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ANÁLISIS DE LA INFECCIÓN DE VELLOSIDADES AISLADAS DE RATÓN LACTANTE POR EL ROTAVIRUS HOMÓLOGO

ECwt LUEGO DE CHOQUE TÉRMICO

Manuel Ricardo García A1; Carlos A Guerrero F2 Resumen Los rotavirus son agentes infecciosos capaces de causar enfermedades del tracto gastrointestinal en el hombre y animales de interés económico como porcinos, bovinos y aves. Los rotavirus son capaces de transmitirse entre el hombre y los animales, además que su incidencia en las poblaciones humanas no depende estrictamente de las condiciones de higiene. La proteína Hsc70 se localiza en la membrana citoplasmática y está implicada como receptor rotaviral en las líneas celulares MA104 y en las células intestinales aisladas de ratón lactante, es probable que al someter las células al choque térmico se aumente su expresión a nivel de membrana y esto se correlacione con un aumento en la infección. Este trabajo buscó analizar la infección de vellosidades aisladas de ratón lactante por el virus ECwt luego del choque térmico. Encontramos que los enterocitos de las vellosidades aisladas del intestino de ratón se mantienen viables por encima del 90% en condiciones de choque térmico e infección; Los niveles de la proteína Hsc70 a nivel de membrana y citoplasmática aumentan aproximadamente 5 veces cuando se someten los enterocitos a choque térmico. Al comparar la infección evaluando los antígenos virales, en células con y sin choque térmico se encontró que no hay diferencias. Sin embargo, al evaluar la producción de viriones infecciosos re-infectando vellosidades con el lisado procedente de células infectadas con y sin choque, se encontró mayor número de viriones en las vellosidades que previamente habían recibido choque térmico, en especial al evaluar a las 4 y 8 h.p.i. Esto sugiere que las proteínas relacionadas con el choque térmico favorecen el ensamblaje de viriones. La proteína Hsp70 no se expresa a nivel de membrana, pero el choque térmico aumenta su expresión entre 40 y 60 veces a nivel membranal y citoplasmático respectivamente. La infección por rotavirus aumenta 15 veces la cantidad de células que expresan la proteína, aunque no hubo un aumentó por encima de estos niveles cuando ambos tratamientos se combinaron. Abstract Rotaviruses are infectious agents capable of causing diseases of the gastrointestinal tract in humans and animals of economic interest as pigs, cattle and poultry. Rotavirus is capable of transmission between humans and animals, in addition to its impact on the human population does not depend strictly hygienic conditions. The Hsc70 protein is localized in the cytoplasmic membrane and is implicated as rotavirus receptor in cell lines MA104 and intestinal cells isolated from suckling mouse, is likely to subject the cells to heat shock expression is increased level of membrane and this correlated with increased infection. This study sought to analyze the infection of suckling mouse-isolated villi by ECWT virus after heat shock. We found that the enterocytes of the intestinal villi isolated mouse remains viable above 90% under thermal shockand infection; Levels HSC70 level and

1 Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias Básicas, Bogotá. 2 Departamento de Ciencias Fisiológicas, Facultad de medicina, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá.

Correspondencia a: Carlos A. Guerrero MD, MSc, PhD. Profesor de Medicina, Departamento de Ciencias

Fisiológicas, Facultad of Medicina, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia. Dirección: Carrera 45 #

26-85, Bogotá D.C. caguerrerof@unal.edu.co. Teléfono: -3165000 Ext. 15052

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cytoplasmic membrane increases about 5-fold when enterocytes are heat shock. Comparing evaluating infection viral antigens in cells with and without heat shock found no differences. However, in assessing the production of infectious virions re-infecting villi with the lysate from infected cells with and without shock, as many virions was found in the villi had previously received thermal shock, especially when evaluating the 4 and 8 hpi. This suggests that proteins related to the heat shock favor virion assembly. Hsp70 protein is not expressed at membrane level, but the thermal shock increases expression between 40 and 60 times respectively membrane and cytoplasmic level. Rotavirus infection increases 15 times the amount of cells expressing the protein, although there was no increased above these levels when both treatments were combined. Palabras claves: vellosidades, ratón, rotavirus, ECwt, humanos y animales. Key words villi, mouse, rotavirus, ECwt, humans and animals. Introducción

La diarrea es una de las enfermedades infantiles más comunes tanto en naciones desarrolladas como en vías de desarrollo. Una de las causas es infección por rotavirus cuya transmisión es oral-fecal. Esta afección gastrointestinal está diseminada en todo el mundo principalmente durante los dos primeros años de vida. Una estrategia optima para el manejo de la diarrea infantil consiste en la terapia de rehidratación oral, correcta alimentación, no uso de antidiarreicos y cuidados adecuados por parte de la madre o cuidador del paciente. La sintomatología comienza con vómito seguido por la diarrea acuosa, esta puede ser blanda y de corta duración o severa con deshidratación secundaria. Son frecuentes la fiebre y el dolor abdominal. El vómito y la fiebre cesan durante los 2 a 3 días iniciales de la enfermedad y la diarrea suele persistir durante 4 ó 5 días. Las infecciones tienden a ser más severas en niños entre 3 y 24 meses de edad, asimismo los niños infectados por rotavirus durante los 3 primeros meses de edad suelen ser asintomáticos probablemente debido a los anticuerpos maternos. De igual manera las personas con infecciones repetidas pueden ser asintomáticas o presentar síntomas leves debido a la inmunidad adquirida por infecciones anteriores (Desselberger & Gray, 2005; OPS, 2007)

El virus conserva su patogenicidad y viabilidad por horas e incluso días en manos y superficies sólidas, de manera que las manos, juguetes e incluso alimentos contaminados pueden actuar como medios para la diseminación del virus. La excreción aproximada de 108 a 1011 partículas por gramo de heces, su permanencia en el agua potable y recreativa, la incapacidad de los desinfectantes de contacto y jabones para mano para remover eficientemente la carga viral infectiva de superficies, la infección cruzada con animales, y la excreción de virus en heces incluso antes de que comiencen los síntomas de diarrea, hace que los rotavirus se conviertan en un agente que afecta todos los estratos sociales y esté ampliamente distribuido en el mundo (Vasickova et al., 2005)

Las infecciones predominan en invierno en países templados, mientras que en los países tropicales las afecciones suelen ocurrir durante todo el año con probables picos mayores durante la época de lluvia (OPS, 2007). En general, los genotipos más frecuentemente identificados en Bogotá, Cali y Barranquilla fueron G3 [P8] (32,7%), G2P [4] (21,1%) y G1P [8] (19,1%) además de algunos genotipos mixtos en 8,5% de las muestras (Cáceres et al., 2006)

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Los rotavirus conforman el género Rotavirus dentro de la familia Reoviridae, se caracterizan por (i) tener partículas maduras de 100nm de diámetro con tres capas concéntricas de proteína icosahédrica, (ii) 60 espículas proteicas que se proyectan de la capa externa, (iii) requerimientos de calcio para mantener la integridad estructural de la capa externa, (iv) presencia de RNA polimerasa dependiente de RNA y otras enzimas capaces de producir transcritos (v) genoma de 11 segmentos de RNA doble cadena, (vi) posible recombinación genética entre virus del mismo grupo, (vii) la replicación viral se lleva a cabo en el citoplasma, (viii) el clivaje del polipéptido de las espículas de la cápside mejora la infectividad in vitro (ix) las partículas virales se forman mediante gemación a través del retículo endoplasmático para producir partículas con envoltura, la cual se pierde posteriormente antes de ser liberadas por lisis o transporte vesicular no clásico en células epiteliales polarizadas. El nombre rotavirus se refiere a que las partículas icosahédricas parecen ruedas con sus espículas a modo de radios en una rueda, existen como TLPs (con sus tres capas intactas) y DLPs sin la más externa, por lo que estos son incapaces de una infección exitosa dado que carecen de los dominios con receptores celulares (Estes & Kapikian, 2007).

Existen 7 grupos de rotavirus (A a la G) de los cuales A, B y C infectan animales y humanos por

igual mientras que los demás sólo se han reportado en animales, a pesar de la capacidad que tienen estos agentes infecciosos de reorganización genómica entre cepas relacionadas. Los rotavirus del grupo A son los causantes de episodios diarreicos en niños y en crías de mamíferos y aves, el grupo B agrupa a agentes causantes de epidemias de diarrea severa en adultos chinos, y por último están los del grupo C que son detectables esporádicamente en las heces de niños durante epidemias familiares (Estes & Kapikian, 2007) Los rotavirus hacen uso de por lo menos dos receptores distintos para interactuar con sus células hospederas, los de adhesión que le permiten unirse a la superficie celular, y los de entrada que permiten la internalización de las partículas virales para iniciar el ciclo replicativo. Estos últimos también reciben el nombre de co-receptores, de posteriores a la unión, fusión o de entrada (López & Arias, 2004; López & Arias, 2006)

El proceso de entrada de los rotavirus a la célula es poco conocido y aunque podría darse por penetración directa mediada por la proteína VP5* (Denisova et al., 1999), la entrada por medio de endosomas le permite desprenderse de este por la baja concentración de Ca2+ en los compartimentos endosómicos antes de ser llevados a lisosomas para la pérdida de la primera capa y conversión en DLP. La liberación de esta DLP transcripcionalmente activa en el citoplasma genera una producción de transcritos mRNA (+) a través de los canales de las vértices de la cápside.

La familia de proteínas denominadas genéricamente como proteínas de choque térmico o HSPs (por

sus siglas en ingles “Heat Shock Proteins”) ayuda en el plegamiento, transporte y ensamble de otras proteínas, por lo cual se les conoce como chaperonas. La proteína “Heat Shock Protein Cognate” Hsc70 pertenece a la familia de proteínas de 70 kDa (HSP’s70) y se identificó primero en células sometidas a estrés, aunque posteriormente se encontró también en células no estresadas. Está compuesta de dos dominios principales: un dominio de ATPasa que tiene una estructura terciaria similar a la actina (Flaherty, et al. 1990) y un dominio carboxi – terminal que tiene una estructura secundaria similar al dominio de unión a péptidos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) de clase I. (Becker & Craig, 1994; Bruce & Churchich, 1997; Kiang & Tsokos, 1998; Daugaard et al., 2007)

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Las principales funciones que se han descrito para Hsc70 son citoplasmáticas y se desconoce aún cómo esta proteína se transporta y se ancla en la membrana citoplasmática. Se ha encontrado por citometría de flujo e inmunofluorescencia, que la proteína Hsc70 está en la superficie de la membrana citoplasmática de algunas líneas celulares y células tumorales, así como en células normales luego de someterlas a choque térmico. Entre las funciones básicas se encuentra la solubilización de agregados proteicos denaturados, restauración de la estructura/ función proteica luego del estrés térmico y eliminación de proteínas irreparables a proteasomas u organelos de degradación (Becker & Craig, 1994; Bruce & Churchich, 1997; Kiang & Tsokos, 1998; Daugaard et al., 2007)

Estudios realizados sugieren que durante el proceso de entrada de múltiples pasos del Rotavirus a la célula, la partícula viral además de utilizar las proteínas de la cápside externa VP4 y VP7 también utiliza la proteína VP6 la cual se une a moléculas receptoras como Hsc70. Probablemente en cada interacción se inducen cambios conformacionales en las proteínas del virión y en las proteínas receptoras exponiendo diferentes dominios de VP4, VP7 y VP6, lo cual facilita la entrada del virus a la célula (Guerrero et al., 2002; Gualtero, et al., 2007). Partimos del raciocinio que la proteína HSC70 se localiza en la membrana citoplasmática y está implicada como receptor rotaviral en las líneas celulares MA104 y en las células intestinales aisladas de ratón lactante, es probable que al someter las células al choque térmico se aumente su expresión a nivel de membrana y esto se correlacione con un aumento en la infección. Por esta razón este trabajo busca analizar la infección de vellosidades aisladas de ratón lactante por el virus ECwt luego del choque térmico. Para esto, determinamos la viabilidad de las células aisladas del intestino delgado de ratón lactante. Evaluamos la expresión de antígenos virales en diferentes tiempos post-infección con el virus ECwt en vellosidades aisladas sometidas a choque térmico y evaluamos la expresión de la proteína Hsc70 en la membrana citoplasmática luego de someter las células aisladas de ratón lactante al choque térmico

MATERIALES Y MÉTODOS

Diseño experimental El primer factor de diseño es la infección de los enterocitos de ratón con el rotavirus homólogo

silvestre ECwt, los niveles de este factor son infectados y no infectado. El segundo factor de diseño es el choque térmico de los enterocitos aislados, los niveles de este factor son con choque y sin choque. Se combinarán todos estos niveles así: choque térmico no infectado (Ch NI), sin choque térmico infectado (NCh Inf) y con choque térmico e infectadas (S Inf).

Sujetos experimentales, virus y anticuerpos Los sujetos experimentales fueron ratones lactantes cepa ICR de 10 a 12 días, obtenidos de Instituto

Nacional de Salud, sin distinción de sexos para mantener las condiciones aleatorias que podrían surgir in vivo. La cepa homóloga ECwt (EDIM CAMBRIDGE Wildtype) P17 G3 se obtuvo como donación del Dr. Harry Greenberg del Stanford University, a partir de una muestra proporcionada por el Dr. Manuel Franco del Instituto de Genética de la Pontificia Universidad Javeriana. También se utilizó la cepa heteróloga RRV (rotavirus de simio Rhesus) donada por el Dr Carlos Arias del Instituto de Biotecnología de la UNAM, México. Los dos virus fueron replicados en el laboratorio de Biología Molecular de Virus de la unidad de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia.

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Para todos los ensayos se agregaron los rotavirus RRV (MOI de 9) y ECwt (MOI de 5), previamente activados con tripsina (1μg/ml) durante 30 minutos a 37 OC. Para la infección se utilizó una dilución 1:1 v/v de RRV (cuyo título en células MA104 fue de 4.3 X106 UFF/ml). El rotavirus ECwt se tituló en cultivo de vellosidades y se usó en dilución 1:10 v:v (título aproximado de 8 x 106 UFF/ml, titulado en vellosidades aisladas). Como control de especificidad viral se utilizó el virus denominado Reovirus, que pertenece a la misma familia de rotavirus (Reoviridae), también produce diarrea, aunque los síntomas son leves, respecto a rotavirus, pero el mecanismo de infección es diferente. Obtención de enterocitos separados de las vellosidades Esta metodología fue probada para intentar obtener una mayor cantidad de células a partir del intestino de ratón y para ver qué tan factible podría resultar el trabajo con los enterocitos de forma individual, lo cual podría facilitar el conteo con inmunocitoquímica y además establecer cómo responden las células a la separación entre sí. Para aislar enterocitos del intestino delgado se siguió una metodología descrita por varios autores (Weiser, 1973; Whitt & Savage, 1988, Simmy et al., 2001. Santana 2009). El proceso se llevó a cabo en cabina de flujo laminar bajo condiciones de esterilidad. Luego de sacrificar los animales por dislocación cervical (Beaver et al, 2001), la piel del abdomen se limpió con alcohol y se cortó de forma longitudinal. Se ubicó el píloro y se cortó el extremo distal del intestino delgado, se extrajo y se mantuvo en Medio Esencial Mínimo EAGLE modificado (MEM). Se puso una jeringa por el extremo más ancho (duodeno) y se lavó con 5 ml de medio de cultivo con antibiótico y antimicótico (Kanamicina: 100µg/ml, Ampicilina: 100µg/ml y Anfotericina B: 2,5 µg/ml). Para obtener enterocitos aislados de las vellosidades, el intestino se lavó con 5 ml de medio con antibiótico y EDTA 3 mM. El intestino se cortó en forma longitudinal, luego se cortó en fragmentos de más o menos 0.5 cm, en una caja de Petri con 7 ml de medio de cultivo que contenía EDTA 3 mM, Ditiotreitol (DTT) 1mM y antibiótico. Los fragmentos se recuperaron en un tubo de centrífuga de 15 ml y se incubó por 30 minutos a 37 oC con agitaciones de 400 rpm. Obtención de vellosidades intestinales

Para obtener las vellosidades completas, se siguió la metodología estandarizada en el laboratorio (Santana 2009). Para esto, se sacrificó el ratón lactante, se extrajo el intestino, se lavó con 5 ml de medio de cultivo con antibiótico y EDTA 1,5 mM. El intestino se cortó en forma longitudinal, luego se cortó en fragmentos de más o menos 0.5 cm, en una caja de Petri con 7 ml de medio de cultivo que contenía EDTA 1,5 mM y antibiótico. Los fragmentos se recuperaron en un tubo de centrífuga de 15 ml y se incubó por 15 minutos a 37 oC con agitaciones de 400 rpm. Con una punta de micropipeta de 1 ml cortada en el extremo terminal, se disgregó dentro de cada tubo las células, luego se pasaron, con la misma punta, por una malla estéril (1mm2 de poro) que estaba sobre una caja de Petri. Los fragmentos que no pasaron nuevamente se colocaron en el tubo de centrífuga con 5 ml de medio con EDTA 1,5 mM y antibiótico, realizando una segunda extracción bajo las mismas condiciones. Las vellosidades que pasaron el poro de la malla la primera vez se recuperan y se mezclan con la segunda extracción. La mezcla se centrifugó durante 10 minutos a 3000rpm para retirar el medio con EDTA. Se descartó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió en 5 ml de medio con antibiótico para lavarlos. El procedimiento se repitió tres veces. Las células obtenidas se mantuvieron en medio de cultivo sin EDTA a 4 OC hasta realizar la infección con los rotavirus.

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Viabilidad por Medio de Tinción con Azul de Tripán Para determinar la viabilidad de los enterocitos aislados de las vellosidades o de las vellosidades integras aisladas del intestino, en función de la integridad membranal, se realizó la técnica con azul de tripán. El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan ruptura en la membrana. Se usó Azul de Tripán 93595 (Sigma Aldrich) en solución para microscopía. Se puso Azul de Tripán y vellosidades intestinales o enterocitos aislados de las vellosidades, en proporción 1:1 por 1 minuto y se contaron las células sin teñir (viables) y células de color azul (no viables) en 10 campos representativos para cada uno de los tiempos post-extracción. Esta metodología se aplicó a las células utilizadas en todos los experimentos que se describen en este trabajo. Tinción Celular con Hoechst 33342 (Sigma Aldrich) Este colorante se ubica de forma intercalada entre las cadenas de DNA y permite evidenciar señales de fragmentación del material nucléico consideradas como señales terminales de un proceso apoptótico. Para esto, las células se fijaron con metanol, luego se aplicó el colorante diluido 1:200 por 20 min en cámara oscura, de una solución stock de Hoechst 1 mg/ mL en agua estéril. Las células fueron analizadas en un microscopio de fluorescencia (Van Guard). Esta metodología se aplicó a las células utilizadas en todos los experimentos que se describen en este trabajo. Ensayos de Choque Térmico Para el ensayo de Choque Térmico, los enterocitos aislados de las vellosidades o las vellosidades integras aisladas del intestino, se pusieron en un baño de María a 42ºC por 30 minutos y luego se incubaron por 30 minutos a 37ºC en ambiente con CO2 al 5% para que las células se restablecieran luego del choque térmico. Las células se utilizaron para los diferentes procedimientos descritos en el trabajo. Infección de vellosidades aisladas con el virus ECwt, RRV y Reo, con o sin choque térmico. Se quiso comparar la capacidad replicativa del rotavirus ECwt y RRV en vellosidades aisladas de intestino de ratón con y sin choque térmico. Para esto, las vellosidades aisladas del intestino se dividieron en dos fracciones: una recibió choque térmico y otra no, la cual se mantuvo a 37°C y se denomina control. Posteriormente se fraccionaron según las necesidades experimentales (variables a examinar). Las vellosidades con y sin choque térmico se sembraron en cajas de 96 pozos y se les

agregó el rotavirus ECwt (MOI de 5), RRV (MOI de 9) que se había activado con tripsina (1g/ml) durante 30 minutos a 37 OC. Luego se cosecharon en los siguientes tiempos: 0, 2, 4, 6, 8, 10 y 12 horas; cada punto se realizó por triplicado y se repitió tres veces. En algunos experimentos las vellosidades se cosecharon todas al cabo de 12hs. Las vellosidades cosechadas se analizaron mediante las técnicas de ELISA o inmunocitoquímica.

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Infección de vellosidades aisladas utilizando lisados provenientes de vellosidades infectadas con virus ECwt o RRV con o sin choque térmico. Es importante determinar si existen diferencias en la capacidad infectiva de lisados provenientes de células sometidas a choque térmico, respecto a las que no lo recibieron y que fueron infectadas. Es decir, se quiso determinar si existen diferencias en la cantidad de viriones ensamblados en cada uno de estos tratamientos. Para esto, las vellosidades aisladas con o sin choque térmico fueron infectadas y cosechadas en los tiempos 0, 4, 8 y 12 h.p.i. (horas post infección). Luego fueron congeladas (-

20°C) y descongeladas dos veces. Posteriormente, se activaron con tripsina (1g/ml) durante 30 minutos a 37 OC. De otro lado, nuevamente se aislaron vellosidades, según la técnica descrita, y estas se pusieron en caja de 96 pozos. A estas nuevas vellosidades se le adicionó el lisado cosechado en cada una de las horas señaladas anteriormente en la siguiente proporción: el lisado que contenía ECwt se aplicó en una dilución 1:5 (v:v) y el que contenía RRV se aplicó en dilución 1:1 (v:v). Las vellosidades infectadas con el lisado se cultivaron a 37°C durante 12hs. Transcurrido este tiempo, se cosecharon a las 12 h.p.i. y se fijaron para evaluar la infección por inmunocitoquímica, utilizando Acs contra proteínas estructurales de los rotavirus. Ensayo de ELISA de Captura Las vellosidades aisladas, con y sin choque térmico, infectadas y/o no infectadas, cosechadas para analizarlas mediante la técnica de ELISA fueron congeladas a -20°C hasta la realización de la técnica. Posteriormente, se congelaron y descongelaron 3 veces, se puso buffer de lisis RIPA (NaCl 150mM, Nonident-P40 1%, Ácido Deoxicólico 0.5%, SDS 0.1% y Tris 50mM pH 8.0) en proporción 1:10. La placa de ELISA contenía Ac de captura en una dilución 1: 500 (contra RRV hecho en Conejo) o 1:500 (contra ECwt generado en Cobayo) y se incubó a 37ºC por 1 hora y luego a 4ºC durante toda la noche. Se lavó tres veces con PBS 1X (pH 7.0) para retirar el anticuerpo que no se unió a la caja, cada lavado fue de 3 minutos. Posteriormente se adicionó leche descremada al 5% en PBS 1X y se dejó 1 hora a 37ºC para bloquear. Luego se puso el lisado de las vellosidades cosechadas, con azida de sodio, y se incubó a 37ºC por dos horas. Se colocó el Ac primario 1: 1000 de origen animal diferente al usado como Ac de captura diluido en PBS 1X + Ázida de Sodio, se dejó 2 horas a 37ºC. Se lavó tres veces con PBS 1X para retirar el Ac que no se unió. Se puso el Ac. secundario 1: 3000 (100 µg/mL Santa Cruz) conjugado con peroxidasa, de origen animal igual al Ac primario, en PBS + Leche descremada al 0.5% y se incubó 1 hora a 37ºC. Se lavó tres veces con PBS 1X y se reveló con peroxidasa en tampón citrato (ácido cítrico 0.1M, citrato sódico 0.1M) y OPD (orto-fenilendiamina dihidrocloruro) 0.001g/ml y se leyó a 492nm (Biorad®). La absorbancia de las células no infectadas se restó a todas las demás absorbancias, las cuales corresponden al delta (Δ) de la absorbancia que se graficó. Inmunocitoquímica Las vellosidades aisladas, con y sin choque térmico, infectadas y no infectadas, cosechadas para analizarlas mediante la técnica de inmunocitoquímica se prefijaron con Metanol – Ácido Acético (3:1

v/v) por 5 minutos, adicionando 10 l - 50 l al medio con células. Se centrifugó a 3000g a por 10 minutos y se descartó el sobrenadante. Posteriormente las células se fijaron adicionando Metanol – Ácido Acético por 20 minutos a 0ºC. El precipitado se centrifugó a 3000g a 4ºC por 10 minutos, se descartó el sobrenadante y se lavó tres veces con PBS 1X, cada lavado con 1mL. Se guardó la muestra en PBS + Ázida de Sodio a 4ºC para evitar la proliferación de hongos y bacterias, de esta

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forma quedan listas las células para realizar Inmunocitoquímica. Las vellosidades se colocaron sobre laminillas cubreobjetos (4x4mm), posteriormente se secaron a 50ºC para que se adhirieran a la laminilla. Luego se puso Ac primario contra las proteínas no estructurales NSP4 1:400 o NSP5 1:500 o contra proteínas estructurales de ECwt o RRV en dilución 1:2000, generados en conejo. El Ac se incubó por 1 hora a 37ºC manteniéndolos en cámara húmeda. Se lavó el exceso de anticuerpo tres veces con PBS 1X por goteo suave, sin dejar secar las células se puso Ac secundario conjugado con peroxidasa 1:3000 de un stock 200 ug/0.5ml (Santa Cruz) por 1h a 37ºC en cámara húmeda. Se lavó tres veces con PBS 1X por goteo suave y se reveló utilizando como sustrato amino etil carbazol 0,64 mg/ml (AEC) en buffer acetato (acetato de sodio 0,030 M-ácido acético 0.012 M) y peroxido de hidrógeno al 0,36%. El AEC se preparó previamente a 4 mg/ml en dimetilformamida. Las células se incubaron hasta detección de coloración roja en las células infectadas. Los controles fueron células infectadas e incubadas con Acs no relacionados y células no infectadas incubadas con Acs contra rotavirus. Las vellosidades se analizaron en un microscopio de luz a 40x (Van Guard). Se tomaron fotos de 10 campos representativos y a partir de estas imágenes se estableció el porcentaje de células infectadas relacionando las células positivas/células positivas + negativas x100. Citometría de Flujo Para determinar la presencia o ausencia de las proteínas de choque térmico HSC70 y HSP70 en la membrana citoplasmática y en el interior de los enterocitos aislados se utilizó la citometría de flujo. Para esto, las vellosidades aisladas se fijaron con para-formaldehido (Sigma) al 4% en PBS 1X durante 30 min a 37°C, se realizaron dos lavados con PBS 1X. Para disgregar los enterocitos de las vellosidades se adicionó PBS 1X con EDTA (4.5mM) durante 1 h a 37°C y luego toda la noche a 4°C. Luego se realizaron tres lavados, re suspendiendo las células con vórtex durante cinco minutos entre lavado y lavado, se eliminaron los cúmulos evidentes en suspensión, y en el caso de las células destinadas a la detección de HSC70 y HSP70 intracelular se pusieron en TritónX100 0.2% por 5 min o con saponina 0.25% 30 min a 4ºC. Posteriormente, las células se incubaron con anticuerpos contra HSC70 (SC1059 Santa Cruz) o contra HSP70 monoclonales (8μg/ml, ZYMED) o policlonales (4μg/ml, SC1060 Santa Cruz). Los anticuerpos se dejaron 1h a 37°C, se lavaron tres veces y se incubaron con el anticuerpo secundario, según la especie, conjugado-FITC (Santa Cruz). Se detectó la fluorescencia en un citómetro de flujo FACSCALIBUR (Beckton Dickinson) y se analizaron los datos por medio del programa CELLQUEST con los parámetros apropiados. Los resultados mostrados corresponden a 3 experimentos independientes para cada una de las proteínas evaluadas.

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Resultados Ensayo de Viabilidad con azul de tripán Los resultados del ensayo mostrados en la figura 1A se refieren a la extracción de vellosidades intestinales empleando una concentración de EDTA 1.5mM; como se puede apreciar la viabilidad de las células durante las 12h que duró el experimento, es superior al 90% para todos los tratamientos. La mayoría de las células teñidas con azul de tripán durante los ensayos de viabilidad eran las del ápice de la vellosidad. La tendencia a disminuir la viabilidad en las células infectadas, que resulta probablemente de la ruptura parcial de las membranas en las células cuando el virus empieza a salir, puede haber ocurrido, dado que desde las 8h se empezaron a observar detritos celulares en todos tratamientos.

Figura 1. Viabilidad de las Vellosidades aisladas. A. Las vellosidades de 3 ratones ICR fueron extraídas usando EDTA 1.5mM y se mezclaron, se dividieron en tres fracciones. Una fracción recibió choque térmico por 30min a 42ºC (barra gris), otra se infectó con el rotavirus ECwt (barra negra), y la otra se cultivo directamente, sin choque térmico ni infección y que denominamos control (barra blanca); las muestras se incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO2 y fueron cosechadas en los tiempos indicados. El azul de tripán y las vellosidades intestinales se pusieron en proporción 1:1 por 1 minuto. Se contaron las células sin teñir (viables) y células de color azul (no viables) en 10 campos representativos. B. Viabilidad de los enterocitos separados de las vellosidades. Para separar los enterocitos de las vellosidades, estas fueron extraídas y los enterocitos se separaron usando EDTA 3 mM. Los enterocitos se mezclaron y se dividieron en dos fracciones: una se infectó con el rotavirus ECwt (barra negra), y la otra no se infecto (control, barra blanca). C. Tinción de Hoechst 33342. Evaluación de la fragmentación del DNA en enterocitos separados de las vellosidades con EDTA 3 mM. Los enterocitos de 3 ratones ICR fueron extraídos usando EDTA 3 mM, se mezclaron y se dividieron en dos fracciones: una se infectó con el rotavirus ECwt (barra negra), y la otra no se infecto (control, barra blanca). Se adicionó el Hoechst (5 μg/ml) por 20 minutos, protegido de la luz y se observaron en un microscopio de fluorescencia (Van Guard). Para explorar la posibilidad de que se obtuviera mayor cantidad de células usando el doble de la concentración usual de EDTA (3.0mM), y que los enterocitos completamente disgregados de la vellosidad intestinal pudieran ser más fáciles de contar al realizar las inmunocitoquímicas, se realizó el experimento mostrado en la figura 1B. En este ensayo se encontró que transcurridas las 2 primeras horas, la viabilidad de los enterocitos estaba alrededor de 90% para las enterocitos control (no infectadas) y cerca al 100% para las infectadas.

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El descenso en la viabilidad de los enterocitos separados de las vellosidades desciende gradualmente, alcanzando un valor cercano al 50% para las 5h en ambos tratamientos. Pasadas las 10h, se observó que la viabilidad de las células para ambos tratamientos era cercano al 10%, y para las 12h los valores obtenidos eran del 5% para ambos tratamientos. Fue una sorpresa encontrar que hay tendencia a un mayor porcentaje de células viables de los enterocitos infectados, observada a lo largo del experimento, dado que a priori se esperaba lo contrario. Se evaluó la integridad del DNA nuclear cuando los enterocitos son disgregados completamente empleando EDTA 3 mM y se analizó la diferencia en la fragmentación del DNA nuclear en los enterocitos aislados de las vellosidades infectadas y no infectadas. Para las 10h de cultivo, los enterocitos infectados tienen menor porcentaje de fragmentación respecto a los no infectados. Durante las primeras 10h los enterocitos infectados no alcanzan el 50%, mientras que los no infectados lo alcanzan entre 7 y 8 h. A las 11 - 12h la fragmentación del DNA es similar en los dos tratamientos. La figura 1C muestra que el porcentaje de células con fragmentación del DNA nuclear, como indicio de un posible proceso apoptótico, en los enterocitos no infectados tiene 10-30% más fragmentación que las infectadas. En conjunto, los resultados indican que los enterocitos infectados muestran una tendencia clara a disminuir la apoptosis, sugiriendo que el virus puede tener una acción anti-apoptótica en las primeras 6-8 horas de infección. Infección de vellosidades aisladas con el virus ECwt, RRV y Reo, con o sin choque térmico. Se quiso explorar la idea de si al dar choque térmico (42ºC por 30 min), se sobre expresaba la proteína Hsc70 en la membrana de las vellosidades intestinales de ratón y al existir más receptores en la membrana celular se aumentaba la infección. La figura 2A indica que no hay diferencias en la infección entre las células que recibieron el choque térmico de las que no lo recibieron. Cabe aclarar que esta técnica permite evaluar la cantidad total de antígenos virales presentes, pero no necesariamente de partículas infectivas ensambladas.

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Figura 2. Detección de antígenos virales en vellosidades infectadas A. ELISA de captura de la infección de vellosidades aisladas con los virus ECwt, RRV y Reo. Se extrajeron las vellosidades intestinales de 3 ratones ICR con 1.5mM de EDTA, se mezclaron y luego dividieron en porciones para cada uno de los tratamientos. Unas se sometieron a choque térmico por 30 min a 42ºC, y luego a 37ºC por 30 min como periodo de restablecimiento; otra porción se mantuvo a 37ºC. Luego las vellosidades se infectaron con los rotavirus ECwt (homólogo), RRV de simio Rhesus (heterólogo) y Reo (reovirus) por un periodo de 12h, luego se congeló y descongeló la muestra tres veces. La placa de ELISA se incubó con un Ac de captura generado en cobayo (1:1000), se bloqueó, se adicionó el lisado y se puso el Ac primario contra proteínas estructurales (1: 3000 de conejo). Se lavó y se puso Ac secundario HRP anticonejo (0.08 mg/ml). Se reveló con OPD en tampón citrato y se leyó a 492nm en un lector Biorad®. Inmunocitoquímica. B. Proteínas estructurales. Se procedió como se menciono en A, luego se infectaron las vellosidades con el virus ECwt y se cosecharon las muestras cada 2 horas hasta completar 12h y se fijaron con metanol-ácido acético 3:1. Se pusieron sobre una lámina cubreobjetos y se mantuvo a 50ºC durante 30 min. Se adicionaron Anticuerpos por 1h contra proteínas estructurales del virus. Se lavó, se adicionó Ac secundario anticonejo acoplado a peroxidasa (0.13 mg/ml), y se reveló con amino etil carbazol por 1h. Las laminillas cubreobjetos se pusieron en una lámina portaobjetos y se contaron las células de 10 campos representativos con el objetivo de 40x. El experimento se realizó 3 veces, cada uno con 3 repeticiones. C. Proteína no estructural NSP4. Todo el procedimiento es similar a lo descrito en B, excepto el anticuerpo que es anti-NSP4. El * indica diferencias estadísticamente significativas por medio de la prueba t de Student con α 0.05. D. Proteína no estructural NSP5. Todo el procedimiento es similar a lo descrito en B, excepto el anticuerpo que es anti-NSP5. El * indica diferencias estadísticamente significativas por medio de la prueba t de Student con α 0.05 La figura 2B indica que, en términos generales, no hay diferencias en la infección entre las células que recibieron el choque térmico de las que no lo recibieron. Al igual que con la técnica de ELISA, esta evalúa la cantidad total de antígenos virales presentes, pero no necesariamente de partículas infectivas ensambladas. Indica que la cantidad de células infectadas iniciales es de alrededor del 25% para las

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primeras 2h, aumentando cerca del 10% por cada par de horas adicionales que transcurren hasta alcanzar un punto cercano al estancamiento de la replicación viral alrededor de las 8 y 10h post infección, para aumentar ligeramente durante las últimas dos horas, culminando en un 75-84% de células infectadas al cabo de 12h. Al analizar la infección utilizando anticuerpos contra proteínas no estructurales (NSP5 y NSP4) no se observan grandes cambios respecto a lo observado al analizar las proteínas estructurales. Sin embargo, al examinar en detalle la figura 2C se observa que a partir de las 2h post infección hay un 32% de células infectadas en el tratamiento sin choque y 49% para el choque térmico. Sin embargo, la tendencia se revierte a las 4 h.p.i., con una diferencia de 10% entre ambas y a las 6 hpi con una diferencia del 3%. Esta misma diferencia se mantiene a las 8 hpi pero a favor de las células con choque térmico. A las 10 y 12 h.p.i. existe una mayor proporción de células infectadas con el choque térmico, con valores de casi 20% de diferencia a las 10 h.p.i. y de 12% e a las 12 h.p.i. Al examinar en detalle la figura 2D se observa que a partir de las 2 h.p.i. la infectividad del virus es de 40% en las células sin choque y de 57% con el choque térmico. A las 4hpi la tendencia se mantiene 64% sin choque y 70% con el choque térmico. A las 6hpi la tendencia se revierte y se observa una mayor proporción de células infectadas en ausencia de choque térmico (71%) en comparación con el 64% observado con el choque térmico. A las 8, 10 y 12 h.p.i. la infectividad de las células con choque es de 75% y las de sin choque de 58%, 60% y 75% respectivamente. Infección de vellosidades aisladas utilizando lisados provenientes de vellosidades infectadas con los rotavirus ECwt o RRV, con o sin choque térmico. Dado que en las técnicas de ELISA o inmunocitoquímica se evalúa la cantidad total de antígenos virales presentes, pero no necesariamente de partículas infectivas ensambladas, es importante determinar si existen diferencias en la capacidad infectiva de lisados provenientes de células sometidas a choque térmico, respecto a las que no lo recibieron y que fueron infectadas.

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Figura 3. Re-infección. Inmunocitoquímica evaluando la infección de vellosidades aisladas utilizando lisados virales provenientes de vellosidades infectadas con virus ECwt o RRV, con o sin choque térmico. Se extrajeron las vellosidades intestinales de 3 ratones ICR con 1.5mM de EDTA, se mezclaron y luego dividieron en porciones para infectar y cosechar en los tiempos 0, 4, 8 y 12 h.p.i., luego fueron congeladas (-20°C) y descongeladas dos veces. Después, se activaron con

tripsina (1g/ml) durante 30 minutos a 37 OC. Posteriormente, a vellosidades recién aisladas se le adicionó el lisado cosechado en cada una de las horas señaladas en la siguiente proporción: el lisado que contenía ECwt se aplicó en una dilución 1:5 (v:v) y el que contenía RRV se aplicó en dilución 1:1 (v:v). Las nuevas vellosidades infectadas con el lisado se cultivaron a 37°C durante 12hs. Se cosecharon a las 12 h.p.i. y se fijaron para evaluar la infección por inmunocitoquímica, utilizando anticuerpos contra proteínas estructurales de los rotavirus. Las células infectadas se contaron en 10 campos representativos con el objetivo de 40x (VanGuard). El experimento se realizó 3 veces, cada uno con 3 repeticiones. Los lisados se habían infectado con: A. ECwt. B. RRV Los resultados de la figura 3 muestra que hay una tendencia hacia mayor infección en los lisados provenientes de vellosidades que fueron sometidas a choque térmico respecto a las que no lo recibieron. En la figura 3A a las 0 h.p.i. el porcentaje de células infectadas con el lisado procedente de células infectadas (ECwt) y sometidas a choque térmico, es 5 veces mayor que las que provenientes de lisados sin choque. A las 4hpi y 8hpi la diferencia es del 15% y 10% entre infectadas con choque e infectadas sin choque. A las 12hpi no se observan diferencias. La figura 3B a las 0 h.p.i. el porcentaje de células infectada con el lisado procedente de células que fueron infectadas (RRV) y sometidas a choque térmico, generó un 25% más vellosidades infectadas en comparación con las infectadas sin choque. A las 4 h.p.i. y 8 h.p.i. la diferencia es aproximadamente del 20% entre infectadas con choque e infectadas sin choque. A las 12 h.p.i. la diferencia es aproximadamente del 5% entre infectadas con choque e infectadas sin choque. La proteína Hsc70 aumenta su expresión en vellosidades infectadas con ECwt y en choque térmico, o cuando se combinan los dos procedimientos. Al hacer los ensayos de infección en células sometidas a choque térmico se buscaba aumentar la expresión de la proteína de choque térmico Hsc70 en la membrana del enterocito y con esto explorar si el virus aumentaba su infección. Se evaluó por citometría de flujo (FACS) si la proteína Hsc70 se sobre expresa o no, luego del choque térmico, dado que ésta es constitutiva. Como punto de

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referencia se examinó la proteína inducible Hsp70, homóloga de Hsc70. Igualmente se examinó si la infección con el rotavirus modifica la expresión de estas proteínas. Al analizar enterocitos que no fueron sometidos a choque térmico, correspondientes a la figura 4, se observa que el porcentaje de células que expresan la proteína Hsc70 en la membrana citoplasmática es del 7.01% (A), e intracelular es del 35.8% (B), lo cual corresponde al nivel basal de expresión de dicha proteína. Cuando estas vellosidades se infectan con el rotavirus ECwt, el porcentaje de células que expresa la Hsc70 en la membrana es del 25,31% (C), e intracelular del 34.57% (D). Cuando las vellosidades son sometidas a choque térmico por 30 min a 42ºC la proporción de células que expresan la Hsc70 en la membrana citoplasmática es del 37.18% (E), 5 veces más que el nivel basal, lo cual contrasta con su expresión a nivel intracelular, la cual es del 37.01% (F). Cuando se combina el choque térmico y la infección, se observa un aumento en la cantidad de células que expresan a nivel de la membrana citoplasmática la Hsc70, alcanzado 65.33% (G), 9 veces más que el nivel basal y casi el doble del valor alcanzado sólo con la infección por rotavirus. A nivel intracelular alcanza un 51.12% (H).

Figura 4. Citometría de Flujo de Hsc70. Para evaluar los cambios en la expresión de la proteína HSC70 a nivel de membrana citoplasmática e intracelular, se extrajeron las vellosidades intestinales de 3 ratones ICR con 1.5mM de EDTA, se mezclaron y se fijaron con paraformaldehido (Sigma) al 4% en PBS. Luego se disgregaron los enterocitos de las vellosidades con EDTA (4.5mM) y se eliminaron los cúmulos. Para permeabilizar se adicionó Tritón X100 0.2% por 5 min y saponina 0.25%, 30 min a 4ºC . Se adicionó Ac anti-Hsc70 (0.2 mg/ml, SC1059 Santa Cruz) durante 1h a 37°C, se lavaron y se adicionó el Ac secundario conjugado con FITC (0.5 mg/ml, Santa Cruz). A. células no permeabilizadas B. células permeabilizadas, C. Infectadas con ECwt, no permeabilizadas D. Infectadas con ECwt y permeabilizadas E. Choque térmico por 30 min a 42ºC, no permeabilizadas F. Choque térmico por 30 min a 42ºC y permeabilizadas, G. Choque térmico e infección con ECwt, no permeabilizadas. H. Choque térmico e infección con ECwt permeabilizadas.

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Se detectó la fluorescencia en un citómetro de flujo FACSCALIBUR (Beckton Dickinson) y se analizaron los datos por medio del programa CELLQUEST con los parámetros apropiados. Los resultados mostrados corresponden a 3 experimentos independientes para cada una de las proteínas evaluadas.

Expresión de Hsc70 en vellosidades intestinales evaluada por citometría de flujo

Membrana Celular Intracelular NCh NI 7,01% NCh NI 35,38% NCh Inf 25,31% NCh Inf 34,57% Ch NI 36,18% Ch NI 37,01% Ch Inf 65,33% Ch Inf 51,12% Tabla 1. Expresión membranal e intracelular de Hsc70 en vellosidades intestinales

evaluada por citometría de flujo. Valores expresados como porcentaje de células positivas para la proteína Hsc70 siguiendo la metodología mencionada anteriormente. Resultados

obtenidos a partir de dos experimentos utilizando anticuerpos comerciales mono y policlonales (Santa Cruz).

La proteína Hsp70 aumenta su expresión en vellosidades infectadas con ECwt y en choque térmico, pero no cuando se combinan los dos procedimientos. Al analizar enterocitos de la figura 5 que no fueron sometidos a choque térmico se observa que el porcentaje de células que expresan la proteína Hsp70 en la membrana citoplasmática es de 0.0% (A), e intracelular es de 1.62% (B), lo cual corresponde al nivel basal de expresión de dicha proteína. Cuando estas vellosidades se infectan, con el rotavirus ECwt, el porcentaje de células que expresa la Hsp70 en la membrana es del 13,1% (C), e intracelular del 17% (D). Cuando las vellosidades son sometidas a choque térmico por 30 min a 42ºC la proporción de células que expresan la Hsp70 en la membrana citoplasmática es del 61.02% (E) e intracelular del 44.39% (F). Cuando se combina el choque térmico y la infección, la expresión a nivel de la membrana citoplasmática es del 17.41% (G), e intracelular del 1.29% (H).

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Figura 5. Citometría de Flujo de Hsp70. Para evaluar los cambios en la expresión de la proteína Hsp70 en la membrana citoplasmática e intracelular, se extrajeron las vellosidades intestinales de 3 ratones ICR con 1.5mM de EDTA, se mezclaron y se fijaron con paraformaldehido (Sigma) al 4% en PBS. Luego se disgregaron los enterocitos de las vellosidades con EDTA (4.5mM) y se eliminaron los grumos. Cuando se permeabilizó se adicionó Tritón X100 0.2% por 5 min y saponina 0.25%, 30 min a 4ºC . Se adicionó Ac monoclonal anti-Hsp70 (1 μg/ml, ZYMED) o policlonal (0.2 mg/ml, SC1060 Santa Cruz), durante 1h a 37°C, se lavaron y se adicionó el Ac secundario conjugado con FITC (0.5 mg/ml, Santa Cruz). Se detectó la fluorescencia en un citómetro de flujo FACSCALIBUR (Beckton Dickinson) y se analizaron los datos por medio del programa CELLQUEST con los parámetros apropiados. Los resultados mostrados corresponden a 3 experimentos independientes para cada una de las proteínas evaluadas. A. células no permeabilizadas B. células permeabilizadas C. Infectadas con ECwt, no permeabilizadas D. Infectadas con ECwt y permeabilizadas, E. Choque térmico por 30 min a 42ºC, no permeabilizadas F. Choque térmico por 30 min a 42ºC y permeabilizadas, G. Choque térmico e infección con ECwt, no permeabilizadas. H. Choque térmico e infección con ECwt permeabilizadas.

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Expresión de Hsp70 en vellosidades intestinales evaluada por citometría de flujo

Membrana Celular Intracelular NS NI 0,00% NS NI 1,62% NS Inf 13,00% NS Inf 17,00% S NI 61,02% S NI 44,39% S Inf 17,41% S Inf 1,29%

Tabla 2. Expresión membranal e intracelular de Hsp70 en vellosidades intestinales evaluada por citometría de flujo. Valores expresados como porcentaje de células positivas para la proteína Hsp70 siguiendo la metodología mencionada anteriormente. Resultados obtenidos a partir

de dos experimentos utilizando anticuerpos comerciales mono y policlonales (Santa Cruz). DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Los enterocitos aislados de las vellosidades y las vellosidades aisladas se les examinó la viabilidad comparando las vellosidades infectadas respecto a las no infectadas. Como se muestra en la figura 1, al comparar las células infectadas con las no infectadas, el porcentaje de viabilidad fue similar durante las 12 horas en que fueron examinadas, determinada con la técnica de azul Tripán y analizando la fragmentación del DNA nuclear mediante Hoechst. Hay una tendencia hacia la disminución la viabilidad en las células no infectadas, sugiriendo que los enterocitos infectados tienen una tendencia a disminuir la apoptosis. Por otro lado, la mayoría de las células teñidas con azul de tripán durante los ensayos de viabilidad eran las del ápice de la vellosidad, lo cual está acorde con lo reportado (Boshuizen et al., 2003) sobre un incremento de la apoptosis de las células apicales, dado que se conoce que los rotavirus tienen un tropismo particular hacia estas células. Llama la atención que el rotavirus infecte preferencialmente los enterocitos del ápice de las vellosidades, puesto que son las que más rápido se desprenden. Pudiera ser que el rotavirus cuando ingresa tiene efectos antiapoptóticos, pero una vez se ha replicado y formado viriones maduros se induce apoptosis, la cual parece estar programada para las 24 h.p.i. y 4 d.p.i. (días post infección) como lo mostró Boshuizen et al. (2003) en un estudio in vivo Los datos obtenidos por Chaïbi et al. (2005) indican que los procesos apoptóticos que sufren las células infectadas por rotavirus, como RRV, se deben a que este agente infeccioso estimula el aumento de la concentración de Ca+2 al interior de la célula, alterando el potencial de la membrana mitocondrial durante su replicación, causando un aumento del citocromo C liberado al citosol.

Durante los experimentos observamos que el número de células en la alícuota de células infectadas fue disminuyendo paulatinamente, respecto a las no infectadas, por la lisis que causa el virus, aunque se mantiene la proporción de células viables en las células infectadas respecto a las no infectadas. Lo anterior obedece a que el virus lisa las células y solo se examinan las restantes que no están infectadas o apenas están en el inicio del proceso. Los fragmentos de las células lisadas se pierden con los lavados durante la fijación a la placa cubreobjetos y al retirar el reactivo (Hoescht), lo que explica que no se puedan ver al examinar las células con inmunocitoquímica. No hay diferencias en la infección entre las células que recibieron el choque térmico de las que no lo recibieron, aunque se aprecia una tendencia de mayor infección en las células con choque térmico a las

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2 h.p.i. En este caso, las técnicas empleadas para evaluar la infección fueron ELISA e inmunocitoquímica. En las dos técnicas se utilizan Acs que reconocen proteínas virales, ya sea que estén haciendo parte de viriones maduros o estén dispersas en el citoplasma de las células, es decir, aún no ensambladas en el virión. Debido a esto, solo podemos decir que no hay diferencias en la detección de antígenos virales cuando se comparan vellosidades con y sin choque térmico. Una probable razón es que a partir de las 4 h.p.i. la replicación viral es tan alta que la proporción de células susceptibles a infección es baja, con relación a los viriones infectivos, de manera que aún si hay muchos virus presentes la cantidad de células infectadas permanece prácticamente igual. Sin embargo, los resultados de la figura 3 muestran que hay una tendencia hacia mayor infección en los lisados provenientes de vellosidades que fueron sometidas a choque térmico, respecto a las que no lo recibieron. Esto sugiere que en las vellosidades, el choque térmico facilita el ensamblaje más rápido de los viriones a partir del aumento de la expresión de estas proteínas de estrés térmico. Esto concuerda con lo reportado para la línea celular MA104 (Pulido et al., 2007) donde se observa que existe una correlación entre células infectadas con un aumento de la expresión de la proteína Hsc70 respecto a las no infectadas. Estos datos contrastan con lo observado en líneas celulares como BHK y MA104, donde no se encontró un aumento del nivel global de expresión de la Hsc70 ante condiciones similares de choque térmico por medio de Western Blot, y usando la citometría de flujo se encontró que aún si se sometieron las células a 47-48ºC por 20 min usando medio DMEM precalentado a 47-48ºC, no hubo cambios en la expresión de Hsc70 en la membrana celular de estas líneas celulares (López et al., 2006) Al analizar los resultados de la citometría de flujo el porcentaje de vellosidades que expresan Hsc70 no cambia cuando se compara la Hsc70 intracelular basal de vellosidades no infectadas, respecto a las infectadas. Se debe tener en cuenta que la forma en que se presentan los datos de la citometría se relaciona el número de células positivas para este marcador, no el cambio de la expresión de Hsc70 en las células individualmente. Sin embargo, cuando se analiza el marcador Hsp70, se observa que esta proteína intracelular aumenta su expresión basal cuando se comparan vellosidades infectadas con las no infectadas, sin choque térmico. Podría ser que Hsp70 también participe en el ensamblaje de las proteínas virales para formar viriones. Esto concuerda con lo reportado (Cuadras et al., 2002) donde por la técnica de micro arreglos encuentran que Hsp70 se sobre expresa en células MA104 infectadas con rotavirus. Por medio de las técnicas Western blot y citometría (FACS) López et al. (2006) encontró que la línea celular BHK no mostró presencia de Hsp70 en la membrana de células no sometidas a choque térmico, aunque sí después 8 h después de dar el choque térmico. La línea MA104 presentó un nivel basal de expresión de Hsp70, el cual aumentó vertiginosamente a partir de las 2 h siguientes al choque térmico en el citoplasma. No se detectó la presencia de Hsp70 en la membrana citoplasmática de células BHK o MA104 sin importar si estas habían sido sometidas a choque térmico o no. Llama la atención que se disminuya el porcentaje de vellosidades infectadas y con choque térmico que expresan la Hsp70 a nivel intracelular, podría suceder que la Hsp70 esté siendo exportada hacia la membrana como encontró Broquet et al. (2003). Es posible que esta proteína, en las condiciones de choque térmico, esté involucrada negativamente en la replicación y ensamblaje del rotavirus. Por esta razón, es probable que el rotavirus tenga mecanismos moleculares para inhibir la expresión selectiva de Hsp70 y no de Hsc70. Es decir, en las condiciones de choque térmico Hsp70 Y Hsc70 pueden tener funciones opuestas relacionadas con la replicación del rotavirus. Este análisis concuerda con lo reportado por Broquet et al. (2007) que muestra que la Hsp70 afecta negativamente la biodisponibilidad

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de las proteínas de rotavirus, en la línea Caco-2. El porcentaje de vellosidades que expresan Hsc70 aumenta con el choque térmico a nivel de la membrana citoplasmática. Cuando se cosechan las vellosidades infectadas entre cero y cuatro horas, y luego este lisado se usa para infectar vellosidades que se cosecharán 12 h.p.i se observa mayor infección respecto a los lisados procedentes de vellosidades infectadas sin choque. Esto sugiere que aunque son tiempos relativamente cortos de infección, hay un mayor ingreso de partículas virales a las células, las cuales se replicaron y formaron viriones rápidamente. El mismo fenómeno no se observa en 8, 10 y 12 h.p.i. probablemente porque cuando ingresa gran cantidad de viriones, que se replican y destruyen rápidamente las células, las cuales no son detectadas por la inmunocitoquímica. Es decir, en este procedimiento, el error técnico consistió en no haber hecho mayores diluciones de los lisados a las 0, 2, 4, 6, 8, 10 y 12 h.p.i. que se emplearon para la re-infección. En este caso solo diluimos cinco veces el lisado que contenía ECwt y una sola vez el de RRV. Es probable que se requieran mayores diluciones de los lisados para poder determinar si existen diferencias claras entre vellosidades con y sin choque térmico. Esto es debido a que alrededor de las 6 h.p.i., hasta las 12 h.p.i., la concentración de viriones es mucho mayor que la de células susceptibles a la infección, de manera que la cantidad de células potencialmente infectables se constituye como un factor limitante de la infección. Por esta razón, en el ELISA no se observan diferencias porque son lisados de 12hpi y no discrimina entre viriones y proteínas virales no ensambladas y que están en suspensión. Los Acs pueden estar reconociendo mayoritariamente proteínas virales no ensambladas en las vellosidades que no recibieron choque, en cambio los Acs pueden estar detectando principalmente viriones en las vellosidades que recibieron el choque térmico; esto asumiendo que la proporción de viriones es mayor, respecto a las proteínas virales no ensambladas en las vellosidades con choque térmico, cuando se compara con las que no lo recibieron.

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