İNSAN KAYNAKLI Lactobacillus Spp SUŞLARININ ...dosyayukleme.ahievran.edu.tr/dosyalar/SELcUK_ZORAL...LAB Laktik Asit Bakterileri MRS Man Ragosa and Sharpe NCCLS Klinik Laboratuar

T.C.

AHİ EVRAN ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

İNSAN KAYNAKLI Lactobacillus Spp SUŞLARININ

PROBİYOTİK ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ

Selçuk ZORAL

YÜKSEK LİSANS TEZİ

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

KIRŞEHİR 2013

T.C.

AHİ EVRAN ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

İNSAN KAYNAKLI Lactobacillus Spp. SUŞLARININ

PROBİYOTİK ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ

Selçuk ZORAL

YÜKSEK LİSANS TEZİBİYOLOJİ ANABİLİM DALI

DANIŞMAN

Doç. Dr. Ergin KARİPTAŞ

KIRŞEHİR

EYLÜL 2013

Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürlüğü’ne

Bu çalışma jürimiz tarafından BİYOLOJİ Anabilim Dalında YÜKSEK LİSANS

TEZİ olarak kabul edilmiştir.

Başkan: Doç. Dr. Kamil IŞIK…………..

Üye: Doç. Dr. Ergin KARİPTAŞ………….

Üye: Yrd. Doç. Dr. Belgin ERDEM…………

Onay

Yukarıdaki imzaların, adı geçen öğretim üyelerine ait olduğunu onaylarım.

…/…/20..

Doç. Dr. Mahmut YILMAZ

Enstitü Müdürü

i

ÖZET

Bu çalışmada, Kırşehir Devlet Hastanesine belirli bir şikayetle başvurmuş 25-50

yaş arası sindirim sistemi problemi bulunmayan 48 hastanın gaitasından izole edilmiş

Lactobacillus spp. suşları kullanılmıştır. Toplam 25 adet olan bu suşların düşük pH

dirençlerinin belirlenmesi, yüksek safra tuzu (oxgall) konsantrasyonlarına karşı toleransı

ve safra tuzu (kolik asit) hidrolizi, bazı patojen mikroorganizmalara karşı inhibitör

etkileri, antimikrobiyal aktiviteleri ve kolesterol asimilasyonunun belirlenmesi

hedeflenmiştir. Değişik pH koşullarında (2.0, 2.5 ve 3.0) asitliğe en dirençli suşlar L.

fermentum1 LS-5, L. fermentum2 LS-15, L. plantarum1 LS-20 ve L. fermentum2 LS-25

olarak tespit edilmiştir. Yüksek safra tuzu konsantrasyonlarında (%0.3, %0.5, %1.0 ve %

1.5) L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L.

plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-15, L. fermentum2 LS-16 suşları canlılığını

koruyabilmiştir. Ayıca safra tuzu (kolik asit) hidrolizi çalışmasında genel olarak iyi

sonuçlar elde edilmiş, en yüksek değerleri ise L. pentosus LS-2 suşunda

gözlemlenmiştir. Bu suşların antimikrobiyal aktivitelerinin tespiti için yapılan çalışmada

13 farklı antibiyogram diski denenmiş, suşların genelinin antibiyotiklere karşı duyarlı

oldukları gözlemlenmiştir. Lactobacillus suşlarının patojen mikroorganizmalar üzerine

inhibitör etkilerinin tespiti üzerine E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27853),

K. pneumoniae (ATCC 25656), S. epidermidis (ATCC 12228) ve Neisseria sp.

patojenleri ile bir çalışma yapılmıştır. Lactobacillus suşları genel olarak patojenlere karşı

inhibitör etki göstermişlerdir. Ayrıca Lactobacillus suşlarının laktik asit dışında ürettiği

antimikrobiyal maddelerin inhibitör etkisinin belirlenmesi üzerine yapılan bir başka

çalışmada ise pH’sı yükseltilmiş süpernatantların patojenler üzerine etkisi

gözlemlenmemiştir. Kolesterol asimilasyonunun belirlenmesi için yapılan çalışmada ise

düşük asitliğe ve yüksek safra tuzuna dayanıklı, safra tuzu aktivitesi yüksek, antagositik

etkiye sahip 5 suş L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L.

plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12 ve L. fermentum2 LS-15 seçilmiş ve kolesterol

giderimi çalışılmıştır. Kültürler MRS sıvı besi yerinde 10-22 µg/ml, %0.3’lük yüksek

ii

safra tuzlu MRS sıvı besi yerinde 14-50 µg/ml, %0.3’lük kolik asitli MRS sıvı besi

yerinde 8-13.5 µg/ml ve %0.3’lük taurocholic asit’li MRS sıvı besi yerinde 15-55 µg/ml

kolesterol asimilasyonu yapmıştır.

iii

ABSTRACT

Lactobacillus spp. strains isolated from the stool of 48 patients between the ages

of 25 and 50 who resorted to the Kırşehir state hospital with various complaints without

having a problem with their digestive system, were used in this study. The aim targeted

was the designation of the low pH resistance, the tolerance against concentrations of

high bile salt (oxgall) and the hydrolysis of bile salt (cholic acid), the inhibitory affects

on some pathogen microorganisms, the designation of antimicrobial activity and

cholesterol assimilation of all strains of which there were a total of 25. It has been found

that the most resistant strains towards acidity under various pH conditions were L.

fermentum1 LS-5, L. fermentum2 LS-15, L. plantarum1 LS-20 and L. fermentum2 LS-

25. Strains L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-

11, L. plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-15, L. fermentum2 LS-16 were able to

maintain their vitality in high concentrations of bile salt. Furthermore pleasing results

were obtained from the bile salt hydrolysis study in general and the highest values were

observed in the L. pentosus LS-2 strain. In the study which was conducted in order to

estimate the antimicrobial activity of these strains, 13 different antibiogram disks were

tried and it was observed that overall the strains were sensitive to antibiotics. A study

was conducted with E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27853), K.

pneumoniae (ATCC 25656) S. epidermidis (ATCC 12228) and Neisseria sp. pathogens

on the estimation of the inhibitory effects of Lactobacillus strains on pathogen

microorganisms. Overall the Lactobacillus strains displayed an inhibitory effect on the

pathogens. Furthermore the effect of supernatants with an increased pH on pathogens

was observed in a different study concerning the estimation of the inhibitory effects of

Lactobacillus strains on antimicrobial substances it produces other than lactic acid. And

in the study which was conducted in order to estimate the cholesterol assimilation 5

strains L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11,

L. plantarum1 LS-12 and L. fermentum2 LS-15 which have low acidity, are resistant to

high bile salt, have a high bile salt activity and have an antagositic effect were chosen

and removal of cholesterol was studied. The cultures made cholesterol assimilation of

iv

10-22 µg/ml in the MRS liquid feedlot, of 14-50 µg/ml in the MRS liquid feedlot with

0.3 %, of 8-13.5 µg/ml in the MRS liquid feed lot with 0.3 % cholic acid and of 15-55

µg/ml in the MRS liquid feedlot with 0.3 % taurocholic acid.

v

TEŞEKKÜR

Çalışmam boyunca yardımlarını benden esirgemeyen değerli danışman hocam

Doç. Dr. Ergin KARİPTAŞ’a ve değerli hocam Yrd. Doç. Dr. Belgin ERDEM’e,

laboratuvar çalışmalarımda bana her zaman yardımcı olan hocam Arş. Gör. Tayfun

KAYA ve hocam Dr. Şener TULUMOĞLU’na, örnek toplamamda bana her konuda

yardımcı olan Kırşehir Devlet Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı çalışanlarına, her

zaman yanımda olan dostluklarını ve yardımlarını benden esirgemeyen arkadaşlarıma,

hayatım boyunca beni yalnız bırakmayan maddi-manevi destekleyen ve moral veren

aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

vi

İÇİNDEKİLER

Sayfa

ÖZET...................................................................................................................................i

ABSTRACT..................................................................................................................... iii

TEŞEKKÜR.......................................................................................................................v

İÇİNDEKİLER .................................................................................................................vi

TABLOLAR DİZİNİ ........................................................................................................ix

ŞEKİLLER DİZİNİ............................................................................................................x

RESİMLER DİZİNİ..........................................................................................................xi

SİMGELER VE KISALTMALAR................................................................................. xii

1. GİRİŞ .............................................................................................................................1

2. TEORİK ALT YAPI ......................................................................................................4

2.1. PROBİYOTİKLER .................................................................................................4

2.1.1. Probiyotiklerin Tanımı ve Tarihçesi ................................................................4

2.1.2. Probiyotik Olarak Kullanılan Mikroorganizmalar ...........................................5

2.1.3. Probiyotik Mikroorganizmalarda Aranan Özellikleri ......................................6

2.1.4. Probiyotiklerin Etki Mekanizması ...................................................................7

2.1.5. Probiyotiklerin Sağlık Üzerine Etkileri............................................................8

2.1.6. Probiyotiklerin Yan Etkileri ...........................................................................10

2.1.7. Probiyotik Ürünler ve Ticari Önemleri ..........................................................11

2.2. PREBİYOTİKLER ve SİNBİYOTİKLER............................................................11

2.2.1. Prebiyotikler...................................................................................................11

2.2.2. Sinbiyotikler...................................................................................................12

2.3. Lactobacillus CİNSİNE AİT BAKTERİLERİN ÖZELLİKLERİ ........................12

2.3.1 Lactobacillus Türlerinin Ürettikleri Antimikrobiyal Maddeler ......................15

2.3.1.1. Laktik asit................................................................................................15

vii

2.3.1.2. Hidrojen peroksit (H2O2) ........................................................................17

2.3.1.3. Bakteriosin ..............................................................................................17

2.4. BAĞIRSAK MİKROFLORASI............................................................................18

2.5. ANTAGONOSTİK ETKİDE KULLANİLAN MİKROORGANİZMALAR ......19

2.5.1. Escherichia coli..............................................................................................20

2.5.2. Staphylococcus epidermidis ...........................................................................20

2.5.3. Neisseria sp. ...................................................................................................21

2.5.4. Klebsiella pneumoniae ...................................................................................21

2.5.5. Pseudomonas aeruginosa ..............................................................................22

3. MATERYAL VE METOD..........................................................................................23

3.1. MATERYAL.........................................................................................................23

3.1.1. Materyal Örnekleri .........................................................................................23

3.1.2. Bakterilerin Aktifleştirilmesi ve Gelişme Ortamları......................................23

3.1.3. Çalışmalarda Kullanılan Besiyerleri ..............................................................24

3.2.METOD..................................................................................................................28

3.2.1. İzolatların İzolasyonu ve İdendifikasyonu .....................................................28

3.2.2. Lactobacillus spp. Suşlarının Muhafazası......................................................28

3.2.3. Patojen Suşların Aktifleştirilmesi ve Muhafazası ..........................................29

3.2.4. Asit Dirençliliğinin Belirlenmesi ...................................................................29

3.2.5. Yüksek Safra Tuzu (Oxgall) Konsantrasyonlarına Dirençliliğin Belirlenmesi

..................................................................................................................................29

3.2.6. Safra Tuzu (Kolik Asit) Hidrolizinin Belirlenmesi........................................30

3.2.7. Antimikrobiyal Aktivitenin Belirlenmesi ......................................................30

3.2.8. Bazı Patojen Mikroorganizmalara Karşı Antagonostik Etkilerin Belirlenmesi

..................................................................................................................................31

viii

3.2.9. Lactobacillus spp. Suşları Tarafından Üretilen Bakteriosin veya Bakteriosin

Benzeri Maddelerin İnhibitör Etkisinin Belirlenmesi ..............................................31

3.2.10. Lactobacillus spp. Suşlarının Kolesterol Giderimi ......................................32

4. BULGULAR VE TARTIŞMA ....................................................................................34

4.1. İZOLATLARIN İDENDİFİKASYONU ..............................................................34

4.2. Lactobacillus spp. SUŞLARIN ASİT DİRENÇLİLİĞİ........................................37

4.3. Lactobacillus spp. SUŞLARIN YÜKSEK SAFRA TUZU (OXGALL)

KONSANTRASYONLARINDA DİRENÇLİLİĞİ.....................................................39

4.4 Lactobacillus spp. SUŞLARININ SAFRA TUZU (KOLİK ASİT) HİDROLİZİ .41

4.5. Lactobacillus spp. SUŞLARININ ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTELERİ ........44

4.6. Lactobacillus spp. SUŞLARIN BAZI PATOJEN MİKROORGANİZMALARA

KARŞI ANTAGONİSTİK ETKİLERİ ........................................................................47

4.7. Lactobacillus spp. SUŞLARI TARAFINDAN ÜRETİLEN BAKTERİOSİN

VEYA BAKTERİOSİN BENZERİ MADDELERİN İNHİBİTÖR ETKİLERİ..........50

4.8. Lactobacillus spp. SUŞLARININ KOLESTEROL GİDERİMİ...........................50

5. SONUÇ VE ÖNERİLER .............................................................................................54

6. KAYNAKÇA...............................................................................................................60

ix

TABLOLAR DİZİNİ

Tablo 1. Probiyotik olarak bilinen mikroorganizmalar ....................................................6

Tablo 2. Gaitadan izole edilerek tanımlanan suşların adları ve kodları ...........................36

Tablo 3. Lactobacillus suşlarının düşük pH (2.0, 2.5 ve 3.0) derecelerine toleransı. (24

saat sonra).........................................................................................................................37

Tablo 4. Lactobacillus spp. suşlarının değişik düzeyde (% 0.3, % 0.5, % 1.0 ve % 1.5)

safra tuzu (oxgall) toleransı..............................................................................................40

Tablo 5. Lactobacillus spp. suşlarının safra tuzu hidroliz (kolik asit) aktivitesi. ............42

Tablo 6. Gaitadan izole edilen Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı

duyarlılık sonuçları (mm).................................................................................................45

Tablo 7. Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı %’de duyarlılık

sonuçları. ..........................................................................................................................46

Tablo 8. Lactobacillus spp. suşlarının değişik patojen bakterilerine karşı oluşturdukları

antagonistik etkileri (mm). ...............................................................................................49

Tablo 9: Bazı Lactobacillus suşlarının MRS sıvı besiyerinde ve değişik safra tuzu ( %

0.3 oxgall, kolik asit ve taurocholic asit) besiyerinde kolesterol giderimi (µg/ml). ........51

x

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 1. Gastrointestinal sistemin değişik kısımlarında yer alan mikroorganizmalar . ....19

Şekil 2. Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı %’de duyarlılık

oranları. ............................................................................................................................47

Şekil 3. L. delbrueckii ssp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum LS-11, L.

plantarum LS-12 ve L.fermentum LS-15 suşlarının kolesterol giderim miktarları (µg/ml).

..........................................................................................................................................52

xi

RESİMLER DİZİNİ

Resim 1: MRS Agar üzerinde 48 saat inkbasyona bırakılmış L. salivarius LS-22 suşunun

Samsung S760 fotoğraf makinesi ile çekilmiş görüntüsü. ...............................................34

Resim 2: L. pentosus LS-2 suşunun Olympus, CH-2 CHT model ışık mikroskobunda

100x10 büyütmede görünümü .........................................................................................35

Resim 3: Hidroliz edilmemiş kolik asit kristali. Novax AP-5 50920 binoküler

mikroskobunda 20X büyütmedeki görüntüsü. .................................................................43

Resim 4: L. pentosus LS-2 suşunun gerçekleştirdiği safra tuzu (kolik asit) hidrolizi.

Kolik asit kristallerinin parçalanmış hali. Novax AP-5 50920 binoküler mikroskobunda

20X büyütmedeki görüntüsü. ...........................................................................................43

xii

SİMGELER VE KISALTMALAR

KISALTMALAR

ATCC Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu

BSH Safta Tuzu hidrolizi

BKZ Bakınız

FAO Gıda ve Tarım Örgütü

GDO Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar

GRAS Genellikle güvenli olarak tanınan

KOB Koloni Oluşturma Birimi

LAB Laktik Asit Bakterileri

MRS Man Ragosa and Sharpe

NCCLS Klinik Laboratuar Standartları Ulusal Komitesi

RPM Devir Sayısı

Spp. Species Plural

Subsp. Subspecies

WHO Dünya Sağlık Örgütü

SİMGELER

mm Milimetre

nm Nanometre

°C Santigrad

µ Mikron

µL Mikrolitre

ml Mililitre

w/v Weight/Volume

µg Mikrogram

µm Mikrometre

xiii

dl Desilitre

mg Miligram

g Gram

L Litre

1

1. GİRİŞ

Mikroorganizmalara karşı insanlarda olumsuz bir ön yargı vardır. Genel kanı

mikroorganizmaların zararlı olduğu yönündedir. Bu ön yargılı yaklaşımla

mikroorganizmalardan korkan insanlar günlük yaşantılarında mikroorganizmaları

‘mikrop’ olarak adlandırmakta ve korunmaya çalışmaktadırlar.

Bu önyargılı yaklaşıma rağmen, İnsan vücudu, sahip olduğu ısı ve besin

maddeleri sayesinde çeşitli mikroorganizmalar için son derece elverişli bir ortam

oluşturmaktadır. Bu ortamda yararlı ve zararlı mikroorganizmalar bir rekabet

içindedirler. Genel olarak sağlıklı bir insanda yararlı mikroorganizmalar daha baskın

ve vücut hücreleri ile birlikte uyumlu bir şekilde çalışmaktadırlar 1-4.

Son yıllarda insan vücudunda yaşayan mikroorganizmalar birçok bilim

insanının dikkatini çekmiştir. Bu mikroorganizmalar inceleme altına alınmış, yeni

projeler ve çalışmalar başlatılmıştır. Bu alanda yürütülen projeye ‘mikrobiyom

projesi’ denilmektedir. Henüz yeni bir proje olmasına karşın ulaşılan bilgiler son

derece önemlidir 5,6.

Yeni doğmuş bir bebek steril durumdadır. Doğum anından itibaren çevrede

bulunan mikroorganizmalar bebeğin vücuduna yerleşmeye başlar, 1-2 gün içinde bu

mikroorganizmaların sayısı 109 -1010’u bulur. Bebeğin vücuduna yerleşen

mikroorganizmaların tür ve sayısı bebeğin bulunduğu ortama, beslenme şekline ve

doğum şekline bağlı olarak değişim gösterir. Bebekte anne sütü kesildiğinde, yetişkin

floranın oluşumu başlar 7-10.

Yetişkin bir insan vücudu yaklaşık 1013 hücreden oluşmakla birlikte bunun 10

katı kadarda zararlı ve yararlı, 500 farklı türde mikroorganizmaya ev sahipliği

yapmaktadır. Bir başka ifade ile vücudun değişik sistemlerinde, sistemin işlevine

göre belirli miktarlarda mikroorganizmalar yer alır. Örneğin; deride 200 gr, ağız

boşluğunda 20 gr, akciğerlerde 20’şer gr, burunda 10 gr, gözde 1 gr ve

gastrointestinal sistemde 1-2 kg mikroorganizma vardır 11-17.

2

Sindirim sistemi çok geniş bir alana sahiptir ve işlevsel olarak çok fazla

miktarlarda besin maddesi içermektedir. Bu sistemin yüzey alanı yaklaşık 400

m2’den oluşmaktadır ve bunun 200 m2’de bağırsak mukozası yer alır. Yaşam için

gerekli olan enerji ve yapısal madde taşları dışarıdan beslenerek temin edilir.

Dışarıdan alınan bu besinler sindirim sisteminden geçerek işlevsel hale getirilir. Bir

insanın ömrü boyunca sindirim kanalından ortalama 60 ton yiyeceğin geçtiği

hesaplanmıştır. Sağlıklı bir yaşam için sindirim sisteminin çok düzenli bir şekilde

çalışması gerekmektedir. Bu sistemin önemini Hipokrat şöyle ifade etmiştir. “Bütün

hastalıklar bağırsaktan başlar. Bağırsak hasta ise vücudun geri kısmı da hastadır” 7, 13,

15-20.

Bu kadar geniş yüzeye sahip ve bu kadar işlevsel bir sistemin elbette bir

yardımcıya ihtiyacı vardır. Gastrointestinal sistemde yaşayan yararlı

mikroorganizmalar, içinde bulunduğu sistem için çok önemli reaksiyonlar

gerçekleştirerek bu sistemin düzenli çalışmasına büyük ölçüde katkı

sağlamaktadırlar. Bu mikroorganizmalar genel olarak probiyotiklerdir.

Probiyotikler, ağız yolu ile alındığında konakçıya belirgin bir yarar sağlayan,

düşük pH’da dayanıklı, bağırsak epiteline tutunabilen, patojen olmayan canlı

mikroorganizmalardır. Probiyotik kelime olarak Yunanca ‘pro’ ve ‘biota’

kelimelerinden türetilmiştir. ‘Yaşam için’ anlamına gelen probiyotik, antibiyotik

kelimesi ile zıt anlamlıdır 21-24.

İnsanlar probiyotikleri doğal yollarla almaktadırlar. Eski insanların

diyetlerine bakıldığında günümüz insanlarından kat kat daha fazla fermente süt

ürünleri tükettikleri görülmektedir. Günümüzde ise insanların diyetlerinde rafine

edilmiş, işlenmiş gıdalar yer almaktadır. Ayrıca hareketsiz yaşam, stres, antibiyotik

kullanımı, sigara ve alkol kullanımı gibi etkenler sağlıklı bir yaşam için olumsuz

etkiler oluşturmaktadır. Bu durumdan bağırsak florası da olumsuz etkilenmektedir ve

sayıları azalmaktadır. Bu nedenlerden dolayı bağırsak florasını uygun sayıda

tutabilmek için ekstradan probiyotik takviyeleri yapma gereği doğmuştur 4,9,18,25.

3

Bu çalışmanın amacı; Kırşehir Devlet Hastanesine belirli bir şikayetle

başvurmuş 25-50 yaş arası sindirim sistemi problemi bulunmayan 48 hastanın

gaitasından izole edilerek tanımlanan Lactobacillus türlerinin, düşük pH ve yüksek

safra konsantrasyonlarında dayanıklılıklarının, safra tuzu hidrolizinin, antimikrobiyal

aktivitelerinin belirlenmesi, serum kolesterol giderimi ve bazı patojen

mikroorganizmalara karşı antagonistik etkilerinin ortaya çıkarılması hedeflenmiştir.

Böylelikle günlük hayatta normal beslenen kişilerin bağırsak florasında probiyotik

tür varlığı belirlenmiş olacağı düşünülmüştür.

4

2. TEORİK ALT YAPI

2.1. PROBİYOTİKLER

2.1.1. Probiyotiklerin Tanımı ve Tarihçesi

Probiyotik, Yunanca iki kelime ‘pro’ ve ‘biota’ dan türetilmiştir ve ‘yaşam

için’, ‘yaşamsal’ anlamlarına gelmektedir 12,26,27. Antibiyotik kelimesiyle zıt

anlamlıdır 28. Probiyotik kavram olarak ilk kez 19. yüzyılın sonlarına doğru ortaya

çıkmıştır 29 ve günümüze değin birçok bilim insanı tarafından tanımlandırılmaya

çalışılmıştır.

Bu kavramı ilk kez 1908 yılında Nobel ödüllü Rus bilim adamı Élie

Metchnikoff tanıtmıştır. Yaşlanma üzerine bir takım çalışmalar yapan Metchnikoff,

Kafkas ve Bulgar köylülerinin uzun ömürlü olduklarını fark etmiş ve bu durumu

köylülerin çok fazla miktarda fermente süt ürünlerini tüketmelerine bağlamıştır.

Metchnikoff fermente süt tüketimi ile bağırsak florasının olumsuz etkilerinin ortadan

kaldırılabileceği ve böylece insanların daha uzun süre yaşayabileceklerini bildirmiştir18,30-32.

Probiyotik terim olarak ise ilk kez 1954 yılında Ferdinand Vergin tarafından

kullanılmıştır. Vergin ‘Anti und probiotika’ adlı makalesinde probiyotiklerin

antibiyotik ve antimikrobiyal maddelerin tersine yaşam için yararlı olduğunu göster-

miştir 33,34. Bu çalışmadan 11 yıl sonra Lilly ve Stillwell yaptıkları çalışmalarında bir

protoza tarafından salgılanan bir maddenin başka bir protozanın gelişimini teşvik

ettiğini gözlemlemişler ve probiyotikler tarafından üretilen maddelerin diğer

mikroorganizmaların gelişmesini teşvik edici olduklarını göstermişlerdir 33,35.

Probiyotiklerin günümüzde en çok kabul gören tanımı 1989 yılında Roy

Fuller tarafında yapılmıştır. Fuller’e göre Probiyotik, “tüketicinin intestinal florasını

koruyup gelişmesine yardımcı olan canlı mikrobiyal gıda katkılarıdır.” şeklindedir 36.

5

Avrupa Birliğinin girişimleri ile 1995’te Brüksel’de yapılan probiyotik

konulu uzmanlar toplantısında probiyotikler için şu tanım yapılmıştır; sağlığa

koruyucu etki gösteren, sindirim, üreme ve solunum sistemleri üzerinde yararlı

etkileri olan, canlı, bir ya da birkaç belirli mikroorganizma tarafından oluşan

kültürler olarak tanımlanmıştır 37.

2.1.2. Probiyotik Olarak Kullanılan Mikroorganizmalar

Kullanılmasıyla birlikte tüketicinin intestinal florasını düzelterek yararlı bir

şekilde etkileyen canlı mikroorganizmalar olan probiyotikler genel olarak LAB

(Laktik Asit Bakterileri) grubundadır. Yoğurt yapımında kullanılan Lactobacillus

delbrueckii subsp. bulgaricus ve Streptococcus thermophilus dışındaki tüm laktik

asit bakterileri bağırsak florası elemanlarıdır. Bununla birlikte bazı küf ve maya

türlerinin de probiyotik özelliğe sahip olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir 23.

Tropikal bir meyvenin kabuğundan izole edilen Saccharomyces boulardii’nin

probiyotik özelliğinin keşfedilmesi buna bir örnektir 12.

Probiyotik olarak bilinen mikroorganizmalar tablo 1’de verilmiştir.

6

Tablo 1. Probiyotik olarak bilinen mikroorganizmalar 38-41.

2.1.3. Probiyotik Mikroorganizmalarda Aranan Özellikleri

Bir mikroorganizmanın probiyotik olarak insanlar tarafından kullanılabilmesi

için öncelikli olarak deneysel ve klinik çalışmalarla o mikroorganizmanın probiyotik

özelliklerinin kanıtlanması gerekmektedir. Bu çalışmaların iki temel amacı vardır.

Birinci amaç probiyotik türlerin belirlenmesi ve bu türlerin sahip olduğu özelliklerin

gösterilmesidir. Burada gösterilmek istenen probiyotik özelliklerin türe özgü

olmasıdır. İkinci amaç ise seçilen probiyotik türlerin etki mekanizmalarının

gösterilmesidir 42.

Probiyotik mikroorganizmalarda aranan özellikler aşağıda sıralanmıştır 4, 43-45.

Sindirim sırasında meydana gelen olaylardan etkilenmeden canlılıklarının

sürdürebilmelidirler,

Özellikle asit ve safra yoğunluğu yüksek ortamlarda faaliyet

gösterebilmelidirler,

BAKTERİLER KÜF VE MAYALAR

LactobacillusL. bulgaricusL. rhamnosusL. cellebiosusL. delbrueckiiL. lactisL. acidophilusL. reuteriL. brevisL. caseiL. curvatusL. fermentumL. plantarumL. johsonliL. helveticusL. salivariusL. gasseL. sporogenes

BifidobacteriumB. adolescentisB. bifidumB. breveB. infantisB. longumB. thermophilumPropionibacteriumP. shermaniiP. freudenreichiiBacteriodesB. capillusB. suisB. ruminicolaB. amylophilusLeuconostocL. mesenteroides

PediococcusP. cerevisiaeP. acidilacticiP. pentosaceusStreptococcusS. cremorisS. intermediusS. lactisS. diacetilactisBacillusB. subtilisB. pumilusB. lentusB. licheniformisB. coagulans

AspergillusA. nigerA. oryzaeSaccharomycesS. cerevisiaeS.boulardiiCandidaC. torulopsis

7

Bağırsak epiteline tutunabilme özelliği gösterebilmelidirler,

Sindirim sistemi mikroflorasının dengede tutulmasını sağlamalı, patojenlerin

gelişimini engellemeli, tüketilen gıdaların yararlanma derecesini

artırmalıdırlar,

Antibakteriyel direnci patojen mikroorganizmalara nakletmemelidirler,

İlave edildiği gıdanın kalitesini düşürmemelidirler,

Patojenler üzerine inhibitör etki yapmalıdırlar,

Metabolik aktiviteyi düzenlemelidirler,

Gıda allerjilerine ve patojenlere karşı immun sistemi güçlendirebilmelidirler,

Konakçının gıdalardan daha fazla yararlanmasını sağlamalıdırlar,

Patojen ve toksijenik olmamalıdırlar,

Mikroorganizmanın adaptasyonunu kolaylaştırmak için insan orijinli suşlar

seçilmelidir,

Depolama ve kullanma süresince canlı kalmalıdırlar.

2.1.4. Probiyotiklerin Etki Mekanizması

Probiyotik mikroorganizmalar, bağırsak sisteminin mikrobiyal dengesini

düzenleyerek yararlı etkiler göstermektedirler. Probiyotiklerin bu yararlı etkileri 3

mekanizma üzerinden gerçekleşmektedir 23.

1. Patojen mikroorganizmaların sayılarını azaltmak

Antimikrobiyal bileşikler üretmeleri,

Besin maddeleri için rekabet etmeleri,

Kolonizasyon bölgeleri için rekabet etmeleri.

2. Mikrobiyal metabolizmayı (enzimatik aktiviteyi) değiştirmek

Sindirim sistemini düzenleyen enzimlerin üretimi,

Amonyak, amin veya toksik enzimlerin üretiminin azalması,

Bağırsak duvarının fonksiyonlarının iyileştirilmesi.

8

3. Bağışıklık sistemini iyileştirmek

Antikor düzeyinin artması,

Makrofaj aktivitesinin artması.

2.1.5. Probiyotiklerin Sağlık Üzerine Etkileri

Metchnikoff köylülerin daha uzun ve sağlıklı bir ömür sürdüklerini

gözlemlemiş ve bunu köylülerin fermente süt tüketmeleriyle ilişkilendirmiştir.

Metchnikoff’a göre insan yaşamının kalitesi ile bağırsak fonksiyonlarının bir

bağlantısı vardır ve fermente süt tüketimi de bağırsaklarda yararlı etki yaparak

bağırsak fonksiyonlarının daha iyi olmasını sağlamaktadır 30.

Teknolojik gelişmelerle birlikte yapılan tıbbi çalışmalar bugün

göstermektedir ki probiyotiklerin doğrudan ve dolaylı olarak vücut için yararlı

etkileri vardır. Probiyotiklerin deneysel verilerle kanıtlanmış yararlı etkileri şunlardır23:

Bağırsak epitelinin koruyucu görevi;

•Epiteller arası direnci arttır,

•Mukus üretimini arttır,

•Epitel glikolizasyonunu yönlendirir,

•Epitel hücre iskeletini ve sıkı bağlantı bütünlüğünü sağlamlaştırır,

•Epitel onarımını destekler,

•Epitel hücrelerin ölümünü (apoptoz) önler

•Antioksidan etki gösterir.

Bağışıklık sisteminin yönlendirilmesi;

•Lokal ve toplam IgA üretimini arttırır,

•T hücresi yanıtını azaltır,

•Fagositik etkinliği arttırır,

•Bağışıklık hücrelerinin apoptozunu arttırır,

•Sitokin profillerini değiştirir,

9

Bağırsak mikroflorasının doğrudan değişimi;

•Patojenin bağırsak duvarına tutunması ile yarışır (yarışmacı dışlama),

•Bakteriyosin üretimini arttırır,

•Bağırsak lümeninin pH’ını organik asitlerin üretimi yolu ile düşürür.

Yapılan çalışmalarla yararlı etkileri kanıtlanan probiyotik

mikroorganizmaların bazı klinik uygulamaları aşağıda sıralanmıştır.

Akut ishal tedavisinde;

Dünyada her 15 saniyede bir çocuk ishal nedeni ile ölmektedir 46. Yapılan

kontrollü çalışmalarda Lactobacillus rhamnosus GG verilen çocuklarda akut

ishallerinin sürelerinin kısaldığı gözlemlenmiştir. Rotavirüs etkenli akut ishallerde

bazı probiyotik türlerin etkinliği gözlemlenmiştir. Bu türlere L. rhamnosus GG, L.

reuteri, L. casei ve Bifidobacterium lactis örnek verilebilir 47, 48

Antibiyotik kullanımına bağlı ishal tedavisinde;

Antibiyotik kullanılması ile birlikte bağırsak florası sayı ve tür açısından

değişim gösterir. Antibiyotik kullanımı ile karşılaşılan ishallerde genellikle

Clostridium difficile’nin sayısal olarak artması sorumludur. Antibiyotik kullanılması

ile meydana gelen ishallerin tedavisinde Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L.

casei ve Saccharomyces boulardii kullanılmaktadır. S. boulardii, C. difficile’in

toksinlerini bağlayarak etkili olmaktadır 49, 50.

Helicobacter pylori enfeksiyonunda;

H. pylori gastrit, ülser ve mide kanserine yol açan gram negatif bir patojendir.

Yapılan laboratuar çalışmaları bazı Lactobacillus türlerinin H. pylori’ye karşı

antagonistik etkisinin olduğunu göstermiştir 18. Ancak bu konuda kullanılacak

probiyotik türün tam olarak tespit edilmemesi, uygun miktar ve zamanın

belirlenememesi nedeniyle probiyotiklerin tedavi amaçlı kullanımı tavsiye

edilmemektedir 51,52.

10

Kolorektal kanser tedavisinde;

Probiyotiklerin insanlarda, prokarsinojenlerin aktif karsinojenlere

dönüşümünü engelledikleri, mutajenik bileşikleri bağlayıp inaktive ettikleri,

antimutajenik madde salgıladıkları, prokarsinojen bakterileri inhibe ettikleri,

mutajenlerin bağırsaklardan emilimini azaltarak immün sistemi güçlendirdikleri

bilinmektedir. Probiyotikler bu özellikleri sayesinde kolorektal kanser gelişimini

önlediği bildirilmiştir 45,53. Ayrıca büyük çapta yapılan araştırmalar da fermente süt

ürünlerinin tüketimi ile kolon ve meme kanseri gelişimi arasında ters bir ilişki

gözlemlenmiştir 54.

Serum kolesterol seviyesinin düşürülmesinde;

Probiyotiklerin kan serum düzeyini düşürücü etki gösterdikleri bazı klinik

çalışmalarla kanıtlanmıştır. Vücutta sentezlenen ya da dışarıdan alınan kolesterol

safra asitlerine dönüşmektedir. Bazı probiyotik türler, örneğin; L. acidophilus, bu

safra asitlerini konjuge edebilme özelliğine sahiptirler. Konjuge edilen safra asitleri

lipitlere göre daha kolay emilir. Bu sayede serum kolesterol seviyesinde düşme

meydana gelir. Bu konuda yapılan bir çalışmada hiperlipidemik hastalara 3 ay

süreyle L. sporogenes verildiğinde serum kolesterol düzeyinin % 32 oranında

azaldığı gözlemlenmiştir 4, 55-57.

2.1.6. Probiyotiklerin Yan Etkileri

Probiyotikler patojen olmayan mikroorganizmalar olsalar da bağışıklık

sistemi iyice zayıflamış kişiler için tehlikeli olabilmektedirler. Bağışıklık sistemi

zayıflamış kişilerde probiyotiklerin sistemik enfeksiyonlara yol açtığı bildirilmiştir.

Bunun yanı sıra probiyotiklerin olası diğer yan etkileri metabolizma değişikliği ve

gen transferidir 47,58,59. Probiyotiklerle ilgili olarak insanların bir diğer endişesi de

kullanılan preparatların GDO (genetik yapısı değiştirilmiş organizmalar) olup

olmadığı konusudur 43.

11

2.1.7. Probiyotik Ürünler ve Ticari Önemleri

Probiyotik ürünler, vücut için yararlı olduğu kanıtlanmış probiyotik

mikroorganizmaların eklenerek tüketicilere sunulan ürünlerdir. Bu ürünlerin en

başında yoğurt, kefir ve peynir gibi fermente süt ürünleri gelmektedir. Gelecekte

probiyotik et ürünlerinin de üretilmesi planlanmaktadır 60.

Probiyotik mikroorganizmalar belirli bir araştırma sonucu yararlı oldukları

anlaşılan canlılardır. Probiyotikler üzerine yapılan çalışmalar her ne kadar gün

geçtikçe artmış olsa da bazı nedenlerden dolayı sınırlı kalmıştır 61.

Bu nedenler, çok fazla sayıda probiyotik tür ve suşun bulunması, bu canlılara

ait özelliklerin tam olarak bilinmemesi, farklı muhafaza koşullarının bu canlıları nasıl

etkileyeceğinin tam olarak bilinmemesi, tek suşun bile bireylerde farklılık göstermesi

ve detaylı klinik uygulamaların maliyetinin yüksek olmasıdır 61.

Probiyotik ürünlere karşı olan ilgi gün geçtikçe artmaktadır. Bu durum

üreticilerin dikkatini çekmekte ve bu yönde ürün pazarlamaktadırlar. Tüketicilerin bu

konuda çok dikkatli olmaları gerekmektedir. Ürün alımında markalı ve patentli

ürünleri tercih edilmelidir 42, 61.

2.2. PREBİYOTİKLER ve SİNBİYOTİKLER

2.2.1. Prebiyotikler

Kolon bakterilerinin çoğalmalarını sağlayan, aktivitelerini artıran, kolonize

olmalarını kolaylaştıran ve fermente olabilen gıda katkılarıdır. Probiyotiklerin ihtiyaç

duydukları besin maddeleri olan prebiyotikler sindirilmeyen karbonhidratlardır 62-64.

12

Disakkaritlerden olan laktuloz, inülin en çok bilinen prebiyotiklerdir.

Bunların dışında oligosakkaritleden maltoz, ksiloz ve galaktooligosakkaritlerden

oligofruktoz, galaktoz diğer prebiyotik besinsel kaynaklardır 65.

Hindiba ve enginar en fazla prebiyotik içeren besinlerdir. Bunların dışında

arpa, buğday, çavdar, soğan, sarımsak, muz, kuş konmaz ve pırasa da prebiyotik

ihtiva eden besin kaynaklarıdır 64.

Bir besin kaynağının prebiyotik olarak kullanılabilmesi için şu özellikleri

taşıması beklenir 62,66.

Sindirime dirençli olmalı,

Kolon mikroflora bakterileri tarafından hidrolize edilmeli,

Bir veya kısıtlı sayıda olmak üzere daha çok bakterinin çoğalmasını

stimüle etmeli,

Konakçının sağlığı üzerinde olumlu etkileri olmalı

2.2.2. Sinbiyotikler

Sinbiyotikler, probiyotiklerle birlikte prebiyotiklerin karıştırılarak

hazırlanmasıyla oluşan besin ve destek amaçlı ürünlerdir. Probiyotiklerin besin

maddesi olan prebiyotiklerle birlikte verilmesi ile onların daha uzun süre canlı

kalabilecekleri düşünülmektedir. Böylece sinbiyotiklerin sağlığa olumlu etkileri

probiyotik ve prebiyotiklerin ayrı ayrı uygulanmalarına göre daha fazla olacağı ön

görülmektedir 67,68. Lactobacillus türleri ile Lactitol’un birlikte verilmesi buna bir

örnektir 19.

2.3. Lactobacillus CİNSİNE AİT BAKTERİLERİN ÖZELLİKLERİ

Lactobacillus cinsi bakteriler Lactobacillaceae familyasına ait olup LAB

(Laktik Asit Bakterileri) grubundandır. Lactobacillus türleri gram pozitif, katalaz

13

negatif, spor oluşturamayan, genelde hareketsiz, fakültatif anaeorob veya

mikroaerofilik mikroorganizmalardır. Çoğu basil olmakla birlikte bazı türler koko-

basildir 69-71.

Lactobacillus türlerinin gelişebilmeleri için aminoasit, peptit, nükleik asit

türevi vitamin, tuz, yağ asidi veya yağ asidi esterleri ile fermente edebilecekleri besin

maddelerine ihtiyaç duyarlar 72. Ayrıca gelişebildikleri optimum sıcaklık 30-40°C

arasıdır. Bu mikroorganizmalar fermentasyon sonucu laktik asit ürettikleri için

ortamı pH’sını 3.2-3.5’e kadar düşürürler. Bu nedenle de aside dayanıklıdırlar 73.

Elektron mikroskobuyla yapılan incelemelerde Lactobacillus cinsi bakteriler

5 ana kısımdan oluştuğu gösterilmiştir. Bunlar hücre duvarı, sitoplazmik membran,

ribozomlar ve nükleer (kromozomlar ve plazmidler) elementlerdir 74.

Hücre duvarı; Lactobacillus cinsi bakterilerde 20-40 nm kalınlığında, mineral

maddeler (tuz vb.), su ve metabolitleri geçirebilen peptidoglikan (murein) bir

tabakaya sahiptirler Peptidoglikan, N-asetilglikozamin ve N-asetilmurminik asit

monomerlerinden oluşurlar. Hücre çeperinde bu monomerlerin dışında teikoik asit,

şekerler, proteinler ve nötr polisakkaritler de bulunur. Teikoik asit hücre duvarının

negatif yükünden ve antijenik karakterinden sorumludur. Teikoik asit, ribitol fosfat

veya gliserol fosfat polimerlerinden oluşurlar. Bakterilerin hücre duvarı, çoğalma ve

azotlu maddelerin parçalanmasında rol alan proteaz enzimlerine sahiptirler 74.

Probiyotiklerin en önemli karakteristik özelliklerinden bir tanesi bağırsak

adhezyon yeteneğine sahip olmalarıdır. Bu yeteneğinde hücre duvarında bulunan

teikoik asit ve lektin benzeri maddelerden kaynaklandığı belirtilmiştir 75.

Sitoplazmik membran; Laktik asit bakterilerinin proteinleri kullanabileceği

büyüklüğe getirilmesi için gerekli olan enzimler burada bulunmaktadır. Aynı

zamanda bu reaksiyon sitoplazmik membranda gerçekleştirilmektedir. Bunun

yanında sitoplazmik membranda fosfotransferaz enzimleriyle aktif taşımada

14

yapılmaktadır. Peptidoglikanların ekstrasellüler polimerizasyonu için gereken

enzimler de sitoplazmik membranda bulunmaktadır 74.

Ribozomlar: LAB ribozomları 70S tipindedir. 70S, 50S büyük ve 30S küçük

olmak üzere iki alt üniteden oluşur. 50S’lik büyük alt birim 5S r-RNA ve 23S r-RNA

ile yaklaşık 35 çeşit protein; 30S’lik küçük alt birim ise 16S r-RNA ve 25 farklı

protein içerir. Laktik asit bakterilerinin birbirlerinden ayırımında 16S r-RNA’nın

özelliklerinden yararlanılmakta ve 16S r-RNA’nın değişen ve değişmeyen kısımlar

bulunur. Değişen kısımlar yakın akrabalıkları, değişmeyen kısımlar ise uzak

akrabalıkların tespitinde kullanılmaktadır 74.

Plazmid: Laktik asit bakterilerinin çoğu en az bir adet plazmid içerir.

Plazmidler, ekzopolisakkarit ve antimikrobiyal madde sentezi gibi koruma görevi

üstlenmiştir 74.

Laktik asit bakterileri, glikozu laktik asit veya bunun yanında diğer ürünlere

fermente etme özelliklerine göre homofermantatif ve heterofermantatif laktik asit

bakterileri olarak iki ana gruba ayrılmaktadır. Bu ayırım şekerlerin temel yıkım

yollarındaki farklılıktan kaynaklanmaktadır 76.

Homofermantatif laktik asit bakterileri glukozu, Fruktoz Di Fosfat (FDP)

yolu ile parçalayarak fermantasyon sonucu % 99 oranında laktik asit, % 1 oranında

diğer bileşikleri meydana getirirler 76-79.

Homofermantatif yol:

C6H12O6 2 CH3-CHOH-COOH (Laktik Asit)

C6H12O6 CH3-CHOH-COOH + CH3-CH2-OH + CO2

15

Heterofermantatif laktik asit bakterileri, glikozu Hegzos Mono Fosfat (HMF)

yolu ile parçalayarak fermantasyon sonucu % 70 laktik asit üretilir. % 30 oranında da

diğer bileşikleri, özellikle asetik asit, etil alkol ve karbondioksiti oluştururlar 77-79.

Heterofermantatif yol:

C6H12O6 CH3-CHOH-COOH + CH3-COOH + CO2

Lactobacillus türleri tarafından fermantasyon sonucu üretilen laktik asidin

fermente ürünleri koruyucu etki göstermesinden dolayı, bu mikroorganizmalar

yıllardır gıda endüstrisinde kullanılmaktadırlar. Ayrıca bakteriosin ve diğer

antimikrobiyal madde üretimleri ve GRAS (Genellikle güvenli olarak tanınan)

statüsünde yer almaları nedeniyle, doğal ve teknolojik uygulamalarla üretilen ve bu

bakterileri içeren gıdalar insan sağlığını hiçbir şekilde olumsuz olarak etkilemezler70.

2.3.1 Lactobacillus Türlerinin Ürettikleri Antimikrobiyal Maddeler

Laktik asit bakterileri, insan sağlığına faydalı olmaları ve fermantasyon

yapabilmelerinden dolayı, gıdalarda uzun yıllardan beri güvenli bir şekilde

kullanılmaktadırlar. Bu nedenle gıda endüstrisinde büyük öneme sahiptirler. Ayrıca

bu bakterilerin gıdaların biyokontrolünde de ayrı bir önemi vardır. Patojen olan

bakterilerin birçoğu Laktik asit bakterileri tarafından son ürün olarak üretilen bazı

maddelere karşı hassastırlar. Laktik asit bakterilerinin antagonistik etki

mekanizmaları içerisinde son yıllarda üzerinde en fazla durulan maddeler Laktik asit,

Hidrojen peroksit (H2O2) ve Bakteriosindir 80-83.

2.3.1.1. Laktik asit

Laktik asitler, laktik asit bakterileri tarafından laktozun yıkımı sonucu oluşan

maddelerden biridir. Ekşi tatta ve kokusuz bir organik asittir. Laktik asit

16

bakterilerinin inhibisyon etkisinin çoğunlukla laktik asitten kaynaklandığı

söylenebilir 80,81.

Laktik asit oluşumu, iki basamaklı reaksiyon sonucu meydana gelir. İlk

olarak laktozun, laktik asit bakterileri tarafından oluşturulan laktaz (β-galaktosidaz)

enziminin etkisiyle, glikoz ve galaktoza parçalanması gerçekleşir. Bunun ardından da

glikoz laktik aside dönüşür 82.

Laktaz(β-Galaktosidaz)

Laktoz + H2O Glikoz + Galaktoz

2C6H12O6 4CH3CHOHCOOHLaktik asit

Bu değişim, homofermantatif laktik asit bakterilerinin, Embden-Meyerhof-

Parnas’ın belirttiği fruktoz-1,6 difosfat metabolik yolunu izleyerek, glikoz

molekülünü, 3C’lu piruvata ve ardından laktik aside dönüştürmesiyle gerçekleşir.

Ancak ortamda heterofermantatif laktik asit bakterileri varsa bu bakteriler, glikozun

yıkımını Embden-Meyerhof-Parnas yolu yerine fosfoketolaz glikolitik yolu

kullanılır. Sonuçta laktik asidin yanı sıra asetik asit, etil alkol, ve CO2 gibi

maddelerde açığa çıkar 82.

Laktozun fermantasyonu sonucunda, D (-) ve L (+) laktik asit olmak üzere iki

laktik asit izomeri meydana gelir. L (+) laktik asit, insan organizmasında daha hızlı

ve kalıntı kalmayacak şekilde metabolize olur. D (-) laktik asit ise çok yavaş bir

şekilde yıkıma uğrar. Bu nedenle vücuda fazla miktarda D (-) laktik asidi alınımı

istenmez. WHO (Dünya sağlık örgütü) ile FAO (Dünya gıda örgütü) tarafından,

günlük D (-) laktik asit alınımı 60 mg/kg vücut ağırlığı ile sınırlandırılmıştır 82.

Laktik asit, tabiatta çok yaygın olarak bulunan asitlerden birisidir ve geniş

şekilde gıda koruyucusu olarak kullanılmaktadır. Laktik asit insanlar tarafından

peynir, tereyağı, bira, ekmek hamuru, süttozu içeren gıdalar, sığır, koyun ve kanatlı

karkaslarında koruyucu olarak kullanılmaktadır 83.

17

2.3.1.2. Hidrojen peroksit (H2O2)

Bazı laktik asit bakterilerinin antimikrobiyal etkileri H2O2 üretimlerine

dayandırılmaktadır. H2O2 laktik asit bakterileri gibi katalaz negatif

mikroorganizmalar tarafından aerobik şartlarda üretilmektedir. Ksantin oksidaz,

glukoz oksidaz, askorbik asit, sulfidril oksidaz, piruvat oksidaz, NADH oksidaz ve α-

gliserofosfat oksidaz veya laktat oksidaz gibi enzimlerin varlığında gerçekleşen

reaksiyonlarda atmosferik oksijenin doğrudan indirgenmesi ile meydana gelmektedir83, 84.

D-glikoz + H2O + O2 D-glukonik asit + H2O2

H2O2’nin üretimi 5 °C ve 7 °C’de en yüksek seviyeye ulaşmaktadır ki bu

durum asit üretimi ile zıtlık göstermektedir 85.

Hidrojen peroksit termodinamik açıdan kararsız bir bileşiktir. Ortama da

katalaz varlığında su ve oksijene ayrılır 86.

Katalaz2 H2O2 2H2O+O2

2.3.1.3. Bakteriosin

Bakteriosinler, çeşitli laktik asit bakterileri tarafından üretilen, protein veya

peptid yapıda, hassas hücrelerdeki reseptörlere bağlanabilen antimikrobiyal

maddelerdir. Üretimleri büyük oranda plazmid DNA tarafından kodlanmaktadır.

Laktik asit bakterilerinin tüm cinslerinde bakteriosin üretimi belirlenmiştir. Özellikle,

Streptococcus ve Lactobacillus cinslerinde bu metabolitin üretimi oldukça yaygındır.

Bu cinsler içerisinde sınıflanan türlerin, bakteriosin üretim sıklıkları da birbirinden

farklılık göstermektedir 83.

18

Protein veya peptitlerden oluşan ve diğer mikroorganizmalara karşı

antogonistik etki gösteren bakteriosinlerin proteolitik enzimlerle inhibe edilebileceği

açıklanmıştır 87.

2.4. BAĞIRSAK MİKROFLORASI

Metchnikoff sağlıklı bir yaşam için bağırsakların çok önemli bir organ

olduğunu düşünmekteydi. Yaşamı boyunca bağırsaklarda gerçekleşen olayları

çözmeye çalışmış ve bu organın önemini vurgulamıştır. Bu konudaki düşüncelerini

hastalandığı sırada arkadaşına şöyle ifade etmiştir. “Otopsimi yapacak mısın?

Bağırsaklarıma dikkatli bak, orada bir şeyler olduğunu düşünüyorum 30.”

Gastrointestinal sistem insan vücudunda 400m2’lik bir alana sahiptir. Bu

sistemin 200m2’sini oluşturan bağırsaklar emici yüzeyi ile gıdaların sindirildiği,

bileşenlerin absorbe edildiği, posa kısımların dışkı olarak atıldığı bir organdır.

Bunların yanı sıra insan vücudununki en büyük diffüz lenfoid bir doku özelliğinde

olan mukozası ile mükemmel bir bağışıklık sistemi organıdır 19,88,89.

Bir insanın yaşamı boyunca yaklaşık 60 ton yiyeceğin gastrointestinal

sisteminden geçtiği hesaplanmıştır 19. Bu sistem, çok geniş bir yüzey alanına sahip

olması, besin maddelerinin burada sindirilmesi ve insan vücudunun sahip olduğu ısı

sayesinde mikroorganizmalar için son derece uygun bir ortam oluşturmaktadır.

Yeni doğmuş bir bebek steril durumdadır. Doğumdan hemen sonra

çevresindeki mikroorganizmalarla kontamine olur. İlk olarak E. coli ve

Streptococcus türleri baskındır. Bebek anne sütü ile beslendikçe bu

mikroorganizmaların yerini Bifidobacterium türleri alır. Anne sütü kesildiğinde

yetişkin florası oluşmaya başlar. Yetişkin bir insanın bağırsaklarında yaklaşık 500

farklı türde mikroorganizma gelişebilir. Bu mikroorganizmalar kütlece 1-2 kg’a

kadar ulaşabilmektedirler 18.

19

Gastrointestinal sistemi oluşturan kısımlar mikroorganizmalar için farklı

ortamlar sağlarlar. Bu nedenle her kısımda farklı türde mikroorganizmalara

rastlanmaktadır. Gastrointestinal sistemde yer alan mikroorganizmalar ve yerleri

Şekil 1’de gösterilmiştir.

Şekil 1. Gastrointestinal sistemin değişik kısımlarında yer alan mikroorganizmalar 18.

2.5. ANTAGONOSTİK ETKİDE KULLANILAN

MİKROORGANİZMALAR

Patojen mikroorganizmalara karşı mücadelede kullanılan yöntemler önemli

bir konudur. Hem ekonomik açıdan hem de kullanılan ilaçların yan etkisi

bakımından en ideal olan seçilmelidir. Probiyotik bakterilerin vücut savunmasına

yardımcı olduğu bilinmediktedir. Bu amaçla çalışmamızda kullanılan Lactobacillus

20

suşlarının günümüzde en yaygın olan patojenlere karşı antogonistik etkileri

araştırılmıştır. Çalışmada kullanılan patojen mikroorganizmalar aşağıda verilmiştir

2.5.1. Escherichia coli

Sınıflandırmada Enterobacteriaceae familyasında yer alan E. coli; gram

negatif, çubuk şeklinde, fakültatif anaerob, peritrik kirpikli ve kapsüler yapıda olan

bir bakteridir. Boyutları 1-2 µm uzunluğunda ve 0.1-0.5 µm çapındadır. E. coli

laktozu fermente edebilme özelliğine sahiptir 70, 90.

E. coli bakterilerinin doğal yaşam ortamları insan ve hayvanların

bağırsaklarıdır. Bu özelliklerinden dolayı su ve besinlerde fekal kirlenmenin

göstergesidir. E. coli fırsatçı bir patojendir. İnsanlarda bakteri enfeksiyonlarında en

sık rastlanan etkendir. Aslında bağırsak mukozasına yerleştiklerinde diğer

patojenlerle rekabet halindedirler. Ancak normal flora üyesi olarak bulundukları

yerden başka yerlere ulaşırlarsa ve burada üremeleri için elverişli koşullar varsa

bağırsak dışı enfeksiyonlar neden olmaktadırlar 90.

2.5.2. Staphylococcus epidermidis

S. epidermidis, Micrococcaceae familyasından olup gram pozitif ve kok

şeklinde fakültatif anaerob bir bakteri türüdür. Katalaz pozitif ve koagülaz negatif

özelliktedir. Zaman zaman insan ve hayvan cildinin mukoz membranlarında görülür90,91.

S. epidermidis klasik fırsatçı patojenlerdendir. Yabancı cisimlerin

yüzeylerinde biyofilm oluşturma yetenekleri nedeniyle yabancı cisimlerle ilişkili

enfeksiyonlara neden olur. Bu açıdan immün sistemi yetersiz çalışan hastalar ve

sürekli kateter takılı olan hastalar için büyük bir risktir 90, 91.

21

2.5.3. Neisseria sp.

Neisseria, gram negatif, aerob, hareketsiz, sporsuz, bazen kapsüllü, oksidaz

pozitif, katalaz pozitif, 0.6-1.0 µm çapındadır. İkili kokobasil ve kısa zincirler halinde

görülebilir. Neisseria’lar genelde kok şeklinde olduklarından iki dik boyutta bölünerek

diplokok (mikroskopla bakıldığında kahve tanesine benzer bir yapıda) görülebilirler.

İnsan vücudu dışında kısa sürede ölen tipik mukaza parazitleridir 90, 92.

İnsanlarda patojen olan türler asıl olarak N. gonorrhoeae ve N. meningitidis

olup, N. flavescens, N. subflava, N. mucosa, N. sicca, N. cinerea, N. lactamica, N.

denitrificans, N. elongata, N. weaveri patojen özellik göstermeyip nazofarinks

mukozasında flora elamanı olarak bulunur 90.

2.5.4. Klebsiella pneumoniae

K. pneumoniae; hareketsiz, sporsuz, 1-2 µm boyunda ve 0.5-0.8 µm eninde

ikişerli ya da kısa zincir halinde basillerdir. Gram negatif, polisakkarid yapıda

kapsüllü, aerop ve fakültatif anaerop özellik gösterebilen, 37 °C ve pH 7’de iyi

üreyen bakterilerdir 93.

E. coli gibi Enterobacteriaceae familyasında yer alan K. pneumoniae, sağlıklı

insanlarda üst solunum yolu ve dışkı florasının % 5-10’unu oluşturan bir bakteri

olduğu için patojenliği uygunsuz koşullar karşısında fırsatçı patojen olarak ortaya

çıkar. Bu nedenle hastane enfeksiyonlarından sorumlu bir bakteridir 93, 94.

K. pneumoniae, pnömoninin yanı sıra idrar yolları enfeksiyonuna, yara

enfeksiyonuna ve bakteriyemiye neden olmaktadır 93.

22

2.5.5. Pseudomonas aeruginosa

Gram negatif, zorunlu aerobik, basil veya kokobasil şeklinde, 0.5-0.8 µm

eninde 1.5-3.0 µm boyunda, sporsuz ve polar flagellası ile hareket edebilen, katalaz

pozitif, sitrat pozitif, metil kırmızısı negatif, Voges Proskauer negatif, bir bakteri

olan P. aeruginosa, insan patojenidir. En iyi 37 °C’de üremekte olup 42 °C’de de

üreyebildikleri rapor edilmektedir 93, 95.

Genç kültürler, üzerinde büyüyebildiği ortamlarda genellikle mavi-yeşil bir

pigment çıkarır. Aerobik olmaları nedeni ile gıdaların yüzeyinde hızlı gelişebilmeleri

sonucu okside ürünler ve mukoz madde oluştururlar 93.

23

3. MATERYAL VE METOD

3.1. MATERYAL

3.1.1. Materyal Örnekleri

Bu çalışmada kullanılan 25 adet Lactobacillus cinsine ait bakteriler, belirli bir

şikayet üzerine Kırşehir Devlet Hastanesine başvuran 25-50 yaş arası 48 hastanın

gaitasından izole edilmiştir. Örneklerin alımında hastalarda bağırsak problemlerinin

olmamasına dikkat edilmiştir.

Lactobacillus spp. suşlarının antagonistik etkilerinin tespiti için kullanılan E.

coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27853), K. pneumoniae (ATCC 25656) S.

epidermidis (ATCC 12228) ve Neisseria sp. İzmir Behçet Uz Çocuk Hastanesi kültür

kolleksiyonundan temin edilmiştir.

3.1.2. Bakterilerin Aktifleştirilmesi ve Gelişme Ortamları

Çalışmada kullanılan tüm test bakterileri uygun sıvı besiyeri ve sıcaklıkta 24-

48 saat inkübe edilerek aktifleştirilmiştir. Lactobacillus türleri için MRS (Man

Ragosa and Sharpe) broth ve agarı (Merck) kullanılmıştır. Ayrıca Lactobacillus

suşlarının antimikrobiyal analizi için sisteinli MRS agar kullanılmıştır. Lactobacillus

suşlarını inhibitör etkilerinin tespiti için kullanılan E. coli (ATCC 25922), S.

epidermidis (ATCC 12228), Neisseria sp., K. pneumoniae (ATCC 25656) ve P.

aeruginosa (ATCC 27853), aktifleştirilmesi ve stoklanması için Nutrient sıvı ve katı

besiyeri (Merck), inhibitör etki çalışmasında ise Muller Hinton katı besiyeri (Merck)

kullanılmıştır.

24

3.1.3. Çalışmalarda Kullanılan Besiyerleri

MRS (Man Ragosa and Sharpe) Sıvı Besiyeri

Maddeler g/L

Pepton 10.0

Beef Ekstrakt 10.0

Yeast Ekstrakt 5.0

Glikoz 20.0

Tween 80 1.08 mL

K2HPO4 2.0

Sodyum Asetat.3H2O 5.0

Tri-Amonyum Hidrojen Sitrat 2.0

MgSO4.7H2O 0.2

MnSO4.4H2O 0.05

Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Besiyerinin pH’sı 0.01 N HCl

ve 0.01 N NaOH kullanılarak 6.2 ± 0.2’ye ayarlanmıştır. Amaca uygun olacak

şekilde besiyerine %1.5 oranında agar ilave edilerek katı besiyeri hazırlanmıştır.

Hazırlanan bütün besiyerleri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir96.

Nutrient Sıvı Besiyeri

Maddeler g/L

Pepton 5.0

Beef Ekstrakt 1.0

Yeast Ekstrakt 2.0

Sodyum Klorür 5.0

Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Besiyerinin pH’sı 0.01 N HCl

ve 0.01 N NaOH kullanılarak 6.2 ± 0.2’ye ayarlanmıştır. Amaca uygun olacak

şekilde besiyerine % 1.5 oranında agar ilave edilerek katı besiyeri hazırlanmıştır.

25

Hazırlanan bütün besiyerleri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir97.

Sisteinli MRS Besiyeri

Maddeler g/L

Pepton 10.0

Beef Ekstrakt 10.0

Yeast Ekstrakt 5.0

Glikoz 20.0

Tween 80 1.08 mL

K2HPO4 2.0



MgSO4.7H2O 0.2

MnSO4.4H2O 0.05

L-Sistein 2.0

Na2HPO4 2.0

Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Amaca uygun olacak şekilde

besiyerine % 1.5 oranında agar ilave edilerek katı besiyeri hazırlanmıştır. Hazırlanan

bütün besiyerleri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir 98.

Muller Hinton Besiyeri

Maddeler g/L

Meat infusion 2.0

Casein hydrolysate 17.5

Starch 1.5

Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Amaca uygun olacak şekilde

besiyerine % 1.5 oranında agar ilave edilerek katı besiyeri hazırlanmıştır. Hazırlanan

bütün besiyerleri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir 99.

26

Düşük Asitli (pH 2.0, 2.5 ve 3.0) MRS Sıvı Besiyeri

Maddeler g/L

Pepton 10.0

Beef Ekstrakt 10.0

Yeast Ekstrakt 5.0

Glikoz 20.0

Tween 80 1.08 mL

K2HPO4 2.0



MgSO4.7H2O 0.2

MnSO4.4H2O 0.05

Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. MRS sıvı besiyeri 3 N HCl

ile pH 2.0, 2.5 ve 3.0 ayarlanmış ve 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda

sterilizasyon yapılmıştır 100.

Yüksek Konsantrasyonlu Safra Tuzlu (%0.3, %0.5, %1.0 ve %1.5 Oxgall)

MRS Besiyeri

Maddeler g/L

Pepton 10.0

Beef Ekstrakt 10.0

Yeast Ekstrakt 5.0

Glikoz 20.0

Tween 80 1.08 mL

K2HPO4 2.0



MgSO4.7H2O 0.2

MnSO4.4H2O 0.05

27

Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Sıvı MRS besiyerine % 0.3,

% 0.5, % 1.0 ve % 1.5 (w/v) oranlarda safra tuzu (oxgall) ilave edilmiştir. Besiyerleri

121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir 101.

Safra Tuzu Hidroliz Besiyeri

Maddeler g/L

Pepton 10.0

Beef Ekstrakt 10.0

Yeast Ekstrakt 5.0

Glikoz 20.0

Tween 80 1.08 mL

K2HPO4 2.0



MgSO4.7H2O 0.2

MnSO4.4H2O 0.05

Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Safra tuzu,% 0.5 kolik asit, %

0.37g/L CaCl2 ilave edilmiştir. Hazırlanan besiyeri 121 °C’de 15 dakika süreyle

otoklavda steril edilmiştir 102.

Antagonistik (% 0.2’lik glikozlu) MRS Sıvı Besiyeri

Maddeler g/L

Pepton 10.0

Beef Ekstrakt 10.0

Yeast Ekstrakt 5.0

Glikoz 0.20

Tween 80 1.08 mL

K2HPO4 2.0



MgSO4.7H2O 0.2

MnSO4.4H2O 0.05

28

Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Hazırlanan besiyeri 121

°C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir 103.

3.2.METOD

3.2.1. İzolatların İzolasyonu ve İdendifikasyonu

Kırşehir Devlet hastanesine başvurmuş 25-50 yaş arası 48 hastadan alınan

gaitalar steril serum fizyolojik ile seyreltilerek MRS agar üzerine çizgi ekim

yapılmış, anaerob jarda 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonucunda

petrilerde oluşan kirli beyaz, beyaz ve opak koloniler alınmış, faz-kontrast

mikroskopta Gram özelliği incelenerek, Gram pozitif, basil bakteriler seçilerek

numaralandırılmıştır 104. Numaralandırılan suşların idendifikasyonu API 50 CHL

Medium (Bio Mérieux La Bali Grottes, France) kullanılarak yapılmıştır.

API 50 CH mikroorganizmaların karbonhidrat metabolizmasının çalışmasını

sağlayan 50 biyokimyasal testten oluşan bir sistemdir. API 50 CH, Lactobacillus ve

ilgili türlerin tanımlanması için API 50 CHL Medium ile kullanılır. API 50 CH stribi,

karbonhidrat ailesi ve onun türevlerine ait olan substratların fermantasyonunu

kullanan 50 mikro tüp içermektedir. Fermantasyon testleri substratları sulandıran

API 50 CHL Medium ile eklenir. İnkübasyon sırasında, fermantasyon asidin

anaerobik üretimi ile ve seçilen besiyerinde bulunan pH indikatörü tarafından

saptanan tüpte renk değişimi olarak ortaya çıkar.

3.2.2. Lactobacillus spp. Suşlarının Muhafazası

Eppendorflar, içerisine yaklaşık 300 µL gliserol (Merck) dağıtılarak, 121

°C’de 15 dakika süreyle steril edilmiştir. Gaitadan izole edilen suşlar MRS broth

besiyerinde 37 °C’de 24 saat süreyle anearob ortamda ard arda iki kez

aktifleştirilmiş, aktif kültürlerden 600 µL alınarak gliserol içeren steril eppendorflara

29

paralelli olarak aktarılmıştır. Derin dondurucuda -20 °C’de depolanarak muhafaza

edilmiştir 81.

3.2.3. Patojen Suşların Aktifleştirilmesi ve Muhafazası

Lactobacillus suşlarının patojen mikroorganizmalar üzerine antagonostik

etkilerinin tespiti amaçlı kullanılan E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC

27853), K. pneumoniae (ATCC 25656) S. epidermidis (ATCC 12228) ve Neisseria

sp. bakterileri Nutrient Broth besiyerinde 37 °C’de 24 saat inkübasyona bırakılarak

aktifleştirilmiş olup yatık Nutrient Agar besi yerinde + 4 °C’de buz dolabında

muhafaza edilmiştir 105.

3.2.4. Asit Dirençliliğinin Belirlenmesi

16 saatlik durgun fazdaki aktif Lactobacillus spp. suşları, HCl (3.0 M) ile

farklı pH değerlerine ayarlanan (2, 2.5 ve 3) taze MRS broth besi yerine inoküle

edilmiştir. Daha sonra örnekler 37 °C’de 3 saat inkübasyona bırakılmıştır.

İnkübasyon sonrası alınan örneklerin ortalama asitliğini nötralize etmek için,

hazırlanan PBS (Fosfat solüsyonu) çözeltisinde (0.01M ve pH 6.2 şeklinde

ayarlanmış) seri dilüsyonlar (10-1 10-7) yapılmış, seyreltilen kültürlerden 100 µL

alınarak MRS katı besiyeri üzerine drigalski spatülü yardımı ile yayma ekim

yapılmıştır. 37 °C’de 24 saatlik inkübasyon sonrası petri yüzeyindeki canlı

mikroorganizma sayısı tespit edilmiştir 100.

3.2.5. Yüksek Safra Tuzu (Oxgall) Konsantrasyonlarına Dirençliliğin

Belirlenmesi

İzole edilmiş türlerin safra tuzu varlığında canlılığını koruyabilirliği, Dunne

ve ark.(2001) metoduna göre yapılmıştır. İçerisine % 0.3, % 0.5, % 1.0 ve % 1.5

(w/v) oranlarda oxgall (sigma) ilave edilmiş MRS broth besiyerine, 16 saatlik durgun

fazdaki Lactobacillus spp. suşları inoküle edilerek, 37 °C’de 3 saat inkübasyona

30

bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda her kültürden 5 log10 CFU (105 CFU) fizyolojik su

içerisinde dilisyon yapılmıştır. Seyreltilen kültürlerden 100 µL alınarak MRS katı

besiyeri (pH 6.2) üzerine yayma ekim yapılarak 37 °C’de 24 saat inkübasyona

bırakılmıştır. İnkübasyon sonrası plak üzerinde canlı koloni sayımı yapılmıştır 106, 107.

3.2.6. Safra Tuzu (Kolik Asit) Hidrolizinin Belirlenmesi

Lactobacillus spp. suşlarının Safra tuzu (kolik asit) hidrolizinin belirlenmesi

amacı ile hazırlanan MRS agar besiyerine % 0.5 kolik asit, % 0.37 g/L CaCl2 ilave

edilmiştir. Hazırlanan bu besiyeri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril

edilmiştir. Sterilizasyon sonrası petrilere dökülen besiyerleri soğumaya bırakılmış

soğuyan besi yerine 16 saatlik taze kültürlerden 10 µL alınarak yayma ekim

yapılmıştır. 24 saat 37 °C’de inkübasyona bırakılan suşların safra hidroliz aktivitesi,

inkübasyon sonrasında opak tanecikli beyaz kolonilerin etraflarında zon oluşturma ve

oluşturmama özelliklerine göre değerlendirilmiştir 102, 108.

3.2.7. Antimikrobiyal Aktivitenin Belirlenmesi

Gaitadan izole edilen Lactobacillus spp. suşlarının ampisilin (10 µg),

basitrasin (10 unit), eritromisin (15 µg), gentamisin (10 µg), meropenem (10 µg)

penisilin (10 unit), piperasilin (100 µg), rifampin (5 µg), seftazidim (10 µg),

teikoplanin (30 µg), tetrasiklin (30 µg), trimetoprim (5 µg), vankomisin (30 µg),

antibiyotiklerine karşı duyarlılıkları test edilmiştir.

İzole edilmiş Lactobacillus spp. suşları 37 °C’de ard arda iki kez MRS sıvı

besiyerinde aktifleştirilmiştir. Aktif kültürlerden 100 µL alınarak sisteinli MRS katı

besiyeri içeren petrilere aktarılmış, steril drigalski spatülü ile yayma ekim

yapılmıştır. İçerisinde besiyeri ve bakteri içeren bu petriler üzerine denenecek olan

antibiyotik diskler steril bir şekilde yerleştirilmiş ve 37 °C’de 24 saat inkübasyona

bırakılmıştır. İnkübasyon sonucunda antibiyotik disk çevresinde oluşan zonların

31

çapları kumpas ile milimetrik olarak ölçülmüştür. Sonuçlar NCCLS (Klinik

Laboratuvar Standartları Ulusal Komitesi) kriterlerine göre değerlendirilmiştir 109-112.

3.2.8. Bazı Patojen Mikroorganizmalara Karşı Antagonostik Etkilerin

Belirlenmesi

İzole edilen Lactobacillus suşları 37 °C’de ard arda iki defa MRS sıvı besi

yerinde aktifleştirilmiştir. Aktif kültürler 5000 rpm’de 15 dakika santrifüj edilmiştir.

Santrifüj sonunda elde edilen süpernatant steril şartlarda alınıp 0.45 µm’lik

disposable filtreden geçirilerek mikrofiltrasyon yolu ile steril edilmiştir 109.

Çalışmada patojen olarak seçilen E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa

(ATCC 27853), K. pneumoniae (ATCC 25656) S. epidermidis (ATCC 12228) ve

Neisseria sp. Nutrient sıvı besiyerinde uygun sıcaklıkta inkübe edilerek

aktifleştirilmiştir. Aktif kültürlerden 50 µL alınarak içerisinde 50 °C’de 20 mL

Muller Hinton (Merck) agar steril besiyeri bulanan petrilere aktarılmıştır. Besiyeri ve

bakterilerin homojen bir şekilde karışımı sağlanmış ve besiyeri donana kadar oda

sıcaklığında beklenmiştir. Besiyeri donduğunda üzerine 8 mm kalınlığında steril

çubukla kuyucuklar açılmıştır ve kuyucukların tabanı steril agarla sıvanmıştır.

Başlangıçta Lactobacillus suşlarından elde edilen steril süpernatantlardan 100 µL

alınarak, açılan kuyucuklara aktarılmıştır. Petriler 37 °C’de 24 saat inkübasyona

bırakılmıştır. 24 saat sonunda kuyucuk çevresinde oluşan zon çapları kumpas

yardımı ile milimetrik olarak ölçülmüştür 113-116.

3.2.9. Lactobacillus spp. Suşları Tarafından Üretilen Bakteriosin veya

Bakteriosin Benzeri Maddelerin İnhibitör Etkisinin Belirlenmesi

Lactobacillus suşlarının bakteriosin üretimleri anaerobik (jar ve CO2 kiti

kullanılarak) şartlarda belirlenmiştir. Bu amaçla 16 saatlik aktif kültürlerden alınarak

% 0.2 oranında glikoz içeren MRS sıvı besiyerine inokülasyon yapılarak 37 °C’de 48

saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda, laktik asidin inhibisyon etkisini

32

gidermek için kültürlü MRS Broth’un pH’sı 1 N NaOH ile 6.5’ e ayarlanıp 5000

rpm’de 15 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüjle elde edilen süpernatant 0.45 μm’lik

membran filtreden geçirilerek mikrofiltrasyon yolu ile steril edilmiştir 117.

Patojen bakteriler, Nutrient Broth besiyerinde uygun sıcaklıkta inkübe

edilerek aktifleştirilmiştir. Aktif kültürlerden 50 µL alınarak içerisinde 50 °C’de 20

mL Muller Hinton agar steril besiyeri bulanan petrilere aktarılmıştır. Besiyeri ve

bakterilerin homojen bir şekilde karışımı sağlanmış ve besiyeri donana kadar oda

sıcaklığında beklenmiştir. Besiyeri donduğunda üzerine 8 mm kalınlığında steril

çubukla kuyucuklar açılmıştır ve kuyucukların tabanı steril agarla sıvanmıştır.

Başlangıçta Lactobacillus suşlarından elde edilen ve pH 6.5’e ayarlanmış steril

süpernatantlardan 100 µL alınarak, açılan kuyucuklara aktarılmıştır. Petriler 37

°C’de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. 24 saat sonunda kuyucuk çevresinde oluşan

zon çapları kumpas yardımı ile milimetrik olarak ölçülmüştür 118.

3.2.10. Lactobacillus spp. Suşlarının Kolesterol Giderimi

Çalışmada düşük asitliğe ve yüksek safra tuzuna dayanıklı, safra tuzu

aktivitesi yüksek, antagositik etkiye sahip L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L.

pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12 ve L. fermentum2 LS-15

suşları seçilerek kolesterol giderimi çalışılmıştır. Çalışmada önceden MRS sıvı

besiyeri içersine % 0.3’lük oxgall, kolik asit ve taurocholic asit ilave edilerek 121

°C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir. Kolesterolü yüksek olan

hastalardan alınan kan (500 mg/dl) 10000 rpm de 10 dakika santrifüj yapılarak üstte

kalan sıvı kısımdan (serum) besiyerlerine (1/4 v/w) oranlarında eklenmiştir. Elde

edilen karışımdan 10’ar mL alınarak steril tüplere dağıtılmıştır. Deneyler bir birinden

bağımsız 2’şer paralel olarak yürütülmüştür. Daha önce hazırlanan Lactobacillus

kültürlerinden 5 log10 CFU (105 CFU) dilisyondan 100 µL alınarak besi yerlerine

inoküle edilmiş ve kültürler 37 °C’de 24 saat süreyle anaerob ortamda inkübasyona

bırakılmıştır. İnkübasyon sonrasında tüpler 10000 rpm 10 dakika santrifüj edilmiş,

santrifüj sonunda elde edilen süpernatant ile kolesterol miktarı enzimatik yöntemle

SYNCHRON® Systems (Beckman Caulter, USA) kiti ile Unicel DxC800 model

33

otoanalizatör (Beckman Caulter, USA) cihazında saptanmıştır. Sonuçlar mg/dl’den

µg/ml’ye çevrilmiştir 119.

34

4. BULGULAR VE TARTIŞMA

4.1. İZOLATLARIN İDENDİFİKASYONU

Bölüm 3.2.1’de anlatıldığı gibi gaitalardan elde edilen örnekler inkübe

edilmiş, inkübasyon sonucunda ilk olarak koloni morfolojilerine göre bir elemine

yapılmıştır. Resim. 1’de L. salivarius LS-22 suşunun 24 saatlik inkübasyon

sonrasında petri kabında oluşan koloni görünümlerinin fotoğrafları verilmiştir.

Resim 1: MRS Agar üzerinde 48 saat inkbasyona bırakılmış L. salivarius LS-22suşunun Samsung S760 fotoğraf makinesi ile çekilmiş görüntüsü.

Resim 1’de görüldüğü üzere kirli beyaz, beyaz ve opak koloniler alınmış, faz-

kontrast mikroskopta gram özelliği incelenerek, gram pozitif, basil bakteriler

seçilerek numaralandırılmıştır. Resim 2’de L. pentosus LS-2 suşunun mikroskop

görüntüsü verilmiştir.

35

Resim 2: L. pentosus LS-2 suşunun Olympus, CH-2 CHT model ışık mikroskobunda100x10 büyütmede görünümü

Numaralandırılan suşların idendifikasyonu API 50 CHL medium (Bio

Mérieux La Bali Grottes, France) kullanılarak yapılmıştır. Yaptığımız bu çalışmada,

25 adet Lactobacillus spp. suşu izole edilmiş ve 8 farklı Lactobacillus spp.

tanımlanmıştır. Gaitadan izole edilen suşların türlere göre dağılımı 11 adet L.

plantarum1 (% 44), 6 adet L. fermentum2 (% 20), 3 adet L. pentosus (% 12), 1 adet

L. delbrueckii subsp. delbrueckii (% 4), 1 adet L. paracasei subsp. paracasei (% 4), 1

adet L. lactis subsp lactis (% 4), 1 adet L. curvatus (% 4) ve 1 adet L. salivarius (%

4) olarak tespit edilmiştir. Suşların isim ve numaraları Tablo. 2’ de verilmiştir.

Jacobsen ve ark. (1999) 120 tarafından yapılan bir çalışmada sağlıklı yetişkin

ve çocuklardan alınan feçeslerde L. paracasei subsp. paracasei, L. plantarum, suşları

izole edilmiştir. Moser ve Savage (2001)’ nın 121 yaptıkları bir çalışmada yetişkin ve

bebek feçeslerinden L. fermentum, L. paracasei subsp. paracasei suşlarının izole

edildiği bildirilmiştir. Martin ve ark. (2006) 122 tarafından yapılan başka bir

çalışmada ise 1 aylık bebek feçeslerinden L. salivarius suşu izole edilmiştir. Klare ve

ark. (2007) 123 tarafından yapılan insan kaynaklı Lactobacillus spp. suşlarının izole

36

edilmeye çalışıldığı bir araştırmada ise L. fermentum, L. plantarum ve L. salivarius

bakterilerinin izole edildiği rapor edilmektedir.

Tablo 2. Gaitadan izole edilerek tanımlanan suşların adları ve kodları

SUŞ ADI SUŞ NO

L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1

L. pentosus LS-2

L. pentosus LS-3

L. plantarum1 LS-4

L. fermentum2 LS-5

L. plantarum1 LS-6

L. paracasei subsp. paracasei LS-7

L. plantarum1 LS-8

L. lactis subsp. lactis LS-9

L. plantarum1 LS-10

L. plantarum1 LS-11

L. plantarum1 LS-12

L. pentosus LS-13

L. plantarum1 LS-14

L. fermentum2 LS-15

L. fermentum2 LS-16

L. curvatus LS-17

L. plantarum1 LS-18

L. fermentum2 LS-19

L. plantarum1 LS-20

L. plantarum1 LS-21

L. salivarius LS-22

L. plantarum1 LS-23

L. fermentum2 LS-24

L. fermentum2 LS-25

37

4.2. Lactobacillus spp. SUŞLARIN ASİT DİRENÇLİLİĞİ

Lactobacillus spp. suşlarının asit dirençlilikleri Bölüm 3.2.3’te anlatıldığı

şekilde tespit edilmiştir. Sonuçlar Tablo 3’te verilmiştir.

Tablo 3. Lactobacillus suşlarının düşük pH (2.0, 2.5 ve 3.0) derecelerinetoleransı. (24 saat sonra)

İzolatlar

Farklı pH değerleri

2.0 2.5 3.0

Canlı mikroorganizma sayısı (cfu/ml)

L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1 6x107 24x107 30x107

L. pentosus LS-2 6x107 18x107 30x107

L. pentosus LS-3 18x107 30x107 30x107

L. plantarum1 LS-4 12x107 24x107 30x107

L. fermentum1 LS-5 24x107 24x107 30x107


L. paracasei subsp. paracasei LS-7 12x107 30x107 30x107


L. lactis subsp. lactis LS-9 12x107 30x107 30x107




L. pentosus LS-13 12x107 24x107 30x107




L. curvatus LS-17 12x107 18x107 30x107





L. salivarius LS-22 15x107 24x107 30x107




38

Düşük pH’ya dirençlilik probiyotik mikroorganizmalar için çok önemli bir

kriterdir. Probiyotik mikroorganizmaların ince bağırsağa gelene kadar mide asitliğine

yakın pH değerlerine (< 3.0) dayanabilmeleri gerekmektedir 124.

Tablo 3’te de görüldüğü gibi pH değeri yükseldikçe hücrelerin canlı kalma

sayılarında bir artış gözlenmektedir. Genel olarak pH 3.0 seviyesinde bütün

mikroorganizmaların canlılıklarını korudukları gözlenmektedir.

Yaptığımız çalışmada Lactobacillus suşlarının asit dirençleri ile ilgili elde

ettiğimiz sonuçlara benzer sonuçları Prasad ve ark.’larıda (1999) 125 bulmuştur.

Yapılan bu çalışmada insanlardan, süt ve süt ürünlerinden izole ettikleri

Lactobacillus suşlarını pH 3.0’te 3 saat canlılıkları incelenmiştir. Sonuçta bu suşların

% 80 oranında canlılıklarını koruduklarını gözlemlemişlerdir. Xanthopoulus ve

ark.’nın (2000) 126 yapmış olduğu başka bir çalışmada ise, bebek feçeslerinden izole

edilmiş L. acidophlus, L. gasseri, L. reuteri, ve L. rhamnosus türlerinden oluşan 20

suşun pH 3.0 de canlılıklarını %0.1-73.3 oranında korudukları belirtilmiştir.

Asit dirençliliği çalışmamızda pH 2.0 değerinde ise canlı kalabilme

oranlarında pH 3.0’e göre bir düşüş gözlenmektedir L. fermentum1 LS-5, L.

fermentum2 LS-15, L. plantarum1 LS-20 ve L. fermentum2 LS-25 suşlarının

canlılıklarını diğer suşlara göre daha iyi korudukları tespit edilmiştir. L. delbrueckii

subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-10, L. plantarum1 LS-

11, L. fermentum2 LS-19, L. plantarum1 LS-23 ve L. fermentum2 LS-24 suşlarının

ise düşük pH değerlerine dirençlerinin daha zayıf olduğu tespit edilmiştir.

Pereira ve Gibson (2002) 127, insan feçesinden izole ettikleri L. fermentum

KC5b suşunun pH 2’de 2 saat canlılığını sürdürebilmesi ile aside toleranslı suş

olarak belirlemişlerdir. Haller ve ark. (2001) 128 tarafından yapılan bir çalışmada

çeşitli kaynaklardan izole edilen Lactobacillus suşlarının pH 2.0 de canlılıkları % 0-

93 olarak tespit edilmiştir. Bu çalışmaya göre farklı türlerin hatta aynı suşa ait

türlerin, pH dirençlerinin farklı olmasının sebebi bakterilerin üreme fazındaki

farklılıktan kaynaklandığı belirtilmiştir.

39

4.3. Lactobacillus spp. SUŞLARIN YÜKSEK SAFRA TUZU (OXGALL)

KONSANTRASYONLARINDA DİRENÇLİLİĞİ

Probiyotik mikroorganizmalar için bir diğer önemli kriter ise safra tuzlarına

karşı dirençliliktir. Çünkü insan sindirim sistemine giren bakteriler midenin asit

ortamından geçtikten sonra bağırsaklarda safra asitleri ve tuzları ile karşılaşırlar. Bu

bakterilerin canlı kalabilmeleri açısından safra tuzu toleranslarının yüksek olması

gerekmektedir 125.

Değişik safra konsatrasyonlarında (% 0.3, % 0.5, % 1.0 ve % 1.5) 3 saatlik

inkübasyona bırakılan Lactobacillus suşlarının safra tuzu dirençliliği Tablo 4’te

gösterilmiştir.

Tablo 4. Lactobacillus spp. suşlarının değişik düzeyde (% 0.3, % 0.5, % 1.0 ve % 1.5) safra tuzu (oxgall) toleransı

İzolatlarFarklı safra tuzu (oxgall) konsantrasyonları (%)

0.3 0.5 1.0 1.5Canlı mikroorganizma sayısı (24 saat sonra) (cfu/ml)

L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1 1320x106 420x106 240x106 120x106

L. pentosus LS-2 600x106 300x106 160x106 100x106

L. pentosus LS-3 120x106 - - -L. plantarum1 LS-4 360x106 240x106 - -L. fermentum1 LS-5 60x106 - - -L. plantarum1 LS-6 280x106 - - -L. paracasei subsp. paracasei LS-7 240x106 - - -L. plantarum1 LS-8 180 x106 60 x106 - -L. lactis subsp. lactis LS-9 - - - -L. plantarum1 LS-10 120 x106 - - -L. plantarum1 LS-11 180 x106 180 x106 120 x106 120x106

L. plantarum1 LS-12 180 x106 120 x106 100 x106 60 x106

L. pentosus LS-13 - - - -L. plantarum1 LS-14 - - - -L. fermentum2 LS-15 300 x106 260 x106 200 x106 160 x106

L. fermentum2 LS-16 420 x106 300 x106 60 x106 -L. curvatus LS-17 - - - -L. plantarum1 LS-18 180 x106 - - -L. fermentum2 LS-19 720 x106 240 x106 - -L. plantarum1 LS-20 - - - -L. plantarum1 LS-21 120 x106 - - -L. salivarius LS-22 - - - -L. plantarum1 LS-23 360x106 - - -L. fermentum2 LS-24 120 x106 - - -L. fermentum2 LS-25 180 x106 60 x106 - -

Canlı kalma oranı %76 %40 %24 %20

40

41

Tablo 4’te de görüldüğü üzere safra tuzuna dayanıklılık açısından suşlar

arasında farklılıklar bulunmaktadır. Lactobacillus suşlarının % 0.3 safra tuzu içeren

ortamda canlı kalabilme oranı % 76 olmuştur. Bu oran % 0.5 safra tuzu içeren

ortamda %40, %1 safra tuzu içeren ortamda % 24 ve % 1.5 safra tuzu içeren ortamda

ise %20’ye düşmüştür. Bu çalışmada safra tuzuna karşı toleransı en iyi olan suşlar L.

delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L.

plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-15, L. fermentum2 LS-16 olduğu

gözlemlenmiştir.

Papamanoli ve ark’nın (2003) 129 % 3.0 safra konsantrasyonunun L. sakei, L.

curvatus, ve L. plantarum türlerine ait suşlar üzerinde inhibe edici etkisini

araştırmışlardır. Çalışmanın sonucunda L. sakei suşları % 100, L. curvatus suşları %

42 ve L. plantarum suşları % 0 oranında inhibe edilmiştir. Yapılan bir diğer

çalışmada ise L. oris AS17 ve L. fermentum AS83 suşlarının %3.0 safra tuzu içeren

ortamda 4 saat süreyle safra tuzu toleransı incelenmiş, bu iki suşun % 3.0’lık safra

tuzuna konsantrasyonunda canlılıklarını koruyabildikleri belirtilmiştir. Bir başka

çalışmada ise, Gilliland ve Walker (1990) 130 12 adet L. acidophilus bakterisinin

safra toleransını incelemiş, kültürler arasında safra toleransı bakımından önemli

farklılıklar tespit etmiştir. Usman ve Hosono (1999) 131 yaptıkları çalışmada L.

gasseri bakterisinin suşları arasında safra tuzları toleransı bakımından farklılıklar

olduğunu belirtmişlerdir.

4.4 Lactobacillus spp. SUŞLARININ SAFRA TUZU (KOLİK ASİT)

HİDROLİZİ

Dekonjuge safra asitleri bağırsak florası ile sekonder safra asitlerine

dönüştürülmektedir. Böylece serum kolesterol düzeyi düşemektedir. 132, 133.

Bölüm 3.2.5’te safra tuzu hidrolizinin belirlenmesi üzerine yapılan araştırma

sonucu elde edilen veriler Tablo 5’de sunulmuştur.

42

Tablo 5. Lactobacillus spp. suşlarının safra tuzu hidroliz (kolik asit) aktivitesi.

SUŞLAR Sonuç*

L. delbrueckii subsp delbrueckii LS-1 +++L. pentosus LS-2 +++L. pentosus LS-3 +++L. plantarum1 LS-4 +++L. fermentum1 LS-5 +++L. plantarum1 LS-6 +++L. paracasei subsp. paracasei LS-7 +++L. plantarum1 LS-8 +++L. lactis subsp. lactis LS-9 +++L. plantarum1 LS-10 +++L. plantarum1 LS-11 ++L. plantarum1 LS-12 -L. pentosus LS-13 ++L. plantarum1 LS-14 +++L. fermentum2 LS-15 +L. fermentum2 LS-16 +++L. curvatus LS-17 +++L. plantarum1 LS-18 +++L. fermentum2 LS-19 -L. plantarum1 LS-20 -L. plantarum1 LS-21 -L. salivarius LS-22 -L. plantarum1 LS-23 -L. fermentum2 LS-24 ++L. fermentum2 LS-25 +

*Safra tuzu hidroliz aktivitesi

**(-): Negatif, (+): Zayıf, (++): Orta, (+++): Yüksek.

Tablo 5’de görüldüğü gibi suşların genelinin safra tuzunu dekonjuge

edebildiği görülmektedir. Sadece suşların altı tanesi safra tuzunu hidroliz

edememişlerdir. L. fermentum2 LS-15 ve L. fermentum2 LS-25 suşları ise belirli bir

miktarda kolik asit hidrolizini gerçekleştirmişlerdir. Resim 3’ de hidroliz edilmemiş

kolik asit kristali gösterilmiştir. Bu çalışmada en iyi sonuç veren suşlardan L.

pentosus LS-2’nın gerçekleştirmiş olduğu kolik asit hidrolizi görüntüsü ise Resim

4’te verilmiştir.

43

Resim 3: Hidroliz edilmemiş kolik asit kristali. Novax AP-5 50920 binokülermikroskobunda 20X büyütmedeki görüntüsü.

Resim 4: L. pentosus LS-2 suşunun gerçekleştirdiği safra tuzu (kolik asit) hidrolizi.Kolik asit kristallerinin parçalanmış hali. Novax AP-5 50920 binokülermikroskobunda 20X büyütmedeki görüntüsü.

Moser ve Savage (2001)121, 30 tanesi insan kaynaklı, 15 tanesi süt

ürünlerinden, 4 tanesi farklı kaynaklardan izole edilmiş Lactobacillus suşunun BSH

44

(Bile salt hydrolyzed) aktivitelerinin incelendiği bir çalışma yapmışlardır. Yapılan bu

çalışmada suşların % 55.1 pozitif sonuç verirken, diğer %44.9 BSH aktivitelerinin

negatif olduğu tespit edilmiştir.

4.5. Lactobacillus spp. SUŞLARININ ANTİMİKROBİYAL

AKTİVİTELERİ

Gaitadan izole edilen Lactobacillus spp. suşlarının ampisilin (10 µg),

basitrasin (10 unit), eritromisin (15 µg), gentamisin (10 µg), meropenem (10 µg)

penisilin (10 unit), piperasilin (100 µg), rifampin (5 µg), seftazidim (10 µg),


antibiyotiklerine karşı duyarlılıkları NCCLS kriterlerine göre değerlendirilmiştir.

Test sonuçları Tablo 6 da verilmiştir. Ayrıca %’de duyarlılık oranları Tablo 7 ve

Şekil 2’de gösteriliştir.

Tablo 6. Gaitadan izole edilen Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı duyarlılık sonuçları (mm).

Lactobacillus spp.Antibiyotikler*

PIP B CAZ RA TE E AM TEC GM VA TMP P MEM**

L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1 S R S S S S S R I R R R SL. pentosus LS-2 S R S S S S S R I R R R SL. pentosus LS-3 S S S S S S S S S S S S SL. plantarum1 LS-4 S S S S S S S S I S S S SL. fermentum1 LS-5 S R S S I S S S R S R S SL. plantarum1 LS-6 S I S S S S S S S S S S SL. paracasei subsp. paracasei LS-7 S I S S S S S S I S R S SL. plantarum1 LS-8 S S S S S S S S I R S S SL. lactis subsp. lactis LS-9 S R S S S S S R R R S S SL. plantarum1 LS-10 S R S S S S S R I R S S SL. plantarum1 LS-11 S R S S S S S R I R S S SL. plantarum1 LS-12 S S S S S S S R I R R S SL. pentosus LS-13 S I S I S S S S I S R S SL. plantarum1 LS-14 S R I I S S S S I S R S SL. fermentum2 LS-15 S S S S S S S R I S R S SL. fermentum2 LS-16 S R S S S S S R I R I R SL. curvatus LS-17 S I S S I R S S I S R S SL. plantarum1 LS-18 S S S S S S S S S S S S SL. fermentum2 LS-19 S R S S S S S R I R I R SL. plantarum1 LS-20 S I S S S S S S I S R R RL. plantarum1 LS-21 S S S S S S S R I I R S SL. salivarius LS-22 S S S S S S S S I S I S SL. plantarum1 LS-23 S S S S S S S R I R R S SL. fermentum2 LS-24 S R S S S S S I I R R I SL. fermentum2 LS-25 S R I S S S S S I S R S S

*S=duyarlı R=dirençli I=orta duyarlı**PIP: ampisilin (10 µg), basitrasin (10 unit), eritromisin (15 µg), gentamisin (10 µg), meropenem (10 µg) penisilin (10 unit), piperasilin (100 µg), rifampin (5 µg), seftazidim (10 µg),


45

46

Tablo 7. Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı %’de duyarlılıksonuçları.

Antibiyotik Duyarlı Dirençli Orta DuyarlıAmpisilin 100 - -Basitrasin 36 44 20Eritromisin 96 - 4Gentamisin 12 8 80Meropenem 96 4 -Penisilin 76 20 4Piperasilin 100 - -Rifampin 92 - 8Seftazidim 92 - 8Teikoplanin 52 44 4Tetrasiklin 92 - 8Trimetoprim 32 56 12Vankomisin 52 44 4

Bu çalışmada Lactobacillus suşlarının genel olarak antibiyotiklere karşı

duyarlı oldukları gözlenmiştir. Özellikle piperasilin ve ampisilin de tüm suşların

duyarlı oldukları tespit edilmiştir. Bununla birlikte yaygın olarak kullanılan

gentamisin, trimetoprim ve vankomisin antibiyotiklerine karşı daha dirençli oldukları

görülmüştür. Lactobacillus suşlarından L. pentosus LS-3 ve L. plantarum1 LS-18

tüm antibiyotiklere duyarlı oldukları tespit edilmiştir. L. delbrueckii subsp.

delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12, L.

fermentum2 LS-16, L. fermentum2 LS-24 suşlarının antibiyotiklere karşı çalışmadaki

diğer suşlardan daha dirençli oldukları gözlemlenmiştir.

47

05101520253035404550556065707580859095100

% D

uy

arl

ılık

Ora

nla

rı

Antibiyotikler

Duyarlı

Dirençli

OrtaDirençli

Şekil 2. Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı %’de duyarlılıkoranları.

Temmerman ve ark. (2003) 134 tarafından yapılan bir çalışmada çeşitli

probiyotik ürünlerden izole edilmiş laktik asit bakterilerinin disk difüzyon yöntemi

ile antibiyotik duyarlılıkları test edilmiştir. Araştırmacılar çalışma sonucunda suşların

tetrasiklin ve eritromisine duyarlı olduklarını tespit etmişlerdir. Arıcı ve ark.’nın

(2004) 135 probiyotik özelliğe sahip 21 Lactobacillus suşu üzerinde yapığı çalışmada,

suşların tetrasikline karşı duyarlı oldukları belirtilmiştir.

4.6. Lactobacillus spp. SUŞLARIN BAZI PATOJEN

MİKROORGANİZMALARA KARŞI ANTAGONİSTİK ETKİLERİ

Lactobacillus suşlarının bu çalışmada kullanılan patojen mikroorganizmalara

karşı genel olarak inhibisyon etkilerinin olduğu gözlemlenmiştir. Elde edilen

sonuçlar Tablo 8’de gösterilmiştir. Lactobacillus suşları genel olarak patojenlere

karşı inhibitör etki gösterirlerken sadece L. plantarum1 LS-18 suşunun hiçbir

48

patojende zon çapı oluşturmadığı tespit edilmiştir. Patojenler karşı inhibitör etkileri

en iyi düzeyde olan suşlar ise L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-

2 L. plantarum1 LS-10 L. plantarum1 LS-11 L. plantarum1 LS-12, L. fermentum2

LS-15 L. fermentum2 LS-16, L. salivarius LS-22 olarak tespit edilmiştir.

Tablo 8. Lactobacillus spp. suşlarının değişik patojen bakterilerine karşı oluşturdukları antagonistik etkileri (mm).

Lactobacillus spp.

Patojen mikroorganizmalara karşı inhibisyon zonları (mm)

S. epidermidis P. aeruginosa K. pneumoniae E. coli Neisseria sp.

L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1 13±0.1 13±0.1 11±0.2 10±0.0 17±0.3L. pentosus LS-2 16±0.5 19±0.2 12±0.1 12±0.1 17±0.2L. pentosus LS-3 12±0.2 - - 12±0.2 -L. plantarum1 LS-4 10±0.1 10±0.0 - - -L. fermentum1 LS-5 13±0.1 12±0.3 - - -L. plantarum1 LS-6 19±0.2 20±0.5 15±0.0 16±0.1 22±0.4L. paracasei subsp. paracasei LS-7 14±0.2 16±0.5 11±0.0 10±0.4 14±0.1L. plantarum1 LS-8 18±0.3 16±0.5 11±0.4 15±0.2 17±0.1L. lactis subsp. lactis LS-9 12±0.2 22±0.5 11±0.1 16±0.2 16±0.3L. plantarum1 LS-10 20±0.3 20±0.2 14±0.0 15±0.2 22±0.5L. plantarum1 LS-11 18±0.2 18±0.2 13±0.1 15±0.3 20±0.2L. plantarum1 LS-12 18±0.1 19±0.2 - 13±0.4 16±0.4L. pentosus LS-13 16±0.2 17±0.1 - 11±0.0 17±0.3L. plantarum1 LS-14 11±0.1 - - - -L. fermentum2 LS-15 18±0.2 19±0.4 13±0.3 12±0.2 17±0.3L. fermentum2 LS-16 17±0.4 16±0.1 12±0.4 13±0.1 18±0.2L. curvatus LS-17 13±0.0 13±0.1 - - 11±0.0L. plantarum1 LS-18 - - - - -L. fermentum2 LS-19 - 12±0.4 - - -L. plantarum1 LS-20 15±0.0 19±0.2 13±0.1 14±0.0 18±0.0L. plantarum1 LS-21 16±0.0 20±0.1 12±0.0 12±0.0 16±0.2L. salivarius LS-22 20±0.2 19±0.4 13±0.3 14±0.0 16±0.0L. plantarum1 LS-23 15±0.0 16±0.1 12±0.0 14±0.1 -L. fermentum2 LS-24 11±0.2 16±0.3 12±0.2 - -L. fermentum2 LS-25 - 12±0.0 - - -

49

50

4.7. Lactobacillus spp. SUŞLARI TARAFINDAN ÜRETİLEN

BAKTERİOSİN VEYA BAKTERİOSİN BENZERİ MADDELERİN

İNHİBİTÖR ETKİLERİ

Lactobacillus suşlarının ürettikleri laktik asit dışındaki diğer metabolitlerinin

inhibitör etkilerinin belirlenmesi üzerine Bölüm 3.2.9’da anlatıldığı gibi yapılmıştır.

% 0.2 glikozlu MRS sıvı besiyerinde geliştirilen Lactobacillus spp. izolatları patojen

bakterilere karşı hiçbir inhibisyon etki göstermemiştir. Bu durum bize indikatör

bakterilere karşı inhibisyon etkinin laktik asit bakterilerin ürettiği organik asitlerden

ileri geldiğini göstermektedir.

4.8. Lactobacillus spp. SUŞLARININ KOLESTEROL GİDERİMİ

Yüksek kolesterol damarları tıkayıp kalp krizlerine ve ölümlere neden

olmaktadır. Laktik asit bakterilerinin kolesterolü asimile ederek serum kolesterol

seviyesini düşürdüğü bilinmektedir. Araştırmada düşük asitliğe ve yüksek safra

tuzuna dayanıklı, safra tuzu aktivitesi yüksek, antagositik etkiye sahip 5 suş seçilmiş

ve kolesterol giderimi çalışılmıştır. Tablo 9’de ve Şekil 3’de L. delbrueckii subsp.

delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12 ve L.

fermentum2 LS-15 suşlarının insan plazma serumunda kolesterol giderimi

görülmektedir. Besiyeri olarak MRS sıvı besi yerinde değişik safra tuzu (% 0.3

oxgall, kolik asit ve taurocholic asit) ortamlarında çalışma yapılmıştır. Çalışmamızda

kültürler MRS sıvı besi yerinde 10-22 µg/ml, % 0.3’lük oxgall’lı MRS sıvı besi

yerinde 14-50 µg/ml, % 0.3’lük kolik asit’li MRS sıvı besi yerinde 8-13.5 µg/ml ve

% 0.3’lük taurocholic asit’li MRS sıvı besi yerinde 15-55 µg/ml kolesterol

asimilasyonu yapmıştır.

Tablo 9: Bazı Lactobacillus suşlarının MRS sıvı besiyerinde ve değişik safra tuzu ( % 0.3 oxgall, kolik asit ve taurocholic asit) besiyerinde

kolesterol giderimi (µg/ml).

Lactobacillus spp.MRS +

Kollesterol

MRS+

% 0.3 Oxgall +

Kollesterol

MRS +

% 0.3 Kolik Asit +

Kollesterol

MRS +

% 0.3 Taurocholic Asit +

Kollesterol

L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1 10 17 9 15

L. pentosus LS-2 13 14 8 43

L. plantarum LS-11 15.5 37.5 10.5 57

L. plantarum LS-12 22 50 13.5 60

L.fermentum LS-15 21 25.5 10 55

51

52

0

10

20

30

40

50

60

70

LS-1 LS-2 LS-11 LS-12 LS-15

MRS

MRS+%0,3 Oxgall

MRS+%0,3 Kolik asit

MRS+%0,3 Taurochili asit

Şekil 3. L. delbrueckii ssp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum LS-11,

L. plantarum LS-12 ve L.fermentum LS-15 suşlarının kolesterol giderim miktarları

(µg/ml).

Gilliland ve ark. (1985) 136 çalışmalarında L. acidophilus suşlarının % 0.5

oxgall ilaveli MRS sıvı besi yerinde, ortamın plazma serum kolesterolünü 18.8-63.0

µg/ml değerinde asimilasyon yaptığını saptamışlardır. Buck ve Gilliland (1994) 137

bir çalışmada insan kaynaklı L. acidophilus suşlarının 20.5-83.3 µg/ml kolesterol

asimilasyonu yaptığını göstermişlerdir. Brashears ve ark.’na (1998) 138 göre L. casei

suşları MRS sıvı besi yerinde 16.9-74.3 µg/ml kolesterol asimilasyonu yapmıştır.

Loing ve Shah (2005) 139 çalışmalarında Lactobacillus’ların MRS sıvı besiyerinde

10.00-21.61 µg/ml ve % 0.30 oxgall ilaveli MRS sıvı besi yerinde 12.03-32.25 µg/ml

kolesterol asimile ettiğini belirlemişler. 2010 yılında yapılan başka bir çalışmada Lye

ve arkadaşları Lactobacillus suşlarının MRS sıvı besi yerinde 14.22-27.89 µg/ml ve

% 0.30 oxgall’lı MRS sıvı besi yerinde 11.17-62.42 µg/ml kolesterol asimile

ettiklerini belirlemişlerdir 140.

Araştırmamız da diğer çalışmalarla paralellik arz etmektedir. L. plantarum

LS-11 MRS besi yerinde 15.5 µg/ml, % 0.3’lük oxgall MRS besi yerinde da 37.5

µg/ml, % 0.3’lük kolik asit 10.5 µg/ml ve % 0.3’lük taurocholic asit MRS besi

53

yerinde 57 µg/ml, L. plantarum LS-12 suşu MRS besi yerinde 22 µg/ml, % 0.3’lük

oxgall MRS besi yerinde 50 µg/ml, % 0.3’lük kolik asit 13.5 µg/ml ve % 0.3’lük

taurocholic asit MRS besi yerinde 60 µg/ml ve L. fermentum LS15 suşu MRS besi

yerinde 21 µg/ml, % 0.3’lük oxgall MRS besi yerinde de 25.5 µg/ml, % 0.3’lük kolik

asit 10 µg/ml ve % 0.3’lük taurocholic asit MRS besi yerinde 55 µg/ml kolesterol

giderimi yapmıştır. Yaptığımız çalışmadan da anlaşıldığı gibi MRS sıvı besiyeri ve

% 0.3’lük kolik asit katkılı MRS sıvı besi yerinde, bakterilerin kolesterol giderimi %

0.3’lük oxgall ve taurocholic asit MRS sıvı besi yerinden daha yüksek olduğu

gözlenmektedir. Bu üç suşun kolesterol gideriminde kullanılabileceği belirlenmiştir.

54

5. SONUÇ VE ÖNERİLER

İnsan vücudu milyarlarca mikroorganizmaya konakçılık eden bir

ekosistemdir. Bu ekosistemde zararlı ve yararlı mikroorganizmalar bir rekabet

halinde olup, sağlıklı insanlarda yararlı mikroorganizmalar baskın mikroflorayı

oluşturmaktadır. İnsan vücudunda mikrofloranın en geniş olduğu yer ise sindirim

sistemidir. Özellikle bağırsaklar yapısı ve işlevi gereği birçok mikroorganizmayı

barındırmaktadır. Bağırsakların fonksiyonu insanların uzun ömürlü ve sağlıklı

yaşaması için çok önemlidir. Filogenetik süreçte yararlı mikroorganizmalarla

insanlar arasında mutualist bir yaşam başlamış, bu mikroorganizmalar bağırsaklara

yerleşerek, bağırsak fonksiyonlarını olumlu yönde etkilemişlerdir 1-4, 15.

Eski çağlarda yaşamış insanların diyetlerini göz önüne getirdiğimizde

günümüz insanına göre çok daha fazla miktarda süt ürünleri ve lifli besin tükettiği

görülmektedir. Bu beslenme tarzı sayesinde bağırsak mikroflorasında yararlı türler

gelişmekte ve bağırsak fonksiyonları daha düzenli olmaktaydı. Dolayısıyla insanlar

daha sağlıklı ve daha uzun ömürlüydüler 4, 9, 18, 25.

Bu bağlamda günümüz insanının stresli yaşam tarzı, fazla miktarda rafine

gıdaların tüketimi ve dengesiz beslenme, düzensiz antibiyotik kullanımı, alkol ve

sigara gibi alışkanlıklar insan vücudunu olumsuz etkilediği gibi vücuda yararlı olan

mikroorganizmalarında sayısını önemli ölçüde azaltmaktadır. Böylece insanlar hem

direk hem de dolaylı olarak ciddi sağlık sorunlarıyla karşılaşmaktadırlar 18, 25.

Starchan tarafından ileri sürülen ‘Hijyen hipotezi’ günümüz insanının yaşadığı

mikrobiyal problemlere verilebilecek güzel bir örnektir. Starchan’a göre çok steril

ortamda yetiştirilen bireylerde alerjik rinit insidansının daha sık görüldüğü tespit

edilmiştir. Bu hipoteze göre insanların aşırı mikrobiyol kontrolu, eskiye göre daha az

insanlarla temas halinde olması (daha az kardeş sayısı ve arkadaş sayısı gibi) ve

hijyen kontrollerinin iyileştirilmesi gibi etkenler insanların gastrointestinal

sisteminde yerleşecek olan yararlı mikroorganizmaların gelişimini engellemektedir141. Bu nedenle gastointestinal sistemde azalan mikroorganizma sayısını

düzenleyebilmek için probiyotik ve prebiyotik takviyeler tavsiye edilmektedir 9.

55

Yüz yılı aşkın bir süredir bazı bilim insanlarının ilgisini çeken bağırsak

mikroflorası üzerine gün geçtikçe yeni araştırmalar yapılmış ve yapılmaktadır. Bu

konuyla ilgili olarak en çok araştırma yapılan konu başlığı probiyotiklerdir.

Günümüzde doğal ürünlere tekrar dönmeye başlayan insanlarında ilgisini çekmeyi

başlamış olan probiyotikler, gastrointestinal sistem üzerinde yaşayan ve konakçıya

belirgin bir yarar sağlayan mikrobiyolojik canlılardır23,30,36.

Probiyotikler insan ve hayvan sağlığı üzerinde büyük faydalar sağlayan

mikroorganizmalardır. Probiyotik bakteriler üzerinde son 30 yılda çok sayıda

araştırmalar yapılmakta ve ülkemizde 2000’li yıllardan sonra üzerinde araştırmalar

yapılmaya başlanmıştır. Ülkemizde yetişkin insanlardan izole edilen Lactobacillus

bakterileri üzerinde yapılmış bir çalışma bulunmamaktadır. Aynı zamanda insan

plazma serumu ile in vitro olarak kolesterol giderimi çalışması da yapılmamıştır.

Bu çalışmada, yaşları 25-50 arasında değişen sağlıklı insanların intestinal

sistemine ait 25 adet Lactobacillus spp. suşları üzerinden yürütülmüştür. Suşların

düşük asit ve yüksek safra tuzu (oxgall) tölarensları, safra tuzu (kolik asit) hidroliz

aktiviteleri, antibiyotik dirençleri, antagonistik etkileri, ve bu suşlar tarafından

üretilen bakteriosin veya bakteriosin benzeri ürünlerin inhibitör etkileri gibi

probiyotik özellikler yönünden değerlendirilmiştir. Ayrıca L. delbrueckii subsp.

delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. Plantarum1 LS-11, L. Plantarum1 LS-12 ve

L. Fermentum2 LS-15 suşları seçilerek kolesterol giderimlerine bakılmıştır.

Probiyotik mikroorganizmalar bağırsaklarda lokalize olduklarına göre doğal

olarak gastrointestinal sistemin şartlarına uyum sağlamaları gerekmektedir. Bu

nedenle öncelikli olarak yüksek asitli ortamlara dirençli olmaları gerekmektedir.

Yapmış olduğumuz üç değişik düşük pH çalışmasında; pH 3 değerinde bütün

suşlarımızın canlılığını korudukları gözlemlenmiştir. pH 2.0 değerinde ise canlı

kalabilme oranlarında pH 3.0’e göre bir düşüş gözlenmektedir L. fermentum1 LS-5,

L. fermentum2 LS-15, L. plantarum1 LS-20 ve L. fermentum2 LS-25 suşlarının

canlılıklarını diğer suşlara göre daha iyi korudukları tespit edilmiştir. L. delbrueckii

subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-10, L. plantarum1 LS-

11, L. fermentum2 LS-19, L. plantarum1 LS-23 ve L. fermentum2 LS-24 suşlarının

56

ise düşük pH değerlerine dirençlerinin daha zayıf olduğu tespit edilmiştir (Bkz.

Tablo 3).

Gastrointestilal sistemin ağır şartlarından, düşük pH’ın yanı sıra, bir diğer

faktörde bilindiği üzere yüksek safra tuzu yoğunluğudur. Probiyotik

mikroorganizmalarda aranan özelliklerden başlıcalarıdan olan safra tuzu dirençliliği

ile ilgili olarak suşlarımızla yapmış olduğumuz değişik safra tuzu

konsantrasyonlardaki (% 0.3, % 0.5, % 1.0 ve % 1.5) çalışmalarımızda, doğal olarak

tuz yoğunluğu yükseldikçe canlı kalma oranlarında azalma olduğu

gözlemlenmektedir (% 0.3 safra tuzunda % 76 iken % 1.5 safra tuzunda % 20).

Sonuç olarak safra tuzuna karşı toleransı en iyi olan suşlar L. delbrueckii subsp.

delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12, L.

fermentum2 LS-15, L. fermentum2 LS-16 olduğu gözlemlenmiştir (Bkz. Tablo 4).

Safra tuzu toleransı ile ilgili olarak bir diğer çalışmamız olan, safra tuzu

hidrolizinde elde ettiğimiz sonuçlar da ise suşlarımızın genelinin safra tuzunu

dekonjuge edebildiği görülmektedir. Dekonjuge safra asitleri bağırsak florası ile

sekonder safra asitlerine dönüştürülmektedir. Böylece serum kolesterol düzeyi

düşemektedir. Serum kolesterol seviyesini düşürme özelliğinin bulunması

Probiyotiklerin yararları konusunda aranan bir özelliktir. Bu çalışmamızda, sadece

altı suşumuz safra tuzunun hidrolizini gerçekleştirememiştir. L. fermentum2 LS-15

ve L. fermentum2 LS-25 suşlarımız ise belirli bir miktarda kolik asit hidrolizini

gerçekleştirmişlerdir. Çalışmada en iyi sonuç veren suşumuz L. pentosus LS-2’dir

(Bkz. Tablo 5 ve Resim 4).

Probiyotik mikroorganizmalar gastrointestinal sistemin şartlarına dirençli

olmalarının yanı sıra dışarıdan gelebilecek etkenlere karşıda dirençli olmaları

gerekmektedir. Bu konuyla ilgili olarak yaptığımız antimikrobiyal aktivite

çalışmasında; suşlarımızın, ampisilin (10 µg), basitrasin (10 unit), eritromisin (15

µg), gentamisin (10 µg), meropenem (10 µg) penisilin (10 unit), piperasilin (100 µg),

rifampin (5 µg), seftazidim (10 µg), teikoplanin (30 µg), tetrasiklin (30 µg),

trimetoprim (5 µg), vankomisin (30 µg), antibiyotiklerine karşı duyarlılıkları

araştırılmış, genel olarak suşlarımızın bu antibiyotiklere karşı duyarlı oldukları

gözlemlenmiştir. Özellikle piperasilin ve ampisilin de tüm suşların duyarlı oldukları

57

tespit edilmiştir. Bununla birlikte yaygın olarak kullanılan gentamisin, trimetoprim

ve vankomisin antibiyotiklerine karşı daha dirençli oldukları görülmüştür.

Suşlarımızdan L. pentosus LS-3 ve L. plantarum1 LS-18 tüm antibiyotiklere duyarlı

oldukları tespit edilmiştir. L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2,

L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-16, L. fermentum2

LS-24 suşlarımız, diğer suşlarımıza göre daha dirençli oldukları gözlemlenmiştir.

Probiyotik mikroorganizmalar gastrointestinal sistemde patojen

mikroorganizmalarla rekabet içindedirler. Burada yaşayabilmeleri için patojen

mikroorganizmalara karşı antagonistik etki özelliklerinin olması gerekmektedir. Bu

özellikten yola çıkarak suşlarımız üzerinde yaptığımız çalışmada, 5 adet patojen

mikroorganizma kullanılmıştır. Bunlar: E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa

(ATCC 27853), K. pneumoniae (ATCC 25656) S. epidermidis (ATCC 12228) ve

Neisseria sp.’dir. Suşlarımızın bu çalışmada kullanılan patojen mikroorganizmalara

karşı genel olarak inhibisyon etkilerinin olduğu gözlemlenmiştir. Sadece L.

plantarum1 LS-18 suşumuz hiçbir patojende zon çapı oluşturmadığı tespit edilmiştir.

Patojenlere karşı inhibitör etkileri en iyi düzeyde olan suşlarımız ise L. delbrueckii

subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2 L. plantarum1 LS-10 L. plantarum1 LS-

11 L. plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-15 L. fermentum2 LS-16, L. salivarius

LS-22 olarak tespit edilmiştir.

Bu çalışmaya paralel olarak yürüttüğümüz bakteriosin veya bakteriosin

benzeri maddelerin inhibitör etkilerinin tespiti amacıyla yaptığımız çalışmada,

suşlarımızın ürettikleri laktik asit dışındaki diğer metabolitlerinin inhibitör etkilerinin

belirlenmesi üzerine % 0.2 glikozlu MRS sıvı besiyerinde geliştirilen suşlarımızdan

elde edilen supernatantlar, patojen bakterilere karşı hiçbir inhibisyon etki

göstermemiştir. Bu durum bize indikatör bakterilere karşı inhibisyon etkinin laktik

asit bakterilerin ürettiği organik asitlerden ileri geldiğini göstermektedir.

Yaptığımız bu çalışmaların sonuçlarından yola çıkarak probiyotik özellikleri

bakımından iyi sonuç veren düşük asitliğe ve yüksek safra tuzuna dayanıklı, safra

tuzu aktivitesi yüksek, antagositik etkiye sahip, L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-

1, L. pentosus LS-2, L. plantarum LS-11, L. plantarum LS-12 ve L. fermentum LS-15

suşlarımız alınarak, kolesterol giderimleri araştırılmıştır. Daha önceki bölümlerde de

58

bahsedildiği gibi kolesterol giderimi probiyotikler içinde aranan bir özellik olmuştur.

Yüksek kolesterol damarları tıkayıp kalp krizlerine ve ölümlere neden olmaktadır.

Laktik asit bakterilerinin kolesterolü asimile ederek serum kolesterol seviyesini

düşürdüğü bilinmektedir. Besiyeri olarak MRS sıvı besi yerinde değişik safra tuzu

(% 0.3 oxgall, kolik asit ve taurocholic asit) ortamlarında çalışma yapılmıştır.

En yüksek kolesterol giderimini L. plantarum LS-12 suşu MRS besi yerinde

22 µg/ml, % 0.3’lük oxgall MRS besi ortamında 50 µg/ml, % 0.3’lük kolik asit 13.5

µg/ml ve % 0.3’lük taurocholic asit MRS besi yerinde 60 µg/ml olarak vermiştir. L.

plantarum LS-11 MRS besi yerinde 15.5 µg/ml, % 0.3’lük oxgall MRS besi

ortamında 37.5 µg/ml, % 0.3’lük kolik asit 10.5 µg/ml ve % 0.3’lük taurocholic asit

MRS besi yerinde 57 µg/ml ve L. fermentum LS15 suşu MRS besi yerinde 21 µg/ml,

% 0.3’lük oxgall MRS besi ortamında 25.5 µg/ml, % 0.3’lük kolik asit 10 µg/ml ve

% 0.3’lük taurocholic asit MRS besi yerinde 55 µg/ml kolesterol giderimi yapmıştır.

Kolesterol giderimi yüksek olan bu üç suşun potansiyel probiyotik olabileceklerine

karar verilmiştir. Bu suşlar başka araştırmalarda kullanılmak üzere muhafazaya

alınmıştır.

Sonuç olarak, sağlıklı bir yaşam için gastrointestinal sistemin düzenli

çalışması elzemdir. Bu sistemin düzenli bir şekilde çalışabilmesi için probiyotikler en

iyi yardımcılardır. İnsan doğumundan itibaren bağırsak florası oluşmaya

başlamaktadır. Doğumdan sonraki dönem anne sütü kullanımı, bebeğin bulunduğu

ortam gibi etkenler bağırsak mikroflorasını belirlemektedir. İnsanlığın başlangıcında

her şey doğaldı ve kendiliğinden gerçekleşmekteydi. Günümüze baktığımızda

insanoğlunun hemen her şeyde müdahalesinin olduğunu görmekteyiz. Örneğin

doğumun sezaryan olması, doğumdan sonra anne sütünün kullanılmaması ve bebeğin

aşırı steril ortamda yetiştirilmesi, bireyin gastointestinal mikroflorasının daha

temelden olumsuz bir şekilde teşekkül etmesine neden olur. Birey büyüdükçe

günümüz şartlarında var olan dengesiz beslenme, gereksiz antibiyotik kullanımı,

sigara ve alkol kullanımı, rafine gıdaların tüketimi ve stresli yaşam tarzı, başlangıçta

oturmamış olan gastrointestinal florayı daha da olumsuz etkilemektedir. Bu nedenle

günümüzde de şahit olduğumuz bir takım doğrudan ve dolaylı birçok hastalıkla

muhatap olmaktayız. Bu nedenlerle sağlıklı bir yaşam ve hastalıkların tedavisinde

59

probiyotik mikroorganizmaların yeri tartışılmaz hale gelmektedir. Probiyotiklerle

ilgili yapılan çalışmalara bakıldığında birçok hastalıktan korunmada ve tedavisinde

kullanıldığı görülmektedir. Ancak sadece probiyotik takviyesi almak, gastrointestinal

sistem için yeterli olmayacaktır. Sağlıklı yaşam için en baştan duyarlı olunması

gerekmektedir ve öncelikli olarak bireylerin normal doğumla dünyaya gelmesi ve

sonrasında anne sütü kullanımı teşvik edilmelidir. Sonrasında bireyler günlük

yaşamlarında diyetlerine dikkat etmeli rafine gıdalardan uzak durmalıdırlar. Gereksiz

antibiyotik kullanımı ve zararlı alışkanlıklardan kaçınmalıdırlar. Gasrointestinal

floradaki probiyotikler için diyetlerinde mutlaka prebiyotik içeren besinleri

tüketmeleri gerekmektedir. Günümüzde bunları yapmak zor olsa da herhangi bir

hastalık karşısında harcanan maddi güç ve zaman göz önüne alındığında daha kolay

olduğu aşikardır.

60

6. KAYNAKÇA

1. Klaenhammer, R. T. ; Kullen, J.M. Int. J. of Food Microbiol, 1999, 50, 45-57.

2. Rolfe, R. D. J. of Nutrition, 2000, 130, 3965-4025.

3. Çakır, İ. Lactobacillus Ve Bifidobacterlerde Bazı Probiyotik Özelliklerin

İncelenmesi, Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, Ankara,

2003.

4. Can, Ö. P. Doğu Anadolu Bölgesi Araştırmaları, 2007, 107-110.

5. Karaçay, B. Bilim Ve Teknik Dergisi, 2010, 514, 36-43.

6. Peter, J. T. ; Ruth, E. L. ; Michael, A. M. ; Vincent, M. ; Elaine, R. M. ; Jeffrey,

I. G. Nature Publishing Group, 2006, 1027-1031.

7. Young, R. J. ; Huffman, S. J. Pediatr Health Care, 2003, 17, 277-283.

8. Guarner, F. ; Malagelada J. R. Lancet, 2003, 360, 512-519.

9. İnanç, N. ; Şahin, H. ; Çiçek, B. Erciyes Tıp Dergisi, 2005, 27 (3), 122-127.

10. Morelli, L. J. Nutr. 2008, 138,1791-1795.

11. Caicedo, R. A. ; Schanler, R.J. ; Li, N. ; Neu, J. Pediatr Res, 2005, 58, 625–628.

12. Gültekin, M. Ankem Dergisi, 2004, 18 (Ek 2), 87-89.

13. Yan, F. ; Polk, D. B. Curr Opin Gastroenterol, 2004, 20, 565–571.

14. Gill, H. S. ; Guarner, F. Postgrad Med J, 2004, 80, 516–526.

15. Coşkun T. Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Dergisi, 2006, 49, 128-148.

16. Quigley, E. M. M. Pharmacological Research, 2010, 61, 213-218.

17. Thomas, D. W. ;Greer, F. R. Pediadrics, 2010, 126, 1217-1231.

18. Özden, A. Güncel Gastroloji, 2005, 9/3, 124-133.

19. Maukonen, J. ; Mattö, J. ; Suihko M-L. ; Saarela, M. Journal of Medical

Microbiology, 2008, 57, 1560–1568.

20. Gibson, G. R. ; Roberfroid, M. B. J Nutr, 1995, 125, 1401-1412.

21. Can, Ö. P. Doğu Anadolu Bölgesi Araştırmaları, 2007, 194-196.

22. Yaşar, B. ; Kurdaş, O. Ö. Güncel Gastroloji, 2009, 13/1, 23-28.

23. Gürsoy, O. ; Kınık, Ö. Mühendislik Bilimleri Dergisi, 2006, 12, 105-116.

24. Bengmark, S. Gastroenterol Clin North Am, 2005, 34, 413-436.

61

25. Parracho, H. ; McCartney, A. L. ; Gibson, G. R. Proceedings of the Nutrition

Society, 2007, 66, 405–411.

26. Sinkiewicz, G. Lactobacillus reuteri in health and disease, Doktora Tezi,

Malmö University Faculty of Health and Society Department of Biomedical

Laboratory Sciences, Holmbergs, Malmö, 2010.

27. Soccol, C. R. ; Vandenberghe, S. L. P. ; Spier, M. R. ; Medeiros, A. B. P. ;

Yamaguishi, C. T. ; Lindner, J. D. ; Pandey, A. ; Soccol, V. T. Food Technol.

Biotechnol, 2010. 48 (4) 413–434.

28. Rosenberg, I. Z. ; Rosenberg, E. J. Microbial Biochem Technol, 2011, S1.

29. Özden, A. Güncel Gastroenteroloji, 2006, 10/3, 273-278.

30. Sullivan A. ; Nord, C. E. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2002, 50,

625–627.

31. Probiotics: Review and Outlook, 3rd International Convention, Paris, 2nd and 3rd

December 2004.

32. Özen, M. Probiyotikler: anlatılmayan Tarihçe Nobel tıp kitap evleri, 2011, 1-15

33. Gürsoy, O. ; Kınık, Ö. Ege Üniv. Ziraat Fak. Derg., 2006, 43(1), 181-188.

34. Rusch, V. Probiotics: Bacteria And Bacterial Fragments As Immunomodulatory

Agents, 2001 Old Herborn University Seminar No. 15, 2002.

35. Fuller, R. Journal of Applied Bacteriology, 1989, 66, 365-378.

36. Gürbüz, H. İnsan Kaynaklı Lactobacillus spp. Suşlarında Agregasyonun

Probiyotik Önemi, Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri

Enstirüsü, Ankara, 2004.

37. Kopp-Hoolihan, L. J Am Diet Assoc, 2001; 101: 229-238.

38. Doron, S. ; Snydman, D. R. ; Gorbach, S. L. Gastroenterol Clin North Am, 2005,

34: 483-498.

39. Gionchetti, P. ; Lammers, K. M. ; Rizzello, F. ; Campieri, M. Gastroenterol Clin

North Am, 2005, 34: 499-513.

40. Çelen, E. ; Hız, I. ; Vural, T. Güncel Gastroloji Dergisi, 1999; 403-405.

41. Önal, D. Bazı laktik asit bakterilerinin probiyotik özelliklerinin araştırılması.

Yüksek lisans tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstirüsü, Ankara, 2005.

42. Gülmez, M. ; Güven, A. Kafkas üniv. Vet. Fak. Derg., 2002, 8(1): 83-89.

62

43. Donnet-Hughes, A. ; Rochat, F. ; Serrant, P. ; Aeschlimann, J. M. ; Schıffrın, J. J

Dairy Sci, 1999, 82, 863–869.

44. Gibson, G. R. ; Fuller, R. American Society for Nutritional Sciences, 2000, 391-

395.

45. Uncello, M. ;Malaguarena G, Basile. F. , BMC Surg. 2012, 12 1, 35.

46. Senok, A. C. ; Ismaeel, A. Y. ; Botta, G. A. Clin Microbiol Infect, 2005, 11,

958-966.

47. Hill, H. S. ; Guarner, F. Postgrad Med J, 2004, 80, 516-526.

48. Penner, R. ; Fedorak, R. N. ; Madsen, K. L. Curr Opin Pharmacol, 2005, 5, 1-8.

49. Hoyos, A. B. Int. J. Infect Dis., 1999, 3, 197-202.

50. Erdeve, O. ; Tiras, U. ; Dallar, Y. ; Savaş, S. Aliment Pharmacol Ther, 2005, 21,

1508-1509.

51. Felley, C. ; Michetti, P. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2003, 17, 785-91.

52. Hamilton-Miller, J. M. Int J. Antimicrob Agents, 2003, 22, 360-366.

53. Commane, D. ; Hughes, R. ; Shortt, C. ; Rowland, I. Mutation Res., 2005, 591,

276-289.

54. Kampman, E. ; Goldbohm, R. A. ; Van Den Brandt, P. A. Cancer Res., 1994, 54,

3186-3190.

55. Mohan, J. C. ; Arora, R. ; Khalilullah, M. Indian Heart J. 1990, 42, 361-364.

56. Belviso, S. ; Giordano, M. ; Dolci, P. ; Zeppa, G. Dairy Sci. Technol., 2009, 89,

169–176.

57. Isolauri, E.at all Am. J. Clin. Nutr.2001, 73 (suppl), 444-450.

58. Vanderhoof, J. A. ; Young, R. J. Ann Allergy Asthma Immunol, 2004, 93, (Suppl

3), 33-37.

59. Penra, F. J. ; Filho, L. A. ; Calsada, A. C. ; Junior, H. ; Nicloi, J. R. J. Pediatr,

2000, 76, (Suppl 2), 209.

60. Roberfroid, M. B. Am. J. Clin. Nutr., 2000, 71, (supp l), 1682–1687.

61. Klaenhammer, R. T. J. Nutr., 2000, 130, 415-416.

62. Gibson, G. R. Clin Nutr., 2004, 1, (Supp l), 25-31.

63. Langlands, S. J. ; Hopkins, M. J. ; Coleman, N. ; Cummings, J. H. Gut, 2004, 53,

1610-1616.

63

64. Brannon, C. Prebiotics: feeding friendly bacteria. Today’s Dietitian September

2003.

65. Yağcı, R. Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Dergisi, 2002, 45(4), 337-344.

66. Manning, T. S. ; Gibson, G. R. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol, 2004, 18,

287-298.

67. Rastall, R. A. ; Maitin, V. Curr Opin Biotechnol, 2002, 13, 490-496.

68. Peitsudou,K. ; karantanos, T. ; Theodoropoulos, G.E. Dig Sung. 2012, 29(5),

426-428.

69. Daeschel, M. A. Food Technol., 1989, 164-167.

70. Tunail, N. Mikrobiyoloji, Pelin ofset, Ankara, 2009.

71. Tunail, N. ; Köşker, Ö. Süt Mikrobiyolojisi, A. Ü. Ziraat Fak., Ankara, 1989.

72. Yetişmeyen, A. Süt Teknolojisi, A. Ü. Ziraat Fak., Ankara, 1995.

73. Arda, M. Genel Bakteriyoloji, A. Ü. Vet. Fak., Ankara, 1985.

74. Sneath, P. H. A. ; Mair, N. S. ; Sharpe, M. E. ; Holt, J.G. Bergey’s Manuel of

Systematic Bacteriology, Williams&Wilkins, London, 1986.

75. Ambrosini, V. M. ; Gonzales, S. ; Holgado, A. P. R. ; Oliver, G. J. Food Prot.,

1998, 61 (5), 557-562.

76. Drinan, D. F. ; Tobin, S. ; Cogan, T. M. Applied And Environmental

Microbiology, 1976, 481-486.

77. Prescott, C. S. ; Dunn, G. C., Industrial Microbiology, Published on

Distributors, Delhi, India, 1987.

78. Tekinşen, O. C. ; Atasever, M. Süt Ürünleri Üretiminde Starter Kültür, Selçuk

Ü. Vet. Fak. Yayınları, Konya, 1994.

79. Halkman, K. Tarım Mikrobiyolojisi, A. Ü. Ziraat Fak., Ankara, 1991.

80. Aslım, B. ; Beyatlı, Y. ; Halkman, K. Türk J. Biol., 2000, 24, 65–78.

81. Çetin, E. T. Endüstriyel Mikrobiyoloji, İ. Tıp Fak. Yayınları, İstanbul, 1983.

82. Üçüncü, M. Süt Ve Mamulleri Teknolojisi, İzmir, 2005.

83. Con, A. ; Gökalp, H.Y., Türk Mikrobiyol. Cem Derg., 2000, 30, 180-190.

84. Evren, M. ; Albayram, C. ; Apan, M. Laktik Asit Bakterilerinin Oluşturduğu

Antimikrobiyel Maddeler, Türkiye 9. Gıda Kongresi; 24-26 Mayıs 2006, Bolu,

977-980.

85. Dahiya, R. S. ; Speck, M. L. J. Dairy Sci. 1968, (51), 1568.

64

86. Juven, B. J. ; Schved, F. ; Lindner, P. Journal of Food Protection, 1992, 55, (3),

157-161.

87. Carminati, D. ; Giraffa, G. ; Bossi, M. G. J. Food Protect, 1988, 52, (9), 614-

617.

88. Kognoff, M. F. Gastroenterology, 1993, (105), 1275.

89. Rautava, S. ;Walker, W. A. Curr. Gastroenterol rep., 2007, 9, 385-392.

90. Kayser, F. H. ; Bienz, K. A. ; Eckert, J. ; Zinkernagel, R. M. Tıbbi Mikrobiyoloji,

Nobel Tıp Kitap Evi, 2002.

91. Erkmen, O. Gıda Mikrobiyolojisi, Efil Yayın Evi, Ankara, 2010.

92. Demirbağ, Z. Genel Mikrobiyoloji, Karadeniz Tek. Üni. Fen Edb. Fak. Biyoloji

Bölümü, Trabzon, 2006.

93. Ustaçelebi, Ş. Temel Ve Klinik Mikrobiyoloji, Güneş Kitap Evi. 1999.

94. Özden, S. Klinik Örneklerden İzole Edilen Klebsiella Pneumoniae Türlerinde

Genişletilmiş Spektrumlu Beta-Laktamaz Varlığının Moleküler Tekniklerle

Araştırılması, Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü,

Ankara, 2007.

95. Kulacaoğlu, N. Klinik Örneklerden İzole Edilen Pseudomonas Aeruginosa

Suşlarında Hücre Yoğunluğunun Farklı Yüzeylere Tutunmadaki Etkisi, Yüksek

Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara, 2006.

96. Man, J. C. ; Ragosa, M. ; Sharpe, M. E. A. J. Appl. Bact., 1960, 23, 130-138.

97. Cruikshank, R. Med. Microbiol, 11th Edition Livingstone, London, 1972.

98. Ronald, M. ; Lawrence, A. ; Park, C. Handbook of Microbiology, 2th Edition,

CRC Press, New York, 1997.

99. Swenson, J. M. ; Facklam, R. R. ; Thornsberry, C. Antimicrobial Agents And

Chemotherapy, 1990, 543-549.

100.Hyronimus, B. ; Le Marrec, C. ; Sassi A. H. ; Deschamps, A. International

Journal of Food Microbiology, 2000, (61), 193–197.

101.Iyer, C. ; Kailasapathy, K. Journal of Food Science, 2005, 70, (1), 18-23.

102.Begley, M. ; Hill, C. ; Gahan, C. G. M. Applied And Environmental

Microbiology, 2006, 1729–1738.

103.Felten, A. ; Bareau, C. ; Bizet, C. ; Lagrange, P. H. ; Philippon A. J. Clin.

Microbiol. 1999, 37, 729-733.

65

104.Yun, J. H. ; Yim, D. S. ; Kang, J.Y. ; Kang, B. Y. ; Shin, E. A. ; Chung, M. J. ;

Kim, S. D. ; Baek, D. H. ; Kim, K. ; Ha, N. J. Arch Pharm Res., 2005, 28(6),

660-666.

105.Moroni, O. ; Kheadr, E. ; Boutin, Y. ; Lacroix, C. ; Fliss, I. Appl. Environ.

Microb., 2006, 72, 6894-6901.

106.Chou, L. ; Weimer, B. J. Dairy Sci., 1999, 82, 23–31.

107.Liong, M. T. ; Shah, N. P. J. Dairy Sci., 2005, 88, 55–66.

108.Pereira, D. I. A. ; Mccartney, A. L. ; Gibson, G. R. Applied And Environmental

Microbiology, 2003, 4743–4752.

109.Şimşek, Ö. ; Çon, A. H. ; Tulumoğlu, Ş. Food Control, 2006, 17, 263-270.

110.Salminen, M. K. ; Rautelin, H. ; Tynkkynen, S. ; Poussa, T. ; Saxelin, M. ;

Valtonen V. ; Järvinen, A. Clin. Infect. Dis., 2006, 42:35-44.

111.Charteris, W. P. ; Kelly, P. M. ; Morelli, L. ; Collins, J. K.. J. Food Protect,

1998, 61, 1636-1643.

112. Avonts, L. ; De-Vuyst, L. Gent., 2001, 66, 543-545.

113. Ashraf, M. ; Arshad, M. ; Siddique M. ; Muhammad, G. Pakistan Vet. J., 2009,

29, (4), 186-190.

114.Harris, C. J. ; Deschell, M. A. ; Stiles, M. E. ; Klaenhammer, T. R. J. Food.

Protect., 1989, 52: 384-387.

115.Forestier, C. ; De Champs, C. ; Vatoux, C ; Joly, B. Res. Microbiol., 2001, 152,

167-173.

116.Kaur, I. P. ; Chopra, K. ; Saini, A. Eur. J. Pharma Sci., 2002, 15, 1-9.

117. Stewart, L. ; Pellegrini, C. A. ; Way, L.W. Surg. Forum, 1986, 37, 157-159.

118.Klayraung, S. ; Okonogi, S. Brazilian Journal of Microbiology, 2009, 40, 757-

766.

119.Ziarno, M. Acta Sci. Pol. Technol. Aliment., 2007, 6(2), 29-40.

120.Jacobsen, C. N. ; Nielsen V. R. ; Hayford, A. E. ; Moller, P. L. ; Michaelsen, K.

F. ; Pærregaard, A. ; Sandström, B. ; Tvede, M. ; Jakobsen, M. Applied And

Environmental Microbiology, 1999, 4949–4956.

121.Moser, S. A. ; Savage, D. C. Applied And Environmental Microbiology, 2001,

3476–3480.

66

122.Martín, R. ; Jiménez, E. ; Olivares, M. ; Marín, M. L. ; Fernández, L. ; Xaus, J. ;

Rodríguez, J. M. International Journal of Food Microbiology, 2006, 112, 35-43.

123.Klare, I. ; Konstabel, C. ; Werner, G. ; Huys, G. ; Vankerckhoven, V. ;

Kahlmeter, G. ; Hildebrandt, B. ; Müller-Bertling, S. ; Witte, W. ; Goossens, H.

Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2007, 59, 900–912.

124.Tuomola, E. ; Crittenden, R. ; Playne, M. ; Erika, I. ; Salminen, S. Am. J. Clin.

Nutr., 2001, 73, 393–39S.

125.Prasad, J. ; Gill, H. ; Smart, J. ; Gopal, P. K. İnt. Dairy Journal, 1998, 993–

1002.

126.Xanthopoulos, V. ; Petridis D. ; Tzanetakis, Food Microbiology and Safety,

2001, 66(5), 747-752.

127.Pereira, D. I. A. ; Gibson, G. R. Applied And Environmental Microbiology,.

2002, 4689–4693.

128.Haller, D. ; Colbus, H. ; Gänzle, M. G. ; Scherenbacher, P. ; Bode, C. ; Hammes

W. P. Systematic and Applied Microbiology, 2001, 218–226.

129.Papamanoli, E. ; Tzanetakis, N. ; Litopoulou-Tzanetaki, E. ; Kotzekidou, P.

Meat Science, 2003, 859–867.

130.Gilliland, S. E. ; Walker, D. K. Journal of Dairy Science, 1990, 905–911.

131.Usman, U. ; Hosono A. J. Dairy Sci., 1999, 82, 243–248.

132.Sanders, M. E. Journal of Nutrition, 2000, 130, 384–390.

133.Bongaerts, G. ; Bakkeren, J. ; Severijnen, R. ; Sperl, W. ; Willems, H. ; Naber,

T. ; Wevers, R. ; Van Meurs, A. ; Tolboom, J. J. Pediatr Gastroenterol

Nutr., 2000, 30(3), 288-93.

134.Temmerman, R. ; Scheirlinck, I. ; Huys, G. ; Swings, J. Applied And

Environmental Microbiology, 2003, 220–226.

135.Arıcı, M. ; Bilgin, B. ; Sağdıç, O. ; Özdemir, C. Food Microbiology, 2004, 21,

19-24.

136.Gilliland, S. E. ; Nelson, C. R. ; Maxwell, C. Appl. Environ. Microbiol., 1985,

49, 377-381.

137.Buck, L. M. ; Gilliland, S. E. Journal of Dairy Science, 1994, 77 (10) 2925-

2933.

67

138.Brashears, M. M. ; Gilliland, S. E. ; Buck, L. M. Journal of Dairy Science, 1998,

81(8), 2103-2110.

139.Liong, M. T. ; Shah, N. P. J. Dairy Sci., 2005, 88, 55-66.

140.Lye, H. S. ; Ali, G. R. R. ; Liong, M. T. International Dairy Journal, 2010, 20,

169-175.

141.Starchan, D.P. Thorax 2000 55(1), 2-10.

Documents

İNSAN KAYNAKLI Lactobacillus Spp SUŞLARININ ...dosyayukleme.ahievran.edu.tr/dosyalar/SELcUK_ZORAL...LAB Laktik Asit Bakterileri MRS Man Ragosa and Sharpe NCCLS Klinik Laboratuar