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Rotas para o etanol celulósico no Brasil
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AS ROTAS PARA O ETANOL CELULÓSICO NO BRASIL
Marcos S. Buckeridge, Wanderley D. dos Santos & Amanda P. de Souza
Departamento de Botânica - IBUSP - Fone: (11) 30917592
Rua do Matão, 277 - Caixa Postal 11461 - CEP 05422-970
Cidade Universitária - Butantã - SP
E-mail – [email protected]
Resumo
Neste capítulo, propomos que a produção de etanol celulósico a partir de cana de
açúcar possa ocorrer em quatro gerações. A primeira seria o que já existe, ou seja, a
produção de sacarose a partir de colmo de cana de açúcar. A segunda seria a produção
de etanol a partir de açúcares produzidos pela hidrólise ácida do bagaço. A terceira
compreende a produção de açúcares a partir da parede celular, usando enzimas de
microorganismos. A quarta geração compreenderia uma integração de todas as
gerações, mas com uma matéria prima (variedades de cana) modificadas geneticamente
e capazes de realizar modificações na parede celular que tornariam mais eficiente o
processo da terceira geração. Para explicar como seriam estes processos, revisamos
brevemente o conhecimento sobre a estrutura de polissacarídeos de parede celular e
comentamos sobre a existência de genes que codificam para enzimas hidrolíticas da
própria cana que poderiam ser utilizadas para a produção de etanol celulósico. A idéia
de utilizar a parede celular pode ser expandida para outras espécies, como o eucalipto e
sementes de árvores de espécies nativas de biomas brasileiros.
Salientamos também a importância de que as estratégias de produção de etanol
celulósico se coadunem com processos que sejam ambientalmente corretos, como os
sistemas agroflorestais. Propomos que o Brasil tem neste momento a oportunidade e
deve aproveitar a chance de produzir energia renovável de forma limpa e eficiente.
Introdução
As mudanças climáticas e a elevação nos custos do petróleo aliadas às
necessidades estratégicas de produção de energia têm motivado uma corrida sem
precedentes à produção de combustíveis alternativos, preferencialmente de fontes
renováveis. Neste cenário, o Brasil desponta como o país com as tecnologias e políticas
mais avançadas do mundo devido à pioneira utilização do etanol obtido a partir da cana
de açúcar como combustível, desde a década de 1970. Hoje, o Estado de São Paulo é o
maior produtor de etanol no Brasil sendo, portanto, o segundo maior produtor depois
dos EUA com ¼ da produção mundial de etanol.
Além da tradição, variedades altamente selecionadas, processos industriais
sofisticados, clima e disponibilidade de terras agricultáveis garantem ao Brasil uma
liderança confortável na tecnologia da produção de etanol. Entretanto, para preservar
essa posição num cenário competitivo, o Brasil precisa manter investimentos
compatíveis na geração de novas tecnologias e formação de competências. Atualmente,
a conversão de material lignocelulósico ou biomassa em açúcares fermentáveis para
produção de etanol vem sendo considerada como uma alternativa promissora para
aumentar a produção de etanol necessária para atender à demanda mundial.
A celulose, principal componente da biomassa, é o polímero mais abundante da
Terra. Ele é formado por uma cadeia linear de moléculas de glicose ligadas entre si na
posição beta (β) -1,4. Tais ligações guardam energia livre e podem ser quebradas para
liberar açúcares fermentáveis. Entretanto, a celulose é muito bem protegida pelas
plantas, a fim de que não sejam facilmente utilizadas por predadores. Por esse motivo, o
rendimento líquido da conversão da celulose em glicose livre e, a seguir, em etanol é
desfavorável, com as tecnologias disponíveis. Tornar os rendimentos favoráveis
possibilitará o melhor aproveitamento dessa rica matéria prima natural encontrada não
só no bagaço da cana, mas em quaisquer outras fontes de biomassa vegetal (madeiras,
serragens, palhadas, cascas, etc.) atualmente desperdiçadas ou utilizadas de formas
menos nobres. O desenvolvimento de tecnologias capazes de desmontar a parede celular
vegetal requer o aprofundamento do nosso conhecimento sobre a fisiologia e estrutura
da parede celular tanto da própria cana de açúcar como de outros sistemas. Além disso,
o estudo de processos enzimáticos de microorganismos que naturalmente já se
alimentam da parede celular e, portanto, já possuem enzimas específicas para tal
finalidade, podem nos auxiliar na utilização da energia disponível nestes
polissacarídeos.
Perspectivas na Produção de Etanol Celulósico
A produção de etanol a partir da cana-de-açúcar ocorre, atualmente, pela
fermentação alcoólica da sacarose. Diante das perspectivas de se obter o etanol
celulósico, o etanol obtido da sacarose, assim como o obtido a partir do amido de milho,
nos EUA, tem sido chamado de etanol de primeira geração. Dessa forma, o etanol
celulósico produzido a partir dos polissacarídeos da parede celular vegetal é
denominado etanol de segunda geração. No entanto, para a produção do etanol
celulósico, prevemos diversas etapas que podem ser claramente distinguidas: 1)
hidrólise química; 2) enzimática; e 3) auto-hidrólise. Por este motivo, propomos que
seja chamado de etanol de segunda geração somente aquele obtido pela hidrólise
química da parede celular. Esse processo utiliza solventes ácidos ou básicos para
afrouxar e quebrar os polímeros da parede celular vegetal liberando mono e
oligossacarídeos fermentáveis. Porém, além dos custos dos produtos químicos
empregados poderá haver a produção colateral de resíduos químicos. Nossa expectativa
é que a combinação de processos biológicos na hidrólise deverá render um processo
ainda mais eficiente. E, por ser um processo que demanda um input maior de estudos e
tecnologia para ser disponibilizado, denominamos este processo de etanol de terceira
geração. Acreditamos que o maior gargalo neste processo será a produção em escala
comercial de enzimas hidrolíticas e microorganismos selecionados e/ou modificados
para essa finalidade. Assim, nós nos arriscamos a ir além e sugerimos o que
denominamos etanol de quarta geração no qual a própria planta poderá ser modificada
geneticamente para produzir as enzimas necessárias à digestão de sua própria parede
celular (acima denominado auto-hidrólise) minimizando ainda mais os custos da
produção (Figura 1).
Além dos métodos de hidrólise da parede, o avanço no conhecimento sobre a
fisiologia de plantas utilizadas para a produção de etanol, o emprego de ferramentas de
engenharia genética e industrial deverão desempenhar importantes papéis no aumento
da produtividade do etanol, independentemente da geração. Mas antes de detalharmos
os principais aspectos das diferentes gerações, vejamos o que é a parede celular.
Figura 1 – Esquema das rotas propostas para obtenção do etanol celulósico.
A parede
Toda célula vegetal possui parede celular. Ela determina o tamanho e a forma da
célula, confere resistência mecânica e proteção contra o ataque de predadores e
patógenos, promove a adesão entre as células, delimita o tamanho e propriedades
químico-físicas das moléculas que têm acesso ao interior da célula, controla o nível de
umidade e ainda pode funcionar como reserva.
A parede celular é composta por uma mistura de polissacarídeos, proteínas,
compostos fenólicos e sais minerais. Os polissacarídeos representam cerca de 90% do
peso seco da parede e consistem em celulose, que compõe de 20-40% da parede celular,
hemiceluloses (15-25%) e pectinas (~30%). Essa matriz é altamente ordenada e
dinâmica podendo tornar-se mais rígida ou mais frouxa conforme as necessidades
ontogênicas e comportamentais da célula ou da planta.
Seis a oito moléculas de celulose se alinham paralelamente para formar uma
fibra onde ocorre a completa expulsão das moléculas de água, tornando a microfibrila
extremamente longa e resistente. Sobre a superfície das microfibrilas, aderem-se as
Parede
celula
r
Açúcares fe
rmentáveis
2ª geraçãoHidrólise ácida
1 a 2 anos
Hidrólise enzimática direta
por fungos
Uso de coquetéis enzimáticos
Uso de fungos geneticamente
modificados
3ª geraçãoHidrólise com
microorganismos+ de 4 anos
4ª geraçãoModificações na parede canaNovas variedades incluindo transgênicos
+ de 10 anos
Modificações na composição da parede celular
Pré-hidrólise pela própria
planta
Resíduos tóxicosp.ex. furfurais Bioeta
nol
Preparações “físicas” d
o bagaço
técnicas que aumentem a superfície
exposta a ácido e enzim
as
Ro
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pa
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hemiceluloses (polímeros heterogêneos que são classificados de acordo com a
composição em monossacarídeos) que cobrem a celulose formando o chamado domínio
celulose-hemicelulose da parede celular (Figura 2). As hemiceluloses impedem que as
moléculas de celulose de fibras paralelas colapsem entre si, mas também permitem a
interação fraca entre uma fibra e outra, formando uma rede. O domínio celulose-
hemicelulose fica imerso em um domínio formado por pectinas, que são açúcares
altamente ramificados que dentre outras funções, determinam a porosidade da parede e
sinalizam a presença de organismos patogênicos e insetos (Buckeridge et al. 2008).
As principais hemiceluloses encontradas em plantas são os xiloglucanos (XyG),
os glucuronoarabinoxilanos (GAX) e os mananos (MN). Em todos os casos, há uma
cadeia principal de monossacarídeos de glicose, xilose e manose, respectivamente, que
pode ser ramificada com diferentes monossacarídeos (Figura 3). Os XyG são os mais
abundantes, encontrados na maioria das eudicotiledôneas. Os GAXs ocorrem em maior
proporção em paredes celulares de gramíneas (família Poaceae) e os MN são de ampla
ocorrência, mas geralmente aparecem em baixa proporção, exceto em alguns grupos de
samambaias (Pteridophytae) (Silva, 2005a). De fato, pode-se dizer que todas as
hemiceluloses ocorrem em todas as espécies, mas em diferentes proporções. Uma
exceção são os chamados glucanos de ligação mista ou β-glucanos (BG) que são
compostos de uma cadeia não ramificada de glicose com ligações β -1,4, interrompida
regularmente com ligações β - 1,3. Esta é uma hemicelulose que ocorre principalmente
em plantas do grupo da ordem Poales (que inclui Poaceae). Porém, sabe-se que está
presente também em líquens (uma associação de fungos e algas) o que indica ser
possível que os genes necessários para sintetizar β-glucanos esteja presente na maioria
das espécies de plantas superiores (Buckeridge et al. 2004).
Figura 2 - Esquema da parede celular vegetal. A figura mostra a estrutura de uma microfibrila, que contém 36 moléculas de celulose depositadas umas sobre as outras. Uma das moléculas de celulose se apresenta aumentada e prolongada, mostrando as unidades de glucose ligadas entre si por ligações do tipo beta-1,4. Uma das moléculas de hemicelulose (o glucuronoarabinoxilano) também e mostrada em detalhe na parte de cima da figura.
Figura 3 – Estrutura química das principais hemiceluloses de parede celular de plantas
Parede celular da cana-de-açúcar
A cana-de-açúcar pertence a um grupo de plantas denominadas família Poaceae
(gramíneas), do qual também fazem parte o milho, sorgo, trigo e arroz. Espécies desta
família apresentam uma arquitetura da parede típica que as distingue dos outros grupos
vegetais. A maioria das plantas possui o xiloglucano como principal hemicelulose. Já as
gramíneas apresentam como principal hemicelulose os glucuronoarabinoxilanos
(GAXs) (Saavedra, Kavacsonyi & Alfoldi, 1988; Souza, 2007), embora também possua,
em pequenas proporções, xiloglucanos e mananos. Além do GAXs, os β- glucanos são
relativamente abundantes em todos os tecidos de cana (Silva, 2005b).
Quando examinadas ao microscópio de fluorescência, as paredes celulares de
gramíneas apresentam autofluorescência (Figura 4). Este fenômeno se deve à presença
de resíduos de ácido ferúlico esterificados aos resíduos de arabinose que formam a
ramificação da cadeia central que, por sua vez, é composta por xilanos.
Figura 4 – Células do parênquima do colmo de cana-de-açúcar mostrando a autofluorescência
da parede celular. A seta branca mostra a parede celular.
Resíduos de ferulatos esterificados a polímeros vicinais podem sofrer
dimerização, interligando os polissacarídeos entre si. A presença do ácido ferúlico
confere à parede de gramíneas, especial resistência aos raios UV e ao ataque das
enzimas hidrolíticas de patógenos (Figura 5).
Figura 5 – Glucuronorabinoxilanos interligados por resíduos de ácido ferúlico esterificados a
resíduos de arabinose de polissacarídeos adjacentes.
Etanol de Primeira Geração: a fermentação da sacarose
Como citado acima, o processo atual de produção de etanol a partir da cana é
realizado pela extração e fermentação do caldo, que possui aproximadamente 15% de
sacarose e 15% de fibras (Macedo, 2008). Antes do processo de fermentação, que
ocorre por meio de linhagens selecionadas de leveduras Saccharomyces cereviseae, o
caldo é esterilizado e purificado. O álcool produzido é então separado da água por
destilação. Uma parte destes processos é impulsionada pela energia obtida com a
queima do bagaço da cana que alimenta as caldeiras e gera eletricidade. Mesmo
utilizando o bagaço para a geração de energia, a usina possui um excesso de cerca de
10% da biomassa que pode ser queimada e vendida na forma de energia elétrica
(Macedo e Nogueira, 2005).
Com técnicas mais eficientes de conservação da energia produzida pela queima
do bagaço esse excesso pode chegar a 45%. Além disso, cerca de 40-50% da palha da
cana que hoje é mantida no campo pode ser recuperada e incorporada à biomassa
(Macedo e Nogueira, 2005). Esse excesso de biomassa juntamente com os 15% de
fibras poderá, no futuro, ser utilizada para produção de etanol celulósico, como
detalhado a seguir.
Etanol de Segunda Geração: obtenção do etanol celulósico por hidrólise ácida
No processo de obtenção de etanol celulósico, o objetivo é “desmontar” a parede
celular para utilizar os polissacarídeos como fonte de açúcares fermentáveis. No
entanto, já foi salientado o quão complexa é a estrutura da parede e o quão “delicado”
deve ser este processo de desmonte para preservar intactos os monossacarídeos que
serão usados para fermentação. Atualmente se utiliza um processo denominado
hidrólise ácida para desmontar a parede celular. Embora o processo seja funcional,
ainda não é eficiente para permitir a produção comercial de etanol.
O processo básico de hidrólise ácida consiste em utilizar um ácido forte para
atacar as ligações glicosídicas entre os monossacarídeos de um polissacarídeo. A Figura
7 ilustra o processo de forma simples. Os ácidos, normalmente utilizados para a
obtenção de hidrólise em laboratório, são ácido sulfúrico, ácido clorídrico e o ácido
trifluoroacético. Há vantagens e desvantagens em relação a cada um. Enquanto os
ácidos sulfúrico e clorídrico discriminam pouco as ligações glicosídicas de diferentes
tipos, atacando celulose e hemiceluloses de forma similar, o ácido trifluoroacético
quebra preferencialmente as ligações mais fracas, que são as ligações do tipo alfa (α)
presente nas ramificações das hemiceluloses.
Figura 7 – diagrama da hidrólise ácida.
No caso da parede celular de cana, os glucuronoarabinoxilanos possuem
ramificações de ácido glucurônico e arabinose cujas ligações são do tipo α, e estas são
as primeiras a serem quebradas. Posteriormente, são quebradas as ligações β (como as
β-1,4 dos xilanos). A celulose, por sua vez, é a última a ser hidrolisada devido à sua
forte interação intermolecular, à completa ausência de água na estrutura da microfibrila
e também ao fato das fibrilas estarem cobertas pelas hemiceluloses. O problema em um
processo de hidrólise de polissacarídeos contendo ligações α e β é que como o tempo
necessário para hidrólise é diferente, os monossacarideos liberados antes tendem a
degradar. Este processo é chamado de caramelização (similar à formação do caramelo
durante a preparação de uma calda de açúcar). Se a degradação é muito intensa formam-
se furfurais que são compostos tóxicos para as leveduras que serão utilizadas na etapa
de fermentação. Assim, ao hidrolisar uma mistura de celulose e hemiceluloses, a
desconexão temporal das quebras das ligações glicosídicas de cada tipo de
polissacarídeo torna-se um entrave para a produção de monossacarídeos fermentáveis.
Nos processos industriais, a hidrólise ácida tem sido realizada com ácido
sulfúrico (H2SO4). O fato de ainda não haver comercialização de etanol produzido a
partir da hidrólise ácida do bagaço da cana está relacionado a dificuldades técnicas e
operacionais que resultam em um custo elevado do produto final (cerca de US$ 0,80
contra US$ 0,35 e US$ 0,27 por kg de etanol obtido a partir do amido e da sacarose,
respectivamente). Parte deste custo se deve ao fato de que para que a hidrólise ocorra de
forma eficiente é necessário aquecer o polissacarídeo na solução ácida. A temperatua
ideal para a quebra de hemiceluloses está entre 100 a 120o C e a concentração ideal de
ácido sulfúrico é ao redor de 3% (Buckeridge & Dietrich, 1990). No caso específico da
cana de açúcar, este custo é minimizado devido ao fato de parte do bagaço ser queimado
para alimentar as caldeiras e produzir a energia elétrica consumida no processo.
Outra dificuldade advém da necessidade de neutralização da solução contendo os
açúcares para que se possa proceder à fermentação. Em geral, para a neutralização,
utiliza-se hidróxido de cálcio (calcário). No entanto, ao se proceder desse modo, o ácido
sulfúrico é convertido em sulfato de cálcio e não pode ser reaproveitado (Ali, Mark &
Daniel, 2006). Esse é o principal fator que contribui para o alto custo da técnica. Para se
obterem níveis aceitáveis de comercialização (< US$ 0,36/kg) será necessária a redução
dos custos associados principalmente ao consumo e reutilização do ácido e ainda a
melhora na produtividade e eficiência na conversão da biomassa (Kaylen et al., 2000;
Goldenberg, 2007).
A fim de melhorar a perspectiva do uso da hidrólise ácida em escala comercial, a
empresa brasileira DEDINI – Indústria de Base investiu em pesquisas para tornar a o
processo mais rentável e, atualmente, possui uma usina experimental que tem utilizado
o próprio etanol em mistura com o ácido sulfúrico como solvente para a lignina. Isso
permite reduzir a utilização do ácido e recuperar o solvente. Outra proposta, feita por
um grupo de cientistas chineses é a substituição do processo de neutralização por um
processo de eletrodiálise, que consiste na aplicação de um potencial elétrico entre dois
compartimentos separados por uma membrana semipermeável carregada eletricamente.
Este processo permitiria uma economia de até 55% no consumo do ácido sulfúrico
(Cheng et al., 2008).
Segundo Rodrigues & Guirardello (2008), os furfurais, que se formam
naturalmente durante a hidrólise ácida, poderiam ser aproveitados como matéria prima
na produção de solventes e resinas para fabricação de fibra de vidro e outros materiais
plásticos. Sua comercialização pelas usinas poderia se tornar rentável e contribuir para
reduzir o custo do etanol celulósico.
Outros pesquisadores brasileiros também têm se dedicado a buscar soluções
compatíveis para melhorar o desempenho da hidrólise ácida. Em Lorena, Adriane
Milagres estuda métodos de remoção química da lignina para entender seu efetivo
papel na limitação da hidrólise. Em São Carlos, Paulo Seleguin e Glauco Caurin, da
Escola de Engenharia de São Carlos desenvolvem um projeto de pré-processamento por
despressurização explosiva do bagaço da cana. Esta técnica expõe as fibras do bagaço,
aumentando a superfície de contato necessário para a quebra das microfibrilas. Estes
estudos brasileiros que estão em andamento têm potencial para aumentar tanto a
eficiência da hidrólise ácida quanto da hidrólise enzimática, como veremos a seguir.
Em suma, o processo de hidrólise tem um ótimo potencial para produzir
açúcares fermentáveis a partir de biomassa vegetal e pode ser adaptado a diferentes
casos. Para a cana, esta tecnologia já está próxima de se tornar comercial e será um
ponto de extrema importância estratégica para as próximas gerações de etanol
celulósico. Considerando-se o ponto em que se encontra no momento, pode-se esperar
que a viabilidade comercial seja atingida em 1 a 2 anos. O desenvolvimento de tal
tecnologia é de extrema importância tecnológica, pois abre o caminho para que se
utilizem enzimas e/ou se modifique a matéria prima para obter rendimentos ainda
maiores.
Etanol de Terceira Geração: complexidade e alternativas para a hidrólise
enzimática
As maiores expectativas para a viabilização do etanol celulósico no longo prazo
estão depositadas na possibilidade de utilizarmos a maquinaria bioquímica de
microorganismos (fungos e bactérias) para desmontar a parede celular. O problema é
que, assim como os fungos desenvolveram estratégias para invadir a parede celular, as
plantas também co-evoluiram para sofisticar seus mecanismos de defesa. Assim,
embora haja fungos capazes de degradar a parede celular vegetal, ela é bastante
recalcitrante à degradação. Uma das formas que as gramíneas desenvolveram para
resistir ao ataque enzimático parece ser a formação de interligações de ácido ferúlico
entre suas hemiceluloses (dos Santos et al. 2008; Figura 5).
Em geral, a lignina, que é bastante resistente ao ataque enzimático, acumula-se
apenas em certos tecidos especializados como fibras e células do tecido vascular das
plantas (xilema). Entretanto, nas gramíneas, pode-se dizer que as pontes formadas pelo
ácido ferúlico realizam uma quasi-lignificação em toda a extensão da parede celular,
mesmo em tecidos parenquimáticos. Esse processo está relacionado à cessação do
crescimento celular e resulta em uma dificuldade adicional para os microorganismos
dispostos a atacar a planta. Por sua vez, certos fungos desenvolveram feruloil-esterases
que são enzimas aptas a separar os resíduos fenólicos dos arabinoxilanos, tornado a
parede mais susceptível às xilanases (enzimas capazes de hidrolisar xilanos).
Para chegar à celulose, que é o principal composto da parede celular, os fungos
ainda precisam hidrolisar as outras hemiceluloses que recobrem as microfibrilas. Esta
dificuldade é semelhante àquela dos ácidos às diferentes camadas e diferentes ligações
glicosídicas. Por essa razão, fungos como os dos gêneros Trichoderma e Penicillium
produzem verdadeiros arsenais com mais de uma centena de glicosidases e dezenas de
celulases, quitinases, proteases e lipases, entre outras hidrolases. Evidentemente que
para proceder à hidrólise enzimática da parede celular e aproveitar ao máximo a energia
armazenada nestas moléculas, é pertinente estudarmos esse poderio enzimático dos
fungos bem como as estruturas finas de enzimas hidrolíticas para que possamos utilizá-
los em nosso favor.
Para desenvolvermos uma tecnologia eficaz para converter a parede em açúcares
fermentáveis e etanol será estratégico compreender os processos relacionados com o
ataque de cada enzima sobre cada ligação na parede celular.
Atualmente, dispomos de algumas informações estratégicas que podem nos
ajudar a nortear o caminho do etanol celulósico:
a) conhecemos as ligações glicosídicas que têm de ser quebradas para liberar
monossacarídeos (Silva, 2005b). A partir desses dados podemos iniciar um escrutínio
sistemático e detalhado de enzimas e métodos para obter uma completa hidrólise desses
monossacarídeos.
b) conhecemos parte da identidade de 469 genes da cana de açúcar que estão
relacionados ao metabolismo de síntese e degradação da parede celular na cana de
açúcar (Lima et al., 2001). Entre estes genes estão vários que são capazes de degradar a
parede celular. Essa informação nos indica que se obtivermos o controle desses genes
poderíamos ativá-los no momento desejado.
c) há um grande número de estudos com enzimas de microorganismos
mostrando como estas atacam polissacarídeos de parede celular. Neste caso, há dois
caminhos que devem ser tomados paralelamente. Um deles é a prospecção de espécies
mais eficientes. O outro é a transformação genética de fungos que produzam maior
quantidade de enzima ou então que expressem genes que codifiquem para enzimas
heterólogas de interesse.
d) Temos algum conhecimento sobre a estrutura de glicosidases de parede
celular que nos possibilitam desenhar estratégias para melhorar o desempenho destas
enzimas ao nosso favor.
Estes quatro conjuntos de informações são fundamentais para a concepção de
uma estratégia para obtermos um etanol de terceira geração que inclua o bagaço da
cana-de-açúcar e como uma das matérias primas com eficiência energética e, sobretudo,
sustentabilidade, tanto em relação aos gases estufa, quanto em relação aos demais
dejetos poluentes.
Outro desafio que se impõe à obtenção do etanol a partir da celulose é o da
fermentação de pentoses. As hemiceluloses são ricas em pentoses como xiloses e
arabinoses. O Saccharomyces cereviseae, microorganismo usualmente empregado na
produção de álcool a partir da sacarose, é muito pouco eficiente na conversão de
pentoses. A presença de pentoses de fato inibe a fermentação das hexoses. Uma
perspectiva é a utilização de outras espécies de fungos, melhor adaptados às pentoses.
Espécies como Pachysolen tannophilus são capazes de utilizar xilose e fermentam
parcialmente outras pentoses depois de consumirem a glicose e a celobiose disponíveis
que são seus alimentos preferidos (Hinman et al. 1989).
Para desenvolver as tecnologias do etanol celulósico é conveniente cruzar estas
informações e coordenar esforços com base em prioridades dos estudos. A tecnologia
deverá incluir o desenvolvimento de maquinário e processos para produção de enzimas
em escala industrial, bem como dos processos de degradação da parede em si, mas
também as tecnologias voltadas ao desenvolvimento das variedades de cana apropriadas
e as tecnologias para preparar o bagaço para incubação.
Prospecção, seleção e engenharia de fungos
A prospecção e a seleção de fungos é uma das estratégias para obter melhores
enzimas para hidrolizar o material lignocelulósico. Em um país como o Brasil, que tem
alto nível de biodiversidade, existe maior probabilidade de encontrar microorganismos
que apresentem novidades nesse aspecto.
Estudos feitos na Índia com palhada de cana, indicam que os fungos Aspergillus
terreus, Cellulomonas uda, Trichoderma reesei e Zymomonas mobilis podem ser
“chaves” na degradação do material lignocelulósico (Singh et al., 2008). No Brasil, o
grupo de pesquisa liderado por Maria de Lourdes Polizeli da USP Ribeirão Preto está
empenhado na prospecção de fungos e na caracterização, imunolocalização e
purificação de enzimas fúngicas. Um dos estudos mostra a caracterização de uma
xilanase de Aspergillus (Rizzati et al., 2008). Nosso grupo, no Departamento de
Botânica - IB/USP prospectou a atividade celulolítica de mais de 50 espécies de fungos
do solo do cerrado e trabalha na viabilização do Penicillium steckii para uso industrial
(não publicado). Nosso grupo também estudou a ação da celulase sobre xiloglucanos
polímero também presente no colmo da cana. Descobrimos, por exemplo, que celulases
de Trichoderma podem funcionar como um sistema de restrição análogo às enzimas de
restrição usadas sobre o DNA (Tiné et al., 2003) agindo sobre a estrutura química fina
dos polissacarídeos hemicelulósicos (ver também Tiné et al., 2006). Informações
detalhadas sobre o mecanismo da ação enzimática sobre polisacarídeos são valiosas se
desejamos induzir um aumento na eficiência dessas hidrolases.
Outro grupo de pesquisa brasileiro que tem trabalhado com hidrolases fúngicas e
sua ação sobre polissacarídeos de parede celular é o de Edivaldo Ximenes Ferreira
Filho, da Universidade de Brasília. Seus estudos estão focados na detecção e
caracterização das enzimas, assim como nos genes que as codificam (ver Iembo et al.
2006 e Salles et al., 2007 como exemplos).
Na USP Zona Leste, Felipe Chambergo, estuda a utilização da potente
maquinaria de expressão gênica de celulases de Trichoderma reesei a fim de sintetizar
celulases de interesse para a indústria. Nesse âmbito (engenharia genética de fungos), já
existem resultados bastante interessantes sobre a regulação e sinalização da expressão
gênica obtidos pela equipe de Gustavo Goldman da USP Ribeirão Preto. Este grupo
verificou que a espécie Aspergillus niger, por exemplo, tem um único fator de
transcrição (XLnR) que regula a expressão de todos os genes relacionados à
degradação de polissacarídeos, enquanto que em Trichoderma, ocorre mais de um fator
de transcrição para estes mesmos genes (Gustavo Goldman, comunicação pessoal).
Goldman pretende manipular os mecanismos de regulação da expressão gênica, a fim de
obter mutantes capazes de produzir continuamente enzimas celulolíticas na presença de
substratos, sem que o sistema de expressão gênica sofra retro-inibição pelos produtos da
ação enzimática, como ocorre naturalmente.
Caracterização e engenharia de enzimas
Outro tipo de retro-inibição ou inibição pelo produto ocorre no nível da catálise.
Quando a concentração de produtos se torna alta no meio, as enzimas não conseguem se
desligar do produto formado e, então, a atividade enzimática começa a cair. A atividade
pode não só parar completamente, como pode até mesmo se inverter. No Instituto de
Química da USP, Sandro Marana está propondo a união de um domínio de ligação à
celulose (CBD – cellular binding domain) a β-glicosidases a fim de promover a redução
da concentração local dos produtos da atividade da enzima. O CBD é uma seqüência
protéica encontrada em algumas celulases que adere à microfibrila provocando uma
desorganização local na estrutura cristalina da fibra que facilita a catálise. Um “braço”
protéico posiciona o sítio catalítico no local exato onde a desordenação promovida pelo
CBD expõe as moléculas de celulose ao ataque enzimático. Um recurso importante na
pesquisa interessada na compreensão e engenharia de enzimas é o do desvendamento da
estrutura terciária de proteínas. O grupo de Marana acredita que a razão
produto/substrato é menor nas proximidades do polissacarídeo. Com foco na estrutura
das enzimas, o grupo de Marana estuda β-glicosidases ativas sobre celobiose (um
dímero de glicose produzido pela hidrólise da celulose) e sobre celodextrinas
(oligossacarídeos beta-1,4 ligados derivados da celulose). Eles estão interessados nos
aminoácidos localizados fora do sítio ativo da enzima e que estão associados à
especificidade da ação enzimática. O grupo trabalha com uma metodologia denominada
evolução dirigida em que são produzidas pequenas variações na seqüência de
aminoácidos das enzimas e a seguir são realizados ensaios a fim de selecionar variantes
cuja eficiência catalítica de interesse aumentou e então são estudadas quais as variações
estruturais responsáveis pelo aumento na atividade/especificidade.
As diferentes glicosidases são agrupadas em famílias. Entretanto, a grande
maioria das delas ainda não tem sua estrutura terciária desvendada ou tem apenas uns
poucos representantes cuja estrutura estérica foi elucidada. O grupo de Igor Polikarpov
da USP de São Carlos estuda a estrutura terciária de enzimas por cristalografia de raios
X e entre elas glicosidases. Eles já conseguiram cristalizar e resolver a estrutura de
xilanases de Trichoderma reesei (Galubev et al. 2000, Rojas et al. 2005). Polikarpov e
seus colaboradores são responsáveis por técnicas que têm levado ao aperfeiçoamento da
cristalografia que tornou a metodologia muito mais eficiente. Eles estão empenhados na
criação/aperfeiçoamento de modelos de enovelamento protéico que possam ser usados
para prever a estrutura terciária com base na seqüência de aminoácidos e que podem ser
utilizados na engenharia de catalisadores enzimáticos.
Usando conhecimentos sobre os mecanismos fisiológicos, bioquímicos e moleculares
para aprimorar o acesso à celulose
Ainda que a estrutura básica das hemiceluloses já seja conhecida (tipos e
proporções entre as ligações glicosídicas), é necessário estudarmos sua “estrutura fina”.
Para tanto é necessário utilizar enzimas específicas que revelem os padrões de
ramificação e/ou das repetições das ligações glicosídidas na cadeia principal
(proporções entre ligações beta-1,3 e beta-1,4 nos beta-glucanos e entre as manoses e
glicoses nos mananos, etc). Tais informações são relevantes, pois temos verificado que
a ação das hemicelulases depende fortemente da estrutura fina (Tiné et al. 2003). Além
das estruturas baseadas nos açúcares, outro aspecto ainda relativamente pouco estudado
em relação às hemiceluloses são as ramificações com radicais acetila e também com
compostos fenólicos (dos Santos et al. 2008b). Para que possamos aprofundar nosso
conhecimento a esse respeito precisamos utilizar estudos com base em enzimas
específicas puras e espectrometria de massas (e.g. MS-MS).
Para que possamos manipular as enzimas corretas para desmontar a parede e
obter acesso à celulose precisamos também aprofundar nosso conhecimento sobre os
mecanismos de sinalização e expressão dos genes relacionados à parede celular.
Atualmente, nosso grupo está estudando a composição e estrutura fina da parede
celular em diversos órgãos da cana de açúcar e as variações nessa composição durante o
desenvolvimento. Investigamos a importância dos compostos fenólicos na recalcitrância
da parede celular ao ataque de hidrolases (dos Santos et al. 2008c) e o controle
hormonal sobre o crescimento, o desenvolvimento e a composição da parede celular.
Estamos estudando ainda os mecanismos de autodigestão da parede que ocorrem
naturalmente (como em frutos e sementes) e que podem auxiliar na compreensão do
processo de síntese e, sobretudo, de degradação da parede. Estamos também
empenhados em estudar as enzimas e a composição da parede celular de sementes
visando à produção de álcool através do uso sustentável de sementes nativas. Sementes
de espécies nativas de vários biomas brasileiros, entre eles a Mata Atlântica e do
Cerrado, acumulam grandes quantidades de polissacarídeos de parede celular
(Buckeridge & Dietrich, 1990, Buckeridge et al. 1995, Mayworm et al. 2000). Em
algumas destas o acúmulo é de tal ordem que é possível extrair carboidratos em larga
escala para uso industrial. Já desenvolvemos, por exemplo, um processo para obter
galactomanano a partir de sementes de faveiro (Dimorphandra mollis; Panegassi et al.
2000). Durante os últimos 15 anos temos desvendado os mecanismos bioquímicos e
fisiológicos envolvidos nos processos de degradação desses polímeros. Purificamos
diversas enzimas (Buckeridge et al. 2000) e clonamos genes relacionados (ver Alcântara
et al. 1999, 2006, Lisboa et al. 2006 e Brandão 2008), bem como investigamos os
mecanismos de controle hormonal da degradação da parede celular nesses modelos de
estudo (Santos et al. 2004, Tonini et al. 2006).
A idéia é introduzir em leveduras os genes que codificam para as enzimas de
hidrólise de galactomananos e xiloglucanos de sementes de Leguminosae. Então,
poderíamos usar as leveduras para degradar o polissacarídeo das sementes para produzir
monossacarídeos e, a seguir, promover a fermentação alcoólica. Além do faveiro
(Dimorphandra mollisii) o feijão-do-mato (Sesbania virgata) e o jatobá (Hymenaea
courbaril) produzem grandes quantidades (acima de 40% do peso seco) de
polissacarídeos nas sementes (Buckeridge et al. 2000). Nos casos citados, as espécies
são de larga ocorrência em vários biomas sul-americanos e é possível a exploração
sustentada através de contatos com cooperativas que já utilizam outras partes de forma
sustentável.
Em termos de escala de produção, a quantidade de etanol passível de ser
produzida é relativamente pequena em relação ao que a cana-de-açúcar pode produzir.
No entanto, as vantagens ambientais suplantam muito às econômicas no caso de se
formar sistemas agro-florestais em que florestas sejam regeneradas (ou mantidas) em
meio ao canavial. Esta estratégia, que denominamos ‘caminho do meio’ (Buckeridge,
2007), tem o potencial de produzir um etanol que poderia ser certificado como
ambientalmente correto e poderia assegurar fatias de mercado (por exemplo, na Europa
e Japão) de combustível que tenha padrão de produção com baixo impacto ambiental.
No caso da cana-de-açúcar, uma possibilidade é fazer um “screening” das
paredes celulares das diversas variedades buscando diferenças de composição que
possam nos auxiliar a compreender as variações estruturais e produzir mutantes que
permitam maior acesso à celulose.
Como o grande propulsor da busca por novas tecnologias para obtenção de
etanol é a mudança climática global, nosso grupo também estuda os efeitos das
mudanças climáticas sobre a cana-de-açúcar e outras espécies de interesse para a
obtenção de energia renovável em regiões amazônicas, como a Senna reticulata (mata-
pasto) e Euterpe oleracea (açaí). Um dos objetivos é entender os mecanismos de
acúmulo de biomassa e avaliar outros aspectos bioquímicos e ecofisiológicos afetados
por mudanças climáticas.
Plantas de cana-de-açúcar incubadas em atmosfera de gás carbônico de 720 ppm
(concentração esperada para 2050, caso as emissões de combustíveis fosseis continuem
na mesma taxa), apresentaram um aumento na taxa fotossintética e um grande aumento
em biomassa. Na cana, o aumento pode chegar a 60% apenas na biomassa do colmo
(Souza et al. 2008). Nestas plantas, observamos a superexpressão dos genes
relacionados com expansão celular como a xiloglucano endo-transglicosilase (XTH),
com a fotossíntese e também com a inibição da expressão de genes relacionados à
síntese de fenilpropanóides (intermediários na síntese da lignina). Paralelamente, o
grupo de Gláucia Souza do IQ USP, com o qual colaboramos, observou que plantas
com alta produtividade de açúcares expressam a XTH com maior intensidade e também
têm inibida expressão da cinamil orto-metiltransferase (COMT), relacionada à síntese
de fenilpropanóides.
Neste momento estamos aprofundando os estudos sobre o papel da enzima XTH
no metabolismo de parede celular de cana e o processo fotossintético em cana-de-
açúcar. Nossa expectativa é a de poder aumentar a produtividade da cana aumentando a
expressão dos genes de fotossíntese que respondem ao CO2 elevado. Com isto, a planta
não só produz mais sacarose, mas também mais fibra, que servirá como substrato para a
produção do etanol celulósico.
Etanol de Quarta Geração: a planta ajudando na produção de etanol
O que chamamos de etanol de quarta geração irá integrar os processos de
produção das demais gerações (Figura 1). Consistirá em um conjunto de alterações na
própria planta de cana-de-açúcar (adaptável também a outras espécies) que deverão
aumentar a eficiência dos processos de produção de etanol de segunda e terceira
gerações.
Além de otimizar a produção do etanol através de modificações na planta e
microorganismos utilizados na degradação da celulose, uma alternativa que poderá
reduzir o custo da produção de enzimas é a modificação da cana para expressar enzimas
capazes de promover a digestão da parede celular. Nosso grupo se dedica a entender
tanto a relação entre a expressão dos genes relacionados à biossíntese e degradação da
parede celular quanto àqueles relacionados com o metabolismo de carboidratos em
geral. Em 2001, nosso grupo participou do projeto SUCEST da cana e encontrou 459
genes relacionados ao metabolismo de parede celular (Lima et al. 2001). Neste trabalho
foi demonstrado que grande parte dos genes da via de biossíntese está ativada, enquanto
os genes da via de degradação em geral não são expressos durante o desenvolvimento.
Isso indica que deve haver um baixo turnover de polissacarídeos da parede. No entanto,
os genes existem e devem ser expressos em condições específicas como durante a
senescência foliar. Se obtivéssemos controle sobre estes genes poderíamos induzir a
planta a expressar estas enzimas na época da colheita, reduzindo a necessidade de se
introduzir enzimas fúngicas para desmontar a parede.
Outra idéia é a de introduzir na cana genes heterólogos que sejam ativos apenas
em condições específicas, durante o processamento da biomassa. Já foram produzidas
plantas transgênicas, nas quais foi inserido o gene da α-amilase que converte o amido
em glicose e uma celulase para a degradação da celulose. Num outro estudo, uma
endoglucanase E1 de Acidothermus cellulolyticus que funciona otimamente a 81o C e
pH 5 foi expressa no apoplasto de várias plantas incluindo Arabidopsis e arroz. A
enzima mostrou-se ativada em extratos brutos e quando adicionada aos colmos de arroz
após a colheita e após um pré-tratamento ácido, mas não causou degradação da celulose
in planta (Dai et al, 2000). Estudos em andamento em nosso laboratório indicam que a
presença de hemicelulose e lignina previnem o acesso da E1 à celulose (dos Santos et al.
2008c). Sendo assim, torna-se necessário estudar in vitro a ação de enzimas que
degradam lignina como lacases e peroxidases, bem como enzimas ativas sobre
hemiceluloses (feuloil-esterases, xilanases, liquenases, etc). Posteriormente, a expressão
dessas enzimas pode ser estudada em Arabidopsis e cana, direcionando-as para
compartimentos celulares que permitam que sua ação seja disparada apenas no
momento desejado. Para tanto, precisamos prospectar as enzimas produzidas pela
plantas de interesse e/ou relacionadas, assim como os mecanismos de sinalização
envolvidos na regulação da expressão desses genes. Dessa forma estaríamos aptos a
tentar controlar esses mecanismos de sinalização em nosso favor. Já prevendo esta
possibilidade, nosso grupo, em colaboração com outros, está realizando experimentos
para verificar quais enzimas, em quanto tempo, e em qual ordem e proporções, devem
ser utilizadas a fim de degradar a parede da cana-de-açúcar com a maior eficiência
possível.
Uma outra possibilidade é modificar o tipo de hemicelulose presente na parede e
ativar a síntese dos polissacarídeos reduzindo a quantidade de lignina a fim de produzir
a “cana-energia” que, como conseqüência da maior quantidade de polissacarídeos,
possuirá mais energia conversível em etanol. Essa planta poderá ser usada para hidrólise
com coquetéis enzimáticos de alta eficiência ou mesmo por fungos geneticamente
modificados ou ainda por enzimas expressas pela própria planta.
Apesar do alto grau de conhecimento que necessitamos ter para que se torne
possível tal situação, a manipulação e/ou introdução de genes para a degradação da
parede in vivo é possível. Acreditamos que o etanol de quarta geração se tornará viável
em cerca de 10 anos, pela utilização de modificações genéticas que alterem a parede
celular e fisiologia da planta de forma a prepará-la para melhor adaptação a diferentes
condições com aquelas advindas das mudanças climáticas globais.
Para que esta quarta geração de etanol seja realizada, metas como o
seqüenciamento completo do genoma da cana e alguns fungos-chave, o mapeamento
dos genes de parede, a compreensão dos mecanismos de controle fisiológico
(hormônios, fatores de transcrição), bem como na compreensão da relação entre
estrutura e eficiência de enzimas e substratos, devem se tornar linhas de pesquisa
prioritárias, hoje.
A Figura 7 resume as rotas do etanol celulósico integradas entre si, considerando
a possibilidade de se alterar, com tecnologias de quarta geração, o balanço entre
biossíntese e degradação e produzir plantas que tenham mais celulose e, portanto, um
maior nível de empacotamento de energia nas ligações glicosídicas (veja Buckeridge
2007 para maiores detalhes).
Figura 7 – Rotas possíveis para o etanol de quarta geração.
B
D
Quais genes?(sequenciamento completo)
Expressão gênica
Proteômica
B
D
B
D
CANA ENERGIA
FermentaçãoHidrolases fúngicas
(modo de ação, cristalografia e
genética)
SinalizaçãoCelular
CO2
Temperatura
Água
Seqüências e propriedade das
proteínas
Controlar a arquitetura da parede
Estudar a variabilidade genética
MUDANÇA
S
CLIM
ÁTICAS
GLOBA
IS
Xilose ?
ETANOL
Mitigação e adaptação
Ro
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pa
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Quais genes?(sequenciamento completo)
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CANA ENERGIA
FermentaçãoFermentaçãoHidrolases fúngicas
(modo de ação, cristalografia e
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SinalizaçãoCelular
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Abordagens paralelas à cana-de-açúcar para o avanço tecnológico do etanol
celulósico
O eucalipto é atualmente a maior fonte de celulose disponível comercialmente,
embora sua produção esteja voltada para a fabricação de papel. Entretanto, a casca do
eucalipto, atualmente desperdiçada, é uma grande fonte de carboidratos que podem vir a
ser matéria-prima para produção de etanol celulósico. Há alguns anos, nosso grupo
realizou um levantamento sobre a composição da parede celular do eucalipto em um
projeto financiado pela Suzano Papel e Celulose e, atualmente, o grupo liderado por
Carlos Labate da ESALQ/USP vem realizando um estudo sobre produtividade e
composição dos carboidratos da casca de diferentes variedades de eucalipto. Algumas
têm a casca especialmente rica em hexoses chegando a apresentar até 5% de sacarose
em sua composição. Labate também está interessado em estudar celulases com
especificidade por essas matérias-primas, como as encontradas no trato digestivo de
cupins e outros insetos especializados em madeiras. Além do conhecimento sobre a
composição da parede de eucalipto, a polpa também já foi estudada com relação ao
ataque de enzimas fúngicas (Medeiros et al., 2002).
Outro resíduo que pode ser obtido em grandes quantidades é o ingáço
(pendúculo do cacho) de banana com composição similar à da cana (resultados não
publicados) que podem ser digeridos por enzimas de fungos (Medeiros et al. 2000).
Outro resíduo promissor é a borra de café, que é rica em manano e celulose (não
publicado) que poderia ser digerida por uma mistura de mananases (Lisboa et al., 2006)
e celulases. Há várias outras possibilidades, mas estes processos podem ser vistos como
exemplos que poderiam complementar a produção de etanol celulósico com base no
bagaço da cana.
Mesmo com o foco no etanol de alta tecnologia, é importante não perdermos a
necessária atenção sobre a fisiologia das plantas de interesse para produção de etanol.
Precisamos investir em plantas mais produtivas e precoces a fim de reduzir a
necessidade de expansão das áreas de plantio. Do mesmo modo, é importante obtermos
variedades mais resistentes à seca, alagamento, frio e patógenos para fazer frente as
modificações climáticas em curso, bem como para atender à demanda por variedades
aptas ao cultivo em regiões distintas das tradicionais.
Conclusões
O etanol celulósico, ao lado do biodiesel, é uma promissora fonte de
combustível sustentável e eficiente capaz de atender à demanda universal por
combustíveis líquidos, tanto para propelir veículos quanto para alimentar as iminentes
células de combustível. Diversos métodos para obtenção de etanol estão em
experimentação e é imprescindível que o Brasil mantenha sua liderança natural neste
campo para que o valor tecnológico agregado dos biocombustíveis possa ser revertido
em nosso favor enquanto o produto avança para se tornar uma comódite. Neste
caminho, a cana de açúcar desponta com larga vantagem como a planta sobre a qual
devemos depositar nossos maiores esforços a curto prazo. Entretanto, não podemos
perder de vista outras fontes de lignocelulose como o eucalipto e outras plantas tais
como o sorgo sacarino e as sementes de espécies nativas. Também devemos manter a
atenção sobre tecnologias voltadas à hidrólise, mas sem perder de vista a necessidade
avançar na produtividade das plantas que servirão como matéria-prima a este processo.
Além disso, independentemente do foco em combustíveis de segunda, terceira e
quarta gerações é importante que conheçamos profundamente a fisiologia das plantas de
interesse para produção de etanol. Assim, poderemos produzir variedades mais
resistentes à seca, alagamento, frio e patógenos, bem como plantas mais produtivas e
precoces frente a modificações no ambiente de plantio devido à possibilidade de
expansão de áreas e às mudanças climáticas em curso no planeta.
A produção de bioenergia é uma medida de extrema importância para
enfrentarmos os sérios desafios ambientais relacionados com os efeitos das mudanças
climáticas globais. Ainda que a bioenergia não seja a única solução para este problema,
ela certamente contribuirá para mitigar as emissões de combustíveis fósseis.
Outro desafio igualmente importante é a preservação da biodiversidade. O
aumento de produtividade esperado nos próximos 10 a 15 anos, deve ser usado para
diminuir a necessidade de expansão da área plantada para produzir combustível. Ao
mesmo tempo, deve ser incentivada a recuperação de florestas que, se possível, podem
ocupar espaço em meio aos canaviais, recuperar as matas ciliares e trazer de volta parte
da biodiversidade.
A produção de etanol celulósico com alta eficiência e sustentabilidade não será
tarefa de poucos, mas resultará da integração entre diversos grupos de pesquisa
especializados em diferentes áreas da fisiologia, ecologia, bioquímica, genética,
enzimologia, física e engenharia, entre outras. O Brasil está diante de mudança no modo
de produção rara ou talvez inédita na história. Podemos desenvolver uma tecnologia de
alto valor agregado e ao mesmo tempo usá-la também para recuperar a biodiversidade,
integrando sustentabilidade e desenvolvimento tecnológico. Talvez não seja exagero
dizer que Brasil tem a chance de liderar uma transição entre o velho Homo sapiens
pujante e poluidor para um novo e equilibrado Homo ambientalis.
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