uzun zincirli bir yağ asidinin özel bir tipinin esterlerinin hidrolizi için birçok özelliğe sahip

olduğu bildirilirken, M. miehei lipazının, düşük pH’larda süt yağındaki bütirik aside

spesifiklik gösterdiği ifade edilmiştir (Telefoncu 1997, Saxena et al. 1999). Bununla

birlikte çok sayıda lipaz spesifik olmayıp, trigliseritlerin yağ asitlerini rastgele parçalar

(Saxena et al. 1999).

56

Lipazın izoformları mevcuttur. İzoformlar; konumsal spesifiklerde, molekül ağırlıklarında,

arayüzey aktivasyonlarında, stereoseçicilikte ve maksimum aktivite gösterdikleri

substratlarda farklılıklar gösterir. Rhizopus niveus tarafından üretilen iki çeşit lipaz (Lipaz I

ve Lipaz II) bilinmektedir. Lipaz I ve Lipaz II’nin molekül ağırlıklarında farklılık

gösterdiği, Lipaz I’in sınırlı proteoliziz ile Lipaz II’ye dönüşebildiği bildirilmiştir.

Geotrichum candidum’un dört farklı lipaz ürettiği açıklanmıştır. Lipaz I’in konumsal

spesifikliği yoktur, Lipaz IV ise alışılmışın dışında bir konumsal spesifiklik

göstermektedir. Martinelle (1995), Candida antarctica lipazı izoformlarından A ve B’nin

(CALA ve CALB) arayüzey aktivasyonu üzerinde çalışmıştır. CALB hiç arayüzey

aktivasyonu göstermemiştir, bu da aktif konuma girişi düzenleyen kapak yapısının

yokluğunu işaret etmektedir. C. rugosa’nın A ve B lipaz izoformları tarafından p-nitrofenil

esterlerinin hidrolizi Rodendo (1995) tarafından belirlenmiştir. Lipaz B maksimum

aktiviteyi laurat, Lipaz A ise kaprilat üzerinde göstermiştir; yani izoformların maksimum

aktivite gösterdikleri substratlar farklılık gösterebilmektedir. Kültür ortamına eklenen

Tween 20, Tween 80 ile bir izoform karışımındaki izoformların bağıl miktarı

değiştirilebilmektedir (Sharma et al. 2001).

Lipazlar yağ ve su ara yüzeyinde fonksiyon gösterir. Bununla birlikte arayüzey

aktivasyonu göstermeyen lipazlar da mevcuttur. Bunlara örnek olarak Pseudomonas

glumae ve Candida antartica B türü lipaz verilebilir (Schmid and Verger 1998). Ara yüzey

alanı emülsifiyerlerin kullanımı (örneğin Tweenler) ile belli ölçülerde artırılabilir. Lipaz

katalizli reaksiyonların çözünmeyen substrat ve enzimin çözündüğü sulu faz arasındaki ara

yüzeyde gerçekleşmesi, reaksiyon kinetiğinin belirlenmesinde ve deneylerde zorluk yaratır

(Saxena et al. 1999).

Lipazlar α/β hidrolaz kıvrım ailesine mensuptur. Yapı, α sarmallarıyla çevrili, merkezi

paralel β yapraklarından oluşur. Aktif nükleofilik serin kalıntısı, bir α-sarmal ve bir β-

yaprak arasındaki bölgede yer alır. α/β hidrolaz ailesi, lipaz, esteraz, proteaz, peroksidaz,

liyaz ve diğer enzimleri içerir. Bununla birlikte bütün lipazlar aynı yapısal aileye girmez.

Örneğin, PLA2 (fosfolipaz A2), PLA-D (fosfolipaz D) ve bazı lizo-fosfolipazlar,

triaçilgliserol lipazlar ile karşılaştırılırsa oldukça farklı bir yapıya sahiptir (Schmid and

Verger 1998, Svendsen 2000).

57

Lipazların çoğu, bir α- sarmal peptit dizininden oluşan, kapalı formasyonda (örneğin ara

yüzey veya organik çözücü yokken), substratın katalitik üçlüye ulaşmasını engelleyen bir

kapağa sahiptir. Kapağın aktif bölgeye bakan kısmı hidrofobik, diğer kısmı hidrofiliktir.

Kapak açıldığında, hidrofobik substratın bağlandığı geniş bir hidrofobik yüzey ortaya

çıkar. Hidrofobik yüzey, yağın temas ettiği bölgenin merkezinde ve substratın içine

yerleşmesi için uygun yapıda olup açil parçalarının içini doldurması için uzatılmış bir cep

gibidir. Lipaz enziminin faaliyeti, bazen birkaç kapağın hareketi ile olur. İnsan pankreatik

lipazı ve Candida rugosa lipazı birden fazla kapağa sahiptir. Bazen aktivasyon sadece belli

substratlar için gösterilir. Örneğin Fusarium solani pisi kütinazı, uzun zincirli açil

substratlarla bir araya geldiğinde yapısında ufak bir değişiklik gerçekleşir (Schmid and

Verger 1998, Svendsen 2000). Şekil 2.2’de Humicola lanuginosa lipazının yapısı

gösterilmiştir.

Şekil 2.1 Lipazların kristal yapısı (Humicola lanuginosa lipazı) (Svendsen 2000). Mavi oklar ile gösterilenler β-yapraklar. β-yaprakları çevreleyen sarı helezonlar

α-sarmallar. Aktif serin kalıntısı kırmızı çubuk, onun üzerinde kırmızıyla

gösterilen bölüm ise kapak.

2.6.4.1 Lipaz kaynakları

Lipazlar, bitki ve hayvan dokularından ekstraksiyonla veya mikroorganizmalardan

fermantasyon yoluyla üretilir. Ticari lipazlar genelde mikrobiyal kaynaklıdır. Lipaz

üreten mikroorganizmalar bakteriler, fungi ve mayalardır. Bakteriler daha çok proteaz

58

kaynağı olarak kullanılmakta, bakteri lipazlarının endüstriyel üretimi fazla

yapılmamaktadır. Çizelge 2.4’te bazı mikrobiyal lipazların özellikleri verilmektedir.

Çizelge 2.4 Bazı mikrobiyal lipazların özellikleri (Saxena et al. 1999)

2.6.4.2 Lipaz üretiminde önemli parametreler

Lipaz üretiminde; karbon ve azot kaynaklarının türü ve derişimi, üretim pH’ı, sıcaklık,

metal iyonları ve çözünmüş oksijen derişimi etkilidir.

Organizma

Spesifiklik

Moleküler

ağırlık

(kDa)

İzolelektrik

noktası

Optimum

pH

Optimum

Sıcaklık

(°C)

Chromobacterium

viscosum

Spesifik değil 30 7.3 6.5-7.0 70

Pseudomonas sp. 1,3 spesifik 32 4.5 7.8 47

P. fluorescens 1,3 spesifik 32 4.5 7.0 50-55

Candida

cylindracea

Spesifik değil 120 4.2 7.2 45

C. carvata 18:1>16.0

=14.0

195 - 5.0-8.0 60

C. deformans 1,3 spesifik 207 - 7.0 80

Aspergillus niger 1,3 spesifik 38 4.3 5.6 25

Geotrichum

candidum

cis-

∆9doymamış

yağ asitleri

55 4.3 6.6 40

Humicola

lanuginosa

Spesifik değil 27.5 - 8.0 60

Mucor miehei 1,3 spesifik - - 8.0 40

Lipaz A Spesifik değil 27 4.9 7.5 35

Lipaz B Spesifik değil 36 4.1 5.8 40

Rhizopus arrhizus 1,3 spesifik 43 6.3 8.0 -

R. delemar 1,3 spesifik 41.3 4.2 5.6 35

59

2.6.4.2.1 Karbon ve azot kaynakları etkisi

Mikrobiyal lipazların üretiminde çoğunlukla zeytinyağı, ayçiçek yağı, soya fasulyesi

yağı, susam yağı, pamuk yağı, mısır yağı, yer fıstığı yağı ve palmiye yağı gibi bitkisel

kaynaklı yağlar denenmektedir. Yağlı bir ortamda çoğalan mikroorganizmalar, lipaz

üretme potansiyeline sahiptir. Mikroorganizmalar yağları karbon veya azot kaynağı

olarak kullanırken bir yandan da lipaz üretmektedir.

Sugihara 1991’de Bacillus sp.’den %1 zeytinyağı içeren kültür ortamında lipaz

üretmiştir. Rhodotorula glutinis’ten elde edilen hücre dışı lipazın üretiminde palmiye

yağı en iyi lipid kaynağı olarak belirlenmiştir. P. fluorescens SIK WI tarafından

üretilen lipaz için ise trikaproik (C6), trikaprilin (C8) en iyi triaçilgliserol kaynağı

olarak gözlenmiş, bununla birlikte enzim triolenin 1 ve 3 konumundaki ester bağlarını

da hidroliz etmiştir (Sharma et al. 2001).

Termofilik Bacillus sp. türü Wai 28A45’ten ısıl kararlı lipaz üretimi tripalmitin,

tristearin, trimiristin karbon kaynakları ile test edilmiş ve tripalmitin en iyi lipaz

aktivitesi vermiştir. Yine termofilik Bacillus türü A30-1 (ATCC 53841), mısır yağı ve

zeytinyağı (%1) kullanıldığında maksimum seviyede lipaz üretmiştir (Sharma et al.

2001) .

Rhizopus oryzae için kolza tohumu ve mısır yağının lipaz üretimi için en uygun

substratlar olduğu, optimal çoğalma için yağ derişiminin %3, optimal lipaz üretimi için

yağ derişiminin %2 olduğu bildirilmiştir (Sharma et al. 2001).

Bir alkali lipazın, P. alcaligenes M-1 tarafından sitrik asit ve soya yağı içeren ortamda

üretildiği bildirilmiştir. Bu lipaz alkali bir ortamda yağ lekelerini çıkarmak için

mükemmel bir özellik göstermektedir. Bacillus stearothermophilus L1’den sığır eti,

palmiye yağı içeren ortamda yüksek alkali ısıl kararlılıkta lipaz üretildiği açıklanmıştır.

Sentetik substratlarla aktivite değerlendirmesi sonucunda enzimin özellikle p-nitrofenil

kaprilata etki gösterdiği anlaşılmıştır (Sharma et al. 2001).

60

P. aeruginosa’nın KKA-5 karbon kaynağı olarak hint yağı kullanıldığında maksimum

lipaz aktivitesi verdiği ifade edilmiştir. Enzim alkali koşullarda kararlıdır (Sharma et

al. 2001).

Acremonium structum’un, azot kaynağı olarak soya fasulyesi içeren ortamda büyük

miktarda lipaz üretmiş olduğu bildirilmiştir (Sharma et al. 2001).

Farklı Rhizopus türlerinin lipazlarının (40-45 kDa) orta zincirli yağ asitlerine (C8-C10)

karşı maksimum aktivite gösterdiği açıklanmıştır. Candida curvata, C. tropicalis, C.

valida ve C. pellioculosa’dan üretilen lipazların trigliseritlerdeki farklı ester bağlarına

nonspesifik olduğu belirlenmiştir (Saxena et al. 1999).

Geotrichum candidum süt ürünlerindeki yağı hidrolize ederken C9’da cis çift bağı

içeren yağ asitlerine spesifiklik göstermiş olup, bu özelliği nedeniyle trigliseritlerin

yapısal analizleri için başvurulan bir türdür (Saxena et al. 1999).

Aspergillus niger’in hücre içi ve hücre dışı lipazları 1,3-(konum)spesifiktir. P.

cyclopium, P. verrucosum var. cyclopium ve P. crustosum gibi Penicillium türlerinden

izole edilen lipazlar bütirik asit için spesifiklik göstermiştir. P. cyclopium lipazının di

ve monogliseritlere trigliseritlere oranla daha yüksek aktivite gösterdiği açıklanmıştır.

H. lanuginosa lipazları kokonat yağı ve yüksek miktarlarda laurik asit içeren yağlara

daha fazla hidrolitik aktivite göstermektedir (Saxena et al. 1999).

Lezitinin, R. japonicus’un lipaz üretimini artırdığı belirlenmiştir. Doymamış yağ asidi

tuzları P. fragi’nin lipaz üretimini inhibe etmiştir (Saxena et al. 1999).

Zeytin yağı, yer fıstığı yağı, pamuk yağı ile oleik asit, linoleik asit ve linolenik asit gibi

yağ asitleri P. mephitica’nın lipaz üretimini artırmaktadır (Saxena et al. 1999).

Gao ve Breuil (1995) bir fungus olan Ophiostoma piceae lipazının üretiminde zeytin,

soya fasulyesi, ayçiçeği, susam pamuk, mısır yağı ve yer fıstığı yağı gibi farklı bitki

61

yağlarını karşılaştırmış, maksimum lipaz üretiminin zeytinyağı kullanıldığında

gözlendiğini bildirmiştir (Saxena et al. 1999).

Rhizopus oryzae ile yapılan bir incelemede ise ortama farklı türde yağların eklenmesi

hem lipaz aktivitesini yükseltmiş, hem de yağsız ortamla karşılaştırıldığında hücre

derişimi artmıştır. Hücre çoğalması için optimum bir yağ derişimi olup, optimum lipaz

üretimi için bu derişim değişmiştir (Sharma et al. 2001).

Lipaz üretimi için kullanılan karbon kaynaklarından biri de glukozdur; P. fragi

lipazının üretimi için glukoz gerekli görülmüştür. Talaromyces emersonii’de ise kuru

mikroorganizma kütlesi başına lipaz aktivitesinin, karbon kaynağı olarak laktoz,

mannoz, ksiloz, fruktoz, dekstrin ve ramnoz kullanıldığında glukoza oranla daha

yüksek olduğu gözlenmiştir (Saxena et al. 1999).

Genellikle mikroorganizmalar yüksek miktarda lipazı organik azot kaynakları

(özellikle polipepton, mısır unu özütü, maya özütü) kullanıldığında sağlar. Penicillium

citrinum türü için yapılan bir incelemede pepton içeren ortamda maksimum üretim elde

edilmiştir (Sharma et al. 2001).

Humicola sp., T. lanuginosus, Penicillium purpurogenum ve Chrysosporium sulfureum

mikroorganizmalarından ısıl kararlı lipaz üretim çalışmalarında azot kaynağı olarak

maya özütü kullanımının yüksek lipaz üretimi verdiği açıklanmıştır. Salleh et al. (1993)

tarafından, Rhizopus oryzae tarafından hücre dışı lipaz üretimi için pepton optimal azot

kaynağı olarak belirlenmiştir. Lin et al. (1996) P. alcaligenes F-111 tarafından soya

tozu, pepton ve maya özütü içeren ortamda bir hücre dışı alkali lipaz üretildiğini,

üretilen bu lipazın aktivitesinin sodyum dodesil sülfat, sodyum tripolifosfat, sodyum

dodesil benzen sülfonat ve sodyum alkil benzen sülfonat gibi katyonik surfaktanlardan

etkilenmediğini bildirmiştir (Sharma et al. 2001).

Üre ve amonyum sülfat kullanımı genel olarak lipaz sentezini inhibe etmekte, oleik asit

ve Tween 80 lipaz üretimi için hızlandırıcı etki göstermektedir (Sharma et al. 2001).

62

2.6.4.2.2 pH etkisi

Çoğalma ortamının başlangıç pH değeri lipaz üretimi için önemlidir. Maksimum

aktivite P. fragi için pH > 7; P. aeruginosa için pH=9 iken gözlenmiş olup ortamın

asitliğinin artmasının lipaz aktivitesini düşürdüğü belirlenmiştir. Buna karşılık

maksimum çoğalma S. lipolytica, M. caseolyticus, B. licheniformis, A. wentii, M.

hiemalis, R. nigricans, Mucor racemosus, R. oligosporus, P. aeruginosa EF2 için

asidik pH (4.0-7.0) olarak açıklanmıştır (Saxena et al. 1999).

2.6.4.2.3 Sıcaklık etkisi

Oso (1978), T. emersonii ’den lipaz üretiminde 45oC’ın en iyi sıcaklık olduğunu

bildirmiştir. 22-35oC aralığındaki sıcaklıkların da A. wentii, M. hiemalis, R. nigricans,

M. racemosus, R. oligosporus ve P. aeruginosa ’nın maksimum lipaz üretimi için

optimum olduğu açıklanmıştır (Saxena et al. 1999).

P. fluorescens’ten elde edilen lipazın bir proteaz olan subtilisin tarafından 20oC’ta

inaktive olduğu bildirilmiş, bu etki mikroorganizma çoğalma ortamında daha yüksek

sıcaklıklarda (30-40oC) daha fazla görülmüştür (Saxena et al. 1999).

2.6.4.2.4 Metal iyonları etkisi

Pokorny et al. (1994) Mg+2’nin Aspergillus niger’den lipaz üretimini artırdığını

açıklarken, benzer şekilde Jannsen et al. (1994) termofilik bir Bacillus sp.’nin lipaz

üretimini üretim ortamına eklenen magnezyum, demir ve kalsiyum iyonlarının birkaç

kat artırdığını bildirmiştir. Kok et al. (1995)’un açıklamasına göre Aci. calcoaceticus

BD 413’ten hücre dışı lipaz üretimi de yine ortama eklenen Mg+2, Ca+2, Cu+2, Co+2 ile

artmıştır. Lin et al. (1995) P. pseudualcaligenes F-111’in lipaz üretiminin fosfat içeren

ortama Mg+2 eklenmesi ile artış gösterdiğini ifade etmiştir. Metal iyonlarının 1 mM

derişimlerinin lipaz aktivitesine etkisini incelediği çalışmasında Lin et al. (1996) P.

pseudoalcaligenes F-111 lipazının Fe+3 varlığında %60 inhibe olduğunu açıklamıştır.

63

Sidhu et al. (1998) tarafından ortamda Ca+2’nin termofilik Bacillus sp. RS-12’nin lipaz

üretimini artırdığı ifade edilirken, Sharon et al. (1998), P. pseudoalcaligenes KKA-5

için ortamdaki Ca+2’nin lipaz üretimine etki etmediğini açıklamıştır. Sharon et al.

(1998), P. aeruginosa KKA-5 lipazının Ca+2 ve Mg+2 varlığında aktivitesini

koruduğunu fakat Mn+2, Cd+2 ve Cu+2 varlığında az miktarda, Fe+2, Zn+2, Hg+2, Fe+3

gibi ağır metal tuzları varlığında güçlü bir şekilde inhibe olduğunu açıklamıştır. Benzer

şekilde Hiol et al. (2000) Rhizop oryzae lipazının aktivitesinin Fe+2, Fe+3, Hg+2, Cu+2

varlığında azaldığını rapor ermiştir. Chartrain et al. (1993) P. aeruginosa MB5001

lipazının 1 mM ZnSO4 ile %94 inhibe olduğunu açıklamıştır. Genellikle Ca+2 ve Mg+2

iyonlarının lipaz üretimini artırdığı görülmektedir. Fe+2, Fe+3, Hg+2, Cu+2, Zn+2, Ag+1

gibi ağır metal tuzları ise enzimi genellikle inhibe etmektedir (Sharma et al. 2001).

2.6.4.2.5 Oksijen aktarımı etkisi

Güçlü havalandırma R. oligosporus, P. fragi, P. aeruginosa ve M .racemosus

tarafından lipaz üretimini büyük ölçüde düşürmüştür (Saxena et al. 1999).

Row and Gilmour (1982) P. florescens ile yaptığı incelemede düşük oksijen

derişiminin lipaz üretimini hızlandırdığını belirlemiştir. Oso (1978), T. emersonii’den

maksimum lipaz üretiminin durağan şartlarda gerçekleştiğini açıklamıştır. Bununla

birlikte P. mephitica var. lipolytica, A. wentii ve M. hiemalis yüksek lipaz aktivitesi

için yüksek havalandırmaya ihtiyaç duymaktadır (Saxena et al. 1999).

2.6.4.3 Lipazların kullanım alanları

Lipazlar deterjan, gıda, farmasötiklerin sentezi, kağıt imalatı, kozmetik ve daha pek çok

endüstriyel alanda kullanılan enzimlerdir. Lipazların en önemli uygulamaları Çizelge

2.5 ile özetlenmiştir.

64

Çizelge 2.5 Mikrobiyal lipazların endüstriyel uygulamaları (Sharma et al. 2001)

Endüstri Faaliyet Ürün veya Uygulama

Deterjan Yağların hidrolizi Kumaşlardan yağ lekelerinin

çıkarılması

Süt Ürünleri Sütteki yağın hidrolizi,

peynir olgunlaştırma,

tereyağının modifikasyonu

Süt, peynir ve tereyağındaki tat

vericilerin geliştirilmesi

Unlu Mamüller Lezzetin artırılması Raf ömrünün uzaması

İçecek Aromanın artırılması İçecek

Yiyecek Sosları Kalite iyileştirme Mayonez, sos

Et ve Balık Lezzetin artırılması Et ve balık ürünleri; yağı

azaltma

Yağ Transesterifikasyon;

hidroliz

Kakao yağı, margarin, yağ

asitleri, gliserol, mono ve

diglisertler

Kimyasallar Enanatiyoseçimlilik,

sentez

Kiral yapılandırma blokları,

kimyasallar

Farmasötik Transesterifikasyon,

hidroliz

Özel lipidler, sindirim

yardımcıları

Kozmetik Sentez Emülsifiyerler, nemlendiriciler

Deri Hidroliz Deri ürünleri

Kağıt Hidroliz Geliştirilmiş nitelikte kağıt

Temizlik Hidroliz Yağların çıkarılması

2.6.4.4 Lipazların deterjan enzimi olarak kullanımı ve üretimi

Lipazlar, yağları hidroliz etme özellikleri ile deterjan katkısı olarak büyük bir kullanım

alanı bulmuştur. Deterjan lipazları, farklı bileşimdeki yağların parçalanabilmesi için

düşük substrat spesifikliğine sahip olmalı, sert yıkama koşullarına (pH=10-11, 30-

60oC), çok sayıda deterjan formülasyonlarının önemli bileşenleri olan surfaktan ve

65

enzimlerin (örneğin lineer alkil benzen sülfonat ve proteazlar) zararlı etkilerine karşı

dayanabilmelidir.

Lipazların çoğu optimum aktivitesini nötral pH’larda ve 35-48oC aralığında

göstermektedir. Misset et al. (1994), Pseudomonas alcaligenes lipazının, alkali

pH’larda (7-11) ve 60oC’ın üzerindeki sıcaklıklarda noniyonik ve anyonik surfaktanlar

varlığında aktivitesinin geliştirildiğini açıklamıştır. Bu enzim, yıkama makinelerinde ve

surfaktanlarla depolama esnasında da kararlı bulunmuştur. Novo grubu, Streptomyces

sp.’den yüksek alkali ve spesifik olmayan bir lipaz elde edildiğini ve lipazın pek çok

bakteriyel termofilik lipazla birlikte çamaşır ve bulaşık deterjanlarında, endüstriyel

temizleyicilerde faydalı olduğunu bildirmiştir. Deterjan enzimlerinin kararlılığı ve

aktivitesi ‘surfaktan lipaz’ olarak isimlendirilen genetik mühendisliği ürünlerle

geliştirilmiştir. Unilever, Cosmo Oil ve Procter&Gamble, surfaktan lipazlar için

rekombinant DNA teknolojisi üzerinde çalışmaktadır (Pandey et al. 1999).

En önemli ticari deterjan lipazları Çizelge 2.6 ile verilmiştir. 1994’te Novo Nordisk, ilk

ticari rekombinant lipaz ‘Lipolase’ı sunmuştur. Enzim, bir fungus olan Thermomyces

lanuginosus’ta klonlanmış ve Aspergillus oryzae’de ekspres edilmiştir. İlk defa

endüstriyel boyutta Hokkaido, Japonya’da üretilen enzim, buradan, Kuzey Amerika ve

Avrupa’ya ihraç edilmiştir. 1995’te Genencor International tarafından, aynı

mikroorganizmada klonlanıp ekspres edilen iki bakteriyal lipaz, Pseudomonas

mendocina’dan ‘Lumafast’ ve P. alcaligenes’ten ‘Lipomax’ piyasaya sunulmuştur.

Gerritse et al. (1998), P. alcaligenes M-1’in ürettiği alkali lipazın modern makine

yıkama koşullarında yağ lekelerinin çıkarılması için çok uygun olduğunu bildirmiştir

(Schmid and Verger 1998, Sharma et al. 2001).

66

Çizelge 2.6 Ticari deterjan lipazları (Schmid and Verger 1998)

Marka

adı

Firma Lipaz Kaynağı Optimum

pH

Optimum

sıcaklık

(oC)

Lipolase Novo-

Nordisk

Humicola lanuginosa kaynaklı,

Aspergillus oryzae’de ekspres edilmiş

10 40

Lipomax Gist-

Brocades[a]

Pseudomona spseudoalcaligenes’de

yeniden klonlanıp aynı organizmada

ekspres edilmiş

11 45

Lumafast Genencor[a] Pseudomonas mendocina kaynaklı,

Bacillus spec.’de ekspres edilmiş

10.5 40

[a] Gist-Brocades’in enzim üretimi, 1995’te Genencor International B. V.’ye (Delft, The Netherlands)

verildi.

Deterjanlarda kullanılacak lipazların oksidatif kararlılık göstermesi ve şelatlama

ajanlarına karşı dirençli olması gerekmektedir. Lipazlar diğer enzimlere oranla

oksidatif maddelere karşı daha kararlıdır. Pseudomonas sp.’deki metioninler diğer

kalıntılarla yer değiştirilerek enzimin oksidatif kararlılığı arttırılabilmekle beraber bazı

durumlarda enzim aktivitesi azalabilmektedir (Swendsen, 2000). P. pseudoalcaligenes

F-111 lipazı üzerine ise metal şelatlama ajanları (EDTA, o-fenantirolin) etki etmemiştir

(Sharma et al. 2001).

Deterjan enzimlerinin ısıl kararlı olması istenmektedir. Pankreatik lipazlar 40oC’ın

üzerindeki sıcaklıklarda saklandığında aktivite kaybederken, bazı mikrobiyal lipazların

ısıl inaktivasyona karşı oldukça dirençli olduğu saptanmıştır (Saxena et al. 1999).

Isıl kararlı lipazlar pek çok kaynaktan izole edilebilmektedir; P. fluorescens, Bacillus

sp., B. coagulans, B. cereus, B. stearothermophilus, Geotricum sp., Aeromonas sobria,

P. aeruginosa bunlardan bazılarıdır.

Sidhu (1998) tarafından izole edilen bir hücre dışı Bacillus lipazının ise en yüksek

aktiviteyi 50oC’ta gösterdiği, enzimin yarı ömrünün 75oC’ta 15 dakika olduğu

açıklanmış; enzimin çeşitli oksitlenme-indirgenmelere, şelatlama ajanlarına, yüzey

aktif ajanlara karşı kararlı olduğu bildirilmiştir (Sharma et al. 2001).

67

A. niger, R. japonicus ve C. viskosum lipazlarının 50oC’ta, H. lanuginosa, P. sp.

nitroreducens’tan elde edilen lipazların ise sırasıyla 60oC ve 70oC’ta kararlı olduğu

belirlenmiştir. A. terreus’un saflaştırılmış lipazının, 60oC’ta 24 saat sonra aktivitesini

%100 koruyabildiği bildirilmiştir. Bununla birlikte C.gigantea’den ve diğer

mezofillerden elde edilen lipazların maksimum aktivitesinin 30-35oC’ta olduğu

belirlenmiştir.

Sıcak su kaynaklarından elde edilen termofilik bakterilerin lipazlarının ise yüksek

aktiviteyi 40-60oC aralığında gösterdiği bildirilmiştir (Saxena. et al. 1999) Başka bir

incelemede Wang tarafından Bacillus türünden izole edildiği bildirilen ısıl kararlı bir

enzimin 60oC ’ta maksimum aktiviteye sahip olduğu, 75oC’ta 30 dakika kalması

halinde aktivitesinin %100’ünü koruduğu, enzimin yarı ömrünün 75oC’ta 8 saat olduğu

açıklanmıştır (Sharma et al. 2001).

Bazı lipazların asidik pH’ta, bazılarının ise alkali pH’ta kullanımları daha aktiftir. A.

niger, Chromobacterium viscosum ve Rhizopus sp.’nin hücre dışı lipazlarının asidik

pH’ta aktif olduğu bildirilmiştir. P. nitroreducens’ dan pH 11’de aktif bir alkali lipaz

izole edildiği açıklanmıştır (Saxena et al. 1999). Deterjanlarda kullanılacak lipazların

alkali pH’larda aktif olması istenmektedir.

Lipazlar hem çamaşır deterjanlarında hem de bulaşık deterjanlarında kullanılmaktadır.

Lipaz temizliği artırmanın yanı sıra kireçlenmeyi de önlemektedir. Lipazların

temizlikle ilgili başka uygulamaları da vardır. Lipazlar,

- ağartma bileşeni olarak

- kuru temizleme çözücülerindeki yağ bileşenlerini parçalamada

- deri endüstrisinde temizleyici olarak

- lensler üzerindeki tortuları temizlemede kullanılan bir kontak lens

temizleme bileşeni olarak

- yağlarla tıkanmış olukların temizlenmesinde

- boşaltma borularının, lağım borularının yüzeyindeki organik atıkların

parçalanmasında

68

- hayvan gübrelerinin temizlenmesinde selülazlarla birlikte kullanılır

(Gandhi 1997).

2.6.4.5 Lipazın saflaştırılması

2.6.4.5.1 Saflaştırmanın önemi

Enzimlerin saflaştırılması, enzimin verimli ve başarılı kullanımına imkan sağlayan

önemli bir basamaktır. Farmasötik ve kozmetik gibi değerli kimyasalların üretiminde

enzimlerin kullanıldığı endüstrilerde, saf enzimlere ihtiyaç duyulduğu için enzimin

saflaştırılması oldukça önemlidir. Saflaştırma ayrıca, enzimin temel amino asit

dizininin ve üç boyutlu yapısının tanımlanmasında kullanılmaktadır. Saf lipazların X-

ışını çalışmaları, yapı-fonksiyon ilişkisinin saptanmasına ve lipazın kinetik

mekanizmasının daha iyi anlaşılmasına olanak sağlamaktadır.

2.6.4.5.2 Protein saflaştırma yöntemleri

Ticari saflaştırma stratejilerindeki temel sınırlamalar; saflaştırma sonucunda az ürün

elde edilmesi, saflaştırmanın uzun zaman alması ve zahmetli oluşudur. Günümüzde

endüstriler, ucuz, hızlı, yüksek verim sağlayan, geniş ölçekli işlemler için uygun

saflaştırma stratejileri araştırmaktadır.

Protein saflaştırmada sıkça kullanılan klasik yöntemler çöktürme, filtrasyon ve

kromatografidir. Son zamanlarda bunlara membran prosesleri, immünosaflaştırma gibi

yeni teknikler de eklenmiştir (Saxena et al. 2003).

2.6.4.5.2.1 Çöktürme

Çöktürme, çoğunlukla saflaştırma prosedürünün ilk safhalarında, tamamen kaba bir

ayırma basamağı olarak yer almaktadır. Saflaştırma projelerinin yaklaşık %80’i bir

69

çöktürme basamağı kullanmaktadır; bunun %60’ı amonyum sülfat, %35’i etanol,

aseton veya bir asit (genellikle HCl) kullanılarak gerçekleştirilmektedir. Çöktürme

aşaması, proteinlerin çözünürlük özeliklerinden yararlanılarak saflaştırılması işlemidir.

Proteinlerin çözünürlüğü sıcaklık, pH ve ortamda bulunacak nötral tuzun iyonik

gücünden etkilenmektedir. Ortamdaki tuzun iyonik gücü, tuzu oluşturan anyon ve

katyonun yükü ve tuz derişimi ile değişmektedir. Yüksek tuz derişimlerinde

proteinlerin hidratasyonu azalmakta ve bunun sonucu olarak protein çökmektedir.

Proteinlerin hidratasyonunun azalması, ortamda yüksek derişimde bulunan tuzun kendi

hidratasyonu için suyu tutması sebebiyledir. Çöktürme işlemi genellikle basamaklar

halinde uygulanır (fraksiyonel çöktürme). Bunun anlamı, iyonik gücü gittikçe artacak

şekilde farklı derişimlerde tuz çözeltileri kullanılarak yani ortama tuz basamak

basamak eklenerek, karışım içerisinde bulunan çeşitli proteinlerin birbirinden

ayrılmasıdır. Çökmüş proteinler, doğal yapılarını koruduklarından, denatüre

olmaksızın, uygun bir çözelti kullanılarak yeniden çözünür hale getirilirler. Çöktürme

işleminin, fazla kimyasal kullanımı, protein olmayan maddelerin

uzaklaştırılamamasında yetersiz kalması gibi birtakım dezavantajları vardır. Lipaz

aktivitesindeki artış, kullanılan amonyum sülfat çözeltisinin derişimine bağlıdır

(Saxena et al. 2003)

2.6.4.5.2.2 Diyaliz ve ultrafiltrasyon

Proteinleri daha küçük molekül ağırlığa sahip maddelerden ayırmak için diyaliz

yöntemi kullanılmaktadır. Bu yöntem yarı geçirgen bir membran içerisine konan protein

çözeltisi içerisinden küçük moleküllerin membranın ultramikroskopik gözeneklerinden

suyla veya tamponla membran dışına geçirilmesi temeline dayanmaktadır. Glukoz ve

NaCl gibi küçük moleküller membrandan geçerken büyük protein molekülleri diyaliz

membran gözeneklerinden geçemediği için içerde kalır. Ortam suyunun birkaç kez

değiştirilmesi ile küçük moleküllerin protein çözeltisi içerisinden uzaklaştırılması

mümkün hale gelmektedir.

Ultrafiltrasyon yöntemi de diyaliz tekniğine göre çalışır. İki yöntemde de proteinler

molekül büyüklüklerine göre ayrılırlar. Aradaki fark, ultrafiltrasyonda küçük

70

moleküllerin ortamdan uzaklaştırılması için hidrostatik basınç veya santrifüj gibi

kuvvetlerin kullanılmasıdır. Ultrafiltrasyon, diyalize göre daha hızlı ve daha yüksek

verimlilikte bir ayırma sağlamaktadır. Basınç sayesinde küçük moleküllerle birlikte bir

miktar sıvı kaybedildiği için protein daha derişik bir şekilde elde edilmektedir

(http://yunus.hacettepe.edu.tr, 2007).

2.6.4.5.2.3 Kromatografik yöntemler

Kromatografi; madde karışımlarının, sabit ve taşıyıcı faz arasında, büyüklük, şekil,

taşıdıkları yük, çözünürlük gibi özelliklerine göre dağılarak ayrılmalarıdır. Kolon

kromatografisi, proteinlerin saflaştırılmasında sıkça kullanılır. Kolon, proteinleri seçici

olarak adsorplayan bir maddeyle (sabit faz) doldurulmaktadır. Protein karışımı kolona

verildiğinde, tampon çözelti (taşıyıcı faz) ile yıkanan kolonda adsorbe edilmeyenler

önce, adsorbe edilenler daha sonra ayrılırlar.

Kolon kromatografi, ayırma mekanizmalarına bağlı olarak jel filtrasyon, iyon değişim,

afinite kromatografisi gibi türlere ayrılmaktadır.

İyon değişim kromatografisi protein saflaştırmada en fazla kullanılan kromatografik

yöntemdir. Proteinleri yük özelliklerine göre ayırmak için kullanılan bir yöntemdir.

Proteinler izoelektrik noktalarına (pI) göre farklı pH’taki ortamlarda farklı yükler

kazanırlar. Ortam pH’ı proteinin izoelektrik noktasından büyükse protein negatif yük

kazanırken, ortam pH’ı proteinin izoelektrik noktasından küçükse protein pozitif yük

kazanmaktadır. En sık kullanılan iyon değiştiriciler, anyon değiştirici olarak DEAE,

katyon değiştirici olarak CM grubudur. Kolon içine pH= 7 de pozitif yük taşıyan bir

selüloz türevi olan DEAE-selüloz (dietil aminoetil selüloz) konulduğunda, bu bileşiğe

negatif yük taşıyan proteinler bağlanırken diğer proteinler kolondan çıkmaktadır.

Kolonun içerisine pH=7’de negatif yük taşıyan CM-selüloz (karboksimetil selüloz)

konulduğunda ise, bu bileşiğe de pozitif yük taşıyan proteinler bağlanmakta, diğer

proteinler ise kolon dolgu maddesine bağlanmadan kolondan çıkmaktadır. Daha sonra

kullanılan tamponların iyonik kuvveti değiştirilerek kolon materyaline geçici olarak

bağlanmış olan bu proteinler kolonun dolgu maddesinden ayrılarak kolonu terk etmeye

71

başlarlar. Fraksiyon toplayıcısı ile küçük miktarlar halinde tüplerde toplanan proteinler

asidik ya da bazik özelliğine göre diğer proteinlerden ayrılmış olur. İyon değiştirici

kromatografi aynı zamanda amino asitlerin ve peptitlerin de birbirinden ayrılmasını

sağlamaktadır. Bu tip kromatografi özellikle molekül ağırlıkları birbirine çok yakın

olan molekülleri ayırmak için kullanılmaktadır.

Jel filtrasyon yöntemi kullanım sıklığı açısından iyon değişim kromatografisinden

sonra gelen saflaştırma metodudur. Proteinlerin molekül büyüklüğüne göre ayrılmasını

sağlar. Bu yöntemde proteinlerin birbirinden ayrılması, sabit fazdaki jelin oluşturduğu

gözeneklerin çapına bağlı olarak moleküllerin belirli derecede engellenmesine dayanır.

Proteinlerin kolonda kalma süresi molekül büyüklüğü ile ters orantılıdır. Sabit faz

olarak kullanılan sefadeks, biojel, agaroz gibi dolgu maddeleri kolona doldurulduktan

sonra uygun bir tampon ile yıkanmakta ve kararlı hale getirilmektedir. Daha sonra

protein çözeltisi tampon ile birlikte kolondan geçirildiğinde yer çekimine göre aşağı

doğru hareket eden çözelti içerisinde bulunan küçük protein molekülleri kolon dolgu

maddesinin küçük gözeneklerine girerken, büyük proteinler bu gözeneklere hiç

girmeden kolondan ilk çıkan moleküller halinde ayrılırlar. Jel filtrasyon yöntemi ile

büyük miktarda protein karışımı saflaştırılabilir; ancak ayrılma yavaş gerçekleşir.

Çok kompleks bir karışım içinde bulunan bazı proteinler, afinite kromatografisi

sayesinde tek basamakta oldukça saf halde elde edilirler. Afinite kromatografisi için

polisakkarit yapısındaki agaroz taneciklerine kimyasal bir reaksiyon ile bir enzimin

koenzimi bağlanır. Üzerine koenzim bağlanmış olan agaroz tanecikleri kolon dolgu

maddesi olarak kullanılır. Protein karışımı bu kolona verildiği zaman yalnız

ilgilendiğimiz enzim proteinleri koenzimin serbest ucuna spesifik olarak

bağlanmaktadır. Bu bağlanma, kovalent bir bağlanma değildir. Diğer proteinler,

koenzimin serbest ucuna bağlanma özelliğine sahip olmadıkları için kolondan ayrılırlar.

Daha sonra serbest koenzim içeren çözelti kolona verildiğinde agaroz taneciklerine

bağlı koenzime bağlanmış olan enzim molekülleri bu kez rekabetten dolayı çözelti ile

birlikte gelen serbest koenzime bağlanarak kolondan çıkarlar. Böylece koenzime

spesifik olan enzim proteini, diğer yüzlerce proteinden afinite kromatografisi ile tek

basamakta saflaştırılmış olmaktadır. Bununla birlikte, kullanılan materyallerin maliyeti

72

yüksek ise, çöktürme basamağından sonra afinite kromatografi yerine genellikle iyon

değişim ve jel filtrasyon kromatografileri tercih edilmektedir.

İyon değişim, jel filtrasyon ve afinite kromatografileri dışında protein saflaştırmada

kullanılan diğer kromatografik metotlar, hidrofobik etkileşim kromatografisi ve

adsorpsiyon kromatografisidir. Hidrofobik etkileşim kromatografisinin enzim

saflaştırmada en sık kullanılan hidrofobik absorbentleri oktil ve fenil fonksiyonel

gruplarıdır. Fungal ve memeli lipazlarının saflaştırılmasında, lipazın glukoprotein yapısı

sebebiyle Konkanavalin A (Con A) ve heparin iyi sonuç vermektedir. Kullanım sıklığı

açısından hidrofobik etkileşim kromatografisinden sonra gelen adsorpsiyon

kromatografisinde, adsorbent olarak çoğunlukla hidroksiapatit kullanılmaktadır (Saxena

et al. 2003).

2.7 Debaryomyces hansenii Mayasından Lipaz Üretimi Debaryomyces (Torulaspora) hansenii yüksek tuz derişimlerine toleranslı bir maya

olduğu için (tuzluluk toleransı %24’e kadar) deniz mayası olarak da bilinen, gıda

endüstrisinde peynir üretiminde ve şarap imalatında kullanılan bir tür mayadır. Üretmiş

olduğu enzimlerin proteolitik ve lipolitik aktivitesi nedeniyle peynir üretiminde -

özellikle peynirin olgunlaştırılması aşamasında- kullanılan bir mikroorganizmadır. D.

hansenii’ye diğer maya türlerinden farklı olarak tüm peynir çeşitlerinde sıklıkla

rastlanmaktadır. D. hansenii’nin düşük sıcaklıklarda tuz varlığında çoğalabilmesi ve

laktik asiti parçalayabilme özelliği süt mamulleri üretimi ve salamuracılıkta kullanımına

imkan sağlamaktadır (http://www.ebi.ac.uk, 2007).

Literatürde Debaryomyces hansenii’den esteraz ve lipaz üretildiğine dair kısıtlı sayıda

çalışmalar yer almaktadır. D. hansenii’den üretilen esterazın izolasyonuna ve kısmi

karakterizasyonuna ilişkin 1995 yılında yayınlanan bir makalede, rokfor peyniri

yüzeyinden izole edilmiş mayadan ekstrakte edilmiş olan esterazın, Q Sepharose

kolonun kullanıldığı bir iyon değişim kromatografisi ve Sephacryl HR S200 kolonunun

kullanıldığı jel filtrasyon ile 224 kat saflaştırıldığı bildirilmektedir. Esteraz enziminin 80

kDa’luk monomerik bir enzim olduğu, tribütirin ve etil bütiratı pH=8 ve T=35oC

73

koşullarında maksimum aktivite ile hidroliz ettiği açıklanmıştır. Tribütirinin enzim

aktivitesine etkisi birkaç metal iyonu ve kimyasal varlığında denenmiştir. Üretilen

esteraz enzimi, kısa zincirli yağ asitlerinden metil ve etil esterlerini (C2-C5) iyi hidroliz

ederken, uzun zincirli yağ asitlerini (C6-C14) kısmen hidroliz ettiği bildirilmektedir.

Enzimin aromatik ve alifatik asetat esterlerini de hidroliz ettiği belirlenmiştir (Besancon

et al. 1995).

Tropikal ortamdan izole edilmiş maya ve maya benzeri türlerin hücre dışı enzim

aktivitelerinin incelendiği başka bir çalışmada, mikroorganizmaların amilaz, esteraz,

lipaz, proteaz, pektinaz, kitinaz ve selülaz aktiviteleri incelenmiştir. Deneyler, enzim

aktivitelerini belirlemek amacıyla mikroorganizmaların, enzimin aktivite göstermesi

için uygun bileşime sahip birbirinden farklı katı ortamlara aşılanmasıyla

gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında, petri kaplarında aktivite gösterdiği

gözlenen mikroorganizmalar seçilerek, ürettikleri enzimlerin sıvı ortam koşullarında

farklı pH’lardaki enzim aktiviteleri incelenmiştir. Sonuç olarak 348 maya ve 46 maya

benzeri türün incelendiği çalışmada 18 adet Debaryomyces hansenii türünün katı

ortamda 16’sının lipaz, 4’ünün esteraz aktivitesi gösterdiği açıklanmıştır. Sıvı ortamda

aktiviteye pH etkisinin de incelendiği ve pH=5, 6.5 ve 8 olmak üzere dört pH değerinin

denendiği çalışmada, Debaryomyces hansenii’nin en yüksek esteraz aktivitesini

denenmiş olan iki maya türü için de (Z102, C10) nötral koşullarda (pH=6.5) gösterdiği

bildirilmiştir. pH=8.0’de esteraz enzimi hiç aktivite göstermemektedir (Buzzini and

Martini 2002).

Debaryomyces hansenii’den lipaz üretimine dair başka bir çalışmada, 155 maya ve

maya benzeri türün lipaz üretimine farklı pH ve farklı bileşimdeki ortamların etkisi

incelenmiştir. Üretim ortamı olarak tribütirat ve zeytin yağı olmak üzere iki farklı ortam

kullanılmıştır. Tribütirat içeren ortamda pH=5.5 ve pH=7, zeytin yağı içeren ortamda

ise pH=7 ve 9.5 denenmiş, her iki ortamda da T=27oC’ta çalışılmıştır. İncelenmiş

Debaryomyces cinsine ait sekiz farklı türden dördünün tribütirat içeren pH=5.5

ortamında, üçünün zeytin yağı içeren pH=7 ortamında, ikisinin zeytin yağı içeren

pH=9.5 ortamında, birinin ise tribütirat içeren pH=7 ortamında lipaz aktivitesi

gösterdiği bulunmuştur. Elde edilen sonuçlara bakılarak farklı mikroorganizmalar

74

içerisinde en aktif türler seçilmiş ve bu türlerin pH=7 ve 27oC’ta zeytin yağının

kullanıldığı sıvı ortamda gösterdiği lipaz aktiviteleri karşılaştırılmıştır. Sonuç olarak

denenmiş tüm ortam koşullarında Debaryomyces hansenii’nin diğer mikroorganizma

türleri ile karşılaştırıldığında çok düşük miktarlarda lipaz enzimi ürettiği bildirilmiştir

(Paškevičius 2001).

75

3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal Çalışmada lipaz üretimi için mikrobiyal kaynak olarak süt mamulleri üretim tesisi yağlı

atığından izole edilen ve bir maya türü olan Debaryomyces hansenii kullanılmıştır.

Deneylerde kullanılan kimyasal ve biyokimyasal maddeler EK 1’de verilmiştir.

3.2 Yöntem

3.2.1 Mikroorganizma izolasyonu

Serum fizyolojik ile bir seri seyreltme yapılarak ekim için hazır duruma getirilen süt

mamulleri üretim tesisi yağlı atığından, petri kaplarındaki tribütirin agar (TBA) besi

yerine tek koloni ekim yapılmıştır. TBA besi yeri %0.5 pepton, %0.3 maya özütü, %1

tribütirin, %1.5 agar ve %1 glukoz içermektedir. Tribütirin agar gibi yağlı bir ortamda

çoğalan mikroorganizmaların lipaz üretme potansiyeline sahip olacağı düşünülmüştür.

Tribütirin agarda mayalarla birlikte bakteriler de çoğalabilmektedir. Çalışmada, sadece

mayaların çoğalması istenildiği için ortama ayrıca bakteri oluşumunu engelleyen

penisilin katılmıştır. Bunun için sterilize suda çözülen 1.000.000 IU’lık Penicillin G

kristalize potasyum besi yerine eklenmiş, daha sonra petri kaplarına paylaştırılan

penisilinli TBA’a yağlı atık örneğinden tek koloni ekimi yapılmıştır. Ekimin ardından

mikroorganizmaların çoğalması için petri kapları beş gün süreyle 30°C’ta inkübasyona

bırakılmışlardır. İnkübasyondan sonra çoğalan mikroorganizmalara basit boyama

yapılarak maya morfolojisi gözlenmiştir. Tek koloni ekiminin yapıldığı ortamdan

penisilin içeren başka bir petri kabına yayma yöntemiyle de ekim yapılarak zon

oluşumu gözlenmiştir. Tribütirin bir yağ asidi esteri olup ortamda şeffaf bir zon

gözlenmesi, mikroorganizmanın tribütirini kullandığını göstermektedir Bunun yanı sıra

paralel ekimin yapıldığı petri kaplarından birindeki büyük ve küçük kolonilerden iki

petri kabına daha ekim yapılarak 30oC’ta inkübasyona bırakılmıştır. Bu petri kaplarında

beşinci gün zon gözlenmiş; ancak mikroorganizmaların çoğalması için birkaç gün daha

76

beklenilmiştir. Bu arada büyük ve küçük koloniler için basit boyama yapılarak

morfolojiler arasında bir fark olup olmadığına bakılmıştır. Sonuç olarak atık örneğinin

tek tip maya içerdiğine karar verilmiştir. Zon oluşumu gözlendikten iki gün sonra

mikroorganizmalar çoğalmış ve penisilinsiz tribütirin agar içeren iki eğik tüpe ekim

yapılmıştır. Tüplere yapılan ekimin ertesi günü mayaların çoğaldığı gözlenmiştir.

Bundan sonra mikroorganizma belli zamanlarda tüpten tüpe ekim ile muhafaza

edilmiştir (stok tazeleme). İzolasyon çalışmaları Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi

Biyoloji Bölümü Biyoteknoloji Laboratuarı’nda yapılmıştır.

3.2.2 Mikroorganizma tür tayini

Mikroorganizma öncelikle morfolojik olarak tanımlanmış, sonrasında genetik çalışma

ile tür tayini yapılmıştır.

3.2.2.1 Mikroorganizmanın morfolojik tanımlaması

Süt mamulleri üretim tesisi yağlı atığından izole edilen mikroorganizmanın tür tayini

için mikroskop altındaki görüntüleri incelenmiştir. Morfolojik yapı, hem faz kontrast

mikroskobu hem de ışık mikroskobu altında gözlenmiştir. Faz kontrast mikroskobunda

mikroorganizmanın boyanmasına gerek yoktur ve hücre iç yapısı gözlenebilmektedir.

Faz kontrast mikroskobu kullanılarak morfolojik yapı aydınlatma çalışmaları Ankara

Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü laboratuarlarında

yapılmıştır. Mikroorganizmanın ışık mikroskobu altında gözlenebilmesi için ise basit

boyama yapılmıştır. Basit boyama için, bir öze dolusu mikroorganizma iki damla çeşme

suyu ile seyreltilerek lam üzerine yayılmış, hava akımında kurutulmuş, alevle fikse

edilmiş, daha sonra üzerine bir damla kristal viyole damlatılarak bir dakika

beklenmiştir. Boya çeşme suyu ile uzaklaştırıldıktan sonra mikroorganizma ışık

mikroskobu altında görüntülenmeye hazır hale gelmiştir. Basit boyama ve ışık

mikroskobu kullanılarak morfolojik yapı aydınlatma çalışmaları Ankara Üniversitesi

Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Biyoteknoloji Laboratuarı’nda yapılmıştır.

77

3.2.2.2. Mikroorganizmanın genetik tanımlaması

Çalışmada mikroorganizmanın tür tanımlaması için 5.8S rRNA ve 26S rRNA analizleri

yapılmıştır. Ökaryotlarda 5.8S rRNA ve 26S rRNA genleri kromozomda çok iyi

korunan bölgelerdir. Bununla birlikte, türden türe farklılık gösteren dizinler de

içermektedirler. Türe özgü olan bu karakteristik dizinlerin tanımlanması,

mikroorganizmanın türünün belirlenmesine imkan sağlamaktadır. Çalışılan

mikroorganizmanın tür tayini için uygulanan yöntemler; kullanılacak primerlerin

saptanması, DNA izolasyonu, PCR ve sekans analizlerini kapsamaktadır.

i) Primerlerin saptanması

5.8S rRNA ve 26S rRNA dizilerini PCR yöntemiyle çoğaltabilmek amacıyla öncelikle

her bölge için uygun primerler belirlenmiştir. Bu amaçla yapılan literatür araştırması

sonucunda 5.8S rRNA için seçilen primerler: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’

(F1), 5’-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3’ (R1) (Fernàndez-Espinar et al. 2000);

26S rRNA için seçilen primerler: 5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’

(F2), 5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3’ (R2) (Takashi et al. 2002) şeklindedir.

ii) DNA izolasyonu

DNA izolasyonu için NucleoSpin Tissue (Macherey Nagel) DNA izolasyon kiti

kullanılmıştır. İzolasyon yapılırken kitin kullanım kılavuzunda yer alan protokol

izlenmiştir. DNA izolasyonunda izlenen protokolün içeriğinde yer alan basamaklar

aşağıda verilmiştir :

DNA izolasyonu için örnekler hazırlanırken 3 ml’lik üretim ortamı 10 dk 5000 g’de

santrifüjlenir, çöken hücre 1 ml 10 mM EDTA (pH=8) çözeltisi ile yıkanır. Üst faz

atılarak hücreler santrifüjle yeniden çöktürülür. Ön-liziz işlemi için, pellet 600 µl

sorbitol çözeltisi içinde çözülür (1.2 M sorbitol çözeltisi; 10 mM CaCl2; 0.1 M Tris-

HCl, pH=7.5; 35 mM β-merkaptoetanol). Liziz için 100 µl 50 U litikaz veya zimolaz

enzimi eklenir ve örnek 30oC’ta 30 dk inkübe edilir. Bu basamakta amaç maya hücre

78

duvarının parçalanmasını sağlamaktır. Bu esnada sferoplast oluşumu (hücre duvarının

parçalanarak stoplazmik zara yapışması) mikroskopla kontrol edilebilir. Karışım 10 dk

2000 g’de santrifüjlenerek üst faz atılır. Pellet halindeki sferoplastlar kite ait 180 µl liziz

tamponunda (Buffer T1) çözülür. 25 µl Proteinaz K çözeltisi (20 mg/ml) eklenen

karışım kuvvetlice vortekslenir. Örnek ön-liziz tamamlanana kadar 56oC’ta en az 1-3

saat inkübe edilir. İnkübasyon boyunca ara ara vortekslenir ya da çalkalamalı su

banyosu kullanılır. Liziz işlemi için örnekler vortekslenir ve üzerlerine 200 µl kite ait

B3 tamponu eklenir (Buffer B1 + Buffer B2 = Buffer B3). Örnekler vortekslendikten

sonra 70oC’ta 10 dk inkübe edilir, sonrasında örnekler yavaşça tekrar vortekslenir. Bu

aşamadan sonra DNA’nın membrana bağlanma koşulları ayarlanır. Bu amaçla örneklere

210 µl etanol eklenerek (%96-100) vortekslenir. DNA’nın silika membrana bağlanması

basamağında, her örnek için bir NucleoSpin Tissue kolonu, 2 ml’lik toplama tüplerine

yerleştirilir. Örnek kolona yüklenir. 11000 g’de 1 dk santrifüj edilir. Toplama tüpündeki

sıvını tamamı atılır ve kolon boş toplama tüpüne geri yerleştirilir. Eğer örnek tam

çökmemişse, yani membran üstünde hala sıvı varsa, santrifüj basamağı tekrarlanır.

Bundan sonraki basamak silika membranın yıkanmasıdır. İki yıkama yapılır. Birinci

yıkamada kolona, kite ait BW tamponundan 500 µl (yıkama tamponu) eklenir. 11000

g’de 1 dk santrifüj edilir. Toplama tüpündeki sıvı atılarak kolon, toplama tüpüne geri

yerleştirilir. İkinci yıkamada kolona, kite ait B5 tamponundan (derişik yıkama tamponu)

600 µl eklenip 11000 g’de 1 dk santrifüj edilir. Toplama tüpündeki sıvı atılarak kolon,

toplama tüpüne geri yerleştirilir. Silika membranın kurutulması için ise kolon 11000

g’de 1 dk santrifüj edilir. Bu basamakta kalan etanol uzaklaştırılır. Son olarak yüksek

saflıkta DNA izolatı için, NucleoSpin Tissue kolon tüpleri 1.5 ml’lik temiz

mikrosantrifüj tüplerine konulur. Üzerlerine 100 µl ısıtılmış (70oC) kite ait elüsyon

tamponu (B5) eklenir. Oda sıcaklığında 1 dk inkübe edilir. 11000 g’de 1 dk

santrifüjlenir. Santrifüj sonrası kolon tüpler atılır. 1.5 ml’lik mikrosantrifüj tüplerindeki

saf DNA, PCR işlemi için saklanır. DNA izolasyonu Ankara Üniversitesi Mühendislik

Fakültesi Gıda Mühendisliği laboratuarlarında yapılmıştır.

79

iii) PCR (Polimeraz zincir reaksiyonu)

DNA izolasyonunun ardından; PCR, PCR pürifikasyonu, DNA dizi analizi, dizileme

reaksiyonları için etanol/EDTA/sodyum asetat çöktürmesi ve sekans analizleri Ankara

Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuarı Genombilim Birimi’nde

yapılmıştır.

Öncelikle izole edilmiş DNA’nın derişimi ve saflığı NanoDrop (ND-1000

Spectrophotometer) cihazında spektrofotometrik olarak incelenmiştir. 260 ve 280 nm

dalga boylarında ölçülen absorbans değerleri birbirine oranlandığında bulunacak

değerin (A260/280) 2’ye yakın olması istenmektedir. 1.7’den düşük değerlerde DNA

izolasyon işlemi tekrarlanmalıdır; çünkü çözelti içindeki fazla miktarda protein PCR

verimini azaltmaktadır. Daha sonra DNA, RNA kontaminasyonu olup olmadığını

gözlemek amacıyla %1’lik agaroz jelde yürütülmüştür (Sky-Plus Electrophoresis; 120

V, 5-10 dakika). Önceden sipariş edilen primerler (F1, R1, F2, R2) sulandırılarak PCR

için hazırlık yapılmıştır. Optimizasyon aşamasında MgCl2’nin (Taq polimeraz

aktivatörü) farklı derişimleri (1, 1.5, 2 mM) ve farklı sıcaklıkların (50, 55, 60oC)

denenmesine karar verilmiştir.

İncelenecek gen bölgesi, DNA polimeraz enzimi kullanılarak PCR uygulamaları ile in

vitro ortamda çok sayıda kopyalanabilmektedir. PCR ile spesifik DNA dizileri

laboratuar ortamında, primer adı verilen oligonükleotid diziler yardımıyla

çoğaltılmaktadır. Reaksiyon; saf DNA, DNA polimeraz, oligonükleotid primerler ve

enzimin kopyalama işleminde kullanacağı serbest deoksiribonükleotid trifosfatlar

(dNTP : dATP, dCTP, dGTP, dTTP) ile gerçekleştirilir. Polimeraz zincir reaksiyonunun

bileşenleri EK 2’de verilmiştir. Kopyalama işlemi DNA’nın 94-95oC’a kadar

ısıtılmasıyla başlamaktadır. Bu sıcaklıkta kalıp DNA’nın her iki sarmalı birbirinden

ayrılmakta (denatürasyon-ayrılma) ve primerlerin iki sarmal arasına girebilmesi

sağlanmaktadır. Sıcaklık aniden düşürülerek, çoğaltılacak kalıbın belli dizilerine

komplementer (tamamlayıcı) olarak tasarlanmış primerlerin hedef bölgeleri tanıması

(bağlanma-annealing) sağlanır. Kullanılacak bağlanma sıcaklığı, primerlerin Tm

değerlerinin (çift iplikli nükleik asit moleküllerinde baz çiftlerinin yarısının ortadan

80

kalkmasına yol açan sıcaklık) 2-4oC altında bir sıcaklık değeridir. Ortamda polimeraz

varlığında 70-75oC’ta her iki primer, 5’ uçlarından 3’uçlarına doğru uzatılmaktadır

(uzama-extension). Bu üç basamağın defalarca tekrarlanması sonrasında her bir döngü

sonunda kalıp DNA iki katına çıkar. Bu basamaklar 30-40 kez tekrarlanırsa kalıp DNA

teorik olarak 230-240 kez çoğaltılmış olur. Böylece incelenecek bölgenin milyarlarca kez

çoğaltılmasıyla PCR ürününün (amplikon) kolay analiz edilmesi olanaklı hale gelir.

Yüksek sıcaklığa dayanıklı DNA polimerazların (Taq polimeraz ve benzerleri)

bakterilerden elde edilmesi sayesinde her döngüde reaksiyona tekrar enzim eklenmesi

gerekliliği ortadan kalkmış ve tüm basamaklar ısı döngü aygıtları (thermal cycler)

yardımıyla kolaylıkla yapılabilir hale gelmiştir. Çalışmada 29 döngü kullanılarak kalıp

DNA’nın denatürasyonu 95oC, primerlerin uzaması 72oC’ta gerçekleştirilmiştir. PCR

için uygun bağlanma sıcaklığını belirlemek için 50, 55, 60oC olmak üzere üç farklı

sıcaklık denenmiştir. PCR işlemi için Bio-Rad DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal

Cycler (Gradient Cycler) PCR cihazı kullanılmıştır.

PCR’ın ardından jel elektroforez yapılarak sekans için en iyi koşullar belirlenmeye

çalışılmıştır. Bu amaçla %2’lik agaroz jel kullanılmıştır. Sekans analizleri için uygun

koşullar belirlendikten sonra, PCR pürifikasyon ve DNA dizi analiz protokolleri

izlenmiştir. PCR pürifikasyonu; primer artıkları, enzim ve fazla dNTP’yi ortamdan

uzaklaştırarak DNA’nın istenilen bölgesini saf olarak elde etmek amacıyla

yapılmaktadır. DNA dizi analiz protokolünde ise sekans cihazında çift iplik

okunamadığı için tek primer (F veya R) kullanılarak sekans PCR’ı yapılmaktadır.

Sonrasında dizileme reaksiyonları için etanol çöktürmesi yapılıp sekans analizlerine

geçilmiştir. Sekans analizleri için kapiler sistem otomatik sekans cihazı (CEQ 8000,

Beckman Coulter Genetic Analysis System) kullanılmıştır. Sekans analiz cihazı

sonuçları kromatogram şeklinde baz dizilimlerini vermektedir. Bu baz dizilimleri

“National Center for Biotechnology Information”in web sayfasındaki BLAST programı

(blastn) kullanılarak (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) gen bankası veri tabanıyla

karşılaştırılmıştır.

81

3.2.3 Mikroorganizma ve lipaz üretim ortamlarının hazırlanışı

Mikroorganizmadan lipaz üretiminde öncelikle petri kaplarında çoğaltılan saf

mikroorganizma, agar içeren eğik tüplere aktarılmış, belli sürelerle tüpten tüpe

ekimlerle stok tazeleme yapılmış, sonra mikroorganizma katı agar içeren tüplerden sıvı

ön çoğalma ortamına, ön çoğalma ortamından da 1/10 aşılama oranı ile daha büyük

hacimli lipaz üretim ortamına aktarılmıştır.

3.2.3.1 Agar ortamı

Kültürlerin uzun süre saklanması için katı besi yerleri kullanılır ve sıvı besi yerlerine

katılaştırıcı madde ilavesi ile hazırlanır. Katılaştırıcı madde olarak agar

kullanılmaktadır. Agar 90-95oC’ta eriyip 40-42oC’ta yeniden katılaşan, deniz

yosunlarından elde edilen bir maddedir. Mikroorganizmaların çoğalmada kullanacağı

besi yeri olarak yağlı bir ortam olan TBA seçilmiştir. Tribütirin agar ortamı %0.5

pepton, %0.3 maya özütü, %1 tribütirin, %1.5 agar ve %1 glukozdan oluşmaktadır.

Hazırlanan katı ortam 121oC’ta 20 dakika sterilizasyonun ardından (ALP CL-40M

Sterilizatör) laminer akış kabininde (Biolab Faster BHG 2004-S) tüplere paylaştırılarak

tüpler eğik duracak şekilde agarın donması beklenmiştir. Tüplerin eğik oluşunun sebebi

mikroorganizmanın çoğalacağı yüzey alanını artırmaktır. Sonra tüplerdeki katı ortama

laminer akış kabininde steril koşullara dikkat edilerek ekim yapılmış ve

mikroorganizma 30oC’ta t=24 saat inkübasyona bırakılmıştır (Shel Lab S16R-2

İnkübatör).

3.2.3.2 Ön çoğalma ortamı Mikroorganizmaların fazla miktarlarda üretimi için fermantasyon çalışmalarında sıvı

besi yerleri kullanılır. Ön çoğalma ortamı, mikroorganizmanın lipaz üretim ortamına

aktarılmadan önce çoğaltıldığı sıvı ortamdır. Bu çalışmada, ön çoğalma ortamı katı besi

yeri ile aynı bileşimdedir. Sadece agar içermemektedir ve katı besi yeri damıtık su ile

hazırlanırken ön çoğalma ortamının hazırlanışında tampon kullanılmıştır. Çalışmalarda

82

tampon olarak geniş bir pH aralığını kapsayan (yaklaşık 2.6-7.6). 0.1 M sitrik asit

monohidrat-0.2 M Na2HPO4 tamponu kullanılmıştır. Deterjan katkısı olarak lipaz

üretiminin incelendiği bu çalışmada, sitrik asit tamponunun kullanılmasının bir sebebi

de sodyum sitratların deterjan endüstrisinde sıklıkla kullanılışıdır. Ön çoğalma

ortamının pH’ı üretim ortamının pH’ı ile aynıdır. Ön çoğalma ortamı T=30oC’ta,

N=150 rpm koşullarında t=24 saat çalkalamalı hava banyosunda (Edmund Bühler SM-

30 İnkübatör; Shel Lab S16R-2 İnkübatör) inkübe edilmiştir. t=24. saatte 10 ml’lik ön

çoğalma ortamlarında yeteri kadar çoğalmış hücreler, lipaz üretim ortamlarına steril

koşullarda 1/10 oranında aktarılmıştır.

3.2.3.3 Lipaz üretim ortamı

Lipaz üretim ortamı, mikroorganizmanın çoğalırken lipaz ürettiği ortamdır. Bu ortam

mikroorganizma için uygun karbon, azot kaynaklarını ve iyonları içermektedir. Üretim

ortamının bileşimi ve sıcaklık, pH gibi enzim üretim koşulları, incelenmek istenen

parametre olarak değişmektedir.

3.2.4 Hücre parçalama

Mikroorganizma, ürettiği lipazı hücre dışına da salgılayabilir (hücre dışı lipaz) veya

hücre içinde de tutabilir (hücre içi lipaz). Eğer hücre içi lipaz ile ilgileniliyorsa lipaza

ulaşabilmek için mikroorganizmanın hücre duvarının parçalanması gerekir. Hücre

duvarını parçalamak için kimyasal, fiziksel ve enzimatik olmak üzere farklı yöntemler

mevcuttur. Çalışmada, hücre parçalamada kullanılan fiziksel yöntemlerden biri olan

cam boncuklarla hücre parçalama yöntemi uygulanmıştır. Cam boncuklarla hücrenin

tam olarak parçalanıp parçalanmadığını anlamak amacıyla parçalama sonrası hücreler

mikroskop altında incelenmiştir. Cam boncukla parçalandığı düşünülen hücrelere,

metilen mavisi ile basit boyama yapılarak mikroorganizmanın mikroskop (OLYMPUS

CX21FS1) altındaki görüntüsü incelenmiş ve mikroorganizmanın hücre bütünlüğünün

bozulduğu gözlenmiştir. Cam boncukla hücre parçalama işleminde öncelikle 12000

g’de (10000 rpm) 4oC’ta 10 dk süreyle santrifüj edilerek çöktürülen hücre, 10 mM Tris-

83

HCl tamponu (pH=8) ile en az iki kez yıkanmıştır. Her yıkama, hücre çöktürülüp sıvı

kısım atılarak gerçekleştirilmiştir. En son hücre 1.5 ml Tris-HCl tamponunda çözünmüş

ve parçalayıcı cihaza ait konik dipli tüpe alınıp üzerine tüp dolana kadar cam boncuklar

ilave edildikten sonra 30 s’lik 8 periyotta parçalanmıştır. Cihaz (Mini-Beadbeater

Biospec Products), 42000 rpm’de çalıştırılmıştır. Parçalayıcı cihazdan alınan tüpler

açığa çıkan ısı nedeniyle enzim aktivitesinin etkilenmemesi için buzda bekletilmiştir.

Parçalanan hücre, 12000 g’de (10000 rpm) 4oC’ta 10 dk süreyle santrifüj edilerek

çöktürülmüş ve böylece üst faz hücre kalıntılarından arındırılarak analize hazır hale

getirilmiştir.

3.2.5 Lipaz saflaştırması

Lipaz enzimi saflaştırılmasında kullanmak üzere 200 ml toplam hacimli (her biri 100’er

ml olmak üzere 250 ml’lik iki erlende), %1 Triton X-100, %0.5 pepton ve %0.3 maya

özütü içeren ortamda (pH=4.5, T=30oC) lipaz üretimi gerçekleştirilmiş; üretim ortamı

en yüksek lipolitik aktivitenin gözlendiği 48. saatte 12000 g’de (10000 rpm) 4oC’ta 20

dk santrifüj edilerek hücrelerden arındırılmıştır. Hücrelerden arındırılmış ortam,

Amicon Ultra 15 (Millipore) ultrafiltrasyon tüpleri kullanılarak 4oC’ta, 4000 g’de (6000

rpm) 40 dakika süreyle santrifüj edilerek 5 kDa molekül ağırlığının altındaki

moleküllerin ortamdan uzaklaşması sağlanmıştır. Santrifüjden sonra filtrenin üzerinde

kalan yüksek molekül ağırlıklı proteinleri içeren kısımlar ise bir sonraki saflaştırma

basamağı için toplanmıştır.

Bir sonraki saflaştırma basamağı kromatografik yöntemle ayırmadır. Çalışmada

saflaştırma amacıyla, proteinlerin izoelektrik noktalarına göre farklı yüklenmeleri

özelliği ile ayırmanın sağlandığı anyon değişim kromatografisi seçilmiştir. Bu amaçla

Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuarı Proteombilim

Birimindeki Bio-Rad Duo Flow Anyon Değişim Kromatografi Cihazı ve Bio-Rad Uno

Q1 kolon kullanılmıştır. 1 ml örnek, 1 ml/dk akış hızı ile kolona yüklenmiştir.

Anyon değişim kromatografisinde Tampon A ve Tampon B olarak isimlendirilen iki

ayrı tampon kullanılmıştır. Tampon A, pH=8.3 olan 20 mM Tris-HCl tamponudur.

84

Tampon B ise pH=8.3 olan 20 mM Tris-HCl + 1 M NaCl tamponudur. Tampon A ve

Tampon B kromatografik ayırma esnasında belli oranlarda karıştırılarak bir tuz derişim

gradyeni oluşturulur. Sürekli artan tuz derişim gradyeninin oluşturulmasındaki amaç,

kolona tutunmuş proteinlerin kademeli olarak fraksiyonlar şeklinde kolondan

ayrılmasını sağlamaktır. Tampon B’deki Cl- iyonları, kolona tutunmuş (-) yüklü

iyonların yerini almakta ve böylece negatif yüklü proteinlerin kolondan ayrılması

sağlanmaktadır. Saflaştırma işleminde öncelikle, A tamponu ile birlikte kolondan

geçirilen örnek içerisindeki, (+) yüklendiği için (+) kolona tutunamayan proteinler (pI >

pH=8.3) gradyen oluşturulmadan önce fraksiyonlar halinde toplanmıştır. Gradyen

oluşturulduktan sonra ise pI < pH=8.3 olan (-) yüklenmiş proteinler (+) kolona

tutunarak ayırma sağlanmıştır. Fraksiyonların toplanması için Bio-Rad Fraction

Collector kullanılmıştır. Toplanan her bir fraksiyonun hacmi 0.4 ml’dir.

3.2.6 TCA çöktürmesi

Kromatografik yöntemle ayrılan proteinlerin SDS-PAGE analizlerinin yapılabilmesi

için -örneklerin protein derişimlerinin düşük olması nedeniyle- proteinleri deriştirmek

amacıyla TCA çöktürmesi yapılmıştır. Bu amaçla 1 ml örnek üzerine 100 µl %100 TCA

konulmuş, 15 s vortekslenen örnekler 15 dk buzda bekletilmiştir. 10 dk 4oC’da 14000

rpm’de santrifüj edilen örneklerin üstte kalan sıvısı atılarak proteinler pellet halinde

çöktürülmüştür. Pelleti yıkamak amacıyla üzerine 500 µl %100 soğuk aseton

konulmuştur. 10-15 s vortekslemenin ardından 14000 rpm’de 5 dk santrifüj edilen

örneklerdeki proteinler çökelti halinde elde edilmiştir. TCA çöktürmesi Biyoteknoloji

Enstitüsü Merkez Laboratuarı Proteombilim Birimi’nde yapılmıştır.

3.2.7 SDS-PAGE yöntemi

Saflaştırma basamaklarının ardından elde edilen enzimin saflığını göstermek ve

mikroorganizmanın ürettiği proteinlerin molekül ağırlıklarını yaklaşık olarak belirlemek

amacıyla SDS-PAGE analizleri yapılmıştır.

85

SDS-PAGE (Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforez), yüklü

moleküllerin elektrik alan altındaki (+/-) farklı davranışlarından yararlanarak yapılan bir

ayırma işlemidir. Protein analizlerinde matriks olarak poliakrilamit jel kullanılır.

Proteinler, molekül ağırlıklarına ve yüklerine göre elektriksel alanda farklı uzaklıklara

hareket ederler. SDS-PAGE denature edici ajan olarak SDS’in (sodyum dodesil sülfat)

kullanıldığı bir ayırma yöntemidir. SDS-PAGE’de örnek proteinler SDS ve

merkaptoetanol ile birlikte kaynatılarak denatüre edilir. Böylece protein molekülü

primer forma dönüşür. Merkaptaetanol proteinin üç boyutlu yapısındaki disülfit

bağlarını koparır, (-) yüklü SDS, proteinlerin kuaterner, tersiyer ve sekonder yapılarını

bozar, katları açılan peptid zincir, SDS ile sarılarak misel görünümü kazanır. Tüm

proteinler SDS nedeniyle (-) yüklendiği için SDS-PAGE’de ayırma sadece proteinin

molekül ağırlığına göre olur. Elektriksel alan içinde proteinlerin hareketi molekül

ağırlıklarına bağlıdır. Daha küçük olanlar, daha hızlı yürür (Laemmli 1970).

SDS-PAGE dikey tipte bir elektroforez şeklidir. Poliakrilamit jel, akrilamit ve bis-

akrilamit monomerlerinin çapraz bağlanması ile oluşur. Polimerizasyon için katalizör

olarak TEMED (Tetra Etil Metilen Diamin) kullanılır. TEMED polimerizasyonu

başlattığı için karışıma en son eklenir. Katalizörün işlev görmesi için gerekli sülfat,

serbest radikal kaynağı olan amonyum persülfattan (APS) sağlanır. Tampon olarak Tris-

HCl tamponu kullanılır. Sürekli jellerde ayırma için tek tip jel kullanılırken, sürekli

olmayan jellerde ayırma jeli (running gel/separating gel) ve yığma jeli (stacking gel)

olmak üzere iki tip jel kullanılır. Yığma jeli tamponu ile ayırma jeli tamponlarının

pH’ları farklıdır. Yığma jeli tamponunun pH’ı daha düşüktür. Bunun nedeni

proteinlerin kazandıkları (+) yük ile daha yavaş hareket etmelerini sağlayarak

başlangıçta bir ayırma sağlamaktadır. Ayırma jeline farklı zamanlarda ulaşan proteinler

bu jelde daha hızlı hareket ederler ve ayırma daha iyi sağlanır. Proteinlerin farklı

jellerdeki koşma hızları sadece tampon pH’ı ile ilgili değildir. Ayırma jeli genellikle

%10-12’lik, yığma jeli ise %4-6’lıktır. Yüzde artıkça gözenek çapı azalır, protein daha

hızlı hareket eder. Jelde yürütülmüş proteinlerin molekül ağırlığını tayin etmede, jele

örneklerle birlikte yüklenen, molekül ağırlıkları bilinen proteinleri içeren standartlar

(marker) kullanılır. Jelin boyanması için farklı boyalar (Coomassie Brillant Blue, Sypro

86

Ruby, Sypro Orange, gümüş boya vb) kullanılabilir (http://yunus.hacettepe.edu.tr,

2007). SDS-PAGE için kullanılan aparatların şematik gösterimi Şekil 3.2’de verilmiştir.

Çalışmada, yürütme jeli için %10’luk, yığma jeli için %4’lük akrilamit jel

hazırlanmıştır. İndirgeme ajanı (reducing agent) ve yükleme tamponundan (loading

buffer) oluşan Laemmli tamponunda çözünen örnekler her kuyucuğa 25’er µl

yüklenmiştir. Bu karışım denatüre edici kimyasal ve izleme boyası içermektedir.

Protein bantlarının gözlemesi için Bio-Rad Silver Stain Plus gümüş boyama kitinin

gümüş boyama metodu kullanılmıştır. Gümüş boyama yönteminin duyarlılığı

Coomassie Blue’ya göre 100 kat fazladır. Boyama için, elektroforez sonrasında jel,

fiksasyon çözeltisine (fixative enhancer solution; %10 fixative enhancer concentrate,

%50 metanol, %10 asetik asit, %30 bidistile su) konulmuş ve 20 dk fiksasyon

çözeltisinde çalkalanmıştır. Sonra 10 dk bidistile suda, 10 dk bitiminde suyu

değiştirilerek 20 dk tekrar bidistile suda tutulmuştur. Daha sonra jel, gümüş boyama

çözeltisine (%35 bidistile su, %5 Silver Complex Solution (SCS), %5 Reduction

Moderator Solution (RMS), %5 Image Development Reagent (IDR) ve kullanmadan

hemen önce eklenen %50 Development Accelerator Reagent) alınmış ve 20 dk boya

çözeltisinde hafifçe çalkalanarak bekletilmiştir. 15 dk sonunda bantların görünmesi

beklenmektedir; ancak bu süre daha kısa sürmüştür. %5’lik asetik asit çözeltisi ile

boyama işlemi durdurulmuştur. Jel asetik asit çözeltisinde en az 15 dk bekletilmiştir. En

son jel yıkama amacıyla 5 dk bidistile suda tutulmuştur.

87

Şekil 3.1 SDS-PAGE aparatlarının şematik olarak gösterimi

3.3 Analizler

Çalışmada yapılan analizler; spektrofotometrik ve titrimetrik olmak üzere iki ayrı

yöntemle lipolitik aktivite tayini, proteaz aktivitesi tayini, hücre ve protein

derişimlerinin belirlenmesidir. Aktivite ve protein derişimleri yardımıyla spesifik

aktivite, zamana karşı hücre derişim değerlerinden yararlanılarak da mikroorganizma

özgül çoğalma hızları hesaplanmıştır.

3.3.1 Spektrofotometrik yöntemle lipaz aktivitesi Tüm üretimlerde lipaz aktivitesi spektrofotometrik olarak belirlenmiştir.

Spektrofotometrik olarak lipaz aktivitesi tayin edilirken, p-nitrofenil palmitatın (PNFP)

enzimatik hidrolizi sonucu oluşan p-nitrofenolün (PNF) absorbansta yarattığı

değişiklikten yararlanılmıştır. Lipaz üretim ortamı 12000 g’de (10000 rpm) 4oC’ta 10

Cam levhalar Boşluk yapıcı

Negatif Elektrot

Pozitif Elektrot

Yürütme Jeli kuyucuklar

Tampon

Örneklerin yüklendiği kuyucuklar

Ayırma Jeli Büyük MA’lı Proteinler Küçük MA’lı Proteinler

Tampon

88

dk santrifüjlenerek (Hettich Zentrifugen Rotina 35R) hücre çöktürülmüş, üstte kalan

sıvıdan 1 ml alınarak 1 ml PNFP çözeltisi (etanol ile hazırlanmış; %0.5 a/h) ile oda

sıcaklığında 5 dk süreyle karıştırılarak hidroliz tepkimesi gerçekleştirilmiştir. Tepkime

2 ml 0.5 N Na2CO3 çözeltisi ile sonlandırılmıştır. Karışım 12000 g’de (10000 rpm), oda

sıcaklığında 10 dk santrifüj edilmiş ve üstteki sıvının λ=404 nm’de spektrofotometrik

okuması yapılmıştır. Bu yöntemle tanımlanan 1 Ünite (U) lipaz aktivitesi, bir dakikada

1 µmol PNF açığa çıkarmak için gerekli enzim miktarıdır. (Hung et al. 2003). Aktivite

tayini için örnek hesaplama EK 3’te verilmiştir.

3.3.2 Titrimetrik yöntemle lipaz aktivitesi

Çalışmada titrimetrik olarak lipaz aktivitesi tayini, sadece en iyi koşullarda enzim

üretimi yapılırken kullanılmıştır. Titrimetrik olarak lipaz aktivitesi belirlenirken substrat

olarak zeytin yağı kullanılmıştır. Küçük bir cam balona konulan 500 µl zeytin yağı, 2.5

ml 0.1 M pH=7.2 fosfat tamponu ve 100 µl hücresi çöktürülmüş lipaz üretim ortamı, su

banyosunda 37oC’ta 30 dk karıştırılmıştır. Reaksiyon etanol/aseton karışımından (h/h)

(1:1) 2.5 ml eklenerek sonlandırılmıştır. Karışım indikatör olarak 2 damla fenolftalein

eklenerek 0.1 N NaOH ile titre edilmiştir. Enzim aktivitesi harcanan NaOH miktarından

yola çıkılarak hesaplanmıştır. Bu yöntemle tanımlanan 1 Ünite (U) lipaz aktivitesi, bir

dakikada 1 µmol yağ asidi açığa çıkaran enzim miktarıdır (Cernia et al. 2002, Wei et al.

2004). Aktivite tayini için örnek hesaplama EK 4’te verilmiştir.

3.3.3 Proteaz aktivitesi

Proteaz aktivitesi, substrat olarak kazein kullanılarak enzimatik hidroliz sonucunda açığa

çıkan hidrolizat absorbansının, spektrofotometrik olarak ölçülmesiyle belirlenmiştir. Bu

amaçla %0.037 EDTA (a/h), %0.5 kazein (a/h) içeren, pH=10 borat tamponu ile

hazırlanan çözeltiden 2 ml alınarak hücresi çöktürülmüş 1 ml lipaz üretim ortamı ile 100

rpm’de, 37oC’ta 20 dk süreyle bir reaksiyon gerçekleştirilmiştir. Reaksiyon 2 ml %10

TCA (a/h) ile durdurulmuştur. 15 dakika buzda bekletilen karışım 12000 g’de (10000

rpm), 4oC’ta 10 dk santrifüjlenerek üstte kalan sıvının λ=275 nm’de spektrofotometrik

89

okuması yapılmıştır. Bu yöntemle tanımlanan 1 Ünite (U) proteaz aktivitesi, bir dakikada

4 nmol tirozin açığa çıkaran enzim miktarıdır (Moon and Parulekar 1991). Çalışmada

kullanılan kalibrasyon grafiği EK 5, örnek aktivite hesabı EK 6 ile verilmiştir.

3.3.4 Hücre derişimi

Hücre derişimleri λ=600 nm’de spektrofotometrik yöntemle belirlenmiştir. Bu amaçla

öncelikle kuru hücre kalibrasyon doğrusu oluşturulmuş ve bu doğrudan yararlanılarak

lipaz üretim ortamından alınmış örneklerin λ=600 nm’de absorbansları okunarak hücre

derişimleri hesaplanmıştır. Okunan absorbansların 1.00 değerini geçmesi durumunda

örnekler belli oranlarda seyreltilmiştir (%90, %99 vb). Kalibrasyon doğrusu

oluşturulurken, öncelikle lipaz üretim ortamında çoğaltılmış hücreler 12000 g’de (10000

rpm), 4°C’ta 10 dakika süreyle santrifüj edilmiş, üstteki sıvı dökülmüş, çökelek bir

miktar damıtık suda çözündükten sonra aynı koşullarda yeniden santrifüj edilmiştir.

Santrifüj işlemine çökeleğin üzerindeki sıvı berraklaşana kadar devam edilmiştir. İki kez

santrifüj yeterli olmuştur. Saf suyla yıkama işleminin ardından tüplerin dibindeki çökelek

halindeki hücreler bir petri kabının üzerine alınıp, hücrelerin kuruması için etüvde

45°C’ta yaklaşık 1 gün bekletilmiştir. Kuru hücreden 1 mg/ml’lik stok çözelti

hazırlanmış, stok çözelti seyreltilerek farklı derişimde hücre süspansiyonları

oluşturulmuştur. Kalibrasyon doğrusu, farklı derişimlerdeki kuru hücre

süspansiyonlarının UV spektrofotometrede 600 nm’de absorbansları okunarak

oluşturulmuştur. Çalışmada kullanılan kalibrasyon grafiği EK 7’de verilmiştir.

3.3.5 Protein derişimi

Protein derişimlerinin belirlenmesi için Bradford yönteminden yararlanılmıştır (Bradford

1976). Oldukça hassas olan bu yöntem (5-100 µg/ml), organik bir boyanın proteinlerin

asidik ve bazik grupları ile etkileşerek renk oluşturmasını esas almaktadır. Daha önceden

hazırlanıp süzülmüş olan 5 ml Bradford çözeltisi (%0.01 (a/h) Coomassie Brilliant Blue

G-250, %5 (h/h) etanol (%95’lik), %10 fosforik asit (%85’lik), %84.99 damıtık su)

üzerine hücresi çöktürülmüş 100 µl lipaz üretim ortamı eklenerek karışım

90

vortekslenmiştir. 10 dk beklendikten sonra karışım yine vortekslenmiş ve λ=595 nm’de

spektrofotometrik okuma yapılmıştır. Boya normal şartlarda 465 nm’de maksimum

absorbans verirken, proteine bağlandığı zaman 595 nm’de maksimum absorbans

vermektedir. Mavi rengin oluşmasında proteinin amino asit bileşimi (özellikle arjinin

gibi bazik amino asitler ve aromatik amino asitler) önemlidir. Çalışmada kullanılan

kalibrasyon doğrusu EK 8’de verilmiştir. Kalibrasyon doğrusu Bovine Serum

Albumin’in (BSA) farklı derişimleri kullanılarak hazırlanmıştır.

3.3.6 Bitkisel yağ analizleri

Ticari olarak sağlanan bitkisel yağların, gaz kromatograf cihazı kullanılarak yağ asidi

bileşimleri belirlenmiştir (Çizmeci vd. 2005). Analizler, yağ asitleri metil esterlerine

dönüştürüldükten sonra gerçekleştirilmiştir (Anonymous 1987) ve sonuçlar EK 9’da

çizelge şeklinde verilmiştir Bitkisel yağ analizleri Ankara Üniversitesi Mühendislik

Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümünde yapılmıştır.

3.4 Verilerin Değerlendirilmesi

Elde edilen deneysel verilerden yararlanılarak spesifik aktivite ve özgül çoğalma hızları

hesaplanmıştır.

3.4.1 Spesifik aktivite

Spesifik aktivite üretilen protein başına enzim aktivitesi olarak tanımlanmaktadır.

Çalışmada, ölçülen protein derişimleri ve aktivite değerlerinden yararlanılarak örneklerin

spesifik aktiviteler hesaplanmıştır.

spesifik aktivite =(U/ml)*(ml/mg protein)……………………………………..(3.1)

91

3.4.2 Mikroorganizmanın özgül çoğalma hızları

Çalışmada, sabit hacimli sistemlerde sıvı faz hücre çoğalma eşitliği düzenlenerek,

ölçülen mikroorganizma derişimlerinin de kullanılmasıyla her bir ortam için özgül

çoğalma hızları bulunmuştur.

Hücre çoğalma hızı :

Zamana karşı ölçülen hücre derişimlerinden t’ye karşı ln(Cx/Cxo) değerleri grafiğe

geçirilir. Eşitlik (3.4)’e göre grafik bir doğru vermelidir. Doğrunun eğimi özgül çoğalma

hızını (µ) verir. Eşitlik (3.4), üstel çoğalma evresindeki veriler için geçerlidir.

)2.3........(......................................................................xx

x Cdt

dCr µ==

)3.3.........(......................................................................0∫∫ =tC

C x

x dtCdCx

xo

µ

)4.3(..........................................................................................ln tCC

xo

x µ=

92

4. BULGULAR

4.1 Mikroorganizma İzolasyon ve Tanımlama

Çalışmada kullanılan mikroorganizmanın mikroskop altındaki görüntüleri

incelendiğinde, yuvarlak, boyutları 10.5-17.5 µm arasında değişen, üzüm salkımı

şeklinde koloniler oluşturmuş ve tomurcuklanarak çoğalan ökaryot hücreler

gözlenmiştir. Bakteriyoloji laboratuarlarında sıkça kullanılan 100X immersiyon

objektifiyle ışık mikroskobundan (Leica DM LB2) alınan görüntü Şekil 4.1’de

verilmektedir.

Şekil 4.1 Mikroorganizmanın ışık mikroskobu altındaki görüntüsü Mikroorganizmanın morfolojisi itibariyle bir maya olduğu anlaşıldıktan sonra mayanın

türünü belirlemek için genetik çalışmalar yapılmıştır. NanoDrop cihazında, izolasyonu

yapılan DNA’da protein kontaminasyonu olmadığı belirlenmiştir. DNA’nın 260 nm’de

ölçülen absorbansına karşılık gelen yoğunluğu, 50 ng/µl’nin üzerinde olduğu için

DNA’nın PCR’da kullanılabileceği sonucuna varılmıştır. DNA agaroz jelde

yürütüldüğü zaman da PCR için yeteri kadar saf olduğu gözlenmiştir. PCR

optimizasyonunda, primer çiftleri (F1R1 ve F2R2) kullanılarak farklı sıcaklıklar (50, 55,

60oC) ve farklı MgCl2 derişimleri (1, 1.5, 2 mM) ile elde edilen PCR ürünleri %1’lik

93

jelde yürütülmüştür. Sonuç olarak denenmiş tüm sıcaklıklar iyi sonuç vermiştir.

MgCl2’nin 1 mM’lık derişiminin kullanımının uygun olmadığı görülmüş; F2 ve R2

primerleri kullanılarak yapılan PCR için 1.5 mM’lık MgCl2 derişimi de iyi sonuç

vermemiştir. Agaroz jel görüntüsü EK 10’da verilmektedir. PCR optimizasyonunun

ardından PCR pürifikasyonu yapılmış ve ürünler bir kez daha jelde (%2’lik jel, 120 V)

yürütülerek saf oldukları görülmüştür. Etanol çöktürmesinin ardından dizileme

reaksiyonları gerçekleştirilmiştir. Sekans cihazından alınan analiz sonuçları baz dizinleri

şeklinde EK 10’da verilmektedir. Elde edilen baz dizinleri, “National Center for

Biotechnology Information”in web sayfasındaki BLAST programı (blastn) kullanılarak

(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) gen bankası veri tabanıyla karşılaştırılmış ve

mikroorganizmanın Debaryomyces hansenii olarak bilinen bir maya türü ile yüksek bir

uyumluluk gösterdiği belirlenmiştir. Blast sonuçları EK 11’de verilmektedir.

4.2 Lipaz Üretiminde Önemli Parametreler

Lipaz üretiminde ortamdaki karbon ve azot kaynakları, iyonlar, ortam pH ve sıcaklığı

önemli parametreler olup yapılan çalışmalarda her bir parametrenin enzim aktivitesi ile

protein ve mikroorganizma derişimleri üzerine etkisi belirlenerek lipaz üretimi için en

uygun koşullar saptanmıştır.

4.2.1 Karbon kaynaklarının etkisi

Üretim ortamına konulan karbon kaynakları, lipaz üretiminde en önemli parametreyi

oluşturmaktadır. Yağların karbon kaynağı olarak kullanılmasının lipaz üretimini

indükleyeceği düşüncesiyle öncelikle bitkisel yağlar karbon kaynağı olarak denenmiştir.

Bu amaçla Debaryomyces hansenii’den lipaz üretiminde; zeytin yağı, ayçiçek yağı,

mısır yağı, soya yağı, keten yağı ve iki çeşit susam yağı ve fındık yağı olmak üzere

sekiz farklı bitkisel yağ kullanılmıştır. Etkisi incelenen bitkisel yağlar içerisinde en

yüksek lipolitik aktiviteyi verenlerin farklı derişimleri de denenmiştir. Farklı bitkisel

yağların lipolitik aktivite üzerine etkilerinin farklı olmasının sebebinin bitkisel yağların

bileşimlerindeki yağ asitleri ve esterleri arasındaki farklılık olduğu düşünülmüş ve

94

bitkisel yağlarda bulunan belli başlı yağ asidi ve esterlerinin aktivite üzerindeki etkileri

de ayrıca incelenmiştir. En yüksek lipolitik aktivitenin elde edildiği yağ asidi ve

esterlerinin farklı derişimlerinin lipaz aktivitesine etkisi de araştırılmıştır. Çalışmada,

bitkisel yağlar, yağ asidi ve esterlerine ek olarak gliserol, glukoz, peynir altı suyu,

Triton X-100 gibi farklı karbon kaynaklarının da enzim aktivitesine etkisi gözlenmiştir.

Karbon kaynaklarının lipolitik aktiviteye etkisinin incelendiği tüm deneyler, pH=4.5,

T=30oC, N=150 rpm çalkalama hızında, azot kaynağı olarak %0.5 pepton ve %0.3 maya

özütü birlikte kullanılarak, 250 ml’lik erlenlerdeki 100 ml’lik üretim ortamlarında

gerçekleştirilmiştir. Deneylerde üretim ortamlarından belirli zaman aralıklarıyla steril

koşullarda 2’şer ml örnek alınmıştır. Alınan örnekler, spektrofotometrik olarak hücre

dışı lipolitik aktivite tayini, protein ve hücre derişimlerinin belirlenmesi için

analizlenmiştir.

4.2.1.1 Bitkisel yağların etkisi

Bitkisel yağlardan zeytin yağı, ayçiçek yağı, mısır yağı, fındık yağı, keten yağı, soya

yağı ve iki farklı susam yağının %1 derişimlerinin Debaryomyces hansenii’den lipaz

üretiminde hücre dışı lipolitik aktiviteye, protein derişimine, mikroorganizma

çoğalmasına ve spesifik aktiviteye etkileri incelenmiştir.

%1 derişiminde kullanılan yağlar içerisinde en yüksek lipolitik aktivite (0.0128 U/ml)

soya yağı içeren ortamda gözlenmiştir (Şekil 4.2). Soya yağını, susam yağı (2), susam

yağı (1), mısır yağı, zeytin yağı, ayçiçek yağı, fındık yağı ve keten yağı izlemektedir.

Lipaz aktiviteleri zamanla önce bir atış, sonra azalma göstermiştir. En yüksek lipolitik

aktiviteler genellikle 48. saatte gözlenmekle birlikte, fındık yağı (24. st), soya yağı (40.

st), keten yağı (40. st) ve ayçiçek yağı (120. st) içeren ortamlar istisna gösterirler.

%1 derişimde bitkisel yağ içeren ortamlardaki protein derişimlerinin zamanla değişimi

incelendiğinde en yüksek protein miktarının, %1 susam yağı (1) içeren ortamda olduğu

görülmektedir (Şekil 4.3). Susam yağı (1)’i, mısır yağı, fındık yağı, ayçiçek yağı, susam

yağı (2), soya yağı, zeytin yağı ve keten yağı izlemektedir. Zamana karşı protein eğrileri

önce bir artış, sonra bir azalma göstermektedir.

95

Bitkisel yağların %1 derişimlerinin spesifik aktiviteye etkisi incelendiğinde, en yüksek

spesifik aktivitenin lipolitik aktivitelerde olduğu gibi soya yağı içeren ortamda

gözlendiği görülmektedir (Şekil 4.4). Spesifik aktiviteler için sıralama, aktiviteler ile

aynıdır. Sadece protein miktarlarından gelen farklılık nedeniyle fındık yağı içeren

ortamda spesifik aktivite, ayçiçek yağı içeren ortamdaki spesifik aktiviteden yüksektir.

En yüksek spesifik aktivitelere, aktivitelerle hemen hemen aynı saatlerde ulaşılmaktadır

%1 derişimdeki bitkisel yağlardan susam yağı (2), soya yağı, mısır yağı, keten yağı ve

fındık yağını içeren ortamlarda mikroorganizma derişimlerinin zaman ile değişimi

incelenmiştir (Şekil 4.5). Mikroorganizma en fazla karbon kaynağı olarak soya yağı

içeren ortamda çoğalmıştır. Hücre çoğalması açısından soya yağı içeren ortamı mısır ve

fındık yağlarını içeren ortamlar izlemektedir. Zeytin yağı, ayçiçek yağı ve susam yağı

(2) içeren ortamlarda ise hücre derişimleri sadece deney sonunda ölçülmüştür. Buna

göre 120. saatte zeytin yağı içeren ortamdaki hücre derişimi 8.892 mg/ml, ayçiçek yağı

içeren ortamdaki hücre derişimi ise 10.639 mg/ml’dir. Susam yağı (1) içeren ortamda

ise 72. saatteki hücre derişimi 6.254 mg/ml’dir. En yüksek hücre derişimine ayçiçek

yağı içeren ortamda ulaşılmıştır.

96

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0 20 40 60 80 100 120 140

zaman,st

Lipo

litik

akt

ivite

, U/m

l

%1 Soya %1 Mıs ır %1 Susam (1) %1 Susam (2)%1 Ayçiçek %1 Zeytin %1 Keten %1 Fındık

Şekil 4.2 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

0.1

0 20 40 60 80 100 120 140

zaman,st

Prot

ein

deriş

imi,

mg/

ml

%1 Soya %1 Mısır %1 Susam (1) %1 Susam (2)%1 Ayçiçek %1 Zeytin %1 Keten %1 Fındık

Şekil 4.3 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

97

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0 20 40 60 80 100 120 140

zaman,st

Sesi

fik li

paz

aktiv

itesi

,U/m

g

%1 Soya %1 Mısır %1 Susam 1 %1 Susam 2%1 Ayçiçek %1 Zeytin %1 Keten %1 Fındık

Şekil 4.4 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin spesifik aktiviteye (U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 10 20 30 40 50 60 70 80

zaman, st

Hüc

re d

eriş

imle

ri, m

g/m

l

%1 Susam (2) %1 Soya %1 Mısır %1 Fındık %1 Keten

Şekil 4.5 Bazı bitkisel yağların %1 derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

Bitkisel yağlar içerisinde en yüksek aktivite değerlerini sağlayan soya yağı, susam yağı

(2) ve mısır yağının farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye etkisi ayrıca incelenmiştir.

98

Soya yağı derişiminin etkisi

Soya yağının %1 derişimine ek olarak %0.5 ve %1.5’lik derişimleri ortama eklenmiş ve

zamanla lipolitik aktivite, protein ve hücre derişimleri izlenmiştir.

En yüksek lipolitik aktiviteye %1 soya yağı içeren ortamda ulaşılmıştır (Şekil 4.6). %1

Soya yağı içeren ortamı sırasıyla %1.5 ve %0.5 soya yağı içeren ortamlar izlemektedir.

Soya yağının %0.5’lik derişimi lipolitik aktivite için yetersiz kalmakta; %1.5’luk

derişimi ise substrat inhibisyonu yaratmaktadır. Tüm derişimler için en yüksek

aktiviteler 40. saatte gözlenmiştir.

Mikroorganizmanın dışarı salgıladığı toplam protein miktarları karşılaştırıldığında en

yüksek protein derişimi %0.5 soya yağı içeren ortamda gözlenmiş, bunu %1.5 soya yağı

ve %1 soya yağı içeren ortamlar izlemiştir (Şekil 4.7).

En yüksek spesifik aktivite %1 soya yağı içeren ortamda gözlenmiştir (Şekil 4.8). %1

Soya yağı içeren ortamı, aktivitede olduğu gibi sırasıyla %1.5 ve %0.5 derişimdeki soya

yağlarını içeren ortamlar izlemektedir. En yüksek spesifik aktiviteler %1 ve %1.5’luk

derişimler için 40. saatte, %0.5’lik derişim için 48. saatte gözlenmiştir

Zamana karşı hücre derişimlerinden yararlanılarak her bir ortam için hücre çoğalma

eğrileri oluşturulmuştur (Şekil 4.9). %1.5 Soya yağı için mikroorganizmanın gecikme,

üstel çoğalma evresi ve durgunluk evresi olmak üzere üç çoğalma evresi de

görülebilmektedir. En fazla hücre çoğalması %1 soya içeren ortamda olmuştur.

99

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0 10 20 30 40 50 60 70 80

zaman, st

Lipo

litik

akt

ivite

, U/m

l

%0,5 Soya %1 Soya %1,5 Soya

Şekil 4.6 Soya yağının farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0 10 20 30 40 50 60 70 80

zaman, st

Prot

ein

deriş

imi,

mg/

ml


Şekil 4.7 Soya yağının farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

100

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0 10 20 30 40 50 60 70 80

zaman, st

Spes

ifik

lipaz

akt

ivite

si, U

/mg


Şekil 4.8 Soya yağının farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye (U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 10 20 30 40 50 60 70 80

zaman ,st

Hüc

re d

eriş

imi,

mg/

ml


Şekil 4.9 Soya yağının farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

101

Susam yağı (2) derişiminin etkisi

Kullanılan iki çeşit susam yağından biri olan ve susam yağı (2) olarak isimlendirilen

bitkisel yağın %1 derişiminin yanı sıra %0.5 ve %1.5’lik derişimlerinin de kullanıldığı

ortamlarda zamanla lipolitik aktivite, protein ve hücre derişiminin değişimi izlenmiştir.

En yüksek lipolitik aktivite %1 susam yağı (2) içeren ortamda gözlenmiştir (Şekil 4.10).

%1 Susam yağı (2) içeren ortamı %0.5 ve %1.5 susam yağı (2) içeren ortamlar

izlemektedir. Susam yağı (2)’nin %0.5’lik derişimi lipolitik aktivite için yetersiz

kalmakta, %1.5’luk derişimi ise inhibisyon etkisi yaratmaktadır. Tüm derişimler için en

yüksek aktiviteler 48. saatte gözlenmiştir.

Toplam protein miktarları karşılaştırıldığında en yüksek protein derişimi %0.5 susam

yağı (2) içeren ortamda gözlenmiş, bunu sırasıyla %1.5 ve %1 susam yağı (2) içeren

ortamlar izlemiştir (Şekil 4.11).

En yüksek spesifik aktivite %1 susam yağı (2) içeren ortamda gözlenmiştir (Şekil 4.12).

%1 Susam yağı (2) içeren ortamı sırasıyla %1.5 ve %0.5 derişimdeki susam yağı (2)

içeren ortamlar izlemektedir. En yüksek spesifik aktiviteler %1.5 derişim için 24. saatte,

%0.5 derişim için 40. saatte, %1 derişim için 56. saatte gözlenmiştir.


eğrileri oluşturulmuştur. En fazla hücre çoğalması %0.5 susam yağı (2) içeren ortamda

olmuştur (Şekil 4.13).

102

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0 10 20 30 40 50 60 70 80

zaman, st

Lipo

litik

akt

ivite

, U/m

l

%0,5 Susam (2) %1 Susam (2) %1,5 Susam (2)

Şekil 4.10 Susam yağı (2)’nin farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0 10 20 30 40 50 60 70 80

zaman, st

Prot

ein

deriş

imi,

mg/

ml


Şekil 4.11 Susam yağı (2)’nin farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

103

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Spes

ifik

lipaz

akt

ivite

si, U

/mg


Şekil 4.12 Susam yağı (2)’nin farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye (U/mg)

etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

0

1

2

3

4

5

6

0 10 20 30 40 50 60 70 80

zaman, st

Hüc

re d

eriş

imi,

mg/

ml


Şekil 4.13 Susam yağı (2) nin farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

104

Mısır yağı derişiminin etkisi

Mısır yağının %1 derişiminin yanı sıra %0.5 ve %1.5 olmak üzere farklı derişimleri de

denenmiş ve zamanla lipolitik aktivite, protein ve hücre derişimleri izlenmiştir.

Mısır yağı derişiminin lipolitik aktivite üzerine etkisi incelendiğinde, en yüksek

aktivitenin %1 mısır yağı içeren ortamda olduğu görülmüştür (Şekil 4.14). %1 Mısır

yağı içeren ortamı %0.5 ve %1.5 mısır yağı içeren ortamlar izlemektedir. %0.5 Mısır

yağı lipolitik aktivite için yetersiz kalmakta; %1.5’luk derişimi ise substrat inhibisyonu

yaratmaktadır. Tüm derişimler için maksimum aktiviteler 48. saatte gözlenmiştir.

Hücre dışına salgılanan protein miktarları karşılaştırıldığında en yüksek protein derişimi

%0.5 mısır yağı içeren ortamda gözlenmiş, bunu %1 mısır yağı ve %1.5 mısır yağı

içeren ortamlar izlemiştir (Şekil 4.15).

En yüksek spesifik aktivite %1 mısır yağı içeren ortamdadır (Şekil 4.16). %1 Mısır yağı

içeren ortamı, aktivitede olduğu gibi sırasıyla %0.5 ve %1.5 derişimdeki mısır yağı

içeren ortamlar izlemektedir. En yüksek spesifik aktiviteler %1 derişim için 40. saatte,

%0.5 ve %1.5 derişim için 48. saatte gözlenmiştir.

Hücre çoğalma eğrileri incelendiğinde, mikroorganizmanın en çok %0.5 mısır yağı

içeren ortamda çoğaldığı görülmüştür. Bunu sırasıyla %1 ve %1.5 derişimde mısır yağı

içeren ortamlar izlemektedir (Şekil 4.17).

105

0

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0.006

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Lipo

litik

akt

ivite

, U/m

l

%0,5 Mısır %1 Mısır %1,5 Mısır

Şekil 4.14 Mısır yağının farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Prot

ein

deriş

imi,

mg/

ml


Şekil 4.15 Mısır yağının farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

106

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Spes

ifik

lipaz

akt

ivite

si, U

/mg


Şekil 4.16 Mısır yağının farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye (U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 10 20 30 40 50 60 70 80

zaman, st

Hüc

re d

eriş

imi,

mg/

ml


Şekil 4.17 Mısır yağının farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

107

Bitkisel yağların karşılaştırılması

Lipolitik aktivite ve spesifik aktivite değerleri göz önünde bulundurulduğunda bitkisel

yağlar içerisinde en iyi karbon kaynağının %1 soya yağı olduğu görülmektedir. En

yüksek aktiviteye daha kısa sürede ulaşılması da bitkisel karbon kaynağı olarak soya

yağının tercih edilmesinde etkili olmuştur. %1 Soya yağını sırasıyla %1 ve %0.5 susam

yağı (2) izlemektedir. Şekil 4.18 ve 4.19’da çalışmada kullanılan farklı tür ve

derişimdeki bitkisel yağlar ile elde edilen en yüksek aktivite ve spesifik aktivite

değerleri karşılaştırmalı olarak verilmiştir. Bitkisel yağların lipolitik aktivite üzerine

farklı etkiler göstermesinin sebebinin yağın bileşimini oluşturan yağ asitleri olduğu

düşünülmüştür.

Mikroorganizmanın farklı bitkisel karbon kaynakları içeren ortamlar için hesaplanmış

olan özgül çoğalma hızları (µ) Çizelge 4.1’de verilmektedir. Buna göre

mikroorganizmanın en yüksek özgül çoğalma hızı %1.5 soya yağı içeren ortama aittir.

Mikroorganizma çoğalması açısından da bitkisel yağlar arasında soya yağının,

diğerlerine göre daha iyi sonuç verdiği görülmektedir.

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

%0,5 S

oya

%1 Soy

a

%1,5 S

oya

%0,5 Mısı

r

%1 Mısı

r

%1,5 Mısı

r

%1 Sus

am 1

%0,5 S

usam

2

%1 Sus

am 2

%1,5 S

usam

2

%1 Ayç

içek

%1 Zey

tin

%1 Kete

n

%1 Fındık

En y

ükse

k lip

oliti

k ak

tivite

ler,

U/m

l

Şekil 4.18 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki bitkisel yağlar ile elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml) pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

108

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

%0,5 S

oya

%1 Soy

a

%1,5 S

oya

%0,5 Mısı

r

%1 Mısı

r

%1,5 Mısı

r

%1 Sus

am

%0,5 S

usam

2

%1 Sus

am 2

%1,5 S

usam

2

%1 Ayç

içek

%1 Zey

tin

%1 Kete

n

%1 Fındık

En y

ükse

k sp

esifi

k lip

az a

ktiv

itele

ri, U

/mg

Şekil 4.19 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki bitkisel yağlar ile

elde edilen en yüksek spesifik aktiviteler (U/ml) pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü Çizelge 4.1 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki bitkisel yağları içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma hızları

Bitkisel Yağlar ve Derişimleri Özgül Çoğalma Hızları (µ), h -1

% 0.5 Soya yağı 0.0523

%1 Soya yağı 0.0506

%1.5 Soya yağı 0.0601

%0.5 Mısır yağı 0.0496

%1 Mısır yağı 0.0498

%1.5 Mısır yağı 0.0492

%0.5 Susam yağı (2) 0.0378

% 1 Susam yağı (2) 0.0386

%1.5 Susam yağı (2) 0.0385

109

4.2.1.2 Yağ asidi esterlerinin etkisi Bitkisel yağlar yapılarında başka bileşenler de içermelerine rağmen esasen gliserinin

yağ asitleri ile birleşmesi sonucunda oluşan trigliseritlerden yani yağ asidi esterlerinden

oluşurlar. Çalışmada Debaryomyces hansenii’den lipaz üretiminde yağ asidi esterlerinin

hücre dışı lipolitik aktivite ile protein ve hücre derişimlerine etkisini incelemek

amacıyla triasetin (C2:0), tribütirin (C4:0), trioktanoin (C8:0), tripalmitin (C16:0),

tristearin (C18:0) ve trioleinin (C18:1) %1 derişimleri kullanılmıştır. Daha sonra

kullanılan yağ asidi esterleri içerisinde lipolitik aktivite üzerinde en iyi sonuç alınan yağ

asidinin %0.5’lik derişimi denenmiştir. Kullanılan yağ asidi esterlerinin basit formülleri

Çizelge 4.2’de verilmektedir.

Çizelge 4.2 Kullanılan yağ asidi esterleri ve basit formülleri Basit Formül Yağ asidi karbon sayısı Yağ asidi esteri

C9H14O6 C2 Triasetin

C15H26O6 C4 Tribütirin

C27H50O6 C8 Trioktanoin

C51H98O6 C16 Tripalmitin

C57H110O6 C18:0 Tristearin

C57H104O6 C18:1 Triolein

Yağ asidi esterlerinin %1 derişimleri karşılaştırıldığında, en yüksek hücre dışı lipolitik

aktiviteye (0.0148 U/ml) 24. saatte %1 tristearin içeren ortamda ulaşıldığı

görülmektedir (Şekil 4.20). Bunu sırasıyla triolein (48. saat), tripalmitin (40. saat),

trioktanoin (40. saat), tribütirin (24. saat) ve triasetin (24. saat) izlemektedir. Lipaz

aktiviteleri zamanla önce bir atış, sonra azalma göstermiştir

En yüksek protein derişimi trioktanoin içeren ortamdadır. Zamana karşı protein eğrileri

de aktivitelerde olduğu gibi önce bir artış, sonra bir azalma göstermektedir (Şekil 4.21).

En yüksek spesifik aktivitelerin gözlendiği ortamlar sırasıyla tristearin (24. saat),

triolein (48. saat), tripalmitin (40. saat), trioktanoin (40. saat), tribütirin (24. saat) ve

110

triasetin (24. saat) içeren ortamlar olup en yüksek aktivitelerin gözlendiği ortamlarla

aynı sıralamayı göstermektedir (Şekil 4.22).

Yağ asidi esterlerinin %1 derişimini içeren ortamlardaki hücre çoğalma eğrileri

incelendiğinde ise en iyi çoğalmanın %1 trioktanoin ve %1 triolein içeren ortamlarda

gerçekleştiği görülmektedir. %1 Trioktanoin içeren ortamda mikroorganizma durgunluk

evresine daha kısa sürede ulaşmaktadır (Şekil 4.23).

00.0020.0040.0060.0080.01

0.0120.0140.016

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Lipo

litik

akt

ivite

, U/m

l

%1 triasetin %1 tribütirin %1 trioktanoin%1 tripalmitin %1 tristearin %1 triolein

Şekil 4.20 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

111

00.010.020.030.040.050.060.070.080.09

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Prot

ein

deriş

imi,

mg/

ml

%1 triasetin %1 tribütirin %1 trioktanoin%1 tripalmitin %1 tristearin %1 triolein

Şekil 4.21 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

Şekil 4.22 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin spesifik lipaz aktivitesine (U/mg)


0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Spes

ifik

lipaz

akt

ivite

si, U

/mg

%1 triasetin %1 tribütirin %1 trioktanoin

%1 tripalmitin %1 tristearin %1 triolein

112

0123456789

10

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Hücr

e de

rişi

mi,

mg/

ml

%1 triasetin %1 tribütirin %1 trioktanoin

%1 tripalmitin %1 tristearin %1 triolein

Şekil 4.23 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü Tristearin derişiminin etkisi

Gerek lipolitik aktivite, gerek spesifik aktivite açısından en iyi sonucu veren %1

tristearinin %0.5’lik derişiminin de karbon kaynağı olarak etkisi incelenmiştir. %1

Tristearin içeren ortamda hem daha yüksek aktivite elde edilmiş, hem de bu aktiviteye

daha kısa sürede (24. saat) ulaşılmıştır (Şekil 4.24). Protein derişimleri açısından ise

%0.5 tristearin içeren ortamdaki protein miktarı daha fazladır (Şekil 4.25). En yüksek

spesifik aktivite %1 tristearin içeren ortamda 24. saatte gözlenmiştir. %0.5 Tristearin

içeren ortamda ise en yüksek spesifik aktiviteye 40. saatte ulaşılmış olup değer olarak

%1 tristearin içeren ortamda ulaşılandan daha azdır (Şekil 4.26). Hücre çoğalmaları

bakımından karşılaştırma yapılırsa, %0.5 tristearin içeren ortamda mikroorganizma daha

fazla çoğalmıştır (Şekil 4.27).

113

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0.016

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Lipo

litik

akt

ivite

, U/m

l

%1 tristearin %0,5 tristearin

Şekil 4.24 Tristearinin farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

00.005

0.010.015

0.020.025

0.030.035

0.040.045

0.05

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Prot

ein

deriş

imi,

mg/

ml

%1 triasetin %0,5 tristearin

Şekil 4.25 Tristearinin farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

114

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Spes

ifik

lipaz

akt

ivite

si, U

/mg


Şekil 4.26 Tristearinin farklı derişimlerinin spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Hüc

re d

eriş

imi,

mg/

ml


Şekil 4.27 Tristearinin farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

115

Yağ asidi esterlerinin karşılaştırılması

Lipolitik aktivite ve spesifik aktivite değerleri göz önünde bulundurulduğunda yağ asidi

esterleri içerisinde en iyi karbon kaynağının %1 tristearin olduğu görülmektedir. En

yüksek aktiviteye kısa sürede (24. saat) ulaşılması da %1 tristearinin tercih edilmesinde

etkili olmuştur. Şekil 4.28 ve 4.29’da deneylerde kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ

asidi esterleri ile elde edilen en yüksek aktivite ve spesifik aktivite değerleri

karşılaştırmalı olarak verilmiştir. Mikroorganizmanın farklı yağ asidi esterleri içeren

ortamlar için hesaplanmış olan özgül çoğalma hızları (µ) ise Çizelge 4.3’te verilmektedir.

Buna göre mikroorganizmanın en yüksek özgül çoğalma hızı, maksimum protein

derişiminin de gözlendiği %1 trioktanoin içeren ortama aittir. Triasetin içeren ortamda

hücre çoğalması çok yavaş gerçekleşmiştir.

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0.016

%1 tria

setin

%1 trib

ütirin

%1 trio

ktano

in

%1 trip

almitin

%1 tris

tearin

%1 trio

lein

% 0,5 t

ristea

rin

En y

ükse

k li

polit

ik a

ktiv

itele

r, U

/ml

Şekil 4.28 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asidi esterleri

ile elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml) pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

116

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

%1 tria

setin

%1 trib

ütirin

%1 trio

ktano

in

%1 trip

almitin

%1 tris

tearin

%1 trio

lein

%0,5 tri

steari

n

En y

ükse

k sp

esifi

k lip

az a

ktiv

itele

ri, U

/mg

Şekil 4.29 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asidi esterleri ile elde edilen en yüksek spesifik lipaz aktiviteleri (U/mg) pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü Çizelge 4.3 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asidi esterlerini içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma hızları

4.2.1.3 Yağ asitlerinin etkisi

Yağları birbirinden farklı kılan, yapılarında bulunan yağ asitlerindeki çeşitliliktir. Doğal

yağlarda bulunan yağ asitleri genellikle 12-18 karbon atomlu düz zincirli karboksilik

Yağ Asidi Esteri ve Derişimi Özgül Çoğalma Hızı (µ), st -1

%1 Triasetin 0.0033

%1 Tribütirin 0.0486

%1 Trioktanoin 0.0537

%1 Tripalmitin 0.0416

%1 Tristearin 0.0315

%0.5 Tristearin 0.0487

%1 Triolein 0.0465

117

asitlerdir. Bir yağın içerdiği yağ asitlerinin uzunluğu ve doymamışlığı onun özelliklerini

belirler. Yağ asitlerinin doymamış olması yapısında çift bağların bulunması demektir.

Çalışmada Debaryomyces hansenii’den lipaz üretiminde bazı doymuş ve doymamış yağ

asitleri ile asetik asitin hücre dışı lipolitik aktivite, protein derişimi ve hücre derişimi

üzerine etkileri % 1 derişimleri için incelenmiştir. Daha sonra doymuş yağ asitlerinden

iyi sonuç veren iki çeşit yağ asidinin derişim etkisi incelenmiştir. Çizelge 4.4’te

deneylerde kullanılan yağ asitleri, içerdikleri karbon sayıları ve molekül formülleri

verilmiştir.

Çizelge 4.4 Kullanılan yağ asitleri, içerdikleri karbon sayıları ve molekül formülleri Yağ Asitleri Molekül Formülü Karbon Sayısı

Asetik asit CH3-COOH C2

Palmitik asit CH3-(CH2)14-COOH C16

Stearik asit CH3-(CH2)16-COOH C18

Oleik asit CH3-(CH2)7CH=CH-(CH2)7COOH C18:1

Linoleik asit CH3-(CH2)4CH=CH-CH2CH=CH(CH2)7-COOH C18:2

Yağ asitlerinin %1 derişimleri karşılaştırıldığında, en yüksek lipolitik aktivitenin

(0.0164 U/ml) %1 oleik asit içeren ortamda gözlendiği görülmektedir (Şekil 4.30).

Bunu sırasıyla palmitik asit, asetik asit, linoleik asit ve stearik asit izlemektedir. Lipaz

aktiviteleri tüm yağ asitleri için zamanla önce bir atış, sonra azalma göstermiştir. Asetik

asit dışındaki tüm asitleri içeren ortamlarda en yüksek aktiviteler 24. saatte

gözlenmiştir. Asetik asit içeren ortamda ise maksimum aktivite 40. saattedir.

En yüksek protein derişimi en yüksek aktivitenin gözlendiği %1 oleik asit içeren

ortamda, en az protein derişimi ise en az aktivitenin gözlendiği %1 stearik asit içeren

ortamda ölçülmüştür (Şekil 4.31). Protein derişimleri de aktivitelerde olduğu gibi

zamanla önce bir atış, sonra azalma göstermektedir.

En yüksek spesifik aktivitelerin gözlendiği ortamlar sırasıyla oleik asit, stearik asit,

asetik asit, palmitik asit ve linoleik asit içeren ortamlardır (Şekil 4.32). Stearik asit

118

haricinde tüm yağ asitleri en yüksek spesifik aktivitelerini 24. saatte göstermektedirler.

%1 Stearik asit içeren ortamda ise en yüksek lipolitik aktivite 40. saatte gözlenmiştir.

Yağ asitlerinin %1 derişimini içeren ortamlardaki hücre çoğalma eğrileri incelendiğinde

en iyi çoğalmanın %1 oleik asit ve %1 linoleik asit içeren ortamlarda gerçekleştiği

görülmektedir. %1 Palmitik asit ve stearik asit içeren ortamlar için hücre derişimleri

durgunluk evresine geçtiği zaman, %1 oleik, %1 linoleik ve %1 asetik asit içeren

ortamlarda mikroorganizma derişimleri azalmaya başlamıştır (Şekil 4.33).

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0.016

0.018

0 10 20 30 40 50 60

zaman, st

Lipo

litik

akt

ivite

, U/m

l

%1 Asetik asit %1 Palmitik asit %1 Stearik asit

% 1 Oleik asit %1 Linoleik asit

Şekil 4.30 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

119

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Prot

ein

deriş

im, m

g/m

l

%1 Asetik asit %1 Palmitik asit %1 Stearik asit% 1 Oleik asit %1 Linoleik asit

Şekil 4.31 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 10 20 30 40 50 60

zaman, st

Spes

ifik

lipaz

akt

ivite

s, U

/mg


Şekil 4.32 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

120

0

2

4

6

8

10

12

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Hüc

re d

eriş

imi,

mg/

ml


Şekil 4.33 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü Stearik asit ve palmitik asit derişimlerinin etkisi

Doymuş yağ asitleri olan stearik asit ve palmitik asitin %0.5 derişiminin etkisi ayrıca

incelenmiştir. %1 Palmitik asit içeren ortamda %0.5 palmitik asit içeren ortama göre

hem daha kısa sürede (24. saat) hem de daha yüksek değerde bir aktivite (0.0082 U/ml)

gözlenmiştir (Şekil 4.34). Stearik asitin ise %0.5 derişimini içeren ortamda %1 derişim

içeren ortama göre daha yüksek bir aktivite (0.0043 U/ml) gözlenmiştir; ancak en

yüksek aktiviteyi gösterme süresi %1 derişim için 24 saat, %0.5 derişim için ise 40

saattir. Aktivitelerde önce bir artış, sonra bir azalma vardır. Protein derişimleri

karşılaştırıldığında palmitik asit ve stearik asitin %0.5 derişimlerini içeren ortamlar, %1

derişimleri içeren ortamlara göre daha fazla protein içermektedirler (Şekil 4.35). Tüm

derişimler için protein miktarları önce artmakta, sonra azalmaktadır. En yüksek spesifik

aktiviteler hem palmitik asit, hem stearik asit için %1 derişimleri içeren ortamlarda

gözlenmiştir (Şekil 4.36). Hücre çoğalmaları bakımından karşılaştırma yapılırsa, %0.5

derişimde palmitik asit ve stearik asit içeren ortamlarda, %1 derişimlere göre

mikroorganizma daha fazla çoğalmıştır (Şekil 4.37).

121

0

0.001

0.0020.003

0.004

0.005

0.0060.007

0.008

0.009

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Lipo

litik

akt

ivite

, U/m

l

%1 Palmitik asit %1 Stearik asit% 0,5 Palmitik asit %0,5 Stearik asit

Şekil 4.34 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin lipaz aktivitesine (U/ml)


0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Prot

ein

deriş

imi,

mg/

ml

%1 Palmitik asit %1 Stearik asit %0,5 Palmitik %0,5 Stearik asit

Şekil 4.35 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

122

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Spes

ifik

lipaz

akt

ivite

leri,

U/m

g

%1 Palmitik asit %1 Stearik asit%0,5 Palmitik asit %0,5 Stearik asit

Şekil 4.36 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

0

1

2

3

4

5

6

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Hüc

re d

eriş

imi,

mg/

ml

%1 Palmitik asit %1 Stearik asit%0,5 Palmitik asit %0,5 Stearik asit

Şekil 4.37 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml)


123

Yağ asitlerinin karşılaştırılması

Lipolitik aktivite ve spesifik aktivite değerleri göz önünde bulundurulduğunda yağ

asitleri içerisinde en iyi karbon kaynağının %1 oleik asit olduğu görülmektedir. Şekil

4.38 ve 4.39’da deneylerde kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asitleri ile elde edilen

en yüksek aktivite ve spesifik aktivite değerleri karşılaştırmalı olarak verilmiştir.

Mikroorganizmanın farklı yağ asitleri içeren ortamlar için hesaplanmış olan özgül

çoğalma hızları ise Çizelge 4.5’de verilmektedir. Buna göre mikroorganizmanın en

yüksek özgül çoğalma hızı, maksimum aktivite ve maksimum spesifik aktivitenin de

gözlendiği %1 oleik asit içeren ortama aittir. En az aktivitenin gözlendiği %1 stearik asit

içeren ortamda hücre çoğalması da en az gerçekleşmiştir.

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0.016

0.018

%1 Ase

tik as

it

%1 Palm

itik as

it

%1 Stea

rik as

it

% 1 Olei

k asit

%1 Lino

leik a

sit

%0,5 P

almitik

asit

%0,5 S

tearik

asit

En y

ükse

k li

polit

ik a

ktiv

itele

r, U

/ml

Şekil 4.38 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asitleri ile

elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml) pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

124

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

%1 Ase

tik as

it

%1 Palm

itik

%1 Stea

rik

% 1 Olei

k

%1 Lino

leik

%0,5 Palm

itik

%0,5 Stea

rik

En y

ükse

k sp

esifi

k lip

az a

ktiv

itele

ri, U

/mg

Şekil 4.39 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asitleri ile

elde edilen en yüksek spesifik lipaz aktiviteleri (U/mg) pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü Çizelge 4.5 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asitlerini içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma hızları

4.2.1.4 Gliserolün etkisi Trigliseritleri parçalayarak yağ asidi ve gliserol oluşumunu sağlayan lipaz enziminin

üretildiği ortamda, Debaryomyces hansenii’nin gliserolü de karbon kaynağı olarak

kullanıp kullanmadığını araştırmak amacıyla gliserolün %1 derişimi denenmiştir.

Yağ Asiti ve Derişimi Özgül Çoğalma Hızı (µ), st -1

%1 Asetik asit 0.0341

%1 Palmitik asit 0.0382

%0.5 Palmitik asit 0.0440

%1 Stearik asit 0.0288

%0.5 Stearik asit 0.0417

%1 Oleik asit 0.0594

%1 Linoleik asit 0.0429

125

%1 Gliserol içeren ortamın, hücre dışı lipaz aktivitesi, protein derişimi ve spesifik lipaz

aktivitesine etkisi Şekil 4.40’ta yer almaktadır. Mikroorganizmanın gliserolü karbon

kaynağı olarak kullandığı ve %1 gliserol içeren ortamdaki en yüksek aktivite değerinin

(0.0058 U/ml), bitkisel yağlardan %1 susam yağı (1), yağ asitlerinden %1 asetik asit,

yağ asidi esterlerinden ise %1 trioktanoin içeren ortamlarda elde edilen en yüksek

aktivite değerlerine yakın bir değer olduğu belirlenmiştir. Aktivite değeri diğer karbon

kaynakları ile karşılaştırılabilecek seviyede iken, spesifik aktivite değeri %1 ayçiçek

yağı içeren ortama yakın bir değer olup, denenmiş tüm yağ asidi ve esterlerini içeren

ortamların yanında düşük kalmaktadır. Mikroorganizmanın hücre çoğalma eğrisi ise

Şekil 4.41’de verilmiştir. %1 Gliserol içeren ortamdaki özgül çoğalma hızı 0.0738 st -1

olarak hesaplanmıştır ki, bu değer denenen tüm bitkisel yağları, yağ asidi ve esterlerini

içeren ortamlardakinden yüksek bir değerdir.

00.010.020.030.040.050.060.070.080.09

0.1

0 10 20 30 40 50 60

zaman, st

Spes

ifik

lipaz

ak

tivite

si,U

/mg

pr

otei

n de

rişim

i, m

g/m

l

0

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0.006

0.007

Lipo

litik

akt

ivite

, U/m

l

Protein derişimi, mg/ml Spesifik lipaz aktivitesi, U/mgLipaz aktivitesi, U/ml

Şekil 4.40 %1 Gliserol içeren ortamın lipaz aktivitesi (U/ml), protein derişimi (mg/ml) ve spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

126

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 10 20 30 40 50 60

zaman, st

Hüc

re d

eriş

imi,

mg/

ml

Şekil 4.41 %1 Gliserol içeren ortamın hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü 4.2.1.5 Glukozun etkisi

Glukoz canlı mikroorganizmada glukoliz yolizinde enerji eldesinde ve hücre gelişimi

için gerekli primer metabolitlerin oluşumunda kullanılmaktadır. Çalışmada, metabolik

yolizlerinde kullanılan ve mikroorganizmanın çoğalmasında etkili olabileceği düşünülen

glukozun Debaryomyces hansenii’den lipaz üretiminde hem hücre çoğalmasına hem de

lipolitik aktiviteye etkisi incelenmiştir. Glukozun %1 derişiminin katı agar ve ön

çoğalma ortamına eklenmesi, mikroorganizma derişimini beş katına çıkarmıştır. Bunun

sonucu olarak TBA besi ortamına %1 glukoz eklenmesine karar verilmiştir. Lipaz

üretim ortamındaki lipolitik aktivite ve hücre derişimlerine karbon kaynağı olarak

glukoz etkisi ise %0, %0.25, %0.5 ve %1 olmak üzere dört farklı derişim için

incelenmiştir. En yüksek lipolitik aktivite (0.0149 U/ml) glukoz içermeyen ortamda elde

edilmiştir (Şekil 4.42). Bunu sırasıyla, %0.25, %0.5 ve %1 glukoz içeren ortamlar

izlemektedir. Glukozun hücre derişimlerine etkisi ise deney sonundaki (87. saat) hücre

derişimleri karşılaştırılarak değerlendirilmiştir (Şekil 4.43). Buna göre en yüksek hücre

derişimi %0.25 glukoz içeren ortamda gözlenmiş olup, bunu %0, %0.5 ve %1 derişimde

glukoz içeren ortamlar izlemektedir.

127

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0.016

0 20 40 60 80 100

zaman st

Lipo

litik

akt

ivite

, U/m

l

%0 glukoz %0.25 glukoz %0.5 glukoz %1 glukoz

Şekil 4.42 Glukozun farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

0123456789

10

%0 glukoz %0,25 glukoz %0,50 glukoz %1 glukoz87. s

aatte

ki h

ücre

der

işim

leri,

mg/

ml

Şekil 4.43 Glukozun farklı derişimlerinin deney sonunda (87. saat) hücre derişimine etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü 4.2.1.6 Peyniraltı suyu etkisi

Süt mamulleri üretim tesisi yağlı atığından izole edilen Debaryomyces hansenii’den

lipaz üretiminde karbon kaynağı olarak peyniraltı suyunun lipolitik aktiviteye etkisini

128

araştırmak amacıyla, enzim üretim ortamına peyniraltı suyunun %1 derişimi

konulmuştur.

Şekil 4.44’de karbon kaynağı olarak kullanılan %1 peyniraltı suyunun hücre dışı

lipolitik aktivite, protein derişimi ve spesifik aktiviteye etkileri yer almaktadır.

Sonuçlar, %1 peyniraltı suyu içeren ortamda gözlenen en yüksek aktivite değerinin

(0.0120 U/ml), bitkisel karbon kaynakları içerisinde en iyi sonuç veren %1 soya yağı

içeren ortamda gözlenen en yüksek aktivite değeri kadar (0.0128 U/ml) yüksek bir

değer olduğunu göstermektedir. Peyniraltı suyu gibi doğal bir karbon kaynağı olan %1

soya yağı içeren ortamda da, %1 peyniraltı suyu içeren ortamda da en yüksek aktivite

değerine 40. saatte ulaşılmaktadır. Spesifik aktivite açısından ise %1 peyniraltı suyu

içeren ortam ile ulaşılan en yüksek spesifik aktivitenin (0.2853 U/mg), %1 soya yağı

içeren ortamdakine göre (0.3591 U/mg) az olduğu görülmektedir. %1 Peyniraltı suyu

içeren ortamdaki protein derişimi zamanla önce bir artış göstermekte, sonra azalmakta

olup bu ortamda gözlenen en yüksek protein derişimi %1 soya yağı içeren ortamdakine

göre daha fazladır. Peyniraltı suyunun hücre çoğalmasına etkisi Şekil 4.4’de

gösterilmiştir. Mikroorganizmanın %1 peyniraltı suyu karbon kaynağı olarak

kullanıldığı zaman hesaplanan özgül çoğalma hızı 0.0473 st-1 olup, diğer karbon

kaynakları ile karşılaştırıldığında ortalama bir değerdir.

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0 10 20 30 40 50 60

zaman, st

Lipo

litik

akt

ivite

, U/m

l Pr

otei

n de

rişim

i, m

g/m

l

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Spes

ifik

lipaz

akt

ivite

si,

U/m

g

Lipaz aktivitesi, U/ml Protein derişimi, mg/ml Spesifik aktivite, U/mg

Şekil 4.44 %1 Peyniraltı suyu içeren ortamın lipaz aktivitesi (U/ml), protein derişimi (mg/ml) ve spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi

pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

129

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 10 20 30 40 50 60

zaman, st

Hüc

re d

eriş

imi,

mg/

ml

Şekil 4.45 %1 Peyniraltı suyu içeren ortamın hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü 4.2.1.7 Triton X-100 etkisi

Çalışmanın amaçlarından biri, doğadan izole edilmiş Debaryomyces hansenii’den

üretilen lipazın deterjan katkısı olarak kullanım potansiyelini araştırmak olduğu için

karbon kaynağı olarak non-iyonik bir surfaktan olan Triton X-100’ün etkisi de

incelenmiştir. Triton X-100’ün lipaz üretimine etkisini incelemek için ortama Triton X-

100’ün %1 derişimi, indükleyici olarak etkisini incelemek için ise ortama karbon

kaynağı olarak en iyi sonuç veren soya yağının %1 derişimi ile birlikte %0.5 Triton X-

100 kullanılmıştır.

%1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton X-100 içeren ortamların hücre dışı

lipolitik aktiviteye etkisi Şekil 4.46’da gösterilmiştir. Sonuçlar incelendiğinde %1

Triton X-100 içeren ortamda elde edilen en yüksek değer (0.0212 U/ml), denenmiş

karbon kaynakları içerisinde en yüksek aktivite değeri olduğu görülmektedir. %1 Soya

yağı + %0.5 Triton X-100 içeren ortamda ise %1 soya yağı içeren ortama göre düşük bir

aktivite (0.0081 U/ml) gözlenmiştir. %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton

X-100 içeren ortamların her ikisinde de en yüksek aktivitelere 48 saat sonra ulaşılmıştır.

130

Her iki ortamda da aktiviteler önce bir artış, sonra bir azalma göstermektedir. Protein

derişimleri her iki ortamda da oldukça yüksektir (Şekil 4.47). Protein derişimleri yüksek

olduğu için diğer karbon kaynakları ile ulaşılan spesifik lipaz aktiviteleri ile

karşılaştırıldığında her iki ortamda da düşük değerler gözlenmektedir. Özellikle %1

Triton X-100 içeren ortamda çok yüksek bir lipolitik aktivite değeri gözlemesine

rağmen, denenmiş karbon kaynakları içerisinde en düşük spesifik lipaz aktivitesine

sahip ortam %1 Triton X-100 içeren ortamdır. %1 Soya yağı ile birlikte %0.5 Triton X-

100 içeren ortam için en yüksek spesifik lipaz aktivitesi değeri, %1 soya yağı içeren

ortam için bulunan değerin yaklaşık yarısıdır. Şekil 4.48’de ortamların, spesifik lipaz

aktivitesine etkisi görülmektedir. Mikroorganizma çoğalmasına ortamların etkisi

incelendiğinde, %1 soya yağı ile birlikte %0.5 Triton X-100 içeren ortamda hesaplanan

özgül çoğalma hızının 0.0833 st-1 değeri ile denenmiş karbon kaynakları içerisinde

bulunan en yüksek değer olduğu görülmektedir. %1 Triton X-100 içeren ortam için

hesaplanan 0.0566 st-1 değeri de diğer karbon kaynakları ile karşılaştırıldığında yüksek

bir değerdir. Karbon kaynağı olarak %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı ile %0.5 Triton

X-100 içeren ortamlarda elde edilen hücre çoğalma eğrileri Şekil 4.49’da verilmiştir.

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0 10 20 30 40 50 60 70 80

zaman, st

Lipo

litik

akt

ivite

ler,

U/m

l

%1 Soya yağı+%0.5 Triton-X-100 %1 Triton-X-100

Şekil 4.46 %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton X-100 içeren ortamların lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

131

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

1

0 10 20 30 40 50 60 70 80

zaman, st

Prot

ein

deriş

imi,m

g/m

l


Şekil 4.47 %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton X-100 içeren ortamların

protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

00.020.040.060.080.1

0.120.140.160.180.2

0 10 20 30 40 50 60 70 80

zaman, st

Spes

ifik

lipaz

akt

ivite

si, U

/mg

%1 Soya yağı+%0.5 Triton-X-100 %1 Triton X-100


spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

132

0

2

4

6

8

10

12

14

0 10 20 30 40 50 60 70 80

zaman, st

Hüc

re d

eriş

imi,m

g/m

l



hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü 4.2.2 Azot kaynaklarının etkisi

Lipaz üretiminde önemli parametrelerden biri de ortamdaki azot kaynaklarıdır. Azot

kaynaklarının Debaryomyces hansenii’den lipaz üretimine etkisini incelemek amacıyla

farklı tür ve derişimlerdeki organik veya inorganik azot kaynakları tek başına veya

gruplar halinde denenmiştir. Bu amaçla seçilen azot kaynakları ve derişimleri; %0.5

pepton + %0.3 maya özütü, %1 pepton + %0.3 maya özütü, %0.5 pepton, %0.3 maya

özütü, %1 üre, %0.5 pepton + %0.5 malt özütü, %0.5 pepton + %0.5 arjinin, %0.5

pepton + %0.5 lizin, %0.5 maya özütü, %1 maya özütü, %1 soya unu, %1 mısır unu,

%1 buğday unu, %5 pepton, %5 üre, %5 amonyum sülfat, %0.25 soya unu, % 0.5 soya

unu, %1.5 soya unu şeklindedir. Azot kaynaklarının lipolitik aktiviteye etkisinin

incelendiği tüm deneyler, pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm koşullarında, karbon kaynağı

olarak lipolitik aktivite açısından bitkisel yağlar arasında en iyi sonucu veren %1 soya

yağı kullanılarak 250 ml’lik erlenlerdeki 100 ml’lik üretim ortamlarında


koşullarda 2’şer ml örnek alınmıştır. Alınan örnekler, spektrofotometrik olarak lipolitik

aktivite ile protein ve hücre derişimlerinin belirlenmesi için analizlenmiştir.

133

Sonuçlar incelendiğinde, en yüksek lipaz aktivitesine (0.0124 U/ml) 24. saatte azot

kaynağı olarak %1 soya unu içeren ortamda ulaşıldığı görülmektedir (Şekil 4.50). %1

Soya unu içeren ortamdaki lipaz aktivitesini sırasıyla, %0.5 maya özütü (24. saat), %5

pepton (24. saat), %0.5 pepton + %0.3 maya özütü (40.saat) %0.3 maya özütü (24.

saat), %0.5 pepton ve %0.5 malt özütü (24. saat), %0.5 soya unu (24. saat), %5 üre (24.

saat), %1 üre (40. saat), %1 maya özütü (24. saat), %1.5 soya unu (24. saat), %0.25

soya unu (24. saat), %0.5 pepton (48. saat), %0.5 pepton ve %0.5 lizin (48. saat), %0.5

pepton ve %0.5 arjinin (40. saat), %5 amonyum sülfat (24. saat) içeren ortamlardaki

lipaz aktiviteleri izlemektedir. %1 Mısır unu ile %1 buğday unu içeren ortamlarda

aktivite gözlenmemiştir. Aktivitelerde zamanla önce bir artış, sonra bir azalma

görülmektedir.

Protein derişimleri karşılaştırıldığında, mikroorganizmanın hücre dışına en fazla protein

salgıladığı azot kaynağının %1 maya özütü olduğu görülmektedir. En düşük protein

derişimi ise azot kaynağı olarak %0.25 soya unu kullanıldığında gözlenmiştir (Şekil

4.51).

Spesifik lipaz aktiviteleri karşılaştırıldığında, en yüksek spesifik lipaz aktivitesinin lipaz

aktivitelerinde olduğu gibi %1 soya unu içeren ortamda olduğu görülür (Şekil 4.53). %1

Soya unu içeren ortamı sırasıyla %0.5 ve %0.3 maya özütü ile %5 üre içeren ortamlar

izlemektedir (Şekil 4.52). Azot kaynağının mikroorganizma derişimine etkisi

incelendiğinde, en fazla çoğalmanın %1.5 soya unu içeren ortamda, en az çoğalmanın

ise %5 üre içeren ortamda olduğu görülmektedir.

134

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Lipo

litik

akt

ivite

, U/m

l

%0,5 pepton+ %0,3 maya özütü %1 pepton+ %0,3 maya özütü%0,5 pepton %0,3 maya özütü%1 üre %0,5 pepton+ %0,5 malt özütü%0,5 pepton+%0,5 arjinin %0,5 pepton+%0,5 lizin%0,5 maya özütü %1 maya özütü%1 soya unu %1 buğday unu%1 mısır unu %5 üre%5 amonyum sülfat %0,25 soya unu%0,5 soya unu %1,5 soya unu%5 pepton

Şekil 4.50 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı

135

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0 10 20 30 40 50 60 70zaman, st

Prot

ein

deriş

imi,

mg/

ml

%0,5 pepton+ %0,3 maya özütü %1 pepton+ %0,3 maya özütü%0,5 pepton %0,3 maya özütü%1 üre %0,5 pepton+ %0,5 malt özütü%0,5 pepton+%0,5 arjinin %0,5 pepton+%0,5 lizin%0,5 maya özütü %1 maya özütü%1 soya unu %1 buğday unu%1 mısır unu %5 pepton%5 üre %5 amonyum sülfat%0,25 soya unu %0,5 soya unu%1,5 soya unu

Şekil 4.51 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı

136

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Spes

ifik

lipaz

akt

ivite

si, U

/mg


Şekil 4.52 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının spesifik lipaz aktivitesine

(U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı

137

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 10 20 30 40 50 60 70zaman, st

Hüc

re d

eriş

imi,

mg/

ml


Şekil 4.53 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı Azot kaynaklarının karşılaştırılması

Lipolitik aktivite ve spesifik aktivite değerleri göz önünde bulundurulduğunda en iyi azot

kaynağının %1 soya unu olduğu görülmektedir. En yüksek aktiviteye kısa sürede (24.

saat) ulaşılması da %1 soya ununun tercih edilmesinde etkili olmuştur. Şekil 4.54 ve

4.55’te deneylerde kullanılan farklı tür ve derişimdeki azot kaynakları ile elde edilen en

yüksek aktivite ve spesifik aktivite değerleri karşılaştırmalı olarak verilmiştir.

Mikroorganizmanın farklı azot kaynakları içeren ortamlar için hesaplanmış olan özgül

çoğalma hızları (µ) ise Çizelge 4.6’da verilmektedir. Buna göre mikroorganizmanın en

138

yüksek özgül çoğalma hızı %1.5 soya unu içeren ortamda, en düşük özgül çoğalma hızı

ise %5 üre içeren ortamda gözlenmiştir.

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

%0,5 pe

pton+

%0,3

may

a özü

tü

%1 pep

ton+ %

0,3 m

aya ö

zütü

%0,5 pe

pton

%0,3 m

aya ö

zütü

%1 üre

%0,5 pe

pton+

%0,5

malt

özütü

%0,5 pe

pton+

%0,5 ar

jinin

%0,5 pe

pton+

%0,5 liz

in

%0,5 m

aya ö

zütü

%1 may

a özü

tü

%1 soy

a unu

%5 pep

ton

%5 üre

%5 amon

yum sü

lfat

%0,25 s

oya u

nu

%0,5 so

ya un

u

%1,5 so

ya un

u

%1 buğ

day u

nu

%1 mısı

r unu

En y

ükse

k lip

oliti

k ak

tivite

ler,

U/m

l

Şekil 4.54 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynakları ile elde edilen en yüksek lipolitik

aktiviteler (U/ml) pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

139

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

%0,5 pe

pton+

%0,3

may

a özü

tü

%1 pep

ton+ %

0,3 m

aya ö

zütü

%0,5 pe

pton

%0,3 m

aya ö

zütü

%1 üre

%0,5 pe

pton+

%0,5

malt

özütü

%0,5 pe

pton+

%0,5 ar

jinin

%0,5 pe

pton+

%0,5 liz

in

%0,5 m

aya ö

zütü

%1 may

a özü

tü

%1 soy

a unu

%5 pep

ton

%5 üre

%5 amon

yum sü

lfat

%0,25 s

oya u

nu

%0,5 so

ya un

u

%1,5 so

ya un

u

%1 buğ

day u

nu

%1 mısı

r unu

En y

ükse

k sp

esifi

k lip

az a

ktiv

itele

ri, U

/mg

Şekil 4.55 Farklı tür ve derişimdeki yağ asitleri ile elde edilen en yüksek spesifik lipaz

aktiviteleri (U/mg) pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü

140

Çizelge 4.6 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarını içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma hızları Azot Kaynağı ve Derişimi Özgül Çoğalma Hızı (µ), st -1

%0.25 Soya unu 0.0912

%0.5 Soya unu 0.0949

%1 Soya unu 0.1326

%1.5 Soya unu 0.1342

%1 Buğday unu 0.1134

%1 Mısır unu 0.0925

%5 Pepton 0.0836

%1 Pepton ve %0.3 Maya özütü 0.0484

%0.5 Pepton ve %0.3 Maya özütü 0.0403

%5 Amonyum sülfat 0.0266

%0.3 Maya özütü 0.0262

%0.5 Maya özütü 0.0250

%1 Maya özütü 0.0227

%0.5 Pepton + %0.5 Malt özütü 0.0206

%0.5 Pepton + %0.5 Arjinin 0.0189

%1 Üre 0.0118

%0.5 Pepton 0.0099

%0.5 Pepton + %0.5 Lizin 0.0073

%5 Üre 0.0067

4.2.3 pH etkisi

Enzimatik tepkimelerin hızı, hidrojen iyonu derişimine göre farklılık göstermektedir.

Enzimin en fazla aktivite gösterdiği pH değeri, optimum pH’ıdır. pH’ı optimum değerde

sabit tutmak veya en azından elverişli durumda tutmak amacıyla tampon çözeltiler

kullanılır. Optimum pH; kullanılan tamponun cinsi, substratın yapısı ve enzimin elde

edildiği kaynakla ilişkilidir. Çalışmada, Debaryomyces hansenii’den lipaz üretiminde

pH’ın lipolitik aktiviteye etkisi incelenirken; pH= 3.5, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 ve 7.5

141

değerlerindeki sitrik asit monohidrat ve disodyum hidrojen fosfat ile hazırlanan tampon

çözeltileri kullanılmıştır. Tüm deneyler, T=30oC, N=150 rpm çalkalama hızında,

lipolitik aktivite açısından doğal karbon kaynaklarından bitkisel yağlar arasında en iyi

sonucu veren %1 soya yağı kullanılarak, azot kaynağı olarak ise en iyi sonucu veren %1

soya unu kullanılarak 250 ml’lik erlenlerdeki 100 ml’lik üretim ortamlarında


koşullarda 2’şer ml örnek alınmıştır. Alınan örnekler, spektrofotometrik olarak lipolitik

aktivite tayini, protein ve hücre derişimlerinin belirlenmesi için analizlenmiştir.

Sonuçlar incelendiğinde, en yüksek lipaz aktivitesine (0.0284 U/ml) 64. saatte pH=6.5

ortamında ulaşıldığı görülmektedir (Şekil 4.56). pH=6.5 ortamındaki lipaz aktivitesini

sırasıyla, pH= 7.0 (88. saat), pH=6.0 (72. saat) ve pH=7.5 (88. saat) ortamlarındaki

lipaz aktiviteleri izlemektedir. Aktivitelerde genel olarak önce bir artış, sonra bir azalma

görülmektedir; aktivitelerdeki azalma düşük pH’larda daha belirgindir.


salgıladığı ortam pH değerinin 7.0 olduğu görülmektedir. En düşük protein derişiminin

ise pH=3.5’ta olduğu gözlenmiştir (Şekil 4.57). Spesifik lipaz aktiviteleri

karşılaştırıldığında ise en yüksek spesifik lipaz aktivitesinin protein derişimlerine bağlı

olarak pH=3.5 ortamında olduğu görülür. pH=3.5 ortamını sırasıyla pH=4.5 ve pH=4.0

ortamları izlemektedir (Şekil 4.58).

Ortam pH’ının mikroorganizma derişimine etkisi incelendiğinde, en fazla çoğalmanın

pH=5.5 ortamında, en az çoğalmanın ise pH=3.5 ortamında olduğu görülmektedir (Şekil

4.59).

142

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

zaman, st

Lipo

litik

akt

ivite

ler ,

U/m

l

pH=3,5 pH=4 pH=4,5 pH=5 pH=5,5pH=6 pH=6,5 pH=7 pH=7,5

Şekil 4.56 Farklı ortam pH’larının lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0 20 40 60 80 100

zaman, st

Prot

ein

deriş

imi,

mg/

ml


Şekil 4.57 Farklı ortam pH’larının protein derişimine (mg/ml) etkisi T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

143

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0 20 40 60 80 100

zaman, st

Spes

ifik

lipaz

akt

ivite

si, U

/mg


Şekil 4.58 Farklı ortam pH’larının spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

zaman, st

Hüc

re d

eriş

imi,

mg/

ml

pH=3,5

Şekil 4.59 Farklı ortam pH’larının hücre derişimine (mg/ml) etkisi T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

144

Ortam pH’larının karşılaştırılması

Lipolitik aktivite değerleri göz önünde bulundurulduğunda optimum ortam pH’ının

pH=6.5 olduğu görülmektedir. Yüksek aktivitelerin gözlendiği yüksek ortam pH’ları

arasında en yüksek aktiviteye kısa sürede (64. saat) ulaşılması da pH=6.5’un tercih

edilmesinde etkili olmuştur. Şekil 4.60 ve 4.61’de farklı ortam pH’larında aktivite ve

spesifik aktivite değerleri karşılaştırmalı olarak verilmiştir. Mikroorganizmanın farklı

pH’lardaki ortamlarda hesaplanmış olan özgül çoğalma hızları (µ) ise Çizelge 4.7’de

verilmektedir. Buna göre mikroorganizmanın en yüksek özgül çoğalma hızı pH=5.0

ortamında, en düşük özgül çoğalma hızı ise pH=3.5 ortamında gözlenmiştir.

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

pH=3,5 pH=4 pH=4,5 pH=5 pH=5,5 pH=6 pH=6,5 pH=7 pH=7,5

En y

ükse

k lip

oliti

k ak

tivite

ler,

U/m

l

Şekil 4.60 Farklı ortam pH’ları ile elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml) T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

145

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

pH=3,5 pH=4 pH=4,5 pH=5 pH=5,5 pH=6 pH=6,5 pH=7 pH=7,5En y

ükse

k sp

esifi

k lip

az a

ktiv

itele

ri, U

/mg

Şekil 4.61 Farklı ortam pH’ları ile elde edilen en yüksek spesifik lipaz aktiviteleri

(U/mg) T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

Çizelge 4.7 Farklı ortam pH’larında hesaplanan özgül çoğalma hızları

Ortamın başlangıç pH’ı Özgül Çoğalma Hızı (µ), st -1

3.5 0.0616

4.0 0.0692

4.5 0.1017

5.0 0.1035

5.5 0.0920

6.0 0.0840

6.5 0.0774

7.0 0.0772

7.5 0.0769

4.2.4 Sıcaklık etkisi

Sıcaklığın Debaryomyces hansenii’den lipaz üretiminde lipolitik enzim aktivitesine

etkisinin incelendiği çalışmalarda, T=25oC, 30oC, 35 oC ve 40oC olmak üzere dört farklı

146

sıcaklık denenmiştir. Tüm deneyler, optimum pH olarak belirlenen pH=6.5 başlangıç

değerinde, T=30oC, N=150 rpm çalkalama hızında, lipolitik aktivite açısından doğal

karbon kaynaklarından bitkisel yağlar arasında en iyi sonucu veren %1 soya yağı

kullanılarak, azot kaynağı olarak ise en iyi sonucu veren %1 soya unu kullanılarak 250

ml’lik erlenlerdeki 100 ml’lik üretim ortamlarında gerçekleştirilmiştir. Deneylerde

üretim ortamlarından belirli zaman aralıklarıyla steril koşullarda 2’şer ml örnek

alınmıştır. Alınan örnekler, spektrofotometrik olarak lipolitik aktivite tayini, protein ve

hücre derişimlerinin belirlenmesi için analizlenmiştir.

Sonuçlar incelendiğinde, en yüksek lipaz aktivitesine (0.0284 U/ml) 64. saatte

T=30oC’ta ulaşıldığı görülmektedir (Şekil 4.62). T=30oC’taki lipaz aktivitesini sırasıyla,

T=25oC (64. saat), T=35oC (40. saat) ve T=40oC’taki (24. saat) lipaz aktiviteleri

izlemektedir. Aktivitelerde zamanla önce bir artış, sonra bir azalma görülmektedir


salgıladığı sıcaklığın T=30oC olduğu görülmektedir. En düşük protein derişiminin ise

T=40oC’ta olduğu gözlenmiştir (Şekil 4.63).

Spesifik lipaz aktiviteleri karşılaştırıldığında ise en yüksek spesifik lipaz aktivitesinin

protein derişimlerine bağlı olarak T=40oC’ta olduğu görülür. Bunu sırasıyla T=35, 30 ve

25oC izlemektedir (Şekil 4.64). Ortam sıcaklığının mikroorganizma derişimine etkisi

incelendiğinde, lipolitik aktivite ve protein derişimlerinde olduğu gibi en fazla

çoğalmanın T=30oC’ta, en az çoğalmanın ise T=40oC’ta olduğu görülmektedir (Şekil

4.65).

147

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0 20 40 60 80 100

zaman, st

Lipo

litik

akt

ivite

, U/m

l

T=25 T=30 T=35 T=40

Şekil 4.62 Farklı sıcaklıkların lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=6.5, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 20 40 60 80 100

zaman, st

Pro

tein

der

işim

i, m

g/m

l

T=25 T=30 T=35 T=40

Şekil 4.63 Farklı sıcaklıkların protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=6.5, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

148

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 20 40 60 80 100

zaman, st

Spe

sifik

lipa

z ak

tivite

si, U

/mg

T=25 T=30 T=35 T=40

Şekil 4.64 Farklı sıcaklıkların spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi pH=6.5, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

0

5

10

15

20

25

30

0 20 40 60 80 100

zaman, st

Hüc

re d

eriş

imi,

mg/

ml

T=25 T=30 T=35 T=40

Şekil 4.65 Farklı sıcaklıkların hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=6.5, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

149

Ortam sıcaklıklarının karşılaştırılması

Lipolitik aktivite değerleri göz önünde bulundurulduğunda optimum ortam sıcaklığının

T=30oC olduğu görülmektedir. Bu sıcaklıkta üretilen lipazın aktivitesini daha uzun süre

koruyabilmesi de T=30oC’ın tercih edilmesinde etkili olmuştur. Şekil 4.66 ve 4.67’de

farklı ortam sıcaklıklarında aktivite ve spesifik aktivite değerleri karşılaştırmalı olarak

verilmiştir. Mikroorganizmanın farklı sıcaklıklarda hesaplanmış olan özgül çoğalma

hızları (µ) ise Çizelge 4.8’de verilmektedir. Buna göre mikroorganizmanın en yüksek

özgül çoğalma hızı T=30oC’ta, en düşük özgül çoğalma hızı ise T=40oC’ta gözlenmiştir.

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

T=25 T=30 T=35 T=40

En

yüks

ek li

polit

ik a

ktiv

itele

r, U

/ml

Şekil 4.66 Farklı ortam sıcaklıkları ile elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml) pH=6.5, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

150

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

T=25 T=30 T=35 T=40

En y

ükse

k sp

esifi

k lip

az a

ktiv

itele

ri,

U/m

g

Şekil 4.67 Farklı ortam sıcaklıkları ile elde edilen en yüksek spesifik lipaz

aktiviteleri (U/mg) pH=6.5, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

Çizelge 4.8 Farklı ortam sıcaklıklarında hesaplanan özgül çoğalma hızları

Ortam sıcaklığı, oC Özgül Çoğalma Hızı (µ), st -1

25 0.0769

30 0.0774

35 0.0663

40 0.0486

4.2.5 Metal iyonları etkisi

Enzimlerin katalitik etkileri, enzime bağlı ya da serbest olarak bulunan bazı metal

iyonları tarafından artırılmakta veya azaltılmaktadır. Bazı metal iyonları enzimlerin

protein kısmını aktif durumdan inaktif duruma getirirken, bazıları proteinleri denatüre

etme özelikleri ile enzimler üzerinde inhibitör etkisi yaratabilmektedir. Çalışmada,

Debaryomyces hansenii’den lipaz üretiminde iyonların enzim aktivitesi ve hücre

çoğalmasına etkisini incelemek amacıyla, +1 ve +2 değerlikli katyonların (monovalent

ve divalent iyonlar) klor ve sülfat tuzları kullanılmıştır. Bu amaçla NaCl, LiCl, KCl,

151

MgCl2, CaCl2, ZnCl2, Na2SO4, K2SO4, MgSO4’ün 1 mM derişimleri denenmiştir. Bu

değer belirlenirken literatürdeki çalışmalar incelenmiş ve metal tuzlarının genellikle 1

mM ve 10 mM derişimlerinin kullanıldığı görülmüştür. Ağır metal iyonlarının enzimi

genellikle inhibe ettiği bilindiği için Fe+2, Fe+3, Hg+2,Cu+2, Ag+1 gibi iyonların etkisi

incelenmemiştir. Metal tuzları seçilirken, aktivite üzerine sadece katyon değil anyon

etkisinin de incelenmesi amacıyla aynı katyonun farklı anyonlarla oluşturduğu bileşikler

seçilmiştir. Tüm deneyler, optimum pH olarak belirlenen pH=6.5 başlangıç pH’ında,

T=30oC, N=150 rpm çalkalama hızında, lipolitik aktivite açısından doğal karbon

kaynaklarından bitkisel yağlar arasında en iyi sonucu veren %1 soya yağı kullanılarak,

azot kaynağı olarak ise en iyi sonucu veren %1 soya unu kullanılarak 250 ml’lik

erlenlerdeki 100 ml’lik üretim ortamlarında gerçekleştirilmiştir. Deneylerde üretim

ortamlarından, 48. saatte steril koşullarda 2’şer ml örnek alınarak spektrofotometrik

olarak lipolitik aktivite tayini ve hücre derişimlerinin belirlenmesi için analizlenmiştir.

48. saatte örnek alınmasının nedeni, sıcaklık deneyleriyle birlikte metal tuzları dışında

en iyi tüm koşulların belirlendiği deneylerde en yüksek aktivitenin gözlendiği 64. saat

ile 48. saatteki aktivite değerlerinin birbirine çok yakın olup 48. saatin metal tuzlarının

etkisini gözleyebilmek için uygun bir saat oluşudur.

Sonuçlar incelendiğinde, en yüksek lipaz aktivitesine (0.0437 U/ml) KCl içeren ortamda

ulaşıldığı görülmektedir (Şekil 4.68). Kontrol amacıyla bu gruba eklenen iyon

içermeyen ortamdaki aktiviteyle karşılaştırıldığında bazı metal tuzlarının aktiviteyi

artırdığı, bazılarının ise azalttığı görülmektedir. Metal tuzlarından sırasıyla; KCl >

K2SO4 > MgCl2 > Na2SO4 lipolitik aktiviteyi artırırken, NaCl > ZnCl2 > MgSO4 > LiCl

> CaCl2 lipolitik aktiviteyi azaltmaktadır.

Metal tuzlarının mikroorganizma derişimine etkisi incelendiğinde, en fazla çoğalmanın

MgCl2, en az çoğalmanın ise en yüksek aktivitenin gözlendiği KCl içeren ortamda

olduğu görülmektedir (Şekil 4.69). Lipolitik aktivitede olduğu gibi bazı metal tuzları

hücre derişimini artırırken, bazıları hücre derişimini azaltmaktadır. MgCl2 ve ZnCl2

dışındaki tüm metal tuzları hücre derişimini azaltıcı etki göstermiştir.

152

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

0.04

0.045

0.05

iyons

uzNaC

lKCl

LiCl

ZnCl2

MgCl2

CaCl2

Na2SO4

K2SO4

MgSO4

Lipo

litik

akt

ivite

ler,

U/m

l

Şekil 4.68 Farklı metal tuzlarının 1 mM’lık derişimlerini içeren ortamların 48. saatteki lipaz aktiviteleri (U/ml) pH=6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

18.5

19

19.5

20

20.5

21

21.5

22

22.5

23

iyons

uzNaC

lKCl

LiCl

ZnCl2

MgCl2

CaCl2

Na2SO4

K2SO4

MgSO4

Hüc

re d

eriş

imle

r, m

g/m

l

Şekil 4.69 Farklı metal tuzlarının 1 mM derişimlerini içeren ortamların 48. saatteki hücre derişimleri (mg/ml) pH=6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya

unu

Metal tuzları arasında en iyi sonucu veren potasyum klorürün 1, 5, 10 ve 15 mM olmak

üzere farklı derişimlerinin zamanla lipolitik aktivite, protein ve hücre derişimleri

153

izlenmiştir. En yüksek lipolitik aktivite (0.0538 U/ml) 10 mM KCl içeren ortamda

gözlenmiştir. 10 mM KCl içeren ortamı 5, 1, 15 mM KCl içeren ortamlar izlemektedir.

Tüm derişimler için maksimum aktiviteler 40. saatte gözlenmiştir (Şekil 4.70).

Mikroorganizmanın dışarı salgıladığı toplam protein miktarları karşılaştırıldığında en

yüksek protein derişimi lipolitik aktivitede olduğu gibi 10 mM içeren ortamda

gözlenmiştir. Protein derişimlerindeki sıralama lipolitik aktivite için olan sıralama ile

aynıdır (Şekil 4.71).

En yüksek spesifik lipaz aktivitesi 10 mM KCl içeren ortamda gözlenmiştir. 10 mM

KCl içeren ortamı, aktivitede olduğu gibi sırasıyla 5, 1, 15 mM derişimdeki KCl içeren

ortamlar izlemektedir. Tüm KCl derişimleri için maksimum spesifik aktiviteler 40.

saatte gözlenmiştir (Şekil 4.72).


eğrileri oluşturulmuştur. En fazla hücre çoğalması 10 mM KCl içeren ortamda olmuştur

(Şekil 4.73). Mikroorganizmanın KCl’nin farklı derişimlerini içeren ortamlarda

hesaplanmış olan özgül çoğalma hızları (µ) ise Çizelge 4.9’da verilmektedir. Buna göre

mikroorganizmanın en yüksek özgül çoğalma hızı10 mM KCl, en düşük özgül çoğalma

hızı ise 1 mM KCl içeren ortamda gözlenmiştir.

Sonuç olarak lipaz üretim ortamına KCl tuzunun 10 mM derişimi eklendiğinde lipolitik

aktivite, spesifik lipaz aktivitesi ve hücre derişimlerinde artış gözlenmektedir. Bunun

yanı sıra ortama KCl tuzunun eklenmesi, en yüksek aktivite ve spesifik aktivite

gösterme sürelerini kısaltmaktadır (40. saat).

154

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Lipo

litik

akt

ivite

, U/m

l

1 mM KCl 5 mM KCl 10 mM KCl 15 mM KCl

Şekil 4.70 KCl’nin farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Prot

ein

deriş

imi,

mg/

ml


Şekil 4.71 KCl’nin farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

155

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Spes

ifik

lipaz

akt

ivite

si, U

/mg


Şekil 4.72 KCl’nin farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye (U/mg) etkisi pH=6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60 70

zaman, st

Hüc

re d

eriş

imle

ri, m

g/m

l


Şekil 4.73 KCl’nin farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

156

Çizelge 4.9 KCl’nin farklı derişimleri için hesaplanan özgül çoğalma hızları

KCl Derişimi, mM Özgül Çoğalma Hızı (µ), st -1

1 0.0674

5 0.0722

10 0.1106

15 0.0757

4.3 En İyi Koşullarda Lipaz Üretimi Debaryomyces hansenii’den lipaz üretimi için en iyi koşullar belirlendikten sonra bu

koşullarda (pH=6.5, T=30oC, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya

unu, 10 mM KCl içeren ortam), 250 ml’lik erlende 100 ml femantasyon ortamı

içerisinde N=150 rpm’de üretim yapılmış ve belli zaman aralıklarıyla üretim

ortamından alınan örneklerin spektrofotometrik ve titrimetrik yöntemle lipaz

aktiviteleri, proteaz aktivitesi, hücre ve protein derişimleri belirlenmiştir.

Hücre içi ve hücre dışı aktiviteler karşılaştırıldığında; hücre içinde titrimetrik lipaz

aktivitesi gözlenmezken, hücre dışında titrimetrik lipaz aktivitesi 24. saatte en yüksek

değere (0.1472 U/mg hücre; 3.3333 U/ml) ulaşmaktadır (Şekil 4.74). Titrimetrik

yöntemle bulunan hücre dışı lipaz aktiviteleri için, birim hacim başına aktivite değerleri

ile birim hücre miktarı başına aktivite değerlerinin zamanla değişim eğrileri paralellik

göstermektedir. Spektrofotometrik yöntemle belirlenen lipaz aktiviteleri

karşılaştırıldığında ise en yüksek hücre içi lipaz aktivitesi 24. saatte gözlenirken (0.0002

U/mg hücre), en yüksek hücre dışı lipaz aktivitesi 40. saatte (0.0020 U/mg hücre; 0.0496

U/ml) gözlenmiştir (Şekil 4.75). Spektrofotometrik yöntemle bulunan hücre dışı lipaz

aktiviteleri için de, birim hacim başına aktivite değerleri ile birim hücre miktarı başına

aktivite değerlerinin zamanla değişim eğrileri paralellik göstermektedir. Titrimetrik ve

spektrofotometrik olarak belirlenen lipaz aktivitelerinde zamanla önce bir artış, sonra bir

azalma vardır. Proteaz aktiviteleri incelendiğinde ise en yüksek hücre içi proteaz

aktivitesine (0.0352 U/mg hücre) 24. saatte ulaşılmaktadır (Şekil 4.76). Hücre içi proteaz

aktivitesinde ise zamanla önce bir artış sonra bir azalma varken, hücre dışı proteaz

157

aktivitesi bir artış gösterdikten sonra yaklaşık olarak sabit bir değere ulaşmıştır. Hücre

dışı proteaz aktivitesinin en yüksek değeri 0.1424 U/mg hücre (3.6888 U/ml) ’dir. Hücre

dışı proteaz aktivitesinde de hacim başına aktivite değerleri ile hücre miktarı başına

aktivite değerlerinin zamanla değişim eğrileri paralellik göstermektedir.

Şekil 4.77’de en iyi koşullarda zamana karşı hücre derişimleri ve hücre dışı protein

derişimleri verilmektedir. Mikroorganizma derişimi en fazla 25.92 mg/ml değerine

ulaşmış olup, en yüksek protein derişimi ise 0.3197 mg/ml’dir. En iyi koşullarda

mikroorganizmanın özgül çoğalma hızı 0.1107 st-1 olarak hesaplanmıştır.

00.020.040.060.08

0.10.120.140.16

0 10 20 30 40 50 60

zaman, st

Titr

imet

rik li

paz

aktv

itesi

, U/m

g hü

cre

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

Titr

imet

rik li

paz

aktiv

itesi

, U/m

l

hücre dışı lipaz (U/mg hücre) hücre içi lipaz (U/mg hücre)

hücre dışı lipaz (U/ml)

Şekil 4.74 En iyi koşullarda hücre içi ve hücre dışı titrimetrik lipaz aktiviteleri (U/mghücre) pH= 6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

158

0

0.0005

0.001

0.0015

0.002

0.0025

0 10 20 30 40 50 60zaman, st

Spek

trof

otom

etrik

lip

az

aktiv

itesi

, U/m

g hü

cre

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

Spek

trof

omet

rik li

paz

aktiv

itesi

, U/m

l

hücre dışı lipaz (U/mg hücre) hücre içi lipaz (U/mg hücre)hücre dışı lipaz (U/ml)

Şekil 4.75 En iyi koşullarda hücre içi ve hücre dışı spektrofotometrik lipaz aktiviteleri (U/mghücre) pH= 6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

00.020.040.060.08

0.10.120.140.16

0 10 20 30 40 50 60

zaman, st

Prot

eaz

aktiv

itesi

, U/m

g hü

cre

00.511.522.533.54

Prot

eaz

aktiv

itesi

, U/m

l

hücre dışı proteaz (U/mg hücre) hücre içi proteaz (U/mg hücre)hücre dışı proteaz (U/ml)

Şekil 4.76 En iyi koşullarda hücre içi ve hücre dışı proteaz aktiviteleri (U/mghücre) pH= 6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu

159

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60

zaman, st

Hüc

re d

eriş

imi,

mg/

ml

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Prot

ein

deriş

imi,

mg/

ml

Hücre derişimi Protein derişimi

Şekil 4.77 En iyi koşullarda hücre dışı protein ve hücre derişimleri (mg/ml) pH= 6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu 4.4 Lipazın Üretim Ortamından Ayrılması ve Kısmi Saflaştırılması Saflaştırmada sorun yaratmaması adına un ve yağ içermeyen, yüksek protein derişimi ve

aktivite sağlayan bir karbon kaynağı olan Triton X-100, azot kaynağı olarak %0.5

pepton ve %0.3 maya özütü içeren ortamda (T= 30oC; pH=4.5) lipaz üretimi

gerçekleştirilmiştir. 200 ml üretim ortamı; öncelikle hücresinden arındırılmış, ultrafiltre

edildikten sonra iyon değişim kromatografisi ile fraksiyonlara ayrılmış, fraksiyonlardan

kromatogramda aynı piki verenler birleştirilerek lipolitik aktivite ve proteinlerine

bakılmıştır. Her saflaştırma basamağının sonunda (hücre çöktürüldükten sonra,

ultrafiltrasyondan sonra ve iyon değişim kolonundan geçirildikten sonra) üretim

ortamının hacmi, aktivite ve protein derişimi ölçülerek Çizelge 4.10 oluşturulmuştur.

160

Çizelge 4.10 Lipaz enzimi kısmi saflaştırma basamakları

Saflaştırma Hacim Toplam Toplam Spesifik Verim Saflaştırma

Basamağı (ml) Aktivite Protein Aktivite (%) Katı

(U) (mg) (U/mg)

Kültür üst faz 180 2.117 2.926 0.723 100 1

Ultrafiltrasyon 20 1.693 1.756 0.965 80 1.33

İyon Değişim 8.8 0.172 0.171 1.007 8.15 1.39

Kromatografisi

Çizelge 4.10’daki % verim toplam aktivitelerin, saflaştırma katı ise spesifik aktivitelerin

oranından yola çıkılarak hesaplanmıştır. Her saflaştırma basamağının sonunda toplam

hacim, toplam aktivite ve toplam protein miktarları azalmakta, spesifik aktiviteler

artmaktadır. Spesifik aktivitelerdeki artış saflaştırmanın iyi yapıldığının bir göstergesi

olup, verim saflaştırma esnasında zamanla aktivitelerdeki azalmaya bağlı olarak

düşmektedir.

124

Şekil 4.78 Anyon değişim kromatografisi sonucunda elde edilen kromatogram

141

İyon değişim kromatografi sonucunda elde edilen kromatogram incelendiğinde (Şekil

4.78), başlangıçta gradyen oluşturulmadan önce kolondan ayrılarak fraksiyonlar halinde

toplanan proteinler görülmektedir. Bunlar pI noktası tampon pH’ından yüksek olan ve

(+) yüklendiği için (+) yüklü olan kolona tutunamamış proteinlerdir. Tuz gradyeni

oluşturulduktan sonra kolonu terk eden proteinler ise pI noktası tampon pH’ından düşük

olduğu için (-) yüklenmiş olan ve (-) değerlerinin büyüklüğüne bağlı olarak kolondan

kademeli olarak ayrılan farklı pI değerlerine sahip proteinlerdir. Kromatogramda pik

vermiş olan [3-5], [20-21], [22-26], [48-55] ve [56-60] olmak üzere beş adet fraksiyon

grubu için SDS-PAGE yapılmış, ayrıca bunlardan hangisinin lipolitik aktiviteye sahip

olduğunun anlaşılması için spektrofotometrik olarak lipaz aktivitelerine bakılmıştır. Bu

fraksiyon grupları içerisinde kromatogramda 3 ve 5 numaralı fraksiyonları kapsayan

grupta ([3-5] fraksiyon grubu) diğerlerinden farklı olarak yüksek bir lipolitik aktivite

gözlenmiştir. SDS-PAGE sonuçlarında da aynı fraksiyon grubunun, diğer fraksiyon

gruplarında gözlenen bantlardan farklı başka bantlara da sahip olduğu görülmektedir.

Daha iyi bir jel görüntüsü elde etmek ve elde edilen bulguların doğruluğunu kontrol

etmek için önceden ayrılıp saklanmış olan örnekler ile tekrar iyon değişim

kromatografisi yapılmış, kromatogramda tuz gradyeni oluşturulmadan önce yine

diğerlerine göre çok büyük bir pik gözlenmiş ve lipaz olduğu düşünülen bu piki

oluşturan fraksiyonlar tekrar toplanarak diğer pik veren fraksiyon gruplarıyla birlikte

SDS-PAGE kuyucuklarına yüklenmiştir. SDS-PAGE sonuçlarına bakıldığı zaman

lipolitik aktivitenin gözlendiği kromatogramda en başta yer alan fraksiyon grubu için

36-28 kDa arasındaki üç bant belirgin olarak görülmektedir (Şekil 4.79).

M 1 2 3 4 5

Şekil 4.79 SDS-PAGE analizi sonuçları (M : Marker, 1: [3-5], 2: [20-21], 3: [22-26], 4: [48-55], 5: [56-60])

250 130 95 72 55 36 28

142

4.5 Kısmi Saflaştırılmış Lipazın Deterjan Katkı Maddeleri ile Kullanım

Potansiyeli

Kısmi olarak saflaştırılmış lipazın aktivitesine deterjan katkılarının etkisini incelemek

amacıyla ultrafiltrasyon sonrası üretim ortamına %1 derişimde SDS, Triton X-100,

H2O2, amilaz ve proteaz ile %0.25 derişimde EDTA eklenmiştir. N=100 rpm, T=45oC

koşullarında lipaz üretim ortamı bir saat süresince deterjan katkıları ile inkübe edilmiş;

inkübasyon sonrası lipaz aktiviteleri spektrofotometrik yöntemle ölçülmüştür. Bir saat

sonrasındaki lipaz aktiviteleri inkübasyon öncesi lipaz aktivitelerine göre verilerek

farklı deterjan katkıları içeren ortamlarda ve katkı içermeyen ortamda lipazın

aktivitesinin yüzde kaçını koruduğu belirlenmiştir.

Sonuçlar incelendiğinde lipaz enziminin katkı içermeyen ortamda inkübasyon sonrası

aktivitesinin %91’ini, SDS içeren ortamda yarısını, amilaz içeren ortamda %83’ünü,

proteaz içeren ortamda %54’ünü, H2O2 içeren ortamda %56’sını ve EDTA içeren

ortamda %42’sini koruduğu görülmüştür (Çizelge 4.11). Triton X-100 içeren ortamda

aktivite düşmemiş; aksine yaklaşık iki katına çıkmıştır.

Çizelge 4.11 Saflaştırılmış lipaz enzimi aktivitesine deterjan katkıları etkisi Katkı Maddesi % Korunan Aktivite

Katkısız 91

%1 SDS 50

%0.25 EDTA 42

%1 Triton X-100 202

%1 Amilaz 83

%1 Proteaz 54

%1 H2O2 56

143

5. TARTIŞMA ve SONUÇ Mikroorganizma tanımlanması

Süt mamulleri üretim tesisi yağlı atığından izole edilen mikroorganizmanın 5.8S rRNA

ve 26S rRNA analizleri sonucunda türünün Debaryomyces hansenii olduğu

belirlenmiştir. Sekans analiz sonuçları değerlendirildiğinde çalışılan mikroorganizmaya

ait baz dizinleri ile Debaryomyces hansenii’ye ait baz dizinleri %100 uyum

göstermiştir. Böylelikle morfolojik olarak bir maya olduğu belirlenen

mikroorganizmanın türü moleküler seviyede de aydınlatılmıştır.

Lipaz üretimi için uygun koşulların belirlenmesi

Debaryomyces hansenii’den lipaz üretiminde en uygun ortam koşullarının belirlendiği

çalışmada, mikroorganizmanın temel besin kaynakları olan farklı tür ve derişimde karbon

ve azot kaynakları ile farklı sıcaklıklar, farklı ortam başlangıç pH’ları ve farklı türde

metal iyonlarının etkisi incelenmiştir. Öncelikle karbon kaynaklarının lipolitik aktivite ve

hücre çoğalmasına etkisi incelenmiş ve bu amaçla kolay ve ekonomik olarak elde

edilebilen bitkisel yağlar karbon kaynağı olarak denenmiştir. Doğal karbon

kaynaklarından bitkisel yağlar içerisinde en yüksek lipaz aktivitesini %1 soya yağı

vermiştir. Farklı derişimleri denenmiş olan tüm yağların %1.5’luk derişimleri aktivite

üzerinde inhibisyon etkisi yaratmış, %0.5 derişimler ise aktivite için yetersiz kalmıştır.

Maksimum özgül çoğalma hızı ise %1.5 soya yağı içeren ortamda gözlenmiştir. Bitkisel

yağların aktiviteye etkisi incelendiğinde genellikle mısır, susam, soya yağı gibi çoklu

doymamış yağların daha iyi sonuç verdiği görülmüştür.

Bitkisel yağların aktivite ve hücre çoğalması üzerindeki etkilerinin farklı oluşunun

nedeni olarak yapılarını oluşturan yağ asidi ve esterleri düşünülmüş, yağ asidi ve

esterlerinin lipolitik aktiviteye ve mikroorganizma çoğalmasına etkisi incelenerek yağlar

ile yapılarını oluşturan yağ asidi ve esterleri arasında bir korelasyon oluşturulmaya

çalışılmıştır. Bu amaçla denenen yağ asitleri içerisinde en yüksek aktiviteyi %1 oleik asit

vermiştir. Mikroorganizmanın en yüksek özgül çoğalma hızı da %1 oleik asit içeren

144

ortamdadır. Yağ asidi esterleri içerisinde ise en yüksek aktivite ise %1 tristearin içeren

ortamdadır. Bitkisel yağların bileşimini oluşturan yağ asitleri dikkate alındığı zaman

oleik asitçe zengin olan zeytin ve fındık yağlarının yüksek aktivite vermesi beklenirken

en iyi sonucu soya yağı vermiştir. Bu sonucun elde edilmesinde soya yağının yağ asidi ve

esteri dışında içerdiği diğer bileşenlerin de rolü olduğu düşünülmektedir. Yağlar sadece

içerdikleri yağ asitlerinin çeşidi ve yüzdesi ile değil proteinler, fosfolipitler, steroller,

vitaminler vb diğer bileşenler ile birlikte değerlendirilmelidir. Örneğin fındık yağı suda

çözünmeyen E vitamini açısından oldukça zengindir. Soya yağının aktivitesinin

diğerlerine göre yüksek oluşunun, yapısındaki linolenik asidin diğer yağlarla

kıyaslandığında fazla olmasının dışında lezitin içermesiyle de (Şenelt 1982) ilgili

olabileceği düşünülmektedir.

Yağ asitleri için genel bir değerlendirme yapılırsa, mikroorganizma doymuş yağ asidi

esterlerinde karbon sayısı yüksek olanları daha iyi kullanmaktadır. Doymuş yağ

asitlerinde de karbon sayısı fazla olanları tercih etmekle beraber, palmitik asit, stearik

asitten daha iyi sonuç vermiştir. Bunun sebebi olarak mikroorganizmanın karbon sayısı

daha yüksek olan stearik asidi parçalamasının daha zor olması gösterilebilir. Nitekim

palmitik asit ve stearik asitin %0.5 ve %1 derişimleri karşılaştırıldığında, palmitik asitin

%0.5 derişimi aktivite ve özgül çoğalma hızı için yetersiz kalırken, stearik asitin %1

derişimi inhibisyon etkisi yaratmaktadır. Genellikle yağ asitleri, esterlerine oranla daha

yüksek aktivite göstermektedir. Ayrıca, doymamış yağ asitlerinde çift bağ sayısı arttıkça

aktivite ve özgül çoğalma hızının azaldığı gözlenmiştir. Bu sonuçlara farklı yağ asidi ve

esterlerinin %1 derişimleri karşılaştırılarak varılmıştır.

Karbon kaynağı olarak bitkisel yağlara, yağ asidi ve esterlerine ek olarak gliserol,

peynir altı suyu, Triton X-100 ve glukoz da denenmiştir. Trigliseritleri parçalayarak yağ

asidi ve gliserol oluşumunu sağlayan lipaz enziminin üretildiği ortamda,

mikroorganizmanın gliserolü karbon kaynağı olarak kullanıp kullanmadığını araştırmak

amacıyla gliserolün %1 derişimi karbon kaynağı olarak kullanılmıştır. Sonuçlar %1

gliserolün %1 susam yağı (1) kadar iyi bir karbon kaynağı olduğunu göstermiş,

mikroorganizma özgül çoğalma hızı da diğer karbon kaynakları ile karşılaştırıldığında

oldukça yüksek bulunmuştur. Canlı mikroorganizmalar için oldukça önem taşıyan

145

glukozun hücre çoğalması ve aktiviteye etkisinin incelendiği deneylerde, glukozun

hücre çoğalması için gerekli olduğu, bu yüzden katı agar ve ön çoğalma ortamında

kullanılabileceği, ancak glukozun lipaz üretim ortamında kullanılmasının lipolitik

aktiviteyi azaltıcı etki göstermesi nedeniyle uygun olmayacağı sonucuna varılmıştır. D.

hanseneii, süt mamulleri üretim tesisinden izole edildiği için peynir altı suyunun karbon

kaynağı olarak kullanımının iyi sonuç vereceği düşüncesi, deney sonuçları ile

desteklenmiştir. %1 Peyniraltı suyu içeren ortamda mikroorganizmanın lipolitik

aktivitesi doğal yağlar arasında en iyi sonucun alındığı %1 soya yağı içeren ortamdaki

kadar yüksektir. Peyniraltı suyu içerdiği laktoz, serum proteinleri ve mineral maddeleri

ile mikroorganizma için iyi bir kaynaktır (http://foodwaste-milk.tripod.com/whey/,

2007). Yapılan deneysel çalışmalar sonucunda belli başlı surfaktanlardan Triton X-

100’ün de iyi bir karbon kaynağı olduğu belirlenmiştir. Bu, Triton X-100’ün ara yüzey

alanını arttırması ve aromatik halka ve ona bağlı bir R grubunun oluşturduğu hidrofob

bir gruba sahip olması ile açıklanabilir. Ayrıca Triton X-100’ün hücre duvarı

geçirgenliğini arttırdığı ve bu sayede hücreye bağlı enzimler üzerine etki ettiği de

bilinmektedir (López et al. 2005). %0.5 Triton X-100’ün ise indükleyici olarak etkisi

gözlenememiştir, hatta inhibisyon etkisi yarattığı görülmüştür.

En yüksek lipolitik aktivite, karbon kaynağı olarak %1 Triton X-100 içeren ortamda

gözlense de, doğal bir karbon kaynağı olması nedeniyle bitkisel yağlardan %1 soya yağı

karbon kaynağı olarak kullanılarak en iyi azot kaynağının belirlenmesinin amaçlandığı

deneyler yapılmıştır. Azot kaynaklarından öncelikle, organik ve inorganik azot

kaynaklarının lipaz aktivitesi üzerine etkisini karşılaştırmak amacıyla %5 pepton, %5 üre

ve %5 amonyum sülfat içeren ortamlar kullanılmıştır. Ortamlardaki azot kaynakları ve

derişimleri, literatür çalışmaları esas alınarak belirlenmiştir (Shirazi et al. 1998, Saxena

et al. 1999, Sharma et al. 2001). En yüksek aktiviteler sırasıyla %5 pepton, %5 üre ve

%5 amonyum sülfat içeren ortamlarda gözlenmiştir. Bu çalışmadan elde edilen başka bir

sonuç, mikroorganizmanın ürettiği enzimin organik azot kaynaklarını kullandığı zaman

daha iyi lipolitik aktivite göstermesidir. Saccharomyces cerevisiae’dan lipaz üretimine

ortam koşullarının etkisinin araştırıldığı bir çalışma da, deney bulgularını destekler

niteliktedir (Shirazi et al. 1998). Daha sonraki deney setinde, ön çoğalma ortamlarında da

azot kaynağı olarak kullanılan %0.5 pepton + % 0.3 maya özütü, %0.5 pepton, %0.3

146

maya özütü, %1 pepton + %0.3 maya özütü içeren ortamlar denenmiştir. Aktiviteler en

yüksekten en düşüğe doğru sırasıyla, %0.5 pepton + % 0.3 maya özütü > %0.3 maya

özütü > %0.5 pepton > %1 pepton + %0.3 maya özütü şeklindedir. Spesifik aktivitelerde

de bu sıra değişmemektedir. Elde edilen sonuçlar değerlendirilecek olursa, peptonun tek

başına kullanımı hücre çoğalması için iyi sonuç vermekte, ancak lipolitik aktivite üzerine

maya özütü gibi etkili olamamaktadır. Maya özütünün tek başına kullanımı ile peptonla

birlikte kullanımı arasında aktiviteler açısından fazla bir fark yoktur. Bu durumda maya

özütü yüksek aktivite elde etmede tek başına bile kullanılabilir. Maya özütünün daha iyi

sonuç vermesi, peptondan biraz daha fazla azot içermesi ve yapısındaki ekstra iyonların

varlığından kaynaklanabilir (Çetin 1983). %1 Pepton aktivitede inhibisyon yaratmıştır.

Bunun yanı sıra maya özütünü yalnız kullanmak yerine peptonla birlikte kullanmak

mikroorganizmanın aktivite gösterme süresini uzatmaktadır. Bir sonraki deney setinde,

%1 üre, %0.5 pepton + %0.5 malt özütü, %0.5 pepton + %0.5 lizin, %0.5 pepton + %0.5

arjinin azot kaynağı olarak denenmiştir. Lizin ve arjinin amino asitlerdir. Ortamlar, en

yüksek aktivite elde edilenden en düşük aktivite elde edilene doğru sıralanırsa, %0.5

pepton + %0.5 malt özütü > %1 üre > %0.5 pepton + %0.5 lizin > %0.5 pepton + %0.5

arjinin olduğu görülür. Spesifik aktiviteler de aynı şekilde sıralanmaktadır. Amino

asitlerin tek başlarına kullanımı lipaz aktivitesinde de çoğalmada da iyi sonuç

vermemektedir. Malt özütü, özellikle mayaların agar besi ortamlarında azot kaynağı

olarak kullanılmaktadır; nitekim hücreler en çok pepton ve malt özütü içeren ortamda

çoğalmıştır. Bununla birlikte peptonla birlikte malt özütünün kullanımı aktivite gösterme

süresini kısaltmıştır. Üre tek başına kullanıldığı halde aktivitede iyi bir sonuç vermiştir,

ancak hücreler üre içeren ortamda iyi çoğalamamıştır. Ürenin %5 derişimi inhibisyon

yaratmıştır. Azot kaynaklarının denendiği son deney setinde, unlar ve aktivitede iyi

sonuç alınan maya özütünün farklı derişimlerini içeren ortamlar çalışılmıştır. Bu amaçla,

%0.5 maya özütü, %1 maya özütü, %1 soya fasulyesi unu, %1 beyaz buğday unu ve %1

mısır unu denenmiştir. Maya özütünün %0.3’lük derişimi lipazı aktivite gösterebilmesi

için yetersiz kalmış, %1’lik derişimi ise inhibisyon etkisi göstermiştir. Maya özütünün

%0.5 derişimi ise lipolitik aktivite açısından uygun bir derişim değeridir. Soya unu,

denenmiş tüm azot kaynaklarından daha yüksek bir lipaz aktivitesi ve hücre çoğalması

gözlenmesini sağlamıştır. Soya unundan sonra en yüksek aktivite veren ortamlar, %0.5

maya özütü ve %1 maya özütü içeren ortamlardır. Buğday ve mısır unları 40. saatte bile

147

aktivite gösterememiştir. Spesifik aktiviteler için de aynı sıralama geçerlidir. Hücre

çoğalması açısından ise, unların diğer azot kaynaklarından daha iyi olduğu

görülmektedir. Sonuç olarak Debaryomyces hansenii, karbon kaynağı olarak soya yağını

tercih ederken, azot kaynağı olarak da soya ununu tercih etmektedirler. Soya ununu

tercih etmelerinin nedeni, bu unun %40 gibi oldukça yüksek bir değerde azot içermesidir

(http://www.fao.org, 2006).

Lipaz aktivitesine ortam pH’ının etkisinin incelenirken karbon kaynağı olarak daha

önceki çalışmalar sonucunda en iyi aktivitenin gözlendiği %1 soya yağı, azot kaynağı

olarak ise %1 soya unu kullanılmıştır. Mayalar için düşük pH uygun olduğu için

öncelikle düşük pH’lar denenmiş, pH artırıldıkça lipolitik aktivitenin artması üzerine

daha yüksek pH’ların da denenmesine karar verilmiştir. Lipolitik aktiviteye karbon

kaynaklarının etkisinin incelendiği deneylere başlanmadan önce ise bir ön çalışma

yapılmış ve pH=4.5, 5.5 ve 6.5 arasında en uygunu daha kısa sürede aktivite gözlendiği

için pH 4.5 olarak belirlenmiştir. Bu kez en iyi karbon ve azot kaynakları ile sitrik asit

tamponu kullanılarak pH=3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5 ve 6.0 denenmiştir. Sonuçlar

değerlendirildiğinde en iyi aktivitenin pH=6.0’da gözlendiği görülmektedir. pH arttıkça

aktivite gösterme süresi uzamaktadır. pH=3.5, 4.0, 4.5 için maksimum aktiviteler 24.

saatte gözlenirken, pH=5.0, 5.5 için 48. saatte, pH=6.0 için ise 72. saatte gözlenmiştir.

pH=6.0’da enzim hem daha yüksek aktivite göstermekte, hem de aktivitesini yüksek

aktivitesini uzun süre koruyabilmektedir. Mikroorganizma en fazla pH=6.0’da

çoğalmakla birlikte, en yüksek hücre çoğalma hızı pH=5.0’tedir. Spesifik aktiviteler

çoktan aza doğru, pH=3.5 > 4.5 > 4.0 > 6.0 > 5.0 > 5.5 olarak sıralanmaktadır. Sonuç

olarak yüksek pH’larda aktivite değerleri, düşük pH’larda ise spesifik aktivite değerleri

daha yüksek bulunmuştur. pH=6.0’daki aktivite, kendisinden sonra gelen pH=5.5’deki

aktivitenin iki katı kadardır. Bu durumda daha yüksek pH’ların da denenmesinin uygun

olduğu düşünülmüştür. Bundan sonraki deney setinde, pH=6.0, 6.5, 7.0 ve 7.5

denenmiştir. Tampon olarak yine sitrik asit tamponu kullanılmıştır. Sonuçlar

değerlendirildiğinde en iyi aktivitenin pH=6.5’ta elde edildiği görülmektedir. Bu sonuçla

birlikte denenen bütün pH’lar arasında en yüksek enzim aktivitesini veren pH 6.5

olmuştur. pH arttıkça aktivite gösterme süresi uzamış; ancak enzim aktivitesini daha

uzun süre koruyabilmiştir. pH arttıkça spesifik aktiviteler ise azalmıştır. Denenen tüm

148

pH’lar arasında en yüksek spesifik aktiviteyi pH=3.5 vermiştir. Mikroorganizma

çoğalması açısından ortamları kıyaslarsak en iyi çoğalmanın pH=5.5’ta olduğunu

görürüz. pH=5.5’tan itibaren ortam pH’ı arttıkça çoğalmanın azaldığı gözlenmektedir.

Bununla birlikte en yüksek hücre çoğalma hızı pH=5.0’te gözlenmektedir. Sonuç olarak

bundan sonraki sıcaklık deneylerine pH=6.5 ile devam edilmesi uygun görülmüştür.

Lipaz aktivitesine sıcaklık etkisinin incelendiği çalışmalarda karbon kaynağı olarak daha

önceki çalışmalar sonucunda en iyi aktivitenin gözlendiği %1 soya yağı, azot kaynağı

olarak ise %1 soya unu kullanılmış ve pH=6.5 değerinde çalışılmıştır. T=30oC, 35oC ve

40oC’ın lipolitik aktivite ve hücre çoğalmasına etkisi incelenmiştir. Lipolitik aktivite

sonuçları göstermiştir ki, sıcaklık arttıkça aktivite düşmektedir. En yüksek aktivite değeri

T=30oC’ta gözlenmekle birlikte bu değere 64. saatte ulaşılabilmiştir. Bunu sırasıyla

T=35oC ve 40oC izlemekte; en iyi aktiviteler T=35oC’ta 40. saatte, T=40oC’ta ise 24.

saatte gözlenmektedir. T=30oC hem en yüksek aktivitenin gözlenebildiği sıcaklık, hem

de bu aktivitenin korunabildiği sıcaklık olarak diğer sıcaklıklara tercih edilebilir.

Bununla birlikte T=35oC ve 40oC da T=30oC’la karşılaştırıldığında daha kısa sürede

aktivitenin gözlenebildiği ve T=30oC’taki ile kıyaslandığında maksimum aktivitelerinin

düşük kalmaması açısından endüstriyel olarak enzim üretiminde çalışılabilecek koşullar

olarak görülmektedir. Aktivitenin yüksek olduğu sıcaklıkta protein derişimi de yüksek

olduğu için spesifik aktiviteler çoktan aza doğru T=40oC, 35oC ve 30oC sıcaklıklarda

gözlenmiştir. T=40oC’taki maksimum spesifik aktivite T=35oC’takinden yaklaşık iki,

T=30oC’takinden yaklaşık üç kat fazladır. Sıcaklığın hücre çoğalması üzerindeki etkisi

düşünüldüğünde, sıralama aktivitedeki sıralamayla aynıdır. En iyi çoğalma, çoğalma

eğrileri dikkate alınarak T=30oC’ta gözlenmiş olup, bu sıcaklığı 35oC ve 40oC

izlemektedir. T=40oC’taki hücre çoğalması diğer sıcaklıkların yanında oldukça düşük

kalmaktadır. Özgül çoğalma hızları karşılaştırıldığında da sıralama değişmemekte ve en

hızlı çoğalma mikroorganizmanın katıdaki çoğalma sıcaklığı olan T=30oC’ta

gözlenmektedir.

Lipaz aktivitesine farklı iyonların etkisinin incelendiği deneylerde, karbon kaynağı

olarak daha önceki çalışmalar sonucunda en iyi aktivitenin gözlendiği %1 soya yağı, azot

kaynağı olarak ise %1 soya unu kullanılmış; pH=6.5 ve T=30oC da çalışılmıştır. Bu

149

amaçla seçilen metal tuzları, NaCl, LiCl, KCl, MgCl2, CaCl2, ZnCl2, Na2SO4, K2SO4 ve

MgSO4’tür. Deneylerde bu metal tuzlarının 1 mM derişimleri kullanılmıştır. Daha önceki

deneylerde en yüksek aktivitenin gözlendiği saat olan 48. saatte üretim ortamlarından

örnekler alınarak hem lipaz aktivitelerine hem de hücre derişimlerine bakılarak iyonların

mikroorganizma çoğalma ve lipolitik aktiviteye etkisi belirlenmiştir. Aktivite sonuçları

karşılaştırıldığında bazı iyonların lipolitik aktiviteyi stimüle ederken, bazılarının inhibe

ettiği görülmektedir. KCl ve K2SO4 ile lipolitik aktiviteyi artırmaktadır. Özellikle KCl

aktiviteyi yaklaşık 1.5 katına çıkararak metal tuzları arasında en iyi sonucu vermiştir.

Metal tuzları arasında KCl’den sonra K2SO4 gelmekte olup o da aktiviteyi yaklaşık 1.2

katına çıkarmıştır. Lipolitik aktiviteyi artıran diğer tuzlar ise sırasıyla, MgCl2 ve

Na2SO4’tür. Bu tuzlar varlığında aktivite çok az bir artış göstermektedir. Aktivite

üzerinde inhibisyon yaratan tuzlar da vardır; bunlar arasında en fazla inhibisyon etkisi

gösteren tuz CaCl2’dir. CaCl2’den sonra en fazla inhibisyon yaratanlar sırasıyla, LiCl,

MgSO4, NaCl ve ZnCl2’dir. Tuzlar hücre çoğalması açısından karşılaştırıldığında ise

ZnCl2 ve MgCl2 içeren ortamlar dışındaki diğer tüm ortamlarda mikroorganizma

derişimlerinin kontrol amacıyla konulan ortamından az olduğu görülmüştür. Hücre en

fazla MgCl2 içeren ortamda, en az KCl içeren ortamda çoğalmaktadır. Lipolitik aktivite

sonuçları göstermiştir ki, potasyum lipaz aktivitesi açısından önemli bir katyondur. Soya

ununun potasyumca zengin oluşu (Çetin 1983) ve en yüksek aktivitelerin ortama azot

kaynağı olarak soya unu konulduğu zaman gözlenmesi de bir kez daha bu katyonun

mikroorganizmanın enzim üretimindeki önemini ortaya koymaktadır. En fazla

aktivitenin gözlendiği KCl içeren ortamda hücre çoğalmasının en az miktarda gözlenmiş

olması, mikroorganizmanın bu iyonu çoğalmadan başka faaliyetlerde kullandığını

göstermektedir. MgCl2 içeren ortamda hem yüksek lipolitik aktivite elde edilebilmekte,

hem de hücre çok çoğalmaktadır. Magnezyum TCA çevriminde enerji elde etmede

kullanıldığı için mikroorganizma için yaşamsal bir önem kazanmaktadır. MgCl2

düzlemsel bir tuz oluşturduğu için neden olduğu sterik etki de azdır. Ancak MgSO4

içeren ortam için aynı durum söz konusu değildir, bu bize katyonlar kadar anyonların da

aktivite ve hücre çoğalmasında etkili olduğunu göstermektedir. Na2SO4 tuzu aktivite ve

hücre çoğalmasında NaCl’den daha iyi sonuç vermektedir. Lityum güçlü bir alkalidir;

böyle bir ortamda enzim kararlı olamayabilir. LiCl içeren ortamda aktivitede düşüş

gözlenmiştir. Ağır metallere bir örnek oluşturan ZnCl2 beklendiği gibi enzim aktivitesini

150

inhibe etmiştir. +2 değerlikli katyonlar ikili tuz oluşturabilme yeteneğine sahiptir. Bu

sayede yağ- su ara yüzeyinde hidroliz sonucu oluşan yağ asitleriyle kompleks oluşturarak

yağ asitlerinin ara yüzeyden uzaklaşmasını sağlayıp lipazın serbestçe diğer yağ

moleküllerine etki etmesini kolaylaştırarak lipolitik aktiviteyi artırırlar (Sharon et al.

1998). Bu aşamada yağ asitlerinin uzaklaştırılması hız kontrol edici basamak olarak

düşünülmelidir. CaCl2 içeren ortamda lipolitik aktivitede inhibisyon gözlenmesi,

Ca+2’nin proteaz enzimi için kofaktör oluşuyla ilişkilendirilebilir. Genellikle +2

değerlikli katyonların klor tuzları hücre çoğalmasında daha etkilidir. +1 değerlikli

katyonların ise sülfat tuzlarını içeren ortamlar, klorür tuzlarını içeren ortamlardan hücre

çoğalmasının daha fazla gözlendiği ortamlardır. Metal tuzları arasında en yüksek

aktivitenin gözlendiği KCl’nin farklı derişimlerinin lipaz aktivitesine etkisinin

incelendiği deneylerde, 1 mM KCl derişimine ek olarak 5, 10, 15 mM’lık tuz derişimleri

denenmiş ve tuz toleranslı bir mikroorganizma (http://www.ebi.ac.uk, 2007) olduğu

bilinen D. hansenii için yüksek aktivite 10 mM KCl içeren ortamda gözlenmiştir.

Üretilen lipazın kısmi saflaştırılması ve deterjan katkı maddeleriyle birlikte kullanımı

D. hansenii’den lipaz üretimi için en uygun parametreler belirlendikten sonra en iyi

koşullarda lipaz üretimi gerçekleştirilerek zamanla hücre içi ve hücre dışı lipaz

aktiviteleri spektrofotometrik ve titrimetrik olarak belirlenmiş, bunun yanı sıra lipazı ve

kendini parçalama özelliği olan proteaz enziminin de zamanla aktivitesi izlenmiştir.

Sonuç olarak mikroorganizmanın ürettiği enzimlerin çoğunu dışarı salgıladığı

görülmüştür. Titrimetrik yöntemle hücre içi lipaz aktivitesi gözlenmemiştir. Titrimetrik

yöntemle substrat ve sıvı ara yüzeyinde etkin lipazın, spektrofotometrik yöntemle ise

substratın sıvıda çözünebildiği durumlarda substrata etki eden esterazın aktivitesi

ölçülmektedir (Bornscheuer 2002). Titrimetrik yöntemle en yüksek lipaz aktivitesi

gözlendikten sonra (24. saat) spektrofotometrik yöntemle en yüksek hücre dışı lipaz

aktivitesi gözlenmektedir (40. saat). Proteaz aktivitesi hücre içinde de hücre dışında da

gözlenmiş olup hücre içinde azalırken hücre dışında artıp sabitlenmektedir. Hücre dışı

proteaz aktivitesi artış gösterdikten sonra yaklaşık olarak sabit bir değere ulaştığı zaman,

spektrofotometrik yöntemle belirlenen hücre dışı lipaz aktivitesi düşmeye başlamıştır.

151

Lipolitik aktivite için en iyi koşullar belirlendikten sonra bu koşullarda (pH=6.5,

T=30oC, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu, 10 mM KCl içeren

ortam) üretilen enzimin saflaştırılması için çalışmalar yapılmıştır. Bunun için öncelikle

enzim saflaştırmada sıkça kullanılan amonyum sülfat çöktürmesi yapılmıştır. Amonyum

sülfat çöktürmesi son hacim % 40 amonyum sülfat içerecek şekilde gerçekleştirilmiştir.

Amonyum sülfat çöktürmesinden sonra ortamdaki tuzu uzaklaştırmak amacıyla 20 saat

süreyle damıtık suya karşı diyaliz yapılmıştır. Diyaliz sonrası ultrafiltrasyon yapılarak 5

kDa’un altında molekül ağırlığına sahip moleküllerin ortamdan uzaklaştırılması

sağlanmıştır. Saflaştırma işlemlerinden sonra elde edilen ürünün çok viskoz oluşu, bize

en yüksek aktiviteyi veren soya unu içeren üretim ortamın saflaştırma aşamaları için

uygun bir ortam olmadığını göstermiştir. Bundan yola çıkılarak un içermeyen % 0.5

maya özütü ve %1 soya yağı içeren berrak bir ortamın enzim saflaştırmada

kullanılabileceği sonucuna varılmıştır (pH=4.5). Bu ortam için de öncelikle amonyum

sülfat çöktürmesi yapılmıştır. Amonyum sülfat derişimi % 20’den % 40’a, % 40’tan %

80’e çıkarılmıştır. Ortamın yağlı olması, protein derişiminin az olması sebebiyle protein

çöktürmesinde sorun yaşanmıştır. Gerek karbon kaynağı olarak yağ kullanıldığında

enzimin yüzeydeki yağla hidrofobik etkileşimi sonucunda çökmemesi ve genel olarak az

olan proteinin bu şekilde kaybedilmesi, gerekse amonyum sülfat çöktürmesi sonrası elde

edilen hacmin çok az olması nedeniyle bundan sonraki saflaştırma işlemlerinde

amonyum sülfat çöktürmesi yapılmamıştır.

Saflaştırmada, un ve yağ içermeyen, protein derişiminin ve aktivitenin yüksek olduğu,

karbon kaynağı olarak Triton X-100, azot kaynağı olarak %0.5 pepton ve %0.3 maya

özütü içeren lipaz üretim ortamına hücre çöktürme, ultrafiltrasyon ve iyon değişim

kromatografisi olmak üzere birkaç saflaştırma basamağı uygulandıktan sonra elde edilen

sonuçlar değerlendirildiğinde verimin zamanla aktivite kaybından dolayı azalmasının

dışında saflaştırma katının her basamakta arttığı görülmektedir ki, bu da saflaştırmanın

başarılı olduğunu göstermektedir.

Saflaştırmanın son basamağı olan iyon değişim kolonundan izoelektrik noktalarına göre

fraksiyonlar halinde çıkan proteinlerin aktivite tayinleri ve SDS-PAGE sonuçları

göstermiştir ki, mikroorganizmanın ürettiği lipaz izoelektrik noktası 8.3’ten büyük,

152

molekül ağırlığı 25-40 kDa arasında değişen bir lipazdır. SDS-PAGE sonuçlarında,

aktivite gösteren fraksiyon grubu için diğer fraksiyon gruplarından farklı olarak üç

değişik bant gözlenmesi, lipazın izoelektrik noktaları 8.3’ten büyük üç farklı izoformu

olabileceğini göstermektedir. Kısmen saflaştırılmış lipaz enzimi, anyon değişim

kromatografisi yerine katyon değişim kromatografisi yapılırsa tamamen saf bir enzim

elde edilebilir.

Kısmen saflaştırılmış olan lipazın deterjan katkısı olarak %1 derişimde SDS, proteaz,

amilaz, Triton X-100 ve H2O2 ile %0.25 EDTA varlığındaki kararlılığı

değerlendirildiğinde, deterjan katkıları varlığında aktivitesinin büyük çoğunluğunu

koruyabildiği için enzimin deterjanlarda kullanım potansiyeline sahip olduğu

belirlenmiş, Triton X-100 içeren ortamda aktivitesinin daha da arttığı gözlenmiştir ki,

literatürde başka lipazlar için bunu destekleyen sonuçlara (Hemachander and

Puvanakrishnan 2000) rastlanmıştır.

153

KAYNAKLAR

Anonim. 2006. Web sitesi: http://www.fao.org, Erişim Tarihi: 22.08.2006.

Anonim. 2007. Web sitesi: http://yunus.hacettepe.edu.tr, Erişim Tarihi: 20.04.2007

Anonim. 2007. Web sitesi: http://foodwaste-milk.tripod.com/whey/, Erişim Tarihi:

21.07.07

Anonymous. 2005. Web sitesi: http://www.mapsenzymes.com, Erişim Tarihi:

26.10.2005

Anonymous. 2005. Web sitesi: http://www.housekeepingchannel.com, Erişim

Tarihi: 26.10.2005

Anonymous. 2006. Web sitesi: http://www.novozymes.com, Erişim Tarihi: 05.04.2006

Anonymous. 2007. Web sitesi: http://www.ebi.ac.uk, Erişim Tarihi: 04.06.2007

Anonymous, 1987. Standart Methods for Analysis of Oils, Fats and Derivates,

International Union of Pure and Applied Chemistry, 7 th ed. Blackwell

Scientific Publications, IUPAC Method 2.301.

Besancon, X., Ratomahenına, R. and Galzy, P. 1995. Isolation and partial

characterization of an esterase (EC 3.1.1.1) from a Debaryomyces hansenii

strain. Neth Milk Dairy J., 49; 97-110.

Bornscheuer, U. T. 2002. Microbial carboxyl esterases : classification, properties and

application in biocatalysis. FEMS Microbiology Reviews, 26; 73-81.

Bradford, M. M. 1976. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of

Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye

Binding. Anal. Biochem., 72; 248-254

Buzzini, P. and Martini, A. 2002. Extracellular enzymatic activity profiles in yeast and

yeast-like strains isolated from tropical environments. Journal of Applied

Microbiology, 93; 1020-1025.

Cernia, E., Deflini, M., Cocco, E., Palocci, C. and Soro, S. 2002. Investigation of lipase-catalysed hydrolysis of naproxen methyl ester : Use of NMR spectroscopy methods to study substrate-enzyme interaction. Bioorganic Chemistry, 30; 276-284.

Chaplin, M. F. and Bucke, C. 1990. Enzyme Technology. Cambridge University Press,

p. 139-143, Cambridge-Great Britain.

154

Çetin, E. T. (edt.). 1983. Endüstriyel Mikrobiyoloji, 1. baskı. İstanbul Tıp Fakültesi

Vakfı-BAYDA Yayını, Fatih Gençlik Vakfı Matbaa İşletmesi, s.147.

Çizmeci, M., Musavi, A., Kayahan, M. and Tekin, A. 2005. Monitoring of Hydrogenation with Various Catalyst Ratios. J. Amer. Oil Chem. Soc., 82; 925-929. Fernández-Espinar, M.T., Esteve-Zarzoso, B., Querol, A. and Barrio, E. 2000. RFLP analysis of the ribosomal internal transcribed spacers and the 5.8S rRNA gene region of the genus Saccharomyces : a fast method for species identification and the differentiation of flor yeasts. Antonie van Leeuwenhoek, 78; 87-97.

Gandhi, N.N. 1997. Review: Applications of Lipase. Journal of American Chemist’s

Society, 74; 621-634.

Gillis, A. 1988. Research discovers new roles for lipases. J. Am. Oil Chem. Soc., 65;

846-850.

Hemachander, C. and Puvanakrishnan, R. 2000. Lipase from Ralstonia pickettiias an

additive in laundry detergent formulations. Process Biochemistry, 35; 809-

814.

Hung, T., Gridhar, R., Chiou, S. and Wu., W. 2003. Binary immobilization of Candida

rugosa lipase on chitosan. J. Mol. Catal. B : Enzymatic, 26; 69-78.

Kirk, O., Borchert, T. V. and Fuglsang, C.C. 2002. Industrial enzyme applications.

Current Opinion in Biotechnology,13; 345-351.

Kumar, C. G., Malik, R. K. and Tiwari, M. P. 1998. Novel enzyme-based detergents:

An Indian perspective. Indian Institute of Science Issue, 75; 1312-1318.

Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature, 227; 680-685.

López, E., Deive, F. J., Longo, M. A. and Sanromán, M. A. November 15-18, 2005.

Effect of inducers on lipase production by Rhizopus oryzae, 10 th

Mediterranean Congress of Chemical Engineering, Barcelona Spain.

Maurer, K. 2004. Detergent Proteases. Current Opinion in Biotechnology 15; 330-

334.

Mitidieri S., Martinelli, A. H. S., Schrank, A. and Vainstein, M. H. 2006. Enzymatic

detergent formulation containing amylase from Aspergillus niger: A

comperative study with commercial detergent formulations. Biosource

Technology, 97; 1217-1224.

155

Moon, S.H. and Parulekar, S. J. 1991. A parametric study of protease production in

batch and fed-batch cultures of Bacillus firmus, Biotechnol. Bioeng., 37; 467-

483.

Pandey, A., Benjamin, S., Soccol, C. R., Nigam, P., Krieger, N. and Soccol, V.T. 1999.

Review: The realm of microbial lipases in biotechnology. Biotecnol. Appl.

Biochem., 29; 119-131.

Paškevičius, A. 2001. Lipase activity of yeasts and yeast-like fungi functioning under

natural conditions. Biologija, 4; 16–18.

Saxena, R.K., Ghosh, P.K., Gupta, R., Davidson, W.S., Bradoo, S. and Gulati, R. 1999.

Microbial Lipases: Potential Biocatalysts for the future industry. Curr. Sci.,

77; 101-115.

Saxena, R.K., Sheoran, A., Giri, B. and Davidson, W. S., 2003. Purification strategies

for microbial lipases. Journal of Microbiological Methods, 52; 1-18.

Schmid, R.D. and Verger, R. 1998. Lipases : Interfacial Enzymes with Attractive

Applications. Angew. Chem. Int. Ed., 37; 1608-1633.

Sharma, R., Chisti, Y. and Banerjee, U.C. 2001. Research review paper: Production,

purification, characterization, and applications of lipases. Biotechnology

Advances, 19; 627-662.

Sharon, C., Nakazato, M., Ogawa, H. and Kato, Y. 1998. Lipase-induced hydrolysis of

castor oil: effect of various metals. Journal of Industrial Microbiology &

Biotechnology, 21; 292-295.

Shirazi, S.H., Rahman, S. R. and Rahman, M.M. 1998. Short communication:

Production of extracellular lipases by Saccharomyces cerevisiae. World

Journal of Microbiology&Biotechnology, 14; 595-597.

Svendsen, A. 2000. Review: Lipase protein engineering. Biochimica et

Biophysica Acta , 1543, 223-238.

Starace, C. A. 1983. Detergent Enzymes-Past, Present and Future. J. Am. Oil Chem.

Soc., 60; 1025-1027.

Şenelt, S. 1982. Natürel ve rafine ayçiçek yağlarının yağ asitleri bileşiminin gaz

kromatografik analiz yöntemi ile aydınlatılması ve rafinasyonun yağ asitleri

156

bileşimi üzerine etkisinin incelenmesi. Yüksek Lisans Tezi. Ankara

Üniversitesi Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı, Ankara.

Takashi, S., Takashima, M., Shinoda, T., Suto, H., Unno, T., Tsuboi, R., Ogawa, H. and

Nishikawa A. 2002. New Yeast Species, Mallassezia dermatis, Isolated from

Patients with Atopic Dermatitis. Journal of Clinical Microbiology, 40; 1363-

1367.

Telefoncu, A. 1997. Enzimoloji Lisansüstü Yaz Okulu, Ege Üniversitesi Fen Fakültesi

Baskısı, s. 249-306, Kuşadası-Türkiye.

Wei, D., Zhang, D. and Song., Q. 2004. Studies on a novel carbon source and

cosolvent for lipase production for Candida rugosa. J. Ind. Microbiol.

Biotechnol., 31; 133-136.

Ünlü, A. E. 2004. Candida rugosa lipazının özellikleri ve enantiyoseçimliliğinin

artırılması. Seminer. Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı,

Ankara.

157

EKLER

EK 1 Deneylerde Kullanılan Kimyasal ve Biyokimyasal Maddeler

EK 2 Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Bileşenleri

EK 3 Spektrofotometrik Lipaz Aktivitesi Örnek Hesabı

EK 4 Titrimetrik Lipaz Aktivitesi Örnek Hesabı

EK 5 Proteaz Kalibrasyon Grafiği

EK 6 Proteaz Aktivitesi Örnek Hesabı

EK 7 Kuru Hücre Kalibrasyon Grafiği

EK 8 Protein (BSA) Kalibrasyon Grafiği

EK 9 Bitkisel Yağların Yağ Asitleri Analizi

EK 10 5.8S rRNA ve 26S rRNA Analizi

EK 11 BLAST Sonuçları

158

EK 1 Deneylerde Kullanılan Kimyasal ve Biyokimyasal Maddeler

Kimyasal / Biyokimyasal Madde Firma Katalog No

Agar Scharlau 07-004

Agaroz Merck 1.12239

Akrilamid Bio-Rad 161-0148

α-Amilaz Sigma A6380

Amonyum persülfat Bio-Rad 161-0700

Amonyum sülfat Sigma A4915

Asetik asit Merck 1.00063

Aseton Merck 1.00013

Brillant Blue G Sigma B0770

BSA Sigma A9647

Çinko klorür Merck 1.08816

D-(+)-glukoz monohidrat AppliChem A1343

DNA izolasyon kiti NucleoSpin Tissue 740952.50

Macherey-Nagel

EDTA Sigma E9884

Etanol Merck 1.11727

Fosforik asit Merck 1.00573

Gliserol Sigma G5516

Gümüş boyama kiti Bio-Rad 161-0449

(Silver Stain Plus)

Hidrojen peroksit Merck 1.08597

Hidroklorik asit Merck 1.00314

Kalsiyum klorür dihidrat AppliChem A4689

Kazein Sigma C5890

Linoleik Asit Sigma L1376

Litikaz (Arthobacter luteus’tan) Sigma L2524

Lityum klorür Merck 1.05679

L-arjinin Merck 1.01542

159

EK 1 (devam)

L-lizin monohidrat Merck 1.12233

Magnezyum klorür hegzahidrat Fluka 63065

Magnezyum sülfat heptahidrat Merck 1.05886

Malt özütü Scharlau 07-080

Marker Fermantas SM1811

Marker Invitrogen 10747-012

Maya özütü Scharlau 07-079

Oleik asit Sigma O1630

Palmitik asit Sigma P5585

Pepton Fluka 70171

Penisilin G kristalize potasyum İ.E. Ulagay ilaç Sanayi T.A.Ş.

Potasyum klorür Scharlau PO0200

Potasyum sülfat Merck 1.05153

p-nitrofenil palmitat Sigma N2752

Proteaz Sigma P5380

SDS AppliChem A2263

Sitrik asit monohidrat Merck M0242

Sodyum fosfat dibazik Fluka 71649

dodekahidrat

Sodyum hidroksit AppliChem A1551

Sodyum karbonat Scharlau SO0116

Sodyum klorür AppliChem A2942

Sodyum sülfat Merck 1.06643

Sodyum tetraborat dekahidrat Sigma S9640

Stearik asit Sigma S4751

TCA Merck 1.00810

TEMED Bio-Rad 161-0801

Triasetin Sigma T5376

Tribütirin Sigma T8626

Tristearin Sigma T5016

160

EK 1 (devam)

Trioktanoin Sigma T9126

Triolein Sigma T7752

Tripalmitin Sigma T5888

Triton X-100 Sigma T8787

Trisma-baz Sigma T6066

Üre Merck 1.08488

161

EK 2 Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Bileşenleri

Bileşenler Miktar

Damıtık su 37.7 µl, 36.7 µl , 35.7 µl

10x PCR Tamponu 5 µl

dNTP Karışımı 1 µl

Primer Karışımı 1 µl

MgCl2 (1 mM, 1.5 mM, 2mM) 2 µl , 3 µl , 4 µl

Taq DNA Polimeraz 0.3 µl

DNA Kalıp 2 µl

Toplam Miktar 50 µl

162

EK 3 Spektrofotometrik Aktivite Örnek Hesabı

PNFP + H2O lipaz PNF + palmitik asit

Bir ünite enzim (U), bir dakikada 1 µmol PNF açığa çıkarmak için gerekli enzim

miktarı olarak tanımlanmıştır.

Monokromatik ışın demetleri için geçerli olan Lambert-Beer Kanununa göre;

A = ε b C

∆A = ε b ∆C ( b = 1 cm, ε = 13290 L/mol.cm )

Burada ε, PNF’nin farklı derişimlerinin 404 nm’de absorbansları okunarak

oluşturulmuş (A-bC) grafiğinin eğiminden bulunmuştur.

Lambert-Beer denklemi aktivite tanımı için kullanılırsa :

TVLml

molmolcm

cmmolL

t1.

110.

101.1.

.13290

3

6 µ=

∆∆Α

∆t ( reaksiyon süresi ) = 5 dakika

VT ( toplam çözelti hacmi ) = 4 ml

mlLml

molmolcm

cmmolL

dk 41.

110.

101.1.

.13290

5

3

6 µ=

∆Α

moldk µ4.1013290

5 3=∆Α

=∆Α

dkmolµ.

13290.54.10. 3

Ünite

163

=∆Αdkmolµ.06,0. Ünite

Örnek hacmi 1 ml olduğu için Ünite = Ünite/ml’dir.

164

EK 4 Titrimetrik Aktivite Örnek Hesabı

Yağ asit esteri + H2O lipaz yağ asidi + gliserol

Bir ünite enzim (U), bir dakikada 1 µmol yağ asidi açığa çıkaran enzim miktarı olarak

tanımlanmıştır.

U/ml enzim = dkmlörnek

NaOHmlkörmlörnek NaOHharcananharcanan

30*),(1*1000*][*),,( )(−

U/ml enzim = dkml

Nmlkörmlörnek NaOHharcananharcanan

30*)1.0(

1*1000*)1.0(*),,( )(−

165

EK 5 Proteaz Kalibrasyon Grafiği

y = 0.7705xR2 = 0.9884

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

0 0.5 1 1.5 2 2.5

Tirozin Derişimi

Abs

orba

ns (

275

nm )

166

EK 6 Proteaz Aktivitesi Örnek Hesabı

Bir ünite enzim (U), bir dakikada 4 nmol tirozin açığa çıkaran enzim miktarı olarak

tanımlanmıştır.

U/ml enzim = (tirozin derişimi, µmol/ml) * F * (1000 nmol)

4 * 20 dk * 1 µmol

F= seyreltme faktörü=1

U/ml enzim = ((Absorbans / 0.7705 µmol) / (1 ml enzim)) * F * 1000 nmol)

4 * 20 dk * 1 µmol

U/ml enzim = Absorbans * 16.22

167

EK 7 Kuru Hücre Kalibrasyon Grafiği

y = 0.5724xR2 = 0.9967

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Hücre derişimi, mg/ml

Abs

orba

ns (

600

nm )

168

EK 8 Protein (BSA) Kalibrasyon Grafiği

153

EK 9 Bitkisel Yağların Yağ Asitleri Analizi Esterleştirme Metodu (Anonymus 1987) Gaz Kromatografisi : ThermoQuest 2000 Dedektör : FID Kolon : Fused Silica Kapillar Kolon Teknoroma TRB-WaxOmega (30 mX0.25 mm I.D. ve 0.25 µm film kalınlığı) Taşıyıcı Gaz : He, 80 kPa Split Oranı : 1:85 Enjeksiyon Bloğu : 250oC

Kolon : 205oC Dedektör : 250oC

Palmitik

Asit

C16:0

Palmitoleik

Asit

C16:1

Stearik

Asit

C18:0

Oleik

Asit

C18:1

Linoleik

Asit

C18:2

Linolenik

Asit

C18:3

Araşidik

Asit

C20:0

Gadoleik

Asit

C20:1

Behenik

Asit

C22:0

Susam yağı (1) 7.163 0.130 3.733 31.716 55.733 0.065 0.333 0.209 0.918

Susam yağı (2) 5.959 0.108 3.632 35.995 53.032 0.115 0.297 0.189 0.673

Ayçiçek yağı 6.024 0.086 3.388 26.157 63.335 0.075 0.143 0.128 0.663

Soya yağı 13.798 0.136 3.396 25.059 51.208 5.623 0.313 0.248 0.219

Mısır yağı 12.199 0.172 1.822 27.679 56.777 0.859 0.296 0.194 0.002

Zeytin yağı 12.312 0.815 2.698 73.383 9.207 0.638 0.454 0.325 0.168

Keten yağı 6.348 0.130 4.234 18.851 14.540 55.035 0.166 0.243 0.453

Fındık yağı 5.789 0.221 2.448 78.273 13.150 0.119 0.000 0.000 0.000

154

EK 10 5.8S rRNA ve 26S rRNA ANALİZLERİ

PCR Optimizasyonu :

DNA Sekans Analiz Sonuçları :

F1R1-50-F TTGCCAGCGCTTAATTGCGCGGCGAAAAAACCTTACACACAGTGTTTTTTGTTGATGTACAAGAACTTTTGCTTTGGTCTGGACTAGAAATAGTGTTGGGCCAGAGGTTTACTGAACTAAACTTCAATA F1R1-50-R TCTTGAATTTAATCAACAAATTGACAATTAAATAAATAACAATTACAATATAAATATTGAAGTGTAGTTCAGTAAACCTCTGGCCCAAACTATTTCTAGTCCAGACCAAAGCAAAAGTTCTTGTAATAACAAAAAACACTTGTGTGGTAAGGTTTTTTCGCCGCGCAATTAAGCGCTAGGCAAAAAGAAT F1R1-55-F AAACCTTACACACAGTGTTTTTTGTTATTACAAGAACTTTTGCTTTGGTCTGGACTAGAAATAGTTTGGGCCAGAGGTTTACTGAACTAAACTTCAATATTTATATTGAATTGTTATTTATTTAATTGTCAATTTGTTGATTAAATTCAAAAAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCT CTTGG

50oC 55oC 60oC F1R1 F2R2 F1R1 F2R2 F1R1 F2R2 1 1.5 2 1 1.5 2 1 1.5 2 1 1.5 2 1 1.5 2 1 1.5 2

155

F1R1-55-R GAATTTAATCAACAAATTGACAATTAAATAAATAACAATTCAATATAAATATTGAAGTTTAGTTCAGTAAACCTCTGGCCCAAACTATTTCTAGTCCAGACCAAA F1R1-60-F GCGCGGCGAAAAAACCTTACACACAGTGTTTTTTGTGTATTACAAGAACTTGTTGCTTTGGTCTGGACTAGAAATAGTTTGGGCCAGAGGTTTACTGAACTAAACTTCAATATGTTATAT TGAATTGTTATTTATTGTAATTGTCAATTTGGTGTGATTAAATTCAAAAAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGGATCTCT F1R1-60-R GAATTTAATCAACAAATTGGACAATTGAAATAAATAACAATGTCAATATAAATATTGAAGTGTTAGTTCAGGTAAACCTCTGGCCCAAACTATTTCTAGTCCAGACCAAAGCAAAAGTTCTTGTAATAACAAAAAACACTGTGTGTAAGGTTTTT

F2R2-50-F CGGCGAGTGAAGCGGCAAATAGCTCAAATTTGAAATCTTGGCACCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTAACTTTGGAGTGGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGCCCAATTCTATGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATA TTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTGGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATGGTTGCGATCCTTTCCTTCTTGGTTGGGTTCCTCCCAGCTTACTGGGCCATCATCGGTATGGATGGTAGGATAATGACTAAGGAATGTGGCTCTACTTC F2R2-50-R GGTCTAGACAGGCAGTATGCAACCAAGGCTATAACACTCCACCGAAGTAGAGCCACATTCCTTAGTCATTATCCTACCATCCAAACCGATGCTGGCCCAGTAAGCTGCGAGGAACCCAACCAAGAAGGAAAGGATCGCAAAATACCAAGTCTGATCTCAAGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTAGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTCGAAAGCACTTTACATAGAATTGGGCATCTCATCGCACGGGATTCTCACCCTCTGTGACGTCCTGTTCCAAGGAACATAGACAAGGAGCCAACTCCAAAGTTACCTTCTTCAAATTACAACTCGGACACCGAAGGTGCCA

156

F2R2-55-F AAGCGGCAAAAGCTCAAATGTNGAAATCTGGCACCTTCGGTGTGCCGAGTTGTAATTTGGAAGAAGGTAACTTTGGAGTGTGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTGCACAGAGGGTGAGAATGCCCGTGCGATGGAGATGCCCA F2R2-55-R ACAGGCAGTATCAACCAAGGCTATAACACTCCACCGAAGTAGAGCCACATTCCTTAGTCATTATCCTACCATCCAAACCGATGCTGGCCCAGTAAGCTGCGAGGAACCCAACCAAGAAGGAAAGGATCGCAAAATACCAAGTCTGATCTCAAGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATGTTGACCAGCCCACTTAGGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTCGAAAGCACTTTACATAGAATTGGGCATCTCATCGCACGGGATTCTCACCCTCTGTGACGTCCTGTTCCAAGGAACATAGACAAGAGCCAACTCCAAAGTTACCTTCTTCAAATCACAACTCGGACACCGAAGGTGCCAAATCTCAAAT F2R2-60-F TAACGGCGAGTGAAGCGGCAAATAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACCTTCGGTGTCCGAGGTTGTAATTTGAAGAAGGTAACTTTGGAGTTGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGCCCAATTCTAGTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGCGATCCTTTCCTTCTTGGTTGGGTTCCTCGCAGCTTACTGGGCCANCATCGGTTTGGATGGTAGGATAATGACTAAGGAATGTGGCTCTACTTCGGTGGAGTGTTATACCCTTGGTTGATACTGCCTGTCTAGACCGAGGACTGCGTCTTTTGACTAGGATGTGGGCATAATGATC F2R2-60-R AAAGACGCAGTCCTCGGTCTAGACAGGCAGTATCAACCAAGGCTATAACACTCCACCGAAGTAGAGCCACATTCCTTAGTCATTATCCTACCATCCAAACCGATGCTGGCCCAGTAAGCTGCGAGGAACCCAACCAAGAAGGAAAGGATCGCAAAATACCAAGTCTGATCTCAAGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTGTAGTGGAATTTACCACCCACTTAGAGCTGCATGTCCCAAACAACTCGACTCTTCGAAAGCACTTTACATAGGAATGTGGGCATCTCATCGCACGGGATGTCTCACCCTCTGTGACGTCCTGTTCCAAGGAACATAGACAAGAGCCAACTCCAAAGTTACCTTCTTCAAATCACAACTCGGACACCGAAGGTGCCAGATGTTCAAATGTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGT

157

EK 11 BLAST Sonuçları F1R1-55-F

158

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı : Banu Şükran ŞENGEL

Doğum Yeri : İzmir

Doğum Tarihi : 04.03.1981

Medeni Hali : Bekar

Yabancı Dili : İngilizce

Eğitim Durumu

Lise : Çankaya Yabancı Dil Ağırlıklı Lise, 1999

Lisans : Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi

Kimya Mühendisliği Bölümü, 2004

Yüksek Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü

Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı, 2007

Yayınları

Şengel, B., Takaç, S., Dönmez, G. 5-8/09/2006. Mikrobiyal Kaynaklı Lipaz

Üretimine Karbon Kaynağı Olarak Bitkisel Yağların ve Glukozun Etkisi, 7. Ulusal

Kimya Mühendisliği Kongresi Bildiri Özetleri Kitabı, BT28.

Documents

ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/eng/browse/24090/banu sukran.pdfBradford yöntemi ile ölçülmüştür. Hücre içi lipaz aktiviteleri