Apostila de Quimica

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIROINSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS

DEPARTAMENTO DE QUíMICASETOR DE BIOQUÍMICA

Bioquímica ExperimentalBioquímica Experimental

Roteiros de Práticas e Fundamentos

Teóricos

2013

ESPECTROFOTOMETRIA

INTRODUÇÃO:

A espectrofotometria é uma técnica analítica que avalia a capacidade dos

solutos absorverem luz em comprimentos de onda específicos. A medida da luz

c = f X

absorvida permite, entre outras coisas, inferir sobre a concentração do soluto em

determinada solução ou material biológico.

Radiação Eletromagnética - Uma radiação eletromagnética, como a luz visível, pode

ser descrita (Figura 1):

Como uma onda constituída por um componente vetor elétrico e por um

componente vetor magnético

Como uma série de pacotes discretos de energia (fótons)

No primeiro caso, pode-se aplicar à radiação os parâmetros característicos de um

movimento ondulatório (comprimento de onda, frequência e número de ondas).

Figura 1: Representação esquemática de uma radiação eletromagnética. O campo elétrico

e o campo magnético são perpendiculares entre si e ambos oscilam perpendicularmente à

direção de propagação da onda, onde E é o campo elétrico e M o campo magnético.

A energia eletromagnética não precisa de um meio material para se propagar,

sendo definida como uma energia que se move na forma de ondas eletromagnéticas à

velocidade da luz (300.000 km/s). Dado que a velocidade de propagação das ondas

eletromagnéticas é diretamente proporcional à sua frequência e comprimento de onda,

esta pode ser expressa por:

Onde:

c: velocidade da luz (m/s)

f: frequência (ciclos/s ou Hz)

λ: comprimento de onda (m)

(1)

Comprimento de onda (λ) é a distância linear entre dois picos de ondas. As

unidades usadas para o comprimento de onda de uma radiação eletromagnética:

1 nanômetro (nm) = 10-9 m

1 micrômetro (µm) = 10-6 m

1 angstrom (Å) = 10-10 m = 10-8 cm

Frequência (f) é o número de ondas completas (ciclos) que passam por um

determinado ponto por segundo. Unidade: s-1

Número de ondas é o número de ciclos (ondas) por cm. Unidade: cm-1

Teoria de Planck e o espectro eletromagnético - A distribuição das radiações

eletromagnético existentes na natureza pela ordem dos seus comprimentos de onda

ou número de onda constitui o espectro eletromagnético.

Em que h é a constante de Planck = 6,62 x 10-27 erg.s. Combinando (1) e (2),

temos:

Assim a energia de cada fóton é proporcional à frequência e ao número de

onda e inversamente proporcional ao comprimento de onda (Figura 2).

Figura 2: Representação do espectro eletromagnético.

OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA:

Dosagens de espécies químicas mediante a absorção de luz e construção de curva

padrão.

I. DETERMINAÇÃO DO ESPECTRO DE ABSORÇÃO:

1. Objetivo:

Determinar o comprimento de onda ótimo (pico de absorção máximo) para o

corante indicado.

2. Princípio do método:

A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um

procedimento analítico através do qual se determina a concentração de espécies

químicas mediante a absorção de energia radiante (luz).

Fotometria é uma técnica de análise quantitativa que envolve a medida de

intensidade de absorção de luz monocromática de um composto químico em solução.

Serve para identificar o comprimento de onda característico para cada composto e

para quantificação do composto através de: 1) absorção direta e 2) através de método

colorimétrico.

As relações quantitativas nesta técnica são dadas pela combinação de duas

leis (Lei de Lambert-Beer):

Lei de Lambert: quando um feixe de luz passa através de um meio

absorvente (sólido ou líquido), porções iguais deste meio irão absorver luz.

Lei de Beer: a absorção da luz é proporcional à concentração do soluto na

solução.

Então, a intensidade de absorção depende:

• do comprimento de onda escolhido (normalmente usa o λmáx – onde o composto

absorve mais luz);

• do percurso que o feixe de luz percorrerá na solução;

• da concentração do composto nessa solução.

A lei de Lambert-Beer relaciona esses três fatores e estabelece que:

A = ε.l.c

Onde: A = absorvância (definida pela reação seguinte: A = - log It/I0, que por ser uma

razão, não possui unidade (Io é intensidade de luz incidente; It é intensidade de luz

transmitida);

ε = absortividade molar (característico de cada substância), em L.(mol.cm)-1;

l = caminho óptico (percurso da luz monocromática na solução), em cm;

c = concentração da substância em mol/L.

Figura 3: Io é intensidade de luz incidente; It é intensidade de luz transmitida após percorrer o

caminho óptico (l) pela solução da amostra.

Desta forma, mantendo-se o caminho óptico constante, a absorvância torna-se

diretamente proporcional à concentração da substância no respectivo λmáx. A fração

de luz que passa por uma amostra (a transmitância = It/I0) está relacionada

logaritmicamente, e não linearmente, com a concentração da amostra (Figura 3).

Então, estabelecendo a relação:

A = log Io/It log 100/It log 100 – log It A = 2 – log It

Ou seja:

Quando Io = 100% A = 2 – log It

Quando It = 1 A = 2

Quando It = 100% A = 0

Quando It = zero A = ∞

A intensidade da radiação transmitida por uma substância é utilizada para a

sua determinação quantitativa. Essa é a base dos ensaios colorimétricos e

espectrofotométricos. Para descontarmos a absorvância do meio em que o soluto está

dissolvido (solventes como água, tampões, solventes apolares, etc) utiliza-se um

branco (que vai conter tudo que se tem no meio a ser medido a absorvância menos o

soluto).

• Espectrofotômetros – instrumento utilizado para medir a quantidade de luz de

um dado comprimento de onda que é transmitida por uma amostra (Figura 4).

LâmpadaMonocromador

Cubeta com amostra com c moles/litros da espécie a ser analisada

Intensidade da luz

incidente I0

Intensidade da luz

transmitida I

Detector

Figura 4: Principais componentes de um espectrofotômetro. Uma fonte (lâmpada) emite a

luz com uma grande faixa de espectro. Essa luz é selecionada por um monocromador que

transmite em um comprimento de onda específico. A luz monocromática passa através da

amostra em uma cubeta com caminho óptico l. Uma parte da luz é absorvida pela amostra

dependendo da concentração (quanto maior é a concentração da amostra maior será a luz

absorvida). A luz transmitida é medida por um detector.

Cubetas: uma vez selecionado o λ no qual se deseja fazer a análise, essa radiação

específica atravessará um recipiente, com caminho ótico definido, que contem a

amostra (cubeta). As cubetas de vidro são as mais baratas do que as de quartzo e por

isso devem ser usadas sempre que possível. No entanto o vidro absorve radiação na

faixa do UV e tem sua utilização limitada para a faixa de 360 a 800nm, enquanto as

cubetas de quartzo podem ser usadas de 200 a 800nm.

3. Reagentes e preparo das soluções:

Azul de metileno, alaranjado de metila, violeta cristal e vermelho de metila,

soluções 1 mg% (0,001%):

Dissolver 0,001 g do corante em 100 mL de água destilada (usar um balão

volumétrico).

4. Procedimento:

Branco: pipetar 3 mL do solvente (água) utilizado para solubilizar o corante na

cubeta de vidro;

Realizar a leitura no espectrofotômetro (zerar a leitura - branco);

Pipetar 3 mL da solução contendo o corante designado na cubeta de vidro;

Realizar as leituras e anotar as absorvâncias nos comprimentos de onda

relacionados abaixo:

CORANTE:

λ (nm) 400 420 440 470 500 530 570 600 630 660 690

ABS

II. CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO (DETERMINAÇÃO DA LEI DE

LAMBERT-BEER):

1. Objetivo:

Construir uma curva padrão e determinar a concentração de uma amostra de

corante desconhecida.


Podemos utilizar uma solução de concentração conhecida do composto a ser

analisado (ou outra substância de características químicas semelhantes) para

construir um gráfico de absorvância em função da concentração da substância em

questão. Com este gráfico, denominado curva padrão, podemos medir a

quantidade da molécula (soluto) que absorve um determinado comprimento de luz

em amostras de concentração desconhecida, desde que, estas estejam nas

mesmo condições utilizadas para a construção da curva padrão (mesmos

reagentes, mesma temperatura, etc) (Figura 5).

Figura 5: Um exemplo de uma curva padrão. ABS x concentração (mol/L)


Idem a seção anterior.

4. Procedimento:

Identificar 7 tubos de ensaio e colocá-los em uma estante;

Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo;

TUBO B 1 2 3 4 5 D

Corante 1mg% (mL) 0 1 2 3 4 5 0

Amostra (mL) 0 0 0 0 0 0 5

Água destilada (mL) 5 4 3 2 1 0 0

ABS

Concentração (mg%)

Realizar as leituras no espectrofotômetro (tubos 1-5 e D) no comprimento de

onda ideal para o seu corante (volumes e procedimento similares ao efetuado

na prática anterior) e anotar os valores obtidos;

III. REGRESSÃO LINEAR E CONSTRUÇÃO DOS GRÁFICOS

Após a construção da curva padrão temos as absorvâncias para diferentes

diluições de uma solução de concentração conhecida (solução padrão). A absorvância

de uma solução é proporcional à concentração da solução e a distância percorrida

pelo feixe de luz através da solução (Lei de Lambert-Beer). Então, ao se construir o

gráfico com os dados obtidos acima (curva padrão), temos:

C1 = A1

C2 = A2

C3 = A3

...

CN = AN

Teoricamente, A1/C1 = A2/C2 = A3/C3 = AN/CN

No entanto, há dispersão dos pontos na prática, então, se traça a melhor reta, ou se

determina o coeficiente angular médio:

Segundo a equação da reta:

y = ax + b

(sendo a o coeficiente angular da reta e b o coeficiente linear)

Ou seja:

Onde:

A = absorvância;

C = concentração conhecida do padrão

C2

CN

AN

A3

A2

A1

C1 C3

A = . C + b (b = 0) ou = A/ C

Calcula-se o para cada concentração (1 = A1/C1; 2 = A2/C2 ....)

O médio é obtido a partir do somatório de todos os calculados e representa a

inclinação da reta.

Então:

Se = A/ C

C = A/

Pode-se calcular a Cd (desconhecida) com os seguintes dados:

Cd = Ad/ m

REFERÊNCIAS:

PETKOWICZ, C.L.O. Bioquímica. 7. ed. Curitiba: Ed. UFPR, 2007.

CISTERNAS, J.R.; VARGA, J.; MONTE, O. Fundamentos de bioquímica

experimental. 2. ed. São Paulo: Atheneu, 2005.

MASTROENI, M.F.; GERN, R.M.M. Bioquímica: práticas adaptadas. São Paulo:

Atheneu, 2008.

NARDY, M. B.C.; STELLA, M.B.; OLIVEIRA, C. Práticas de laboratório de

bioquímica e biofísica: uma visão integrada. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,

2009.

MÉTODOS QUALITATIVOS DE ANÁLISE DE BIOMOLÉCULAS

INTRODUÇÃO:

Muitas moléculas biológicas são macromoléculas, que são polímeros de alto peso

molecular constituídos pela repetição de unidades menores, chamados monômeros.

Estas macromoléculas se apresentam em grande variedade quanto ao tamanho e

também quanto aos seus monômeros constituintes. Entre as macromoléculas de maior

importância estão as proteínas, formadas por aminoácidos; os polissacarídeos

(carboidratos), polímeros de açúcares simples, como a glicose; e os ácidos nucléicos

(DNA e RNA), constituídos por nucleotídeos. Além destas macromoléculas, moléculas

menores como lipídios, água, sais minerais e vitaminas também possuem um importante

papel na constituição e função celular. Embora moléculas individuais de lipídios sejam

muito menores do que proteínas, ácidos nucléicos e carboidratos, estes também

apresentam unidades monoméricas e muitos podem se associar não covalentemente

formando agregados maiores. A bioquímica preocupa-se com o estudo tanto da

constituição destas biomoléculas como a importância biológica dos processos e

interações destas. A identificação destas biomoléculas, assim como o conhecimento de

suas características e propriedades é um passo essencial para o entendimento destes

processos.


Identificar a presença de diferentes biomoléculas (proteínas, lipídios, ácidos

nucleicos, carboidratos e também aminoácidos) em amostras biológicas através de

reações específicas.

Nesta prática cada grupo irá receber um conjunto com 6 amostras e deverá

identificar para cada amostra se esta é um lipídio, uma proteína, um aminoácido, um

carboidrato ou um ácido nucléico. Para atingir este objetivo serão realizados os testes

qualitativos descritos abaixo.

A. TESTE PARA LIPÍDIOS (TESTE DE SOLUBILIDADE EM ÁGUA):

1. Objetivo:

Identificação da presença de lipídios nas amostras desconhecidas.


Os lipídios são moléculas com grande variedade estrutural e funcional, no

entanto, estas substâncias são caracterizadas pela baixa solubilidade em água e

outros solventes polares, e alta solubilidade em solventes apolares.

3. Procedimento:

Identificar 7 tubos de ensaio conforme a tabela abaixo e colocar em uma

estante;

Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:

Obs. Note que você fará um “controle positivo do teste” usando uma amostra de óleo.

TUBOLipídio

(mL)

Amostra

(mL)Água

Resultados

CP 1,0 - 2,0

A no__ - 1,0 2,0

A no__ - 1,0 2,0

A no__ - 1,0 2,0

A no__ - 1,0 2,0

Legenda: CP (controle positivo); A (amostra).

No teste é considerado positivo para a presença de lipídios quando houver a

formação de duas fases.

B. TESTE PARA PROTEÍNAS (REAÇÃO DO BIURETO)

1. Objetivo:

Identificar a presença de proteínas nas amostras desconhecidas.


Proteínas e peptídeos com no mínimo três aminoácidos, na presença do

“Reativo de Biureto” desenvolvem uma coloração púrpura. Este método é baseado na

reação do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo de Biureto) com proteínas e

peptídeos. O nome do método provém do fato de que a uréia aquecida a 180oC forma

um composto chamado Biureto. Este composto na presença de íons de cobre em meio

fortemente alcalino formará um composto de cor azul.

Figura 14: Reação do Biureto.

Quando o composto contém duas ou mais ligações peptídicas, produz um

complexo cobre-proteína ou cobre-peptídeo de cor púrpura ou azul-violeta, que

absorve luz a 545 nm. A intensidade de cor produzida é proporcional ao número de

ligações peptídicas que estão reagindo, portanto, a quantidade de proteínas presentes

pode ser determinada. Quando a solução possuir elevada concentração de peptídeos

Uréia Biureto Complexo com cobre

(tri-, oligo- e polipeptídeos) a coloração desenvolvida será rosa a avermelhada. A

sensibilidade do método é de 0,5 a 5 mg/mL.


Reagente de Biureto:

Dissolver 1,5 g de CuSO4.5H2O e 6 g de tartarato duplo de sódio e potássio

(C4H4O6.Na.K.4H2O) em 500 mL de água;

Adicionar 300 mL de NaOH 10%;

Adicionar água destilada suficiente para completar o volume final para 1 litro de

solução. Conservar a temperatura ambiente protegido da luz.

Solução padrão de caseína 1%:

1. Dissolver 2 g de caseína em 200 mL de água destilada. Aliquotar em frações

de 10 mL e conservar a –20oC.

4. Procedimento:

Identificar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo e colocar em uma

estante;


Obs. Note que você fará um “branco de reação” usando apenas água e um “controle

positivo do teste” usando caseína (uma proteína encontrada no leite).

TUBOÀgua(mL)

Caseína10 mg/mL

(mL)

Amostra(mL)

Reativo do

Biureto(mL)

Resultados

B 1,0 - - 4,0CP - 1,0 - 4,0

A no__ - - 1,0 4,0A no__ - - 1,0 4,0A no__ - - 1,0 4,0

Legenda: B (branco); CP (controle positivo); A (amostra).

Após a adição do reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em

repouso por 30 minutos;

No teste é considerado positivo se a amostra desenvolver uma

coloração púrpura de forma semelhante ao controle positivo (porém a

intensidade depende da concentração de proteína, como veremos em

práticas posteriores.

O

O

H

H

H

H

OH

OH

O

O

H

H

H

H

OH

OHO

NH3+

O-

R

+ +

CO2 +O

H

H

+ H2O + H+

O

O

N

H

H

H

H

O

O

H

H

H

H

ninidrina

aminoácido

Pigmento púrpura

C. TESTE PARA AMINOÁCIDOS (REAÇÃO DA NIHNIDRINA)

1. Objetivo:

Identificar a presença de aminoácidos nas amostras desconhecidas.


O grupo amino dos aminoácidos é muito resistente à hidrólise, porém pode ser

removido facilmente por oxidação. A ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) é um

poderoso agente oxidante causando a desaminação oxidativa de -aminoácidos

produzindo CO2, NH3 e um aldeído com um carbono a menos que o aminoácido inicial

(Figura 6). Então, a ninhidrina reduzida (hidridantina) reage com NH3 liberado e outra

molécula de ninhidrina, formando um complexo arroxeado que apresenta absorção

máxima a 570 nm. A intensidade de cor, sob condições padrão, é a base para um

teste quantitativo extremamente útil. Outras aminas, além dos -aminoácidos, também

reagem com a ninhidrina dando uma coloração azul, mas sem a liberação de CO2.

Cabe ressaltar que o produto da reação de iminoácidos, como a prolina e

hidroxiprolina, com ninhidrina apresenta coloração amarela ao invés de roxa, cujo

máximo de absorção ocorre em = 440 nm. Neste caso não há liberação de NH3,

porém há produção de teores quantitativos de CO2.

Figura 6: Esquema geral da reação de aminoácidos com ninhidrina.

3. Reagentes e preparo de soluções

Ninhidrina 0,25%

Pesar 0,25 g de ninhidrina e dissolver em acetona até completar o volume de 100 mL.

Alanina 0,1 M

Pesar 0,890 g de L-alanina dissolver em água destilada e avolumar para um balão

volumétrico de 100 mL

Prolina 0,1M

Pesar 2,30 g de L-prolina, dissolver em água destilada e avolumar para um balão de

200 mL.

4. Procedimento:


estante;



positivo do teste” usando o aminoácido alanina e um controle positivo para prolina ou

alanina que resultam em uma coloração amarela.

Tubo Água(mL)

Alanina 0,1 M(mL)

Prolina 0,1 M (mL)

Amostra(mL)

Ninhidrina 0,25% (gotas)

Resultados

B 1,0 - - - 5CP1 - 1,0 - - 5CP2 - - 1,0 - 5

A no__ - - - 1,0 5A no__ - - - 1,0 5

Após a adição da ninhidrina, aquecê-los em banho-maria a 100º C

por 3 minutos;

No teste é considerado positivo para a presença de aminoácidos quando

ocorre a formação de uma coloração rosa (no caso da maioria dos aminoácidos) e

para iminoácidos (prolina) ou cisteína coloração amarela.

D. TESTE PARA CARBOIDRATOS (REAÇÃO DA ANTRONA):

1. Objetivo:

Identificar a presença de carboidratos nas amostras desconhecidas.


O reagente de antrona contém antranol em meio de H2SO4 concentrado. O calor

liberado pela diluição do H2SO4 é suficiente para que a reação ocorra. No caso de

oligo e polissacarídeos, o ácido atua como catalisador de hidrólise convertendo-se a

monossacarídeos (hexoses e pentoses) e também como agente desidratante levando

à formação de hidroximetilfurfural e furfural que, na presença de antranol, dão

produtos de condensação coloridos.

Figura 7: Reação de Antrona.

O hidroximetilfurfural proveniente da desidratação de hexoses produz uma

substância de coloração verde musgo relativamente estável enquanto que o furfural

proveniente da desidratação de pentoses fornece um produto de cor análoga, mas que

em alguns minutos se torna vermelho-amarelada ou rubi.


Reativo Antrona

Pesar 0,2 g de antrona (C14H10O) e dissolver em 100 mL de ácido sulfúrico (H2SO4)

95%.

Glicose 2 mg/mL

Pesar 0,2 g de glicose dissolver em água destilada e avolumar para um balão

volumétrico de 100 mL.

4. Procedimento:


estante;



positivo do teste” usando glicose.

TUBOÁgua

(mL)

Glicose

2 mg/mL

(mL)

Amostra

(mL)

Reagente de

Antrona

(mL)

Resultados

B 0,1 - - 0,5

CP - 0,1 - 0,5

OC C

H

OH

HO

H

OH

OC C

H

OH

H

H

OH

OH

OC C

H

OH

H

H

OH

OH

hidroximetilfurfural antranol

Complexo verde musgo

A no__ - - 0,1 0,5

A no__ - - 0,1 0,5

Legenda: B (branco); CP (controle positivo); A (amostra).

Em banho de gelo, adicionar o reagente de Antrona e deixar por 5 minutos;

Aquecer em banho fervente (100oC) por 10 minutos;

No teste é considerado positivo para a presença de carboidratos quando ocorre

a formação de uma coloração verde.

REFERÊNCIAS:

MASTROENI, M.F.; GERN, R.M.M. Bioquímica: práticas adaptadas. São Paulo: Atheneu, 2008.

DAVID L. NELSON & MICHAEL M. COX. Lehninger. Principles of Biochemistry. 5ª Edition. W.

H. Freeman and Company. New York.

ANÁLISE QUALITATIVA DE AMINOÁCIDOS

1. Objetivo:

Identificar a presença de aminoácidos nas amostras desconhecidas.


O grupo amino dos aminoácidos é muito resistente à hidrólise, porém pode ser

removido facilmente por oxidação. A ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) é um

poderoso agente oxidante causando a desaminação oxidativa de -aminoácidos

produzindo CO2, NH3 e um aldeído com um carbono a menos que o aminoácido inicial

(Figura abaixo). Então, a ninhidrina reduzida (hidridantina) reage com NH3 liberado e

outra molécula de ninhidrina, formando um complexo arroxeado que apresenta

absorção máxima a 570 nm. A intensidade de cor, sob condições padrão, é a base

para um teste quantitativo

extremamente útil. Outras aminas,

além dos -aminoácidos, também

reagem com a ninhidrina dando uma

coloração azul, mas sem a liberação

de CO2.

Cabe ressaltar que o produto da

reação de iminoácidos, como a

prolina e hidroxiprolina, com

ninhidrina apresenta coloração

amarela ao invés de roxa, cujo máximo de absorção ocorre em = 440 nm. Neste

caso não há liberação de NH3, porém há produção de teores quantitativos de CO2.

3. Reagentes e preparo de soluções

Ninhidrina 0,25%

Pesar 0,25 g de ninhidrina e dissolver em acetona até completar o volume de 100 mL.

Alanina 0,1 M

Pesar 0,890 g de L-alanina dissolver em água destilada e avolumar para um balão

volumétrico de 100 mL

Glicina 0,1M

Pesar 2,30 g de L-glicina, dissolver em água destilada e avolumar para um balão de

200 mL.

4. Procedimento:


estante;


Obs. Note que você fará um “branco de reação” usando apenas água

Tubo Amostra/Concentração Volume - mL Ninhidrina 0,25% - (gotas)

1 Água 1,0 5

2 Triptofano 0,1 M 1,0 5

3 Alanina 0,1 M 1,0 5

4 Leucina 0,1 M 1,0 5

5 Aspartame 4 %* 1,0 5

6 Solução protéica 1,0 5

* Aspartame (L-aspartil-fenilalanina metil éster), adoçante 200 vezes mais potente do

que o açúcar. Dissolver o conteúdo de um envelope em 20 mL de água destilada.

Após a adição da ninhidrina, aquecê-los em banho-maria a 100º C

por 3 minutos;

No teste é considerado positivo para a presença de aminoácidos quando

ocorre a formação de uma coloração rosa (no caso da maioria dos aminoácidos) e

para iminoácidos (prolina) ou cisteína coloração amarela.

I. CROMATOGRAFIA EM PAPEL

1. Objetivo:

No caso desta aula prática confirmar a identidade do aminoácido presente na

amostra dada ao grupo. Porém, cabe ressaltar que esta técnica pode ser usada para

separação e detecção de aminoácidos presentes em misturas.


As técnicas de cromatografia em geral são utilizadas para separação e purificação

de várias classes de biomoléculas, porém o tipo de cromatografia e o protocolo variam

com o objetivo e características/tipo de amostra. No entanto, todos os tipos de

cromatografia baseiam-se na interação da amostra a ser analisada (soluto) com duas

entidades físicas distintas: a fase móvel (que pode ser gasosa ou líquida), e a fase

estacionária. A fase móvel move a amostra pela fase estacionária e a separação dos

componentes depende da sua distribuição e interação diferencial com a fase móvel

e/ou com a fase estacionária.

Na presente aula prática, usaremos cromatografia em papel (CP), técnica usada

para separação, detecção e caracterização de aminoácidos e que constitui uma das

técnicas cromatográficas mais simples e que requer menos instrumentos para sua

realização, porém é a que apresenta as maiores restrições para sua utilização em

termos analíticos.

Para iniciar o processo a(s) amostra(s) contendo o(s) aminoácido(s) é(são)

aplicada(s) em uma fase estacionária (no caso, o papel) na parte inferior marcada por

uma linha à lápis (origem). Os pontos de aplicação de cada amostra são secos e

aplica-se novamente a respectiva amostra a cada ponto várias vezes, secando sempre

o papel antes da próxima aplicação (Figura 3). Finalmente, o papel com as amostras

secas é posto em uma câmara tendo a extremidade inferior em contato com o solvente

(que pode ser uma mistura de solventes e água), porém sem permitir que os pontos

onde as amostras foram aplicadas tenha contato direto ou seja submerso pelo

solvente contido no recipiente. Assim, o solvente se difunde pelo papel por

capilaridade, os componentes da amostra se distribuem pelas fases móvel (solvente) e

estacionária (papel) de acordo com sua solubilidade (Figura 11).

O papel é composto por moléculas de celulose que possuem uma forte

afinidade pela água presente na mistura de solvente, mas muito pouca afinidade pela

fase orgânica, atuando como suporte inerte contendo a fase estacionária aquosa

(polar). A medida que o solvente contendo o soluto flui através do papel, uma partição

deste composto ocorre entre a fase móvel orgânica (pouco polar) e a fase estacionária

aquosa. Desta forma, parte do soluto deixa o papel e entra na fase móvel.

Quando a fase móvel alcança uma seção do papel que não contém soluto, o

fenômeno de partição ocorre novamente, só que agora o soluto é transferido da fase

móvel para a fase estacionária. Com o fluxo contínuo de solvente, o efeito desta

partição entre as fases móvel e estacionária possibilita a transferência do soluto do

seu ponto de aplicação no papel, para outro ponto localizado a alguma distância do

local de aplicação no sentido do fluxo de solvente.

Como os aminoácidos diferem no grupamento R, possuem diferentes

solubilidades, propriedade usada para sua separação no presente método,

apresentando portanto diferentes taxas de migração (Rf). A detecção (Figura 3) se dá

através de agentes capazes de revelar os aminoácidos em geral (como ninhidrina) ou

específicos para determinados aminoácidos (como Sakaguchi para arginina, Pauly

para histidina e Nitroprussiato para cisteína).


Solvente de Partridge (n-butanol/ácido acético glacial/água 4:1:1)

Misturar 400 mL de n-butanol com 100 mL de ácido acético glacial e 100 mL de água

Ninhidrina 0,25%

Pesar 0,25g de ninhidrina e dissolver em acetona até completar o volume de 100 mL.

4. Procedimento:

Traçar linhas (bem leves) de lápis, a 2 cm da borda inferior e 1,0 cm da borda

superior do papel de filtro. Evitar tocar no papel durante toda a operação. As

amostras devem ser aplicadas (com tubos capilares) nos pontos numerados de

tal modo que a mancha formada sobre o papel seja a menor possível.

Aplique a amostra em um ponto do papel conforme o desenho:

P1 P2 P3 M

2,0 cm

Seque as amostras (pode ser usado um secador).

Front

Colocar o papel em uma cuba apropriada contendo o solvente de Partridge.

Tome o cuidado de não tocá-lo com os dedos e não encostar na parede da

cuba.

Fechar a cuba. Deixar o solvente migrar até 1,0 cm da borda superior.

Retirar o papel. Deixar secar à temperatura ambiente.

Pulverizar a tira de papel com a solução reveladora de Ninhidrina e levar à

estufa (60°C) por 15 minutos.

Após revelação, calcular o RF dos padrões e da mistura, para sua

identificação.

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM UMA

AMOSTRA BIOLÓGICA PELO MÉTODO DO BIURETO

Métodos de determinação da concentração de proteínas

A determinação da concentração de proteínas em materiais biológicos é necessária

em diversas situações, como na purificação de uma determinada proteína a partir de um

extrato de material biológico para o estudo de suas propriedades e funções, ou na

avaliação dos níveis de certas proteínas que têm suas quantidades alteradas em

determinadas situações patológicas.

Existem diversos métodos para a determinação do conteúdo total de proteínas em

uma amostra. Suspensões puras de proteínas apresentam absorção de luz de

comprimento de onda abaixo de 230 nm com absorção máxima a 220 nm,

correspondente principalmente às ligações peptídicas. Entretanto, já que outros

compostos como ácidos carboxílicos, íons de tampão, alcoóis, bicarbonato e

substâncias aromáticas também absorvem nesta região, os resultados obtidos devem

ser interpretados com cuidado. As proteínas também absorvem luz ultravioleta em

comprimentos de onda próximos a 280 nm que correspondem a presença de tirosina

(275 nm), triptofano (280 nm) e fenilalanina (260 nm) nas moléculas. Como o teor destes

aminoácidos varia entre diferentes proteínas, a absorção a 280 nm será particular de

cada grupo de proteínas. A quantificação de proteínas através da absorção a 280 nm é

uma técnica rápida e eficiente, entretanto ela está sujeita a interferências,

particularmente de ácidos nucléicos que exibem absorção máxima a 260 nm. Outros

métodos bastante comuns baseiam-se no conteúdo de nitrogênio de proteínas (todas as

proteínas possuem um conteúdo médio de nitrogênio de 16%), como o “método de

Kjeldahl”, ou na reação de sulfato de cobre em meio alcalino com proteínas, que fornece

um produto de coloração púrpura, como no “método do Biureto”. Também bastante

utilizado, o “método de Folin-Lowry” apresenta modificações ao método do Biureto.

Neste método, após a realização do método do Biureto é adicionado à reação o

reagente de Ciocalteau (ácido fosfotúngstico fosfomobilídico) que é reduzido pela

tirosina presente nas moléculas de proteínas. Nesta reação a coloração desenvolvida é

mais muito mais intensa, tornando o método 100 vezes mais sensível do que o método

do Biureto, sendo este bastante útil para amostras muito diluídas.

Todos os métodos possuem vantagens e limitações, portanto a escolha deve

ser cautelosa e levar em consideração os diversos fatores relativos aquela analise,

como, por exemplo, as características da amostra e a disponibilidade de recursos

como equipamentos e reagentes.

Nesta prática será realizado o método do Biureto, que será descrito em

maiores detalhes a seguir.


Construir uma curva padrão de proteínas e determinar a concentração de

proteínas totais em uma amostra biológica desconhecida pelo método do Biureto.

I. CONSTRUÇÃO DE UMA CURVA PADRÃO E DETERMINAÇÃO DA

CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM UMA AMOSTRA DESCONHECIDA:

1. Objetivo:

Determinação da concentração de proteínas através da formação de produtos com

coloração que poderão ser quantificados por espectrofotometria.


Este método é baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo de

Biureto) com proteínas e peptídeos (no mínimo tripeptídeos). Maiores detalhes podem

ser encontrados no roteiro da aula “Análise Qualitativa de Biomoléculas”.


Reagente de Biureto:

Dissolver 1,5 g de CuSO4.5H2O e 6 g de tartarato duplo de sódio e potássio

(C4H4O6.Na.K.4H2O) em 500 mL de água;

Adicionar 300 mL de NaOH 10%;

Adicionar água destilada suficiente para completar o volume final para 1 litro de

solução. Conservar a temperatura ambiente protegido da luz.

Solução padrão de caseína 1% (10 mg/mL):

2. Pesar 1g de caseína, dissolver com aproximadamente 70mL de água destilada

e depois adicionar hidróxido de sódio 1M até a solução tornar-se límpida e

completar o volume para 100mL. Aliquotar em frações de 10 mL e conservar a

–20oC.

4. Procedimento:

A) Construção da curva padrão (ou curva de calibração) e determinação

da concentração de proteínas em uma amostra biológica de concentração

desconhecida

Identificar 7 tubos de ensaio e colocar em uma estante;

Adicionar os reagentes conforme a tabela seguinte:

Tubo (No)H2O(mL)

Caseína 10 mg/mL

(mL)

Amostra Reativo de Biureto

(mL)

Abs.540 nm

B 1,0 0 - 4,01 0,8 0,2 - 4,02 0,6 0,4 - 4,04 0,4 0,6 - 4,05 0,2 0,8 - 4,06 - 1,0 - 4,07 - - 1,0 4,0

Após a adição do reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em

repouso por 30 minutos (a coloração púrpura formada é indicativa da presença

de proteínas);

Neste momento, inicie a realização do protocolo seguinte (abaixo) para

a determinação da concentração de proteínas na amostra de concentração

desconhecida que seu grupo recebeu no inicio desta aula;

REFERÊNCIAS:

PETKOWICZ, C.L.O. Bioquímica. 7. ed. Curitiba: Ed. UFPR, 2007.

NARDY, M. B.C.; STELLA, M.B.; OLIVEIRA, C. Práticas de laboratório de bioquímica e

biofísica: uma visão integrada. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2009.

DAVID L. NELSON & MICHAEL M. COX. Lehninger. Principles of Biochemistry. 5ª

Edition. W. H. Freeman and Company. New York.

CINÉTICA E NZIMÁTICA


Determinação da atividade enzimática da invertase de levedura.

I. CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO DE AÇUCAR REDUTOR:

1. Objetivo:

A construção da curva padrão de açúcar redutor (glicose) servirá para

determinar a concentração de glicose produzida pela reação da invertase.

2. Princípio do experimento:

As reações químicas conduzidas pelos organismos vivos são, na sua grande

maioria, catalisadas enzimaticamente, tornando a velocidade das mesmas compatíveis

com as exigências metabólicas.

A enzima escolhida para este estudo é justamente a invertase da levedura

que catalisa a hidrólise da sacarose para produzir glicose e frutose:

C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6

sacarose água glicose frutose

Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (µg) de açúcar redutor

formado, por um cálculo estequiométrico simples, pode-se determinar a quantidade

correspondente (µg) sacarose hidrolisada.

Podemos determinar a afinidade de determinada enzima pelo substrato da

reação que catalisa utilizando um valor KM, que é a concentração de substrato

necessária para se atingir metade da velocidade máxima da reação catalisada pela

enzima em questão. Um modelo da reação onde a enzima interage com o substrato

está fornecido abaixo:

E + S ES E + P

onde E é a enzima, S é o substrato, ES é o complexo enzima-substrato e P é o

produto da reação. Observe que a enzima é devolvida ao meio na mesma proporção

em que foi utilizada na reação à esquerda.

Michaelis e Menten, com essas considerações, desenvolveram a expressão

de velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e desta forma puderam

descrever o comportamento de diversas enzimas.

V = Vmáx * [S] KM + [S]

onde [S] é a concentração do substrato e Vmáx é a velocidade máxima da

reação, em mol (de produto formado) por unidade de tempo.

Assim a levedura (Saccharomyces cerevisiae), por intermédio da

"invertase" hidrolisa a sacarose resultando numa mistura equimolecular de glicose e

frutose, açúcares esses que são absorvidos pela célula. A membrana plasmática é

impermeável à sacarose, e a levedura acaba excretando a invertase (sendo, pois, uma

exoenzima) para a hidrólise ocorrer fora da célula de levedura.

Hidrólise da sacarose catalisada pela invertase. Tanto a glicose quanto a frutose são açúcares

redutores.

No presente experimento a invertase será obtida de levedura de

panificação (fermento Fleischmann) e adicionada à sacarose (açúcar não redutor),

cuja hidrólise resulta na formação de açúcares redutores (glicose e frutose) que serão

estimados pela reação de Somogyi-Nelson.

Para tal se colocará a enzima frente à diferentes concentrações de

substrato (sacarose), resultando em diferentes velocidades de reação enzimática,

permitindo, mediante um tratamento matemático adequado, determinar graficamente

os valores de Km e Vm para a reação enzimática da levedura.

II. CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO DE AÇUCAR REDUTOR:

3. Objetivo:

A construção da curva padrão de açúcar redutor (glicose) servirá para

determinar a concentração de glicose produzida pela reação da invertase.

O

CH2OH

H

OH

H

H

OH

H

OH

H

O

H

OHH

OH

CH2

CH2OH

HOHO

SACAROSE(NÃO REDUTOR)

O

CH2OH

H

OH

H

H

OH

OH

H

OH

HHO

H

OHH

OH

CH2

CH2OH

HO

H

GLICOSE

+

FRUTOSE

REDUTORES

4. Princípio do experimento:

A invertase é uma enzima hidrolítica que catalisa a hidrólise da sacarose, dando

como produto a glicose e a frutose. A sacarose é um dissacarídeo não-redutor assim

para cada molécula de sacarose hidrolisada, duas moléculas redutoras são formadas.

Figura 19: Esquema geral da reação da invertase.

O nome da invertase foi dado a esta enzima porque ao hidrolisar a sacarose

liberando glicose e frutose, ocorre uma inversão do sinal da rotação óptica de positivo

para negativo sendo denominado açúcar invertido. A sacarose tem um desvio de

+66,5, a glicose de +52,7 enquanto o desvio da frutose é de -92, portanto após a

hidrólise, a rotação óptica que era de 66,5 passa a ser -39,3.

As propriedades químicas da sacarose e do açúcar invertido são bem

diferentes quanto ao poder edulcorante, solubilidade, poder redutor.

As enzimas que catalisam a hidrólise da sacarose são largamente distribuídas.

As mais conhecidas são a invertase de leveduras e a sacarase intestinal.

Sendo um açúcar não redutor, pode-se medir a atividade hidrolítica da enzima pelo

aparecimento de açúcar redutor (glicose mais frutose) após a incubação com a

enzima. Para determinar a quantidade de açúcar redutor formado, basta utilizar uma

curva-padrão de açúcar redutor elaborado nas mesmas condições.


Reativo de Somoggy

Dissolver 28 g de fosfato dissódico anidro (Na2HPO4) e 40 g de tartarato duplo

de sódio e potássio (C4H4O6NaK) em 500 mL de água destilada; adicionar 100 mL

de hidróxido de sódio (NaOH) 1 M, dissolver 8 g de sulfato de cobre cristalizado em

80 mL de água destilada e adicionar lentamente com agitação. Após, acrescentar

180 g de sulfato de sódio anidro (Na2SO4), homogeneizar e completar o volume

para 1000 mL em um balão volumétrico. Deixar em repouso por 2 dias e filtrar se

necessário. Manter em frasco âmbar.

Reativo de Nelson

Dissolver 50 g de molibdato de amônio [(NH4) MoO4] em 800 mL de água

destilada; adicionar 52 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado lentamente com

agitação. Após, dissolver 3 g de arseniato de sódio (Na2HAsO4.7H2O) em 50 mL de

água destilada, adicionar à solução acima e homogeneizar. Completar o volume

para 1000 mL em um balão volumétrico. Deixar em repouso por 2 dias, manter em

frasco âmbar.

Glicose 0,02% (0,2 mg/mL)

Pesar 0,02 g de glicose, dissolver em água destilada e completar o volume

para 100 mL em um balão volumétrico.

6. Procedimento:

Identificar 6 tubos de ensaio, colocar em uma estante e adicionar os reagentes

conforme a tabela abaixo:

Tubo

s

H2O

(mL)

Glicose

0,2

mg/mL

Reativo

de

Somogg

Agitar bem e

levar ao

banho-maria

fervente

(100C) por

10 min

Reativo

de

Nelson

H2O

(mL)

Glicose

(mg)

ABS

(530

nm)B 1,0 0 1,0 1,0 7,0

1 0,8 0,2 1,0 1,0 7,0

2 0,6 0,4 1,0 1,0 7,0

3 0,4 0,6 1,0 1,0 7,0

4 0,2 0,8 1,0 1,0 7,0

5 0 1,0 1,0 1,0 7,0

Esta curva servirá para determinar a concentração do açúcar redutor produzido

a partir da sacarose por ação da invertase;

Com os dados obtidos construir a curva-padrão (absorvância x concentração

de glicose).

III. CONSTRUÇÃO DA CURVA DE MICHAELIS-MENTEN E CÁLCULO DO

GRÁFICO DE LINEWEAVER-BURK:

1. Objetivo:

Determinação dos parâmetros cinéticos Km (constante de Michaelis) e Vmáx

(velocidade máxima) através da construção dos gráficos de Michaelis-Menten e de

Lineweaver-Burk.

.


Os mesmos utilizados nos experimentos anteriores.

3. Procedimento:

Adicionar os reagentes em tubos de ensaio conforme a tabela abaixo:

Tampão*

(mL)

Sacarose

0,4 M

(mL)

Enzima

(mL) Agitar

bem e

levar ao

banho-

maria

por 15

min.

A 37oC

Reativo de

Somoggy

(mL)

Agitar bem

e levar ao

banho-

maria

fervente

(100C) por

10 min

Reativo de

Nelson

(mL)

H2O

(mL)

Absorvância

a 530 nm

B1 2,3 0,2 - 1,0 1,0 5,5

1 1,8 0,2 0,5 1,0 1,0 5,5

B2 2,1 0,4 - 1,0 1,0 5,5

2 1,6 0,4 0,5 1,0 1,0 5,5

B3 1,7 0,8 - 1,0 1,0 5,5

3 1,2 0,8 0,5 1,0 1,0 5,5

B4 0,9 1,6 - 1,0 1,0 5,5

4 0,4 1,6 0,5 1,0 1,0 5,5

B5 0,5 2,0 - 1,0 1,0 5,5

5 0 2,0 0,5 1,0 1,0 5,5

Construir os gráficos: velocidade x concentração de sacarose (Gráfico de

Michaelis-Menten) e 1/V x 1/S (Gráfico de Lineweaver-Burk ou duplo-recíproco).

1. Agora com seus dados experimentais complete a tabela abaixo:

tubo [sacarose] (M) Atividade

(g/mL/min)

1

2

3

4

5

2 Construa o gráfico de Michaelis-Menten (curva de sbstrato) em papel milimetrado.

3. Calcule os inversos e complete a tabela abaixo

tubo 1/[sacarose] 1/atividade

1

2

3

4

5

4. Construa o gráfico de Lineweaver-Burk (duplo recíproco) em papel milimetrado.

5. Calcule a constante de Michaelis e a velocidade máxima da enzima

ANÁLISE QUALITATIVA DE CARBOIDRATOS

Propriedades Químicas dos carboidratos

Diferentemente dos aminoácidos que apresentam reações específicas

baseadas principalmente na natureza química de seu radical, os carboidratos

apresentam estruturas muito parecidas entre si o que os torna quase impossíveis de

identificá-los.

Neste caso o que se faz é caracterizar grupos de carboidratos utilizando suas

propriedades químicas comuns.

As reações mais utilizadas na prática estão baseadas em 2 dessas propriedades:

1) Desidratação de carboidratos por ácidos fortes

OC C

H

OH

HO

H

OH

OC C

H

OH

H

H

OH

OH

OC C

H

OH

H

H

OH

OH

OHOH2C

H

H

CH2OHOH H

OHH

OHOH2C

COH

HH

OH

OH

Hexoses e pentoses colocadas nestas condições são desidratadas,

respectivamente a hidroximetilfurfural e furfural; estes compostos são capazes de se

condensar com substâncias fenólicas, com aminas aromáticas, tiocompostos, uréia.

Os complexos formados são, algumas vezes, coloridos e utilizados para a

caracterização de certos grupos glicídicos. Neste caso, situam-se:

A) Reação de antrona

Teste geral de glicídios

O reagente de antrona contém antranol em meio de H2SO4 concentrado. O

calor liberado pela diluição do H2SO4 é suficiente para que a reação ocorra. No caso

de oligo e polissacarídeos, o ácido atua como catalisador de hidrólise convertendo-se

a monossacarídeos (hexoses e pentoses) e também como agente desidratante

levando a formação de hidroximetilfurfural e furfural que, em presença de antranol, dão

produtos de condensação coloridos.

O hidroximetilfurfural proveniente da desidratação de hexoses

produz uma substância de coloração verde azulada realtivamente estável enquanto

que o furfural proveniente da desidratação de pentoses fornece um produto de cor

análoga, mas que em alguns inutos se torna vermelho-amarelada ou rubi.

O teste de antrona é muito sensível e pode ser usado, quando modificado, para a

quantificação de glicídios.

B) Reação de Seliwanoff

Teste de diferenciação entre aldoses e cetose

A reação é feita com resorcinol em meio de HCl à quente. As cetohexoses dão

um produto de coloração vermelha que se desenvolve rapidamente; as aldohexoses

correspondentes reagem mais lentamente. Durante o tempo em que cetohexoses são

desidratadas e reagem com o resorcinol fornecendo o produto, as aldohexoses

fornecem apenas um produto levemente rosa.

+

hidroximetilfurfural antranol

Complexo verde azulado

COH

H

C H H

OH

COH

H

C

OHC

H

OH

OH

COH

HH

CH3

OHHO

C) Reação de Bial

Teste para a identificação de pentoses e certos ácidos urônicos (galacturônico,

glicurônico e outros) que se decompõem durante o aquecimento em presença de H+,

formando pentoses.

O reagente consiste de orcinol em meio de HCl concentrado e em presença de

íons Fe+3. O furfural proveniente da desidratação de pentoses quando aquecido em

presença do reagente de Bial fornece uma cor verde. O hidroximetilfurfural (hexoses)

reage formando um produto diferente que oscila entre amarelo e marrom.

O teste de Bial foi modificado a permitir quantificar pentoses, trioses e o ácio 5-

cetoaldônico. As cetoheptoses fornecem produtos de coloração púrpura, as

cetohexoses e metilpentoses formam inicialmente um produto de cor laranja que em

repouso, posteriormente, precipita apresentando uma cor verde.

2) Poder redutor

Os açucares contêm grupos aldeídos e cetonas capazes de reduzir sais de metais

pesados; desses os sais mais usados são dos de Cu+2.

O princípio fundamental de todos os procedimentos analíticos que utilizam Cu+2 é sua

dissolução em meio alcalino em presença de ácidos orgânicos (como ácido c´trico e o

ácido tartárico) capazes de formarem complexos. Também podem ser empregados

outros ácidos orgânicos como EDTA, ácido láctico, ácido trihidroxiglutárico ou ácido

sacárico.

+

cetohexosehidroximetilfurfural

H2O

resorcinol

Produto de coloração vermelha

2H2O

Produto de coloração verde

pentose furfural orcinol

+

A reação de formação do complexo ocorre em geral em meio fortemente

alcalino e isto promove profundas modificações na estrutura do açúcar. Os açucares

apresentam um poder redutor diferente sobre o íon Cu+2. Isso significa que dois tipos

de hexoses em uma mesma concentração fornecem quantidades diferentes de óxido

cuproso (produto final da reação). A quantidade de íons cobre reduzida pelos

diferentes glicídios é função do pH, da temperatura, da concentração e dos tipos de

glicídios e íons orgânicos complexantes.

Há diversos métodos para a determinação de teor de Cu2O, os mais utilizados

para a determinação em material biológico, são os colorimétricos que utilizam o Cu2O

dissolvido em excesso de reagentes como fosfomolibdato, fosfotungstato ou arsênio-

molibdato, formando um complexo azul. Dentre os testes baseados em poder redutor

de glicídio destacam-se:

A) Teste de Benedict

Teste geral de glicídio redutores.

O reagente consiste de uma única solução onde estão presentes íons Cu+2, citrato

e carbonato de sódio. A reação é complexa e influenciada por uma série de fatores

podendo ser esquematizada por:

B) Teste de Barfoed modificado

Teste de diferenciação entre monossacarídeos e dissacarídeos redutores

A reação é feita usando-se acetato de cobre em meio de ácido láctico

(reagente de Barfoed) a quente e por 30 segundos; o produto formado nesta primeira

etapa é posteriormente revelado com solução de fosfomolibdato. Só monossacarídeos

formam produto de cor azul. A adição de ácido fosfomolíbdico leva a formação de um

complexo corado de azul intenso.

OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA

Identificar os carboidratos presentes em diferentes amostras dadas. Determinar

algumas de suas propriedades químicas.

Cu+2 + glicídio Composto oxidado + Cu2O (precipitadovermelho)

Cu+2 + glicídio Composto oxidado + Cu2O

H3PO4 . 12 MoO3

Complexo de cor azul

I. TESTE DE BENEDICT:

1. Objetivo:

Identificar se amostra apresenta açúcar redutor (monossacarídeos e

dissacarídeos) em sua composição.


Reativo BenedictPesar 17,3 g de sulfato de cobre (CuSO4 . 5H2O), 173 g de citrato de sódio (Na3C6H5O7), 100

g de carbonato de sódio anidro (Na2CO3), dissolver em água destilada e completar o volume

para 1000 mL em um balão volumétrico.

3. Procedimento:

Adicionar os reagentes de acordo com a tabela abaixo:

Obs. Note que você irá fazer um controle positivo do teste usando uma solução de

glicose.

Tubos H2O (mL) Amostras (mL) Reagente de

Benedict (mL)

Resultados

B 0,2 ----- 1,0

CP ----- 0,2 1,0

CN ----- 0,2 1,0

A ----- 0,2 1,0

Legenda: B (Branco); CP (Controle Positivo - açúcar redutor); CN (Controle Negativo

– açúcar não redutor) e A (Amostra).

Aquecer os tubos em banho fervente (100oC) por 5 minutos;

O teste é positivo se houver o desenvolvimento da coloração vermelha

tijolo.

II. TESTE DE BARFOED MODIFICADO:

1. Objetivos:

Diferenciar monossacarídeos redutores de dissacarídeos redutores.


Reativo Barfoed Modificado:

Dissolver 48 g de acetato cúprico ((CH3COO)2 Cu.H2O) em 900 mL de água destilada

quente, adicionar lentamente 50 mL de ácido lático (C3H6O3) 8,5%. Resfriar e completar o

volume para 1000 mL em um balão volumétrico. Filtrar se necessário.

Reagente Fosfomolídico:

Dissolver 150 g de ácido molíbdico (H2MoO4) e 75 g de carbonato de sódio anidro

(Na2CO3) em 500 mL de água destilada quente com agitação. Aquecer até ebulição. Filtrar.

Adicionar 300 mL de ácido fosfórico (H3PO4) 85%. Completar o volume para 1000 mL em um

balão volumétrico.

3. Procedimento:


Tubos H2O

(mL)

Amostras

(mL)

Reagente de

Barfoed

(mL)

Aquecer os

tubos em

banho

fervente

(100oC) por

30 segundos

Reagente

Fosfomobdílico

(mL)

Resultados

B 0,2 ----- 1,0 0,5

CP ----- 0,2 1,0 0,5

CN ----- 0,2 1,0 0,5

A ----- 0,2 1,0 0,5

Legenda: B (Branco); CP (Controle Positivo – monossacarídeo redutor); CN (Controle negativo

– dissacarídeo redutor); A (Amostra).

O teste é positivo se houver o desenvolvimento da coloração azul escuro.

III. TESTE DO IODO

1. Objetivos:

O objetivo do teste é permitir que o aluno seja capaz de identificar uma amostra

contendo o polissacarídeo amido.



Lugol (KI -I2)Pesar 5 g de iodo (I2) e 10 g de iodeto de potássio (KI), dissolver em água destilada

e completar o volume para 1000 mL em um balão volumétrico.

4. Procedimento:


Tubos H2O

(mL)

Amostras

(mL)

LUGOL

(gotas)

Resultados

B 2,0 ----- 2

CP ----- 2,0 2

CN ----- 2,0 2

A ----- 2,0 2

Legenda: B (Branco); CP (Controle Positivo - amido); CN (Controle negativo –

glicose); A (Amostra).

Aguardar 30 segundos à temperatura ambiente;

O teste é positivo se houver o desenvolvimento da coloração verde

azulada.

REFERÊNCIAS:



ANÁLISE QUANTITATIVA DE COLESTEROL

( Reação de Liebermann-Buchard)

1. Objetivos:

Determinar concentração de colesterol em uma amostra biológica

desconhecida.


Os esteróides, incluindo o colesterol, apresentam em sua estrutura o

ciclopentanoperidrofenantreno que é representado por

quatro anéis fundidos (A, B, C, D). O colesterol, que é um

álcool esteróide ou esterol, apresenta uma função alcoólica

na posição C3, uma insaturação entre os carbonos C5 e C6

e uma cadeia alquila em C17. Embora as propriedades de solubilidade sejam análogas

as dos lipídios, esteróides como colesterol, possuem estrutura e propriedades químicas

diferentes, podendo ser evidenciados através de reações de coloração específicas:

O ácido sulfúrico concentrado causa a desidratação da molécula de colesterol

no grupo hidroxila C3 , fornecendo como produto o 3,5-colestadieno. O derivado

desidratado na presença do reativo cromogênico produz o ácido bis-3,5-colestadienil-

mono-sulfônico de coloração verde.

3. Procedimento:

I. Construção de uma curva padrão e determinação da concentração de

colesterol em uma amostra desconhecida:

Em tubos de ensaios, adicione os reagentes seguindo a ordem da tabela:

TUBO Padrão de colesterol

(0,3 mg/ mL)(mL)

Amostra(mL)

Clorofórmio (mL)

Anidrido Acético

(mL)

H2SO4

Conc(mL)

Colesterol(mg)

ABS

Branco - - 5,0 1,0 0,1

1 0,1 - 4,9 1,0 0,1

2 0,2 - 4,8 1,0 0,1

3 0,4 - 4,6 1,0 0,1

4 0,8 - 4,2 1,0 0,1

5 1,0 - 4,0 1,0 0,1

A 1,0 4,0 1,0 0,1

Misturar e deixar em repouso por 10 minutos no escuro (em caso de presença

de colesterol desenvolve-se uma coloração verde);

Realizar a leitura em espectrofotômetro a 650 nm.

REFERÊNCIAS:



ANÁLISE QUALITATIVA DE ÁCIDOS NUCLEICOS

(Extração e caracterização de DNA de cebola)

INTRODUÇÃO:

Os ácidos nucleicos (DNA e RNA) são macromoléculas formadas por subunidades

repetidas chamadas nucleotídeos, os quais são unidos através de ligações fosfodiéster,

formando uma fita de comprimento variado (Figura 1). Os nucleotídeos, que possuem as

características de serem estáveis em uma ampla

faixa de pH, são constituídos por três estruturas:

• uma base nitrogenada: existem duas classes

de bases nitrogenadas: as purinas e as

pirimidinas. As principais purinas são guanina e

adenina; e as principais pirimidinas são citosina,

uracila e timina. Uracila é, geralmente,

encontrada só em RNA e timina, só em DNA;

• um açúcar do tipo pentose: as pentoses podem ser de dois tipos: ribose, presente

apenas nas moléculas de RNA e desoxirribose, presente apenas nas moléculas de

DNA;

• um grupo fosfato: PO43-.

Figura 1. Estrutura do DNA.

O DNA é relativamente estável em soluções aquosas próximas do pH neutro, o que o

torna adequado para o armazenamento da informação genética ao longo do tempo. Ao

contrario, o RNA é mais instável (é mais suscetível à hidrólise). A separação das fitas de

DNA pode ser estudada elevando-se a temperatura de uma solução. Em temperaturas

relativamente baixas, poucos pares de bases são rompidos. Em temperaturas elevadas,

as fitas de DNA se separam e adquirem uma conformação em espiral aleatória. A esse

fenômeno dá-se o nome de desnaturação.


Realizar a extração e a caracterização de DNA de uma amostra biológica.

EXTRAÇÃO DE DNA:

1. Objetivo:

Extrair DNA de uma amostra biológica (cebola).


Os métodos utilizados para a extração e dosagem do DNA celular nuclear de

eucariontes implicam no rompimento das membranas citoplasmática e nuclear. Neste

experimento, o rompimento das membranas plasmática e nuclear será realizado com o

tratamento de um detergente comum. Os tratamentos com detergentes, iônicos ou

não, são largamente utilizados na solubilização de proteínas e lipídeos de membrana.

Nestes processos de solubilização por detergentes, são formadas micelas, que

consistem de proteínas, lipídios e detergentes. O tratamento das células com uma

concentração relativamente alta de detergente resulta no rompimento das membranas

celulares e subsequente liberação das nucleoproteínas. A atividade da enzima

digestiva (DNAase) será inibida pela ação do EDTA em meio alcalino − que altera pH

e quela os íons divalentes necessários à ação da DNAase. A solução salina (NaCl) no

início da experiência diminui a agregação proteica e minimiza a formação de

precipitados (nucleoproteínas). A adição de etanol sobre a fase aquosa, contendo os

ácidos nucleicos dissolvidos, resultará na precipitação destes, uma vez que o etanol

diminui a constante dielétrica da água, promovendo uma menor solubilização das

moléculas de DNA.


Amostra: cebola

Água destilada

Solução salina concentrada

Etanol absoluto 95%

Detergente (solução de lise – SDS 0,1 % + EDTA 25 mM, pH 8,0)

Reativo de difenilamina

4. Procedimento:

Descascar 1/2 cebola de tamanho médio;

Ralar a cebola em ralador comum ou processador de alimentos (é importante que

não haja grandes pedaços de cebola);

Homogeneizar em água destilada (20 mL aproximadamente);

Acrescentar ao homogeneizado, ½ colher de cloreto de sódio e 3 mL de

detergente;

Misturar evitando a formação de espuma;

Filtrar a suspensão em um funil com filtro de papel, perfex, algodão ou gase,

recolhendo o filtrado em uma proveta;

Adicionar ao filtrado 20 mL de etanol 95% com auxílio do bastão de vidro. Não

misturar! Observar na interfase a formação de um material insolúvel filamentoso

(Figura 2).

Com auxílio do bastão de vidro, transferir o material insolúvel para um recipiente

contento 1 mL de H2O destilada.

COH

CH2

C

C

C

OH

OH

OH

H

H

H

H

COH

CH2

CH2

C

C

O

OHH

H

NH

Figura 2: Formação do material insolúvel filamentoso (novelo) após adição de

álcool à solução.

REAÇÃO DE DIFENILAMINA:

1. Objetivo:

Detectar a presença de desoxirribose.


Em meio ácido, as desoxirriboses livres de bases nitrogenadas geram

grupamentos aldeídicos livres, que por sua vez sofrem desidratação, originando como

produto aldeídos -hidroxilevulínicos (Figura 3). Estes aldeídos formados reagem com

a difenilamina, gerando um produto de coloração azul (com absorvância máxima em

595 nm). Assim a reação da difenilamina é útil para caracterizar, indiretamente, a

presença de DNA.

Figura 3: Reação da desoxirribose com difenilamina em meio ácido.

Ácido Nucleico

Antes Depois

2-desoxirribose

+ H+

Aldeído -hidroxilevulínico

H2O

+

Difenilamina

Complexo de cor azul


Reativo de difenilamina:

Pesar 1 g de difenilamina, dissolver em 100 mL de ácido acético P.A e adicionar 2,75

mL ácido sulfúrico P.A.

4. Procedimento:

Identificar 2 tubos de ensaio e colocar em uma estante;

Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo.

TUBO Amostra Volume de (mL) Reativo de

Difenilamina (mL)

HCl 37%

(GOTAS)

B Água 1,0 1 2

D DNA de cebola 1,0 1 2

Legenda: B (branco) e D (DNA).

Misturar e manter os tubos em banho fervente (100oC) por 10 min;

Retirar os tubos do banho-maria e resfriá-los;

Identificar a formação de uma coloração azul na tubo contendo a amostra de

DNA (realizar a leitura no espectrofotômetro a 595 nm no caso de quantificação).

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Apostila de Quimica