APLICACIONES DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR I

“Identificación de la(s) hexocinasa(s) sensor(es) de carbohidratos en maíz”

Giovanna Paulina Aguilera Alvarado

Tutor: Dra. Sobeida Sánchez Nieto

Departamento de Bioquímica

Facultad de Química

2018-1

PARA INICIAR UNA INVESTIGACIÓN, HAY QUE ESCOGER UN MODELO DE ESTUDIO…

Gran parte del estudio de la biología moderna se basa en el uso de organismos modelo. En esencia se asume que a través del estudio detallado de un organismo en particular, se puede obtener información suficiente que nos ayudará a entender como funcionan otros organismos. Los organismos modelo deben: • Ser de tamaño pequeño y fáciles de mantener en el laboratorio. • Poseer un genoma pequeño. • Tener un ciclo de vida relativamente corto.

doi:10.1038/nplants.2015.67, Nat Plants (2015).

Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae

Caenorhabditis elegans Arabidopsis

thaliana

¡¿POR QUÉ LAS PLANTAS?!

Las plantas son el esqueleto de toda la vida en la tierra y un recurso esencial para la existencia del ser humano. Sólo imaginen como su vida diaria depende de las plantas…

Plantas

Agua Alimento

Cambio climático

Hábitat

Aire Medicamentos

http://www.bgci.org/plantconservationday/whyplantsimportant/

INCREMENTO DE LA DEMANDA ALIMENTARIA.

Para el año 2050 se espera que la demanda alimentaria incremente de un 59% a un 98%. Esto hace necesario que se incremente la PRODUCTIVIDAD de los cultivos en lugar de aumentar las áreas destinadas a la siembra.

Factores que afectan la

productividad de las plantas

Factores genéticos

Factores ambientales

Apariencia, resistencia, tamaño, rendimiento…

Temperatura

Radiación solar

Presencia de microorganismos

Nutrientes C, H, O, N, P, K Ca, Mg, S Cu, Mn, Zn, Cl, Fe…

BIOMOLÉCULAS

Elferink & Shierhorn, Harvard Business Review, https://hbr.org/2016/04/global-demand-for-food-is-rising-can-we-meet-it (2016) http://broome.soil.ncsu.edu/ssc051/Lec3.htm.

CARBOHIDRATOS: MOLÉCULAS SEÑALIZADORAS.

Arenas-Huertero et al., Genes Dev. (2000), Moore et al., Science (2003); Rolland et al., Annu. Rev. Plant Biol. (2006). Tomado y modificado de Henderson & Jacobsen, Nature (2007).

Ovario Antera

Flor

Planta adulta

Plántula

Semilla

Establecimiento de la plántula

Germinación Desarrollo vegetativo y reproductivo

Senescencia y estrés ↑[Glu]

↑[Glu]

↑[Sac] ↑[Glu ]

↑[Hexosas]

↑[Sac]

↑[Sac] ↑[Hexosas]intracelular

↑[Hexosas]extracelular

?

Price et al., Plant Cell (1994).

GLUCOSA: EL CARBOHIDRATO MÁS ESTUDIADO.

GLUCOSA: EL CARBOHIDRATO MÁS ESTUDIADO.

3 veces de cambio

El transporte de Glu al interior de

la célula no es suficiente para

desencadenar una señal.

Hexocinasa

Glu Man

2DOG 6DOG 3OMG

Glu Man

2DOG 6DOG 3OMG

Glu6P Man6P

2DOG6P

3OMG6P

Expresión de genes

Aguilera-Alvarado & Sánchez-Nieto, Plant Cell Physiol (2017); Price et al., Plant Cell (1994).

HEXOCINASA (EC 2.7.1.1).

HXK

ATP(Mg2+) D-Hexosa

ADP(Mg2+)

D-Hexosa 6-P

Glucólisis

Citosol

Núcleo

Plastidio

Mitocondria

RE

Filamentos de actina

Tipo A

Tipo B

Tipo C

Tipo D

Cho et al., Planta (2006); Cheng et al., Biol. Plantarum (2011); Claeyssen y Rivoal, Phytochemistry (2007); Frommer et al., Science (2003); Nilsson et al., BMC Plant Biol. (2011)

HEXOCINASA ES UNA PROTEÍNA MOONLIGTHING.

Cheng et al., Biol. Plantarum (2011); Cho et al., Plant Physiol. (2009); Kim et al., J. Integr. Plant Biol. (2015).

AtHXK1 AtHXK2 AtHXK3

AtHKL1 AtHKL2 AtHKL3

AtHXK1:GFP Mito-Tracker

A. thaliana.

OsHXK1 OsHXK2 OsHXK3 OsHXK4

OsHXK5 OsHXK6 OsHXK7

OsHXK8 OsHXK9 OsHXK10

O. sativa.

OsHXK5:GFP Mito-Tracker OsHXK6:GFP Mito-Tracker OsHXK7:GFP

Balasubramanian et al., Plant Physiol. (2007); Karve et al, Planta (2008); Moore et al., Science (2003).

Glu 6%

PERO ¿QUÉ ES UNA PROTEÍNA MOONLIGTHING? Una proteína moonlighthing es aquella que es capaz de llevar a cabo más de una función. Muchas de estas proteínas son enzimas, receptores, canales iónicos o chaperonas. La función más común de las proteínas moonlighthing es la catálisis enzimática sin embargo, a través de la evolución estas enzimas adquirieron funciones no enzimáticas secundarias por ejemplo, la transducción de señales, la regulación transcripcional, de la apoptosis y estructural.

http://www.moonlightingproteins.org/results.php?search_text=hexokinase&searching=yes&search=search

HEXOCINASAS EN PLANTAS.

↑PR1, PR5 ↑H2O2

Low O2 condition ↓AtbZIP1

Induction ABA biosynthesis

↓Photosynthesis ↑Stomatal closure ↓Transpiration rate

↑Starch biosynthesis ↑Fatty acid biosynthesis

↓Membrane potential ↓H2O2 PCD

Meristem proliferation

↑NDP-sugars

CK signaling ET signaling

Aux signaling

BR signaling HXK

↑Pollen germination Restore male fertility

↑Hexoses accumulation ↑Starch biosynthesis

↑Fatty acid biosynthesis ↑Anthocyanin biosynthesis

↑Senescence

SÍ, ES IMPORTANTE A. thaliana, PERO ¿PASARÁ LO MISMO EN OTRAS ESPECIES?

Una vez que un gen ha sido descubierto en A. thaliana, el gen (o los genes) equivalente en otra planta puede ser encontrado con más facilidad. Por lo tanto, muchos de los genes provenientes de especies de importancia agrícola pueden ser entendidos a través del estudio de sus homólogos en A. thaliana.

https://www.nsf.gov/bio/pubs/reports/arabid/chap1.htm

Tamaño del genoma: • Nuclear: 135 Mb. • Plastídico: 154 kb. • Mitocondrial: 367 kb. Cinco cromosomas. Baja cantidad de DNA repetido. Metabolismo C3.

Tamaño del genoma: • Nuclear: 2300 Mb. • Plastídico: 140 kb. • Mitocondrial: 287 kb. Diez cromosomas. Alta cantidad de DNA repetido. Metabolismo C4.

A. thaliana Zea mays

HEXOCINASA EN Z. mays.

HXK Sustrato KM (µM) Vmax

(µmol/min/mg)

Partículas Submitocondriales

Glucosa 129 ± 50 2.04 ± 0.04

ATP 156 ± 56 2.10 ± 0.05

Soluble Glucosa 49 ± 25 0.12 ± 0.03

ATP 167 ± 84 0.09 ± 0.03

Galina et al., Biochem J (1995).

R T H E EM

B2 B3

B4

B5

B1

Fracción Citosólica

Glu 2 mM

R T H E EM

B2

B3

B4

B5

B1

Fracción Mitocondrial

Glu 2 mM

R: Raíz T: Tallo H: Hoja E: Espiga EM: Embrión maduro, 24h imbibición

Estrada-Antolín, Tesis de licenciatura UNAM (2011).

HIPÓTESIS.

En algunas plantas se han identificado HXKs con función sensora de Glu y catalítica entonces en maíz que se predice tiene una gran variedad de isoformas de HXKs, al menos una HXK presentará la función dual.

OBJETIVO GENERAL.

Identificar y caracterizar a la o las hexocinasas sensoras de carbohidratos en maíz.

OBJETIVOS PARTICULARES.

1. Determinar por análisis in silico las HXKs de maíz que son homólogas a las HXKs sensores AtHXK1, AtHXK2, OsHXK5, OsHXK6 y a las HXKs citosólicas de arroz OsHXK7 y OsHXK8.

2. Clonar a las HXKs de maíz.

3. Caracterizar cinéticamente a las HXK de maíz.

4. Determinar la localización subcelular de las HXKs mediante la expresión de las HXKs unidas a GFP en protoplastos de A. thaliana.

5. Determinación de su capacidad “señalizadora” mediante ensayos de complementación en mutantes de A. thaliana carentes de HXK1 (mutantes gin2-1) y la evaluación de los fenotipos de las plantas en presencia de carbohidratos.

ANÁLISIS In silico

ALINEAMIENTOS.

Nombre del gen Número de acceso

ZmHXK3a GRMZM2G068913

ZmHXK3b GRMZM2G467069

ZmHXK4 GRMZM2G058745

ZmHXK5 GRMZM2G432801

ZmHXK6 GRMZM5G856653

ZmHXK7 GRMZM2G051806

ZmHXK8 GRMZM2G104081

ZmHXK9 GRMZM2G171373

ZmHXK10 GRMZM2G046686

http://plants.ensembl.org/index.html https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

ALINEAMIENTOS.

ZmHXK3a ZmHXK3b ZmHXK4 ZmHXK5 ZmHXK6 ZmHXK7 ZmHXK8 ZmHXK9 ZmHXK10

Porcentaje de identidad

ZmHXK3a 100.00 93.57 55.77 55.59 57.18 58.52 56.48 55.45 69.28

ZmHXK3b 93.57 100.00 55.56 55.52 56.63 58.52 56.77 55.59 69.08

ZmHXK4 55.77 55.56 100.00 93.24 79.12 63.24 61.48 64.79 52.22

ZmHXK5 55.59 55.52 93.24 100.00 78.99 61.93 61.53 65.32 51.96

ZmHXK6 57.18 56.63 79.12 78.99 100.00 63.09 62.74 64.24 52.51

ZmHXK7 58.52 58.52 63.24 61.93 63.09 100.00 70.76 59.53 52.69

ZmHXK8 56.48 56.77 61.48 61.53 62.74 70.76 100.00 59.66 53.39

ZmHXK9 55.45 55.59 64.79 65.32 64.24 59.53 59.66 100.00 53.51

ZmHXK10 69.28 69.08 52.22 51.96 52.51 52.69 53.39 53.51 100.00

http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/

ALINEAMIENTOS.

Adenosina(425-461) G441

AtHXK1 AtHXK2 AtHXK3 AtHKL1 AtHKL2 AtHKL3 OsHXK1 OsHXK2 OsHXK3 OsHXK4 OsHXK5 OsHXK6 OsHXK7 OsHXK8 OsHXK9 OsHXK10 ZmHXK3a ZmHXK3b ZmHXK4 ZmHXK5 ZmHXK6 ZmHXK7 ZmHXK8 ZmHXK9 ZmHXK10

..\2017-1\Tesis\ARBOL HXKS

ZmHXK4 ZmHXK5 ZmHXK6 ZmHXK7 ZmHXK8 ZmHXK9

Gouy et al., Mol Biol Evol (2010).