RECENZIJA NAUNO-ISTRAIVAKOG STUDENTSKOG RADA

____________, student Biolokog fakulteta Univerziteta u Beogradu, je uradila nauno istraivaki rad pod naslovom Antioksidativni efekat etanolnih ekstrakata razliitih biljnih delova Salvia amplexicaulis Lam. na Katedri za morfologiju i sistematiku biljaka u Institutu za botaniku i botanikoj bati Jevremovac Biolokog fakulteta.Vrste roda Salvia od davnina imaju iroku primenu u tradicionalnoj medicini, a novija istraivanja su dokazala mnoga bioloka dejstva njhovih ulja i ekstrakata. Postavljeni cilj ovog istraivanja je bio odreivanje antioksidativne aktivnosti DPPH metodom, kao i sadraja fenola i flavonoida u etanolnim ekstraktima S. amplexicaulis (cele biljke i posebnih delova - stabla, listova i cvetova).Dobijeni rezultati su pokazali da etanolni ekstrakti cele biljke i pojedinanih delova S. amplexicaulis pokazuju znaajno antioksidativno dejstvo. Na osnovu navedenih rezultata, moe se pretpostaviti da je visoka vrednost antioksidativnog efekta etanolnog ekstrakta analizirane vrste direktno povezana sa visokim sadrajem ukupnih flavonoida i fenola. Rezultati ovog istraivanja ukazuju da S. amplexicaulis predstavlja potencijalno znaajan prirodni izvor antioksidanasa.Ovaj rad ima i aplikativni znaaj, s obzirom na sve veu potrebu za prirodnim izvorima antioksidanasa, jer su sintetiki antioksidansi, uprkos efikasnosti, pokazali neke negativne efekte po zdravlje ljudi.

Kandidatkinja je ispoljila izuzetno interesovanje za nauno-istraivaki rad i odlino snalaenje u laboratoriji. Svoje rezultate diskutovala je u svetlu najnovijih saznanja u ovoj oblasti, koristei najnoviju literaturu. Stoga, smatram da se od Mariane Oale moe oekivati uspean nastavak nauno-istraivakog rada.

Beograd, 06.05.2014.

Recenzent

_________________________________

Prof. dr Petar Marin,

Bioloki fakultet Univerziteta u Beogradu

NAUNO ISTRAIVAKI RADAntioksidativni efekat etanolnih ekstrakata razliitih biljnih delova Salvia amplexicaulis Lam.

S A D R A J2I UVOD

21.1. Lekovite biljke

31.2. Familija Lamiaceae

41.2.1. Rod Salvia L. (alfija)

41.2.2. Salvia amplexicaulis Lam..........................................................................................

51.3. Antioksidativna aktivnost

61.3.1. DPPH metoda (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil)

61.3.2. Flavonoidi i fenoli

71.4. Istraivanja bioloke aktivnosti vrena na rodu Salvia

81.5. Istraivanja bioloke aktivnosti vrena na vrsti Salvia amplexicaulis .....

II CILJ ISTRAIVANJA...........................................................................................................9III MATERIJAL I METODE...................................................................................................10102.1. Hemikalije

102.2. Biljni materijal

102.3. Priprema ekstrakata

102.4. DPPH test za odreivanje antioksidativnog dejstva

112.5. Odreivanje ukupnog sadraja fenola

112.6. Odreivanje ukupnog sadraja flavonoida

112.7. Statistika analiza

12IV REZULTATI

13V DISKUSIJA

15VI ZAKLJUAK

VII 16LITERATURA

I UVOD

ovek dananjice je izloen svakodnevnom oksidativnom stresu. Supstance koje se suprostavljaju oksidaciji supstanci u telu, titei elije organizma od tetnog delovanja slobodnih radikala, nazivaju se antioksidansi. Poslednjih godina poraslo je interesovanje za aditive hrane biljnog porekla, preteno zbog toga to sintetiki antioksidansi imaju odreene nedostatke. Mnoga istraivanja su pokazala pozitivne efekte biljnih ekstrakata i etarskih ulja, pa su nali primenu u farmaciji, kozmetologiji, prehrambenoj industriji, itd.Flavonoidi su velika grupa prirodnih fenolnih jedinjenja koja su iroko rasprostranjena u carstvu biljaka. Veoma su vana komponenta ljudske ishrane. Dnevna koliina flavonoida koja se unosi u telo kree se izmeu 50 i 800 mg, u zavisnosti od toga koliko se voa, odnosno povra konzumira (Seyoum et al., 2006). Brojna istraivanja su ukazala na postojanje njihove bioloke aktivnosti, i to antialergijske, antiviralne, antiinflamatorne, hepatoprotektivne, antioksidativne, antitrombotike, vazodilatorne i antikancerogene aktivnosti (Tapas et al., 2008). Meutim, antioksidativnoj aktivnosti je pridat najvei znaaj. Ova aktivnost podrazumeva sposobnost flavonoida da spree formiranje slobodnih radikala, odnosno sposobnost da hvataju slobodne radikale. Poslednjih godina su flavonoidi poeli da privlae panju naunika zbog moguih lekovitih dejstava protiv bolesti koje su uzrokovane slobodnim radikalima. Flavonoidi, kao i mnogi drugi polifenoli, dobri su hvatai slobodnih radikala zbog toga to su veoma reaktivni kao donori vodonika ili elektrona. Brojna istraivanja veze izmeu njihove strukture i aktivnosti su pokazala koliki je znaaj broja i pozicije prisutne OH grupe fenola. I pored svih izvrenih istraivanja, veza izmeu njihove aktivnosti hvatanja radikala i hemijske strukture je jo uvek malo poznata. Takoe, objanjenje za molekularni fenomen koji se tu odigrava nije adekvatno. Izgleda da je za ove nedostatke odgovoran pristup konceptu veze izmeu strukture i bioloke aktivnosti. 1.1. Lekovite biljke

Lekovite biljke su prvi lek koji je oveku oduvek bio dostupan. Leenje lekovitim biljkama datira od davnih dana ljudske civilizacije. Kolevka biljne (herbalne) medicine je Kina, a postoje podaci da su stari Vavilonci pre 5000 godina pravili biljne tablete u kombinaciji sa glinom. U Grkoj je Pitagora 600. godine p.n.e. svoje uenike poduavao o nainima leenja uz pomo lekovitih biljaka.U kozmetike svrhe biljke su u upotrebi ve 7000 godina. Rimski lekar Galen je jo pre 1800 godina zapisao recept biljne kreme za lice, koji i danas ini osnovu svih savremenih krema. Tako je on proglaen za oca galenske farmacije (Pelagi, 1973).Neke biljke predstavljaju mone lekove. injenica je da one ine osnovu mnogih savremenih lekova, esto kotaju malo, a pomau mnogo.Smatra se da je upotreba biljaka kao zaina za jela poela pre 50000 godina.Tradicionalna medicina tvrdi da lekovite biljke mogu da izlee veoma veliki broj bolesti samo ako se one pravilno upotrebe. One rastu svuda oko nas, lako se uzgajaju i prerauju, ne zagauju i nisu opasne za okolinu. Najvanije je to to one mnogo manje tete od mnogih vetakih sastojaka koje nalazimo u skoro svim lekovima, kozmetikim preparatima i vetakoj hrani.Danas je u upotrebi oko 10000 vrsta biljaka, a istraivanja o njihovim lekovitim svojstvima se vre gotovo neprekidno u svim krajevima sveta.1.2. Familija Lamiaceae

Familija usnatica (Lamiaceae, Labiate) predstavlja jednu veoma vanu i brojnu grupu biljaka. Sadri oko 7000 vrsta rasporeenih u oko 230 rodova (Encyclopdia Britannica, 2011). Uglavnom naseljavaju suva stanita koja su dobro osunana. Kosmopolitskog su rasprostranjenja, ali je najvea raznolikost vrsta prisutna u oblasti Mediterana, Male i Centralne Azije. Meutim, postoje i endemine vrste, poput rtanjske metvice (Nepeta rtanjensis), koja raste samo na planini Rtnju u Srbiji.

Biljke iz familije Lamiaceae mogu biti zeljaste biljke, polubunovi, bunovi i malo drvee. Stabljika je etvrtasta (retko okrugla), listovi su naspramni, a cvet je u obliku usana. Imaju etiri pranika (2 dua i 2 kraa), ree dva. Kod roda Salvia pranici su izmenjeni tako da sadre karakteristinu polugu koja igra vanu ulogu u opraivanju insektima. Ovo se smatra evolutivnom prednou, te one predstavljaju i najbrojniji rod (oko 900 vrsta).Usnatice imaju znaajnu primenu u narodnoj medicini, jer sadre veliki broj aktivnih sastojaka. Na prvom mestu sadre etarska ulja. To su smee alifatinih i aromatinih jedinjenja koje veoma lako isparavaju. Upravo zbog toga se predstavnici Lamiaceae nikada ne kuvaju (samo se prelivaju kljualom vodom) i ne bi ih trebalo previe usitnjavati, jer e se na takav nain etarsko ulje izgubiti, a ono je najee nosilac lekovitog dejstva biljke. Ulja se sintetiu u lezdanim dlakama na povrini listova i drugih organa. Etarsko ulje prua biljci mnoge prednosti. Privlai insekte opraivae, deluje toksino na insekte biljojede, ljutog je ukusa, te odbija ivotinje (ne i oveka), toksino je i za bakterije i mikrogljive. Takoe, ispravajui, uva biljku od preteranog osvetljavanja i gubitka vode u toplijim krajevima. U tradicionalnoj medicini biljke sa ovim uljima se, izmeu ostalog, upotrebljavaju protiv infekcija, kod bolova u stomaku i za podsticanje iskaljavanja.Neke imaju etarska ulja u tragovima, ali zato akumuliraju gorke iridoidne heterozide, koji podstiu luenje ui, te olakavaju varenje.

Ruzmarinska kiselina je prisutna u velikim koliinama kod npr. matinjaka i ruzmarina. Osim sto je veoma dobar antioksidans, esto je sastojak preparata za tretiranje herpesne infekcije usana.Diterpeni su glavni sastojak meksike alfije (Salvia divinorum). Zbog njih ova biljka izaziva halucinacije, te se zato koristi i kao droga. U tradicionalnoj kineskoj medicini neke alfije sa diterpenima se koriste za umirenje i jaanje srca.Triterpeni, kao to je ursolna kiselina, prisutni su kod ruzmarina, i ona je aktivni sastojak nekih kometikih preparata.Tanini imaju antibakterijsko i adstringentno delovanje.Flavonoidni heterozidi (na primer kod timijana) mogu delovati tako da oputaju miie bronhija i olakavaju iskaljavanje.1.2.1. Rod Salvia L. (alfija)Rod Salvia obuhvata oko 900 aromatinih vrsta i ini oko etvrtine ukupnog broja vrsta familije usnatica (Kamatou et al., 2008). Naziv roda potie od latinske rei salvare spasiti, a odnosi se na lekovita svojstva ovih biljaka (orevi et al., 2000). Prvi poznati autor koji je opisao biljke po imenu Salvia (Salvia officinalis L.) je bio Plinije Stariji, pre oko 2000 godina. U Starom Egiptu (za vreme vladavine faraona Ramzesa) biljke iz roda Salvia su koristili za leenje steriliteta kod ena, dok su u antikoj Grkoj ove biljke koristili u raznim ritualima. U Rimskom carstvu su veoma cenili alfiju, tako da je jedna medicinska kola u Salermu nazvana Salvia salvatrix, zbog njenih lekovitih svojstava (Tama & Ivopol, 2009).Vrste iz roda Salvia imaju iroku primenu u tradicionalnoj medicini zbog njihovih razliitih biolokih aktivnosti: antiseptike, antibakterijske, antituberkulozne, spazmolitike, hemostatike, antivirusne, antidijabetike i citotoksine aktivnosti. Poznato je da se u Turskoj narodnoj medicini neke vrste (S. tomentosa, S. virgata, S. limbata i S. sclarea) koriste u leenju prehlade, infekcija usta i grla, za bre zaceljenje rana, kao i za regulaciju menstrualnog ciklusa (Uyde-Doan et al., 2005). Takoe, dokazani su i kardiovaskularni efekti ovih biljaka. S. milthinrrhiza, na primer, kod pacova izaziva hipotenziju, a u Kini se koristi za leenje angine pektoris i infarkta miokarda (Wang, 2010).Vrste Salvia imaju nelezdane i lezdane trihome na listovima, stablu i cvetnim delovima. lezdane dlake sadre volatilne komponente, etarska ulja, koja daju tipinu aromu ovim biljkama.

Vrste roda Salvia obuhvataju jednogodinje ili viegodinje biljke, zeljaste, polubunaste i bunaste. Listovi su celi, ali ponekad nazubljeni ili igliasto deljeni. Cvetovi su organizovani u racemozne cvasti, uglavnom su bujne, od plave do crvene boje, manje ih je belih i utih. aica je normalno tubularna ili zvonasta, dvousnata gornja usna cela ili sa tri zupca, donja sa dva zupca. Krunica je esto kukasta i dvousnata. Donja usna je tipino podeljena na dva lobusa. Pranici su redukovani na dve kratke strukture sa dvoelijskim anterama gornja elija je fertilna (Dikli, 1974).Prirodni areal biljaka iz roda Salvia su Evropa, Azija, Severna i Juna Amerika. Centri rasprostranjenosti su Juna i Centralna Amerika (oko 500 vrsta), Centralna Azija i Mediteran (oko 250 vrsta) i Istona Azija (oko 90 vrsta) (Ifrim, 2012).1.2.2. Salvia amplexicaulis Lam.Salvia amplexucaulis Lam. (Slika 1) je viegodinja biljka. Stabljika moe biti visoka do 80 cm (Hedge, 1972), odnosno 120 cm (Dikli, 1974), debela je, uspravna ili se izdie. U gornjem delu ona je veoma razgranata, stvarajui cvast u vidu metlice, koja je gusto pokrivena dugakim dlakama i njena duina je jednaka debljini stabljike. Listovi su na kratkoj drci ili su sedei (Hedge, 1972). Donji listovi stabla su sa kratkom lisnom drkom ili skoro sedei, izdueno-lancetasti, pri osnovi srcasto useeni ili zaokrugljeni. Srednji i donji listovi su izdueni, sedei, srcastom osnovom obuhvataju stabljiku. Na licu su manje ili vie goli, na naliju bledi, manje ili vie pokriveni dlakama, a du celog oboda su tupo nazubljeni. Brakteje srcasto jajaste, celog oboda, due ili krae od stabljike, esto ljubiaste, spolja prekrivene dlakama. Cvetovi su dugaki izmeu 10 i 12mm, sa kratkom cvetnom drkom, po 4 do 6 (Dikli, 1974), odnosno 8 (Hedge, 1972) sloeni u prividne, zbijene prljenove. aica je zvonasta, gusto pokrivena dlakama, dvousnata donja usna sa 2 dugaka, a gornja sa 3 kratka zupca. Krunica dvousnata, plavoljubiasta, krunina cev jednaka po duini sa aicom. Pranici ne vire iz krunice, stubi je mnogo dui (Dikli, 1974).Stanite ove vrste predstavljaju suni pranjaci, kamenjari, rastu pored puta, u ikarama (Dikli, 1974).Rasprostranjena je u zapadnoj Anatoliji, na istoku Balkana (Bosna i Hercegovina, Srbija, Albanija, Makedonija, Grka, Bugarska, Turska), na jugu Rumunije, a takoe i kao invazivna biljka u Maarskoj (Petrovi et al., 2009). U Srbiji je rasprostranjena na istoku (Zajear, Knjaevac, Ni), jugoistoku (Pirot, Vlasotince, Lunica), jugu (Vranje), i na Kosovu (Dikli, 1974).1.3. Antioksidativna aktivnost

Antioksidansi su supstance koje, prisutne u malim koliinama u odnosu na supstrat podloan oksidaciji (lipidi, proteini, ugljeni hidrati, DNK), inhibiraju ili potpuno spreavaju njihovu oksidaciju. Brojna istraivanja su pokazala da izmerena antioksidativna aktivnost zavisi do metode koja se primenjuje. Veina metoda za odreivanje antioksidativne aktivnosti se karakterie sposobnou testirane supstance ili produkta da hvata slobodne radikale i/ili da kompleksi jona metala voze oksidativni proces (Tirzitis & Bartosz, 2010).Potrebno je naglasiti da postoji razlika izmeu termina antiradikalna i antioksidativna aktivnost i da se oni ne moraju podudarati. Prema Burlakovu i saradnicima (1975), antiradikalnu aktivnost karakterie sposobnost jedinjenja da reaguju sa slobodnim radikalima (u reakciji jednog slobodnog radikala), dok antioksidativna aktivnost predstavlja sposobnost da se inhibira proces oksidacije (to, bar kada su lipidi u pitanju, podrazumeva skup razliitih reakcija). Shodno tome, svi test sistemi koriste stabilne slobodne radikale (na primer DPPH i ABTS), to daje informacije o sakupljanju radikala ili antiradikalnoj aktivnosti, iako u mnogim sluajevima ova aktivnost ne odgovara antioksidativnoj aktivnosti. Da bi se dobile informacije o stvarnoj antioksidativnoj aktivnosti u vezi sa stabilizatorima hrane, na primer, neophodno je izvesti istraivanja na stvarnim produktima (biljnim uljima, lipoproteinima...) (Tirzitis & Bartosz, 2010).Svi eksperimenti u vezi antioksidativne aktivnosti koji se vre u in vitro uslovima prevode se na in vivo uslove antioksidativnog delovanja na ljude i druge ivotinje, to zahteva dobru metodologiju (Halliwell, 2012).Slobodni radikali su nekompletni molekuli imaju nesparen slobodan elektron. Prisustvo nesparenog elektrona ini slobodni radikal jakim oksidantom i visoko reaktivnim zato to tei da se spari sa drugim elektronom i na taj nain oteuje elije lananom reakcijom (molekul koji je ostao bez elektrona i sam postaje slobodan radikal). Kiseonini slobodni radikali su: superoksid, vodonik peroksid, hidroksi radikal. Slobodni radikali mogu otetiti elijsku membranu, masne kiseline, holesterol, proteine i DNK, i imaju ulogu u patogenezi mnogih hroninih degenerativnih bolesti. Oksidacija elijskih proteina i membrana moe izazvati oteenje tkiva kod mnogih bolesti koje su dugi niz godina opisivane kao bolesti nepoznate etiologije, kao to su: reumatoidni artritis, zapaljenska crevna oboljenja, Parkinsonova bolest. Oksidacija LDL holesterola poveava rizik od ateroskleroze. Oksidativno oteenje DNK moe doprineti nastanku karcinoma. Slobodni radikali imaju vanu ulogu i u procesu starenja organizma (Sies, 1991).

Oksidativni stres predstavlja poremeaj ravnotee izmeu prooksidanasa i antioksidanasa u korist prooksidanasa usled ega dolazi do oteenja vitalnih elijskih makromolekula (Sies, 1991).1.3.1. DPPH metoda (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil)

DPPH test je najrasprostranjenija metoda za ispitivanje antioksidativne aktivnosti mnogih biljnih lekova, odnosno za istraivanje prirodnih antioksidanasa. Prvi put je ova metoda opisana 1958. godine (Blois, 1958), a kasnije je modifikovana od strane brojnih istraivaa (Krishnaiah et al., 2011). PubMed baza podataka pokazuje da je DPPH test od 1969. godine bio ukljuen u vie od 850 istraivanja (Tirzitis & Bartosz, 2010). Ova metoda se bazira na redukciji rastvora obojenih stabilnih slobodnih radikala DPPH nekim redukcionim sredstvom (Shivaprasad et al., 2005) (Slika 2). Slobodni radikal DPPH sa nesparenim elektronom ima maksinum apsorpcije na 517nm (ljubiasta boja). Kada antioksidans reaguje sa DPPH, u prisustvu vodonika kao donora elektrona, ovaj radikal se redukuje u DPPHH i posledica toga je apsorpcija na manjim talasnim duinama nego DPPH. Pritom dolazi do obezbojavanja (uta boja), to je proporcionalno prisutnim elektronima: vei stepen obezbojavanja oznaava veu redukcionu sposobnost. Ovaj test je bio najprihvaeniji model za procenu slobodnih radikala tako to se odreivala aktivnost novih lekova. Kada se rastvor DPPH pomea sa supstancom koja je donor vodonikovog atoma, poveava se koliina redukovanog oblika (difenilpikrilhidrazil nije radikal) i gubi se njegova ljubiasta boja (mada se oekuje da postoji preostala uta boja koja potie od pikril-grupe koja je jo uvek prisutna) (Patel & Patel, 2011). Ova aktivnost se izraava kao efektivna koncentracija (EC50) ili inhibitorna koncentracija (IC50) (Shivaprasad et al., 2005) koncentracija jedinjenja koja redukuje apsorbanciju DPPH rastvora za 50% (Tirzitis & Bartosz, 2010).

1.3.2. Flavonoidi i fenoliPolifenolna jedinjenja spadaju, zajedno sa -tokoferolom i -karotenom, u grupu neenzimskih antioksidanasa. Smatra se da je antioksidativna aktivnost polifenolnih jedinjenja prvenstveno rezultat njihove sposobnosti da budu donori vodonika, nakon ega nastaju manje reaktivni fenoksil radikali. Relativno velika stabilnost fenoksil radikala (FlO) se objanjava delokalizacijom elektrona uz postojanje vie rezonantnih formi. Smatra se da se deo antioksidativnog potencijala mnogih vrsta biljaka moe pripisati polifenolnim jedinjenjima. Najprihvatljivija reakcija flavonoida koja pokazuje aktivnost hvatanja radikala je (Seyoum et al., 2006):

FlOH + DPPH FlO + DPPH2

Antioksidativni sastojci flavonoida su odgovorni za inhibiciju lipidne peroksidacije, to pospeuje leenje rana. Oni takoe poseduju i aktivne antiinflamatorne sastojke. Inflamatorni procesi su vani jer pruaju otpor mikroorganizmima, a dugi inflamatorni period dovodi do kasnijeg izleenja rane. U tom sluaju je vana antiinflamatorna aktivnost flavonoida (Sntar et al. 2011).Istraivanja su pokazala da su flavonoidi dobri hvatai slobodnih radikala, te imaju znaajnu ulogu u farmaceutskoj i prehrambenoj industriji. Zatitni efekat ovih jedinjenja dokazan je in vitro i ex vivo. Oni inhibiraju oksidaciju lipida, koja se u biolokim sistemima dovodi u vezu sa pojavom hroninih oboljenja i starenjem elija. Flavonoidi inhibiraju neke enzimske sisteme, reaguju sa peroksil radikalom kao vitamin E i pri tome okonavaju autooksidaciju nezasienih masnih kiselina (Laranjinha et al., 1994).Antioksidativno delovanje polifenola, a time i flavonoida, zavisi od njihove strukture. Flavonoidi inhibiraju enzime odgovorne za nastajanje superoksid anjon radikala, kao to su ksantin-oksidaza i protein kinaza C, ali inhibiraju i cikloksigenazu, lipoksigenazu, mikrozomalnu monoksigenazu i glutation S-transferazu, mitohondrijalnu sukcin-oksidazu, NADH oksidazu, ime spreavaju nastajanje reaktivnih vrsta kiseonika. Flavonoidi pokazuju antioksidativnu aktivnost kako u hidrofilnim, tako i u lipofilnim sistemima. Zahvaljujui niem redoks potencijalu (0,23 0,75V) flavonoidi mogu redukovati slobodne radikale (R), koji imaju vei redoks potencijal (2,13 1,0V), kao to su superoksid anjon radikal, peroksil, alkoksil, hidroksil radikal, odavanjem atoma vodonika. Oni imaju i irok spektar drugih biohemijskih funkcija. Poznati su i sinergistiki efekti kod antioksidativnog delovanja flavonoida. Flavonoidi pod uslovima oksidativnog stresa mogu delovati prooksidativno, te umesto hvatanja, mogu formirati slobodne radikale. 1.4. Istraivanja bioloke aktivnosti vrena na rodu SalviaVrste iz roda Salvia se koriste u tradicionalnoj medicini irom sveta zbog toga to poseduju antibakterijska, antioksidativna, antidijabetika, kao i antitumorska svojstva. Takoe je kod nekoliko vrsta Salvia iz Turske otkriveno da poseduju kardiovaskularnu aktivnost (Ulubelen, 2003).Istraivana su etarska ulja i metanolni ekstrakti biljaka Salvia cryptantha i Salvia multicaulis radi ispitivanja njihovih potencijalnih antimikrobnih i antiradikalnih aktivnosti. Nikakva ili veoma mala aktivnost je uoena testiranjem polarnih ili nepolarnih podfrakcija ekstrakata, dok etarska ulja pokazuju antimikrobnu aktivnost. Etarska ulja koja su izolovana iz ove dve vrste biljaka su analizirana pomou GC-MS i identifikovana su 53 jedinjenja kod S. cryptantha, i 47 kod S. multicaulis. Antioksidativna aktivnost polarnih podfrakcija i etarskih ulja su ispitana korienjem 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH), testa slobodnih radikala i testa peroksidacije lipida. Etarska ulja i nepolarne podfrakcije metanolnog ekstrakta pokazale su antioksidativnu aktivnost. Zakljuak ove studije je da ulja ove dve vrste Salvia imaju sposobnost hvatanja slobodnih radikala i inhibiranja rasta patogenih mikroorganizama (npr. Staphylococcus aureus, S. pneumoniae, Escherichia coli, Candida albicans). Zbog toga mogu biti pogodne za korenje u prehrambenoj industriji kao antimikrobni i antioksidativni agensi (Tepe et al., 2004).Sprovedena je studija na jo jednoj vrsti Salvia Salvia tomentosa Miller. Ova studija se bavila istraivanjem in vitro antimikrobnih i antioksidativnih aktivnosti etarskih ulja i razliitih ekstrakata pripremljenih korienjem rastvaraa razliitih polarnosti. Naeno je da etarska ulja poseduju jako antimikrobno dejstvo; nepolarni ekstrakti i podfrakcije pokazuju umerenu aktivnost, dok su polarni ekstrakti skoro neaktivni. Antimikrobna aktivnost je ustanovljena kada su u pitanju S. aureus, S. pneumoniae, M. catarrhalis, B. cereus, A. lwoffii, C. perfringens, M. smegmatis i C. albicans. Osim kod etiri vrste ispitanih mikroorganizama (M. catarrhalis, B. cereus, A. lwoffii i C. albicans), etarska ulja biljke S. tomontosa pokazuju jaku antimikrobnu aktivnost. Generalno je uoena slabija aktivnost protiv Gram-negativnih bakterija. Analizama ulja pomou GC i GC/MS identifikovana su 44 jedinjenja, koja predstavljaju 97.7% ulja, od kojih su glavne komponente -pinen (39.7%), -pinen (10.9%) i kamfor (9.7%). Takoe su uzorci ispitivani i korienjem DPPH testa, kao i testa -karoten-linoleinske kiseline, radi otkrivanja mogue antioksidativne aktivnosti. U prvom sluaju (DPPH test) je pokazano da je aktivnost hvatanja slobodnih radikala u vodeno-metanolnom ekstraktu jaa od ostalih ekstrakata (IC50 = 18.7g/ml). Polarni ekstrakti pokazuju jae aktivnosti od nepolarnih ekstrakata. U sluaju testa linoleinske kiseline, oksidacija linoleinske kiseline je efektivno inhibirana polarnim podfrakcijama vodeno-metanolnog ekstrakta, dok su se ulja pokazala manje efikasna. Vodeno-metanolni ekstrakt je pokazao 90.6% inhibicije, to je prilino blizu procentu inhibicije koji pokazuje sintetiki antioksidans BHT (Tepe et al., 2005).Salvia officinalis L., aromatina i lekovita mediteranska biljka dobro je poznata zbog svojih antioksidativnih svojstava koja se prvenstveno odnose na fenolni sastav. Metanolni i vodeni ekstrakti su pripremljeni iz nadzemnih delova biljke S. officinalis i fenolna jedinjenja su analizirana pomou HPLC/DAD. Tako je identifikovano osam fenolnih jedinjenja, ukljuujui pet fenolnih kiselina (ruzmarinska kiselina, kafena kiselina, ferulina kiselina, 3-kafeolikvinska i 5-kafeolikvinska kiselina) i tri flavonoida (luteolin-7-glukozid, 4,5,7,8-tetrahidroksiflavon, apigenin-7-glukozid). Metanolni ekstrakt je imao veu koliinu ovih komponenti od vodenog ekstrakta. Glavni fenolni sastojak u metanolnom ekstraktu je bila ruzmarinska kiselina (132.2g/mg ekstrakta), dok je u sluaju vodenog ekstrakta, pored ruzmarinske kiseline (52.0g/mg ekstrakta), bio i luteolin-7-glukozid (19.7g/mg ekstrakta). DPPH testom je pokazano da metanolni ekstrakt ima veu koliinu fenolnih jedinjenja i veu antiradikalnu aktivnost (IC50 = 13.5 0.5g/ml), kao i veu antiradikalnu efikasnost od vodenog ekstrakta, ija je IC50 vrednost 14.9 0.3g/ml. Aktivnost oba ekstrakta je manja od postavljene kontrole, kvercetina (Krishnaiah et al., 2011). U testu sa superoksidnim radikalima, vodeni rastvor je pokazao veu antiradikalnu aktivnost (14.4 1.4g/ml) od metanolnog ekstrakta (162 39g/ml) (Lima et al., 2007). Lima et al. (2005) su sproveli studiju u kojoj su u periodu od 14 dana pacovima i mievima pijau vodu zamenili infuzijama S. officinalis, to je pospeilo antioksidativni status njihovih jetri.1.5. Istraivanja bioloke aktivnosti vrena na vrsti Salvia amplexicaulis U studiji Petrovi et al. (2009) ispitivan je hemijski sastav, kao i antimikrobna aktivnost etarskog ulja vrste Salvia amplexicaulis. Identifikovana je 51 komponenta, to ini 90.2% ulja. Karakterie ga visoka koliina (81.1%) seskviterpena meu kojima su najzastupljeniji germakren D (14.8%), viridiflorol (10.6%), kariofilen-oksid (10.5%) i -kariofilen (9.4%). Monoterpena ima svega 1.6%. Uporeen je hemijski sastav ulja kod S. amplexicaulis sa drugim vrstama Salvia. Ustanovljeno je da je -kariofilen jedna od glavnih komponenti ulja S. nemorosa L. (sa kojom je S. amplexicaulis i na osnovu drugih karakteristika slina), S. pratensis L., zatim S. verticillata L. i S. hypoleuca Benth. Takoe su ustanovili da je kod S. glutinosa L. glavni seskviterpen kariofilen-oksid, a da je kod S. argentea L. viridiflorol. Ispitivanja antimikrobne aktivnosti S. amplexicaulis su pokazala da je najbolji inhibitorni efekat protiv M. luteus (MIC 0.3mg/mL), zatim protiv S. aureus, S. epidermidis i C. albicans (MIC 0.6mg/mL). Takoe se pokazalo da su Gram-negativne bakterije otpornije (MIC.>.0.6mg/mL) od Gram-pozitivnih bakterija i C. albicans (Petrovi et al., 2009).Kolak et al. (2001) su iz ove vrste izolovali pet diterpenoida: feruginol, horminon, 7-acetilhorminon, sugiol i 7-okso-abieta-9,12,14-trien, steroide stigmast-4-en-3-on, stigmasterol, -sitosterol, kao i -amirin, ursolnu kiselinu, oleanolsku kiselinu, acetiloleanolsku kiselinu i salvigenin. Pokazano je da 7-okso-abieta-9,12,14-trien, feruginol, stigmast-4-en-3-on, kao i sirovi ekstrakt imaju vazodepresorni efekat izazivaju nagli pad krvnog pritiska (Ulubelen, 2003).Istraivanja su pokazala da salvigenin, koji spada u grupu flavona, zajedno sa 6-hidroksiluteolin-6,7,3,4-tetrametil etrom dovodi do relaksacije izolovane aorte pacova, u zavisnosti od prisutne koncentracije ovih flavona. Posmatrana je njihova IC50 vrednost i dolo se do zakljuka da salvigenin izaziva veu osetljivost tkiva nego drugi flavon korien u ovoj studiji. Uklanjanjem endotelijuma znatno je inhibirana relaksacija pod uticajem salvigenina, dok je odgovor na 6-hidroksiluteolin-6,7,3,4-tetrametil etar samo delimino promenjen. Ovo ukazuje na to da je endotelijum vaan posrednik kada se koristi salvigenin kao vazodilatator. Takoe, kada se uzme u posmatranje i NO, koji takoe izaziva vazodilataciju, moe se videti da njegovo oslobaanje pokazuje slinost sa vazodilatacijom uzrokovanom flavonoidima, i to direktnim merenjem produkcije NO. Epidemioloki dokazi ukazuju na obrnutu povezanost izmeu unoenja flavonoida hranom i kardiovaskularnih oboljenja. Savremena istraivanja, meutim, pokazuju korelaciju izmeu njihovog zatitnog efekta i antioksidativne aktivnosti, kao i poveane produkcije NO od strane vaskularnog endotelijuma. Dakle, ne bi bilo pogreno zakljuiti da jaki vazodilatatorni efekat salvigenina, moe da donese neku korist kada su u pitanju kardiovaskularne bolesti (Uyde-Doan et al., 2005).II CILJ ISTRAIVANJACilj ovog istraivanja je bio odreivanje i poreenje antioksidativne aktivnosti, sadraaja fenola i flavonoida u celoj biljci Salvia amplexicaulis i pojedinim biljnim delovima, tj. stablu, listovima i cvetovima.

III MATERIJAL I METODE

3.1. Hemikalije

Metanol, etanol i destilovana voda su kupljeni od Zorka Pharma, abac, Srbija. Galna kiselina, kvercetin, askorbinska kiselina, 2(3)-t-butil-4-hidroksianizol (BHA), 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH), kalijum-acetat (C2H3KO2), anhidrovani natrijum-karbonat (Na2CO3), aluminijum-nitrat nonahidrat (Al(NO3)3 x 9H2O) i Folin-Ciocalteu-ov reagens su nabavljeni od Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO, USA. Sve hemikalije i rastvarai korieni u eksperimentu su analitikog stepena istoe.3.2. Biljni materijal

Nadzemni delovi biljke Salvia amplexicaulis su sakupljeni na kraju perioda cvetanja u julu 2011. godine na lokalitetu Pletvar (Makedonija). Biljni materijal je osuen na vazduhu i skladiten u suvoj i tamnoj prostoriji na sobnoj temperaturi do daljeg procesuiranja. Vaueri su deponovani u Herbarijumu Instituta za Botaniku Biolokog fakulteta Univerziteta u Beogradu (BEOU; vauer br.16673).

3.3. Priprema ekstrakata

Ekstrakti su pripremljeni od celih biljaka, kao i od posebno odvojenih biljnih delova. Odmereno je 5g biljnog materijala (cele biljke, listovi, stabla i cvetovi, uglavnom cvetne drke i aice) i samleveno na komadie veliine 26 mm u blenderu, a zatim ekstrahovano pomou 50 mL 96% etanola klasinom metodom maceracije tokom 24 h na sobnoj temperaturi (10% w/v). Meavina je izloena ultrazvuku 1h pre i 1h nakon 24-asovne maceracije. Nakon toga, ekstrakti su profiltrirani kroz filter papir (Whatman No.1) i viak rastvaraa je uparen pod smanjenim pritiskom pomou rotacionog evaporatora (Buchi rotavapor R-114). Nakon uparavanja, dobijeni sirovi ekstrakti (Tabela 1) su uvani u friideru na +4C do sledeih eksperimenata.

3.4. DPPH test za odreivanje antioksidativnog dejstva

Ovaj spektrofotometrijski test (Blois, 1958) meri antioksidativni kapacitet biljnog ekstrakta kao hvataa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) radikala. Neposredno pre eksperimenta je pripremljen sve radni rastvor DPPH koncentracije 40 g/ml. Suvi ekstrakt je rastvoren u 96%om etanolu da se dobije poetno razblaenje 1000 g/ml (w/v). Ostala razblaenja (10, 15, 20, 25, 30 g/mL (v/v)) u zapremini od 4000 l reakcione smee su dobijena meanjem odreenog volumena poetnog rastvora (1000 g/ml) sa radnim rastvorom DPPH. Metanol je korien kao blank, dok je metanol u rastvoru DPPH korien kao slepa proba. BHA i askorbinska kiselina rastvoreni u vodi su uvedeni kao pozitivne kontrole (referentni antioksidansi ili standardi). Slepa proba, uzorci i standardi su pripremljeni u triplikatu. Absorbanca je merena nakon 30 minuta u mraku na sobnoj temperaturi na 517 nm uz pomo spektrofotometra JENWAY 6305UV/Vis. Inhibicija DPPH radikala u prisustvu testiranog uzorka se rauna formulom i izraava u procentima (%):gde je Asp absorbanca slepe probe (bez uzorka) i Auz je absorbanca probe sa uzorkom razliite koncentracije. Na osnovu jednaine krive apsorpcije koja se dobija kao grafiki prikaz zavisnosti inhibicije (%) od koncentracije ekstrakta moe se izraunati IC50 vrednost (g/mL). U ovom testu IC50 vrednost predstavlja koncentraciju uzorka i/ili standardnog antioksidansa koja inhibira 50% poetne koncentracije DPPH molekula na 517nm.3.5. Odreivanje ukupnog sadraja fenola

Za odreivanje ukupnog sadraja fenolnih jedinjenja je koriena procedura po Singleton i Rossi (1965). U test epruvete je odmereno po 200 L ekstrakta koncentracije 1 mg/mL, a zatim je dodato po 1 mL 10% rastvora FolinCiocalteu reagensa. Nakon 6 minuta, u test epruvetu je sipano 800 L 7.5% rastvora Na2CO3. Slepa proba je pripremljena tako da sadri sve komponente i destilovanu vodu umesto uzorka i koriena je za zeriranje. Za konstruisanje kalibracione krive umesto ekstrakta je koriena galna kiselina rastvorena u destilovanoj vodi u koncentracijama: 0.01, 0.025, 0.05, 0.1 mg/ml. Sva merenja su ponovljena tri puta.Absorbanca je oitavana na 517 nm nakon inkubacije u trajanju od 120 minuta na sobnoj temperaturi pomou JENWAY 6305UV/Vis. spektrofotometra. Ukupan sadraj fenola u uzorcima je izraunat iz jednaine kalibracione krive i predstavljen u ekvivalentima galne kiseline kao mg GAE/g suvog ekstrakta.

3.6. Odreivanje ukupnog sadraja flavonoida

Za odreivanje ukupnog sadraja flavonoida je koriena procedura po Park et al. (1997). U test epruvete je odmereno po 1 mL uzorka koncentracije 1 mg/mL, zatim dodato 4.1 mL 80% etanola, 0.1 mL 10% Al(NO3)3 x 9H2O, i 0.1Ml 1M rastvora CH3COOK. Slepa proba je sadrala sve komponente i 1 mL 96% etanola umesto uzorka. Za konstruisanje kalibracione krive umesto ekstrakta je korien kvercetin rastvoren u 96% etanolu, u koncentracijama: 0.01, 0.025, 0.05, 0.1 mg/ml. Absorbanca je oitavana nakon 40 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi na 415 nm pomou JENWAY 6305UV/Vis spektrofotometra i konstruisana je kalibraciona kriva. Sadraj flavonoida je izraunat iz jednaine kalibracione krive i izraen je u ekvivalentima kvercetina, kao mg QE/g suvog ekstrakta.

3.7. Statistika analiza

Sva merenja su ponovljena tri puta i predstavljena kao srednja vrednost tri probe standardna devijacija. Izraunavanja i konstrukcija krivih je izvedena pomou programskog paketa MS Office Excel, 2007.IV REZULTATI

U Tabeli 1 su prikazani rezultati merenja prinosa ekstrakata dobijenih iz razliitih delova Salvia amplexicaulis. Prinos (%) je izraunat po formuli: me/m gde je me izmerena masa suvog ekstrakta, a m masa biljnog materijala korienog za ekstrakciju (u ovom radu je m = 5g). Rezultati pokazuju da ekstrakt cvetova (14.14%) i cela biljka (13.18%) imaju najvei prinos, a stabla najmanji (7.52%). Ekstrakt% prinosa ekstrakta (w/w)

Cela biljka13.18

Listovi10.18

Stabla7.52

Cvetovi14.14

Protiv DPPH radikala najefikasniji je etanolni ekstrakt listova, a najmanje aktivan je ekstrakt cvetova (Slika 3). Antioksidativna aktivnost ekstrakta je predstavljena kao IC50 vrednost, odnosno koncentracija ekstrakta koja redukuje poetnu koncentraciju DPPH molekula za 50%. Dakle, to je manja IC50 vrednost, ekstrakt je bioloki aktivniji.Slika 3. DPPH aktivnost etanolnih ekstrakata S. amplexicaulis predstavljena kao IC50 vrednost (g/ml)U Tabeli 2 je prikazan sadraj fenola i flavonoida u etanolnim ekstraktima dobijenim iz cele biljke i odvojenih biljnih delova. Rezultati pokazuju da su ovim metabolitima najbogatiji ekstrakti listova, a najsiromaniji ekstrakti cvetova. Sadraj fenola i flavonoida u biljnim ekstraktima je izraen preko ekvivalenata galne kiseline i kvercetina, respektivno.Tabela 2. Ukupni sadraj fenola i flavonoida etanolnih ekstrakata dobijenih iz razliitih delova biljke. Ukupni sadraj fenola je izraen kao ekvivalenti galne kiseline (mg GAE/g ekstrakta), dok je sadraj flavonoida predstavljen kao ekvivalenti kvercetina (mg Q/g ekstrakta). Vrednosti su prikazane kao srednja vrednost standardna devijacija.Etanolni ekstrakti Salvia amplexicaulisTotalni fenoli(mg GA/g suvog ekstrakta)Totalni flavonoidi(mg Q/g suvog ekstrakta)

Cela biljka138.05 0.99727.35 0.601

Cvetovi112.42 0.60121.85 1.846

Stabla173.67 1.27328.77 0.577

Listovi222.40 0.64349.81 0.820

V DISKUSIJA

Na vrsti Salvia amplexicaulis ranije je uraeno istraivanje metanolnih i etil-acetatnih ekstrakata (cela biljka). Tako je pokazano da prinos metanolnih ekstrakta (m=1g) iznosi 3.05% (w/w), a etil-acetatnih 2.79% (Orhan et al., 2012). U ovom radu je korien etanolni ekstrakt i prinos cele biljke iznosi 13.18%.Dobijeni prinosi ekstrakata prikazani u Tabeli 1 su u saglasnosti sa literaturnim podacima iz istraivanja etanolnih ekstrakata cvetova, listova i stabljika S. officinalis L., gde cvetovi pokazuju najvei prinos (3.5%), zatim listovi (3.1%), a najmanji prinos pokazuju stabla (1.2%) (Velikovi et al., 2003).Na Slici 3 prikazane su IC50 vrednosti (g/mL) etanolnih ekstrakata razliitih delova biljke i celih biljaka, kao i pozitivnih kontrola (sintetiki antioksidans BHA i askorbinska kiselina). Uoeno je da je protiv DPPH radikala najefikasniji etanolni ekstrakt listova, a da je najmanje aktivan ekstrakt cvetova. Koriene pozitivne kontrole imaju malu IC50 vrednost, to znai da je njihova bioloka aktivnost velika. Listovi imaju IC50 vrednost najbliu BHA (16,07g/mL), odnosno ekstrakt listova je najaktivniji. Stabla su manje aktivna, imaju neto manju IC50 vrednost (22.53g/mL), zatim sledi ekstrakt cele biljke (28.74g/mL), dok je bioloka aktivnost cvetova najmanja imaju najveu IC50 vrednost (32.29g/mL). Literaturni podaci pokazuju veliku raznolikost rezultata antioksidativne aktivnosti meu ispitivanim vrstama Salvia iz razliitih regiona. Raena su istraivanja metanolnih ekstrakata nadzemnih delova razliitih vrsta turskih Salvia. Koristei BHA kao pozitivnu kontrolu, Tosun et al. (2009) su utvrdili da najmanju aktivnost ima S. limbata (88.2 g/mL), a najveu S. verticillata (18.3 g/mL). Kamatou et al. (2010) su odredili antioksidativnu aktivnost nekoliko vrsta junoafrikih Salvia i od ispitivanih vrsta, najmanju aktivnost imaju S. radula i S. dolomitica (>100 g/mL), a S. schlechteri ima najveu aktivnost (1.61 0.03).Ukupni sadraj flavonoida koji je izraen kao ekvivalent kvercetina (mg Q/g ekstrakta) ispitivan je na celoj biljci S. amplexicaulis (Orhan et al., 2012) i dobijene su razliite vrednosti, u zavisnosti od toga da li je korien metanolni ili etil-acetatni ekstrakt. Sa etil-acetatnim ekstraktom ukupni sadraj flavonoida iznosi 58.40 1.10, dok sa metanolnim ekstraktom iznosi 10.12 0.61. Koristei metanolni ekstrakt i galnu kiselinu (GAE), Kamatou et al. (2010), odredili su sadraj totalnih fenola (mg GAE/g ekstrakta) razliitih vrsta Salvia. Tako je utvreno da kod S. garipensis iznosi 45.6 mg/g, dok je kod S. chamelaeagnea najvei meu ispitivanim vrstama, i iznosi 212 mg/g. Tosun et al. (2009) su takoe ispitivali sadraj totalnih fenola i utvrdili su da kod S. nemorosa iznosi 63.9 mg GAE/g ekstrakta, a da je najvei meu ispitivanim vrstama kod S. limbata (167.1 mg/g). Slika 4. Linearna korelacija izmeu sadraja ukupnih fenola i antioksidative aktivnosti. Koeficijent determinacije R = 0,996, koeficijent korelacije r = - 0,998. Korelacija je znaajna sa koeficijentom rizika 0.05.

Slika 4 prikazuje linearnu korelaciju izmeu sadraja ukupnih fenola i antioksidativne (DPPH) aktivnosti ekstrakata. S obzirom na to da manja IC50 vrednost oznaava veu antiksidativnu aktivnost, moe se primetiti da sa porastom sadraja fenola raste aktivnost protiv DPPH radikala, tj. smanjuje se IC50 vrednost. Linearna korelacija je stoga negativna i jaka (r = - 0.998).Iz ekstrakata nekoliko vrsta turskih Salvia je odreen sadraj flavonoida uz pomo jednaine: y=0.0058x0.0002 (R2.=.0.9929), a na osnovu spektrofotometrijskih merenja. Tako je pokazano da etil-acetatni ekstrakt vrste S. pilifera (68.92 2.44 mg/g ekstrakta) i metanolni ekstrakt vrste S. aytachii (60.04 2.44 mg/g ekstrakta) imaju najvei sadraj ukupnih flavonoida izraeni kao ekvivalenti kvercetina po gramu ekstrakta (Orhan et al., 2012). Kamatou et al. (2010) su pokazali da postoji jaka korelacija izmeu sadraja totalnih fenola i DPPH testa (R2 = 0.90). Ovo ukazuje na to da su fenoli delimino, ako ne i potpuno, odgovorni za antioksidativnu aktivnost koja je uoena kod ispitivanih vrsta Salvia. Kod osam vrsta koje su ispitivali, Tosun et al. (2009) su odredili da R2 iznosi 0.70, odnosno tu je ta korelacija neto slabija. Njihovo istraivanje je pokazalo da S. verticillata i S. virgata mogu biti koriene kao dobri antioksidansi jer je kod njih korelacija izmeu sadraja totalnih fenola i antioksidativne aktivnosti u DPPH testu izraenija. VI ZAKLJUAKEtanolni ekstrakti cele biljke i razliitih biljnih delova Salvia amplexicaulis Lam. pokazuju znaajno antioksidativno delovanje. Ekstrakt listova je pokazao najbolju antioksidativnu aktivnost. Na osnovu navedenih rezultata, moe se pretpostaviti da je visoka vrednost antioksidativnog efekta etanolnog ekstrakta S. amplexicaulis direktno povezana sa visokim sadrajem ukupnih flavonoida i fenola.

Rezultati ovog istraivanja su pokazali da S. amplexicaulis predstavlja potencijalno znaajan prirodni izvor antioksidanasa.VII LITERATURADikli, N. (1974): Rod Salvia L. U: Flora SR Srbije (Ed. Josifovi, M.), 432-453. SANU, Beograd.

orevi, S., Caki, M., Amr, S. (2000): The extraction of apigenin and luteolin from the sage Salvia officinalis L. from Jordan. FACTA UNIVERSITATIS, Ser. Working and Living Environmental Protection 1(5): 87-93.

Encyclopdia Britannica Ultimate Reference Suite (2011): Lamiaceae, Chicago: Encyclopdia Britannica.Halliwell, B. (2012.): Free radicals and antioxidants: updating a personal view. Nutrition Reviews, 70(5), 257-265.

Hedge, I.C. (1972). Salvia L. In: Tutin, T.G., Heywood, V.H., Burges N.A., Valentine, D.H., Walters, S.M., Webb, D.A. (Eds.) Flora Europea, Vol. 3: Cambridge University Press, pp. 188-192.Ifrim, C. (2012): Morphological peculiarities of the nutlets of some Salvia species (Lamiaceae). Contribuii Botanice..2012, XLVII: 73-80, Grdina Botanic Alexandru Borza, Cluj-Napoca.

Kamatou, G.P.P., Alvaro, M.V., Steenkamp, P. (2010): Antioxidant, antiinflammatory activities and HPLC analysis of South African Salvia species. Food Chemistry, 119, 684-688.Kamatou, G.P.P., Makunga, N. P., Ramogola, W.P.N., Viljoen, A.M. (2008): South African Salvia species: A review of biological activities and phytochemistry. Journal of Ethnopharmacology, 119(3), 664-672. Krishnaiah, D., Sarbatly, R., Nithyanandam, R. (2011): A review of the antioxidant potential of medicinal plant species. Food and Bioproducts Processing, 89, 217-233.

Laranjinha, J.A.N., Almeida L.M., Madeira, V.M.C. (1994): Reactivity of dietary phenolic acid with peroxyl radicals: antioxidant activity upon low density lipoprotein peroxidation. Biochemical Pharmacology, 48, 487-494.

Lima, C.F., Andrade, P.B., Seabra, R.M., Fernandes-Ferreira, M., Pereira-Wilson, C. (2005): The drinking of a Salvia officinalis infusions improves liver antioxidant status in mice and rats. Journal of Ethnopharmacology, 97(2), 383-389.

Lima, C.F., Valentao, P.C.R., Andrade, P.B., Seabra, R.M., Fernandes-Ferreira, M., Pereira-Wilson, C. (2007): Water and methabolic extracts of Salvia officinalis protect HepG2 cells from t-BHP induced oxidative damage. Chem. Biol. Interact. 167, 107-115.Orhan, I.E, Senol, F.S., Ozturk, N., Akaydin, G., Sener, B. (2012): Profiling of in vitro neurobiological effects and phenolic acids of selected endemic Salvia species. Food Chemistry, 132(3), 1360-1367.

Patel, R.M., Patel N.J. (2011): In vitro antioxidant activity of coumarin compounds by DPPH, Super oxide and nitric oxide free radical scavenging methods. Journal of Advanced Pharmacy Education & Research, 1, 52-68.

Pelagi, V. (1973): Leenje lekovitim biljem. Narodna knjiga, Beograd.Petrovi, S., Pavlovi, M., Tzakou, O., Couladis, M., Milenkovi, M., Vuievi D., Niketi, M. (2009): Composition and Anti-microbial Activity of Salvia amplexicaulis Lam. Essential Oil. Journal of Essential Oil Research, 21, 563-566.Seyoum, A., Asres, K., Kandeel El-Fiky, F. (2006): Structure-radical scavenging activity relationships of flavonoids. Phytochemistry, 67, 2058-2070.

Shivaprasad, H.N., Mohan, S., Kharya, M.D., Shiradkar, M.R., Lakshman, K.: (2005): In-Vitro Models For Antioxidant Activity Evaluation: A Review. Pharmaceutical Reviews, 3(4).Sies, H. (1991): Oxidative stress II: Oxidants and Anti-oxidants. Academic Press, London.

Sntar, I., Akkol, E.K., enol, F.S., Hikmet, K., Orhan, I.E. (2011): Investigating wound healing, tyrosinase inhibitory and antioxidant activities of the ethanol extracts of Salvia cryptantha and Salvia cyanescens using in vivo and in vitro experimental models. Journal of Ethnopharmacology, 135, 71-77.Tama, V., Ivopol, M. (2009): Suplimente alimentare i produse cosmetice pe baz de salvie. Hofigal Natur i Sntate, Iunie/Iulie Tepe, B., Donmez, E., Unlu, M., Candan, F., Daferera, D., Vardar-Unlu, G., Polissiou, M., Sokmen, A. (2004): Antimicrobial and antioxidative acitities of the essential oils and methanol extracts of Salvia cryptantha (Montbret et Aucher ex Benth.) and Salvia multicaulis (Vahl). Food Chemistry, 84(4), 519-525.

Tepe, B., Daferera, D., Sokmen, A., Sokmen, M., Polissiou, M. (2005): Antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil and various extracts of Salvia tomentosa Miller (Lamiaceae). Food Chemistry, 90(3), 333-340.Tirzitis, G., Bartosz, G. (2010): Determination of antiradical and antioxidant activity: basic principles and new insights. Acta Biochimica Polonica, 57(1), 139-142.Tosun, M., Ercisli, S., Sengul, M., Ozer, H., Polat, T., Ozturk, E. (2009): Antioxidant Properties and Total Phenolic Content of Eight Salvia Species from Turkey. Biological Research, 42, 175-181.

Ulubelen, A. (2003): Cardioactive and antibacterial terpenoids from some Salvia species. Phytochemistry, 64, 395-399.Uyde-Doan, B.S., Takr S., zdemir, O., Kolak, U., Topu, G., Ulubelen, A. (2005): The comparison of the relaxant effects of two methoxylated flavones in rat aortic rings. Vascular Pharmacology, 43, 220-226.Velikovi, D., Ranelovi, N., Risti, M., Velikovi, A., melcerovi, A. (2003): Chemical constituents and antimicrobial activity of the ethanol extracts obtained from the flower, leaf and stem of Salvia officinalis L. Journal of the Serbian Chemical Society, 68(1), 17-24.Wang, B.Q. (2010): Salvia miltiorrhiza: Chemical and pharmacological review of a medicinal plant. Journal of Medicinal Plants Research, 4(25), 2813-2820.

Slika 1. S. amplexicaulis Lam.

Slika 2. Reakcija DPPH do DPPH (Shivaprasad et al., 2005)

DPPH + H-A DPPH-H + A (Ljubiasto) (uto)

Tabela 1. Prinos etanolnih ekstrakata Salvia amplexicaulis

3