Antígenos Del Líquido Seudocelómico de Ascaris Suum

REBIOL Revista Científica de la Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú Vol 32, N° 1, Enero-Junio, 2012, pp. 48-103

Antígenos del líquido seudocelómico de Ascaris suum detectados por Western blot utilizando

IgG producidos en Oryctolagus cuniculus

Seudocelomic fluid antigens detected by Western blot technique using IgG produced in Oryctolagus cuniculus

Deysi M. Leiva Varas1, Juan J. Colina Venegas1, Hermes Escalante2 y

César A. Jara2

1Exalumno de la Escuela AP de Microbiología y Parasitología. 2Departamento de Microbiología y

Parasitología. Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú.

RESUMEN

Las infecciones por Ascaris lumbricoides y A. suum son globalmente prevalentes y deterioran la salud de la población infantil y disminuyen su capacidad cognitiva, aspecto que requiere de continuas investigaciones, en particular en lo relacionado con el diagnóstico temprano. El presente trabajo tuvo como objetivo determinar, mediante la técnica de Western Blot (Wb), los antígenos del liquido pseudocelómico (LC) de Ascaris suum que inducen la producción de anticuerpos policlonales IgG producido en Oryctolagus cuniculus inmunizado experimentalmente. El líquido pseudocelómico fue obtenido de ejemplares adultos hembras de A. suum extraídas del intestino de Sus scrofa parasitada naturalmente, el cual se utilizó para inmunizar, junto con el adyuvante completo e incompleto de Freud, a un ejemplar de O. cuniculus, a fin de obtener los anticuerpos. La técnica de Wb se hizo siguiendo el protocolo propuesto por Tsang. Utilizando el LC tratado con dithiothreitol se encontró 12 bandas antigénicas, cuyos pesos moleculares son: 102.3, 97.4 66.2, 56.2 39.8, 34.9, 28.2, 21.5, 16.9, 15.8, 14.4, y 13.1-10.7 KDa, de las cuales la 102.3, 39.8, 34.9, 28.2, 16.9, 15.8, 14.4, y 13.1-10.7 KDa son las más reactivas. Estos resultados permiten concluir que el líquido pseudocelómico es una buena fuente de antígeno y que por la facilidad en su obtención respecto de otra fuente de antígeno podría utilizarse en el diagnóstico de la ascariasis. Palabras clave: Western blot, Ascaris lumbricoides, Ascaris suum, Sus scrofa

ABSTRACT

Infections with Ascaris lumbricoides and A. suum are globally prevalent and impair the health of

children and reduce their cognitive ability, an aspect that requires continuous research, particularly in relation to early diagnosis. This study aimed to determine, using the technique of Western blotting (Wb) antigens pseudocelomic fluid (PF) of Ascaris suum to induce the production of polyclonal IgG produced in Oryctolagus cuniculus experimentally immunized. PF was obtained from adult females of A. suum intestine naturally parasitized Sus scrofa, which was used to immunize, with complete and incomplete Freud´s adjuvant, a specimen of O. cuniculus, in order to obtain the antibodies. Wb technique was performed following the protocol proposed by Tsang. Using the PF treated with dithiothreitol was found 12 antigenic bands, whose molecular weights are 102.3, 97.4 66.2, 56.2 39.8, 34.9, 28.2, 21.5, 16.9, 15.8, 14.4, and 13.1-10.7 kDa, of which 102.3, 39.8 , 34.9, 28.2, 16.9, 15.8, 14.4, and 13.1-10.7 kDa are the most reactive. These results indicate that the PF is a good source of antigen and the ease in obtaining it related to another source of antigen could be used in the diagnosis of ascariasis.

Key words: Western blot, Ascaris lumbricoides, Ascaris suum, Sus scrofa


INTRODUCCIÓN

La ascariasis es una de las helmintiasis más frecuentes a nivel mundial y se distribuye

principalmente en regiones húmedas, tropicales y templadas donde imperan las malas condiciones higiénicas, el deficiente saneamiento ambiental, las pobres condiciones socioeconómicas y la deficiente cultura higénico-sanitaria. Existe dos tipos de Ascariasis: la intestinal producida por los adultos de Ascaris lumbricoides y la pulmonar ocasionada por los estadios larvales de A. lumbricoides y A suum1,2,3,4

A. suum presenta un ciclo evolutivo directo, la hembra deposita aproximadamente 200 mil huevos insegmentados que se eliminan junto con la materia fecal y se dispersan en el medio exterior, donde se convierten en infectivos y se mantienen como tales por periodos superiores a cinco años; al ser ingeridos con agua, vegetales y alimentos contaminados las larvas de segundo estadio (L2) eclosionan en el intestino estimulados por la temperatura corporal, niveles de anhídrido carbónico, pH y condiciones reductoras no especificas optimas; luego, penetra la mucosa intestinal, alcanza la circulación porta, el hígado donde se establece temporalmente y causa una reacción tisular inflamatoria (manchas de leche), y luego a los pulmones donde se transforma en L3 larva de tercer y cuarto estadio, la cual migra a la tráquea y faringe para ser deglutida hacia el tubo digestivo5,6,7,8,9. Esta parasitosis tiene frecuencias variables en la población suina y es responsable de pérdidas económicas, por la reducción de ganancia en el peso y el decomiso de hígados en los mataderos de cerdos14.15.16.

Las larvas del segundo estadio pueden migrar dentro de un amplio rango de huéspedes, entre ellos cerdos, pollos, conejos y ratones infectados experimentalmente al administrarles huevos con la larva dos (L2); la penetración y el establecimiento de un parasito en su hospedador depende de numerosos factores, entre ellos, los factores bioquímicos y los inmunológicos, los cuales difieren según la localización del parasito en el hospedador; ya que al ingresar es reconocido como un agente extraño activando una serie de mecanismos inmunológicos entre ellos, los de tipo celular y humoral que varían considerablemente8,10,11,12.

A. suum es una especie muy parecida morfológicamente a A. lumbricoides, sin embargo, ambas especies se diferencian por la configuración que tienen los dentículos de los tres labios orales y por la secuencia de 6 nucleótidos de su ADN ribosomal1; además, se ha encontrado similitud entre las bandas patrones de proteínas extraídas de la pared del cuerpo y de los órganos reproductivos de ambos nematodos, lo que refleja su estrecha relación genética, apuntando a la naturaleza zoonótica de la infección y a la alta probabilidad de infección cruzada entre el ser humano y el cerdo17.

Se ha informado que animales de experimentación inoculados con huevos larvados infectivos de A. suum presentaron alteraciones clínicas como: respiración rápida, ronquidos, perdida de peso; y alteraciones histológicas como: infiltrado por polimorfonucleares, abolición del parénquima pulmonar, esto es debido a la migración de las larvas desde los capilares sanguíneos hacia los alveolos pulmonares ocasionando microhemorragias y edema16,18. Asimismo, se ha determinado, mediante hemaglutinación indirecta (HAI), la prevalencia de anticuerpos contra las larvas L3 y L4 de A. suum en suero de niños de 6 a 12 años de la ciudad de México, en el cual se reportó un 4.6% de seropositividad, en otro estudio se analizaron 1264 muestras de sangre detectándose el 45% de individuos con anticuerpos IgG contra A. suum mediante el ELISA, lo que confirma la infección por A. suum19,20,21,22; además, se ha presentado casos de cuatro estudiantes infectados con las larvas de A. suum, ocasionándoles infiltrados pulmonares con eosinofilia, asma y niveles elevados de inmunoglobulinas IgE21; otros casos humano se presentaron en Japón detectándose mediante el Dot Elisa35-36. Esto significa que el parasitismo por las larvas de este helminto es inespecífico y cuando se presenta en el hunmano produce cuadro alérgicos, el Sindrome de Loeffler y encelopatías23,24,25,26.

Se ha identificado que los antígenos de excreción/secreción de los estadios larvarios L3 y L4 de A. lumbricoides utilizando la técnica de inmunoprecipitación, tienen un peso molecular que van desde 14 a 410 KDa; también se ha encontrado que existe homología entre los antígenos de excreción/secreción (E/S) de los estadios larvarios de A.lumbricoides y A.suum, tanto a nivel molecular como inmunológico25, en otros trabajos se ha encontrado similitud antigénica entre los antígenos de E/S y Somáticos de los estadios larvarios de A. lumbricoides, A. suum y Toxocara canis, caracterizándose una reacción cruzada entre sus componentes, ya que existe una proteína de 14KDa homóloga en los tres parásitos26.


El Western Blot es una técnica que se está utilizando para detectar antígenos de excreción/secreción (E/S) y somáticos (S) de algunas parasitosis como: la equinococosis humana usando antígenos de fluido hidatidico27, la cisticercosis usando antígenos del fluido vesicular28, la fasciolosis usando antígenos de E/S, la anquilostomiasis usando antígenos de E/S de las larvas filariformes de Ancylostoma duodenale30, la teniasis usando antígeno de E/S de Taenia solium31. Particularmente en A.suum, se ha caracterizado su composición antigénica mediante extractos de la cutícula, ovarios y útero encontrándose, bandas de 13-16 KDa y de 33-66 KDa comunes en la mayoría de ellos32 y, mediante Western Blot con antígenos de E/S y somáticos de las larvas pulmonares de A.suum, se detectaron 12 bandas antigénicas de las cuales 100, 72.4, 16.9, 15.5 y 14.9 KDa fueron las bandas mas reactivas y 5 bandas antigénicas poco reactivas en caso de los antígenos somáticos, reconocidas por anticuerpos de tipo IgG33.

El diagnóstico de la ascariasis se realiza por examen copropasitológico por la observación tanto de sus huevos fecundados como los huevos infecundos2,3,4; sin embargo, para los casos de A. suum no es de mucha ayuda, debido a que, no detecta la presencia de los estadios larvarios. En estos casos los métodos serológicos son de especial interés; por un lado, como prueba auxiliar en el diagnóstico clínico de la parasitosis y por otro, al ser utilizados en estudios epidemiológicos, que nos permita determinar la prevalencia de la parasitosis, asimismo, debido a la similitud antigénica, como se ha descrito, podría ser de utilidad para detectar los casos de ascariasis por A. lumbricoides en etapa de migración que, en algunos casos, puede afectar a los pulmones y derivar en alergias, por lo que, es más importante clínicamente que la intestinal.

Al mismo tiempo, como se ha señalado, se ha planteado la posibilidad de usar la técnica de Western Blot para el diagnóstico serológico de la ascariasis utilizando antígenos de excreción/secreción de las formas adultas y de las larvas de tercer estadio (pulmonares); sin embargo, la obtención de éstos antígenos demanda una tarea difícil en su obtención y gastos por el costo del medio de cultivo que está compuesto sólo por aminoácidos, por lo que en este trabajo se pretende usar otra fuente de antígeno, además, para obtener una cantidad útil para inmunizar a animales de laboratorio se requiere de miles de larvas o varios adultos íntegros y viables; a esto se adiciona que no hay trabajos realizados, donde se haya utilizado el liquido pseudocelómico como antígeno.

Teniendo en cuenta dichas premisas, se planteó una investigación orientada a determinar los antígenos del liquido pseudocelómico de A. suum (que por el tamaño del parásito son abundantes, fáciles de obtener, incluso de nematodos recientemente muertos) mediante la técnica de Western Blot utilizando anticuerpos producidos en Oryctolagus cuniculus (conejo) inmunizado experimentalmente. Se espera que debido a la naturaleza proteica y glicoproteica del líquido seudocelómico, éste induzca la producción de anticuerpos en el conejo que reconocen a varios antígenos.

MATERIAL Y MÉTODOS

Material biológico:

10 Ejemplares adultos de Ascaris suum

1 Ejemplar de Oryctolagus cuniculus del Instituto Nacional de Salud del Perú. Obtención de los adultos de A.suum

Se obtuvo del intestino de los cerdos infectados del camal Municipal de El Porvenir; recolectándose 12 ejemplares de hembras adultas de A. suum en un frasco con SSF al 0.85%, transportándose inmediatamente al laboratorio de helmintología de la Universidad Nacional de Trujillo. Obtención del líquido seudocelómico.

Los 12 ejemplares de A. suum fueron lavados cuatro veces con SSF y una con SSF más antibiótico Gentamicina 0.5 ml/100ml y Penicilina G sódica 0.5 ml/100ml de 1.000 000 UI por cinco minutos cada una; luego en condiciones de esterilidad y con la ayuda de una jeringa de 1ml se obtuvo el líquido pseudocelómico; el cual fue conservado en refrigeración a -20 ºC hasta ser usado. Determinación de concentración de proteínas

Al líquido pseudocelómico se centrifugo a 10000 rpm por 10min, luego se eliminó el sedimento y se determinó la concentración de proteínas por el método colorimétrico de Bradford 34.

Inmunización y obtención de suero de Oryctolagus cuniculos


Se utilizó un conejo obtenido del Bioterio del Instituto Nacional de Salud del Perú (INS), al cual se le inmunizó con 1 ml de líquido Pseudocelómico y 1 ml adyuvante completo de Freund la primera inmunización y las tres restantes con adyuvante incompleto; se le inoculó vía subcutánea en cada una de las caras externas e internas de las patas posteriores y en el lomo, cada 10 días.

A las cinco semanas de la primera inmunización se obtuvo una muestra de sangre de los conejos por punción cardiaca, la cual fue centrifugada a 3000 rpm por 15min para obtener el suero inmune que fue conservado a -20ºC hasta es momento de su procesamiento. Las IgG fueron purificadas parcialmente por precipitación salina con sulfato de amonio al 33% y por diálisis de en membrana de celulosa35,36 Detección de los antígenos del Líquido Pseudocelómico (LP) por la técnica de Western Blot

La ejecución de la técnica y preparación de los reactivos se realizo siguiendo metodologías propuestas previamente28,30,33

a) Preparación: El líquido seudocelómico fue preparado a la concentración de 0.02 ug/uL, una parte se trató con dithiothreitol (DDT), 0.1% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 6% de glicerol y 0.025% de azul de Bromofenol y la otra parte sin DDT, luego se calentó a 65ºC por 20 min, dejándose a temperatura ambiente antes de su uso.

b) SPS-PAGE se realizo los corridos en mini geles de 8 x 7 x 0.05 cm a la concentración del 15% de acrilamida del gel separador y al 3% del gel concentrador, colocando 15ul de antígeno en cada uno de los pocillos del gel concentrador. La electroforesis se llevo a cabo a 60V en el gel de apilamiento por 10 minutos y a 200Ven el gel separador por 50 minutos, hasta que el colorante trazador alcance extremo inferior del gel.

c) Transferencia: Los componentes proteicos separados en el gel de poliacrilamida fueron transferidos al papel de nitrocelulosa en una cámara de electroforesis horizontal a 100V por espacio de dos horas y a 4ºC, utilizando un buffer de transferencia constituido por 0.2ml Tris/HCL Ph 8%; 20% de metanol y agua destilada. Para ello el gel se unió con el papel de nitrocelulosa, se cubrió con papeles de filtro y esponjas que fueron colocadas en un casquete especial, el cual fue depositado en la cámara de transferencia.

d) Revelado enzimático de las proteínas especificas: Para ello se hidrató el papel de nitrocelulosa en PBS, luego se le añadió la solución bloqueadora (leche descremada) con el suero (1/60) y se incubó por una hora en agitación constante y a temperatura ambiente. Se realizó tres lavados con PBS Tween 20 por 5 minutos cada uno en agitación constante. Se añadió el conjugado (Puried Goad Anti Rabit IgG Conjugate BioRad) 1/1200, se incubó por una hora en agitación constante y se lavó cuatro veces. Finalmente, el revelado se hizo agregando el sustrato (H2O2 al 0.01% y la diaminobenzidina) por 10 minutos, la reacción se detuvo al lavarlo con agua destilada, después que secó el papel de nitrocelulosa se determinó los pesos moleculares por comparación con el marcador de bajo peso molecular conocido.

RESULTADOS

Se encontró que el líquido seudocelómico de A. suum presenta una concentración de 7520 ug/mL;

asimismo, que cuando se utilizó a la concentración de 0.02 para realizar el corrido electroforético del material tratado con Dithiotreithol (DTT) para ejecutar la técnica de western Blot, aparecieron 12 bandas antigénicas, cuyos pesos moleculares son: 102.3, 97.4 66.2, 56.2 39.8, 34.9, 28.2, 21.5, 16.9, 15.8, 14.4, y 13.1-10.7 KDa, de las cuales la 102.3, 39.8, 34.9, 28.2, 16.9, 15.8, 14.4, y 13.1-10.7 KDa son las más reactivas; por su parte, cuando se ejecutó la técnica con proteínas sin tratar con DTT también se detectaron 12 bandas antigénicas, cuyos pesos moleculares son 102.3, 97.4,70.8, 63.1, 28.2-25.7, 21.5, 16.9, 15.8, 14.4, y 13.1-10.7 (Fig. 1)


Fig. 1. Bandas antigénicas del liquido seudocelómico de Ascaris suum detectados mediante la técnica de Western Blot por IgG producidos en Oryctolagus cuniculus.

A. Marcador de peso molecular en Kilodaltons (KDa) B. Antígenos del líquido pseudocelómico, sin tratar con dithithritol (DTT) con suero hiperinmuine C. Antígenos del líquido pseudocelómico tratado con dithithreitol (DTT) con suero hiperinmune

DISCUSIÓN

La técnica de Western blot en el diagnóstico de enfermedades parasitarias ha venido siendo usada

con gran éxito, debido a su elevada especificidad (100%) y sensibilidad (93% en algunos casos), tanto así que se dispone de Kits para algunas de ellas, tales como cisticercosis, hidatidosis y fasciolasis28,29; sin embargo, hay otras enfermedades cuyas prevalencias son incluso mayores que las nombradas que están a la espera de poder contar con un Western blot para el diagnóstico confirmativo y con un kit comercial, como el caso de la ascariasis temprana, siendo uno de los pasos iniciales conar con una buena fuente de antígenos. Para la obtención de antígenos del líquido pseudocelómico se necesita pocos ejemplares adultos de Ascaris suum; esto está en proporción al tamaño del parasito, a comparación de las miles de larvas que se usan para obtener antígenos de excreción/secreción30,33.

Al mismo tiempo, en trabajos previos se ha verificado que, tal como ha sido utilizado en la presente investigación, el protocolo para obtener los anticuerpos específicos, que son indispensables para ejecutar la técnica de Western blot, da buenos resultados; es decir, la inoculación al conejo del liquido seudocelomico mezclado con adyuvante completo de Freud en la primera vez y con adyuvante incompleto en las sucesivas, asegura la producción de suficiente cantidad de anticuerpos como para obtener buenas lecturas30,31,32 porque en el huésped conejo, que es de raza pura y se ha asegurado su

102.3

97.2

66.2

39.8

34.9

28.2

21.5

16.9

14.4

15.8

13.5-10.7

56.2

97.4

66.2

45.0

31.0

14.4

21.5

A B C B C


salubilidad con un buen cuidado, funciona el fenómeno de anamnesis. El conejo, por su parte, ha demostrado ser un excelente productor de anticuerpos para su uso en el Western blot porque, por su tamaño intermedio entre mamíferos que se usan para obtener mayores cantidades de suero útiles para usarlos como antisueros, como es el caso de cabras o caballos, y otros mamíferos pequeños, como cuyes y ratas, que producen muy poca cantidad de anticuerpos por su tamaño pequeño. Además, favorece el depósito del antígeno en el sitio de inoculación, liberándolo gradualmente, lo que permite un mayor contacto con el sistema inmune originando un aumento de la estimulación de células presentadoras de antígeno logrando un estímulo persistente; su uso economiza la cantidad de antígeno, dosis y tiempo; también se utiliza por su fácil manejo y por el menor número de efectos adversos28,30,31. Esta inmunización se realizó por vía subcutánea teniendo en cuenta estudios donde han comparado la producción de anticuerpos, inmunizando tanto por vía subcutánea e intramuscular, en el cual, demuestran que no existe diferencias entre estas dos vías de inmunización, siendo estas dos las más óptimas para producir una adecuada respuesta inmune25.

El tratamiento de los antígenos del líquido pseudocelómico con un agente reductor (DTT) de puentes bisulfuro, se realizó con la finalidad de desnaturalizar las proteínas, tal como ha sido usado en trabajos anteriores28,29,30,31 y el hecho de haber encontrado bandas más nítidas en relación a cuando se utilizó al líquido sin tratar con DTT, permite afirmar que posee una composición proteica compleja y que es preferible hacer el Western blot con DTT; sin embargo, el número de bandas fue igual: 12, hecho que enfatiza que el uso del DTT es para simplificar la complejidad proteica, no para cambiarlas.

De las 12 bandas detectadas, algunas de ellas han sido detectadas en otras investigaciones; por ejemplo: (i) se detectó una proteína de 14.4 KDa similar a la encontrada en un trabajo realizado anteriormente, a partir de antígenos de excreción-secreción del estadio larvario tres (L3) de A. suum, A. lumbricoides y Toxocara canis, mediante la técnica de radioinmunoprecipitacion26; esto significa que este componente es común en los tres nematodos, todos correspondientes a la Familia Ascarididae, y podría dar lugar a reacciones cruzadas cuando se haga el diagnóstico de las parasitosis causadas por ellos; esta banda también se ha encontrado en la larva 225,33, que es la que migra por los diversos órganos de los huéspedes y es, por lo tanto la principal forma patógena, entonces, igualmente, su detección no tiene mucho valor diagnóstico. En este mismo sentido, en otras investigaciones se han encontrado que las bandas responsables de la reacción cruzada son las que están en un rango 66-55 KDa17,33. (ii) las bandas cuyo peso molecular son de 25.7, 21.5 KDa coinciden con otro trabajo en donde se analizaron proteínas de los órganos reproductores y cutícula de A. suum y A. lumbricoides25

considerándose que podría tratarse de antígenos de poca utilidad para el diagnóstico específico, aunque sí, como en estos casos para descartar la presencia de anticuerpos en un determinado individuo, aspecto que tiene gran valor para la interpretación del diagnóstico, aunque de poca utilidad en países como el Perú en donde el parasitismo por estos organismos es un fenómeno frecuente, (iii) una proteína cuyo peso molecular es de 16 KDa presente en el estadio larvario 3, ya que han creado un recombinante de esta proteína llamada AS 16, el cual fue reportado como protector contra la migración larvaria, (iv) las bandas de 39.8, 34.6, 16.9 y 14.4 que coinciden con las bandas encontradas por Escalante y col. a partir de antígenos de excreción / secreción y las bandas de 39.8, 34.6 y 25.2 apartir de antígenos somáticos del estadio larvario 3 de A. suum. Las bandas de 39.8 y 34.6 se han encontrado en antígenos de E/S y S por que los antígenos E/S quedan atrapados en la cutícula y como los antígenos somáticos provienen mayormente de la cutícula, por ello que también se encuentran en los antígenos somáticos; esto también significaría que parte del liquido pseudocelómico se excreta y conformarían parte de los antígenos E/S33 y (v) Frontera17 estudio la composición antigénica de A. suum a partir de extractos de la cutícula, ovarios y útero, mediante el SDS PAGE en donde reporto bandas de 33-66 KDa en la mayoría de los extractos, estas bandas también coinciden con las encontradas en este trabajo.

CONCLUSIONES

El líquido pseudocelómico es una buena fuente de antígeno, capaz de producir una respuesta

inmune, reflejada por la detección de 12 bandas: 102.3, 97.4 66.2, 56.2 39.8, 34.9, 28.2, 21.5, 16.9, 15.8, 14.4, y 13.1-10.7 KDa

Las bandas más nítidas (102.3, 39.8, 34.9, 28.2, 16.9, 15.8, 14.4, y 13.1-10.7 KDa) se obtuvo en condiciones reductoras


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Antígenos Del Líquido Seudocelómico de Ascaris Suum