Approccio olistico o decostruttivo (Rev 1 gennaio 2005) · Validazione dei metodi e incertezza di misura ... incertezza di diluizione ecc) – (categoria B), e ... La distribuzione

ARPA Emilia Romagna – ARPA Marche

Giornata di formazioneBologna 25 novembre 2004

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Validazione dei metodi e incertezza di misura nei laboratori di prova addetti al controllo di alimenti e bevande

Approccio olistico o decostruttivo

(Rev.1 gennaio 2005)

Graziano Bonacchi

ARPAT

Agenzia regionale per la protezione ambientale della ToscanaDirezione generale- Articolazione funzionale sistema qualità

Via Nicola Porpora n.22 - 50144 FIRENZETel. 055-3206476 – Fax 055-3206410

E. mail : g.bonacchi @arpat.toscana.it



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Indice

1. Introduzione

2. Terminologia: la chiave per comprendere la scienza analitica

3. L’approccio olistico: le possibile “insidie” di una scelta “virtuosa”

4. Un po’ di statistica:formule e calcoli

4.1 Lo scarto tipo di ripetibilità4.2 Lo scarto tipo di riproducibilità4.3 Come può il laboratorio”appropriarsi” dello scarto tipo di riproducibilità4.4 Ripetibilità intermedia

5. Esattezza ( “trueness”)= accuratezza della media

6. Trattamento dello scostamento ( “ bias”) del metodo di prova

7. Stima dell’incertezza utilizzando studi di ripetibilità intermedia ( Appendice A)

APPENDICE A Stima dell’incertezza nella determinazione di metalli nelle acque con tecnica FAAS e contecnica ICP/MS

1. Introduzione

Da quando è stata pubblicata , nel 2000, la norma ISO/IEC 17025:1999 “ Requisiti generali per lacompetenza dei laboratori di prova e taratura”, la stima dell’ incertezza di misura sembra esserdiventato il problema principale dei laboratori e dei loro clienti.Può essere peraltro segnalato che il punto 5.4.6 “ Stima dell’incertezza di misura” della normacitata è stato oggetto di un lungo dibattito1 che ha attraversato i lavori del gruppo tecnicointernazionale costituito, all’inizio degli anni ’90 , per unificare in un unico “standard”2 la normaeuropea EN 45001:1989 con la linea guida ISO 25: , che trattano, entrambe, i criteri generali dibuon funzionamento dei laboratori.

Il dibattito sulle modalità di stima dell’incertezza dei risultati delle prove chimiche, che la normanon aveva il compito di definire3, è ancora, per certi aspetti, aperto, anche se una lettura attenta deldocumento EURACHEM/CITAC Guide: “Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement” (1° edizione 1995 , 2° edizione 20004), sia pure impostato secondo i principi metrologici generali (Teorema del limite centrale e legge di propagazione delle incertezze) riportati nella ISO “Guide tothe expression of Uncertainty in Measurement”(1993)5,6, consente ai chimici di pianificaremodelli sperimentali per la validazione dei metodi dai quali ricavare informazioni preziose per lavalutazione dell’ incertezza dei risultati ottenuti applicando quei metodi.La Guida ISO GUM , ,recepita con la norma ENV 13005/20004, per quanto necessaria per lacomprensione delle problematiche di tipo metrologico ( “bottom-up approach), per la stimadell’incertezza di misura, non fornisce ai chimici e ai biologi un modello direttamente riconducibilealla loro esperienza ed alle caratteristiche del loro lavoro e risulta quindi difficile da applicare pervalutare le prestazioni dei metodi di prova7.Per stimare l’incertezza con l’approccio metrologico deve essere preliminarmente valutata lasequenza completa delle operazioni necessarie per l’esecuzione della prova ed attribuire ad ognunadi esse la variabilità associata.La ISO GUM, considera due fonti di incertezza:• quelle valutabili dallo scarto tipo di ripetibilità (categoria A)•• quelle valutabili attraverso informazioni o stime di provenienza interna( incertezza di taratura ) oesterna ( incertezza dei materiali di riferimento; incertezza di pesata ; incertezza di diluizione ecc) –(categoria B), e utilizza un modello matematico ,che descrive la relazione funzionale tra grandezzeda quantificare Y e le grandezze X effettivamente misurate (grandezze di ingresso)

1 Acc.Qual.Ass. 5;394;20002 La norma ISO 17025:2000 rappresenta adesso l’unica norma di riferimento a livello internazionale . I lavori direvisione della norma, previsti per adeguarne alcuni contenuti alla norma ISO 9001:2000, sono stati di recentecompletati e la versione finale ISO/IEC 17025:2004 FDIS dovrebbe essere definitivamente approvata ad inizio 2005.

3 La norma prescrive che “I laboratori di prova devono avere e devono applicare procedure per stimarel’incertezza.In certi casi la natura dei metodi di prova può escludere il calcolo dell’incertezza di misura rigoroso evalido da un punto di vista metrologico e statistico.In questi casi il laboratorio deve almeno tentare di identificare tuttele componenti dell’incertezza e fare una stima ragionevole, e deve garantire che l’espressione del risultato non forniscaun’impressione errata dell’incertezza.Una stima ragionevole deve essere basata sulla conoscenza del metodo e sulloscopo della misura e deve far uso, per esempio, delle esperienze precedenti e della validazione dei dati” 4 La 2a Edizione è stata tradotta nel 2003 a cura di Marina Patriarca et al. ( Rapporti ISTISAN 03/30)5 La ISO Guide (ISO GUM) è stata recepita prima come norma UNI CEI 9 :1997 e successivamente come norma UNICEI ENV 13005 :2000 , mantenendone inalterato il testo ed il titolo : “ Guida all’espressione del’incertezza di misura”6 William Horwitz in un lungo articolo apparso su Journal of AOAC International 81;785-794;1998 titolato:“Uncertainty-A Chemist’s View”, polemizza sulla possibilità di applicare la GUM alle prove chimiche ; valuta“incomprensibili” i contenuti della ISO e sospetta che sia stata estesa alle misure chimiche “by default” , senza rifletteresulle implicazioni. Horwitz ritiene anche che la Guida EURACHEM/CITAC non possa produrre risultati utili.7 Vedi prefazione alla traduzione italiana del documento EURACHEM/CITAC.



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)....,....,( 21 Ni xxxxfy = ∑= ⎥

⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

N

ii

i

ic xu

xxf

yu1

2 )()(

)(δ

δ

Nella maggior parte dei casi che interessano, i calcoli sono semplificabili, come risulta dai dueesempi:

La Guida EURACHEM/CITAC rappresenta un passaggio obbligato per la comprensione dellamodalità di stima dell’incertezza definita di tipo “tradizionale chimico” ( Approccio olistico odanche “top down approach”), che si basa sulla stima dell’incertezza ricavata dai dati di precedentistudi interlaboratorio ( Punto 7.6 della Guida) od anche utilizzando studi interni per lo sviluppo e lavalidazione del metodo ( Punto 7.7 della Guida).8

La Guida EURACHEM dà evidenza al fatto che è necessario identificare qualsiasi fonte diincertezza che non sia inclusa nei dati dello studio collaborativo : campionamento; pretrattamentodel campione;scostamento sistematico del metodo ; valutazione delle condizioni; cambiamentodelle matrici ecc. e rimanda alla norma ISO 5725:1994 “ Accuracy (trueness and precision) ofmeasurement methods and results” , fondamentale per stimare l’incertezza dei risultati avvalendosidell’approccio olistico9. L’approccio olistico prevede ,anch’esso, come vedremo, di considerare le diverse fonti diincertezza, e di combinarle “quadraticamente” per comporre l’incertezza risultante.

2. “Terminologia : la chiave per comprendere la scienza analitica ”10.

Per comprendere bene cosa significa esprimere il risultato di una prova dichiarandone anchel’incertezza, è necessario sapere in quale rapporto sta il parametro dell’incertezza con quelli di :•precisione, •esattezza , •accuratezza.

8 Il documento “ Linee Guida per la valutazione dei metodi analitici e per il calcolo dell’incertezza di misura” (LBallati; G.Bonacchi ; S.De Martin, P.Quaglino) predisposto dal Gruppo di lavoro APAT/ARPA/APPA“Accreditamento e Certificazione” e pubblicato nel 2003 nella serie I Manuali di Arpa, contiene esempi di stimadell’incertezza che applicano gli insegnamenti del documento EURACHEM/CITAC. 9 La norma ISO 5725 , in tutte le 6 parti che la costituiscono,è stata recepita, tradotta, come norma UNI ISO 5725:2004 10 “ Terminology-the key to understanding analytical science.Part.1: Accuracy, precision and uncertainty (AMC-Analytical Methods Committee/ Royal Society of Chemistry: AMC technical brief No13 sept.2003)

( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )4

42

3

32

2

22

1

12

xxu

xxu

xxu

xxu

yyuyu c

c +++==&4

321 ..x

xxxy =

321 xxxy ++= ( ) ( ) ( ) ( )32

22

12 xuxuxuyuc ++=



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Incertezza“Parametro associato al risultato di una misurazione o prova, che caratterizza la dispersione deivalori ragionevolmente attribuibili al misurando”. ( UNI CEI ENV 13005:2000; VIM :1993)11.Precisione“ Grado di accordo tra i risultati indipendenti ottenuti con un procedimento d’analisi in condizioniben specificate”. (La precisione di un risultato singolo è espressa come scarto aleatorio= differenza tra il risultatodella singola prova e la media dei risultati delle n prove)Le condizioni sono individuate da alcuni fattori : metodo, materiale esaminato , laboratorio,operatore, apparecchiatura, sua taratura , intervallo di tempo tra le prove. Premesso che il metodo ed il materiale esaminato devono , in ogni caso, essere sempre gli stessi , sipossono avere, a seconda della variazione degli altri fattori, tre tipi di precisione: •Ripetibilità stretta o ripetibilità( Sr )=precisione ottenuta nelle condizioni in cui tutti i fattori sopraindicati cono mantenuti costanti. •Ripetibilità intermedia ( SI ) o riproducibilità intermedia ( “Long term repeatibility” od anche“within reproducibility”) = precisione ottenuta nelle condizioni in cui quattro fattori :operatore,apparecchiatura e sua taratura, tempi di esecuzione variano con diverse modalità12. •Riproducibilità ( SR) = precisione ottenuta nelle condizioni in cui , oltre ai fattori sopra indicati,varia anche il laboratorio. La riproducibilità è stimabile soltanto da prove interlaboratorio.

Rimanendo all’interno del laboratorio è quindi possibile stimare soltanto la ripetibilità intermedia o la ripetibilità stretta .In ogni caso ,la precisione di un metodo “ misura” la dispersione dei risultati di prove ripetutesullo stesso campione dovuta a fattori casuali La distribuzione è assunta di tipo normale o gaussiana e la dispersione “random” intorno al valoremedio è misurato dallo scarto tipo di ripetibilità ( “standard deviation”) : Esattezza =trueness ( Accuratezza della media)“ Grado di accordo tra il valore medio ottenuto da una larga serie di risultati ed il valore diriferimento accettato”Se il laboratorio ha eseguito, come è opportuno fare, le n prove di ripetibilità su un materiale diriferimento in cui è noto il valore , presunto vero, dell’analita, la differenza tra la media dei valoritrovati ed il valore noto misura l’esattezza del risultato , che viene espressa con il termine “scostamento” ( “Bias”). Lo scostamento fornisce una misura del “recupero” dell’analita dalla matrice.Se il laboratorio esegue sullo stesso materiale di riferimento una successiva serie di n prove , è certoche troverà dei valori diversi di scostamento.In questo senso è necessario tener conto anche di questa variabilità ( “incertezza” del recupero).

Accuratezza“ Grado di accordo tra il risultato di una misurazione ed il valore di riferimento del misurando”. Il parametro dell’accuratezza nasce dal confronto tra il risultato ottenuto applicando il metodo per ladeterminazione di un certo analita e il valore atteso per quell’ analita in quel campione.Tanto più un risultato è accurato, tanto minore è l’errore di misura, essendo l’errore di misura(“scarto”) espressodalla differenza tra il “valore vero” ed il risultato della misura

11 La precedente definizione era:“ La stima che caratterizza il campo di valori entro cui giace il valore vero di unmisurando”.(VIM :1984)12 La ripetibilità intermedia rappresenta la “Run to run precision” : precisione riferibile alle condizioni in cui irisultati di prova indipendenti sono ottenuti in separate sequenze di prove eseguite in condizioni di ripetibilità stretta ,ma in tempi diversi e di solito ritarando le apparecchiature. “Run to run precision” corrisponde alla ripetibilitàintermedia definite da ISO 5725 e e si stima applicando correttamente il controllo interno di qualità routinario ( AMC-Analytical Methods Committee/ Royal Society of Chemistry: AMC technical brief No13 sept.2003)



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Il parametro dell’accuratezza è il più importante tra quanti vengono impiegati nella valutazione diun metodo d'analisi13; esso ricomprende i parametri della precisione e della esattezza ( Accuracy=precision and trueness :ISO 5727)

“Poiché una stima dell’incertezza deve incorporare sia ciò che è conosciuto circa gli effetticasuali ( scarti aleatori) sia che ciò che è noto circa le incertezze associate agli effetti sistematicisul processo di misura ( variabilità degli scostamenti), una stima dell’incertezza è probabilmente ilmodo più appropriato per esprimere l’accuratezza dei risultati”10.In altre parole, il laboratorio non può valutare l’accuratezza del risultato se non è in grado distimarne l’incertezza.

3. L’Approccio olistico: le possibili “insidie” di una scelta “virtuosa”

Ripartiamo dalle definizioni di incertezza, precisione ed esattezza:Incertezza “Parametro associato al risultato di una misurazione o prova, che caratterizza ladispersione dei valori ragionevolmente attribuibili al misurando”Precisione“ Grado di accordo tra i risultati indipendenti ottenuti con un procedimento d’analisi incondizioni ben specificate”.Esattezza: “ Grado di accordo tra il valore medio ottenuto da una larga serie di risultati ed ilvalore di riferimento accettato

Per stimare in modo corretto l’incertezza dei risultati, occorre disporre non solo della correttavalutazione della loro precisione, garantita dalla indipendenza dei risultati delle n prove ( ottenibilenelle condizioni di riproducibilità o, come vedremo di ripetibilità intermedia) , ma anche della loro

13 Nicola Bottazzini : vari corsi UNICHIM (Milano)



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esattezza , per cui le n prove di verifica del metodo devono essere eseguite su un materiale diriferimento a valore presunto vero e di cui si conosca l’incertezza.

La Guida ISO/TS 21748 :2004(E) “ Guidance for the use of repeatibility, reproducibillity andtrueness estimates in measurement uncertainty estimation” formula il risultato osservato di unamisura y ,con l’equazione seguente14 :

∑++++= 'ii xceBy δµ Equazione 1

µ = Valore del materiale di riferimento ( MRC o MR)δ = Componente dello scostamento intrinseca al metodo di misura (“Esattezza del metodo”)B = Componente dello scostamento riferibile al laboratorio e = Scarto aleatorio

∑ 'ii xc = corrisponde a componenti di scostamento non ricompresi nei precedenti

'ix =deviazione dal valore nominale di x

ii x

ycδδ

= = coefficiente di sensibilità

La Linea guida richiede che :- stime di ripetibilità, riproducibilità ed esattezza del metodo in uso,ottenuti da studi

collaborativi , come descritti in ISO 5725, siano disponibili e pubblicati15;- il laboratorio confermi la capacità di applicare il metodo di prova in modo consistente con

le prestazioni del metodo stesso controllando lo scostamento e la precisione .Questo aconferma che i dati pubblicati sono applicabili ai risultati ottenuti dal laboratorio

- sia identificata ogni influenza dei risultati di misura che non sia adeguatamente coperta dallostudio collaborativo .

Michael Thompson , nell’articolo14b “ Towards a unified model of errros in analyticalmeasurement” considera ugualmente che :

“ Result= true value+method bias+run bias+repeatability error”

L’ approccio di Thompson, che valuta peraltro che ciascuna sorgente di errore contribuisca ineguale misura a determinare l’errore complessivo finale, può essere ben rappresentato e spiegatodalla figura seguente:

14 Tale impostazione è sostanzialmente condivisa ; vedi : a) ISO 5725; b) M.Thompson, Analyst,2000,125,2020-2025 ; c) M.Thompson et al. “ Harmonized Guidelines for single-laboratory validaztion of methods of analysis”(IUPAC Technical Report) Pure Appl Chem 74;835-855; 2002; d) CITAC/EURACHEM Guide to Quality in AnalyticalChemistry(2002); N .Bottazzini, Vari Corsi UNICHIM:15 Il Gruppo di lavoro CEN/BT/WG122 costituito dal Technical Bureau del CEN ha concluso l’incarico ricevuto diimplementare il concetto di incertezza negli Standards europei con queste raccomandazioni:

- Ogni nuovo standard europeo che includa un metodo di misura o un metodo di prova che forniscano risultatiquantitativi, deve riportare il dato dell’incertezza di misura. Un processo per valutare l’incertezza o , se non èpossibile,la precisione ( cioè ripetibilità e riproducibilità) deve, di norma , essere incluso.La stessa politicadeve essere applicata alle norme soggette a revisione.

- Nel periodo transitorio, ossia fin quando le norme non saranno riviste per corredarle dei parametridell’incertezza , i risultati di prova , a meno che leggi o norme non lo richiedano ,devono essere interpretatisenza tener conto dell’incertezza nella valutazione del rispetto di limiti specificati .(AccQual..Ass 8;579-580;2003)



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Il punto di forza( e di interesse!!) dell’approccio olistico si basa sulla seguente considerazione:se il metodo è in grado di fornire risultati esatti, l’incertezza può essere stimata dallo scartotipo di riproducibilità , perché le condizioni di riproducibilità, garantite nei circuitiinterlaboratorio, assicurano, appunto,quell’indipendenza dei risultati forniti dalle n proveeseguite in laboratori diversi , che è reclamata , ma non perseguibile quando le prove sonoeseguite in condizioni di ripetibilità stretta e , non completamente, in condizioni di ripetibilitàintermedia .

Il rischio ( “l’insidia”) che il laboratorio può correre è quello di cercare di “appropriarsi” delloscarto tipo di riproducibilità, trascurando “ a priori” gli altri contributi all’incertezza,che possonoessere rappresentati con la Equazione 2 che si rapporta con la Equazione 1.Un esempio serve a chiarire il problema.Un laboratorio applica un metodo di prova, potendosi avvalere dei dati ( Rσ e rσ e “bias”δ delllostesso metodo) ricavati da un “collaborative trial” partecipato da p laboratori ai quali è richiesto dieseguire n prove su un campione costituito da un MRC ( µ = concentrazione del MRC ;

=µu incertezza del MRC al 66% di probabilità), non “troppo” diverso ( come caratteristiche dimatrice e come livello di concentrazione) dai campioni di interesse del laboratorio stesso.In questo caso il laboratorio può esprimere l’incertezza del risultato y espresso, ad esempio, comemedia di m repliche, utilizzando l’equazione 2, dopo aver verificato che il valore dello scarto tipo diripetibilità Sr delle prove eseguite, nel corso dello studio di validazione, sullo stesso MRC ( odanche su campioni del tutto confrontabili) non è statisticamente diverso dal valore di rσ . ( vedipunto 4.1 della presente relazione)

∑+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛++

⎟⎟⎟⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜⎜⎜⎜

⎝

⎛

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

+= 222

22

22

2ii

rL

rL

e ucmSu

pn

utU σ

σσ

µµ Equazione 2



9/27

pn

rL ⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

22 σ

σ = varianza della media delle medie dei risultati ottenuti nel “collaborative trial”

⎟⎟⎟⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜⎜⎜⎜

⎝

⎛

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

2

22

µ

σσ

up

nr

L

= varianza dello scostamento del metodo ( vedi punto 6 seguente)

2Lσ = varianza dello scostamento del laboratorio

con t= t di Student, calcolato in rapporto al grado di copertura ( livello di confidenza) ed ai gradi dilibertà.

Considerato che:• il valore di n è in genere =2 o 3 e che un laboratorio opera eseguendo, in genere, con un numero

di provem=1 o 2;• che il valore dello scarto tipo di ripetibilità può essere stimato da 2 a 3 volte più basso del valore

dello scarto tipo dello scostamento del laboratorio,

ne consegue che l’equazione 2 può essere semplificata:

∑++⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛++= 2222

22

iiMM

e ucup

utU σσ

µµ Equazione 2/1

Considerando infine che:• l’incertezza del MRC deve essere trascurabile ;• i contributi sotto sommatoria ∑ non siano considerati ,• il numero p dei laboratori partecipanti al circuito sia =10;

l’equazione 2/1 può essere ancora semplificata :

RMe ttU σσ ≅≅ Equazione 2/2

Rimane tuttavia da considerare la stima dell’esattezza dei risultati del laboratorio e “l’incertezza”della stima stessa. ( vedi punti 6 e 7 della presente relazione)



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4 Un po’ di statistica : formule e calcoliLa statistica necessaria è tutto sommato semplice ed i calcoli possono essere gestiti facilmente daprogrammi Excel16 , ma i risultati che se ne ricavano devono essere considerati “filtrati” dal “goodthinking” del chimico, oltre che assicurati dalla sua onestà professionale.Deve essere , prima di tutto, messo in evidenza che la corretta stima dell’incertezza ( e di tutte le“performance” del metodo) deve essere garantita da programmi di controllo ed assicurazione dellaqualità delle prestazioni di laboratorio ( “Quality Assurance and Quality Control Programs”) sianella fase di validazione o di verifica del metodo, sia nella fase della sua applicazione routinaria.Il controllo delle condizioni ambientali; la manutenzione e taratura delle apparecchiature, ilcontrollo e la gestione dei reattivi, con particolare attenzione per i materiali di riferimento(certificati o non), e, soprattutto, la garanzia della capacità degli operatori impiegati nella prova,costituiscono presupposti irrinunciabili, il cui rispetto deve essere pianificato e documentato.

4.1 Lo scarto tipo di ripetibilitàQualunque sia il modello scelto dal laboratorio per stimare l’incertezza( “ Top down” o “Bottom-up approach”) il primo passo è pianificare lo studio di ripetibilità, che può impegnare molte risorsee deve quindi essere impostato correttamente.Lo studio dovrebbe essere tale da coprire tutto il campo di applicazione del metodo o, quantomenoil suo intervallo di misura.Per coprire il campo di misura , il laboratorio dovrebbe impegnarsi a stimare almeno tre livelli ,distribuiti in un intervallo che deve ricomprendere il valore del limite di legge , se previsto, o dellaspecifica contrattuale definita con il “cliente”.Per coprire il campo di applicazione , il laboratorio dovrebbe estendere lo studio a più matrici , sepreviste.La presente nota si confronta soltanto sullo studio ad un livello e non considera l’effetto matrice.Lo studio di ripetibilità dovrebbe essere eseguito utilizzando un materiale di riferimento a valore“noto”(possibilmente certificato da un produttore accreditato) che abbia caratteristiche di matriceidentiche o simili a quelle dei campioni di prova e che , naturalmente, contenga l’analita ad unlivello di interesse per il laboratorio.In questo modo , il laboratorio, dispone di una prima valutazione dell’esattezza del risultato , anchese non è in condizione di sapere quanto della differenza tra la media dei valori trovati ed il valore diriferimento dipende dallo scostamento del metodo o del laboratorio17.Il numero n di prove da eseguire sul materiale di riferimento è deciso in funzione dell’ interesse del laboratorio ad avere un risultato più o meno predittivo rispetto al valore “target” di precisioneche il metodo si impegna a garantire ; la scelta del numero di repliche è condizionata , moltospesso, anche dalla complessità del metodo18.La statistica suggerisce di non eseguire meno di 7 prove replicate19 e valuta anche che non è utileeseguire più di 20 replicati: il compromesso raccomandato è n= 10-12 prove20.La distribuzione dei risultati deve essere di tipo normale o gaussiana e la dispersione “random”intorno al valore medio è misurato dallo scarto tipo di ripetibilità ( “standard deviation”) :

16 Quasi tutti i calcoli , richiamati in questa nota, sono gestiti da Moduli statistici preparati da ARPAT , distribuiti conla documentazione nel corso della iniziativa di Ancona ( Ottobre 2003) e disponibili in rete.17 ISO 5725-1 Punto 518 Metodi di difficile esecuzione comportano tempi e costi tali da non consentire un grosso numero di repliche.19 Vedi ,ad esempio, EURACHEM/CITAC Guide punti 8.3.3 e 8.3.420 Vedi,ad esempio, Linea Guida SINAL DT-0002 Rev1, al punto 4.

( )1

1

2

−

−=∑=

n

XXS

n

ii

r n

XX

n

ii∑

== 1



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Il laboratorio deve disporre,naturalmente, di tests statistici per la verifica della normalità delladistribuzione dei dati (ad esempio :test di Shapiro-Wilks) e per il controllo dell’eventuale presenzadi dati anomali (ad esempio: Tests di Dixon; Grubbs; Huber)

Tutte le operazioni relative alla composizione dei diversi contributi delle incertezze ( “ Legge dipropagazione degli errori”) devono essere effettuate sommando le varianze e non gli scarti tipo.

Il numero di prove n che i laboratori eseguono per stimare lo scarto tipo rappresenta quindi solo un campione, più o meno rappresentativo, della intera popolazione di prove che potrebbero esserefatte.

Se il numero di prove fatte fosse infinito ed il risultato ottenuto fosse esatto, il valore mediocorrisponderebbe al valore vero e ogni singolo risultato sarebbe ricompresso nell’intervallo di ±σcon una probabilità del 68 % e ±2σ con una probabilità del 95% circa.

Il rapporto tra lo scarto tipo Sr stimato dal laboratorio,con le n prove e σr ,stabilito con le infiniteprove, si avvicina tanto più ad 1, quanto più alto è il numero n ( gradi di libertà ν=n-1) delle proveeseguite dal laboratorio sul campione. Il livello di compromesso prima riportato ( n= 10-12 ; compreso tra 7 e 20) è spiegato dall’esamedella tabella 1.

Tabella 1Gradi di libertàν=n-1 A B

1 0,0316 2,2412 0,160 1,9216 0,454 1,5519 0,548 1,48011 0,589 1,41220 0,692 1,30730 0,748

BS

Ar

r ≤≤σ

1,251

( )1

1

2

2

−

−==∑=

n

XXSV

n

ii

rr



12/27

p

Sp

jj

r

∑== 1

2

2σ

Appare evidente che lo scarto tipo ottenuto dalla ripetizione di n=10 prove ripetute consente unapredizione inferiore, che è gestita con il t di Student e può essere rappresentata dallo allargamentodella curva di Gauss.L’intervallo di confidenza, al 95% di fiducia, della media dei 10 risultati è espresso dalla relazione:

( )

1022,2 10=±= nrS

XRisultato con 2,22 = t di Student per grado di libertà ν= 10-1=9 ( Tabelle del t

di Student)

Se il laboratorio mantiene sotto controllo statistico le prestazione del metodo ( carte di controllo), èin grado di garantire che:- la differenza tra due risultati ottenuti in condizioni di ripetibilità risulterà inferiore od uguale

al limite di ripetibilità : ( ) 222,2 1012 =≤−==∆ nrxSXXr ;- il risultato ottenuto, ad esempio con m=3 prove replicate in routine, sarà esprimibile

( )

322,2 10=± nrS

X

Se il laboratorio non disponesse del valore stimato di scarto tipo di ripetibilità ottenuto con n=10prove al momento della verifica iniziale ed eseguisse, in routine, una prova in triplo il risultato

sarebbe molto meno preciso ( )

33,4 3=± nrS

X con 4,3 = t di Student per n=3 prove

Lo sforzo fatto per appropriarsi, durante lo studio di validazione, di un valore sufficientementecorretto ( predittivo) di scarto tipo di ripetibilità ( n=10-12 ) e di mantenerlo sotto controllostatistico ( usando carte di controllo del “Range”) consente quindi al laboratorio di esprimererisultati molto più precisi.21 E’uno sforzo ben “remunerato”!.

4.2 Lo scarto tipo di riproducibilitàLa stima della precisione in condizioni di riproducibilità (i risultati sono ottenuti con lo stessometodo, sullo stesso campione, in laboratori diversi , con diversi operatori e diverseapparecchiature , in diverse condizioni di taratura ) fornisce il contributo più importante alla stimaincertezza, se le prove sono eseguite su un materiale di riferimento certificato , del quale si conoscaanche l’incertezza ed il circuito interlaboratorio è organizzato da un “provider” affidabile , magari,accreditato22.Lo scarto tipo di riproducibilità σR è ricavato dallo scarto tipo di ripetibilità dei p laboratoripartecipanti e dallo scarto tipo interlaboratorio σL, che è a sua volta ricavato dallo scarto tipo dellemedieσM dei risultati ottenuti nelle n prove ripetute dai singoli laboratori:

21 Una delle differenze più importanti tra il lavoro dei chimici e quello dei biologi consiste nel fatto che le prove ditipo microbiologico, per loro natura, non consentono di “immagazzinare” il dato di scarto tipo di ripetibilità e di“spenderlo” nella routine delle singole prove. La Relazione del dott. Lido Ballati darà conto di questa differenza.

222rLR σσσ +=

nr

ML

222 σσσ −=

( )2

1

2

)1(1 ∑

=

−−

=p

jjM XX

pσ 222 1

rMR nn σσσ −

+=



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Ai laboratori che partecipano ai circuiti è richiesto23 di eseguire n prove sul campione ed i lororisultati sono valutati sia per la loro precisione che per la loro esattezza. Anche per quanto riguarda la stima dello scarto tipo di riproducibilità, la statistica insegna che essaè più corretta ( predittiva) in funzione del numero p di laboratori partecipanti , del numero n diprove eseguite da ciascun laboratorio ed anche del rapporto γ tra scarto tipo di riproducibilità e diripetibilità ( Tabella 2) :

Tabella 2 ( Ripresa da ISO 5722-1 Prospetto 1) Ar AR Numero

plaboratori n=2 n=3

n=4

γ=2n=2 n=3 n=4

γ=5 n=2 n=3 n=4

5 0,62 0,44 0,36 0,61 0,58 0,57 0,68 0,67 0,6710 0,44 0,31 0,25 0,41 0,39 0,38 0,45 0,45 0,4520 0,31 0,22 0,18 0,28 0,27 0,26 0,31 0,31 0,3130 0,25 0,18 0,15 0,23 0,22 0,21 0,25 0,25 0,25

AsA +<−

<−σσ ossia AsA +<<− 11

σ

r

R

σσγ =

Il numero p dei laboratori partecipanti dovrebbe essere compreso tra 8 e 15 ed inoltre se γ>2 , come “ spesso accade”24 , la predittività non aumenta significativamente aumentando il numero ndi prove.

22 I MODULI STATISTICI ARPAT 20 ( o 50) sono impostati per fornire tutte le informazioni relative alla gestionestatistica dei risultati dei circuiti interlaboratorio.23 Il Servizio di metrologia ambientale APAT , diretto dalla dott.ssa Maria Belli, sta prediponendo i Protocollisperimentali che definiscono le condizioni di partecipazione ai circuiti e i criteri di valutazione dei risultati.24 ISO 5725 –1 Punto 6.3.4.



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Le figure seguenti danno una rappresentazione grafica efficace del significato delle formule



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4.3 Come può il laboratorio “appropriarsi” dello scarto tipo di riproducibilità?

I laboratori non hanno , in grandissima maggioranza, il compito di validare nuovi metodi di prova ,bensì di applicare metodi “normalizzati”, emessi da organismi specializzati ( UNI ; ISO ecc)Un metodo di prova normalizzato dovrebbe essere già “validato” ; e quindi dovrebbe riportare idati della precisione ( scarto tipo di ripetibilità e di riproducibilità), della esattezza e dell’incertezza, a vari livelli rappresentativi del campo di misura e di applicazione del metodo stesso.Al laboratorio che decide ( o deve) applicare quel metodo , dovrebbe restare il compito di verificarela propria capacità di applicarlo garantendone le prestazioni dichiarate, e , se necessario, dovrebbedimostrare che le eventuali modifiche introdotte nella procedura non alterano le prestazioni stesse.I metodi normalizzati difficilmente, purtroppo, riportano i parametri di validazione e , anchequando lo fanno, essi sono poco documentati o sono basati su circuiti interlaboratorio non recenti.La situazione è destinata a modificarsi positivamente dopo il Gruppo di lavoro CEN/BT/WG122costituito dal Technical Bureau del CEN ha concluso l’incarico ricevuto15 di implementare ilconcetto di incertezza negli Standards europei con questa raccomandazione:

- Ogni nuovo standard europeo che includa un metodo di misura o un metodo di prova cheforniscano risultati quantitativi, deve riportare il dato dell’incertezza di misura. Unprocesso per valutare l’incertezza o , se non è possibile,la precisione ( cioè ripetibilità eriproducibilità) deve, di norma , essere incluso.La stessa politica deve essere applicata allenorme soggette a revisione.

Nel caso in cui il metodo normalizzato riporti i parametri di validazione, il laboratorio si confrontacon questi eseguendo n prove di ripetibilità stretta su un materiale di riferimento adeguato econtrollando che il rapporto tra la sua ripetibilità Sr e quella del metodo, assunta pari a σr ,siacoerente con quanto riportato in Tabella 1.

Se così è, il laboratorio si appropria del valore di scarto tipo di riproducibilità ed anzi puòdisaggregarlo nelle due parti che lo costituiscono: σL e σr, cominciando a costruirsi “pezzi” dellastima dell’incertezza estesa, applicando la equazione 2 , riportata al punto 3 della presente relazione

Se il metodo è esatto e il laboratorio ha eseguite le proprie prove di verifica con un materiale diriferimento adeguato, che gli consente di controllare anche l’esattezza dei suoi risultati ( vedi punto5 della presente relazione), allora può esprimere l’incertezza del risultato singolo ( purchè siaall’intorno del livello verificato) con la espressione”:

RXRisultato σ2±= ( stimato al 95% di confidenza);

Se il laboratorio intende valorizzare il fatto di avere eseguito m prove replicate per diminuirel’incertezza del risultato , allora può esprimere l’incertezza così:

mSXRisultato r

L

222 +±= σ

Il laboratorio che applica un metodo normalizzato che non riporta i parametri di validazione , puòappropriarsi del valore dello scarto tipo di riproducibilità o partecipando, con successo, ad un circuito interlaboratorio( pianificato in modo tale che tutti i p laboratori partecipanti (p>8) effettuinoalmeno due prove ed applichino, naturalmente lo stesso metodo sullo stesso campione) oppure



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anche verificando , “in house”, se è in grado di ottenere i risultati di un circuito già effettuato25,pur non avendoci preso parte , con un approccio del tutto simile a quello già descritto.Se non sono disponibili circuiti interlaboratorio , che consentano di verificare le prestazioni delmetodo normalizzato, oppure il laboratorio decide, per corrispondere a richieste particolari, dimettere a punto un proprio metodo interno, possono essere praticate alcune scelte che mettono ingiuoco le capacità e l’esperienza del chimico.In questi casi deve essere eseguito lo studio di ripetibilità su un materiale di riferimento , del qualesiano note caratteristiche e l’ incertezza, perché è senz’altro irrinunciabile valutare l’esattezza delmetodo e stimare l’incertezza stessa di questa stima.Il confronto con i dati del certificato del MRC , soprattutto se sono correttamente riportati , comeaccade per i materiali BCR di IRMM (www.irmm.jrc.be/), i risultati del proficiency test di

certificazione : incertezza del materiale ( p

tU Mσµ = ); scarto tipo di ripetibilità; scarto tipo

interlaboratorio; numero p dei laboratori ; numero n di prove eseguite da ciascun laboratorio, puòfornire informazioni preziose26

Il laboratorio procede quindi, al solito , confrontando la sua ripetibilità con quella dei p laboratoricertificanti e , se va bene, acquisisce i dati dello scarto tipo interlaboratorio per esprimere i suoirisultati con una incertezza che tiene conto anche della componente della variabilità riferibileall’uso di metodi diversi.Naturalmente, il lavoro sopra descritto per ottenere la stima di Sr e SR ad un livello , va ripetuto perciascuno dei livelli ( di solito 3 o 4) in cui è stato ripartito il campo di misura del metodo.Successivamente, portando sulle ascisse i livelli e sulle ordinate gli scarti tipo SR o Srcorrispondenti, si può ricavare ( nei casi “fortunati”) una equazione della curva di interpolazionesufficientemente affidabile. I dati ricavati dai circuiti UNICHIM su acque potabili ed acque di scarico , che riguardano inparticolare metalli ( tecnica GFAAS ) od anioni ( Tecnica Cromatografia ionica) sono utili per lacostruzione delle curve di interpolazione , anche se il rapporto tra riproducibilità e ripetibilitàappare spesso troppo elevato, con la conseguenza di stimare una incertezza eccessivamente altautilizzando lo scarto tipo di riproducibilità. ( Vedi : Esempio del Cadmio in acque potabili, inAppendice A)I circuiti UNICHIM non possono peraltro fornire alcuna informazione sull’incertezza del “bias”,perché non utilizzano materiali di riferimento a valore noto, di cui sia conosciuta l’incertezza. In mancanza di qualsiasi riferimento utile , il laboratorio può operare una “prima stima”dell’incertezza dei risultati , utilizzando la relazione di Horwitz , con le modifiche introdotte daThompson ( M.Thompson ; Analyst 2000,125,385-386):

cR 22,0=σ ( Thompson) se c< 1,2 x10-7 ( 120ppb)27

8495,002,0 cR =σ (Horwitz) se 1,2 x10-7< c <0,138

5,002,0 cR =σ ( Thompson) se c>0,138con c espresso come m/m.

25 Ad esempio : i Circuiti UNICHIM su acque potabili ed acque di scarico.26 N.Bottazzini; Corsi UNICHIM ; Manuale UNICHIM 197 :2003 ; G:Bonacchi ; Articolo in stampa su Boll. ChimIg. N°2 ; 2004.27 La relazione di Thompson è stata riportata nel testo della Decisione dlela Commissione del 12 agosto 2002 cheatau al direttiva 96/23/CE del Consiglio relativa al rendimento dei metodi analitici e al’interpretazione dei risultati



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Le relazioni -in particolare quella di Horwitz- forniscono in genere valori di scarto tipo diriproducibilità molto elevati ( Vedi tabelle in Appendice A)Deve essere considerato tuttavia che lo stesso Horwitz valuta che il valore del scarto tipo ricavabiledalla sua relazione σHorwitz possa oscillare tra 0,5 e 2 volte il suo valore28.Il laboratorio che confronta la sua ripetibilità con quella desumibile dallo scarto tipo della relazionedi Horwitz, dovrebbe tener conto di questo fatto e dovrebbe considerare anche poco predittivoquanto indicato con Decreto 23 dicembre 2000 del Ministero della Sanità29, là dove considera cheil rapporto tra scarto tipo di ripetibilità del laboratorio e scarto tipo di riproducibilità di Horwitz siapari a 0,66 ( riferimento: determinazione delle aflatossine).Tale rapporto di 0,66 è stato probabilmente accettato e “divulgato” in base alla affermazione dellostesso W.Horwitz :“ Within-laboratory variability is expected to be one-half to two-thirds theamong-laboratory variability”30 Tale rapporto, in ogni caso, appare poco credibile, soprattutto tenendo conto del fatto che illaboratorio sarebbe chiamato a confrontare il proprio scarto tipo di ripetibilità , calcolato con pocheprove con un valore di scarto tipo di riproducibilità σHorwitz estrapolato da un numero molto alto didati.Come conclusione a questo punto della Relazione ,vale la pena di riportare quanto affermaS.Ellison:“Deve comunque essere tenuto presente che la riproducibilità è senz’altro una misura diprecisione; essa informa inoltre sull’incertezza dello scostamento del laboratorio, ma non copre loscostamento inerente al metodo né, in generale, gli effetti matrice”. ( S.Ellison et al.; AnalyticalChemistry News &Features, 607A ;1997)

4.4 Ripetibilità intermedia

La stima della ripetibilità intermedia ( stesso campione , stesso metodo , tempi di esecuzione e/ooperatori diversi) rappresenta una modalità di grande interesse per la stima della incertezza.Riportiamo di seguito alcuni riferimenti:“La ripetibilità intermedia ( “long –term standard deviation”) di un serie di misure replicate (almeno 7 e preferibilmente fino a 20) eseguite su un MRC per un periodo di tempo non inferiore atre mesi, fornisce una accettabile approssimazione della scarto tipo di riproducibilità”31 “ Quando lo studio è realizzato da un unico laboratorio, lo scarto tipo interlaboratorio σL non puòessere determinato direttamente. In molti casi è sufficiente sostituire σL con lo scarto tipo diripetibilità intermedia”32

“Generalmente, nell’analisi chimica, lo scarto tipo ottenuto , sotto condizioni di precisioneintermedia, può essere due o tre volte quello ottenuto in condizioni di ripetibilità stretta. Esso nondovrebbe , naturalmente , essere superiore allo scarto tipo di riproducibilità”33

28 W.Horwitz et al.; Journ.A,O.A.C: 81;1257, 1998 “ A simple method for evaluating data from interlaboratory studies”;M.Thompson et al ; Analyst 1995: 120; 271-272 “ A Horwitz –like function describes precision in proficiency test”29 Decreto Ministero23 dicembre 2000 ;Ministero della Sanità” Recepimento della direttiva 98/53/CE dellaCommissione che fissa i metodi per il prelievo dei campioni e metodi d’analisi per il controllo ufficiale dei tenorimassimi di taluni contaminanti nei prodotti alimentari” ( riguarda le aflatossine)30 W.Horwitz et al. ;Anal.Chem.1997,69,789-790 “ A Heuristic derivation of the Horwitz curve”.31 V.Barwick et al; “Applications of reference materials in analycal chemistry” Published for Laboratory of theGovernment Chemist :2001 ; vedi anche ISO Guide 33:2000(E) Punto 6.4.2.632 ISO Guide 33: 2000 “Uses of reference materials” 33 ISO 5725-3 Punto 09.



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Le modalità per condurre lo studio , avendo a disposizione materiale stabile ed in quantitàsufficiente, sul quale siano state eseguite preventivamente le prove di ripetibilità stretta, sono:a) Eseguire una prova singola in giorni successivi e controllare come variano i risultati rispetto alimiti prefissatib) Eseguire ogni volta , in giorni successivi almeno una prova in doppio.Al laboratorio deve essere suggerito di procedere, secondo metodologia b), eseguendo proveripetute almeno in doppio in giorni successivi perché, in questo modo, è possibile stimare non sololo scarto tipo di ripetibilità stretta ( e di verificare se non cambia significativamene nel temporispetto allo scarto tipo di ripetibilità determinato ad inizio studio) ma anche lo scarto tipo relativoal fattore tempo e riferibile alla influenza delle condizioni ambientali oltre che all’uso di vetreria ,reagenti diversi ecc.La statistica , in queste condizioni, è identica a quella presentata per la riproducibilità: l’unicadifferenza consiste nel fatto che al posto di laboratori diversi, devono essere considerati giorni gdiversi.34

222rILI SSS +=

nSSS r

IMIL

222 −= ( )∑ −

−=

22

11 XX

gS mjIM

Deve essere valutato dal laboratorio se la differenza tra scarto tipo riferibile alla dispersione deivalori dovuta al fattore tempo e quello della ripetibilità stretta è significativa ; nel caso non lo fossetutti i risultati sarebbero elaborati insieme e sarebbe stimata la dispersione intorno alla grande media(ISO 5725 –3 ;6)Il laboratorio deve inoltre valutare con attenzione se considerare, nella stima della incertezza , oltreal contributo stimabile con lo scarto tipo di ripetibilità intermedia, anche quello riferibileall’incertezza della curva di taratura.In Appendice A sono riportati due esempi di stima dell’incertezza dei risultati ottenuta utilizzandolo scarto tipo di ripetibilità intermedia: 1° esempio : metalli in acque superficiali (MRC) determinati con tecnica ICP/MS 2° esempio : metalli in acqua di sorgente (MR) determinati con tecnica GFAAS.In entrambi i casi sono state stata considerate le incertezze di taratura (retta per ICP/MS; parabolaper GFAAS) ; mentre sono state considerate trascurabili le incertezze dei materiali di riferimento. Il grande interesse che il laboratorio deve avere per la stima iniziale ed il controllo successivo delloscarto tipo di ripetibilità intermedia ( carte di controllo) , non consiste soltanto nel fatto che questoparametro è considerato adeguato per la stima dell’incertezza, ma anche perché è un efficacestrumento di controllo e di assicurazione della qualità dei dati.Una sperimentazione particolare di ripetibilità , da eseguire in giorni diversi e che deve esseregestita con grande precauzione, riguarda l’uso delle carte del “Range” applicato a campioni di provadi routine, di cui non è noto quindi il valore di concentrazione. Il laboratorio può essere interessato a gestire tali carte per tipologie di campioni che controlla inroutine ( esempio: acque di scarico; acque potabili ecc ) eseguendo periodicamente prove in doppioin modo da controllare l’effetto della variabilità dei livelli trovati sulla permanenza del dato discarto tipo stimato all’inizio su un dato livello iniziale.Se, come quasi sempre accade, il valore di scarto tipo varia con i diversi livelli, gli stessi possonoessere riuniti per gruppi, l’elaborazione dei risultati può essere ripetuta ed alla fine , nei casi“fortunati”, può essere stimata la ripetibilità ai diversi livelli e verificato il rapporto tra Sr econcentrazione.

34 Il Modulo statistico ARPAT elabora in automatico tutti i calcoli ( vedi Appendice A)



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I valori di scarto tipo ottenuti dalla relazione N

RS

N

ii

21

2∑== sono valori di scarto tipo di ripetibilità

stretta ( N= numero di prove in doppio)

5. Esattezza ( “trueness”) = Accuratezza della media

“ Grado di accordo tra il valore medio ottenuto da una larga serie di risultati ed il valore diriferimento accettato”Le modalità con cui si può stimare l'esattezza della media dei risultati di un procedimento analiticosono sostanzialmente due:

a) dal confronto con valori di riferimento b) dal confronto con la media dei risultati ottenuti con altri metodi indipendenti e già validati

Si consideri il caso a) :Confronto con un materiale di riferimentoI materiali di riferimento “ ideali” sono quelli certificati (MRC costituiti da analiti dispersi inmatrice : “nativi” o fortificati), che devono essere scelti in modo da corrispondere , per tipologia dimatrice e per livello di analita presente , alle necessità di indagine del laboratorio .Se non sono disponibili MRC , il laboratorio dee prepararseli aggiungendo quantità nota di analitaalla matrice di interesse, con una inevitabile perdita di predittività, sicuramente accettabile nel casodi matrici liquide L’incertezza del materiale di riferimento dovrebbe essere , secondo le indicazioni ILAC35 ,trascurabile rispetto al valore dell’incertezza che il laboratorio ha deciso di avere come requisito“target” (rapporto da 1:4 a 1:10; se possibile!!)). Come si calcola l’esattezza Si eseguono n prove replicate ( almeno 7 ; possibilmente 10) indipendenti sul MRC o su unamatrice bianca fortificata e , dopo aver valutato che lo scarto tipo trovato è in linea con leaspettative di ripetibilità, si confronta il valore medio trovato con il valore di riferimento e siverifica se la loro differenza è significativa o meno al 95 % di confidenza. Se il laboratorio ha disponibile la stima dello scarto tipo di riproducibilità SR e di ripetibilità Sr, èin grado di conoscere anche lo scarto tipo di ripetibilità interlaboratorio SL , per cui, conoscendol’incertezza del MRC uµ , verifica la significatività statistica della differenza applicandol’Equazione 3:

95,0;

22

2

=≤

++

−p

rL

t

umS

S

Xν

µ

µEquazione 3

Se il rapporto è tale che il valore trovato è inferiore a t critico considerato al 95% di probabilità (ma possiamo semplificare dicendo che : se il rapporto è inferiore a 2), allora il metodo è consideratoesatto e non si introduce alcuna correzione nel calcolo del risultato; altrimenti il risultato dovrebbeessere corretto.Gli organismi internazionali sono concordi nel ritenere che se la differenza –lo scostamento-non èsignificativa , il risultato non deve essere corretto; ma non sono tutti d’accordo sul problema di 35 ILAC-G9: 1996 “ Guidelines for the selection and use of Certified Reference Materials”



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inserire in ogni caso , nella stima dell’incertezza, anche il contributo dell’incertezza nella stima delrecupero36. Ciò che dovrebbe risultare chiaro , nell’ applicare la verifica di significatività delloscostamento , è che il rapporto diventa tanto più alto quanto più alta è la precisione del metodo (ossia è basso il denominatore nell’Equazione3 !), con la conseguenza paradossale che un metodopuò risultare esatto quando i risultati sono imprecisi e viceversa.Questo dovrebbe dare evidenza ad un aspetto troppo spesso trascurato: il laboratorio ( o meglioancora il legislatore37) dovrebbe imporsi degli obiettivi di precisione e di esattezza- e quindi diincertezza- e verificarne il rispetto .Potrà accadere che, nonostante che il rapporto di cui alla Equazione 3 segnali che il metodo èsignificativamente non esatto, tuttavia la differenza tra il valore medio trovato- magari si tratta delvalore medio calcolato al termine di uno studio di ripetibilità intermedia – ed il valore di riferimentosia inferiore al valore di accettabilità δm predefinito :

mX δµ ≤−

In questi casi lo scostamento sistematico non può essere ritenuto inaccettabile (Vedi ISO 5725 –6Punto 8.5.2)Caso b : Confronto con un metodo normalizzatoIl metodo da validare può essere confrontato con un metodo normalizzato che dispone di dati discarto tipo di ripetibilità e di riproducibilità . In questo caso, il laboratorio esegue sullo stesso campione due serie di prove na e nb , con ilmetodo da validare e con quello normalizzato , ottenendo due valori medi e due valori di scartotipo sa e sb. Se i due valori di scarto tipo non risultano significativamente diversi ( test specificodel fattore F di Fisher) tra loro e sono entrambi compatibili con lo scarto tipo del metodonormalizzato allora il metodo interno può essere considerato esatto se :

95,0;11 =≤+

−p

ba

ba t

nnS

XXν con ( ) ( )

211 22

−+−+−

=ba

bbaa

nnSnSn

S

con t = valore della variabile di Student al livello di probabilità p( al 95%) e con n= gradi dilibertà. Da notare che, se lo scostamento non è significativo, non occorre correggere i risultati del metododa validare, tuttavia nell’incertezza del risultato occorre considerare anche il contributo

all’incertezza dello scostamento espressa dal denominatore38: ba nn

S 11+

Lo stesso approccio e la stessa statistica, considerati nel caso b, sono utilizzabili nei casi-frequenti-in cui un laboratorio deve verificare che le variazioni introdotte ad un metodo normalizzato nonsiano tali da modificarne significativamente le prestazioni.

36 Pure & Appl.Chem. Vol.71, No 2,pp 337-348 ,1999 “ Harmonised Guidelines for the use of recovery information inanalytical measurement” ( Technical Report: IUPAC, ISO and AOAC INTERNATIONAL) Prepared for publication byM.Thompson et al.37 I segnali del legislatore cominciano ad arrivare: nel D.Lvo 31 ;2001 si richiede che la precisione e l’esattezza sianoinferiori al 10% del valore trovato , all’intorno del limite di legge.38 Vedi Rapporto ISTISAN 03/30 Punto 7.7 : “Stima dell’incertezza utilizzando studi interni per lo sviluppo e lavalidazione del metodo” ( Traduzione del Documento EURACHEM/CITAC )



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6. Trattamento dello scostamento (“bias”) del metodo di prova .Come già ripetutamente considerato nei punti precedenti, una delle questioni più controverserelative alla modalità di stima dell’incertezza dei risultati , riguarda non tanto il come si stimal’incertezza dello scostamento, ma piuttosto se , e come , e quando inserire nel computodell’incertezza totale il contributo dell’incertezza dello scostamento.L’estensore di questa nota non ha trovato niente di più convincente , su questo argomento, diquanto riportato in un articolo di W.Hasselbarth39 , apparso sulla rivista “Accreditation and QualityAssurance”: W.Hasselbarth esplicita con grande evidenza40 che , in ogni caso, sia che “il recupero”, ossia loscostamento, risulti significativo, sia che non risulti , l’incertezza della stima di questasignificatività deve contribuire a comporre l’incertezza totale del risultato, a prescindere dal fattoche nella formula di calcolo sia stato introdotto il fattore di recupero (ossia la correzione per loscostamento) sia che non lo sia ( vedi schema seguente).Anzi, nel caso in cui il laboratorio decida dinon inserire nel calcolo del risultato il fattore di recupero , nonostante la significatività statisticadello scostamento, l’incertezza del risultato deve essere “caricata” addirittura del valore delloscostamento stesso“a” , sommato ,naturalmente, quadraticamente agli altri fattori di incertezza.

( ) ( )22

rifXun

Sau +=

In un articolo apparso di recente sulla stessa rivista (Accred.Qual.Assur.9;509-514; 2004),significativamente titolato: “Accounting for bias in measurement uncertainty estimation”,Hasselbarth riprende l’argomento e lo estende prendendo in considerazione la precisione stimata incondizioni di ripetibilità intermermedia.

Schema di W.Hasselbarth. ( Accred.Qual.Assur. 3 ;418-422 ;1998)

39 Werner Hasselbarth ; “Measurement uncertainty procedures revisited: Direct determination of uncertainty and biashandling”; Accred.Qual.Assur. 3:418-422; 1998.40 Un approccio molto simile a quello di Hasselbarth è proposto da una nutrita serie di pubblicazioni del “ Laboratory ofthe Government Chemist “ (LGC); ad esempio : Vicki J. Barwick and Stephen L.R. Ellison “ Measurement uncertainty: Approach to the evaluation of uncertanties associated with recovery” Analyst,1999,124,981-990.



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7. Stima dell’incertezza utilizzando studi di ripetibilità intermedia.(Appendice A) La difficoltà, rappresentata nel corso della relazione , di disporre di metodi normalizzati corredatidei parametri di validazione e di disporre di circuiti interlaboratorio adeguati, spinge a ricercaresoluzioni “in house” impostate su studi di ripetibilità intermedia ( vedi Punto 5).In Appendice A sono riportati i risultati di due studi relativi alla determinazione di metalli nelleacque, eseguiti nel corso degli ultimi mesi.Il primo studio è stato eseguito nel laboratorio di “Publiacqua S.p.A. ”, ente gestore del cicloidrico integrato dell’ Ambito Territoriale Ottimale N°3 Medio Valdarno (A.T.O 3) che gestisce ilcontrollo delle acque destinate alla potabilizzazione e delle acque potabili nell’aria vasta di Firenze.Pistoia, Prato,Arezzo. Il secondo studio è stato eseguito nel laboratorio del Dipartimento provinciale ARPAT di Arezzo.Le tabelle in Appendice A riportano tutte le informazioni : i risultati ottenuti (che corrispondono aivalori medi risultanti dalle prove ripetute in condizioni di ripetibilità intermedia); i metodi e letecniche analitiche impiegati; i materiali di riferimento utilizzati; le apparecchiature; il tipo di curvadi taratura utilizzata (la retta per Publiacqua S.p.A.; la parabola per il Dipartimento ARPAT diArezzo)L’esattezza dei risultati è stata verificata per confronto con il valore del MRC nel caso diPubliacque SpA e con i valori dei MR ottenuti per fortificazione di matrice, nel caso delDipartimento provinciale ARPAT di Arezzo. In tutti i casi lo scostamento è risultato inferiore omolto inferiore al 5% eccetto il caso della determinazione del Cadmio nell’acqua di sorgentefortificata ad 1µg/L, in cui lo scostamento risulta +17%.L’incertezza è stata , in entrambi i casi studiati, stimata componendo quadraticamente lo scarto tipodi ripetibilità intermedia con l’incertezza di taratura, stimata con le equazioni riportate nelle normeISO 41.I valori trovati sono stati confrontati con quelli ottenuti applicando le relazioni di Thompson e diHorwith e, quando disponibili, con i risultati dei circuiti UNICHIM .Interessante notare che l’incertezza estesa stimata dal laboratorio di Publiacqua SpA risulta coerentecon il dato di incertezza estesa riportata dal certificato del MRC , mentre risulta molto inferiore aquella stimata con la relazione di Horwitz ( ed anche con quella di Thompson).Nel caso del laboratorio ARPAT di Arezzo , è di grande interesse osservare che i valori diincertezza estesa stimati con lo studio di ripetibilità intermedia sono coerenti con quelli riportatinella recentissima norma UNI EN ISO 15586:2004 “ Determinazione di elementi in tracciamediante spettrometria di asssorbimento atomico con fornetto di grafite”.Nel caso dello studio di Arezzo, i valori stimati di incertezza sono molto più bassi di quelli calcolatiinterpolando i dati di scarto tipo di riproducibilità ottenuti nei Circuiti UNICHIM ( sono statielaborati i dati UNICHIM ottenuti con tecnica GFAAS) e di quelli calcolati con le relazioni diThompson ed Horwitz .Può inoltre essere osservato che il contributo dell’incertezza di taratura , nella stima della incertezzacomposta , è molto poco significativo usando l’interpolazione della parabola e la tecnica GFAAS (ARPAT Arezzo ) e poco significativo, eccetto il caso del Piombo a 4,1 µg/L , usandol’interpolazione della retta e la tecnica ICP/MS ( “Publiacqua S.p.A.”)Questo risultato è probabilmente da riferire al fatto che sia il laboratorio di Publiacqua S.p.A. chequello del Dipartimento ARPAT di Arezzo hanno costruito le loro curve con grande attenzione:sualmeno 5 livelli e con letture ripetute su ogni livello .

41 Le equazioni utilizzate per la stima dell’incertezza di taratura sono riportate in ISO 8466-1:1990 per la retta e ISO8466-2:2001 per la parabola.



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Deve essere, infine, ancora una volta segnalato che gli studi di ripetibilità intermedia consentonouna efficace verifica delle prestazioni del metodo, sia in fase di validazione iniziale, sia ,seproseguiti nel tempo,nelle fasi di impiego routinario .



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APPENDICE A

Dati ARPAT ( Dipartimento provinciale di Arezzo)

Campione Acqua di sorgente fortificataMetodo Rapporto ISISAN 0014/Pt1Tecnica FAASApparecchiatura SpectraA 220Z (Varian) Curva di taratura : Parabola

Concentrazioni(µg/L)

Dati InterpolatiCircuitiUNICHIM

Ripetibilità Intermedia:N prove in doppio (settimane)

Incertezza taratura

Incertezza estesa

Relazione Thompson

CR 22,0=σ

RelazioneHorwitz

8495,002,0 CR =σ

Analita

σr 2σR X N Sr SI Tu

222 TIe uSU +=

2σR 2σR

Cadmio 1 0.05 0.31 1.17 14 0.059 0.276 0.047 0.56 0.44 0.902,5 0.15 1.16 2.57 11 0.110 0.351 0.072 0.66 1.10 1.974 0.25 2.00 4.24 8 0.141 0.326 0.120 0.74 1.76 2.925 0.31 2.56 5.20 8 0.259 0.408 0.240 0.94 2.20 3.54

Rame 10 0.47 3.52 9.6 12 0.171 0.720 0.100 1.45 4.40 6.4020 0.68 5.78 19.7 8 0.409 0.807 0.140 1.63 8.80 11.5250 1.30 12.57 48.9 10 0.560 1.569 0.200 3.15 22.00 25.10

Piombo 20 0.76 7.08 20.3 12 0.374 0.710 0.040 1.42 8.80 11.5240 1.82 17.56 41.7 10 1.063 2.350 0.080 4.70 20.20 20.7650 2.35 22.80 48.6 8 1.580 2.956 0.100 5.91 20.50 25.10

Nichel 25 0.75 5.84 24.4 10 0.528 1.080 0.350 2.26 11.00 13.9245 1.14 10.73 46.2 8 0.650 1.560 0.585 3.51 19.80 22.9450 1.24 11.95 49.7 10 1.024 1.937 0.800 4.01 22.00 25.10

Tabella confronto ripetibilità

Concentrazioni(µg/L)

DatiInterpolatiCircuitiUNICHIM

Ripetibilità Intermedia:N prove in doppio (settimane)

Incertezza taratura

Incertezza estesa

Dati UNI EN ISO15586 (Ottobre 2004)

Analita

σr 2σR X N Sr SI Tu

222 TIe uSU +=

X σr 2σR

Cadmio 2,5 0.15 1.16 2.57 11 0.110 0.351 0.072 0.66 2,7 0,051 0,57

Rame 20 0.68 5.78 19.7 8 0.409 0.807 0.140 1.63 22,5 0,855 2,52

Piombo 40 1.82 17.56 41.7 10 1.063 2.350 0.080 4.70 45 0,810 7,9250 2.35 22.80 48.6 8 1.580 2.956 0.100 5.91

Nichel 50 1.24 11.95 49.7 10 1.024 1.937 0.800 4.01 54 1,08 9,50



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Dati Publiacqua SpA - FirenzeCampione : Acqua del lago Ontario

MRC : TM-28.2. “ A low level fortified standard for trace elements” Produttore canadeseaccreditato: National Water Research Institute (NWRI)

Metodo : EPA Method 200.8Tecnica : ICP/MSApparecchiatura: Agilent ICP/MS 4500 Curva di taratura : retta

MRCRipetibilità intermedia :

N prove in doppio( 5 mesi)

Incertezzataratura

Incertezzaestesa

RelazioneThompson

CR 22,0=σ

RelazioneHorwitz

8495,002,0 CR =σAnalita

µ 2σR(µ) Xmedio

N Sr SI Tu 222 TIe uSU += 2σR 2σR

Cadmio 1,3 0,41 1,29 22 0,037 0,113 0,098 0,30 0,572 1.12

Rame 6,2 1,6 6,58 22 0,12 0,64 0,33 1,44 2,73 4.26

Nichel 11,1 1,61 10,95 24 0,17 0,55 0,18 1,15 4,88 6.98

Piombo 4,1 0,94 3,81 20 0,067 0,30 0,30 0,85 1,80 3.00



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Ripetibilità intermedia nel tempo con prova in doppio eseguita ogni giorno(riepilogo dati elaborati)

Documents

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