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Antibiograma: NCCLS, Kirby-Bauer e Automação.
“Uma visão crítica”
Pedro F. Del Peloso
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O Microbiologista ContemporâneoO Microbiologista ContemporâneoEstará sempre em dúvida (coleta, transporte, exames complementares, unidade de internação,etc.)Espírito investigativo (avaliar protocolos, ecologia, epidemiologia, valorizar etiologias)Sabemos o suficiente? + experiência, + pesquisa, + atualizaçãoTomadas de decisão em grupo: maior número de informações sobre amostra, médico assistente, opinião da equipe, analisar todas as variáveisNão temos valores de referência (Dra. Flavia Rossi)Coletamos os microrganismos do paciente para serem estudados no laboratório: fases pré-analítica, analítica e avaliação crítica (Dra. Cassiana Leite)Fundamentos: Colorações, Coagulase, Catalase, Oxidase, Latex, etc.Leitura de placas: “ nada mudou “
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“Os médicos dependem das informações do Laboratório de Microbiologia para o tratamento das infecções bacterianas em seus pacientes.A importância clínica do teste de sensibilidade e de seus resultados, exigem que eles sejam realizados sob ótimas condições por esses laboratórios e que ainda estejam aptos a fornecer resultados de novos agentes antimicrobianos.” NCCLS
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HistóricoHistóricoO teste de disco difusão é utilizado em laboratório há mais de 70 anos1950: Alexander Fleming1966: Bauer, Kirby, Sherris e Turckpublicam artigo original após padronizar o método de disco difusãoNCCLS adota a disco difusão como metodologia de referência, utilizada até nossos dias
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NCCLS – National Commitee for Clinical Laboratory Standards
NCCLS – National Commitee for Clinical Laboratory Standards
Organização americana privada conveniada a especialistas da indústria, meio acadêmico e governo que desenvolve normas para laboratórios clínicos.O órgão tem como função desenvolver procedimentos técnicos de referência. Não avalia, não endossa e não recomenda nenhum sistema comercial para Teste de Sensibilidade.
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CLSI CLSI ClinicalClinical andand LaboratoryLaboratory Standards Standards
InstituteInstitute
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Outras metodologias de referênciaOutras metodologias de referênciaOutras metodologias de referência
Macrodiluição em caldo:É utilizada como medida quantitativa da atividade in vitrode um agente antimicrobiano em um isolado bacterianoFornece CIM exata a partir do ensaio com 7-8 diluições (Full Range – limite completo) de diferentes antimicrobianos.
Diluição em ágar:Diferentes concentrações de antimicrobianos são incorporadas ao agar enquanto ele é preparado.Aplicações usuais: Triagem de VRE , ORSA
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Concentração Inibitória Mínima Conceito
Concentração Inibitória Mínima Concentração Inibitória Mínima ConceitoConceito
A mínima concentração do antimicrobiano necessária para inibir a multiplicação de um isolado bacteriano
E-test
Macrodiluição em Caldo
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ConcentraConcentraçãção Inibito Inibitóória Mria Míínima nima ConceitoConceito
Microdiluição em Caldo
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Metodologias que fornecem CIMMetodologias que fornecem CIM
Microdiluição em caldo (sistemas comerciais, sistemas in house)E-test (AB Biodisk)Macrodiluição em caldo
Os sistemas automatizados fornecem breakpoints (CIM aproximadas) através de testes com 2 a 5 diluições de cada antimicrobiano. Os resultados são liberados qualitativamente (S/R/I) e com CIM aproximado.
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Importância da CIMImportância da CIMPaciente com Infecção GraveDisco Difusão: Resultado Sensível – CIM?Opção Dose Plena: Aumento de reações adversas, Aumento de toxidade (hepática,renal,etc.) Resultado Intermediário – CIM?Excelente concentração no parênquima pulmonar – Terapia combinadaSucesso terapêuticoCIM <= 0.5 mcg/ml.
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O Método Kirby-BauerO Método O Método KirbyKirby--BauerBauerA) Retirar para temperatura ambiente as placas e os discos a serem utilizados.B) Com auxílio de um swab estéril tocar levemente 3 a 4 colônias bacterianas
isoladas em meio de cultura. Transferir para um tubo contendo 3-5 ml de solução salina estéril (NaCl 0,9%).
C) Ajustar a turbidez da suspensão bacteriana para 0.5 na escala McFarland.D) Em até 15 minutos após o ajuste da suspensão, imergir um novo swab estéril e
promover rotações contra a parede do tubo para retirar o excesso de fluido.E) Inocular na superfície de uma placa de Ágar Mueller-Hinton (que tenha sido
retirado previamente da geladeira até atingir temperatura ambiente) estriando o inóculo ao longo de três planos diferentes em toda a superfície o Agar (rotações a 60°). Tampar a placa. Aguardar 3 a 15 minutos (mas não mais do que 15 minutos) antes de colocar os discos de antimicrobianos na superfície do Agar inoculado.
F) Colocar os discos de antimicrobianos apropriados na superfície do Ágar Mueller-Hinton com auxílio de pinça ou dispensador.
G) Pressionar levemente cada disco contra a superfície do Agar para que o contato seja uniforme. Não mover os discos após a colocação dos mesmos uma vez que a droga é difundida quase que imediatamente. Os discos devem ser distribuídos na superfície do Agar de modo que fiquem pelo menos 24 mm entre um e outro(em placas de 150mm, colocar no máximo 12 discos).
H) Inverter a placa e incubar a 35°C em aerobiose por 18-24 horas.
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Kirby-Bauer Controle de QualidadeKirby-Bauer Controle de Qualidade
O que controlar?
Meio de Cultura (Ágar Mueller -Hinton): pH, Timidina (excesso causa falsa resistência a Sulfatrimetoprim/metoxazol), Ca e Mg (excesso causa falsa resistência aos aminoglicosídeos frente a P. aeruginosa e Tetraciclinas, diminuição causa efeito contrário), Espessura.Discos de Antimicrobianos (performance frente a cepas ATCC)(armazenar em freezer –20°c. Menos estáveis: Imipenem, Cefaclor e combinações com ácido clavulânico)Metodologia (Teste de Proficiência)
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Meio De Cultura(Agar Mueller-Hinton)
Meio De Cultura(Agar Mueller-Hinton)
Meios Comerciais x Meios preparados in house
Vantagens: Controle de Qualidade Total (desempenho, esterilidade, validade, ingredientes, espessura, pH, timidina/timina, Ca & Mg, Substituição do Lote).NCCLS M22A Quality Assurance for Comercially Prepared
Microbiological Culture Media.
Desvantagens: Realização de todos os itens anteriores, compra de meio/insumos, gasto de energia, espaço físico, mão de obra, planilhas, etc.
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Componentes do Controle de Componentes do Controle de Garantia da Qualidade para TSAGarantia da Qualidade para TSA
Fonte: Centers for Disease Control and Prevention (CDC) – 2004
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16 Teste com cepascontrole
CompetênciaTécnica
Correlação entreMicro/TSA
Relevância Clínica
Supervisão deResultados FinaisProcedimentosManuais
AntibiogramasCumulativos
Testes deProficiência
Outros
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Uso e Manutenção de Cepas ATCCUso e Manutenção de Cepas ATCCCepa ATCC
Preparar solução estoque permanente (suspensão bacteriana em TSB Glicerol ou Skim Milk Glicerol, a -20°C)
Subcultivar em Agar Sangue ou meio apropriado
Selecionar colônias e subcultivá-las em novo agar
Armazenar este agar a 2-8°C para uso por até 1 mês
Semana 3:Subcultivar em agar sangue
Semana 4:Subcultivar em agar sangue
Semana 1:Subcultivar em agar sangue
Semana 2:Subcultivar em agar sangue
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Teste de ProficiênciaTeste de ProficiênciaConceito: Desempenho do teste – Introdução da
Metodologia.- Caracterização do desempenho da metodologia
de teste de sensibilidade no Laboratório de Microbiologia, para cada painel utilizado e para cada cepa padrão.
- Sua performance será monitorada por 30 dias consecutivos.
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ProcedimentoProcedimentoExecutar a técnica estabelecida no procedimento de Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos – Disco difusão frente as cepas determinadas pelo NCCLS para o controle do disco específico.Resultados: Se mais do que três resultados de zonas de inibição apresentarem-se fora dos intervalos, aplicar ações corretivas:
1) Repetição do teste do antibiótico/cepa controle específica por cinco dias consecutivos.
- - a obtenção de resultados satisfatórios encerra a investigação.- - A confirmação do resultado fora do limite implica na eliminação do
frasco referente aos discos utilizados e substituição por um frasco liberado para rotina e recomeço do teste do antibiótico específico/cepa controle específica por 30 dias.
2) Se três ou menos resultados de zonas de inibição apresentarem-se fora dos intervalos, o laboratório pode passar a realizar o teste de controle de qualidade semanal.
O teste de proficiência deve ser realizado uma vez por ano
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Sistemas Automatizados e Semi-AutomatizadosSistemas Automatizados e Semi-Automatizados
Os sistemas automatizados e semi-automatizados são aprovados pelo FDA (EUA), baseados nas normas do NCCLS (reprodutibilidade do método >95%)
- Baseados em metodologias de microdiluição em caldo (Vitek, MicroScan, Leitor de Mini-API, ATB) e Disco-Difusão (OSIRIS)
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Sistemas Automatizados e Semi-AutomatizadosSistemas Automatizados e Semi-Automatizados
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Sistemas Automatizados e Semi-AutomatizadosSistemas Automatizados e Semi-Automatizados
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Sistemas Automatizados e Sistemas Automatizados e SemiSemi--AutomatizadosAutomatizados
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Sistemas Automatizados e Sistemas Automatizados e SemiSemi--AutomatizadosAutomatizados
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Class II Special Controls Guidance Document: Antimicrobial Susceptibility Test (AST) Systems; Guidance for Industry and FDA
Document issued on: February 5, 2003
This document supersedes Guidance on Review Criteria for Assessment of Antimicrobial Susceptibility Devices; Draft, March 8, 2000
U.S. Department of Health and Human ServicesFood and Drug Administration
Center for Devices and Radiological HealthDivision of Microbiology Devices
Office of In Vitro Diagnostic Device Evaluation and Safety
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Sistemas Automatizados e Semi-Automatizados -VantagensSistemas Automatizados e Semi-Automatizados -Vantagens
Painéis pré-definidos (Gram-negativos,Gram-positivos, Perfil Urinário)Agilização de rotinas; redução das variáveis do métodoGerenciamento da rotina por software atualizado frente às normas do NCCLS; Alertas; CustomizaçãoScreening de ResistênciaEstatística Epidemiológica (Relatórios CCIH)Gerenciamento de dados de CIQ
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Sistemas Automatizados e Semi-Automatizados -DesvantagensSistemas Automatizados e Semi-Automatizados -Desvantagens
Não pode ser considerada metodologia de referênciaFalha na indicação de procedimentos prévios incorretos (microrganismos misturados; contaminações; erros técnicos);Problemas no TSA de microrganismos fastidiosos (tempo e condições de crescimento)Falta de acurácia em TSA para determinados microrganismos (P. aueruginosa, Acinetobacterspp, S. pneumoniae)Necessidade de pessoal técnico especializado e com conhecimento em Microbiologia
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Documento NCCLS M100-S14 (Jan/04):
Principais modificaçõesDocumento NCCLS M100-S14 (Jan/04):
Principais modificações
Padronização do TSA para S. maltophilia(minociclina, ciprofloxacina, levofloxacina e TMP-SXT) e B. cepacia (ceftazidime, meropenem)Sugestão de grupos de antimicrobianos para situações de Bioterrorismo (B. anthracis, Y. pestis, B. mallei, B. pseudomallei)
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Documento NCCLS M100-S15 (Jan/05):
Principais modificaçõesRecomendação para testar a produção de ESBL em Proteus mirabilisListagem específica de antimicrobianos para: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Burkholderia cepacia e Stenotrophomonas maltophiliaCritério de interpretação para Polymyxin B/ Colistin por diluição em caldo (MIC) em Pseudomonas aeruginosa e nãoEnterobacteriaceaeCritério de interpretação para Trimetoprim/Sulfametoxazol por disco difusão em Burkholderia cepacia
