1

ISOLASI ENZIM α-AMILASE TERMOSTABIL DARI HASILSKRINING BAKTERI TERMOFILIK DI SUMBER AIR PANAS SONAI

SULAWESI TENGGARA

Sapto Raharjo, Andi Noor Kholidha Syarifin, L.M. RamadhanFakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Haluoleo, Kendari

ABSTRAK Isolasi dan karakterisasi enzim α-amilase termostabil dari isolat bakteri

termofilik terpilih S60T3-4 telah dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan penentuan kondisi optimum (substrat, pH, dan suhu) bagi aktivitas enzim yang diperoleh untuk kemudian bisa digunakan pada aplikasi industri. Isolasi bakteri diawali dengan pengambilan sampel di Sumber Air Panas Sonai kemudian dilakukan seleksi terhadap isolat yang memiliki aktivitas amilolitik tertinggi menggunakan larutan iod. Isolat S60T3-4 dipilih untuk digunakan dalam produksi enzim α-amilase karena memiliki aktivitas tertinggi dimana indeks amilolitik yang ditunjukkan adalah 4,8. Hasil pengamatan morfologi menunjukkan bahwa isolat tersebut merupakan bakteri gram negatif berbentuk monococcus dan koloninya berbetuk putih bulat. Enzim α-amilase dalam bentuk ekstrak kasar memiliki aktivitas spesifik 2,141 U/mg enzim, setelah ekstraksi dengan (NH4)2SO4 40% - 60% aktivitas spesifiknya 4,117 U/mg enzim, dan setelah dialisis aktivitas spesifknya menjadi 3,54 U/mg enzim.Aktivitas α-amilase termostabil mencapai optimumnya pada konsentrasi substrat amilosa 1,5%; nilai pH 7,5; dan suhu 80oC..

Kata kunci :α-amilase, bakteri termofilik, enzim termostabil.

ABSTRACTIsolation and characterization of thermostable α-amylase from selected

thermophilic bacteria S60T3-4 had been carried out. The aim of this study was to determine the optimum condition (substrate concentration, pH, and temperature) for enzyme activity that was obtained to be used on industrial application. Isolation of the bacteria was started by sampling on Sonai Hot Spring, and than continued by selecting the bacteria with highest activities using iodium reagent. S60T3 isolate was chosen to be used on enzyme production because of its highest activity that was shown by its amylolitic index 4,8. Based on the morphology observation, the isolate was gram negative bacteria with monococcus form and its colony was white and circle. Crude enzyme of α-amylase had specific activity 2,141 U/mg, after fractination with (NH4)2SO4 40% - 60%, the activity became 4,117 U/mg and after dialysis the activity became 3,54 U/mg. The optimum concentration of substrate was on 1,5 % soluble starch, optimum pH 7,5 and the optimum temperature for thermostable α-amylase activity in this study was 80oC.

Keyword : α-amylase, thermophilic bacteria, thermostable enzyme

2

PENDAHULUANPeranan enzim sebagai biokatalisator dalam berbagai bidang industri semakin

penting. Enzim yang diproduksi secara komersial, telah banyak digunakan dalam bidang industri, analisis, dan kedokteran. Oleh karena itu, berkembangnya berbagai teknologi proses pada industri biologi yang menggunakan enzim akan memerlukan berbagai jenis enzim dengan spesifikasi masing-masing (Richana, et al., 2009).

Saat ini, enzim amilase (α-amilase, β-amilase dan glukoamilase) merupakan salah satu enzim paling penting di bidang bioteknologi. Enzim yang berasal dari famili amilase memiliki potensi luas pada berbagai aplikasi industri. Amilase yang menguasai kurang lebih 25 % perdagangan enzim sangat berperan pada proses hidrolisis pati di bidang industri untuk berbagai keperluan. Jumlah aplikasi enzim menjadi semakin meningkat dengan ditemukannya enzim termostabil. Hal ini berdampak pada semakin berpeluangnya penggunaan enzim di berbagai jenis aplikasi industri (Haki, 2003), sebab proses termofilik lebih stabil, cepat, murah, serta memudahkan aktivitas reaktan (Rasooli, et al., 2008).

Karakteristik organisme termofilik adalah kemampuannya untuk memproduksi enzim termostabil yang memiliki kestabilan pada proses produksi dengan suhu tinggi serta kemampuan organisme tersebut untuk beraktivitas lebih lama. Industri gula cair sangat memerlukan enzim α-amilase termostabil yang masih aktif pada temperatur tinggi, misalnya pada proses gelatinisasi (100-110oC) dan proses pencairan (80-90oC). Oleh karena itu, dibutuhkan suatu penelitian yang berkesinambungan agar diperoleh lebih banyak enzim α-amilase yang bersifat termofilik dan termostabil (Rasooli, et al., 2008). Aplikasi mikroorgnisme temofilik pada proses fermentasi juga mencegah kontaminasi dari bakteri mesofilik yang lain (Ahmaloka, et al., 2006).

Mata air panas atau sumber air panas adalah mata air yang dihasilkan akibat keluarnya air tanah dari kerak bumi setelah mengalami pemanasan geotermal. Indonesia adalah salah satu kawasan tektonik yang paling aktif di dunia dengan lebih dari 70 gunung merapi yang masih aktif, dan memiliki banyak daerah geotermal (Ahmaloka, et al., 2006).

Sejumlah mikroorganisme termofilik telah diisolasi dari sumber air panas di kawasan Indonesia. Namun, hingga saat ini belum ditemukan bakteri termofilik yang berasal dari kawasan Sulawesi, khususnya di Sulawesi Tenggara. Sumber Air Panas Sonai merupakan daerah yang berpotensi sebagai salah sumber bakteri termofilik yang memiliki aktivitas amilolitik. Di sekitar sumber air panas tersebut terdapat area tanaman sagu, sehingga memungkinkan di daerah tersebut hidup bakteri termofilik dengan aktivitas amilolitik yang tinggi.

TUJUANTujuan kegiatan ini adalah untuk melakukan skrining bakteri dari sumber air

panas Sonai Sulawesi Tenggara dan mengisolasi enzim α-amilase termostabil dari bakteri tersebut serta melakukan karakterisasi pH, suhu, dan substrat optimum terhadap aktivitas enzim yang telah diproduksi.

METODE PENELITIAN

Waktu dan TempatPengambilan sampel dilakukan di Sumber Air Panas Sonai Sulawesi

Tenggara. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Matematika dan

3

Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Haluoleo. Keseluruhan tahapan penelitian dilakukan mulai bulan Juli 2009 hingga Februari 2010.

Alat dan BahanAlat-alat yang digunakan yaitu: oven incubator, timbangan analitik, autoklaf,

Laminar Air Flow (LAF), Shaker incubator, Waterbath, pH meter, Mikroskop, Spektofotometer (Spektronik 20D genesys), cawan petri, Jarum ose, pinset, dan pembakar bunsen. Selain itu, juga digunakan alat-alat gelas berbagai ukuran, meliputi erlenmeyer, labu takar, pipet ukur, gelas ukur, pipet tetes, gelas kimia, dan tabung reaksi.

Bahan yang digunakan berupasampel air dari Sumber Air Panas Sonai, media NA (0.5 % pepton, 0.3 % ekstrak daging, 1,5 % agar), media pati, media LB (Pepton 0,5 %, Yeast Extract 0,25 %, NaCl 0,5 %, MgSO4.7H2O 0,3 %, CaCl2 0,01 %, H3BO3

0,001 %, Molibdat 0,01 %), larutan iod, media produksi, buffer pH 4–9, BaCl2 1 %, Etanol 96%, (NH4)2SO4, Reagen DNS (Dinitrosalisilat), larutan maltosa, Bovin Serum Albumin (BSA), reagen biuret, dan reagen uji biokimia bakteri meliputi berbagai larutan kaldu karbohidrat, metil merah, voges proskauer, sitrat, dan gelatin.

Prosedur KerjaSecara umum, prosedur kegiatan penelitian yang telah dilakukan adalah :

Gambar 1. Bagan Prosedur Penelitian

Isolasi dan Screening Bakteri Termofilik Penghasil α-AmilaseSebanyak 500 mL media LB disiapkan dan disterilisasi. Kemudian disimpan

dalam termos dan dibawa ke tempat pengambilan sampel air panas. Sampel diambil dari sumber air panas Sonai Konawe Sulawesi Tenggara di empat titik (T1, T2, T3,

- Karakterisasi substrat optimum- Karakterisasi pH optimum- Karakterisasi suhu optimum-

Data Pengamatan

Sumber Air Panas

Suhu 40oC Suhu 50oC Suhu 60oC Suhu 70oC

- Identifikasi aktivitas bakteri

Bakteri dengan aktivitas tertinggi

- Uji biokimia- Pengamatan

morfologi

Data Pengamatan

- Produksidan Pemurnian Enzim α-amilase termostabil

Enzim α-amilase termostabil

4

dan T4). Sampel dari keempat titik tersebut ditentukan suhu dan pH nya, kemudian dimasukkan ke dalam media cair LB yang telah disterilkan. Setelah diinkubasi selama 2 hari pada suhu 40oC, sampel kemudian dipindahkan ke media NA dan diinkubasi kembali selama dua hari. Isolasi dilakukan berulang-ulang sampai diperoleh isolat tunggal (kultur murni) untuk masing-masing koloni. Hal yang sama juga dilakukan untuk suhu yang lebih tinggi (50, 60, dan 70oC).

Setelah diperoleh isolat tunggal dari berbagai koloni yang diperoleh, maka dilakukan skrining untuk masing-masing suhu agar diperoleh bakteri amilolitik yang memiliki aktivitas pada suhu tertinggi.Skrining bakteri amilolitik dilakukan dengan menumbuhkan isolat pada media pati selama dua hari. Degradasi pati akan menghasilkan zona bening di sekitar koloni setelah penambahan Lugol’s iodine ke dalam cawan (Fossi et al., 1995).

Uji Biokimia dan Pengamatan Morfologi BakteriIsolat bakteri diindentifikasi berdasarkan ciri morfologi dan karakteristik

biokimia. Parameter identifikasi meliputi morfologi koloni, sifat gram, bentuk endospora, produksi katalase, pertumbuhan anaerob, reaksi Voges-Proskauer (VP), uji pati, uji sitrat, uji lecithinase, uji nitrat, dan lain-lain. Identifikasi lebih lanjut dilakukan berdasarkan metode Bergey’s Manual and Systematic of Bacteriology (Apun et al., 2000).

Pengukuran Kurva Pertumbuhan Bakteri Pengukuran kurva petumbuhan bakteri dilakukan setiap 2 jam. Pertumbuhan

bakteri ditentukan secara spektrofotometer dengan mengukur kekeruhan sel pada panjang gelombang 600 nm (Rasooli, et al., 2008).

Produksi Enzim α-AmilaseProses fermentasi dilakukan dengan sistem batch menggunakan

bioreaktor.Waktu produksi optimum enzim ini diukur dengan melihat pertumbuhan jumlah sel bakteri, konsentrasi enzim, dan jumlah produk hasil hidrolisis berdasarkan kurva pertumbuhan yang telah dibuat.

Pemurnian Enzim α-AmilaseBeberapa tahapan pemurnian enzim yang dilakukan pada penelitian ini adalah

sentrifugasi, ekstraksi dengan Amonium sulfat, dan dialisis. Masing-masing tahapan pemurnian tersebut didasarkan pada perbedaan sifat masing-masing komponen yang terkandung dalam campuran enzim baik sifat fisika maupun kimianya.

a. Sentrifugasi

b. Ekstraksi

c. Dialisis

Penentuan Aktivitas EnzimAktivitas enzim diukur dengan mencampur 1 mL enzim,1 mL substrat

amilosa 1%, dan 1 mL buffer pH optimum lalu diinkubasi selama 60 menit. Inkubasi dihentikan dengan penambahan 2 mL pereaksi DNS kemudian dikocok dan dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit. Selanjutnya didinginkan dalam air es dan ditambahkan akuades sampai volumenya menjadi 10 mL. dan diukur absorbansinya pada λ 550 nm (Shaw et al, 1995)

Pengukuran Kadar Protein Enzim

5

Kadar protein enzim ditentukan berdasarkan Metode Biuret, dengan cara mencampur 1 mL enzim dengan 4 mL reagen biuret dan didiamkan selama 30 menit, kemudian diukur absorbansinya pada λ 550 nm dengan menggunakan Bovin Serum Albumin (BSA) sebagai standar protein (Aiyer, 2004)..

Penentuan Kadar Substrat Optimum Enzim Penentuan substrat optimum untuk aktivitas enzim dilakukan dengan

membuat variasi kadar substrat yang digunakan selama inkubasi. Substrat pati divariasikan dari 0,25 % -1,75 %. Penentuan pH Optimum Aktivitas Enzim

Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim α-amilase diukur melalui inkubasi enzim kasar larutan buffer (diatur pada pH 3 – 9). Komposisi buffer yang digunakan adalah buffer sitrat pH 3,4 - 5,5; fosfat pH 5,5 – 8; dan Boraks-HCl pH 8,5 - 9.

Penentuan Suhu Optimum Aktivitas Enzim Pada penentuan suhu optimum, penentuan aktivitas enzim dilakukan

menggunakan kadar substrat dan pH optimum pada suhu yang divariasikan (30-100oC), dan diinkubasi selama 60 menit. Inkubasi dihentikan dengan penambahan reagen DNS.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi dan Identifikasi Bakteri

Berikut adalah data sampling yang dilakukan pada empat titik

Tabel 1. Data Sampling Sumber Air Panas Sonai

No. Sampel Asal pH Suhu (oC)1 T1 Sumber mata air 7 432 T2 ±5 meter dari T1 6 383 T3 ±15 meter dari T1 7 394 T4 Kolam permandian ±7 meter dari T1 8 41

Dari empat titik sampel tersebut dilakukan isolasi dan skrining bakteri. Diameter zona bening yang dihasilkan pada media pati yang dinyatakan dengan Indeks Amilolitik (IA) diukur dan digunakan sebagai indikasi adanya aktivitas amilolitik dari bakteri (Tabel 2). Isolat bakteri dengan aktivitas amilolitik tertinggi akan digunakan sebagai inokulum dalam produksi α-amilase.

Zona Bening

Koloni

Gambar 2. Pembentukan zona bening pada isolat S60T3-4

6

Tabel 2. Indeks Amilolitik Isolat Bakteri

Variasi Suhu (oC)

Isolat Bakteri

Indeks amilolitik

40

S40T1-4 1,7S40T1-5 -S40T2-4a 1,5S40T2-4b -S40T2-6a -S40T2-6b 0,3S40T3-4a -S40T3-4b -S40T3-5a -S40T3-5b 0,4S40T4-4 -S40T4-5 1S40T4-6 0,4

50S50T2-5 2S50T2-6 1,4S50T3-5 1,8

60

S60T2-4a 0,8S60T2-4b -S60T2-4c 1,8S60T2-5 -S60T2-6 2,2S60T3-4 4,8S60T3-5 2,9S60T4-4 3,4S60T4-5 1,4S60T4-6 3,4

Dari 26 isolat yang diperoleh, dipilih bakteri dengan aktivitas tertinggi yang dinyatakan dengan indeks amilolitik. Isolat S60T3-4yang ditumbuhkan pada suhu 60oC dari titik III memiliki indeks amilolitik tertinggi (gambar 2). Isolat ini kemudian diidentifikasi morfologinya dan dilakukan pengujian biokimia. Identifikasi morfologi bakteri menunjukkan bahwa isolat yang diperoleh memiliki koloni berwarna putih bulat. Isolat ini diduga merupakan bakteri berbentuk Monococcus dengan sifat gram negatif (Gambar 3).

Gambar 3. Morfologi Isolat S60T3-4 dengan Perbesaran 10 x 100

7

Untuk mengidentifikasi beberapa sifat S60T3-4dalam memfermentasi berbagai sumber nutrisi, maka dilakukan uji biokimia. Tabel 3 menunjukkan beberapa hasil uji biokimia terhadap isolat S60T3-4.

Tabel 3. Uji Biokimia pada Isolat S60T3-4No. Jenis Uji Hasil Uji1. Fermentasi Karbohidrat

Glukosa Positif Sukrosa Positif Manitol Positif Maltosa Negatif Laktosa Positif Dekstrosa Positif

2. Uji Metil Merah Negatif3. Uji Voges Proskauer Negatif4. Uji Sitrat Negatif5. Uji Gelatin Positif6. Uji Katalase Negatif7. Uji Hidrogen Sulfida Positif

Hasil dari Proses fermentasi bakteri ini berupa asam yang ditandai dengan positifnya beberapa uji fermentasi karbohidrat dengan berubahnya warna media kaldu karbohidrat yang semula merah berubah menjadi kuning. Asam yang dihasilkan dari hasil fermentasi dapat menurunkan pH media biakan dimana tidak terjadi fermentasi asam campuran yang ditandai dengan warna kaldu menjadi kuning menunjukkan hasil negatif pada uji Methyl Red. Bakteri ini juga tidak melaksanakan fermentasi butanadiol melalui uji Voges-Proskauerdengan berubahnya warna kaldu menjadi merah.

Isolat S60T3-4 tidak mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi, namun memiliki kemampuan menghidrolisis media biakan gelatin menjadi cair. Proses hidrolisis ini dikatalisasikan oleh eksoenzim yang disebut gelatinase. Gelatin yang telah dicerna tidak mampu membentuk gel dan bersifat cair (Lay, 1994).

Berdasarkan Bergey’s manual of determinative bacteriology, karateristik morfologi dan biokimia dari isolat S60T3-4 bakteri amilolitik asal Sumber Air Panas Sonai menunjukkan ciri-ciri dari genus Thermococcus yang merupakan kelompok Archae. Berikut adalah urutan taksonomi Genus Thermococcus berdasarkan Bergey’s manual Trust (2002).

Kingdom : MoneraDomain : ArchaeFilum : EuryaechaeotaKelas : ThermococciOrder : ThermococcalesFamily : ThermococcaceaeGenus : Thermococcus

Genus Thermococcus memiliki bentuk sel bulat yang terjadi dalam bentuk tunggal maupun berpasangan. Sel ini memiliki diameter 0,5 – 3 µm, memiliki suhu tumbuh 50 – 98°C, dan pH 4 – 8. Karateristik biokimia menunjukkan bahwa sel ini bersifat anaerob dengan menggunakan sulfur untuk proses respirasi maupun fermentasi. Kehadiran sulfur ditandai dengan terbentuknya H2S. Peptida,

8

karbohidrat, ekstrak ragi, tripton, ekstrak daging, dan kasein dapat digunakan sebagai sumber karbon dan energi. Fermentasi karbohidrat juga menunjukkan tidak terbentuknya gas H2 (Holt, et al., 1994).

Produksi Enzim α-Amilase Termostabil

Isolat dengan aktivitas tertinggi (S60T3-4) digunakan dalam produksi enzim karena kemampuannya dalam menghidrolisis pati yang paling tinggi. Enzim diproduksi pada bioreaktor dan menggunakan waktu fermentasi yang disesuaikan dengan kurva pertumbuhan yang telah dibuat. Pertumbuhan optimum isolat S60T3-4dicapai pada fase stasioner yaitu 36 jam waktu fermentasi. Oleh karena itu, enzim segera dipanen dalam keadaan stasioner sebelum terjadi fase kematian bakteri (Gambar 4).

Pemurnian Enzim α-Amilase Termostabil

Hasil fermentasi selama 36 jam kemudian dipisahkan dari sel bakteri dengan sentrifugasi (Tiwari, et al., 2007). Pemisahan ini didasarkan pada perbedaan berat molekul antara supernatan yang mengandung enzim dengan sel bakteri yang mengendap di akhir sentrifugasi. Selanjutnya dilakukan pengukuran aktivitas enzim dengan metode DNS (Dinitrosalisilat). Berdasarkan hasil pengukuran diperoleh aktivitas spesifiknya 2,141U/mL. Kadar protein diukur dengan metode biuret dan diperoleh 0,312 mg/mL kadar protein enzim.

Tahapan pemurnian selanjutnya yang dilakukan adalah pengendapan protein enzim dengan menggunakan amonium sulfat. Kelarutan protein pada konsentrasi ion yang rendah umumnya meningkat (salting in), sedangkan pada konsentrasi yang tinggi, kelarutan protein justru menurun (salting out). Sumber ion yang digunakan umumnya berupa garam. Garam yang sering digunakan adalah amonium sulfat, (NH4)2SO4. Penggunaan garam tersebut memberikan beberapa keuntungan, antara lain kelarutan dalam air tinggi (533 g/L pada suhu 20oC), harganya murah dan umumnya tidak mempengaruhi struktur protein (Suhartono, 1989).

Pemberian garam amonium sulfat divariasikan dengan kadar presentasi antara 20-80%, untuk mengetahui konsentrasi optimum amonium sulfat terhadap aktivitas enzim yang dimurnikan. Adapun pengaruh konsentrasi garam terhadap aktivitas enzim hasil pemurnian dengan fraksinasi amonium sulfat disajikan pada grafik berikut :

Gambar 4.Kurva Pertumbuhan Bakteri

9

Berdasarkan karakterisasi amonium sulfat, diperoleh data aktivitas enzim α-amilase hasil fraksinasi amonium sulfat tertinggi pada konsentrasi 40-60 % (b/v) amonium sulfat. Data tersebut tidak jauh berbeda dengan yang dilaporkan Safey dan Amar (2004), Fossi et al., (2005), dan Azad (2009), dimana fraksinasi amonium sulfat pada kadar 60 – 65 % telah memberikan aktivitas yang paling tinggi pada enzim α-amilase di banding fraksi-fraksi yang lain. Aktivitas enzim α-amilase termostabil menunjukkan nilai optimum pada pada 40-60 % karena setiap enzim memiliki residu asam amino tertentu dengan sifat hidrofobisitas yang spesifik. Ketika konsentrasi amonium sulfat sesuai dengan jumlah residu asam amino yang terkandung pada enzim yang ingin dipisahkan, maka aktivitasnya akan menunjukkan nilai optimum.

Enzim yang telah dimurnikan dengan fraksinasi amonium sulfat belum sepenuhnya murni, sebab dikhawatirkan masih mengandung sisa-sisa garam sehingga perlu dimurnikan lebih lanjut dengan metode dialisis. Metode dialisis menggunakan membran semipermeabel. Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan konsentrasi pada dua larutan, baik di dalam maupun di luar membran. Kemurnian enzim yang ditunjukkan oleh berkurangnya amonium sulfat dalam larutan enzim dapat ditentukan menggunakan indikator BaCl2. Indikator ini ditambahkan ke dalam buffer di luar membrane dialisis dan akan membentuk endapan putih jika bereaksi dengan amonium sulfat.

Berdasarkan data yang ditunjukkan Tabel 7, maka dapat kita amati bahwa aktivitas enzim setelah diekstraksi dengan amonium sulfat cenderung lebih meningkat dari aktivitas enzim kasar yang hanya 2,141 Unit/mg enzim menjadi 4,117

Gambar 5.Pengaruh Konsentrasi (NH4)2SO4 terhadap Aktivitas Enzim α-amilase Termostabil

0-20 20-40 40-60 60-80

10

Unit/mg dengan tingkat kemurnian 1,923 dari aktivitas enzim kasar. Namun, aktivitas enzim setelah dilakukan dialisis mengalami penurunan menjadi 3,54 Unit/mg dengan tingkat kemurnian 1,653 dari aktivitas enzim kasar. Pada proses dialisis, sisa-sisa garam amonium sulfat dikeluarkan dari larutan enzim.

Tabel 4. Aktivitas dan Kadar Protein Enzim α-amilase Termostabil

Setiap Tahap Pemurnian

Tahap Pemurnian

Volume Enzim (mL)

Aktivitas (Unit/mL enzim)

Aktivitas Total (Unit)

Protein (mg/mL enzim)

Protein total (mg enzim)

Aktivitas Spesisfik (Unit/mg enzim)

Tingkat Kemurnian

Ekstrak Kasar

(NH4)2SO4 60%

Dialisis

1000

25

10

0,668

1,338

1,062

668

33,45

10,62

0,312

0,325

0,3

312

8,125

3

2,141

4,117

3,54

1

1,923

1,653

Karakterisasi Enzim α-Amilase TermostabilPengaruh konsentrasi substrat amilosa terhadap aktivitas enzim α–amilase

termostabil telah dilakukan pada rentang konsentrasi substrat 0,25 - 1,75% dengan hasil seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6. Aktivitas α-amilase terus meningkat dari konsentrasi substrat 0,25% hingga mencapai optimumnya pada konsentrasi substrat 1,5% dengan aktivitas 0,345 U/mL. Di atas konsentrasi substrat 1,5 %, tidak terjadi lagi peningkatan aktivitas enzim dikarenakan konsentrasi substrat yang telah jenuh.

Gambar 6. Pengaruh konsentrasi Substrat terhadap aktivitas enzim

0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11

Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim juga telah diamati pada rentang pH 4-9. Grafik pada Gambar 7 menunjukkan bahwa enzim memiliki aktivitas tertinggi pada pH 7,5 dengan aktivitas 0,953 U/mL.

Aktivitas α-amilase juga diuji pada suhu yang bervariasi dari 30oC sampai 100oC. Hal ini dilakukan untuk mencari suhu yang memberikan aktivitas optimum enzimα-amilasetermostabil pada pH 7,5 dengan konsentrasi substrat 1,5 %. Hasil pengukuran pengaruh suhu terhadap aktivitas α-amilase diberikan pada Gambar 6.Aktivitas enzim α-amilase meningkat di atas suhu 30oC dan mencapai optimumnya pada suhu 80oC dengan aktivitas 0,309 U/mL. Aktivitas α-amilase kemudian menurun di atas suhu 80oC akibat denaturasi enzim oleh panas (Gambar 7).

Gambar 8. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim α-amilase Termostabil

KESIMPULAN Isolat bakteri amilolitik termofilik dari Sumber Air Panas Sonai terdiri atas 26

isolat. Dari isolat-isolat tersebut, isolat S60T3-4 memiliki aktivitas amilolitik tertinggi. Isolat ini memiliki ciri-ciri morfologi berupa warna koloni putih, bentuk koloni bulat, bentuk tepian koloni rata, bentuk selnya monococcus dan bersifat gram negatif. Enzim α-amilase dalam bentuk ekstrak kasar memiliki aktivitas spesifik 2,141 U/mg enzim, setelah ekstraksi dengan (NH4)2SO4 40% - 60% aktivitas spesifiknya 4,117 U/mg enzim, dan setelah dialisis aktivitas spesifknya menjadi 3,54 U/mg enzim.Aktivitas α-amilase termostabil mencapai optimumnya pada konsentrasi substrat amilosa 1,5%; nilai pH 7,5; dan suhu 80oC.

Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Ibu Dr.Prima Endang Susilowati, M.Si selaku Kepala Laboratorium Biokimia FMIPA Unhalu yang telah membimbing dan mendampingi penulis dalam pelaksanaan kegiatan sampai penulisan artikel ini diselesaikan.

Gambar 7. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim

12

DAFTAR PUSTAKA

Ahmaloka, A. Suharto, S, Nurbaiti , I N. Tika dan F.M. Warganegara, 2006. ‘Ribotyping Identification of Thermophilic Bacterium from Papandayan Crater’. Proceeding of ITB Engineering Science. Vol. 38 B(1):1-10.

Aiyer, P.V.D. 2004. ‘Effect of C:N Ratio on Alpha Amylase Production by Bacillus licheniformis SPT 27’, African J. of Biotechnology. Vol 3 (10):519-522.

Apun, K., Jong, B.C., dan Salleh, M.A. 2000. ‘Screening and Isolation of A Cellulolytic and Amylolytic Bacillus from Sago Pith Waste’, J. Gen. Appl. Microbiol.Vol. 46:263-267.

Fossi, B.T., Tavea, F., dan Ndjouenkeu, R. 2005. ‘Production and Partial Characterization of a Thermostable Amylase from Ascomycetes Yeast Strain Isolated from Starchy Soils’, African J. of Biotechnology Vol. 4 (1):14-18.

Haki, G. D., Rakshit, S.K. 2003. ’Developments in Industrially Important Thermostable Enzymes: a Review’. Biosourche Technology, Vol.39:17-34.

Holt JG. Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT dan Williams ST. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology Ninth Edition. Williams and Wilkins. United States of America.

Lay, B.W., 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada, Jakarta.

Rasooli, I., Astaneh, S.D.A., Borna, H., Barchini, K.A. 2008. ‘A Thermostable α-amylase Producing Natural Variant of Bacillus spp. Isolated from Soil in Iran’. American Journal of Agricultural and Biological Sciences 3, Vol. 3:591-596.

Richana, N., Ahmad T., dan Pia P., 2009. ‘Tehnik Produksi Amilase Skala Pilot dari Isolat Rekombinan Pembawa Gen Amilase’. Prosiding Seminar Hasil Penelitian Rintisan dan Bioteknologi Tanaman. Hlm.365-372.

Shaw, J.F., Lin, F.P., Chen, S.C., dan Chen, H.C. 1995. ‘Purification and Properties of an extracellular -amylase from Thermus sp.’. Bot. Bull. Acad. Sin.,Vol. 36.

Suhartono, M.T., 1989,Enzim dan Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Tiwari, K.L., Jadhav, S.K., dan Fatima, A. 2007. ‘Culture Condition for the Production of Thermostable Amylase by Penicillium rugulosum’. Global Journal of Biochemistry and Biochemistry 2, Vol.1:21-24.