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ARBEITSTECHNIKEN IN DER PROTEINCHEMIE
Seminarunterlagen
http://www.univie.ac.at/ibmz/student/student1.htm
Probenvorbereitung und elementare Proteintrenntechniken
Trennparameter
Zucker: AffinitätschromatografieAcetyliert: Hydrophobic interaction chromatographyLipide….: Hydrophobic interaction chromatography
Oberflächen-modifikationen:
Metall-Chelat ChromatografieHistidin auf Proteinoberfläche
Fällungen, Adsorption, Hydrophobic interaction Chromat.Hydrophobizität
Fällungen, AdsorptionLadungsverteilung
Elektrophorese, IEF,Ionenaustauschchromatografie, Chromatofocussing
Ladung
DichtegradientenzentrifugationDichte
Ausschlusschromatografie, Gradientengel, SDSMasse
Ausschlusschromatografie, Gradientengel, SDSForm
Ausschlusschromatografie, Gradientengel, SDS, Dialyse, Sedimentations-v-zentrifugation
Größe
Verfahren mit hoher Kapazität(aber geringer Trennschärfe)
Präzipitation Dialyse Adsorption (Säulen)chromatographie
Hochauflösende Trennmethoden
Ionenaustauschchromatografie
(Gel)elektrophoreseGas-
chromatografieHPLC
Affinitätschromatografie
Wichtige Reinigungsparameter
biolog. Einheiten d. Proteins (charakt Rk)mg Proteingehalt
Spezifische Aktivität=
Gesamtaktivität= (spez. Akt.) (Gesamtgehalt an Protein d. Fraktion)
Ausbeute =(Recovery)
___Gesamtaktivität einer Fraktion____Gesamtaktivität d. ursprüngl. Gemisches
Reinigungsfaktor= Spez. Aktivität einer Fraktion__Spez. Aktivität des Gemisches
IDEALFALL: (spez. Aktivität)Probe nimmt zuRecovery = 1
Entscheidungen für den Trennvorgang:
• analytisch oder präparativ
• chemische, physikalische Eigenschaften einer Substanz
• Stabilität (Hofmeister Serie)
• vergleichbare Trennungen aus der Literatur
• Verfügbarkeit von Ausrüstung und Erfahrung
• Kosten
Trennparameter:Löslichkeit, M, Ladungen, Affinitäten, Stabilität,Form, Dichte, Ladungsverteilung, BiorecognitionenHydrophobizität, Oberflächenmodifikationen
RIVANOL (2-Ethoxy-6,9-diamino-acridin-lactat)
• Bei Raumtemperatur einsetzbar
• Entfernen durch Adsorption an Norit (aus Torf gewonnene Aktivkohle mit feinster Partikelkörnung und daraus resultierender großer Oberfläche für die Adsorption)
• Regenerierung: Elution
CHCH3
OHCOH
O
N
OC2H5
NH2
NH2
Fraktionierte FällungenMETHODEN UND AGENTIEN
1. Neutralsalze (Sulfate; Sulfite; Alkalimetall-, Ammonium- und Mg-phosphate; Glycin und ß-Alanin: dipolare Substanzen – Funktion wie Neutralsalze)
2. Hydrophile organische Lösungsmittel (Methanol, Ethanol, Aceton)
3. Gut wasserlösliche, nicht dissoziierbare Polymere (Dextran, Polyethylenglycol)
4. Schwermetallionen (Zn2+, Mn2+,…) und deren Hydroxide (Zn(OH)2)
5. Organische Kationen (Rivanol)
6. Organische Anionen (Pikrinsäure) und Polyanionen (Polyacrylsäure)
7. Entfernung von Elektrolyten (Entsalzen)
8. Immunochemische Methoden
!! Varianten: Fällen nahe am isoelektrischen Punkt!!
Wegen Reproduzierbarkeit zu beachten: Parameter (T, pH, Konzentration, Ionenstärke, ε des Mediums) sind unbedingt konstant zu halten!!!
Dialyse
Knots in end of dialysistubing
Pencil marked nametag
Stirring bar
Board or glass cover
Magnetic stirrer
Cloth, paperor rod heatbaffle to reduce heatflow fromstirrer
Hohlfaserdialyse
Detergentien in der Proteinchemie 1
• Primäreffekt bei Reinigung: Solubilisierung von schwerlöslichen Proteinen (z.B. Membranproteinen)
• Nützlich bei Vorbehandlung vor Chromatografie bzw. Elektrophorese (zur Hemmung von Aggregation)
• Zusatz bei Rekonstitution bzw. Rekristallisation von (Membran)proteinen
• Additive zu Imunoassays bzw. anderen nasschemischen Proteinassays
Anwendung:
Detergentien in der Proteinchemie 2a
• Definition: Detergentien sind Amphiphile und oberflächenaktiv, bilden Micellen (Unterschied zu anderen polaren Lipiden wie z.B. Cholesterin und Phospholipide), sind in Wasser signifikant löslich
• Die erreichbare Micellenstruktur (sphärisch, zylindrisch, invers) ist abhängig von: Monomerenstruktur, Temperatur, Druck, pH, Ionenstärke, Gegenwart von Verunreinigungen – Umwandlung von kugeligen zu zylindrischen Formen bei hoher Ionenstärke
• Praktisch wichtige Kenngrößen:Kritische Micellenkonzentration (= Konz. bei der Micellenbildung beginnt) Aggregationszahl (mittlere Anzahl von Monomeren pro Micelle) Kritische Micellentemperatur (Übergang des Det./Lösungsmittelsystems aus einem solvatisierten Zustand in eine isotrope micelläre Lösung – nur dann möglich, wenn kritische Micellentemperatur über dem Gefrierpunkt des Solvens liegt) Trübungspunkt ( jene Temperatur, bei der eine vorgewärmte 1% trübe Lösung beim Abkühlen klar wird -Übergang vom isotropen, micellaren System in ein Zweiphasensystem)Hydrophil-lipophil balance number (HLB) (Maß für Hydrophilie eines Detergens, Zahlenwerte aus empirischen Formeln bestimmt, Zahlenwerte diverser Gruppen im Molekül lassen Prognosen über den Grad der Hydrophilie zu)
Detergentien in der Proteinchemie 2b
0.5Hydroxyl (sorbitan ring)
1.3-O-
1.9 Hydroxyl (free )
-0.15-(CH2-CH2-CH2-O)-2.1-COOH
+0.33-(CH2-CH2-O)-2.4Ester (free)
Derived:6.8Ester (sorbitan ring)
-0.475=CH-9.4-N (tertiary amine)
-0.475CH3-19.1-COO-Na+
-0.475-CH2-21.1-COO-K+
-0.475-CH-38.7-SO4-Na+
Lipophilic:Hydrophilic:
Group number
GroupsGroup number
Groups
HLB Group Numbers:
Detergentien in der Proteinchemie 3
• Protein darf unter den gegebenen Arbeitsbedingungen nicht in Struktur und Aktivität beeinträchtigt werden (Temperatur, pH, Ionenstärke des Systems, mögliche Anfälligkeit des Proteins für Hydrolyse bzw. eigene hydrolytische Aktivitäten – Spaltung von Detergentien durch Lipasen zB)
• Detergentien ungeeignet wenn schwer entfernbar, schwer nachweisbar bzw. quantifizierbar oder Nachweisreaktionen stören
• Voraussagen für geeignetes Detergens meist schwierig – WW des polaren Teils mit dem Protein ® Vorversuche nötig
• Meist folgende Vorgangsweise zielführend:T, p, pH, Ionenstärke des Systems konstant halten, polaren Kopf, hydrophoben Teil und Detergenskonzentration variieren
Auffinden geeigneter Detergentien:
Detergentien in der Proteinchemie 4
• Optimierung des hydrophoben Teils:Die Reihen in der Tabelle 1 screenen – sollte dabei eine optimale Gruppe gefunden werden, die polaren Gruppen screenen
• Um die Effizienz der div. Detergentien festzustellen, bestimmt man die „kritische Micellenkonzentration“
Basis für Trial & Error (siehe Tab. 1):
Tabelle 1: Detergentien für systematischen Trial & Error
Big CHAPDeoxy BigCHAP
Digitonin
Triton X-114
Triton X-100Triton X-100 reduced
Dodecylglucoside
Dodecylmaltoside
C12E8
C12E9
C12E10
Decylglucoside
Decylmaltoside
(C10E10)b
Octylglucoside
MEGA-9
Octylthioglucoside
(C8E10)b
Nonionic
LDAO
Cationic/Nonionic
DTABCationic
CHAPS
Na-dodecylsulfate
Zwittergent 3-12
Empigen BBZwittergent 3-10
Zwittergent 3-08
Zwitterionic
Na-taurocholate
Na-tauro-deoxycholate
Na-cholate
Na-deoxycholate
Na dodecanesulfonate
Na-decanesulfonate
Na-octanesulfonateAnionic
Steroid-skeleton
p-tert-octylphenol
or
p-tert-octyl-cyclohexyl
C12C10C8
Tail group
Head group
Detergentien in der Proteinchemie 8Anionische Detergentien
Verwendung für:
Elektrophoresen
ElektrophoresenSolubilisierung nativer Membranproteine
Elektrophoresen
Elektrophoresen
Detergentien in der Proteinchemie 9
Kationische Detergentien: Verwendung:
ElektrophoresenPhasentransferkatalysator
Zwitterionische Detergentien:
ElektrophoresenSolubilisierung nativer Membranproteine
ElektrophoresenSolubilisierung nativer Membranproteine
Elektrophoresen
Detergentien in der Proteinchemie 10Nichtionische Detergentien: Verwendung:
ElektrophoresenSolubilisierung nativer Membranproteine
ElektrophoresenSolubilisierung nativer Membranproteine
Elektrophoresen
Elektrophoresen
ElektrophoresenSolubilisierung nativer Membranproteine
ElektrophoresenSolubilisierung nativer Membranproteine
Detergentien in der Proteinchemie 11Strukturbeziehungen für verwendete Detergentien:
R: geradkettiges AlkylB: GallensalzrestT-R: tert. OctylgruppeCnEm: AlkylethoxylateCn: PolysorbateEm: Sorbitan
n: Zahl der C in der Alkylgruppe m: Zahl der Oxyethylengruppen
Detergentien in der Proteinchemie 5
Solubilisierung nativer Membranproteine 1
Voraussetzungen:
• Auswahl des geeigneten Detergens (darf nicht denaturieren)
• geeignete Solubilisierungsbedingungen z. Entfernen des Detergens
• Kenntnis der spektralen Eigenschaften: falls Routinemessungen bei 245 oder 280 nm oder höher nötig sind (Säulenchromatografie zB) –welche Detergentien stören in diesem Bereich (alle mit aromatischen Gruppen zB Triton X100, Triton N101) – hier günstig: Alkylpolyether (zB Brij, Lubrol), Gallensalze und Derivate incl. CHAPS und CHAPSObei 206-210 nm stören alle Detergentien mit Alkohol, Amid, Säure, Basengruppen. Problemlösung: sehr reine Detergentien benützen und minimale Detergenskonzentration in allen Elutionspuffern
Detergentien in der Proteinchemie 5
Solubilisierung nativer Membranproteine 2
• Kenntnis der Kompatibilität mit divalenten Kationen:langkettige Carbonsäuren vermeiden (präzipitieren mit divalenten Kationen) wenn solche in Proteinlösung nötig sindungünstig ebenfalls N-Laurylsarcosinat, Gallensalze und Derivate mit COOH Gruppen(CHAPS, CHAPSO, Taurinderivate der Cholsäure u. Desoxycholsäurepräzipitieren nicht!!)
• Kenntnis des Einflusses von pH auf Löslichkeit und Detergentieneigenschaften:wichtig bei Aufreinigung, wo pH Änderungen als Trennparameter benutzt werden (isoelektrische Fokussierung, pH- Gradienten Ionenaustauschertrennung, Chromatofocussing Techniken): in den benötigten pH Bereichen darf sich der Ladungszustand des Detergens nicht ändern!!-COO- (Gallensalze, N-Laurylsarcosinat) protonieren und werden unlöslich bereits bei relativ schwach saurem pHpolare Gruppen mit stärkeren Säuren (Sulfonsäuren, Sulfatester: pKa 0-2): relativ unkritischschwach basische Gruppen (Imidazolderivate, div. primäre Amine) ungünstig bei pH Erhöhung
Detergentien in der Proteinchemie 5
Solubilisierung nativer Membranproteine 3
• Kenntnis der Temperatureffekte:wichtig für nichtionische Polyoxyethylenether (Triton X100, Lubrol PX): charakteristische T- abhängige Änderungen der MicellengrößeSteigt die Temperatur linear, wachsen die Micellen exponentiell ® ab einerbestimmten Temperatur Bildung einer nichtwässrigen Phase – kann alsExtraktionstrick genutzt werden, aber bei Elphos Probleme machen!Möglichst auf Temperaturkonstanz achten oder andere nichtionische oderzwitterionische Detergentien benutzen.
• Kenntnis der elektrischen Eigenschaften:nichtionische und zwitterionische Detergentien mit weitauseinanderliegenden pK der funktionellen Gruppen verhalten sichungeladen, wandern nicht im elektrischen Feld, binden nicht an Ionenaustauscher, tragen bei Bindung an Makromoleküle keine zusätzlicheNettoladung bei ® gut geeignet für Ionenaustauschchromatografie und präparative Elphos
Detergentien in der Proteinchemie 5
Solubilisierung nativer Membranproteine 4
• Pufferwahl: für Löslichkeit und Stabilität entscheidend, meist genügen 20-50mM, Phosphatpuffer besonders gut geeignet; höhere Konzentrationen (0,1-0,5 M) können totale Löslichkeit von Membranproteinen erhöhen!
• Ionenstärke: Membranproteine neigen zu ionischen und hydrophoben WW ® günstig 150mM NaCl in den üblichen Puffern, falls das nicht reicht bismax. 0,5M steigern
• Harnstoff oder chaotrope Ionen (Guanidin/HCl): zum Puffer zugebenbei besonders intensiven Protein/Protein WW (Struktur- od Skelettproteine) Interaktionen zwischen Chaotrop und Detergentien möglich:Harnstoff: Komplexbildung mit nichtionischen Detergentien (ev Störungenbei Chromatografie); Nichtionische Detergentien und lineareAlkylsulfobetaine bei geringen Guanidin/HCl Konzentrationen unlöslich! In diesen Fällen gut geeignet: CHAPS und hohe Guanidin/HClKonzentrationen
Detergentien in der Proteinchemie 5
Solubilisierung nativer Membranproteine 5
•Glycerin: oft in Puffern (5-50% v/v) ® Änderung von Viskosität und Dichte, beeinflusst Ultrazentrifugation und Säulenchromatografie(Quell/Schrumpfverhalten – Vorsicht bei FPLC und HPLC Säulen!)
•Solubilisierungskriterien bei Membranproteinen:Sehr geringe Detergensmengen: Bindung an die Membran möglichDetergens/Membranverh=1:10 kritische Konzentration der Membranlyse
erreicht – Bildung von Membransegmenten mit incorporiertenDetergensmolekülen
Detergens/Membranverh=1:1 Membransegmente kleiner, Beginn der Bildungvon Detergens assoziiertem Protein
Detergens/Membranverh=10:1 bis 20:1 meist individuelle Detergens/Protein und Detergens/Lipidkomplexe gebildet.
!!Optimale Detergenskonzentration experimentell bestimmen ® zu geringe
Konzentration kann zu schlechten Ausbeuten führen!!
Detergentien in der Proteinchemie 6Start eines Solubilisierungsexpriments
1. Präparation einer geeigneten Membranfraktionsstammlösung ®suspendieren (ca. 5mg/ml) im gewählten Solubilisierungspuffer(Proteasehemmer nicht vergessen)
2. Präparation einer Detergensstammlösung (10%v/v bzw 0,1M falls Molmassebekannt), frisch herstellen
3. Konzentrationsreihe herstellen: nichtionische Detergentien: 0,01-5%v/v, Gallensäuren und Derivate: ca 0,1-50mM
4. Proteinsolubilisierung:Experimentelle Messpunkte möglichst als Triplikate
0,5ml Membranstammsuspension bei 4°C0,5ml aus der Detergens Verdünnungsreihe
beides 1 Stunde bei 4°C unter Rühren inkubieren (ohne zu schäumen!) ®Zentrifugation (105 000g) 1Stunde bei 4°C
5. Bestimmung der solubilisierten Proteine: Klaren Überstand vom Pellet trennen, möglichst beides auf gesuchte Proteine testen.
Detergentien in der Proteinchemie 7Solubilisierung von Proteinaggregaten 1
• Protein-inclusion bodies gebildet durch massive Expression geklonter Gene• Ursache noch unbekannt, Parallelen mit Zellen in denen Heat Shock
Proteine induziert werden• Großteil der Proteine in inclusion bodies denaturiert – (reduzierende
Nachbarschaft des Cytoplasmas, Dimere und Multimere, hydrophobe WW) –zur Solubilisierung starke Solventien nötig wie z.B.Guanidin/HCl (5-8 M)Harnstoff (6-8 M)SDSpH>9Acetonitril/Propanol
• Refolding zur Rückbildung der korrekten Konformation:Disulfidbrückenbildung u andere destruierende Aggregationen vermeidenmöglichst geringe ProteinkonzentrationenFremdproteine, irreversibel inkorrekt gefaltetes Protein u Nucleinsäurenentfernen (Ionenaustauscher, ev. HPLC)
• Je größer die inclusion bodies, umso geringere Verunreinigungen zu erwarten!!
Detergentien in der Proteinchemie 7Solubilisierung von Proteinaggregaten 2
• Solubilisierung, natives Falten und Reinigen von Proteinen in „inclusionbodies“:1. Zell-Lyse2. Isolation der inclusion bodies3. Solubilisierung der Proteine4.Refolding der solubilisierten Proteine
• Harnstofflösungen immer frisch und mit reinstem Wasser bereiten, kühl aufbewahren (sonst Cyanat-Bildung!)Guanidin/HCl (6M) reinst!!, pH mit HCl conc auf 7-8 gestellt
• Zellaufbrechen unter Erhaltung der inclusion bodies:UltraschallFrench PressLysozym/Detergens Behandlung
• Zentrifugation (10000-20000g, 20 min, 4°C); falls Überstand im Mikroskop noch inclusion bodies zeigt, weiterzentrifugieren (25 000g, 15 min), Pellet in Wasser resuspendieren
Detergentien in der Proteinchemie 7Solubilisierung von Proteinaggregaten 3
• Waschen:* Lysozym (0,2mg/ml) / 1M EDTA / Desoxycholat (1mg/ml): Proteine bleiben unlöslich, Nucleinsäuren, Phospholipide, Lipopolysaccharideentfernt*Variante: Lysozym / EDTA/ DNAse / TritonX100*Wäscht man inclusion bodies mit bis zu 4M Harnstoff, so werden überwiegend Verunreinigungen gelöst, Wunschprotein bleibt meist zurück
• Solubilisierung: genaue Technik für jedes Protein ist neu zu entwickelnFolgende Variable dabei durchtesten, nachdem laut Tab. 1 optimales Solubilisierungsagens gefunden wurde:pHInkubationstemperaturEinwirkzeit des SolvensIonische Komponenten des SolvensKonzentration des SolubilisierungsagensProtein-TotalkonzentrationVerhältnis Solubilisierungsagens/ProteinAn- bzw Abwesenheit von Redoxagentien; Derivatisierung von Thiolgruppen
Detergentien in der Proteinchemie 7Solubilisierung von Proteinaggregaten 4
• Refolding: kann begonnen werden nachdem das Pellet solubilisiert istFolgende Parameter beachten:pHInkubationstemperaturZeitIonische Komponenten des SolvensUmstellungszeit beim Überführen aus den Solubilisierungsbedingungen auf das RefoldingambienteReinheit des WunschproteinsKonzentration des WunschproteinsAn- bzw. Abwesenheit von Redox-Agentien
Detergentien in der Proteinchemie 7Solubilisierung von Proteinaggregaten 5
• Solubilisierung von Hybrid-Protein-Aggregaten:werden oft hergestellt um die Expressionsrate zu steigern ® Hybridproteinin vitro spalten um Wunschprotein zu erhalten. Die geeignete Spaltstelle(direkt vor dem N-Terminus) schon vor der Hybrid-Genkonstruktionüberlegen (Spaltstelle darf innerhalb des Wunschproteins nicht oder nur an gut abgeschirmter Stelle enthalten sein!!)
• Spaltungsmethoden: chemisch oder enzymatischProtein muss soweit solubilisiert sein, dass die Spaltstelle ausreichendexponiert istextrem saure Bedingungen können Polypeptide sowohl solubilisieren alsauch hydrolysierenSpaltungsbedingungen: (meist nach Aspartat)30 mM HCl im Vakuum, 105°C, 20 Std – falls nicht ausreicht ®6M Guanidin/HCl in 70% HCOOH, 37°C, 72 Std, Proteinkonz. 0,85-1 mg/mlwenn kein Met im Wunschprotein: Met an Spaltstelle – Selektive Spaltungmit BrCN durchführbar (Vorsicht!! Wird meist in Gegenwart von HCOOH gemacht – HCN Entwicklung!!)
Detergentien in der Proteinchemie 7Solubilisierung von Proteinaggregaten 6
• Enzymatische Spaltung: Hybridprotein soll > 80% rein sein
• Strategien:1. Solubilisieren des Hybridproteins - enzymat. spalten in Gegenwart der
SolubilisierungsagentienProteasen wie Clostripain halten 4M Harnstoff aus, Carboxypeptidase 5M
2. Refolding des solubilisierten Hybrids – Entfernen der Solubilisierungsagentien – enzymatische Spaltungoft entsteht dabei ein falsch gefaltetes Hybrid
• Reinigung gelöster Proteinaggregate:nach den typischen Waschprozeduren stringente SolubilisierungstechnikenanwendenWeitere mögliche Techniken: Chromatografie, die diese Bedingungen aushält (Tabelle 3)
Detergentien in der Proteinchemie 7Solubilisierung von Proteinaggregaten 7
• Befreien von Membranproteinen von Detergentien nötig:- nach der Solubilisierung von Membranen vor Chromatografie falls störend- bei Detergenswechsel z.B. Adsorption des Detergens/Membranproteinkomplexes ® waschen mitPuffer, der das neue Detergens enthältGelfiltration oder Dialyse
• - am Ende der Reinigungsprozedur um Analytik oder Charakterisierung nicht zu beeinträchtigen (Membranproteine in wässrigen Medien unlöslich!)Detergens enthaltenes Medium durch ein Solvenssystem ersetzen, das die
Analytik nicht stört z.B.Adsorption des Detergens* auf hydrophoben MaterialienPräzipitation mit PolyethylenglycolChromatografie auf diversen hydrophoben oder “reversed phase”-Materialien
* Überschüssiges Detergens
Detergentien in der Proteinchemie 7Solubilisierung von Proteinaggregaten 8
• Sequenzieren von durch SDS Elpho gewonnenen Proteinen:SDS vor der Sequenzierung durch Elektroelution entfernen
• Anwesenheit von ionischen Detergentien in Proben die isoelektrischfokussiert werden sollen:Zugabe von TritonX100 Überschuss (oder anderen nichtionischen Detergentien) – hier keine weitere Reinigung nötig
• Entfernen von Cholat vor HPLC:Bedingungen suchen die Cholat gegen anderes nichtionisches Detergensauf der Säule austauschen, gut waschen, eluieren mit Ionenstärke- oder pHGradienten
• Detergensaustausch durch Chromatografie:a) Adsorption des Membran/Detergens/Proteinkomplexes an das Chromatografiematerial (Lectinsäulen für Glycoproteine, Ionenaustauscher) ® ausgiebig waschen (20 Säulenvolumina) mit neuem Detergens in Puffer (Bildung gemischter Micellen ) ® anschließend Gradientenelution (Zuckerbzw. Salze)
Detergentien in der Proteinchemie 7Solubilisierung von Proteinaggregaten 9
• Detergensaustausch durch Chromatografie:b) Gelfiltrationschromatografie:Stokes‘scher Radius der Detergensmicellen, Detergens-Lipid-Mischmicellenund Protein-Detergens-Komplexee meist deutlich unterschiedlichSäule mit Zieldetergens equlibrieren ® Proteinprobe mit ursprünglichemDetergens chromatografieren ® nach Elution meist >90% der Proteine imneuen Detergens
• Dialyse:ohne Detergensaustausch fallen Proteine z. Teil aus – wie gut dialysierbarabhängig von kritischer Micellenkonz und Molekulargewicht der MicellenKritische Micellenkonz Maß für Menge an freiem Detergens in der Mischung– Detergensmicellen und Protein-Detergenskomplexe meist zurückgehalten– Adsorbentienzugabe für Detergens empfohlen (Ionenaustauscher fürgeladene, hydrophobe Adsorption für ungeladene)
• Präzipitation: Fällung von Membranproteinen mit Polyethylenglycol:(MW 4000-6000, größere PEG unnötig, machen Lösung nur viskoser)praktisch nicht denaturierend, nicht temperaturabhängig, rascheGleichgewichtseinstellung, auch für das Züchten von Proteinkristallen
Detergentien in der Proteinchemie 7Solubilisierung von Proteinaggregaten 10
Solubilisierung von Mausleber-mikrosomen durch CHAPS:Differentielle Zentrifugation des homogenisierten Gewebes (150mM KCl, 10mM EDTA, pH7,25, 4°C)Solubilisierungsexperimente:Proteinmenge verdünnt (Insert) mit angegebenen CHAPS Konz und Endkonz von 20% (v/v) Glycerol, 0,1M Kaliumphosphatpuffer pH 7,25
5ml Aliquote inkubiert (30 min, 25°C), bei 105000g, 25°C 2Std zentrifugiert
% Cytochrom P450 beziehen sich auf den gesamten Gehalt in den intakten MikrosomenMessung durch A450-A490 im reduzierten vs reduziertem+CODifferenzspektrum
Säulenchromatografie 2
Niedrige Salzkonzentration Hohe Salzkonzentration
Magnetrührer
Fraktionssammler
Lineare Gradientenelution
Gradienten starten:
1. Gleiche Mengen Flüssigkeit in die Becher füllen
2. Flüssigkeiten ins Y-Stück hochziehen und Klemme schließen
3. Magnetrührer starten
4. Flüssigkeit durch die Säule tropfen lassen
Y-Stück mit Schlauch und Klemme