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Tratamientos biológicos de sueloscontaminados: contaminación porhidrocarburos. Aplicaciones de hongosen tratamientos de biorrecuperaciónCarmen Martín Moreno1, Aldo González Becerra2 y María José Blanco Santos1

1CIEMAT y 2CIB-CSIC, Madrid, España

La biodescontaminación es un proceso espontáneo o dirigido en el cual mediante procedimientos biológicos, fundamentalmente microbiológicos, se degradan o transforman los contaminantes hasta formas menos tóxicas o no tóxicas y se mitiga, como consecuencia, la contaminación ambiental.Algunos de los parámetros más importantes a tomar en consideración para lacaracterización de un emplazamiento contaminado, incluyen labiodegradabilidad, la distribución del contaminante en las distintas fases, el potencial de lixiviación, la reactividad química de los contaminantes, el tipo y propiedades del suelo, la disponibilidad de oxígeno y la presencia o ausenciade sustancias inhibidoras. La utilización de la capacidad de degradación de los microorganismos es la base fundamental de los tratamientos biológicosde contaminaciones orgánicas. En consecuencia, el conocimiento de lascaracterísticas fisiológicas y bioquímicas así como de la ecología y genética de las especies o consorcios microbianos involucrados, es un requisitoesencial, junto con el conocimiento de la naturaleza del emplazamiento y laelección de un protocolo adecuado, para lograr el objetivo de dichostratamientos. Los hongos basidiomicetos ligninolíticos producen un conjunto de enzimas extracelulares para metabolizar la lignina que les confieren,asimismo, la capacidad de degradar un amplio abanico de contaminantes. La aplicación de estos hongos para tratar y recuperar espacios contaminadostiene un interés creciente. Esta revisión recoge diversos aspectos de lastecnologías de biorrecuperación y de los avances en el conocimiento delmetabolismo ligninolítico.

Biodescontaminación, Hongos ligninolíticos, Degradación de lignina,Contaminantes orgánicos persistentes

Biological treatments of contaminated soils:hidrocarbons contamination. Fungal applicationsBioremediation is a spontaneous or controlled process in which biological,mainly microbiological, methods are used to degrade or transform contaminantsto non or less toxic products, reducing the environmental pollution. The most important parameters to define a contaminated site are:biodegradability, contaminant distribution, lixiviation grade, chemical reactivityof the contaminants, soil type and properties, oxygen availability andoccurrence of inhibitory substances. Biological treatments of organiccontaminations are based on the degradative abilities of the microorganisms.Therefore the knowledge on the physiology and ecology of the biologicalspecies or consortia involved as well as the characteristics of the polluted sitesare decisive factors to select an adequate biorremediation protocol.Basidiomycetes which cause white rot decay of wood are able to degrade ligninand a variety of environmentally persistent pollutants. Thus, white rot fungi andtheir enzymes are thought to be useful not only in some industrial process likebiopulping and biobleaching but also in bioremediation. This paper provides areview of different aspects of bioremediation technologies and recent advanceson ligninolytic metabolism research.

Bioremediation, White rot fungi, Lignin degradation, Persistent pollutants

Resumen

Palabras clave

Summary

Key words

Dirección para correspondencia:Dr. Aldo Gonzalez BecerraDpto. de Microbiología Molecular, CIB-CSICRamiro de Maeztu, 928040 Madrid, EspañaFax: +34 915 360 432Correo electrónico: aldo@cib.csic.es

©2004 Revista Iberoamericana de MicologíaApdo. 699, E-48080 Bilbao (Spain)1130-1406/01/10.00 Euros

Revisión

Cuando se empezó a actuar sobre los espacios con-taminados a comienzo de los años 1980, el método solíaconsistir en retirar los residuos y/o suelo contaminado a unvertedero o cubrirlos con una capa impermeable (confina-miento). Más tarde, se planteó la necesidad de desarrollaralternativas para solucionar de forma más permanente ymenos costosa el problema de los espacios contaminados.En consecuencia, el desarrollo y uso de tecnologías másapropiadas para el tratamiento de suelos contaminados haavanzado mucho y en la actualidad es un tema de graninterés por sus repercusiones económicas y sociales.

La rápida expansión y la sofisticación creciente dediferentes sectores industriales, fundamentalmente en losúltimos treinta años, se ha traducido en un incremento dela cantidad y la complejidad de residuos tóxicos. Al mismotiempo, se ha ido desarrollando una conciencia social deeste peligro que lentamente va forzando el establecimientode legislación para reducir la producción de residuos con-taminantes y prevenir el escape de los mismos al mediocircundante. Algunos accidentes que han supuesto un ele-vado impacto ambiental como el vertido de combustibledel Exxon Valdez, la liberación de productos radiactivostras el accidente de la central nuclear de Chernobil, larotura de la presa de Aznalcóllar o la reciente catástrofeecológica producida por el vertido del petrolero Prestigefrente a las costas gallegas, han puesto de manifiesto lajustificada preocupación y alarma que estos temas suscitanen el conjunto de la población y lo mucho que queda porhacer para prevenir o resolver adecuadamente ese tipo desituaciones.

Entre las posibles técnicas de tratamiento aplicablespara la descontaminación de un determinado espacio natu-ral, merecen especial atención los procesos de degradaciónbiológica ya que son útiles para muchos tipos de residuosorgánicos, son procesos naturales que no suponen unimpacto adicional sobre los ecosistemas y que se puedenrealizar a un bajo coste. En muchos casos, pueden llevarsea cabo en el sitio donde se ha producido la contaminación,con lo cual se elimina la necesidad de transportar materia-les peligrosos. Los tratamientos de biodescontaminaciónse basan en la acción de microorganismos o plantas sobrelos productos contaminantes.

El resultado final de un tratamiento de biodegrada-ción depende en gran medida de la toxicidad y la concen-tración inicial de los contaminantes, su biodegradabilidad,las propiedades del suelo contaminado y el sistema de tra-tamiento seleccionado.

Los contaminantes tratados habitualmente por estosmétodos son los compuestos orgánicos volátiles y semivo-látiles no halogenados y los derivados del petróleo. Cuan-do la contaminación incluye altas concentraciones de me-tales, compuestos orgánicos con alta proporción de cloro osales inorgánicas, la eficacia del tratamiento se reducedebido a la toxicidad microbiológica de estos compuestos.

Aunque el esfuerzo social y las políticas en mate-ria ambiental deben continuar por la vía de la presión alsector industrial para que se reduzca la producción de residuos tóxicos, la biotecnología ofrece buenas perspecti-vas para descontaminar los efluentes industriales. Losmicroorganismos pueden ser modificados para producirprincipalmente determinadas enzimas que contribuyan ametabolizar los compuestos producidos como consecuen-cia de la actividad industrial y que son tóxicos para otrasformas de vida. Incluso, se pueden diseñar rutas metabóli-cas alternativas para la biodegradación de residuos com-plejos. Puesto que el tratamiento de residuos es una activi-dad industrial establecida, la genética y la enzimologíapodrían unirse a la experiencia de la ingeniería en estecampo.

Como es evidente, el proceso biológico para tratarlos compuestos tóxicos, debe competir con los métodosexistentes en términos de economía y eficiencia. Los pro-cesos biológicos tienen las ventajas de requerir inversionesde capital moderadas, bajo consumo de energía, ser am-bientalmente seguros y no generar residuos.

En los últimos años, se han creado una serie deempresas para desarrollar y comercializar las tecnologíasde biodegradación. La existencia de estas compañías sejustifica desde el punto de vista económico por el aumentodel coste de los tratamientos tradicionales y del rechazosocial a los mismos, así como por el endurecimiento de lasnormativas en materia de residuos y medioambiente. Eldesarrollo futuro de las técnicas de recuperación biológicade espacios contaminados, requiere la adecuada integra-ción de microbiología molecular e ingeniería de sistemas.

El tratamiento de recuperación biológica fue yaensayado a gran escala, con motivo de la contaminaciónpor petróleo ocasionada por el vertido al mar del buquepetrolero Exxon Valdez. Algunos microorganismos puedenutilizar derivados del petróleo como fuente de carbono y muchos de ellos producen surfactantes, que puedenemulsionar los aceites en el agua y facilitar su eliminación.A diferencia de los surfactantes químicos, los de origenmicrobiológico son inocuos y biodegradables. También sehan utilizado, en ocasiones, fertilizantes para incrementarla tasa de crecimiento de las poblaciones autóctonas capa-ces de degradar compuestos derivados del petróleo.

El uso de microorganismos no está restringido úni-camente al tratamiento de compuestos orgánicos. En algu-nos casos, los organismos seleccionados pueden tambiénreducir los cationes tóxicos de los metales pesados (comoel selenio), a la forma elemental menos soluble y menostóxica. Por lo tanto, el tratamiento biológico puede tam-bién aplicarse a las aguas superficiales contaminadas pormetales pesados.

Técnicas para tratamiento de emplazamientoscontaminados

La recuperación de un espacio contaminado puedeabordarse mediante diferentes estrategias [73, 85] que, engeneral, se pueden agrupar en tres categorías: confina-miento, limpieza y estrategia de respuesta.

El confinamiento tiene como finalidad el aisla-miento de la fuente contaminante, evitando la salida delíquidos (lixiviados), polvo o gases; es decir controlando ladispersión de la contaminación. Es el tratamiento que seaplica habitualmente en el caso de contaminaciones pro-vocadas por los vertederos incontrolados de residuosindustriales. Las medidas que incluye generalmente estetipo de actuación son: recubrimiento, revegetación, controlde aguas de escorrentía superficial y control de lixiviadosy aguas subterráneas.

La limpieza incluye la aplicación de una o variastecnologías para eliminar los contaminantes del suelo. Sedistinguen tres tipos de tratamiento: 1) tratamiento in situdel suelo contaminado, 2) excavación del emplazamientocontaminado, retirada del suelo afectado y tratamiento ex situ del mismo y 3) excavación, retirada y depósito envertedero controlado. En el primer caso, la contaminaciónse trata en el lugar en el que se ha producido y en elsegundo caso hay que proceder a una excavación del suelocontaminado o a un bombeo del agua contaminada antesde proceder a su tratamiento. En general, el tratamiento in situ es menos costoso y permite que se utilice el espa-cio durante el mismo, por lo que se aplica cada vez conmás frecuencia a pesar de que habitualmente requiere lar-gos períodos de tiempo [21,48,65,98].

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La estrategia de respuesta es un tratamiento a largoplazo que incluye actuaciones diversas y modificables en función de una primera evaluación de la situación y dela evolución de la misma durante el tratamiento. Se sueleelegir, cuando las aguas subterráneas ya se han contami-nado. Las aguas contaminadas pueden tratarse mediante:a) extracción por bombeo seguida de tratamiento en el propio emplazamiento, por técnicas convencionales aplica-bles a aguas residuales industriales, b) tratamiento in situmediante muros de tratamiento y c) dilución o desvío de lacontaminación, mediante inyección de agua limpia utili-zando sistemas de pozos.

Los métodos existentes para tratar los suelos conta-minados pueden ser de naturaleza física, química o bioló-gica y tanto unos como otros pueden aplicarse en el lugarde la contaminación o como tratamiento ex situ. A conti-nuación, se incluye una clasificación de las diferentes téc-nicas empleadas, agrupadas según su naturaleza y la formade aplicación.

1. Tratamientos in situ– Fisicoquímicos:

a) Extracción con vaporb) Lavadoc) Solidificación y estabilizaciónd) Separación electrocinética

– Biológicos:a) Biodescontaminaciónb) Fitodescontaminación

2. Tratamientos ex situ– Térmicos:

a) Desorción térmicab) Incineración

– Fisicoquímicos:a) Extracción con disolventesb) Lavadoc) Oxido-reducciónd) Deshalogenación químicae) Solidificación y estabilización

– Biológicos:a) Laboreo agrícolab) Biopilasc) Biodegradación en reactor

El tratamiento biológico mediante plantas (fitodes-contaminación) implica el uso de vegetales superiores pararetirar, contener, acumular o degradar los contaminantesambientales del suelo, aguas subterráneas, aguas superficia-les, sedimentos y aire. Esta definición se aplica a todos losprocesos biológicos, químicos y físicos sobre los que pue-den influir las plantas (incluyendo la rizosfera con hongos)y que ayudan en la limpieza de espacios contaminados.Las plantas pueden ser usadas en la descontaminaciónaprovechando su capacidad de mineralizar determinadoscompuestos tóxicos o de acumular y concentrar metales pe-sados y otros compuestos inorgánicos del suelo [41,58,80].

El tratamiento microbiológico de espacios contami-nados, que es el que se va a abordar en mayor profundidaden este trabajo, se basa en la capacidad de diversos micro-organismos, ya sean levaduras, hongos o bacterias pararomper o degradar sustancias peligrosas convirtiéndolas enproductos menos tóxicos o inocuos.

Algunos microorganismos pueden metabolizar pro-ductos como combustibles o disolventes, que constituyenun riesgo para la salud humana y para los ecosistemas enlos que son vertidos. Una vez que los contaminantes sondegradados, la población microbiana decrece, al consu-mirse lo que constituía su fuente nutritiva.

Los microorganismos deben tener un estado vigo-roso, para que se produzca su crecimiento sobre los pro-ductos contaminantes. El objetivo de las técnicas de re-cuperación biológica, es la creación de las condicionesambientales óptimas para que los micoorganismos se pue-dan desarrollar adecuadamente y provocar la máxima des-toxificación. La tecnología específica empleada en cadacaso, depende del tipo de microorganismos de que se trate,de las condiciones del espacio contaminado y de la natu-raleza y cantidad de contaminante o contaminantes. Dis-tintos microorganismos degradan diferentes tipos de com-puestos y sobreviven en diferentes condiciones.

Los microorganismos denominados endógenos, sonaquellos que se encuentran formando parte del ecosistemaque se pretende descontaminar. Para estimular el creci-miento de estos microorganismos y forzar la degradaciónde los contaminantes, puede que sea necesario establecerunas condiciones de temperatura, oxigenación y contenidode nutrientes determinadas.

Cuando en el ecosistema no esté presente la activi-dad biológica que se requiere para degradar la contamina-ción producida, pueden incorporarse microorganismos deotra procedencia cuya eficacia haya sido probada anterior-mente. En este caso, se habla de microorganismos exóge-nos. Cuando esto sucede, hay que asegurarse de que lascondiciones de este nuevo emplazamiento permitirán eldesarrollo de la microflora incorporada.

El tratamiento biológico del entorno contaminado,puede tener lugar en condiciones aerobias o anaerobias. Enambos casos, los productos intermedios que se formancomo consecuencia del metabolismo microbiano, puedenser menos, igual o más contaminantes que los originales.

Antes de profundizar en las técnicas biológicas delas que se dispone en la actualidad para proceder a la lim-pieza de un espacio contaminado por algún compuestoorgánico recalcitrante, conviene hacer una breve referenciaa lo que se denomina proceso de atenuación natural y queengloba las diversas reacciones naturales que tienen lugaren un espacio, concretamente un suelo, después de produ-cida la contaminación.

Procesos de atenuación natural

La atenuación natural se puede describir como elconjunto de procesos físicos, químicos y biológicos, queespontáneamente ocurren en un espacio determinado, conposterioridad a la aparición de la contaminación en elmismo. En condiciones favorables, la atenuación naturalreduce, sin la intervención humana, la masa, la toxicidad,la movilidad, el volumen o la concentración de contami-nantes en suelo o agua subterránea [104]. Este procesoincluye diversos mecanismos tales como dispersión, dilu-ción adsorción, volatilización, estabilización y transforma-ción o destrucción de contaminantes por vía química obiológica. En general, se puede considerar que en un pro-ceso de atenuación natural, intervienen o pueden intervenirlos cinco grupos de mecanismos siguientes:

1. Biodegradación.2. Transformación química (por ejemplo, hidrólisis

y deshalogenación). La tasa de transformaciónquímica depende de diferentes variables talescomo pH, temperatura y naturaleza del contami-nante.

3. Estabilización. Los contaminantes quedan quí-micamente ligados por un agente estabilizante(por ejemplo, arcilla y materiales húmicos) y sedificulta o impide su migración.

105Tratamiento de suelos contaminados con hongosMartín Moreno C, et al.

4. Volatilización. Puede contribuir al proceso deatenuación natural mediante transferencia deVOC (compuestos orgánicos volátiles) desde elagua subterránea hacia la zona de vadosa o laatmósfera pero es comparativamente un compo-nente menor de la atenuación natural.

5. Dispersión y dilución. Asumiendo que la fuentede contaminación cesa, a medida que la plumade contaminante se mueve vertical y lateral-mente desde el punto inicial, se dispersa la con-taminación y disminuye la concentración delcontaminante.

La atenuación natural es considerada, en algunoscasos, una alternativa aceptable en comparación con otrosmétodos más activos, siempre y cuando se puedan cumplirunos objetivos de descontaminación en un intervalo detiempo aceptable. En la figura 1, se representa, en esque-ma, un proceso natural de atenuación.

Uno de los componentes más importantes de la ate-nuación natural es la biodegradación. Muchos de las frac-ciones de los hidrocarburos del petróleo, más significati-vas desde el punto de vista ambiental, tales como BTEX(benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos) y algunos PAH(hidrocarburos policíclicos aromáticos) pueden ser degra-dadas en condiciones ambientales adecuadas. Sin embar-go, otros PAH, el MTBE (metil, terbutil éter, un aditivo dela gasolina) y diversos componentes de los hidrocarburosdel petróleo no son fácilmente biodegradables. En térmi-nos generales, los hidrocarburos del petróleo que son másmóviles en el ambiente (excepto el MTBE), son tambiénlos más fácilmente biodegradados. Una vez que los hidro-carburos más móviles son degradados, los hidrocarburosresiduales pueden suponer también un alto riesgo en losalrededores del área en los que permanecen.

La capacidad real del fenómeno de atenuaciónnatural para promover la descontaminación de un empla-zamiento determinado, depende de que uno o más de losmecanismos anteriormente citados puedan funcionar a lavelocidad suficiente como para evitar que la pluma decontaminación alcance un receptor. Por lo tanto, hay querealizar un estudio previo para identificar los siguientesaspectos:

1. Las características del suelo, tales como tipo,conductividad hidráulica y contenido orgánico.

2. Características del las aguas subterráneas, talescomo dirección, gradiente y velocidad de flujo,temperatura, pH y oxígeno disuelto, dentro yfuera de la pluma.

3. Grado de contaminación vertical y horizontal enel suelo y el agua, comportamiento histórico dela pluma y capacidad de atenuación de la plumaen las condiciones del emplazamiento.

4. Una revisión detallada de receptores y vías demigración, en el área geográfica del emplaza-miento.

Sin embargo, en muchos casos, la atenuación natu-ral no va a producirse con la celeridad y eficacia suficien-tes para evitar los riesgos, para la salud humana o elambiente, derivados de la existencia de un espacio conta-minado y es necesario realizar actuaciones de saneamientoo recuperación.

Tratamiento biológico in situ de suelos contaminados

El tratamiento in situ no requiere excavar y retirarel suelo contaminado, por lo cual provoca menos libera-ción de polvo y contaminantes y permite descontaminarmayor volumen de suelo por tratamiento que las técnicasex situ. En este caso, el propio suelo funciona como unreactor biológico. Tiene otros inconvenientes como mayorlentitud, dificultad de mantener las condiciones y depen-dencia del tipo de suelos, que deben ser permeables si sequiere asegurar un buen rendimiento del proceso.

En este tipo de tratamiento se persigue la adecuadaoxigenación y aporte de nutrientes a los microorganismosdel suelo. Existen dos métodos para incorporar el oxígenoal suelo. Uno es la inyección directa de aire en el suelo queestá por encima de la capa freática y el otro consiste ensuministrar oxígeno en forma líquida como peróxido dehidrógeno. A veces, estos tratamientos no dan los resulta-dos esperados, sobre todo si se trata de terrenos arcillososo subsuelos muy estratificados, ya que el oxígeno nopuede difundirse uniformemente en toda el área de trata-miento. A menudo, las técnicas de tratamiento in siturequieren años para alcanzar los objetivos de descontami-nación fijados, dependiendo fundamentalmente de la bio-degradabilidad de los contaminantes de que se trate.

Cuando lo que se bombea es aire, se hace a travésde unos pozos perforados en la zona contaminada. Elnúmero, localización y profundidad de los pozos, dependede los factores geológicos y de ingeniería del proceso. A lavez que el aire, también deben bombearse al suelo nutrien-tes como nitrógeno y fósforo.

En el caso de adición de peróxido de hidrógeno, hayque tener en cuenta que se trata de un compuesto químico,que puede difundirse a las aguas subterráneas y contaminaracuíferos. Por lo tanto, este sistema sólo se utiliza si el aguasubterránea está ya contaminada. La inyección del peróxi-do puede hacerse a través de tuberías y difusores o de pozosen el caso de que la contaminación del suelo sea profunda.

Tratamiento biológico de aguas subterráneas

Con este tratamiento se pretende aumentar la velo-cidad del proceso de degradación natural, que tiene lugaren el suelo embebido de agua que se encuentra por debajode la capa freática. En los emplazamientos en los quesuelo y agua subterránea están contaminados, esta técnica

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Figura 1. Procesos de atenuación natural de una contaminación porhidrocarburos.

puede servir para el tratamiento de ambos. En general, eldispositivo para tratar aguas subterráneas consiste en unpozo para extraer el agua contaminada, un sistema super-ficial de tratamiento en el que se añaden al agua oxígeno ynutrientes y otros pozos adicionales de reinyección delagua tratada para que los microorganismos lleven a cabo laactividad degradadora de los contaminantes.

Una de las principales limitaciones de este tipo deoperaciones, es que las diferencias en la estratificación ydensidad del subsuelo pueden ocasionar que el agua acon-dicionada siga, al reinyectarse, vías de flujo preferentes.En este caso, el agua pretratada no alcanzaría algunaszonas contaminadas.

Otra forma de tratamiento in situ de aguas subterrá-neas es la difusión de aire que consiste en bombear aire endichas aguas para ayudar a extraer contaminantes en com-binación con técnicas de extracción con vapor.

Tratamiento biológico ex situ de suelos contaminados

Las técnicas ex situ pueden ser más rápidas, másfáciles de controlar y aplicables a un mayor abanico de contaminantes y suelos que las técnicas in situ. Sinembargo, requieren excavación y acondicionamiento delsuelo contaminado antes e incluso, a veces, después de lafase de tratamiento biológico. Incluyen tanto técnicas detratamiento en fase sólida como en forma de lodos.

1. Tratamientos de lodos. En el caso de que el tra-tamiento se realice en forma de lodos, el suelocontaminado se combina con agua y otros aditi-vos en un biorreactor. Se controlan las condi-ciones de tratamiento y se añaden nutrientes yoxígeno. Cuando finaliza el tratamiento, se se-para el agua de los sólidos que son retornados alemplazamiento o sometidos a un tratamientoposterior si contienen todavía algún tipo de con-taminante. Este proceso puede ser relativamenterápido si se compara con otros tratamientos bio-lógicos, sobre todo, cuando se trata de terrenosarcillosos y es especialmente útil cuando serequiere un tratamiento rápido.

2. Tratamientos en fase sólida. Para que se puedarealizar un tratamiento en fase sólida, se requie-re que el área de aplicación disponga de siste-mas colectores adecuados para evitar cualquiercontaminación en caso de escapes. La humedad,el calor, los nutrientes y el oxígeno se controlanpara aumentar el rendimiento del proceso debiodegradación. Los sistemas de fase sólida sonrelativamente fáciles de mantener y operar, re-quieren grandes espacios y en general son demás larga duración que los tratamientos en for-ma de lodos.

Este tipo de tratamientos incluye las modalidadesde laboreo agrícola, tratamiento en pilas y técnicas decompostaje. En el primer caso, el suelo se excava y seextiende sobre una superficie dotada de un sistema pararecoger los lixiviados contaminados. El suelo se remueveperiódicamente para favorecer su aireación. La humedad ylos nutrientes se controlan, para optimizar el rendimientodel proceso y evitar las pérdidas por volatilización de loscontaminantes.

En el caso de los tratamientos en pilas, el suelo esdistribuido en montones de varios metros de altura, colo-cándose sobre un sistema de distribución de aire queinyecta aire en cada uno de los montones mediante unabomba de vacío. Se controlan los niveles de humedad y

nutrientes. Las pilas pueden también ubicarse en espacioscerrados, para controlar la emisión de volátiles ya queéstos forman parte del flujo de aire que sale de la pila.

En el tratamiento de compostaje, el residuo biode-gradable se mezcla con otros materiales, generalmente, detipo lignocelulósico (paja de cereales) para favorecer ladifusión del oxígeno y la humedad y optimizar el metabo-lismo microbiano. Los métodos de compostaje que se pue-den aplicar, son de tres tipos: compostaje en pilas estáticas(la aireación de las pilas se hace mediante difusores obombas de vacío), compostaje en reactores con agitaciónmecánica (el compost es mezclado y aireado en un reactor)y compostaje en grandes pilas que periódicamente se mez-clan utilizando tractores o equipos similares.

Biodisponibilidad de los contaminantes e interaccionescon la matriz del suelo

Uno de los aspectos más importantes a tener encuenta, con relación a la capacidad de biodegradar conta-minantes orgánicos hidrofóbicos en el suelo, es el de labiodisponibilidad [76,90,94].

La biodisponibilidad es un concepto difícil de defi-nir ya que en cada compartimento ambiental (agua, sedi-mentos, suelo o aire) juega un papel diferente. Por ejem-plo, la disponibilidad de un compuesto orgánico en agua sereduce, temporalmente, cuando se une a partículas suspen-didas o a sedimentos; la biodisponibilidad de un metal enun sedimento o en un suelo puede aumentar cuando el pHdisminuye; en el aire, los hidrocarburos aromáticos policí-clicos que están ligados o incluso incorporados en partícu-las pueden resultar inaccesibles a las superficies respirato-rias (por ejemplo pulmones de los mamíferos), al contrarioque los hidrocarburos gaseosos. El concepto de biodispo-nibilidad engloba pues diferentes factores, físicos, quími-cos y biológicos del entorno y es diferente para diferentesorganismos.

Cuando se hace referencia a la biodisponibilidad ensuelo, hay que tener en cuenta las características físicas,químicas y biológicas de este compartimento. La textura,granulometría y la composición del suelo determinan suspropiedades físicas y químicas como contenido de agua,oxígeno, sales, arcilla, minerales, materia orgánica y pH.Cada una de estas propiedades puede variar espacialmentepero también temporalmente. Cuando hay un exceso delluvia, el contenido en agua aumentará y como resultado laconcentración de sales disminuirá, mientras que el pHpuede aumentar, disminuir o permanecer inalterado. En laépoca de caída de las hojas, se forma una capa de materiaorgánica en la superficie del suelo, que comienza a serdegradada por los microorganismos, alterándose esta-cionalmente el contenido y la composición de la materiaorgánica.

En el capítulo de propiedades biológicas, se incluyela variedad de microorganismos que viven en el suelo,tanto en superficie como en el interior de la matriz y queagrupa bacterias, algas, hongos, actinomicetos, nemátodos,oligoquetos, insectos, pequeños mamíferos, arbustos y ár-boles.

En general, se puede decir que la evolución y com-portamiento de los compuestos orgánicos en el suelo, vie-nen determinados por los siguientes factores: característi-cas del suelo, propiedades de los compuestos y factoresambientales como temperatura y precipitación. La combi-nación de todos ellos puede hacer que el compuesto sigadiferentes vías, como lixiviación a la fase acuosa, biode-gradación, volatilización al aire, unión a las fases sólidasdel suelo y transferencia a organismos.

107Tratamiento de suelos contaminados con hongosMartín Moreno C, et al.

Los términos libre o ligado, aplicados a los residuosorgánicos que contaminan un emplazamiento determinado,establecen la diferencia entre la porción del compuesto quepuede ser extraída del suelo –normalmente por un solventeorgánico– sin alterar la estructura química del compuestoy la porción no extraíble de dicho compuesto. Sin embar-go, esta distinción no está siempre clara ya que existe unagran diversidad de métodos que han sido empleados paradeterminar la distribución de compuestos orgánicos en elsuelo y esto influye en la proporción de residuo extraíbley no extraíble. A continuación, se incluyen las definicionespropuestas por Weller et al. [106] para intentar sistemati-zar los distintos tipos de interacciones de los compuestosorgánicos en la matriz del suelo:

1. Residuo ligado covalentemente. Es el compues-to original o un metabolito principal unido cova-lentemente al sustrato.

2. Residuos solubles ligados covalentemente. Sonaquellos que se extraen conjuntamente con lamatriz por un procedimiento específico que res-peta el enlace covalente.

3. Residuos adsorbidos. Son compuestos originaleso metabolitos principales que están ligados a lamatriz por interacciones no covalentes reversi-bles.

4. Residuos inmovilizados (atrapados). Son com-puestos originales o metabolitos principales quese retienen con la matriz por efectos estéricos yque se comportan como residuos ligados a noser que se modifique la estructura de la matriz.

En muchos casos, cuando se aplica el término resi-duo ligado se hace referencia a los ligados covalente-mente, a los adsorbidos y a los atrapados.

Una vez que el contaminante orgánico entra en con-tacto con el suelo, puede experimentar diversas interaccio-nes. Incluso la fracción extraíble puede resultar adsorbidaen la fase sólida del suelo y, en consecuencia, presentaruna disminución de su biodisponibilidad y por lo tanto delpotencial de biodegradación.

Existen evidencias de que los residuos ligados pue-den removilizarse en solución o sufrir alteraciones debidoa interacciones microbiológicas o reacciones químicas.Los mecanismos de secuestro de compuestos, tales comola difusión intraorgánica (IOMD) y la difusión intraparti-cular (IPD), retrasan la liberación de los compuestosadsorbidos. La materia orgánica está sujeta a alteracionespor factores ambientales así como por procesos químicos ybióticos. Es decir, que los residuos libres pueden mostrar,en algún grado, propiedades tradicionalmente atribuibles alos xenobióticos ligados. Hay que tener en cuenta por lotanto, que al hablar de capacidad de extracción de un com-puesto hay que especificar claramente la naturaleza delextractante y las condiciones experimentales en las que serealiza la extracción.

Proceso de envejecimiento de la contaminación

Se han realizado numerosos estudios para investi-gar el comportamiento de los compuestos orgánicos per-sistentes en el suelo. El envejecimiento de los compuestosen el suelo depende de diversos factores tales como, canti-dad y naturaleza de la materia orgánica, constituyentesinorgánicos del suelo, fundamentalmente estructura ytamaño de poro, microflora del suelo, concentración decontaminante, procesos de adsorción y atrapamiento en losmicroporos del suelo o en los complejos húmicos de lamateria orgánica. Se ha comprobado que el humedeci-

miento y el secado sucesivo del suelo, también contribu-yen al proceso de envejecimiento. En la figura 2, se recogeun esquema de los posibles procesos que intervienen en elenvejecimiento de los contaminantes en un suelo.

El resultado final del proceso de envejecimiento esla movilización de compuestos desde los compartimen-tos más accesibles del suelo, a los menos accesibles o a losinaccesibles, con lo cual se produce una reducción en lacapacidad de extracción de dichos compuestos. Se admite,en general, que transcurrido un cierto tiempo desde laaparición de la contaminación, se distinguen dos grupos de asociación contaminante/suelo. El primero correspondea la fracción de compuesto que puede ser rápidamentedesadsorbida y el segundo a la fracción que se desadsorbemás lentamente. Se ha propuesto que la transferencia demasa de contaminante y en particular el tamaño de la frac-ción fácilmente desadsorbible, gobiernan la biodisponibili-dad del mismo. La disminución de la biodisponibilidadcon el paso del tiempo, que permite la interacción pro-longada entre el contaminante y el suelo, ha sido obser-vada tanto en el caso de los microorganismos como deotros organismos superiores.

El conocimiento de las interacciones entre los com-puestos orgánicos y los suelos o los sedimentos así comode los mecanismos que contribuyen a la formación de resi-duos ligados, es todavía limitado. Mientras que se han rea-lizado numerosos estudios sobre la evolución a corto plazode los procesos de adsorción y desorción entre diversoscompuestos y tipos de suelo, hay pocos estudios sobre laformación de compuestos ligados. Esta carencia ha limi-tado, a su vez, el conocimiento del papel que juegan losresiduos ligados, en los mecanismos de destoxificación yreducción de la biodisponibilidad así como del comporta-miento a largo plazo de los residuos ligados en suelos ysedimentos.

La mayoría de los estudios sobre interaccionesentre los residuos y el ecosistema del suelo, se han llevadoa cabo en ensayos de laboratorio con microcosmos, quehan permitido determinar la influencia de factores especí-ficos en la formación de residuos ligados. Sin embargo, senecesitaría disponer de resultados obtenidos a partir deexperimentación en campo utilizando lisímetros expuestosa las condiciones ambientales y climáticas reales. Esto per-mitiría profundizar en el conocimiento de las interaccionesentre los residuos orgánicos y la matriz del suelo, esencialpara el desarrollo de criterios de calidad, establecimientode límites regulatorios y predicción de riesgo y asesora-miento sobre posibles tratamientos para contaminacionescon compuestos orgánicos.

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Figura 2. Esquema de los procesos que intervienen en el envejecimiento delos contaminantes orgánicos en el suelo.

Valoración de la biodisponibilidad

La biodisponibilidad de un compuesto orgánicopuede ser evaluada con dos perspectivas distintas, químicao biológica.

Aspectos biológicos de la valoración de la biodisponibilidad

Para que la biodegradación tenga lugar deben cum-plirse dos requisitos:

1. El compuesto debe ser accesible al organismo uorganismos de que se trate.

2. El compuesto como tal debe ser biodegradable.

Obviamente, tanto la biodisponibilidad como la bio-degradabilidad pueden ser valoradas por métodos biológi-cos y existe un buen número de ensayos estándar utilizandomicroorganismos. Estos métodos incluyen: mineralizaciónde análogos marcados con 14C hasta 14CO2 (biodegrada-ción), determinación del efecto del contaminante sobre lademanda biológica de oxígeno (biodisponibilidad) o sobrelas variaciones de la remoción de carbono orgánicodisuelto (biodisponibilidad).

Una técnica que se está introduciendo es la de labioluminiscencia que evalúa la biodisponibilidad, midien-do el impacto de los contaminantes sobre la actividad deorganismos luminiscentes. Puesto que la luminiscenciaestá ligada al funcionamiento de la cadena de transporteelectrónico del organismo en cuestión, es una medida de laactividad metabólica del mismo. Por tanto, una disminu-ción del metabolismo por la presencia de un contaminantetóxico, se traduce en una disminución de la bioluminis-cencia. El desarrollo de microorganismos con marcadoresde bioluminiscencia para determinar la toxicidad en espa-cios contaminados, presenta ventajas sobre otros ensayoscon organismos superiores, ya que es una técnica rápida ypoco costosa que permite obtener buenos resultados conmetales pesados y contaminantes orgánicos. Sin embargo,con algunos compuestos considerados contaminantes prio-ritarios como los hidrocarburos aromáticos policíclicos(PAH), los resultados obtenidos con esta técnica, indicanuna menor toxicidad que la evaluada por el ensayo deMicrotox®.

Esta misma técnica, también permite construir mar-cadores de bioluminiscencia específicos para contami-nantes concretos. Por ejemplo Pseudomonas fluorescens(HK44) que contiene el plásmido pUTK21 para catabo-lismo de naftaleno, produce luz en presencia de naftalenoy ácido salicílico. Aunque los ensayos con sensores de bio-luminiscencia son muy útiles para la determinación detoxicidad en sistemas acuáticos, existen grandes limitacio-nes para su utilización en suelos contaminados. Algunosautores han llevado a cabo los estudios de bioluminiscen-cia en extractos de suelos contaminados, pero esto pre-senta problemas con muchos contaminantes orgánicos yaque debido a su hidrofobicidad, tienen que extraerse consolventes orgánicos que, por una lado tienen efectos nega-tivos sobre los propios biosensores y por otro, no reflejanexactamente la biodisponibilidad del compuesto.

Aspectos químicos de la valoración de la biodisponibilidad

Tradicionalmente, las técnicas de extracción en sue-los han tenido como objeto la determinación de la concen-tración de compuestos totales y, por tanto, se han aplicadométodos enérgicos como la extracción en Soxhlet. Sinembargo, a la luz del conocimiento sobre disponibilidad delos compuestos y su envejecimiento en el suelo, estosmétodos no son los adecuados para evaluar la cantidad deun compuesto que puede calificarse como biodisponible.

Más recientemente, se han investigado técnicas menosexhaustivas, con objeto de determinar cuales reproducenmás fielmente la fracción biodisponible. Hay que señalar,en este punto, que puesto que el concepto de biodisponibi-lidad es dependiente, no sólo del tipo de organismo sino,incluso, de la especie, es imposible desarrollar un métodoquímico que refleje exactamente este concepto.

Como conclusión, se puede decir que a la hora devalorar la biodisponibilidad de un contaminante, no sólohay que tener en cuenta la especificidad de los organismos,sino, también, el objetivo concreto de la valoración, quepuede ser tanto la predicción del potencial de descontami-nación biológica en un determinado emplazamiento conta-minado, como la determinación de riesgo toxicológico o laevaluación de la posibilidad de bioacumulación.

Ensayos para evaluar la efectividad del tratamiento

Estos ensayos son críticos para llevar a cabo un tra-tamiento biológico de descontaminación. Es muy difícilque dos emplazamientos contaminados posean idénticascaracterísticas y por lo tanto el tratamiento tiene que adap-tarse a cada caso concreto. Existen muchas variables queinfluyen en la eficiencia del proceso biológico y que estánrelacionadas con las condiciones ambientales, el tipo decontaminantes y el medio contaminado. Por ello, es reco-mendable tener un protocolo que ayude a decidir sobre laposibilidad de aplicar un tratamiento biológico y las con-diciones en las que debe aplicarse.

Hasta la fecha, la mayoría de las tecnologías detratamiento biológico se han aplicado para casos de con-taminantes naturales orgánicos. Los contaminantes que son biodegradables bajo condiciones naturales incluyen: 1) hidrocarburos del petróleo como benzeno, tolueno, eti-leno y xileno (BTEX) y gasolina, 2) creosota, 3) com-puestos orgánicos volátiles (VOC) como tricloroetileno ypercloroetileno (TCE y PCE), 4) pesticidas, 5) solventesorgánicos y 6) conservantes para madera.

Los estudios piloto indican la eficiencia del trata-miento microbiano de nitrotoluenos en suelos contamina-dos con explosivos. Muchos de los contaminantes máspersistentes en el ambiente como bifenilos policlorados(PCB) e hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH) sonresistentes al tratamiento microbiológico por diferentescausas, entre las que se pueden citar: a) toxicidad de loscompuestos para los microorganismos, b) utilización pre-ferente, por los microorganismos, de otros compuestoscomo fuente de energía, c) incapacidad genética de losmicroorganismos para usar el contaminante como fuentede carbono y energía y d) condiciones ambientales desfa-vorables para la propagación de la estirpe apropiada demicroorganismos.

La alteración de las condiciones ambientales es-timula, frecuentemente, el desarrollo de las poblacionesmicrobianas adecuadas para degradar los contaminantesorgánicos de que se trate. Estos cambios pueden incluir:ajuste de la concentración del compuesto, pH, concentra-ción de oxígeno o temperatura así como la adición denutrientes o microorganismos aclimatados al uso del con-taminante en cuestión.

Los PCB y los PAH pueden ser metabolizados otransformados parcialmente como segundo sustrato. Aun-que pueden no ser adecuados para permitir el crecimientode los microorganismos, pueden ser degradados por unproceso de co-metabolismo, que facilita que los microbioscrezcan sobre un compuesto produciendo al mismo tiempoenzimas que transformen otras moléculas que, sin embar-go, esos organismos no podrían utilizar directamente para

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crecer. Una gran variedad de reacciones enzimáticas talescomo oxidaciones, hidrólisis, deshalogenaciones reducto-ras, etc. catalizan los procesos co-metabólicos.

Aunque el tratamiento biológico no puede degradarcontaminantes inorgánicos (metales y radionúclidos),puede ser usado para cambiar la valencia de los mismos ycausar adsorción, incorporación, acumulación y concentra-ción de dichos compuestos, tanto en microorganismoscomo en organismos superiores. En algunos casos, lasespecies químicas modificadas pueden ser más fácilmenteextraíbles del sustrato geológico en el que están incorpora-das, debido al aumento de su solubilidad con respecto a lasespecies originales. En otros casos, puede ocurrir lo con-trario y el contaminante puede ser inmovilizado in situ.Estas técnicas, aunque están todavía en fase experimental,se consideran prometedoras para la estabilización o recu-peración de compuestos inorgánicos del suelo.

Con respecto al emplazamiento, también existencondiciones ambientales que puede retardar o incluso dete-ner el proceso de biodegradación. Entre ellas:

1. Una concentración de contaminante demasiadoelevada o la coexistencia de otros materialestóxicos para los microorganismos.

2. Existencia de gradientes de concentración dema-siado rápidos para permitir la aclimatación delos microorganismos al contaminante o contami-nantes.

3. Número o tipo de microorganismos inadecuadopara la biodegradación o bien capacidad inade-cuada para la colonización del subsuelo conta-minado.

4. Condiciones demasiado ácidas o demasiado al-calinas.

5. Falta de nutrientes adecuados (tales como nitró-geno, fósforo, potasio, azufre, o elementos traza)que pueden ser necesarios para utilizar el conta-minante como fuente de energía.

6. La transferencia de contaminantes, desde lasbolsas de suelo saturadas por los hidrocarburos,puede estar limitada por la baja permeabilidad oexistencia de estratos y como consecuencia difi-cultar la eficiencia de la descontaminación.

7. Condiciones de humedad desfavorables (porexceso o por defecto).

8. Escasez de oxígeno, nitrato o sulfato, necesariospara la utilización de los contaminantes comofuente de energía.

Para hacer una predicción de la viabilidad del trata-miento biológico de un emplazamiento contaminado,deberían identificarse las siguientes variables:

a) Biodegradabilidad de los contaminantes.b) Distribución de los contaminantes en suelo,

agua, NAPL (fase líquida no acuosa de deriva-dos del petróleo, en el caso de contaminacionespor hidrocarburos) y fase de vapor.

c) El potencial de lixiviación de los contaminantes(solubilidad en agua y coeficiente de adsorciónal suelo).

d) Reactividad química de los contaminantes (ten-dencia de reacciones no biológicas como hidró-lisis, oxidación y polimerización).

e) Extensión y profundidad de la contaminación.f) Tipo y propiedades del suelo (contenido de

materia orgánica, contenido mineral, pH, porosi-dad, permeabilidad, densidad, humedad, nivelde nutrientes, capacidad de retención de agua,etc.).

g) Competencia biológica por oxígeno (potencialredox y niveles de oxígeno ambiental).

h) Presencia o ausencia de sustancias tóxicas paralos microorganismos.

i) Capacidad de los microorganismos del suelopara degradar los contaminantes.

Se requiere un conocimiento de la cinética de bio-degradación en el suelo, para saber la eficacia que puedentener las técnicas de tratamiento biológico in situ o ex situ.Para ello, los estudios previos de laboratorio pueden ayu-dar a determinar el grado probable de degradación pormétodos biológicos, así como a diseñar los criterios de tra-tamiento. Tradicionalmente, las cinéticas de bidegradaciónin situ se han determinado mediante la aplicación de estu-dios con microcosmos que son difíciles de adaptar a mode-los matemáticos.

La biodegradación en el suelo es un complejísimoproceso, que integra difusión de contaminantes en lamatriz porosa del suelo, adsorción a la superficie del sueloy biodegradación en las biopelículas que se configuran enla superficie de las partículas de suelo y los grandes poros,así como en la fase acuosa. Cuando se emplean reactores,en los que el suelo es tratado en forma de lodos, la biode-gradación de contaminantes ocurre tanto en la fase líquida,debido a los microorganismos liberados de la matriz delsuelo, como en la biopelícula inmovilizada en las partícu-las del mismo. Cuando se emplea un sistema de suelocompactado, la biodegradación que ocurre en la faseacuosa, tanto asociada como libre, es producida por losmicroorganismos inmovilizados en las partículas, siendomuy pequeña la contribución de microorganismos en sus-pensión, debido al bajo contenido de agua.

Una forma de estudiar la capacidad de degradarbiológicamente un cierto contaminante en un suelo deter-minado, es evaluar –utilizando técnicas de respirometría–la demanda biológica de oxígeno de ese suelo a largoplazo. Se trata de conocer la tasa de respiración que tienelugar en el suelo contaminado y que puede servir paradeterminar la posibilidad de éxito al estimular el creci-miento biológico en ese medio.

El seguimiento del crecimiento microbiano en unamezcla contaminada, puede hacerse con técnicas másespecíficas que las de seguimiento de la actividad respira-toria. Se pueden usar, por ejemplo, marcadores radiactivosen las moléculas contaminantes que incrementan significa-tivamente la sensibilidad de los estudios de biodegrada-ción, permitiendo seguir la evolución metabólica de loscompuestos marcados con menores interferencias analíti-cas. Este hecho es importante, si se tiene en cuenta la com-plejidad del entorno biótico-abiótico en el que tiene quellevarse a cabo el seguimiento. Estos métodos permiten,asimismo, analizar concentraciones de productos tanto ini-ciales como intermedios y finales que están por debajo delos límites de detección de otros métodos analíticos.

En general, puede decirse que el desarrollo de losmodelos de biodegradación de contaminantes orgánicos ensuelos es difícil, por la existencia de una serie de factorescomplejos, entre los que pueden incluirse los siguientes:

1. La presencia de barreras que dificultan la difu-sión de contaminantes, oxígeno y nutrientes, enlos macroporos y microporos del suelo.

2. El efecto de la adsorción química a las arcillas ya los constituyentes húmicos del suelo.

3. La presencia de otros materiales orgánicos bio-degradables en el suelo.

4. Los cambios en el crecimiento microbiano, oca-sionados por parasitismos de protozoos.

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5. El efecto de la solubilidad del compuesto en lafase acuosa.

6. La formación de biopelículas en la superficie delsuelo, relacionadas con la microflora suspen-dida.

7. La existencia de microflora no adaptada a lascondiciones creadas por la contaminación.

La mayoría de los modelos cinéticos, no tienen enconsideración la adsorción de los contaminantes a las par-tículas del suelo, que se ha demostrado que es un factor degran importancia en el transporte de contaminantes. Desdeel punto de vista cinético, la adsorción es un proceso endos fases, con una etapa inicial rápida (horas) seguida deuna fase más lenta (días), controlado por la difusión haciapuntos de adsorción interna.

El suelo tiene diferentes tamaños de poro, corres-pondiendo alrededor del 50% del volumen total de poros,a los de radio menor de 1 µm. La mayoría de las bacteriasdel suelo tienen un tamaño comprendido entre 0,5 y 0,8 µmy por lo tanto, una porción significativa del suelo es inac-cesible a la mayoría de la población microbiana.

El papel de los agregados del suelo y el efecto desus características en el tratamiento biológico de los sue-los, ha sido analizado con modelos analíticos que hanmostrado los efectos del tamaño de los agregados, del coe-ficiente de reparto y de la concentración inicial de conta-minantes, en la duración y los mecanismos de descontami-nación. Se ha observado que las tasas de difusión decontaminante y oxígeno y las cinéticas de biodegradacióncontrolan los mecanismos de tratamiento biológico en losagregados.

El éxito de un proceso biológico de descontamina-ción radica en la degradación de los contaminantes orgáni-cos y en la reducción de la toxicidad y el potencial demigración de los compuestos peligrosos en el suelo. Losestudios de laboratorio realizados usando compuestosfenólicos han indicado que la pérdida de dichos compues-tos orgánicos se puede describir satisfactoriamente me-diante cinéticas de primer orden y que la disminución delos contaminantes en la fracción soluble en agua es másrápida que la disminución de los mismos compuestos en el suelo. Además, la toxicidad de la fracción soluble enagua disminuye con la concentración y no se produce unaumento de la movilización de los compuestos químicosestudiados durante el proceso de degradación.

Algunos trabajos sobre las cinéticas de biodegrada-ción en el suelo han concluido que los modelos habitual-mente aplicados se basan en estudios con poblacionesmicrobianas constituidas por un solo microorganismo ocon enzimas aisladas y que es muy improbable que losmodelos basados en estos estudios tan específicos y dis-tantes de la complejidad biológica que caracteriza un suelosean capaces de explicar lo que ocurre en un proceso realde biodegradación con multitud de microorganismos, con-taminaciones complejas y suelos y condiciones ambienta-les variadas.

Basándose en estas consideraciones previas se handesarrollado algunos protocolos como el elaborado porTabak et al. [97] que integra varios niveles: biodisponibi-lidad (equilibrio de adsorción-desorción y cinéticas), limi-taciones para la difusión de oxígeno y contaminantes ycinéticas de biodegradación de contaminantes orgánicos ensistemas compactos de suelos. En su modelo, utilizanmicrocosmos del suelo y estudios de respirometría en trestipos de reactores: biorreactores de suelos en forma delodos, en capa fina y en columna.

Desde el punto de vista microbiológico es conve-niente hacer una serie de consideraciones que pueden apli-carse al tratamiento de cualquier compuesto xenobiótico:

1. En la mayoría de los sistemas naturales estánpresentes muchos microorganismos diferentes yla degradación de un compuesto xenobióticoconcreto depende de la actividad de varios mi-croorganismos aunque las reacciones secuencia-les se deban a un solo miembro del consorcio.

2. Es infrecuente que en los ecosistemas naturalesse encuentre presente un solo substrato. Por lotanto es importante examinar como puede verseafectada la regulación de las vías de degradaciónpor la presencia de diferentes tipos y concentra-ciones de productos que pueden inducir o inhi-bir, dependiendo del caso concreto, las víasmetabólicas necesarias para la degradación delcontaminante o contaminantes en cuestión.

3. En ausencia de oxígeno molecular pueden in-tervenir otros aceptores de electrones que inclu-yen nitrato, sulfato, carbonato, clorato, Fe (III),Cr (VI) y U (VI). En este sentido, conviene des-tacar la gran versatilidad metabólica de las bac-terias reductoras de sulfato.

4. Un aspecto importante a tener en cuenta, es el delenvejecimiento de la contaminación en el suelo.Este término, del que ya hemos hecho algunasconsideraciones previas, engloba un conjunto demecanismos complejos que no se conocen enprofundidad, mediante los cuales los compuestosorgánicos se van asociando a los componentespoliméricos de la matriz del suelo, con el resul-tado final de que disminuye, en mayor o menorgrado, la disponibilidad de dichos compuestospara la acción degradadora de los microorganis-mos. Esto implica, que aunque exista una capa-cidad teórica de biodegradación de un compuestodeterminado, éste puede resultar en la prácticainaccesible al microorganismo. Un punto críticoes el grado de reversibilidad de estos complejos,puesto que una lenta liberación por lixiviaciónpuede introducir el compuesto contaminante enla fase acuosa, provocando la posterior contami-nación de las aguas subterráneas.

5. Tanto en los sistemas acuáticos como terrestres,los microorganismos pueden estar formandobiopelículas debido a su capacidad para secretarproductos poliméricos. Esto puede favorecer supenetración en la matriz del suelo y prevenir supérdida por arrastre.

6. Hay que tener en cuenta, que además de la de-gradación biológica de los contaminantes en el suelo, cualquier metabolito puede experimen-tar transformaciones de naturaleza puramentequímica que pueden tener importantes implica-ciones para los microorganismos y para el eco-sistema en general. En ocasiones, los compues-tos originados en el metabolismo microbiano de un contaminante son tóxicos para organis-mos superiores. Como ejemplo, mencionaremosla toxicidad que presentan para los peces el3.4.3’.4’-tetracloroazoxybenceno, producido apartir de la 3.4 dicloroanilina, y los clorovera-troles, producidos por metilación biológica delos guayacoles. Los metabolitos intermediospueden jugar, también, un papel importante en laasociación del substrato con los ácidos húmicosy fúlvicos del suelo. Por ejemplo, el 1-naftolproducido en el metabolismo fúngico del nafta-leno puede jugar un papel importante en la aso-ciación del naftaleno con el componente húmicodel suelo.

111Tratamiento de suelos contaminados con hongosMartín Moreno C, et al.

7. Muchos substratos contienen N, P o S y los mi-croorganismos pueden utilizar alguno de esoselementos, dejando la mayor parte del substratointacto. Esto es particularmente importante paralos contaminantes relacionados con las municio-nes militares que tienen una relación C/N baja ypara los que la adición de fuentes de carbonopuede conducir al desarrollo favorable de micro-organismos anaerobios facultativos o estrictos.

8. No existen organismos o grupos de organismosde aplicación universal a procesos de biodescon-taminación. Su compatibilidad con el emplaza-miento de aplicación debe ser considerada en lamisma medida que sus características fisiológi-cas y su potencial bioquímico. Sin embargo, esconveniente tener en cuenta que determinadosgrupos de organismos, presentan una elevadaversatilidad metabólica y son capaces de degra-dar un amplio espectro de substratos. Entre estoscabe destacar bacterias que utilizan compuestosde un átomo de carbono como metano y metanoly que pueden por ejemplo aplicarse a la degra-dación de tricloroetano. Dos géneros de bacte-rias Gram+ que presentan grandes posibilidadesson Rhodococcus sp. y Mycobacterium sp. Mien-tras que las bacterias son consideradas los agen-tes fundamentales de la biodegradación en lossistemas acuáticos, el papel de los hongos en lossistemas terrestres puede ser igual o inclusomayor. Entre los hongos la atención de las in-vestigaciones actuales se centra en los hongosde la podredumbre blanca, debido a su gran ver-satilidad metabólica.

9. Se han encontrado claras evidencias en los eco-sistemas acuáticos de la existencia de concentra-ciones umbral, por debajo de las cuales las tasasde biodegradación de los compuestos xenobióti-cos es lenta o incluso inapreciable. Se han ela-borado numerosas hipótesis para explicar estehecho, que se basan fundamentalmente en laexistencia de concentraciones mínimas para lainducción y el mantenimiento de las enzimas de degradación implicadas en el metabolismo de los compuestos orgánicos contaminantes. Elparalelismo de este hecho en los medios terres-tres, ha sido estudiado hasta la fecha con pocaprofundidad pero puede ser importante cuandosólo estén disponibles bajas concentraciones deun substrato contaminante por desorción delmismo.

Muy pocos de los compuestos que son objeto deprogramas de biodescontaminación son fácilmente degra-dables y aunque muchos de ellos han resultado ser meta-bolizables en experimentos de laboratorio controlados, lacuestión fundamental es si pueden ser degradados en unambiente natural. La biodegradación implica la consecu-ción de un grado de mineralización apreciable y no unasimple transformación biológica.

Valoración de la eficiencia de un tratamiento biológicode descontaminación

Un aspecto imprescindible en cualquier programade biodescontaminación, es la evaluación del éxito obte-nido después de la aplicación del tratamiento. Aunqueparezca obvio, el hecho es que esta valoración no se rea-liza adecuadamente en muchas ocasiones, debido a la difi-

cultad de integrar todos los factores implicados en unmodelo que refleje el grado real de la biodegradaciónalcanzada. Algunos de estos factores difíciles de valorarson los siguientes:

1. La disminución de la concentración de los subs-tratos no es una medida inequívoca de la degra-dación ocurrida ya que una parte importante delos mismos puede perderse por volatilización opor transformación, con la subsiguiente apari-ción de metabolitos intermedios o finales.

2. El ambiente es siempre de una gran heteroge-neidad y por lo tanto es muy difícil encontrar un método de muestreo que sea representativo e ilustre con aproximación el proceso que hatenido lugar.

3. El grado de lixiviación es muy difícil de evaluar,ya que los ecosistemas suelen ser suficiente-mente abiertos como para que se pueda estable-cer un balance certero de las concentraciones desubstratos iniciales y de los metabolitos produci-dos, incluyendo dióxido de carbono, amoniaco ometano, que pasan a la atmósfera.

Para sortear este tipo de obstáculos se han pro-puesto numerosas estrategias que pretenden ayudar en laevaluación y el seguimiento de un proceso de biodescon-taminación. Estas técnicas incluyen la aplicación de análi-sis por PCR (amplificación de secuencias de DNA) paradeterminar la presencia de organismos degradadores espe-cíficos y la evaluación de parámetros metabólicos queincluyen entre otros los siguientes:

– Presencia de determinados metabolitos que ha-yan sido identificados previamente en experi-mentos de laboratorio sobre rutas de degradaciónde los contaminantes implicados.

– Presencia de actividades enzimáticas específicasfrente a los substratos de interés. En el caso dehidrocarburos aromáticos policíclicos se incluyenla actividad de tolueno la dioxigenasa, naftalenodioxigenasa y manganeso peroxidasa.

Técnicas para predecir la efectividad del tratamientobiológico de un suelo contaminado

Habitualmente, se emplea un protocolo metodoló-gico de varias fases para predecir si la estrategia de bio-descontaminación puede ser aplicable. Sea cual sea elenfoque del estudio de predicción utilizado, existen unaserie de elementos comunes, que incluyen la revisiónbibliográfica, los estudios de caracterización de microcos-mos y los estudios finales de optimización. Además de esta fase que podríamos considerar de investigación mi-crobiológica, también son elementos decisivos a la hora deevaluar el potencial de un proceso de biodescontamina-ción, la distribución de contaminantes en el emplaza-miento contaminado, la hidrogeología y la biogeoquímicadel mismo.

Según los datos publicados, los estudios respiromé-tricos y de mineralización, utilizando microcosmos en con-diciones controladas, son los más empleados para evaluarlas posibles opciones de tratamiento. Los análisis respiro-métricos tienen como objetivo utilizar la producción dedióxido de carbono como un índice indirecto de la activi-dad biológica y, por lo tanto, de la degradación del conta-minante. En estos estudios, se mide el aumento de la pro-ducción de CO2 en suelos control con respecto a aquellosen que se ha añadido el contaminante objeto de estudio. Si

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se observa este aumento, quiere decir que el contaminanteestá siendo utilizado por los microorganismos, adicional-mente a la materia orgánica del suelo. Estos estudios sepueden diseñar para evaluar la incidencia de diversos pa-rámetros, tales como diferentes concentraciones de conta-minante, procesos de atenuación fisicoquímica y otros fac-tores.

Los estudios con microcosmos a escala de labora-torio requieren en general de uno a tres meses y se puedenllevar a cabo junto con otros ensayos para valorar el re-querimiento de nutrientes inorgánicos y las condiciones de inhibición. Los resultados de estos estudios son, gene-ralmente, utilizados para determinar las especificacionesde los ensayos piloto de tratamiento. Si los estudios conmicrocosmos dan resultados positivos, se pueden llevar acabo otros adicionales para optimizar la biodegradación decontaminantes. Estos estudios pueden evaluar la relaciónentre aceptores electrónicos y nutrientes y otras condicio-nes para optimizar la eficiencia de eliminación de conta-minantes. Los costes de los estudios con microcosmosvarían en función de la complejidad y la duración de losmismos.

La enumeración microbiana es una herramienta queha sido utilizada, fundamentalmente, para evaluar la res-puesta in situ de las bacterias del suelo, a la hora de degra-dar contaminaciones por hidrocarburos derivados delpetróleo. La respuesta de la comunidad microbiana, refle-jada en forma de un incremento significativo en la den-sidad de población media de los suelos contaminados conrespecto a la situación anterior (por ejemplo, alrededor demedio orden de magnitud), es un indicador del potencialintrínseco de la descontaminación biológica y por exten-sión de la posibilidad de estimular ese potencial.

Para las muestras de suelo, las densidades de pobla-ción se expresan habitualmente como TRH (total de hete-rótrofos recuperados de la matriz del suelo). Este índiceincluye bacterias heterótrofas aerobias y anaerobias facul-tativas, que pueden constituir en su conjunto alrededor dela mitad de la riqueza microbiana del suelo. En un suelo no contaminado, en condiciones óptimas de crecimiento,la riqueza microbiana está entre 106 y 108 unidades forma-doras de colonia de bacterias por gramo de peso seco desuelo; 105 unidades formadoras de colonia de hongos y 106

de actinomicetos. La riqueza taxonómica de un suelo pue-de exceder las 10.000 especies por gramo de suelo seco.Del total de flora bacteriana, las bacterias aerobias repre-sentan entre el 50 y el 70%, las bacterias anaerobias el10%, los actinomicetos entre el 20 y el 30% y los micro-micetos entre el 1 y el 2%.

Los factores que controlan la densidad de poblacióny la diversidad biológica de un suelo, son de dos tipos:

Factores fisicoquímicos. En este grupo se incluyenla disponibilidad de carbono orgánico y de aceptores elec-trónicos, el potencial de oxidación-reducción, los nutrien-tes inorgánicos, el pH, el contenido de agua, la tempera-tura, la salinidad y la textura del suelo. La densidad depoblación microbiana disminuye generalmente con laprofundidad, debido a la disminución de la disponibilidadde carbono orgánico y oxígeno molecular. También influyela distribución microtopológica del carbono.

Factores biológicos. En este grupo de factores seincluyen la competencia por los recursos, la existencia depredadores como protozoos y microartrópodos y los inhi-bidores metabólicos.

En los suelos normales, los organismos capaces deutilizar contaminantes suelen constituir menos del 0,1% dela comunidad microbiana, mientras que los degradadorespueden llegar a constituir el 100% de la riqueza microbio-lógica de un suelo contaminado. Cuando se produce un

estrés ambiental o un cambio en la fuente de carbono orgá-nico, la composición de la comunidad microbiana se modi-fica, para favorecer a las especies que pueden tolerar eseestrés o utilizar el nuevo substrato. Después de una conta-minación con hidrocarburos del petróleo, algunas especiesdisminuyen debido a la toxicidad, algunas no sufren efec-tos apreciables y otras experimentan un desarrollo adicio-nal, al ser capaces, por su constitución enzimática especí-fica, de metabolizar el carbono orgánico de la fraccióncontaminante. En general, se puede decir que la presenciade contaminantes disminuye la diversidad taxonómica yaumenta la diversidad metabólica de la población que seorigina, que incorpora características nutricionales relacio-nadas con el contaminante y que es, en general, resistentea otras presiones ambientales distintas del contaminante encuestión.

Estos cambios en la composición de la poblaciónmicrobiana, subsiguientes a la aparición de la contamina-ción, van acompañados de un incremento considerable dela densidad total de dicha población. Algunos autores handescrito incrementos de hasta 3000 veces la poblaciónmicrobiana de un suelo por un derrame de carburante [98].Esto se traduce en que mientras en un suelo normal el fac-tor limitante del crecimiento de la microflora suele ser elcarbono orgánico, en los suelos contaminados por hidro-carburos, la falta del oxígeno molecular, necesario parapermitir el metabolismo aerobio, se convierte en el factorlimitante para el desarrollo de los heterótrofos aerobios yanaerobios facultativos.

Según los resultados obtenidos en los estudios deecología microbiana del suelo, la enumeración de bacteriasen suelos contaminados y su comparación con los suelosnormales es un método muy útil para evaluar si aumenta elcrecimiento de la microflora indígena del suelo y, portanto, se están metabolizando los contaminantes o si por elcontrario disminuye, lo cual indicaría el efecto inhibitorioo tóxico de dichos productos.

Los estudios de enumeración microbiana propor-cionan datos sobre la viabilidad y la actividad microbioló-gica pero no pueden identificar la naturaleza del efectoinhibitorio, si éste existe. Además, en el caso de contami-naciones por mezclas complejas, el recuento de viablespermite saber que la mezcla está siendo metabolizada,pero no permite conocer qué componente específico ogrupo de compuestos están siendo degradados. Por ejem-plo, el aumento de la densidad de población microbiana,medida por el índice TRH, en suelos contaminados congasolina, puede ser debido a la utilización de la fracciónalifática del combustible permaneciendo, sin embargo, lafracción aromática inalterada.

Puesto que los hidrocarburos derivados del petró-leo constituyen uno de los mayores problemas en lo refe-rente a la contaminación de suelos conviene hacer unabreve referencia a la química de los hidrocarburos delpetróleo.

Química de los hidrocarburos del petróleo

El grupo de hidrocarburos del petróleo comprendeun gran número de compuestos que por definición seencuentran en el combustible crudo, así como en otrasfuentes combustibles como gas natural, carbón y turba.Existen tres grupos mayoritarios en los hidrocarburos delpetróleo: alcanos (parafinas), alquenos (olefinas) e hidro-carburos aromáticos.

Las parafinas son uno de los principales constitu-yentes del crudo y se encuentran en los diferentes produc-tos refinados del petróleo: gasolina, queroseno, diesel,

113Tratamiento de suelos contaminados con hongosMartín Moreno C, et al.

aceites combustibles etc. Hay tres tipos de parafinas: alca-nos lineales, alcanos ramificados y naftenos. En este últi-mo caso, los átomos de carbono están dispuestos en uno omás anillos.

Las olefinas se forman durante el proceso de refinodel crudo. Estas moléculas se caracterizan por tener doblesenlaces en su estructura.

Los hidrocarburos aromáticos pueden ser de un soloanillo: benceno, tolueno, etilbenceno y xileno (BTEX) ocontener varios anillos aromáticos como en el caso de naf-taleno, antraceno, pireno y otros muchos. Por sus propie-dades semivolátiles, tienen gran movilidad y presentan unabaja solubilidad en agua, siendo la mayor parte de elloslipofílicos. En la figura 3, se recoge la estructura químicade algunos hidrocarburos policíclicos aromáticos.

Los diferentes productos obtenidos por refino ydestilación del crudo: gasolina, diesel y asfaltos, son com-binaciones de múltiples hidrocarburos individuales, cadauno de los cuales tiene diferente temperatura de ebullición.Por ejemplo, la gasolina es la combinación de muchoscomponentes de bajo rango de ebullición, incluyendo alca-nos de C4 a C12, alquenos de C4 a C7 y aromáticos tipoBTEX. Los compuestos de rango intermedio de ebulliciónse utilizan en diferentes proporciones para conseguir pro-ductos como queroseno, diesel y aceites combustibles.Estos productos contienen preferentemente alcanos de C10

a C24 y policíclicos aromáticos con bajo o ningún conte-nido en olefinas.

Tratamiento biológico de contaminaciones por petróleoy sus derivados

En el caso de las contaminaciones con productosderivados del petróleo, se pueden establecer tres categoríasde situaciones en las que el problema es susceptible de serresuelto mediante procesos de descontaminación biológica:(1) residuos de las refinerías de petróleo y contaminacióndel área próxima al emplazamiento de las mismas, (2) fugasen las conducciones o en los tanques subterráneos dealmacenamiento y (3) derrames de crudo en el mar des-pués de accidentes en buques de transporte. Existen impor-tantes revisiones bibliográficas sobre este tema [3,17,75].A continuación, se enumeran algunas de las consideracio-nes generales con relación a cualquier proceso de degrada-ción biológica de compuestos derivados del petróleo:

1. La biodegradación de todos los hidrocarburosrequiere la disponibilidad de aceptores electró-nicos: oxígeno, peróxido de hidrógeno, en eco-sistemas terrestres, y nitrato o sulfato, en lascondiciones anaerobias que prevalecen en losestratos profundos del suelo.

2. La biodegradación de alcanos así como las rutasmetabólicas implicadas están bien identificadas.El conjunto de compuestos degradables incluyelos de cadena ramificada como el pristano, aun-que la estructura ramificada puede presentar un obstáculo importante. Con respecto a la bio-degradación de los hidrocarburos aromáticos,mientras que el naftaleno y el fenantreno sonfácilmente degradables, los aromáticos policí-clicos de más de cinco anillos son más recalci-trantes.

3. Muchas bacterias producen surfactantes comorespuesta a la presencia de hidrocarburos. Estehecho se ha comprobado tanto en bacterias quedegradan alcanos como en las degradadoras depolicíclicos aromáticos.

4. En algunas ocasiones, aunque no se produzcauna biodegradación considerable, se pueden pro-ducir biotransformaciones beneficiosas. Porejemplo, el diciclopentadieno, producido pirolí-ticamente en las plantas petroquímicas y que secaracteriza por su olor desagradable y pene-trante, aunque puede ser completamente degra-dado por una población mixta bacteriana, estransformado, en su mayor parte, en una serie decompuestos oxigenados que no presentan esacaracterística.

De los trabajos publicados en el tema de biodes-contaminación de emplazamientos contaminados conhidrocarburos [4,7,8,22,64,72,98] se pueden extraer algu-nas conclusiones generales entre las que cabe destacar laevidencia de que la adición de nutrientes inorgánicos, fun-damentalmente nitrógeno, y la provisión de oxidantes ade-cuados, facilitan el proceso de biodegradación. Por otraparte, la inoculación con microorganismos exógenos,incluso cuando estos microorganismos hayan sido aisladosdel mismo emplazamiento contaminado, no es en generalefectiva. Los microorganismos endógenos resultan efecti-vos, siempre y cuando, dispongan de los nutrientes ade-cuados y se les suplemente con oxígeno, como tal o enforma de peróxido de hidrógeno. La mayor eficiencia seobtiene probablemente optimizando la capacidad de lamicroflora indígena que es prácticamente ubicua.

A la hora de poner en marcha una estrategia de des-contaminación biológica, hay una serie de cuestiones quedeben ser respondidas para integrar los distintos factoresinvolucrados y elaborar un protocolo jerarquizado de tra-tamiento. En primer lugar, hay que conocer los compues-tos contaminantes que están presentes y cuales de ellosdeben ser eliminados. Hay que decidir que tipo de micro-organismos van a ser empleados (exógenos o indígenas) yhay que diseñar el método que va a permitir evaluar elgrado de éxito del tratamiento aplicado. En general, sepuede establecer un sistema de evaluación en tres etapasque incluye: (1) estudios básicos de laboratorio (2) estu-dios con microcosmos usando material del emplazamientocontaminado y (3) evaluación del tratamiento en sistemasde mayor escala ya sea plantas piloto o instalaciones insitu. Es indispensable considerar, desde el principio ydurante el desarrollo de todo el proceso, las interaccionesentre los aspectos microbiológicos, geológicos, químicos yde ingeniería de procesos.

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Figura 3. Estructura de algunos hidrocarburos policíclicos aromáticos.

Pericondensados Catacondensados

PirenoC16H10

CoronenoC24H12

NaftalenoC10H8

FenantrenoC14H10

PerilenoC20H12

Benzo[ghi]perilenoC22H12

TetrafenoC18H12

CrisenoC18H12

OvalenoC32H14

AntantrenoC22H12

PentafenoC22H14

PentacenoC22H14

Experimentos de laboratorio

Hay que tener en cuenta los siguientes aspectos apli-cables tanto a organismos exógenos como flora indígena:

1. Examen de las rutas metabólicas implicadas,incluyendo formación de metabolitos interme-dios o finales.

2. Requerimiento de substratos como fuente decarbono, nitrógeno, fósforo y azufre.

3. Establecimiento de los valores óptimos de tem-peratura, pH y concentración de oxígeno.

4. Toxicidad de substratos.5. Inducción de enzimas catabólicas, mediante cre-

cimiento sobre un substrato relacionado estruc-turalmente con el/los contaminantes.

6. Degradación de un compuesto, simultáneamenteal crecimiento del microorganismo sobre otrosubstrato compatible metabólicamente (co-meta-bolismo o metabolismo concurrente).

7. Existencia de mezclas de substratos incompati-bles metabólicamente.

8. Utilización de sondas biológicas adecuadas paradetectar la presencia de microorganismos espe-cíficos o sus actividades.

En el caso de microflora indígena, se requieredeterminar la presencia de dichos microorganismos, sunúmero y su actividad metabólica por procedimientos con-vencionales de laboratorio. Puede ser conveniente poner apunto cultivos enriquecidos, empleando muestras delemplazamiento contaminado, con objeto de disponer dematerial adecuado para realizar los estudios de laboratorioy con microcosmos.

Experimentos con microcosmos

Estos experimentos deben plantearse con materialrecogido del emplazamiento contaminado y simular condi-ciones aerobias, anaerobias o microaerófilas. Deben pro-porcionar los datos cinéticos necesarios para el tratamientoa gran escala, fundamentalmente los siguientes:

1. Tasas de degradación o desaparición de subs-tratos.

2. Datos sobre la existencia y la estabilidad de me-tabolitos y su toxicidad para otros organismos.

3. Existencia de concentraciones de substrato um-bral, por debajo de las cuales las tasas de degra-dación biológica son muy lentas o despreciables.

4. Capacidad de inducir la degradación utilizandoanálogos de substratos y metabolitos.

5. Estabilidad del sistema durante un tiempo deoperación prolongado.

En esta fase de estudio, es conveniente establecer lasecuencia de métodos que va a permitir evaluar el grado debiodescontaminación obtenido con el tratamiento utili-zado. Entre otras, se pueden considerar las siguientes téc-nicas: (1) empleo de substratos marcados radiactivamente(que en general no podrán utilizarse en la etapa de expe-rimentación en campo), (2) evaluación de metabolitos y (3) evaluación de marcadores como por ejemplo enzimasespecíficas.

Tratamientos a gran escala

En esta etapa se hace necesaria la colaboraciónestrecha con geólogos e ingenieros. En ocasiones, las con-diciones que se habían mostrado como óptimas en las eta-pas de experimentación previas, no resultan adecuadascuando son aplicadas a la situación real. Esto puede abo-

car a un nuevo estudio de las condiciones de operación enla fase anterior o, incluso, en ensayos de laboratorio. Unbuen ejemplo, es el caso de la aplicación de sistemas debombeo y tratamiento, cuando los substratos tienen unabaja permeabilidad que puede ser debida a movilización dematerial coloidal en el sistema y a la subsiguiente deposi-ción y atasco en los puntos de inyección. Es posiblementedesaconsejable evaluar estrategias alternativas una vez queel proceso a gran escala esté en marcha. Todos los proble-mas específicos del aumento de la escala de operacióndeben ser detectados y resueltos. Entre otros cabe destacar:(1) movilidad de microorganismos, substratos, nutrientes y metabolitos (2) transporte de oxígeno y mantenimientode otros aceptores de electrones, por ejemplo nitrato y (3) estabilidad del sistema completo.

Como conclusión general, se puede decir que si bienel potencial de la biodescontaminación es prometedor, suaplicación tiene importantes limitaciones. Según Allard yNeilson autores de un exhaustivo estudio bibliográfico [1]sobre las posibilidades de los tratamientos biológicos dedescontaminación, para sortear estas limitaciones es nece-sario conceder la atención adecuada a la integración de losfactores microbiológicos, químicos y de ingeniería, en eldesarrollo del tratamiento a escala real ya que muchos delos datos experimentales, obtenidos en ensayos de labora-torio o en biorreactores de pequeño tamaño, no son extra-polables a las condiciones reales de operación.

Un aspecto importante a tener en cuenta es el pro-pio proceso de atenuación natural que se pone en marchacuando tiene lugar una contaminación. Por ejemplo, en elcaso de un derrame de petróleo (Figura 4), a medida quela mancha de hidrocarburos se va moviendo por el interiordel suelo una parte puede ser atrapada en los poros delmismo y en los sedimentos (saturación residual); otra partepuede evaporarse (volatilización); una tercera fracciónpuede adsorberse en las partículas del suelo (adsorción) y finalmente una parte puede disolverse en el agua sub-terránea (pluma disuelta). Puesto que el conjunto de hidro-carburos del petróleo es menos denso que el agua, el líqui-do puede flotar sobre la capa freática subiendo y bajandocon las fluctuaciones estacionales de dicha capa. Estehecho puede crear una zona amplia de saturación residual.Con el avance de la pluma de hidrocarburos disueltos, laconcentración de estos disminuye por los efectos de dilu-ción y dispersión. Los microorganismos pueden degradarlos hidrocarburos que están disueltos, volatilizados o ad-sorbidos.

Entre los aspectos microbiológicos, que siguen pre-sentando las mayores incógnitas a la hora de aplicar estosprocesos de descontaminación, merecen especial atenciónlos siguientes:

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Figura 4. Efectos de una contaminación por derrame de hidrocarburos yposibles procesos de atenuación que tienen lugar.

a) Grado de accesibilidad de los compuestos,objeto del tratamiento, a los microorganismosque pueden efectuar su degradación.

b) Capacidad de mantener o, incluso, incrementarla población de microorganismos responsablesde la degradación.

c) Biodegradabilidad relativa de los distintos com-ponentes en el caso de mezclas complejas decontaminantes, como hidrocarburos policíclicosaromáticos o bifenilos policlorados, ya que enocasiones los componentes menos degradablespueden ser los más peligrosos, desde el punto devista toxicológico y ambiental.

d) Incluso cuando el porcentaje de eliminación deun determinado contaminante sea elevado, pue-de que la eliminación mayoritaria o total no seaposible, debido a la existencia de concentracio-nes umbral por debajo de las cuales la degrada-ción se dificulta o se hace imposible.

e) Es necesario disponer de una metodología fiablepara decidir el éxito del tratamiento. La desapa-rición del contaminante no es suficiente para es-tablecer la eficiencia del proceso, ya que, comoresultado de la biotransformación, pueden origi-narse productos intermedios y finales de igual osuperior toxicidad que el compuesto inicial.

Aplicaciones de hongos en tratamientos debiodescontaminación

Aunque buena parte de los estudios de descontami-nación biológica se han centrado en bacterias por la facili-dad que ofrecen para estudiar sus vías metabólicas y llevara cabo construcciones genéticas que permitan degradarespecíficamente determinados compuestos contaminantes,la capacidad de los hongos para transformar una granvariedad de compuestos orgánicos y llevarlos hasta CO2 yH20 ofrece un potencial indiscutible para su utilización enprocesos de tratamiento de contaminaciones. Ese potencialradica fundamentalmente en las características de su sis-tema enzimático y en su vigoroso crecimiento que les per-mite, a través del desarrollo de su micelio, colonizar dife-rentes tipos de sustratos y acceder a los compuestos queconstituyen las contaminaciones más frecuentes de lossuelos. El elevado valor de la relación superficie/volumencelular de los hongos filamentosos les convierte en efica-ces degradadores en determinados nichos como los sueloscontaminados. Por otra parte, los hongos tienen una capa-cidad muy notable para acumular metales pesados comocadmio, cobre, mercurio, plomo y zinc, lo que está demos-trado por los aislamientos realizados en minas de cobre,zinc o plomo.

También se ha detectado una gran diversidad deespecies que viven en ríos con una alta concentración deminerales y bajo pH como Río Tinto (Huelva) [71]. Enotros trabajos se ha estudiado su capacidad como eficien-tes secuestradores de isótopos radiactivos [96] lo quepodría resultar de utilidad para descontaminar zonas afec-tadas por accidentes nucleares.

Entre los basidiomicetos que causan la podredum-bre blanca de la madera que se corresponde aproximada-mente con el 96% de las Poliporáceas, se encuentran lasespecies con las características más adecuadas para ser uti-lizadas en diferentes procesos biotecnológicos, incluidoslos de biodescontaminación. En este sentido, la investiga-ción de la ecología y fisiología de dichos hongos juega unpapel relevante en el desarrollo de biotecnologías emer-gentes como la obtención de pulpa biomecánica, el blan-

queo enzimatico de pulpas, la decoloración de efluentesindustriales (papeleros, cerveceros, azucareros...), la de-gradación de contaminantes orgánicos y el biotratamientode colorantes industriales.

Los hongos de podredumbre blanca disponen entreotras, de una capacidad muy relevante, que es la de degra-dar mayoritariamente la lignina, un polímero polifenólicoheterogéneo que es uno de los tres componentes principa-les de los sustratos lignocelulósicos. En algunos casos, elresultado final de su acción confiere una apariencia blan-quecina a la madera atacada como consecuencia de ladesaparición de la lignina. Aunque existen algunos asco-micetos degradadores de lignina [29], los hongos lignino-líticos más eficaces se encuentran entre los basidiomicetos.Para ello, cuentan con una batería de enzimas extracelula-res, oxidasas y peroxidasas, que contribuyen, en determi-nadas condiciones, a despolimerizar la compleja estructurade la lignina [25,40,52,59,66,105]. La oxidación y rupturade la molécula de lignina tiene como finalidad principaleliminar dicha barrera química y posibilitar el acceso a lospolisacáridos de la madera que constituyen una importantefuente de energía [51].

La peculiar irregularidad estructural del polímerode lignina, hace que estas enzimas se caractericen por unosmecanismos de acción no específicos que oxidan los ani-llos aromáticos constitutivos de dicho polímero [45,81].Las enzimas que participan en este proceso son: ligninaperoxidasa (LiP, E.C. 1.11.1.14), peroxidasa dependientede Mn (MnP, E.C. 1.11.1.13) y lacasa, una fenoloxidasaque contiene principalmente cobre [67,84]. El patrón deexpresión de esas actividades enzimáticas depende de losdiferentes organismos, mientras unos secretan LiP y MnP(no producen lacasas), otros secretan MnP y lacasas (noproducen LiP). Existen otras enzimas asociadas con lasanteriores en la degradación de lignina de una maneraindirecta: glioxal oxidasa (E.C. 1.2.3.5) y superóxido dis-mutasa (E.C. 1.15.1.1) que producen H2O2, compuestorequerido para la actividad de LiP y MnP [66]. Finalmente,otras enzimas actúan como nexos de unión entre las dis-tintas vías de degradación de la lignocelulosa: glucosa oxi-dasa (E.C. 1.13.4), aril alcohol oxidasa (E.C. 1.13.7), celo-biosa quinona oxidorreductasa (E.C.1.15.1) y celobiosadeshidrogenasa (E.C.1.199.18) [66,84]. Leonowicz et al.han propuesto un modelo de interacción de estas enzimasen el proceso de degradación de lignina por hongos ligni-nolíticos [66].

La inespecificidad química y la intensa actividadoxidante de estas enzimas les otorga una considerablecapacidad de degradar diferentes compuestos orgánicoscon una estructura similar a la de las unidades monoméri-cas que constituyen la lignina. Entre los diferentes xeno-bióticos que pueden ser transformados por hongos basi-diomicetos, se encuentran fundamentalmente: pesticidas,hidrocarburos aromáticos (benzo �-pireno, fenantreno,pireno, etc.) compuestos orgánicos clorados (pentaclorofe-noles, cloroanilinas, bifenilos policlorados…) azocoloran-tes, etc. [9,16,30-32,34,35,38,39,42,78,84,86,]. En los últi-mos años, los hongos basidiomicetos de podredumbreblanca han sido utilizados para descontaminar suelos oaguas por su especial capacidad para degradar compuestosxenobióticos del tipo de hidrocarburos aromáticos poli-cíclicos, aspectos sobre los que se han realizado ampliasrevisiones por varios autores [5,9,12,13,60,78]. Asimismo,se ha mostrado la capacidad de estos organismos paradecolorar efluentes de industrias aceiteras, textiles o pape-leras [2,27,28,38,93,100].

Como se puede constatar en la bibliografía, durantelos últimos años se ha producido un importante avance en elconocimiento de la fisiología de los hongos basidiomicetos

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y su aplicación en procesos relacionados con la degrada-ción de lignina y el tratamiento de contaminantes. Se haestudiado la capacidad de estos hongos para degradar omodificar diferentes sustratos tales como, pulpas papele-ras, clorofenoles, hidrocarburos policíclicos aromáticos,lignina kraft, sustratos lignocelulósicos, etc. con lacasas yMnP de Trametes versicolor [27,44,50,53-57,88,103];pulpa kraft, hidrocarburos policiclicos aromáticos y carbo-nes de baja calidad con lacasas de Pycnoporus cinnaba-riuns [10,55,99]; creosota con lacasa de Pleurotus ostrea-tus [30]; compuestos aromáticos con lacasa de Marasmiusquercophilus [33], diversos contaminantes con lacasa deCerrena unicolor [36]; lignina con MnP de Phlebiaradiata y Nematoloma fordwardi [49]; residuos de laindustria de aceite de oliva con lacasa, LiP y MnP de Lentinula edodes, Phanerochaete flavido-alba, P. chrysos-poirum y Pleurotus ostreatus [26,61,79]; lignina con laca-sas azules y amarillas de Panus tigrinus [68]; hidrocar-buros aromáticos policíclicos con lacasa de Coriolopsisgallica [82,83]; lignina kraft con crudo de Trametes cingulata [77]. Algunos de los tratamientos con lacasa se han potenciado aplicando a los cultivos mediadores o inductores como es el caso del 1Hidroxibenzotria-zol (HBT) [14,37,53,54,70,89,95] que en algunos casoscumplen la función de estabilizadores de estas proteínasprolongando su actividad en el tiempo. Asimismo, se hanpublicado diversos trabajos sobre tratamiento de coloran-tes industriales con enzimas de basidiomicetos [89,91].

Estos avances han impulsado a numerosos grupos ainvestigar la biodegradación de hidrocarburos aromáticospolicíclicos, utilizando hongos de podredumbre blanca y/o sus enzimas. Se han publicado diversos trabajos de losque se concluye la gran diversidad de basidiomicetos con capacidad de degradar cuatro hidrocarburos aromáti-cos policíclicos: naftaleno, fluoranteno, criseno y benzo a-pireno. Los resultados obtenidos apoyan la hipótesis deque la participación de las LiPs, MnPs y lacasas difiere en función de las especies estudiadas y de las condicionesde cultivo [6,45]. El tratamiento del antraceno ha permi-tido determinar como se produce la apertura del anillo aro-mático por hongos [47]. Se ha estudiado, asimismo, laexpresión de los genes lip, durante el crecimiento dePhanerochaete chrysosporium y la oxidación de antracenoen suelos contaminados por dicho hidrocarburo. Expe-rimentos en medio sólido han demostrado la habilidad de diversas especies y/o sus enzimas extracelulares paradegradar numerosos hidrocarburos aromáticos [74]. Tam-bién se ha observado esa capacidad en tratamientos in situde suelos contaminados con compuestos xenobióticos,como en el caso de Phanerochaete sordida [62]. Otrosgrupos han demostrado la viabilidad de estos tratamien-tos, en condiciones naturales, depositando inóculos deestirpes miceliales en el suelo y constatando la efectividadde los mismos al obtener reducciones de hasta el 40% paradiferentes moléculas de hidrocarburos aromáticos policí-clicos [23,69].

En una revisión [25], Cullen hace una valoración delos avances obtenidos en la biología molecular de los hon-gos basidiomicetos en los últimos 10 años y analiza losprincipales resultados que ha proporcionado el estudio delsistema de degradación de Phanerochaete chrysosporiuma nivel molecular. Propone que el estado actual de la bio-logía molecular en estas especies se apoya fundamental-mente en los siguientes avances metodológicos: i) estan-darización para lo producción de auxótrofos, ii) análisis derecombinación, iii) puesta a punto de un sistema rápido depurificación de ARN y ADN y iiii) transformación gené-tica por complementación auxótrofa y por resistencia amarcadores [87].

El resultado más espectacular de los estudios deexpresión, ha sido la confirmación de que en los sistemasde producción de enzimas oxidantes extracelulares estánimplicados familias de genes, que a su vez codifican parafamilias de isoenzimas reguladas por parámetros medio-ambientales. La elucidación del papel y las interaccionesde las isoenzimas individuales en la degradación de ligninay de hidrocarburos aromáticos contaminantes, requiere laidentificación de isoenzimas específicas en sustratos com-plejos. En este sentido, experimentos específicos con téc-nicas de inmunocitoquímica han permitido localizar LiP,MnP y xilanasas sobre maderas atacadas por basidiomice-tos [11]. Asimismo, los experimentos llevados a cabo porLamar et al. [63] utilizando RT-PCR cuantitativa en suelocontaminado por hidrocarburos, permitieron detectar laexpresión de genes lip.

El análisis por RT-PCR ha aportado valiosa infor-mación sobre los factores que disparan los mecanismos de regulación de la expresión [18-20,43], de la mismamanera que las técnicas de transformación con ADN, per-mitirán el uso de constructos para estudios de las interac-ciones individuales promotor-regulador. Los estudios demutagénesis sitio dirigida [101,102] y sistema antisentido,junto con la expresión de sistemas recombinantes, podráaportar mayor información acerca de la contribución di-recta de los diferentes genes en los procesos de reciclaje enla naturaleza. La función de estos genes está dirigida tantohacia los ecosistemas naturales como aquellos que estándegradados por productos resultantes de la intervenciónhumana.

El hecho que P. chrysosporium haya demostrado sucapacidad para degradar fenantreno en condiciones no lig-ninolíticas y que otros hongos oxiden antraceno por algúnsistema independiente de lignina peroxidasa [12,24,47],sugiere que este grupo de hongos posee mecanismos paradegradar polímeros aromáticos, alternativos a los conoci-dos para degradar la lignina de la madera, que deberán serobjeto de futuras investigaciones.

Los hongos responsables de la degradación de lig-nina en la naturaleza y sus enzimas tienen, por lo expuestoanteriormente, unas perspectivas importantes de aplica-ción, no sólo en la industria papelera donde la eficien-cia de eliminación de lignina es un aspecto primordial(biopulpeo y bioblanqueo de pastas), sino también en losprocesos de biorremediación de contaminaciones diversas.El interés de la aplicación de estos microorganismos ensuelos contaminados se refleja en las publicaciones ypatentes que han aparecido en los últimos años sobre elestudio y desarrollo de procesos de biodegradación dediferentes contaminantes. Como en el caso de aplicaciónde cualquier tecnología, la biodescontaminación con hon-gos debe ser, además de factible de aplicarse en condicio-nes de campo –y sobre este punto se están llevando a cabocuantiosas investigaciones que deberán esclarecer la natu-raleza exacta y la regulación de la actividad enzimática delos hongos basidiomicetos–, respetuosa con el entornonatural en el que tiene que desarrollarse y competitivadesde un punto de vista económico. En estos últimosaspectos, los hongos degradadores de lignina reúnen carac-terísticas ecológicas y metabólicas muy valiosas ya queson degradadores naturales de compuestos xenobióticos yse encuentran frecuentemente asociados a los espacioscontaminados por dichos compuestos. Por otro lado, su ca-pacidad de desarrollarse sobre residuos agrícolas y fores-tales de bajo coste [15,30,92] y el hecho de que sus inócu-los puedan ser producidos masivamente mediante técnicasconvencionales de uso industrial habitual, les hace candi-datos singulares para su utilización en procesos de biorre-mediación.

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Conclusiones

La biodescontaminación es un proceso espontáneoo dirigido en el cual se utilizan procedimientos biológicos,fundamentalmente microbiológicos, para degradar o trans-formar los contaminantes hasta formas menos tóxicas o notóxicas y mitigar, como consecuencia, la contaminaciónambiental. En presencia de oxígeno suficiente (condicio-nes aerobias) y nutrientes, los microorganismos convier-ten, finalmente, muchos contaminantes orgánicos en dió-xido de carbono, agua y biomasa microbiana. En ausenciade oxígeno, (condiciones anaerobias), el aceptor electró-nico es otro compuesto distinto del oxígeno molecular, talcomo sulfato, nitrato o dióxido de carbono y los contami-nantes se metabolizan finalmente a metano, cantidadeslimitadas de dióxido de carbono y trazas de hidrógeno.Hasta la fecha, la mayoría de las tecnologías de desconta-minación biológica se han desarrollado para el tratamientode contaminaciones por compuestos orgánicos, aunquemuchos de los contaminantes más persistentes en elmedioambiente, tales como bifenilos policlorados (PCB) ehidrocarburos policíclicos aromáticos (PAH), son difícil-mente degradables por la acción de los microorganismos.

Un buen número de condiciones ambientales pue-den hacer más lento o, incluso, detener un proceso de bio-degradación. Es importante, por lo tanto, realizar previa-mente un estudio de viabilidad que permita prever laeficiencia de un tratamiento biológico y decidir finalmentesobre la conveniencia de ponerlo en marcha. Algunos delos parámetros más importantes a tomar en consideraciónpara la caracterización del emplazamiento, incluyen la bio-degradabilidad, la distribución del contaminante en las dis-tintas fases, el potencial de lixiviación, la reactividad quí-mica de los contaminantes, el tipo y propiedades del suelo,la disponibilidad de oxígeno y la presencia o ausencia desustancias inhibidoras. Aunque la biodescontaminación esen principio una técnica prometedora, deben conocerse ytenerse en cuenta sus limitaciones y los criterios para eluso adecuado de dicho proceso. Entre las limitaciones, seencuentra el grado final de descontaminación alcanzable,el tiempo requerido para alcanzarlo, la posibilidad de quese generen productos intermedios tóxicos, etc. Los costesde un proceso biológico de tratamiento varían muchodependiendo de diversos factores tales como, tipo y canti-dad de contaminantes presentes, condiciones del emplaza-miento, volumen de material a procesar, objetivo finalespecífico del tratamiento, extensión y profundidad de lacontaminación, uso de microorganismos exógenos y/o adi-tivos para aumentar la tasa de descontaminación, etc.

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La utilización de las capacidades degradadoras delos microorganismos es la base fundamental de los trata-mientos biológicos de contaminaciones orgánicas. En con-secuencia, el conocimiento de las características fisiológi-cas y bioquímicas así como de la ecología y genética delas especies o consorcios microbianos involucrados, es unrequisito esencial, junto con el conocimiento de la natura-leza del emplazamiento y la elección de un protocoloadecuado, para lograr el objetivo de dichos tratamientos.El uso de metodologías adecuadas para determinar elestado de “salud” de un suelo, un ambiente acuático o laatmósfera, mediante tecnologías que incluyen la aplicaciónde biosensores, puede ser de gran utilidad y abre nuevaslíneas en la investigación en enclaves contaminados. El éxito final de un proceso de descontaminación biológicaen condiciones reales requiere una aproximación multidis-ciplinar que incluya a especialistas en muy diversos cam-pos. El desarrollo y aplicación de tecnologías baratas, efi-caces y respetuosas con el medio ambiente depende de laintegración de diversas disciplinas, así como de la profun-dización en el conocimiento básico de los factores fisico-químicos, biológicos y ecológicos que gobiernan la degra-dación de contaminantes orgánicos in situ y ex situ.

Las técnicas de tratamiento de contaminaciones pormétodos biológicos, requieren todavía muchos estudiosadicionales para conocer con mayor profundidad los meca-nismos biológicos responsables de la degradación de loscontaminantes, así como el conjunto de características(tanto bióticas como abióticas) que conforman el complejoentorno (suelo, aire, agua) en el que se produce la conta-minación y para el que hay que diseñar sistemas específi-cos de tratamiento en cada caso.

En este contexto, se puede añadir, finalmente, quelos hongos basidiomicetos, que han mostrado su capacidadincluso para solubilizar parcialmente el carbón, un com-puesto altamente polimérico más complejo que la lignina,se configuran como uno de los grupos biológicos con másposibilidades de ser aplicados en procesos de biorremedia-ción en el futuro.

Los autores agradecen la contribución ténica de José María Carbajo.

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